CN1909914A - 由酿酒酶母is2分离的水溶性葡聚糖低聚物用于预防和治疗禽流感的新应用 - Google Patents

由酿酒酶母is2分离的水溶性葡聚糖低聚物用于预防和治疗禽流感的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过用市售β－葡聚糖水解酶处理由酵母变体IS2细胞壁分离的不溶性β－葡聚糖制备的分子量为1,000～10,000的水溶性葡聚糖低聚物用于制备药物组合物的新用途，所述药物组合物在需要其的哺乳动物(包括人类)中治疗和预防禽流感，因此，它可以被用作治疗和预防禽流感的治疗或者保健食品。

Description

由酿酒酵母IS2分离的水溶性葡聚糖低聚物用于预防和治疗禽流感的新应用
技术领域
本发明涉及由酿酒酵母IS2分离的水溶性葡聚糖低聚物用于制备在需要其的哺乳动物(包括人类)中治疗和预防禽流感的药物组合物的新用途，明确而言，为H1N2型禽流感。
背景技术
多种类型的禽流感，包括非致病性和高致病性禽流感，都是由通过禽类(比如，农场饲养或者在活畜市场中的鸡、鸭、火鸡和野生禽类等等)介导的禽类病毒性感染引起的。在它们之中，高致病性禽流感在韩国已经被认定为第一组法定传染病，和在OIE(Office International des Epizooties)中已被认定为目录A类传染性疾病。所述病原体，即禽流感病毒，一种动物传染病病毒，根据它们的致病性，被划分为高致病性、低致病性和非致病性病毒，并且根据它们的血清型，存在135种病毒，其中包括15种HA蛋白和9种NA蛋白。在那些血清型之中，感染人类的恶性禽病毒(比如H5N1和H9N2亚型)最近已经得到了报道。
禽流感病毒往往通过中间宿主(比如猪、鸡等等)传染人类，通过在宿主中发生遗传突变进行改变，然后突变的病毒通过呼吸道以及其它途径被传染到人类，导致致病性禽流感。
然而，由于禽流感病毒具有许多血清型和表现出频繁的突变，因此迄今为止，尚未研制出预防或者治疗禽流感的有效药剂。据此，大多数受禽流感影响的国家惯常采用大量聚集或者屠宰政策，并且据报道，障碍隔离(比如严禁通行)和消毒是防止禽流感的最佳方式。
最近已经发现，由韩国猪类分离的猪流感病毒亚型是H1N2，并且由H1N2分离株的8个基因片段分离的PA和PB基因都来源于禽流感病毒(K.Jung and C.Chae.，Archives of Virology，印刷中，2004)。据此可以确定H1N2分离株具有禽流感病毒部分。
β-葡聚糖可以从多种资源中分离，比如酵母、微生物、蘑菇、谷物和藻类。迄今为止，它已经以多种产品的形式得到了研究和应用。特别是，由酵母细胞壁获得的β-葡聚糖已经得到了研究和为人们所熟知。
酵母，一种在FDA中被划分为GRAS(公认安全)的微生物，已经用于了包括食品领域的多种领域，并且酵母内细胞膜包括β1，3-和1，6-葡聚糖作为主要主分以及少量的壳质和甘露糖蛋白(mannoprotein)，然而，其外细胞膜包括甘露糖蛋白—一种与甘露聚糖连接的蛋白质。
已经报道，β-葡聚糖—酵母细胞壁的主要组分，通过病毒刺激受感染宿主的免疫系统和加强受感染宿主的预防机能。据报道，在炎症期间由巨噬细胞和单核细胞分泌的TNF-α以及由此诱导的NO(可诱导的氧化氮)可以有效的预防包括禽流感病毒的RNA病毒(Akaike T等，Immunology，101，pp300-308，2000；Seo S.H.等，Journal of Virology， 76，pp1071-1076，2002)。
然而，在上面引用的任何文献中，都没有报道或者公开由酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)分离的特定可溶性葡聚糖低聚物对禽流感的治疗和预防作用，上述文献在此引入作为参考。
本发明发明人致力于通过研究从具体的酵母变异菌株中寻找药理学有效的β-葡聚糖，并且最终，通过确定经提取酵母突变株IS2细胞壁获得的分子量小于50,000D的可溶性葡聚糖低聚物对直接和间接由禽流感病毒衍生的猪流感病毒显示出有效的抗病毒活性，完成了本发明。
本发明的这些目的以及其它目的将根据提供于下文中的本发明详细公开内容而得到明确化。
发明内容
技术问题
根据本发明的一方面，本发明提供了来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的水溶性葡聚糖低聚物用于制备在需要其的哺乳动物(包括人类)中治疗和预防禽流感的药物组合物的用途，明确而言，为H1N2型禽流感。
此外，本发明还提供了包括通过本发明方法制备的可溶性葡聚糖低聚物的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和预防禽流感，明确而言，为H1N2型禽流感。
技术方案
据此，本发明的目的是提供来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的水溶性葡聚糖低聚物用于制备在需要其的哺乳动物(包括人类)中治疗和预防禽流感的药物组合物的用途，明确而言，为H1N2型禽流感。
本发明的另一目的是提供包括由酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)获得的水溶性葡聚糖低聚物的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和预防禽流感，明确而言，为H1N2型禽流感。
在此公开的术语“可溶性葡聚糖低聚物”可以通过以下方式进行制备：
本发明的可溶性葡聚糖低聚物可以通过以下步骤制备：
(a)在肉汤培养基中培养用于接种的酵母(酿酒酵母)变体IS2(KCTC0959BP)；(b)将上述酵母培养液接种至肉汤培养基中，培养并离心处理，得到酵母；(c)将NaOH加入其中，从酵母细胞壁中提取β-葡聚糖；(d)使提取的β-葡聚糖与水解酶反应，然后对其进行过滤，从而获得可溶性葡聚糖低聚物；和(e)最后经冻干法对其进行干燥，从而获得本发明的可溶性葡聚糖低聚物。
上述酵母变体IS2的特征在于治疗和预防禽流感。
通过上述方法制备的可溶性葡聚糖低聚物包括分子量小于50,000的葡聚糖低聚物，优选为1,000～10,000。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物，包括以治疗和预防禽流感(明确而言，为H1N2型禽流感)有效量存在的作为活性成分的通过上述方法获得的来源于酵母变异菌株(KTCT 0959BP)细胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，以及其药学上可接受的载体。
本发明可溶性葡聚糖低聚物可以按照以下优选的实施方案进行制备。
对于本发明，上述可溶性葡聚糖低聚物可以通过以下方法进行制备：
第一步骤，培养酵母IS2(KCTC 0959BP)步骤，包括：将酵母IS2(KCTC0959BP)培养在含有0.5～10w/v％葡萄糖、0.1～5w/v％酵母提取物和0.1～10w/v％胨的液体培养基中；
第二步骤，由酵母培养基中获得酵母的步骤，包括：将由第一步骤制备的酵母培养基以0.1～10％(v/v)的量接种到含有0.5～10w/v％葡萄糖、0.1～5w/v％酵母提取物、0.01～2w/v％硫酸铵、0.001～1w/v％磷酸钾和0.001～1w/v％硫酸镁并且pH值为5.0～6.0的原液体培养基中，在生长培养基中，在速率为100～400rpm、通风气体量为0.3～3vvm、温度为20～40℃下培养12～48小时，然后对其进行离心，从而获得酵母；
第三步骤，从酵母细胞壁中提取湿式β-葡聚糖的步骤，包括：将1～10％的氢氧化钠溶液加入到酵母中，对其进行分散，在70～100℃的温度下使其反应30分钟～5小时，对其进行离心，从而获得干燥的酵母细胞团块(DCW)，此方法可以重复进行若干次并进行收集，使用强酸(比如盐酸和硫酸)将团块的pH值滴定至4.0～5.0，再次将其分散在氢氧化钠溶液中，另外在75℃下反应1小时，对其进行离心，从而将氢氧化钠溶液和固体组分分离；并且最后对固体组分进行洗涤和纯化，从而获得湿式β-葡聚糖；
第四步骤，获得葡聚糖低聚物液体相的步骤，包括：将相当于葡聚糖体积1～10倍(v/v％)的蒸馏水和相当于葡聚糖1/20～1/5倍(v/w％)的β-葡聚糖水解酶加入其中，使其在30～80℃下反应6～24小时，在将反应猝灭之后通过离心回收上层清液，用超滤膜过滤上层清液，从而获得分子量小于50,000的本发明可溶性葡聚糖低聚物溶液。
第五步骤，获得最终可溶性葡聚糖低聚物的无水粉末形式，包括：在低于-70℃下，将由第四步骤制备的低聚物单独放置12小时～48小时，然后将其冻干，从而获得本发明可溶性葡聚糖低聚物的粉末形式。
本发明的另一目的是提供通过如上所述制备方法制备的来源于酵母变体IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，和本发明的另一目的是提供一种药物组合物，包括以治疗和预防禽流感(明确而言，为H1N2型禽流感)有效量存在的作为活性成分的通过上述方法获得的来源于酵母变异菌株(KTCT 0959BP)细胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，以及其药学上可接受的载体。
上述禽流感包括由比如H1N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的禽流感病毒传染所引起的流感，优选为H1N2亚型病毒传染所引起的流感。
本发明的目的是提供包括来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的水溶性葡聚糖低聚物的药物组合物的用途，用于制备在需要其的人类或者哺乳动物中治疗和预防禽流感的治疗剂。
本发明的目的是提供一种在哺乳动物中治疗或者预防禽流感的方法，包括给药所述哺乳动物有效量的本发明组合物的步骤，所述组合物包括来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物及其药学上可接受的载体。
根据所应用的方法，本发明组合物可以另外包括常规的载体、添加剂或者稀释剂。优选所述载体根据应用和用药方法使用适当的物质，但是对其并没有限定。适当的稀释剂列在著作Remington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing co，EastonPA)中。
在下文中，以下制剂方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝非是对本发明进行限定。
根据本发明的组合物可以被提供为药物组合物，其中含有药学上可接受的载体、添加剂或者稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可以另外包括填料、抗粘合剂、润滑剂、润湿剂、增香剂、乳化剂和防腐剂等等。可以通过使用本领域熟知的方法对本发明组合物进行配制，使得它们在给药之后，提供活性成分的快速、缓释或者延迟释放。
例如，可以将本发明组合物溶解于通常用于生产注射剂的油、丙二醇或者其它溶剂中。适宜的载体的实例包括但不限于，生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、十四烷酸异丙酯等。对于局部给药，本发明提取物可以被配制成软膏剂和乳膏剂的形式。
含有生药组合物的药物制剂可以被制备成任何形式，比如口服剂量形式(粉剂、片剂、胶囊、软胶囊、药物水溶液、糖浆剂、酏剂、丸剂、粉剂、小袋、粒剂)或者局部制剂(乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶、香膏、贴片、糊剂、喷雾剂和气雾剂等等)、栓剂或者无菌可注射制剂(液剂、混悬剂、乳剂)。
在药物剂量形式内的本发明组合物可以以它们药学上可接受的盐形式使用，并且还可以单独使用或者适当联合使用，以及可以与其它药学活性成分联合使用。
取决于对象症状和重量、严重程度、药物形式、给药途径和周期，本发明组合物的合意剂量可以不同，并且可以由本领域技术人员选择。然而，为了获得合意的效果，通常建议给药量为按重量计每天0.01～500mg/kg，优选0.1～100mg/kg本发明组合物。所述剂量可以每天单一剂量给药或者分为多个剂量给药。
用于预防和减轻禽流感的药物组合物可以含有约0.1～50w/w％本发明上述来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，以组合物的总重量计。
本发明的药物组合物可以经多种途径给药至对象动物，包括哺乳动物(例如鼠、小鼠、家畜(比如狗、猫、奶牛、猪)和人类。所有给药方式都是本领域熟知的预期方式，例如，可以口服、直肠或者静脉内给药，肌内、皮下、皮内、鞘内、硬膜外或者脑室内注射给药，或者通过与动物饲料联合进食给药。
本发明的另一目的是提供一种用于预防和改善禽流感的保健食品，其中包括主要包括来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的组合物，以及营养学可接受的添加剂。
预防和减轻禽流感的保健食品可以含有约0.01～80w/w％，优选1～50w/w％本发明上述来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，以组合物的总重量计。
本发明提供用于预防和减轻禽流感的保健食品饮料组合物，其中包括来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
可以将上述本发明低聚物组合物加入到预防和减轻禽流感的食品和饮料中。
为了开发保健食品，包括本发明上述低聚物组合物的可添加食品的实例为，例如多种食品、饮料、面包、饼干、果酱、糖果、胶、茶叶、酸奶酪、复合维生素、健康改善食品等等，并且可以被用作粉末、颗粒、咀嚼片、胶囊或者饮料等等。
本发明的发明组合物没有毒性和副作用，因此，可以安全地对它们进行应用。
可以将上述中组合物中加入到食品、添加剂或者饮料中，其中上述低聚物在食品或者饮料中的量，对于保健食品组合物通常为食品总重量的约0.01～80w/w％，每100ml健康饮料组合物通常为0.02～30g，优选0.3～5g的比例。
只要本发明健康饮料组合物以所述比例含有上述低聚物作为主要组分即可，对其它液体组分没有特别限定，其中其它组分可以为多种芳香剂或者天然碳水化合物等等，比如常规的饮料。上述天然碳水化合物的实例为单糖，比如葡萄糖、果糖等等；二糖，比如麦芽糖蔗糖等等；常规的食糖，比如糊精、环糊精；和糖醇，比如木糖醇和赤藻糖醇等等。作为除上述之外的其它芳香剂，天然芳香剂(比如taumatin、甜菊提取物(比如levaudioside A、甘草甜素等))和合成芳香剂(比如糖精、阿斯巴特等等)都可以有利地应用。上述天然碳水化合物的量通常为，每100ml本发明饮料组合物约1～20g，优选5～12g的比例。
除上述组分之外的其它组分是，乳酪巧克力等情形中为多种营养素、维生素、矿物质或者电解质、合成增香剂、着色剂和改善剂；用于碳酸盐饮料等之中的果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、防止胶质粘合剂、pH值控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、碳化剂。除上述组分之外的其它组分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和植物饮料的果汁。
本发明组合物可以在乳酸菌配制饮料或者浆料等等中用作混合剂。
上述组分可以单独使用或者组合使用。
本发明提供了一种保健食品，其中除本发明组合物之外，还包括约0.01～30w/w％的维生素、寡糖和膳食组分。
所述组分的比例并非非常重要，但是相对于每100w/w％本发明组合物，通常为约0.01～30w/w％。其中包括上述提取物的可添加食品的实例包括多种食品、饮料、胶、复合维生素和健康改善食品等等。
本发明组合物还可以另外包括一种或多种有机酸，比如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸；磷酸盐或酯，比如磷酸酯、磷酸钠、磷酸钾、焦磷酸、多磷酸盐；天然抗氧化剂，比如多酚、儿茶素、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、甘草提取物、脱乙酰壳多糖、鞣酸、植酸等等。
对于本领域熟练的技术人员而言，很显然可以对本发明组合物、用途和制剂进行多种改变和变体，这并不背离本发明的精神或者范围。
有益效果
通过用市售β-葡聚糖水解酶处理从酵母变体IS2细胞壁分离的不溶性β-葡聚糖而制备得到分子量小于50,000的本发明可溶性葡聚糖低聚物，对直接和间接由禽流感病毒衍生而来的猪流感病毒表现出有效的抗病毒活性，因此，可以把它用作治疗和预防禽流感的治疗或者保健食品。
附图简述
本发明的上述以及其它目的、特征和其它优点，根据以下详细说明结合附图将得到更清楚地理解，其中：
图1表示腹膜注射后，可溶性葡聚糖低聚物对小鼠淋巴细胞NO产生量的影响；
图2表示当将其腹膜注射至小鼠后，可溶性葡聚糖低聚物对脾细胞中IL-2产生量的影响；
在下文中，本发明将通过以下实施例进行更明确地说明。然而，应当理解，本发明并不以任何方式限于这些实施例。
发明的具体实施方式
以下实施例和试验实施例用来进一步说明本发明，并不限制它的范围。
实施例1酵母变体IS2的培养和采集
将含有10g/l葡萄糖、6g/l酵母提取物、3g/l硫酸铵((NH4)2SO4)、1.5g/l磷酸钾(K2PO4)、0.5g/l硫酸镁(MgSO4·7H2O)的液体培养基用作原代培养基。
液体YPD培养基(葡萄糖20g/l、酵母提取物10g/l、胨20g/l)用于接种，和生长培养基含有400g/l葡萄糖、30g/l酵母提取物、40g/l硫酸铵((NH4)2SO4)、15g/l磷酸钾(K2PO4)和5.7g/l硫酸镁(MgSO4·7H2O)。
热压处理所述生长培养基之后，将100ml培养的酵母变体IS2(KCTC 0959BP)接种其中，在转速300rpm、通风气体量为1vvm、在30℃以及pH值5.5下进行培养，最后通过分批培养获得50～55g/l无水酵母细胞团块(DCW)。
实施例2从酵母变体IS2中提取β葡聚糖
将80g上述实施例1制备的酵母DCW悬浮在1000ml 4％氢氧化钠(NaOH)溶液中，然后在95℃下培养1小时。以2000rpm的速度对培养的悬浮液进行离心15分钟，从而将其分离为NaOH溶液部分和固体部分。
将上面分离的固体部分再次悬浮在2000ml 3％氢氧化钠溶液中，在75℃下培养3小时，然后以2000rpm的速度将其离心15分钟，从而再次将其分离为NaOH溶液和固体部分。
用HCl将合并的固体部分调节至pH4.5，将其分散至最终体积为2000ml，然后在75℃再培养1小时。以2000rpm的速度对培养的悬浮液进行离心，从而将其分离为NaOH溶液部分和固体部分。
所得固体部分用蒸馏水洗涤3次，从而由酵母变体细胞壁获得160g湿式β葡聚糖。
实施例3由酵母变体IS2的β-葡聚糖制备可溶性葡聚糖低聚物
将由实施例2制备的160g湿式β葡聚糖置入1000ml烧瓶中，并且将480ml蒸馏水和相当于1/10葡聚糖(v/w)量的βb-葡聚糖酶加入其中，在40℃下保温15小时。
停止反应之后，在7000rpm下将所得反应混合物离心15分钟，收集上清液。将收集的上清液过滤，并且利用超滤膜(Filtron Co.，MWCO 10K)将未反应的酶除去，从而得到含有分子量小于10,000道尔顿的葡聚糖低聚物的溶液。将所得溶液放置在-74℃下过夜后，将溶液冻干，从而产生5.8g粉末形式的可溶性葡聚糖低聚物。
试验实施例1可溶性葡聚糖低聚物对NO(氧化氮)和TNF-α形成的影响。
通过以下试验，对含有实施例3制备的可溶性葡聚糖低聚物的测试组和对照组对由肺泡巨噬细胞经LPS(脂多糖)处理而引起分泌的NO(氧化氮)和TNF-α的产生量进行确定。
细胞培养
对健康的新离乳的猪进行尸体解剖，并且无菌地取出它们的pneumoenterus。利用PBS将肺泡巨噬细胞从器官中取出，并且用含有10％FBS和2x抗菌-抗真菌溶液的DMEM培养基将巨噬细胞漂浮在尺寸为75cm2的细胞培养瓶中。为了确定巨噬细胞是否被7种猪科病毒，即猪细小病毒、猪科圆环病毒2型、猪科圆环病毒1型、猪科再生和呼吸性综合症病毒、日本脑炎病毒、encephalomyelocarditis病毒和伪狂犬病病毒感染，通过从漂浮溶液中12小时的部分提取RNAs，对其进行PCR(聚合酶链反应)测试，该方法通过文献(Jabrane等人，Can.Vet.J. 35，pp86-92，1994)中公开的方法进行调整。
在将肺泡巨噬细胞接种到板上之前，用PBS溶液洗涤巨噬细胞两次，并且使用胰蛋白酶-EDTA使其从瓶表面脱离。将分离的肺泡巨噬细胞的浓度调节为在24孔板上，每个孔中的浓度为1×106-107/ml/孔。
NO(氧化氮)和TNF-α产生量的确定
将溶于DMEM介质中的10mg/ml水溶性葡聚糖低聚物接种入每个孔中，孔中浓度为5mg/ml。24小时之后，将H1N2猪流感病毒接种入每个孔中。在接种之后，对接种后12～60小时期间的上清液每隔12小时收集一次，从而确定NO(氧化氮)和TNF-α的产生量。NO和TNF-α的浓度通过利用硝酸盐/亚硝酸盐比色定量试剂盒(Cayman Chemical Co.)和猪科TNF-αELISA试剂盒(Endogem Co.)分别进行确定。
根据NO产生量的测定结果，同阴性对照相比较，注入可溶性葡聚糖低聚物的实验组显示出NO产生量升高了4～5倍(参见图1)。
根据TNF-α产生量的测定结果，在病毒处理组中，在接种后12小时～48小时中TNF-α表达升高，在接种60小时后急剧下降。在接种后24～60小时期间内，用水溶性葡聚糖低聚物处理的试验组中TNF-α的表达量显著高于阴性对照(参见图2，P＜0.05)。
试验实施例2可溶性葡聚糖低聚物对猪流感病毒的抗病毒作用
通过用病毒处理肺泡巨噬细胞中培养介质上清液并且将其接种至培养细胞，从而观察由流感病毒引起的细胞致病作用，对试验样品组和阴性对照组的间接抗病毒活性进行测定。通过用流感病毒直接处理样品，对试验样品组和阴性对照组的直接抗病毒活性进行测定。
2-1.病毒和细胞株的制备
将H1N2分离株用作猪流感病毒并且其TCID50值为5×107.5/ml。
将由试验实施例1-2中制备的肺泡巨噬细胞上清液获得的NO用于测定抗病毒活性，并且将由狗肾获得的MDCK(Mardin-Darby Canine Kidney，ATCC)细胞株用于试验。
2-2.抗病毒活性的间接测定
在96孔板中对单层细胞进行培养和生长。将5mg/ml葡聚糖低聚物(GO组)和葡聚糖/LPS(GL组)处理的上清液用作NO处理组。作为阴性对照组，在试验中使用DMEM培养基和葡聚糖/LPS未处理的上清液。所述病毒以多种浓度进行接种，即为103、102、10TCID50/孔。在病毒接种24小时和36小时后，根据文献(Belaid等人，J.Med.Virol.， 66(2)，pp229-34，2002)中公开的方法，通过倒置显微镜对由接种病毒引起的CPE进行确定，并且将结果划分为四个等级，即+++(最强CPE)、++(中等CPE)、+(轻微CPE)和-(无CPE)。每组使用连续三个孔，并且对所得结果值的平均值进行确定。
从表1中可以看出，表现出主要有效NO产生活性的从用葡聚糖低聚物和LPS处理的肺泡巨噬细胞培养介质收集的上清液对猪流感病毒具有主要的有效抗病毒作用。特别是，与对照组相比较，在接种24小时和36小时之后，最大量病毒处理组(103TCID50)显示出更高的抑制活性，由猪流感病毒引起的CPE分别为70％和30％。此外，与对照组相比较，在接种36小时之后，最小量病毒处理组(102和101TCID50)显示出主要的有效抑制活性，由猪流感病毒引起的CPE为约100％。
表1
时间(小时)   NO处理组   阳性对照   阴性对照
  GO组   GP组
  103*   102   101   103   102   101   103   102   101   103   102   101
  24   +**   -   -   +   +   -   +++   +++   +++   -   -   -
  36   ++   -   -   ++   +   -   +++   +++   +++   -   -   -
 *：TCID50 **：+++(强CPE)，++(中等CPE)，+(轻微CPE)，-(无CPE)
2-3.抗病毒活性的直接测定
为了测定水溶性低聚物的直接抗病毒活性，将实施例3制备的5mg/ml葡聚糖和猪流感病毒直接进行混合，并且将其处理入单层细胞内，作为试验组(GV组)。所述病毒以多种浓度进行接种，即为103、102、10TCID50/孔。仅仅用葡聚糖低聚物(G组)处理的组用来与其它对照组相比较。在病毒接种24小时和36小时后，根据文献(Belaid等人，J.Med.Virol.， 66(2)，pp229-34，2002)中公开的方法，通过倒置显微镜对由接种病毒引起的CPE进行确定，并且将结果划分为四个等级，即+++(最强CPE)、++(中等CPE)、+(轻微CPE)和-(无CPE)。每组使用连续三个孔，并且对所得结果值的平均值进行确定。
从表2中可以看出，至24小时为止，同对照组相比较，不论病毒量为多少，仅仅用葡聚糖低聚物(G组)处理的组显示出100％的抗病毒活性。在接种36小时之后，最大量病毒处理组(103TCID50)表现出70％的抗病毒活性，最小量病毒处理组(102和101TCID50)显示出100％的抗病毒活性。
表2
  时间(小时)   GO组   阳性对照   阴性对照   G组
  103*   102   101   103   102   101   103   102   101
  24   --**   -   -   +++   +++   +++   -   -   - - - -
  36   +   -   -   +++   +++   +++   -   -   - - - -
 *：TCID50**：+++(强CPE)，++(中等CPE)，+(轻微CPE)，-(无CPE)
在下文中，本发明将对配制方法和赋形剂的种类进行描述，但是本发明并不局限于它们。代表性的制品实施例如下所述。
粉剂的制备
实施例3的干粉50mg
乳糖100mg
滑石10mg
通过将上述组分混合并且装填密封包装，所述粉末制品得到制备。
片剂的制备
实施例3的干粉50mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
通过将上述组分混合和压片，所述片剂制品得到制备。
胶囊的制备
实施例3的干粉50mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
通过常规的凝胶制备方法将上述组分混合并且装填胶囊，所述片剂制品得到制备。
注射剂的制备
实施例3的干粉50mg
注射蒸馏水最优量
pH值控制剂最优量
通过常规的注射剂制备方法溶解活性组分、将pH值控制至约7.5和随后将所有组分装填入2ml安瓿内并进行灭菌，所述注射剂得到制备。
液剂的制备
实施例3的干粉0.1～80g
食糖5～10g
柠檬酸0.05～0.3％
焦糖0.005～0.02％
维生素C0.1～1％
蒸馏水79～94％
CO2气体0.5～0.82％
通过常规的液剂制备方法溶解活性组分、将所有组分装填并进行灭菌，液剂制品得到制备。
保健食品的制备
实施例3的提取物1000mg
维生素混合物最优量
维生素A醋酸酯70mg
维生素E1.0mg
维生素B10.13mg
维生素B20.15mg
维生素B60.5mg
维生素H10mg
酰胺烟酸1.7mg
叶酸50mg
泛酸钙0.5mg
矿物质混合物最优量
硫酸亚铁1.75mg
氧化锌0.82mg
碳酸镁25.3mg
磷酸二氢钾15mg
磷酸氢钙55mg
柠檬酸钾90mg
碳酸钙100mg
氯化镁24.8mg
上述维生素和矿物质混合物可以以多种方式进行变化。但是，并不能认为这些变体是对本发明精神和范围的背离。
健康饮料的制备
实施例3的干粉1000mg
柠檬酸1000mg
寡糖100g
杏浓缩物2g
牛磺酸1g
蒸馏水900ml
通过常规的健康饮料制备方法溶解活性组分、混合、在85℃下搅拌1小时、过滤和随后将所有组分装填入1000ml安瓿内并进行灭菌，所述健康饮料制品得到制备。
如上所述，在此对本发明进行了上述描述，但是很显然，本发明同样可以在许多方面进行变化。并不能认为这些变体是对本发明精神和范围的背离，这些变体对本领域技术人员都是显而易见的，因此所有上述改变都包括在本发明以下权利要求的范围内。
工业实用性
如本发明发明详述所述，通过用市售β-葡聚糖水解酶处理从酵母变体IS2细胞壁分离的不溶性β-葡聚糖制备得到的分子量为1,000～10,000的可溶性葡聚糖低聚物对直接和间接源于禽流感病毒的猪流感病毒显示出有效抗病毒活性，因此，它可以用作治疗和预防禽流感的治疗或者保健食品。

Claims (6)

1、来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的水溶性葡聚糖低聚物用于制备在需要其的哺乳动物中治疗和预防禽流感的药物组合物的用途，所述哺乳动物包括人类。
2、根据权利要求1的用途，其中所述水溶性低聚物由包括下述步骤的方法制备：
(a)在肉汤培养基中培养用于接种的酵母(酿酒酵母)变体IS2(KCTC 0959BP)；
(b)将上述酵母培养液接种至肉汤培养基中，培养并离心处理，得到酵母；
(c)将NaOH加入其中，从酵母细胞壁中提取β-葡聚糖；
(d)使提取的β-葡聚糖与水解酶反应，并且随后对其进行过滤，从而获得可溶性葡聚糖低聚物；和
(e)最后经冻干法对其进行干燥，从而获得分子量小于50,000的可溶性葡聚糖低聚物。
3、根据权利要求1的用途，其中所述禽流感由H1N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒引起。
4、根据权利要求3的用途，其中所述禽流感由H1N2亚型流感病毒引起。
5、一种药物组合物，含有用于治疗和预防禽流感的来源于酵母变异菌株(KCTC0959BP)细胞壁的作为活性成分的可溶性葡聚糖低聚物。
6、一种用于预防和改善禽流感保健食品，包括如权利要求1所述的来源于酵母变异菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，以及营养学可接受的添加剂。
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