DE19835767A1 - Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces CerevisiaeInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae. In einer ersten Verfahrensstufe werden die Hefezellen durch Einwirkung von Scherkräften mechanisch soweit zerrissen, daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt sind. Die Zellwandbestandteile werden von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt. In einer zweiten Verfahrensstufe wird dann das gewonnene Zellwandmaterial gereinigt und gefriergetrocknet. Danach wird das Zellwandmaterial in einer dritten Verfahrensstufe einem enzymatischen Aufschluß unterzogen und das hierbei entstehende wasserunlösliche Glucan durch Zentrifugation als Feststoff und das wasserlösliche Mannan im Überstand gewonnen. Durch dieses Verfahren erfolgt eine hohe Ausbeute von Glucan und Mannan mit intakter nativer Struktur.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver
immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae.
Die Bedeutung des Immunsystems zur Abwehr von Krankheiten in menschlichen und tierischen
Organismen ist bekannt. Es ist ferner allgemein bekannt, daß es in der Zellwand von Hefe
Polysaccharide gibt, die in tierischen und menschlichen Organismen immunstimulierend wirken
und zur Abwehr von Krankheiten eingesetzt werden können. Diese Polysaccharide sind
Mannan und Glucan. Das Mannan, bestehend aus 1,2-, 1,3- und 1,6-α-glykosidisch
verknüpften Mannose-Einheiten, ist an eine Protein-Matrix gebunden und sitzt auf der äußeren
Zellwand der Hefezelle, während das Glucan 1,3-β-glykosidisch verknüpft ist mit wenigen 1,6-β-
glykosidischen Seitenketten und sich in der inneren Zellwand befindet. Zur Isolierung dieser
beiden Polysaccharide wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, bei denen durch Einwirkung
von Säuren und Laugen die beiden Zellwandkomponenten getrennt werden. Bei diesen
herkömmlichen Verfahren sind jedoch viele Verfahrensschritte erforderlich und darüber hinaus
wird die native Struktur der Zellwand-Polysaccharide beschädigt, so daß die
immunabwehrfördernden Effekte beeinträchtigt werden.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Verfahren der eingangs genannten Art so zu
gestalten, daß bei einer Verminderung der erforderlichen Verfahrensschritte ein optimaler
immunmodulierender Effekt erzielt wird.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen
beschrieben.
Nach der Erfindung wird gegenüber den herkömmlichen sauren und alkalischen Extraktionen
bei der Isolierung der Polysaccharide eine Degradation vermieden, da durch den Einsatz von
Enzymen extreme pH-Werte vermieden werden. Außerdem wird die Anzahl der erforderlichen
Verfahrensschritte deutlich reduziert. Gemäß der Erfindung werden zunächst über einen
mechanischen Zellaufschluß die Zellwände vom Zellinneren abgetrennt und die erhaltenen
Zellwandabschnitte gereinigt und gefriergetrocknet. Dann erfolgt eine Einwirkung von
technischen Enzymen auf die isolierten Zellwandabschnitte der Hefe Saccharomyces
Cerevisiae, wodurch die Substanzen rein isoliert werden können. Man erhält sowohl Mannan
als auch Glucan, welche direkt für immunstimulierende Zwecke z. B. in Hautcremes eingesetzt
werden können. Da das Glucan in Wasser unlöslich ist, kann es durch chemische
Umsetzungen in wasserlösliche Derivate überführt werden. Hierzu sind zahlreiche
Derivatisierungsmethoden bekannt. Es können spezielle Mannan-Komponenten isoliert werden,
die Molmassen im Bereich von 20.000 bis 400.000 g/mol haben, eine spezifische,
immunmodulierende Reaktion zeigen und dabei aber nicht cytotoxisch wirken. Diese Mannan-
Komponenten können auch zur Bekämpfung von Asthma-Erkrankungen genutzt werden. Zur
Isolierung der Polysaccharide können vorteilhaft Enzyme eingesetzt werden, wie Protease
(SIGMA-ALDRICH), Pronase (MERCK), beide aus Streptomyces griseus, Lyticase, auch
Zymolyase genannt (SIGMA-ALDRICH), wie auch Enzymcocktails aus Helix pomatia und aus
Cytophaga (MERCK). Es ist aber auch die Verwendung anderer geeigneter Enzyme oder
Enzymcocktails möglich.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der in der Zeichnung schematisch
dargestellten Verfahrensabläufe näher erläutert.
Die Hefezellen 1 werden in der ersten Verfahrensstufe A durch Einwirkung von Scherkräften
mechanisch zerrissen, so daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt werden. Hierzu wird ein
Mahlbehälter 2 mit einer Suspension aus Hefezellen und Glasperlen gefüllt und in z. B. einer
Schwingmühle 3 mit hoher Frequenz geschüttelt. Als Glasperlen werden vorzugsweise solche
mit einem Durchmesser von 0,75-1,5 mm verwendet. Die Frequenz der Schwingmühle 3
beträgt z. B. 1600 s-1. Das so gewonnene Zellwandmaterial 4 wird dann in einer weiteren
Verfahrensstufe B durch Zentrifugation gereinigt oder aber an mikroporösen Membranen durch
Waschen gereinigt. Das so aufbereitete Zellwandmaterial 4 wird dann gefriergetrocknet. In der
dann folgenden Verfahrensstufe C wird das Zellwandmaterial 4 einem enzymatischen
Aufschluß unterzogen. Spezifische Enzyme wie Pronase oder Glucanase oder spezifische
Enzymcocktails wie Zymolyase, Cytophaga, Helicase oder Cellulase zerstören in der äußeren
Zellwand des Zellwandmaterials 4 die Proteinmatrix und setzen lösliches Mannan 5 frei. Das
unlösliche Glucan 6 wird durch Zentrifugation abgetrennt und gesondert aufbereitet. Das
Mannan 5 kann durch Dialyse oder chromographisch gereinigt werden.
Nachstehend werden zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben:
5,0 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 115 ml Trispuffer-Lösung
(Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf
37,0°C temperiert. 10,6 mg Pronase E (Streptomyces griseus, Fa. MERCK) wurden in 5 ml
Puffer-Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach sechs Stunden wurde
der Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man
Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 2,9 g Glucan zu finden sind.
1,55 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 60 ml Trispuffer-Lösung
(Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf
37,0°C temperiert. 462 mg Protease (Streptomyces griseus, Fa. SIGMA) wurden in 5 ml Puffer-
Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach 6,5 Stunden wurde der
Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man 352
mg Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 522 mg Glucan zu finden sind.
Claims (7)
1. Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender
Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, daß in
einer ersten Verfahrensstufe A die Hefezellen durch Einwirkung von Scherkräften
mechanisch soweit zerrissen werden, daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt sind
und daß dann die Zellwandbestandteile von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt
werden, daß dann in einer zweiten Verfahrensstufe B das in der ersten Verfahrensstufe A
gewonnene Zellwandmaterial gereinigt und gefriergetrocknet wird und daß dann das
Zellwandmaterial in einer dritten Verfahrensstufe C einem enzymatischen Aufschluß
unterzogen und das hierbei entstehende wasserunlösliche Glucan durch Zentrifugation
als Feststoff und wasserlösliche Mannan im Überstand gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in der ersten
Verfahrensstufe A gewonnenen Zellwandbestandteile durch Zentrifugation von den
Bestandteilen des Zellinneren getrennt und vor der Gefriertrocknung gereinigt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in der ersten
Verfahrensstufe A gewonnenen Zellwandbestandteile an mikroporösen Membranen von
den Bestandteilen des Zellinneren getrennt und durch Waschen vor der Gefriertrocknung
gereinigt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gefriergetrockneten
Zellwandbestandteile in einem Puffersystems bei einem pH-Wert von 3,0 bis 11 bei
Temperaturen zwischen 20°C und 50°C über einen Zeitraum von vier bis 30 Stunden mit
enzymatischen Aufschlußmitteln zur Reaktion gebracht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisches
Aufschlußmittel Proteasen aus Streptomyces griseus und/oder Lyticase (Zymolyase)
verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisches
Aufschlußmittel Enzymcocktails aus Helix pomatia und/oder aus Cytophaga verwendet
werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisches
Aufschlußmittel ein Gemisch aus Enzymen und Enzymcocktails verwendet wird.
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