KR20140105620A - 미립자-가용성 글루칸 제제 - Google Patents

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Abstract

미립자 β-글루칸을 승압 및 승온에서 가용화하여 미립자-가용성 β-글루칸을 형성한다. 미립자-가용성 β-글루칸은 분말 형태로 건조되고 이후 재가용화될 수 있다.

Description

미립자-가용성 글루칸 제제 {PARTICULATE-SOLUBLE GLUCAN PREPARATION}
본 출원은 2007년 5월 8일에 출원된 발명의 명칭 "가용성 글루칸 제조(SOLUBLE GLUCAN PREPARATION)"의 미국 가특허출원 제60/916,690호의 이익을 주장한다.
본 발명은 미립자-가용성 β-글루칸에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 미립자-가용성 β-글루칸의 개선된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
글루칸은 일반적으로 글루코스의 중합체로서 설명되며, 효모, 세균, 진균 및 식물, 예컨대 귀리 및 보리로부터 유래된다. β(1-3)-연결된 글루코피라노스 주쇄를 함유하는 글루칸은 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로는 면역계를 조절하고 보다 최근에는 조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 동원을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
과거에, 고품질 가용성 β-글루칸은 제조하는데 많은 비용이 들었다. 그 비용으로 인해 고품질 가용성 β-글루칸은 예를 들어 영양 보충물 또는 식품 성분으로서 금지되었다. 따라서, 개선된 가용성 β-글루칸이 필요하다.
<발명의 요약>
미립자 β-글루칸은 승온 및 승압에서 산성 용액 중에 가용화된다. 생성된 가용성 β-글루칸은 예를 들어 원심분리 및/또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 추가로 정화 및 정제될 수 있다. 수득된 생성물은 고분자량 글루칸으로 구성된 경우라도, 분말로 건조되고 이후 재-가용화될 수 있다.
본 발명에서 사용된 출발 물질은 임의의 방법에 의해 제조된 미립자 또는 불용성 β-글루칸이다. 미립자 β-글루칸 출발 물질은 전체 글루칸 입자로부터 서브마이크로미터-크기의 입자에 이르는 크기 범위일 수 있다. 출발 물질 내의 불순물 수준은 또한 변할 수 있다. 그러나, 출발 물질 내의 불순물 수준이 증가할수록, 회수된 가용성 글루칸의 양은 감소한다. 적합한 출발 물질의 한 예는 바이오테라(Biothera)의 WGP 3-6®이다.
β-글루칸의 다수의 공급원 중 임의의 공급원이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 공급원의 예로는 효모, 보리, 귀리, 버섯 및 다른 진균 등이 있다.
가용성 β-글루칸을 제조하기 위해 미립자 β-글루칸을 가압 및 승온 하에서 산으로 처리한다. 처음에, 펠렛화된 미립자 β-글루칸을 밀봉가능한 반응 용기 내 완충 용액 중에서 재현탁 및 혼합하고, pH 3.6에 이르게 한다. 최종 현탁 혼합물의 모든 리터, 총 부피가 아세트산나트륨 약 0.61 g, 빙초산 5.24 ml 및 펠렛화된 미립자 β-글루칸 430 g을 함유하도록 완충제를 첨가한다. 용기를 질소로 퍼징하여 산소를 제거하고 반응 용기 내 압력을 증가시킨다.
전형적으로, 용기 내부 압력을 35 PSI에 이르게 하고, 현탁액을 약 5.5 이하의 시간 동안 약 135℃로 가열한다. 이들 조건 하에서 β-글루칸이 가용화될 것이라는 것을 발견하였다. 온도가 135℃로부터 감소할수록, 가용화의 양 또한 감소한다.
이러한 온도 및 압력은 기재된 실시양태에서 최적화된 것임을 주목해야 한다. 임의의 반응 조건 및/또는 시약이 변경되는 경우 온도 및 압력의 최적화 및 조정이 요구될 수 있다.
증가된 압력 및 온도는 방법으로부터 위험 화학물질의 사용을 사실상 배제함으로써 β-글루칸을 가용화하기 위한 종래 기술 방법에 비해 이점을 부여한다. 이전에 사용된 위험 화학물질로는 예를 들어 가연성 VOC, 예컨대 에테르 및 에탄올, 매우 강한 산, 예컨대 포름산 및 황산, 및 매우 높은 pH의 부식성 용액이 포함된다. 본 방법은 보다 안전할 뿐만 아니라, 사용된 여러 화학물질의 수 및 관여된 단계의 수를 감소시킴으로써 보다 경제적이다.
본 방법의 추가 이점은 상기 처리 기간이 생성된 미립자-가용성 β-글루칸의 분자량을 조절한다는 것이다. 그 기간이 전반적으로 사용되는 경우, "미립자-가용성 β-글루칸"은 임의의 가용성 미립자 또는 재가용화 형태일 수 있다. 처리 기간은 생성된 분자량 크기와 역으로 관련된다. 즉, 처리 기간이 증가할수록, 생성된 미립자-가용성 β-글루칸의 평균 분자량은 감소한다. 이러한 원리가 하기에 예시되어 있다.
상기 기재된 방법 동안 여러 시점 (60, 90, 120 및 240분)에서 미립자-가용성 β-글루칸 현탁액의 배치로부터 4개의 샘플을 수집하였다. 샘플의 분자량을 덱스트란 분자량 표지에 대해 크기 배제 크로마토그래피로 측정하였다. 결과가 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure pat00001
*
Figure pat00002
에 의해 계산된 수평균 분자량
**
Figure pat00003
에 의해 계산된 중량평균 분자량
(여기서 Ni는 분자량 Mi의 분자 수임)
*** z-평균 분자량은 중합체 쇄의 부피 기준임
상기 데이타에 의해 증명된 바와 같이, 미립자 β-글루칸은 서서히 분해되기 시작하며 최대 평균 크기가 약 90분에서 발생한다. 90분 시점 후, 평균 크기는 감소한다. 시점 특정 데이타가 도 1 내지 4에 도시되어 있다.
도 1은 패널 A 및 B를 포함한다. 패널 A는 60분 샘플의 굴절률 (RI) 자취이다. 패널 B에서, 패널 A에서 생성된 데이타의 한 구역을 변환시키고 도시된 그래프에 플롯팅하였다. 곡선 10은 변환된 로 데이타(raw data)를 나타낸다. 곡선 12는 특정 분자량의 누적률(％)을 나타낸다. 분자량은 알려진 크기의 덱스트란으로 생성된 표준 곡선에 의해 측정하였다 (데이타는 도시되지 않음).
90분 샘플로부터 생성된 데이타는 도 2에 도시되어 있다. 곡선 14 및 16을 갖는 패널 A 및 패널 B가 도 1의 패널 A 및 B에 상응한다.
120분 샘플로부터 생성된 데이타는 도 3에 도시되어 있다. 곡선 18 및 20을 갖는 패널 A 및 패널 B가 도 1의 패널 A 및 B에 상응한다.
240분 샘플로부터 생성된 데이타는 도 4에 도시되어 있다. 곡선 22 및 24를 갖는 패널 A 및 패널 B가 도 1의 패널 A 및 B에 상응한다.
미립자-가용성 글루칸의 특정 크기는 특정 응용에 보다 유용할 수 있다. 예를 들어, 국소 적용되는 경우, 보다 작은 분자량의 분자일수록 피부를 더 잘 침투할 수 있다. 한편, 보다 큰 분자량의 분자일수록 경구 투여에 더 적합할 수 있다. 따라서, 글루칸 분자의 평균 크기를 용이하게 조절하는 능력은 유의한 경쟁적 이점을 제공한다.
열 처리의 정확한 지속기간은 전형적으로 반응기 내용물을 샘플링하여 실험적으로 결정한다. 다양한 시험, 예컨대 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 분석을 수행할 수 있다. 그 방법은 특정 상세 프로파일 및 불순물 수준을 충족하는 미립자-가용성 물질의 수율을 최대화한다. β-글루칸이 가용화되면, 혼합물을 냉각시켜 반응을 중단시킨다.
미립자-가용성 β-글루칸을 이 시점에서 세척 및 이용할 수 있지만, 제약 응용을 위해 전형적으로 추가 정제를 수행한다. 하기 단계 중 하나 이상의 임의의 조합을 사용하여 미립자-가용성 β-글루칸을 추가로 정제 및/또는 정화할 수 있다. 필요한 경우 당업계에 공지된 다른 수단을 또한 사용할 수 있다. 적합한 수단으로는 예를 들어 원심분리 또는 유의한 양의 액체 불순물을 제거하는 연속-유동 원심분리가 포함된다.
일부 경우, 미립자-가용성 β-글루칸 내 액체를 포함시켜 특정 감염성 질환에 대한 그의 효과를 증가시키거나 또는 면역계를 증강시킬 수 있다. 본원에 제공된 방법은 미립자-가용성 β-글루칸 조성물 중 액체의 양을 효과적으로 제어하고 변화시키는 수단을 제공한다.
별법으로 또는 추가로, 미립자-가용성 β-글루칸을 여과할 수 있다. 한 실시양태에서, 물질을 0.2 μm 필터를 통해 여과한다.
또한, 크로마토그래피를 정제에 사용할 수 있다. 미립자-가용성 β-글루칸을 크로마토그래피를 위해 제조 중 일부 시점에서 컨디셔닝할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 경우, 미립자-가용성 β-글루칸을 황산암모늄 및 아세트산나트륨 용액에 의해 적절한 전도도 및 pH로 컨디셔닝할 수 있다. 적합한 용액은 3.0 M 황산암모늄, 0.1 M 아세트산나트륨이며, 이를 사용하여 pH를 5.5로 조정한다.
이용할 수 있는 또다른 크로마토그래피 단계는 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)이다. 로드가 컬럼의 용양을 초과하지 않도록 하기 위해 수회의 크로마토그래피 사이클이 필요할 수 있다.
이 시점에서, 미립자-가용성 β-글루칸을 정제하고 사용을 위해 준비한다. 일반적으로 수집된 미립자-가용성 β-글루칸은 평균 분자량이 1,000,000 Da 초과이며 높은 다분산도를 갖는다. 특히 백만 달톤 (Da) 초과와 같은 고분자량 범위에 있는 상기 미립자-가용성 β-글루칸 생성물의 이점은 생성물이 분말 형태로 분무 건조된 다음, 이어서 pH 약 5 이상 - 본질적으로 약산 내지 강염기의 용액 중에 재가용화될 수 있다는 것이다. 또한, 재가용화는 대략 실온 (약 25℃) 만큼 낮은 온도, 바람직하게는 대략 실온(약 25℃) 내지 약 60℃의 온도에서 일어난다. 재가용화 후 최종 농도 및 사용된 용매에 따라, 재가용화에 대한 시간 및 온도 요건이 변할 것이다.
생성물의 재가용화 능력은 생성물을 예를 들어 인스턴트 음료 분말에 적합한 인스턴트화 형태의 β-글루칸을 고안하는데 이상적이도록 한다. 간단히, 건조 형태의 미립자-가용성 β-글루칸은 재습윤되어 약 9％ 내지 12％의 수분 함량을 달성하며, 응집체를 형성한다. 레시틴과 같은 계면활성제가 2-유체 노줄을 통해 응집체에 첨가된다. 계면활성제의 농도는 사용된 계면활성제 및 생성물이 최종적으로 용해될 조건 및 용도에 따라 변할 것이다. 이어서, 응집체는 유동층 건조기의 3 단계를 통과한다. 제1 단계는 생성물을 가열하고, 제2 단계는 생성물을 컨디셔닝하고, 제3 단계는 생성물을 냉각시킨다. 생성된 생성물은 체로 걸러져 인스턴트화 제품을 형성한다.
인스턴트화 제품을 형성하는 또다른 방법은 설탕 및 소금 (NaCl)과 같은 제2 건조-형태 가용성 성분을 첨가하는 것이다. 한 예로, 분말화 미립자-가용성 β-글루칸 200 mg 및 수크로스 결정 약 0.5 내지 약 1.0 g을 혼합하고, 모터 볼에서 약 2 내지 3분 동안 분쇄한다. 혼합물을 실온수 500 ml에 첨가하고, 강력하게 진탕한다. 미립자-가용성 β- 글루칸은 재가용화되었다. 동일한 실험을 NaCl을 이용하여 수행하였고, 동일한 결과를 얻었다.
미립자-가용성 β-글루칸 생성물은 가용화 형태이든, 분말화 형태이든, 또는 재가용화 형태이든지 간에 임의의 다수 응용에 사용될 수 있다. 미립자-가용성 β-글루칸은 인간 및 농업/반려/외래 동물에서 사용하기 위한 영양 보충물, 식품 성분, 화장품 성분 및 제약 제품으로서 이용하기에 이상적이다.
건조 또는 습윤 형태의 미립자-가용성 β-글루칸을 첨가할 수 있는 전형적인 식품에는 예를 들어 곡물 및 곡물 제품, 베이킹 제품 및 베이킹 혼합물, 음료 및 음료 기재, 낙농 제품 유사품, 예컨대 대두유, 우유 및 유제품, 식물 단백질 제품, 가공된 과일 및 과일 쥬스, 소프트 캔디, 수프 및 수프 혼합물, 요구르트, 병에 담긴 물 및 드링크, 영양바 등이 포함된다. 필요하다면 다양한 차폐제 및 기타 첨가제를 첨가하여 풍미 및 질감을 개선시킬 수 있다.
액체 형태로 미립자-가용성 β-글루칸을 사용하여 식용 필름을 제조할 수 있다. 액상 제품의 박층을 당업계에 공지된 임의의 다수 수단에 의해 건조시킨다. 첨가제를 액상 제품에 첨가하여 다양한 질감의 필름을 고안해내거나 액상 제품을 다소 유연하게 만들 수 있다. 필름은 제약 또는 보충 제품용 담체로서 유용하다. 여기서 다시, 다양한 차폐제를 첨가하여 필름의 풍미를 개선시킬 수 있다.
미립자-가용성 β-글루칸 생성물은 또한 종래 기술의 미립자 β-글루칸보다 더 효능있을 수 있다. 예를 들어, 생성물은 감염성 질환 또는 암에 대해 더 효과적일 수 있다. 증가된 효능은 보다 나은 흡수, 보다 나은 면역계 증강, 감소된 투여 요법 등의 관점에서일 수 있다.
이를 위해, 시험관내 연구는 미립자-가용성 β-글루칸이 300 μg/mL 이하의 농도에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 TNFα를 유도하지 않는다는 것을 보여주었다. 구체적으로, 인간 PBMC를 5％ 가열-불활성화된 FCS를 함유하는 cRPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 다양한 베타 글루칸 (모두 내독소 무함유), TLR7/8 효능제, 또는 비히클로 촉진하였다. 베타 글루칸을 다양한 농도로 사용하였다. 37℃, 5％ CO2에서 밤새 인큐베이션한 후, 세포-무함유 상청액을 수집하고, ELISA에 의한 시토카인 분석시까지 -20℃에서 저장하였다. 3개의 복제물로부터의 결과를 도 5에 도시하였다. 그래프에 의해 증명된 바와 같이, 전체 글루칸 입자는 TNFα 생성을 촉진한 반면, 미립자-가용성 생성물은 그렇지 않았다. TNFα는 염증 반응에 관여하는 주요 시토카인이므로, 미립자-가용성 생성물은 염증 반응을 유도하지 않는다고 예상된다.
본 발명은 특정 실시양태를 참조로 도시 및 기재되었지만, 당업자는 첨부된 청구의 범위에 포함된 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 일어날 수 있음을 이해할 것이다.
도 1 내지 4는 미립자-가용성 β-글루칸 샘플의 RI 자취 및 데이타 변환이다.
도 5는 다양한 β- 글루칸에 의해 유도되는 TNFα 생성을 나타내는 그래프이다.

Claims (1)

  1. 미립자 β-글루칸을 승압 및 승온에서 가용화하여 미립자-가용성 β-글루칸을 형성하는 방법.
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