JPS6152125B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗腫瘍剤に関する。 本発明の目的は容易に大量生産でき、しかもほ
とんど毒性のない抗腫瘍剤を提供するにある。 アルカリゲネス属もしくはアグロバクテリウム
属に属する微生物の株がβ−１・３結合を主な結
合様式として有する水不溶性、加熱凝固性
（thermogelable）のグルカン（以下TAK−Ｎと
略称する）を生産することは、日本特許出願公告
昭43−7000号、同48−32673号、同48−32674号お
よび英国特許第1352938号によつてすでに知られ
ている。しかしながら、その医薬的用途は未だ全
く知られていない。 本発明者らは、TAK−Ｎおよびそれを部分的
に加水分解した低重合体（以下TAK−Ｄと略称
する）について種々研究を重ねた結果、それらが
強力な抗腫瘍作用を有することならびにそれらの
示す腫瘍阻止率ならびに腫瘍消失効果が著るしく
高いことを見出し、鋭意研究を続行して遂に本発
明を完成するに至つた。 本発明は、水不溶性、平均重合度約170におい
て加熱凝固性を有するβ−１・３グルカンもしく
はその部分水解低重合体を含有する抗腫瘍剤であ
る。 本発明に用いられる水不溶性、加熱凝固性のβ
−１・３−グルカン（TAK−Ｎ）は、上記の特
許公報類に詳述されている通り、アグロバクテリ
ウム・ラジオバクター（IFO13127、
ATCC6466）、アグロバクテリウム・ラジオバク
ター・Ｕ−19（IFO13126、ATCC21679、微工研
菌寄第1166号）、アルカリゲネス・フエカリス・
バル・ミクソゲネス・NTK−ｕ（IFO13140、
ATCC21680、微工研菌寄第1168号）あるいはア
ルカリゲネス・フエカリス・バル・ミクソゲネ
ス・Ｋなどの培養によつて生産されるもので、β
−１・３−結合を結合様式として有し、水に不溶
性で、多くのものは水分と共に加熱するとゲル化
して凝固するという、他のβ−１・３−グルカン
には見られない特性を有している。 TAK−Ｎの重合度は製造法の違いによつて変
動しうる。たとえば、マナーズらの方法（カーボ
ハイドレート・リサーチ、第17巻、109頁、1971
年）で測定した場合、その平均重合度は約70−
1000を示すが、300−500の場合が多い。そして、
これらは一般に加熱凝固性であるが、平均重合度
が低下すると凝固性を失う。たとえば平均重合度
113においては非凝固性であるが、約170において
は凝固性を有する。 本発明者らは、TAK−ＮおよびTAK−Ｄがい
ずれも強い抗腫瘍作用を有するこことを見出し
た。 殊に多糖類とは呼び難いTAK−Ｄのあるもの
がこのような作用を有することは驚くべきことで
ある。 TAK−ＤはTAK−Ｎの加水分解によつて製造
される。その加水分解手段としては、従来からよ
く知られている酸加水分解、アルカリ加水分解も
しくはβ−１・３−グルカナーゼによる酵素加水
分解などがある。 反応混合物からTAK−Ｄを分離するには、多
糖類、寡糖類の精製や分画に用いられる種々の手
段、たとえば、酸性における沈澱、エタノール添
加による沈澱、ゲル過などを用いうる。このよ
うな手段により所望の平均重合度を持つ各種の低
重合体を分離することができる。 本発明にいうTAK−ＤはTAK−Ｎの部分加水
分解によつて生成するあらゆる種類の低重合体を
包含している。 前記のように、微生物の培養物から得られる
TAK−Ｎの平均重合度は広い範囲にわたつてい
る。そして、培養物中に生成したβ−１・３−グ
ルカンは培養時間の延長と共に加水分解される傾
向があるので、前記の範囲よりもさらに低重合度
のTAK−Ｎを製造することもできる。 一方、TAK−ＤはTAK−Ｎの加水分解によつ
て製造されるから、その平均重合度は原料TAK
−Ｎのそれよりも当然小さいが、一般的に言え
ば、大部分のTAK−Ｄに相当する重合度のTAK
−Ｎが微生物の培養によつても生成されうる。そ
してTAK−ＮとTAK−Ｄとは、平均重合度が同
じである限り、両者の間に実質的な相違がない。 以下TAK−ＮからTAK−Ｄを製造する態様を
実験例によつて説明する。 実験例 １ （硫酸による加水分解） TAK−Ｎ（平均重合度540、マナーズらの方法
により測定した。以下特に記載しない限り同方法
により測定）60ｇを4N硫酸６に懸濁し、60℃
の恒温水槽中で撹拌しながら加水分解反応を行つ
た。30分後および１時間後に、それぞれ２宛反
応液を採取し（各反応液を順にS₁、S₂とする）、
残りをさらに１時間反応させて反応液S₃を得た。
S₁、S₂、S₃からそれぞれ以下の操作により分解物
標品を調製した。 先ず遠心分離により沈澱を集め、1.6の蒸留
水による洗滌と遠心分離を２回くり返してからふ
たたび1.2の蒸留水に懸濁し、8N水酸化ナトリ
ウム溶液を加えて中和したのち、凍結乾燥して粉
末22ｇ、20ｇおよび19ｇを得た。次いでこれらの
粉末それぞれ７ｇを蒸溜水700mlに懸濁し、8N水
酸化ナトリウム溶液でPH12.5に調整し、溶液
S₁′、S₂′、S₃′を得た。S₁′、S₂′にエタノールを終
濃度60％となるように加え、生ずる沈澱を除いた
あとエタノールをさらに70％まで加え稀塩酸で中
和して沈澱を生成させ、これらの沈澱を蒸溜水
250mlでくり返し４回洗浄したのち凍結乾燥した
ところ、S₁′からは1.8ｇ、S₂′からは1.5ｇの白色
粉末（それぞれＳ−、Ｓ−とする）が得られ
た。S₃′にはエタノールを終濃度70％となるよう
に加え、遠心分離により沈澱を集めたのちふたた
び蒸溜水約500mlに懸濁し、エタノールを70％と
なるように加えて少量の塩酸で中和することによ
り沈澱を生成させた。この沈澱を遠心分離により
集め、蒸溜水250mlによる洗浄を４回くり返した
のち凍結乾燥したところ、白色粉末（Ｓ−）
5.6ｇが得られた。Ｓ−、Ｓ−およびＳ−
の物理化学的特性値は第１表に示す通りであつ
た。

【表】

【表】 実験例 ２ （ギ酸による加水分解） (i) TAK−Ｎ（平均重合度540）６ｇを85％ギ酸
150mlに溶解し、88℃で20分間加水分解反応を
行なつた。冷却後反応液を濃縮乾固し濃縮物を
水に懸濁したのち5N水酸化ナトリウム溶液で
PH12.5として溶解し、ふたたび5N塩酸でPH7.0
に補正したのち遠心分離により沈澱を採取し
た。沈澱を蒸溜水で充分洗浄したのち凍結乾燥
して白色粉末（Ｆ−）5.4ｇを得た。 (ii) (i)で用いたTAK−N12ｇを90％ギ酸300ml中
95℃で20分間加水分解した反応液から、(i)と同
様の操作により白色粉末（Ｆ−）10.3ｇを得
た。 (iii) (i)で用いたTAK−N12ｇを90％ギ酸400ml中
95℃で40分間加水分解した反応液から、(i)と同
様の操作により白色粉末5.4ｇを得た。この粉
末を0.05N水酸化ナトリリウム溶液に終濃度1.0
％となるように溶解し、エタノールを57.5％ま
で加えて沈澱を生成させた。この沈澱を遠心分
離により集め、蒸溜水に懸濁して稀塩酸で中和
し、70％エタノール水で充分洗浄したのち凍結
乾燥して白色粉末（Ｆ−）2.2ｇを得た。ま
た、エタノール沈澱を採取したあとの上清液に
さらにエタノールを70％になるように加え塩酸
で中和して沈澱を生成させ、遠心分離、70％エ
タノール水洗浄、凍結乾燥の操作を経て白色粉
末（Ｆ−）2.3ｇを得た。さらに、加水分解
反応液から最初の沈澱5.4ｇを採取した残りの
上清液中にはかなりの量の部分水解物が溶解し
た状態で存在していたので、この上清液を濃縮
し、遠心分離により沈澱と上清部とに分け、前
者を凍結乾燥して白色粉末（Ｆ−）2.9ｇ
を、また後者をセフアデツクスＧ−25カラムを
用いたゲル過（溶媒0.1M重炭酸アンモニウ
ム）により分画後凍結乾燥して白色粉末（Ｆ−
）0.7ｇを得た。 (iv) (i)で用いたTAK−N18ｇを90％ギ酸450ml中
95℃で40分間加水分解した反応液に(iii)と同様の
濃縮、アルコール沈澱、ゲル過などの操作を
適用し、４種の白色粉末（Ｆ−2.3ｇ、Ｆ−
2.8ｇなど）を得た。 こゝで得られたＦ−、Ｆ−、Ｆ−、Ｆ−
、Ｆ−、Ｆ−、Ｆ−およびＦ−の物理
化学的特性値は第２表に示す通りであつた。ま
た、これらのうちの重合度の小さいＦ−以下の
６標品を0.02N水酸化ナトリウム溶液に溶解し、
あらかじめ同一溶液で処理しておいたセフアデツ
クスＧ−200カラムを用いて同一条件でそれぞれ
ゲル過したところ、平均重合度の大きい標品か
ら大きさの順（Ｆ−からＦ−へ）それぞれ対
称性を持つた溶出像を形成して溶出し、各標品と
もに平均重合度を中心として重合度が正規分布し
ていることを示した。

【表】 上記のようにして得られるTAK−Ｎおよび
TAK−Ｄはすべての平均重合度たとえば565以上
のものから約７のものに至るまでいずれもが温血
動物、たとえば人、家畜、家禽、犬、猫、ウサ
ギ、ラツト、マウスなどの各種の腫瘍特に治療の
困難性が指摘されている固型腫瘍に対してすぐれ
た抑制作用を示す。 TAK−ＮもしくはTAK−Ｄの投与量は、対象
腫瘍を有効に阻止しうる量であればよく、たとえ
ば、投与剤の種類、対象動物、腫瘍の症状、投与
経路、剤型などにより変動しうる。 一般に、一回の投与量は約0.2−2000mg/Kg体重
で、その上限は好ましくは約500mg/Kg、さらに好
ましくは約200mg/Kg程度の場合が多く、注射剤の
場合、その上限は約100mg/Kg程度の場合が多い。
投与回数は、１日１回−６回の範囲で適宜選択さ
れうる。 マウスに移植したザルコーマ180腫瘍、SN−36
腫瘍、MM−46腫瘍、CCM腺癌、NTF細網肉
腫、エールリツヒ腫瘍などの発育は、TAK−Ｎ
もしくはTAK−Ｄを腫瘍細胞移植前、移植後あ
るいは移植と同時に腹腔内、静脈内もしくは皮下
に、あるいは経口的に１回もしくはくり返して、
１回当りの投与量が約１−1000mg/Kgとなるよう
に投与することにより顕著に抑制された。 TAK−ＮおよびTAK−Ｄの毒性はきわめて低
く、たとえば急性毒性試験においてマウスあるい
はラツトに経口投与および腹腔内投与した時の
LD₅₀値はそれぞれ５ｇ/Kg以上、２ｇ/Kg以上で
あり、人に対しても安全に反復投与することがで
きる。 投与方法としては腫瘍治療における一般的な方
法を適用できる。それは皮下、筋肉内もしくは必
要に応じて静脈内への注射、経口投与、直腸内へ
の投与および外用剤として塗布、点滴などが可能
である。投与量および投与スケジユールは患者お
よび腫瘍の種類、症状などを勘案して適宜選択で
きる。たとえば、注射剤の場合、１日当り１−
2000mg/Kg程度、好ましくは３−500mg/Kg程度が
よい。 TAK−ＮおよびTAK−Ｄは他の抗腫瘍剤と併
用することもできる。免疫学的効果の増強をもた
らすような併用は特に効果的である。 次に本発明の実施例を示す。これらの例の幾つ
かは、動物をモデルとして本発明の抗腫瘍剤の効
果を示している。そしてこれらの動物における効
果が他の温血動物においても再現することはよく
知られている。また他の例においては本発明の抗
腫瘍剤の投与形態の一部が示される。 もちろん、本発明はこれらの例によつて制限さ
れるものではない。 実施例 １ 体重約23ｇのICR−JCLマウスの右鼠径部皮下
に６×10⁶個のザルコーマ180腫瘍細胞を移植し、
移植後24時間目から１日１回ずつ10日間連続して
種々の量のTAK−Ｎを腹腔内に投与した。移植
後35日目の腫瘍結節を摘出してその重量を測定
し、無投与対照群のそれと比較して腫瘍阻止率を
算出した。なお、試料は乳鉢ですりつぶしたのち
注射用蒸溜水に懸濁して投与した。第３表に示す
通りTAK−N1回投与量１〜50mg/Kgで、腫瘍発
育は抑制され、特に５〜25mg/Kgで抑制効果は顕
著であつた。

【表】 実施例 ２ TAK−Ｎ（平均重合度540）を水に懸濁し120
℃に加熱して凝固させたのち乾燥し、ジメチルス
ルホキシド（DMSO）に溶解しもしくは注射用蒸
溜水に懸濁して試料とし、実施例１の方法により
抗腫瘍性を試験した結果、第４表に示す通りいず
れの試料においても著効が認められた。

【表】 投与
実施例 ３ 本文中に述べた各種TAK−ＤならびにTAK−
Ｎについての実施例１の方法により抗腫瘍性を試
験した結果、第５表に示す通り、平均重合度16か
ら565に至るすべての試料に効果が認められ、な
かでも10mg/Kgの投与では平均重合度50以上の試
料で効果が顕著であつた。なお、30mg/Kg（１回
量）とした場合には39、24、16の平均重合度でも
顕著な効果が認められた。

【表】 実施例 ４ 生後５〜６週令、雌性、体重20〜24ｇのICR−
JCLマウスの液窩部皮下に４×10⁶個のザルコー
マ180腫瘍細胞を移植したのち、移植後24時間目
から１日１回20mg/Kgずつ10日間連続してTAK−
Ｎまたは平均重合度50のTAK−Ｄ（Ｆ−）を
皮下に投与し、実施例１と同様にして腫瘍阻止率
を算出した。なお、試料を乳鉢ですりつぶしたの
ち生理食塩水に懸濁して投与した。第６表に示す
通り、いずれも腫瘍発育を抑制した。

【表】 実施例 ５ 実施例４と同様にして移植したのち、腫瘍が完
全に生着した移植後７日目から、TAK−Ｎまた
はTAK−Ｄを用いて実施例４と同様に調製した
試料を１日おきに10回、毎回20mg/Kgずつマウス
腹腔内に投与し、実施例１と同様にして腫瘍阻止
率を算出した。第７表に示す通り、いずれも顕著
に腫瘍の発育を抑制した。

【表】 実施例 ６ 実施例４と同様にして移植したのち、移植後７
日目にTAK−Ｎを20mg/Kg、60mg/Kgもしくは100
mg/Kgとなるように、または平均重合度50のTAK
−Ｄ（Ｆ−）を100mg/Kg、200mg/Kgもしくは
400mg/Kgとなるようにそれぞれ１回腹腔内に投与
した。これらの試料は実施例４と同様の方法で懸
濁液として投与した。移植後35日目の腫瘍重量を
測定し、実施例１と同様にして腫瘍阻止率を算出
した。第８表に示す通り、TAK−Ｎは60mg/Kgお
よび100mg/Kgの１回投与で、TAK−Ｄ（Ｆ−
）は100〜400mg/Kgの１回投与で、いずれも顕
著な腫瘍発育抑制効果を示した。

【表】 実施例 ７ 体重約23ｇのICR−JCLマウスに、TAK−Ｎお
よび平均重合度の異なる種々のTAK−Ｄを１日
１回20mg/Kgずつあるいは50mg/Kgずつ連続５日間
腹腔内投与し、最終投与時から数えて24時間目に
６×10⁶個のザルコーマ180腫瘍細胞を右鼠径部皮
下に移植し、移植後35日目の腫瘍重量を測定し
た。試料は実施例１の方法により懸濁液として投
与した。第９表に示す通り、いずれの場合にも腫
瘍発育が顕著に抑制された。

【表】 実施例 ８ TAK−Ｎおよび平均重合度68のTAK−Ｄ（Ｓ
−）を１日１回20mg/Kgずつ連続５日間マウス
の腹腔内に投与し、最終投与日から数えて３日目
に４×10⁶個のザルコーマ180腫瘍細胞を腋窩部皮
下に移植して移植後35日目の腫瘍重量を測定し
た。試料は実施例４の方法により懸濁液として投
与した。その結果、第10表に示す通り、いずれの
場合にも腫瘍発育が顕著に抑制された。

【表】 実施例 ９ 実施例４と同様にして腫瘍を移植し腫瘍が完全
に生着したのち、移植後７日目から１日置きに８
回TAK−Ｎまたは平均重合度50および16のTAK
−Ｄ（Ｆ−およびＦ−）をそれぞれ20mg/Kg
ずつ静脈内に投与し、腫瘍移植後35日目の腫瘍重
量を測定して腫瘍阻止率を算出した。試料は乳鉢
ですりつぶしたのち生理食塩水に懸濁して投与し
た。その結果、第11表に示す通り、いずれも顕著
な腫瘍発育抑制効果を示した。

【表】 実施例 10 平均体重23ｇのICR−JCLマウスの右鼠径部皮
下に7.2×10⁴個のSN−36腫瘍細胞を移植し、移
植後24時間目から１日１回ずつ10日間連続して
種々の投与量のTAK−Ｎを腹腔内に投与した。
移植後35日目の腫瘍を摘出してその重量を測定し
た。試料は実施例１のように懸濁液として投与し
た。第12表に示す通りTAK−N1回投与量10〜50
mg/Kgで腫瘍発育は顕著に抑制された。

【表】 実施例 11 平均体重23ｇのC3H／Heマウスの右鼠径部皮
下に６×10⁶個のMM−46腫瘍細胞を移植し、移
植後24時間目から１日１回ずつ10日間連続して20
mg/KgのTAK−Ｎを腹腔内に投与した。移植後35
日目の腫瘍重量を測定した。試料は実施例１記載
のように懸濁液として投与した。第13表に示す通
り、腫瘍発育が抑制された。

【表】 〓平均重合〓
〓度540 〓
実施例 12 平均体重23ｇのICR−JCLマウスの右鼠径部皮
下に1.1×10⁷個のCCM腺癌細胞を移植し、移植後
24時間目から１日１回ずつ10日間連続して、毎回
20mg/KgのTAK−Ｎを腹腔内に投与した。移植後
35日目の腫瘍を摘出してその重量を測定し、腫瘍
阻止率を算出した。なお、試料は実施例１のとお
り懸濁液として投与した。第14表に示す通り、腫
瘍発育が顕著に抑制された。

【表】 〓平均重合〓
〓度540 〓
実施例 13 平均体重23ｇのICR−JCLマウスの右鼠径部皮
下に4.5×10⁶個のNTF細網肉腫細胞を移植し、移
植後24時間目からTAK−Ｎを１日１回、10mg/Kg
あるいは30mg/Kgずつ連続10日間腹腔内に投与し
た。移植後35日目の腫瘍を摘出してその重量を測
定し、腫瘍阻止率を算出した。なお、試料は実施
例１のように懸濁液として投与した。第15表に示
す通り、いずれの投与量においても腫瘍発育は顕
著に抑制された。

【表】 〓平均重合〓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性で、平均重合度約170において加熱
   凝固性を有するβ−１・３−グルカンもしくはそ
   の部分水解低重合体を含有する抗腫瘍剤。 ２ 注射剤の形態にある特許請求の範囲第１項記
   載の抗腫瘍剤。 ３ 経口剤の形態にある特許請求の範囲第１項記
   載の抗腫瘍剤。