KR100485056B1

KR100485056B1 - 효모의 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 항 h1n2형 조류독감 바이러스제

Info

Publication number: KR100485056B1
Application number: KR1020040003621A
Authority: KR
Inventors: 문원국; 김동우; 정봉현; 박정훈
Original assignee: (주)네추럴에프앤피
Priority date: 2004-01-19
Filing date: 2004-01-19
Publication date: 2005-04-22
Also published as: WO2005067940A1; CN1909914A

Abstract

본 발명은 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 수득한 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 조류독감 유래 바이러스의 억제활성을 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머은 세포에 처리시 NO 및 TNF-α의 생성을 증가시켜 간접적인 항 바이러스 효과를 나타내고, 또한 직접적인 항바이러스 효과를 나타내므로 돼지 또는 조류독감 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

Description

효모의 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 항 H1N2형 조류독감 바이러스제{Anti H1N2 type viral composition comprising soluble glucan oligomer of Saccharomyces cerevisiae}

본 발명은 수용성 글루칸 올리고머(soluble glucan oligomer)를 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 수득한 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 조류독감 유래 바이러스의 억제활성을 갖는 조성물에 관한 것이다.

조류독감은 닭, 오리, 칠면조 및 야생조류 등에 감염되는 급성 바이러스성 질병으로 병원성이 없는 것에서부터, 치사율이 100%인 고병원성까지 다양하게 있으며, 고병원성 조류독감(가금인플루엔자)은 국내에서 제1종 법정전염병, OIE(국제수역사무국)에서 List A 전염병으로 분류하고 있다. 원인체인 조류독감 바이러스는 인수(人獸)공통바이러스로, 병원성에 따라 고병원성, 약병원성, 비병원성으로 구분하며 혈청형(HA 단백질 15 종류, NA 단백질 9종류)에 따라 135종류로 분류할 수 있다. 최근 사람에게 전파된 조류독감 바이러스는 예를 들면 H5N1, H9N2이 있다.

조류독감 바이러스는 비말, 공기, 물 등에 의하여 전파되나 주요 전파요인은 오염된 분변인데, 즉, 사람의 손, 발, 사료차, 기구, 장비 등에 분변이 묻어 간접적으로 전파된다.

또한, 조류독감 바이러스가 돼지, 닭 등 중간 숙주를 거쳐 사람에게 감염되는 경우가 있는데, 중간 숙주의 몸 속에서 조류독감 바이러스가 유전자 변이를 일으키고, 변이된 바이러스는 호흡기 감염 등을 통해 사람에게 전파되어 조류독감을 발병시킨다.

이러한 조류독감 바이러스는 혈청형이 다양하고 변이가 심하여 현재까지 효과적인 예방약이 개발되어 있지 않다. 따라서 대부분의 국가에서는 고병원성 조류독감 바이러스에 대하여 살처분 정책을 실시하고 있다. 농가에서는 철저한 출입통제 및 소독 등 차단방역만이 최선의 예방대책이다.

최근에 국내 돼지에서 분리된 돼지 독감 바이러스는 그 아형이 H1N2로 밝혀졌다. 그리고 유전자 분석 결과, H1N2 분리주내의 8개 유전자 분절에서 PA와 PB2 유전자가 조류 독감 바이러스에서 유래된 것으로 확인되었다(K. Jung, and C. Chae., Archives of Virology, in press, 2004). 그 외의 6개의 유전자 중에서 NA와 PB1은 인간 독감 바이러스에서 나머지 HA, M, NP, NS 유전자는 돼지에게서 유래된 것으로 확인되었다. 이것은 이 분리주가 조류 독감 바이러스의 유전자를 일부분 가지고 있음을 증명한다.

한편, 효모와 곰팡이의 세포벽은 베타-글루칸(β-glucan)으로 되어있으며, 이것은 작은 수의 1→6-결합된 분지를 가진 1→3-결합된 글루코피라노실(glucopyranosyl) 잔기로 구성되어있다. β-글루칸은 면역자극제로 활동하는 것으로 알려져있다. 그리고 바이러스 감염시 숙주 방어기전을 강화시킨다. 그리고, 염증반응시 대식세포와 단핵세포에서 분비되는 TNF-α와 유도된 질산(inducible nitric oxide, NO)는 일반적으로 독감 바이러스를 포함한 RNA 바이러스에 대해 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Akaike T, Maeda H, Immunology, 101, pp300-8, 2000; Seo SH and Webster R, Journal of Virology, 76, pp1071-1076, 2002).

이에 본 발명자는 조류독감 바이러스가 중간 숙주를 통하여 유전자를 변이, 전파하여 질환을 발병시키는 경로를 차단하기 위해서, 조류독감 바이러스 유전자가 있는 중간숙주 바이러스에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 항바이러스 효과를 연구한 결과, 효모 β-글루칸의 조류독감 바이러스 유래 돼지독감 바이러스에 대한 직접적, 간접적인 항바이러스 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 분리한 β-글루칸을 처리한 폐포 대식구에서의 TNF-α와 유도성 산화 질소(inducible nitric oxide, NO)의 발현 양상을 비교하고, H1N2 돼지 독감 바이러스에 대한 간접적인 항바이러스 효과와 효모의 β-글루칸 자체의 직접적인 항바이러스 효과를 알아보는 것이다.

본 발명의 목적은 효모 변이주 IS2(KCTC 0959BP)로부터 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 조류독감 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모(Saccharomyces cerevisiae) 변이주(KCTC 0959BP) 세포벽 유래의 불용성 베타-글루칸을 효소로 처리하여 수득된 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 항 H1N2형 조류독감 바이러스제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 효모유래 수용성 글루칸 올리고머는, (a) 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 변이주 IS2(KCTC 0959BP)를 접종용 액체배지에서 배양하는 제 1단계; (b) 상기 효모배양액을 액체배지에 접종하여 유가배양한 후 원심분리로 효모를 수득하는 제 2 단계; (c) 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 효모 IS2 세포벽으로부터 베타글루칸을 추출하는 제 3 단계; (d) 추출한 베타글루칸을 베타-글루칸 분해효소와 반응시킨 후 여과하여 수용성 글루칸 올리고머를 생산하는 제 4 단계; 및 (e) 상기 수용성 글루칸 올리고머를 동결건조하여 건조분말을 수득하는 제 5 단계로 이루어진 공정을 통하여 제조될 수 있다.

더욱 상세하게는 본 발명의 효모 유래 수용성 글루칸 올리고머는,

(a) 효모 IS2(KCTC 0959BP)를 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v% 및 펩톤 0.1 내지 10 w/v%을 함유하는 접종용 액체배지에서 배양하는 제 1 단계; (b) 상기 1단계의 효모배양액을 접종원으로 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v%, 황산암모늄 0.01 내지 2w/v%, 이인산칼륨 0.001 내지 1 w/v% 및 황산마그네슘 0.001 내지 1 w/v%를 함유하고, pH가 5.0 내지 6.0인 초기 액체배지에 0.1 내지 10%(v/v)의 양으로 접종한 후, 온도 30℃, 회전수 100 내지 400rpm, 통기량 0.3 내지 3vvm의 조건으로 12시간 내지 48시간동안 배양하면서, 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v%, 황산암모늄 0.01 내지 2w/v%, 이인산칼륨 0.001 내지 1 w/v% 및 황산마그네슘 0.001 내지 1 w/v%을 함유하는 성장배지를 사용하여 유가배양한 후, 원심분리하여 효모를 수득하는 제 2 단계; (c) 상기 제 2단계에서 수득한 효모에 1 내지 10%의 수산화나트륨 용액을 첨가하여 분산시키고, 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간동안 반응시킨 다음 원심분리하여 고형성분을 수득하는 과정을 1회 내지 5회 반복수행한 후, 수득된 고형성분을 염산 및 황산과 같은 강산을 사용하여 pH 4.0 내지 5.0이 되도록 적정하고, 다시 수산화나트륨 용액에 분산시킨 후, 다시 75℃에서 1시간동안 반응시킨 후 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하고, 고형성분을 1회 내지 5회에 걸쳐 증류수로 세척하여 효모 IS2 세포벽으로부터 함수 베타글루칸을 추출하는 제 3단계; (d) 상기 제 3단계에서 추출한 함수 베타글루칸에 1배 내지 10배의 증류수 및 함수 베타글루칸 무게의 1/20 내지 1/5 부피에 해당하는 베타글루칸 분해효소를 첨가한 후, 30 내지 80℃에서 6 내지 24시간 반응시킨 후, 반응이 종료되면 원심분리하여 상등액만을 회수하고, 회수한 상등액을 한외여과막에서 걸러, 50,000 이하의 분자량을 가지는 글루칸 올리고머만을 포함하는 액상을 수득하는 제 4단계; 및 (e) 얻어진 액상을 -70℃ 이하에서 12시간 내지 48시간 방치한 후, 동결건조하여 수용성 글루칸 올리고머 건조분말을 수득하는 제 5단계로 이루어진 제조공정을 포함하는 제조방법에 의해 수득될 수 있다.

상기 제법으로 제조된 효모변이주(KCTC 0959BP) 유래의 수용성 β-글루칸은 조류독감 바이러스 유래 유전자를 갖는 H1N2 돼지 독감 바이러스에 직접적, 간접적인 증식억제효과를 보여, 돼지독감바이러스 및 조류독감 바이러스에 항 바이러스 활성을 나타낸다.

본 발명은 상기 제법으로 제조된 효모 IS2 (KCTC 0959BP) 유래 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 조류독감 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은 인간 또는 개, 고양이, 소, 돼지 등의 가축에 투여가능하고 가축에 사용시에는 사료에 혼합하는 등의 당업계에 통상적인 투여방법으로 사용이 가능하다.

추가적으로, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 수용성 글루칸 올리고머를 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 분획물과 결합 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 수용성 글루칸 올리고머에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 수용성 글루칸 올리고머의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은 조류독감 바이러스 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 기타 식품의 주, 부원료 및 식품첨가제로서 사용이 가능하다.

또한 본 발명은 수용성 글루칸 올리고머 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 조류독감 바이러스를 억제하거나 상기 바이러스에 의한 질환을 예방 또는 개선을 위한 건강기능성식품을 제공한다.

본 발명의 상기 수용성 글루칸 올리고머는 조류독감 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 효모변이주 IS2의 배양 및 수확

초기배지는 포도당(glucose) 10 g/ℓ, 효모추출물(yeast extract) 6 g/ℓ, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 3 g/ℓ, 이인산 칼륨(K₂HPO₄) 1.5 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO_4·7H₂O) 0.5 g/ℓ의 조성을 가진 액체배양액을 사용하였다.

접종을 위한 접종원의 배양액은 액상 YPD 배지(포도당 20 g/ℓ, 효모추출물 10 g/ℓ, 펩톤(peptone) 20 g/ℓ)를 사용하였고, 성장배지는 포도당 400 g/ℓ, 효모추출물 30 g/ℓ, 황산암모늄 40 g/ℓ, 이인산칼륨 15 g/ℓ, 황산마그네슘 5.7 g/ℓ의 조성을 가진 액체배양액을 사용하였다.

성장배지 2 ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣어 살균한 후, 효모변이주 IS2(KCTC 0959BP) 접종원(seed) 100 ㎖을 접종하고, 회전속도 300 rpm, 통기량 1 vvm, 배양온도 30℃, pH 5.5에서 회분식으로 배양한 후, 성장배지를 공급하는 유가배양을 통해 50-55 g/ℓ에 해당하는 효모균체(DCW, dried cell mass)를 수득하였다.

실시예 2. 효모변이주 IS2로부터 베타글루칸의 추출

상기 실시예 1에서 얻어진 효모균체 80 g을 4% 수산화나트륨(NaOH) 1,000 ㎖에 분산시킨 후, 95℃에서 1시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하였다. 분리된 고형성분을 3% 수산화나트륨 용액 2,000 ㎖에 분산시킨 후, 75℃에서 3시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하였다. 수확된 고형성분을 염산을 사용하여 pH 4.5가 되도록 적정하고, 최종부피 2,000 ㎖에 분산시킨 후, 다시 75℃에서 1시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하고, 고형성분을 3번에 걸쳐 증류수로 세척하여 효모변이주의 세포벽으로부터 160 g의 함수 베타글루칸(wet β-glucan)을 추출하였다.

실시예 3. 효모변이주 IS2 유래의 베타글루칸으로부터 수용성 글루칸 올리고머의 생산

상기 실시예 2에서 얻어진 160 g의 함수 베타글루칸을 1,000 ㎖ 유리용기에 넣고 480 ㎖의 증류수와 함수 베타글루칸 무게의 1/10 부피에 해당하는 베타-글루칸 분해효소(β-glucanase, Novozyme사)를 첨가한 후 40℃에서 15시간 반응시켰다. 반응이 종료되면 7,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액만을 회수하고, 회수한 상등액을 한외여과막(Filtron사, MWCO 10K)에서 걸러, 반응시 사용했던 효소를 제거하고 10,000(dalton) 이하의 분자량을 가지는 글루칸 올리고머만을 포함하는 액상을 수득하였다. 얻어진 액상을 -74℃에서 하루 방치한 후 동결건조하여 수용성 글루칸 올리고머 파우더 5.8 g을 수확하였다.

실험예 1. 수용성 글루칸 올리고머의 폐포대식구에서의 NO 및 TNF-α 생성에 대한 효과

상기 실시예 3에서 수확된 수용성 글루칸 올리고머를 처리한 군과 처리하지 않은 폐포대식구에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 이용하여 폐포대식구가 분비하는 니트릭 옥사이드(nitric oxide, NO) 및 TNF-α(tumor necrosis factor α) 생성의 차이를 비교하였다.

1-1. 세포 배양

1-3일령의 질병이 없는 건강한 자돈을 부검하여 폐장을 무균적으로 적출하였다. 폐장으로부터 PBS를 사용하여 폐포대식구를 추출하고 DMEM 배지(10% FBS, 2× 항균-항진균 용액 포함)를 이용하여 75cm²세포배양 플라스크에 폐포대식구를 부유시켰다. 이때 부유액 일부에서 RNA를 추출하여 7가지 돼지바이러스(Porcine parvovirus, Porcine circovirus type 2, Porcine circovirus type 1, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Japanese encephalitis virus, Encephalomyelocarditis virus, Pseudorabies virus)의 폐포대식구 감염유무를 확인하기 위해 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 검사하였다(Jabrane et al., Can. Vet. J., 35, pp86-92, 1994). 12시간 동안 폐포대식구의 오염유무를 살피고 플레이트에 폐포대식구세포를 접종하기 전 PBS로 2회 가볍게 세척한 후 트립신-EDTA를 이용하여 폐포대식구를 플라스크 표면에서 탈락시켰다. 탈락된 폐포대식구를 24 웰 플레이트에 한 웰당 1 ×10⁶∼10⁷/㎖이 되게 폐포대식구를 준비하였다.

1-2. NO와 TNF-α 생산 유도 및 측정

세포가 준비되면 수용성 글루칸 올리고머를 DMEM 배지로 10mg/㎖이 되게 녹이고 웰 당 5mg/㎖의 농도로 웰에 접종하였다. 24시간 후 H1N2 돼지 독감 바이러스를 웰에 접종하였다. 접종 후 12시간부터 60시간까지 12시간 간격으로 상층액을 수획하여 NO 및 TNF-α를 측정하였다. NO의 농도는 아질산염/질산염 발색 분석 키트 (Nitrate/nitrite colorimetric assay kit, Cayman Chemical Co.)를 사용하여 측정하였고, TNF-α는 돼지 TNF-α ELISA 키트(porcine TNF-α ELISA kit, Endogen Co.)를 이용하여 측정하였다.

도 1에 NO 생산량을 비교한 결과가 나타나있다. 접종 후 12시간부터 실험 종료 60시간까지 수용성 글루칸 올리고머를 처리한 군의 폐포 대식세포의 NO 생산능이 4배에서 5배정도 수용성 글루칸 올리고머를 처리하지 않은 군보다 높았다.

또한, 도 2에서 TNF-α 생산량을 비교하여 보면, 바이러스를 처치한 군에서 접종후 12시간부터 48시간까지 점진적으로 TNF-α의 발현양이 증가하다 접종 후 60시간에는 급속히 감소하였다. 바이러스 및 수용성 글루칸 올리고머 처치군의 TNF-α 발현양이 바이러스만을 투여한 군에 비해 접종 후 48시간에서 유의성있게 높았다 (P<0.05). 그리고 수용성 글루칸 올리고머만을 단독으로 처치한 군과 무처치군(negative)을 비교하였을때 수용성 글루칸 올리고머를 처치한 군이 24시간부터 60시간까지 유의성있게 무처치군에 비해 많은 TNF-α를 분비하였다 (P<0.05).

실험예 2. 수용성 글루칸의 돼지 독감 바이러스에 대한 항바이러스 효과 분석

수용성 글루칸 올리고머를 처리한 폐포대식구의 배양상층액과 글루칸을 처리하지 않은 폐포대식구의 배양상층액을 바이러스와 처리하여 세포에 접종한 후, 바이러스에 의한 세포 변성(cytopathic effect; CPE)을 관찰하여 간접적인 항바이러스 효과(anti-viral effect)를 측정하였다. 또한 글루칸을 바이러스와 함께 직접 세포에 처리하여 직접적인 항바이러스 효과를 측정하였다

2-1. 바이러스 및 세포주 준비

돼지 독감 바이러스(swine influenza virus)는 H1N2 분리주를 사용하였다. TCID₅₀측정 결과는 ㎖ 당 5 × 10^7.5 TCID₅₀이었다.

항바이러스 효과 분석에 사용된 NO는 실험예 1-2를 통하여 얻은 폐포 대식 세포의 상층액을 사용하였다. 실험에 사용하는 세포는 개의 신장 유래 세포인 MDCK(Mardin-Darby Canine Kidney) 세포주를 준비(ATCC, USA)하였다.

2-2. 수용성 글루칸 올리고머의 간접적 항바이러스 효과 측정

세포를 96 웰 플레이트에 단층으로 자라도록 배양하여 준비하였다. NO 처리군은 글루칸(5 mg/㎖) 처리 상층액과 글루칸/LPS 비처리 상층액을 각각 이용하고, 음성대조군에는 각 웰에 DMEM 배지와 글루칸/LPS 비처리 상층액을 사용하였다. 바이러스는 플레이트 웰당 10³, 10², 10 TCID₅₀으로 접종하였다. 바이러스 접종 24시간, 36시간 후에 바이러스에 의한 세포 변성(CPE)을 도립 현미경(inverted microscope)을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 +++ (strongest CPE), ++ (moderate CPE), + (mild CPE), - (no CPE) 4등급으로 나누어 비교하였다(Belaid et al., J. Med. Virol., 66(2), pp229-34, 2002). 각 군마다 연속 3개의 웰에 실시하였고 이들의 평균치를 기록하였다.

접종후 시간

NO 처치군

양성대조군

음성대조군

수용성 글루칸 올리고머/LPS처리상층액

수용성 글루칸 올리고머처리상층액

10^3*

10²

10¹

10³

10²

10¹

10³

10²

10¹

10³

10²

10¹

24

+^**

-

+

-

+++

-

36

++

-

++

+

-

+++

-

^* TCID50 ^**+++ (strong CPE), ++ (moderate CPE), + (mild CPE), - (no CPE)

상기 표 1의 결과를 보면, NO의 생산을 가장 많이 유도하는 수용성 글루칸 올리고머과 LPS로 같이 처리한 폐포대식구 배양액에서 채취한 상층액이 돼지 독감 인플렌자 바이러스의 항바이러스 효과가 가장 높았다. 특히 대조군과 비교하였을 때에도 24시간에서는 가장 바이러스를 많이 투여한 군(10³TCID₅₀)에서도 돼지 독감 인플렌자 바이러스에 의한 세포변성(CPE)을 약 70% 억제하는 효과가 있으며, 접종 36시간이 경과되었을 때에도 약 30%의 억제효과가 지속되는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 소량의 독감 인플렌자 바이러스 투여군(10², 10¹TCID₅₀)에서는 접종 36시간까지 100%의 억제 효과가 관찰되었다.

2-3. 수용성 글루칸 올리고머의 직접적 항바이러스 효과 측정

수용성 글루칸 올리고머의 직접적인 항바이러스 효과를 알아보기 위해, 상기 실시예 3에서 제조된 글루칸 5mg/㎖과 돼지 독감 인플렌자 바이러스와 혼합하여 단층세포에 처치하였다. 바이러스는 플레이트 웰당 10³, 10², 10 TCID₅₀으로 접종하였다. 음성 대조군으로는 글루칸 단독 투여군을 두어 비교하였다. 바이러스 접종 24시간, 36시간 후에 바이러스에 의한 세포 변성(CPE)를 도립 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 +++ (strongest CPE), ++ (moderate CPE), + (mild CPE), - (no CPE) 4등급으로 나누어 비교하였다. 각 군마다 연속 3 개의 웰에 실시하였고 그것의 평균치를 기록하였다.

접종후 시간	수용성 글루칸 올리고머/바이러스 처리군			양성대조군			음성대조군			수용성 글루칸 올리고머 단독 처리군
접종후 시간	10^3*	10²	10¹	10³	10²	10¹	10³	10²	10¹	수용성 글루칸 올리고머 단독 처리군
24	-^**	-	-	+++	+++	+++	-	-	-	-	-	-
36	+	-	-	+++	+++	+++	-	-	-	-	-	-
^* TCID50 ^**+++ (strong CPE), ++ (moderate CPE), + (mild CPE), - (no CPE)

상기 표 2의 결과를 보면, 수용성 글루칸 올리고머 단독으로도 바이러스 접종 24시간까지 바이러스의 양에 상관없이 대조군에 비하여 100% 항바이러스 효과를 관찰했다. 또한 바이러스 접종 36시간 후에도 소량의 바이러스(10², 10¹TCID₅₀) 투여군에서는 100% 항바이러스 효과를, 다량의 바이러스(10³TCID₅₀) 투여군에서는 70%의 항바이러스 효과를 확인하였다.

본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머..........100 ㎎

소디움 메타비설파이트......................3.0 ㎎

메틸파라벤.................................0.8 ㎎

프로필파라벤...............................0.1 ㎎

주사용 멸균증류수.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머..............200 ㎎

유당...........................................100 ㎎

전분...........................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘............................적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머..............100 ㎎

유당...........................................50 ㎎

전분...........................................50 ㎎

탈크...........................................2 ㎎

스테아린산마그네슘.............................적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머..............1000 ㎎

설탕...........................................20 g

이성화당.......................................20 g

레몬향.........................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강식품의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머..............1000 ㎎

비타민 혼합물...................................적량

비타민 A 아세테이트..............70 ㎍

비타민 E.........................1.0 ㎎

비타민 B1........................0.13 ㎎

비타민 B2........................0.15 ㎎

비타민 B6........................0.5 ㎎

비타민 B12.......................0.2 ㎍

비타민 C.........................10 ㎎

비오틴...........................10 ㎍

니코틴산아미드...................1.7 ㎎

엽산.............................50 ㎍

판토텐산 칼슘....................0.5 ㎎

무기질 혼합물....................................적량

황산제1철........................1.75 ㎎

산화아연.........................0.82 ㎎

탄산마그네슘.....................25.3 ㎎

제1인산칼륨......................15 ㎎

제2인산칼슘......................55 ㎎

구연산칼륨.......................90 ㎎

탄산칼슘.........................100 ㎎

염화마그네슘.....................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머............1000 ㎎

구연산.......................................1000 ㎎

올리고당.....................................100 g

매실농축액...................................2 g

타우린.......................................1 g

정제수를 가하여 전체.........................900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기와 같이 효모변이주 IS2 세포벽 유래의 불용성 베타 글루칸을 상업적 사용이 가능한 베타 글루칸 분해효소를 처리하여 분자량이 50,000 이하의 수용성 글루칸 올리고머를 생산하였으며, 생산된 수용성 글루칸 올리고머가 조류독감 바이러스 유전자 조각을 갖는 돼지 독감 바이러스 억제 활성에 탁월한 효능을 보임을 확인하여, 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 조류독감 바이러스와 관련된 질환 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 은 수용성 글루칸 올리고머(GO) 및 바이러스를 처리한 폐포 대식세포의 NO 생산량을 시간별로 측정한 결과 그래프이고,

도 2 는 수용성 글루칸 올리고머(GO) 및 바이러스를 처리한 폐포 대식세포의 TNF-α 생산량을 시간별로 측정한 결과 그래프이다.

Claims

(a) 효모 변이주 IS2(KCTC 0959BP)를 접종용 액체배지에서 배양하는 제 1단계; (b) 상기 효모배양액을 액체배지에 접종하여 유가배양한 후 원심분리로 효모를 수득하는 제 2단계; (c) 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 효모 IS2 세포벽으로부터 베타글루칸을 추출하는 제 3단계; (d) 추출한 베타글루칸을 베타-글루칸 분해효소와 반응시킨 후 여과하여 수용성 글루칸 올리고머를 생산하는 제 4단계; 및 (e) 상기 수용성 글루칸 올리고머를 동결건조하여 건조분말을 수득하는 제 5단계로 이루어진 공정을 통하여 제조되는 50,000 달톤 이하의 수용성 올리고머를 유효성분으로 함유하는 항 H1N2형 조류독감 바이러스제.
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