DE69219607T2

DE69219607T2 - Verfahren zur anregung der immunresponz

Info

Publication number: DE69219607T2
Application number: DE69219607T
Authority: DE
Inventors: Ross Clark; Paula Jardieu; Kenneth A Kudsk
Original assignee: Genentech Inc; University of Tennessee Research Foundation
Current assignee: Genentech Inc; University of Tennessee Research Foundation
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2012-06-17
Also published as: US5202119A; WO1993000110A1; CA2109705A1; DE69219607D1; ATE152627T1; DK0602050T3; NO934851L; FI935898A; NZ243232A; EP0602050B1; JPH06508830A; NO934851D0; ES2101106T3; AU655059B2; FI935898A0; EP0602050A1; US5583109A; AU2252592A; GR3024128T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Stimulation der Immunantwort bei Säugern oder Vögeln, einschließlich der Verstärkung der Antikörperantwort auf Antigene bei Patienten mit geschwächten Immunsystemen.
Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I) ist ein Polypeptid, das natürlicherweise in Flüssigkeiten des menschlichen Körpers, z.B. Blut und menschlicher Hirnflüssigkeit, vorkommt. Die meisten Gewebe, und insbesondere die Leber, produzieren IGF-I zusammen mit spezifisch IGF-bindenden Proteinen. Die IGF-I-Produktion steht unter dem dominierenden stimulierenden Einfluß des Wachstumshormons (GH) und einige der IGF- I-bindenden Proteine werden durch GH ebenfalls erhöht. Siehe Tanner et al., Acta Endocrinol., 84: 681-696 (1977); Uthne et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554 (1974)). IGF-I wurde aus Human-Serum isoliert und auf rekombinante Weise produziert. Siehe beispielsweise EP 123228 und 128733.
Human-Wachstumshormon (hGH) ist ein einkettiges Polypeptid, das aus 191 Aminosäuren besteht (Molekulargewicht 21.500). Disulfidbindungen verknüpfen die Positionen 53 und 165 und die Positionen 182 und 189. Niall, Nature, New Biology, 230: 90 (1971). hGH ist ein potentes Anabolikum, insbesondere aufgrund der Retention von Stickstoff, Phosphor, Kalium und Calcium. Die Behandlung von hypophysektomierten Ratten mit GH kann mindestens einen Teil der Wachstumsrate der Ratten wiederherstellen. Moore et al., Endocrinology, 122: 2920-2926 (1988). Zu dessen beeindruckendsten Wirkungen bei hypopituitären (GH-defizienten) Personen zählt das beschleunigte Linearwachstum der Knochenwachstumsplattenknorpel, das zu größerem Wuchs führt. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
Es wurde berichtet, daß, insbesondere bei Frauen nach der Menopause, die GH- Sekretion mit dem Alter abnimmt. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology, 46: 137-142 (1987). Siehe auch Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) und Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Darüber hinaus liegt ein Bericht vor, daß einige Begleiterscheinungen des Alterns, einschließlich verringerter magerer Körpermasse, Erhöhung der Fettgewebemasse und Dünnerwerden der Haut, durch GH-Behandlung dreimal in der Woche verringert werden können. Siehe z.B. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) und den Begleitartikel in derselben Journalausgabe von Dr. Vance (S. 52-54).
Es wurde berichtet, daß die IGF-I-Spiegel bei 20 Monate alten Ratten im Vergleich zu 6 Monate alten Ratten um die Hälfte verringert sind. Takahashi und Meiters, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 186: 229-233 (1987). Siehe auch Florini und Roberts, J. Gerontol., 35: 23-30 (1980); Florini et al., Mech. Ageing Dev., 15: 165-176 (1981); Chatelain et al., Pediatrie, 44: 303-308 (1989); Florini et al., J. Gerontol., 40: 2-7 (1985); Hall und Sara, Clinics in Endocrin. and Metab., 13: 91 (1984); Baxter, Advances in Clinical Chemistry, 25: 49 (1986); Clemmons and Underwood, Clinics in Endocrin. and Metab., 15: 629 (1986); Hintz, Advances in Pediatrics, 28: 293 (Year Book Medical Publishers, Inc., 1981); Johanson und Blizzard, The Johns Hopkins Medical Journal, 149: 115-117 (1981), wobei die letzteren fünf Referenzen niedrige IGF-I-Spiegel bei Männern fortgeschrittenen Alters beschreiben. Bei den Referenzen von Hintz, Clemmons und Underwood, und Baxter handelt es sich um allgemeine Überblicke über IGF-I.
Ferner wurde festgestellt, daß es bei diploiden Human-Fibroblasten, welche imstande sind, in reifen Kulturen in vitro Zyklen zu durchlaufen, wenig Veränderungen bei der Regulation der Wachstumsfraktion durch Trombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) gab, aber eine stark erhöhte IGF-I-Abhängigkeit hinsichtlich der Regulation der Eintrittsrate in die S-Phase. Chen und Rabinovitch, J. Cell. Physiol., 144: 18-25 (1990). Die Autoren schließen daraus, daß das langsamere Wachstum der sich teilenden Population von Zellen in reifen Kulturen in Zusammenhang stehen könnte mit einem Bedürfnis nach IGF-I auf Niveaus, die weit über den normalerweise zur Verfügung gestellten liegen. Dies könnte auf eine Überproduktion des IGF- I-bindenden Proteins, IGFBP-3, und deshalb auf eine Verringerung der IGF-I-Verfügbarkeit für dessen Rezeptor zurückzuführen sein. Goldstein et al., "Cellular and Molecular Applications to Biology of Aging", AFCR Meeting abstract, Seattle, 4.-5. Mai 1991.
Es wurden verschiedene biologische Aktivitäten von IGF-I bei Säugern nicht fortgeschrittenen Alters identifiziert. Beispielsweise senkt IGF-I einem Bericht nach die Blutglucosespiegel bei Menschen. Guler et al., N. Engl. J. Med., 317: 137-140 (1987). Ferner fördert IGF-I das Wachstum in verschiedenen metabolischen Zuständen, die durch niedrige IGF-I-Spiegel gekennzeichnet sind, wie z.B. bei hypophysektomierten Ratten [Skottner et al., J. Endocr., 112: 123-132 (1987)], diabetischen Ratten [Scheiwiller et al., Nature, 323: 169-171 (1986)] und Zwergratten [Skottner et al., Endocrinology, 124: 2519-2526 (1989)]. Das Nierengewicht von hypophysektomierten Ratten erhöht sich nach anhaltenden subkutanen Infusionen von IGF-I wesentlich. Guler et al., Proceedings of the 1st European Congress of Endocrinology, 103: Abstract 12-390 (Kopenhagen, 1987). Die Nieren von Snell-Zwergmäusen und Zwergratten verhielten sich ähnlich. Van Buul-Offers et al., Pediatr. Res., 20: 825-827 (1986); Skottner et al., Endocrinology, supra. Ein weiteres Anwendungsgebiet von IGF-I ist die Verbesserung der glomerulären Filtration und des renalen Plasmaflusses. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989). Die anabole Wirkung von IGF-I bei schnellwachsenden neugeborenen Ratten wurde in vivo demonstriert. Philipps et al., Pediatric Res., 23: 298 (1988). Bei unterernährten, gestreßten, kranken oder geschwächten Tieren sind die IGF-I-Spiegel bekanntermaßen erniedrigt.
GH und IGF-I wurden mit immunregulatorischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Die Immunantwort resultiert aus der Wechselwirkung von Antigenen (fremden oder Nicht-Selbst-Gruppierungen) mit Wirtszellen (Lymphozyten), die auf der Oberflächenmembran spezifische Rezeptoren für diese Antigene tragen. Lymphozyten werden in zwei Hauptklassen, T-Zellen und B-Zellen, eingeteilt.
T-Zellen stammen aus dem Thymus, wo sie reifen und aus Stammzellen des Knochenmarks differenzieren. Die reifen T-Zellen verlassen die Thymusdrüse, um kontinuierlich vom Blut zu Lymphknoten und Milz und zurück zum Blut zu zirkulieren. T- Zellen werden weiter in drei Hauptuntergruppen eingeteilt: T-Helferzellen, T-Suppressorzellen und zytolytische T-Zellen. T-Helferzellen "helfen" anderen Zellen: B-Zellen bei der Sekretion von Antikörpern, zytotoxischen Zellen dabei, funktionsfähig zu werden, und Makrophagen bei deren Aktivierung. Diese Population von T-Zellen trägt den CD&sub4;- Oberflächenmarker, der zur Identifizierung dieser Untergruppe in Gewebe und Blut verwendet wird.
Zytolytische T-Zellen sind verantwortlich für das Abtöten von Target-Zellen, wie z.B. viral infizierten Zellen, Tumorzellen und Allotransplantaten. Suppressor-T-Zellen dienen zur Beschränkung und Beendigung der Immunantwort. Die zytolytischen T-Zell- und Suppressor-T-Zell-Populationen werden durch den CD&sub8;-Oberflächenmarker identifiziert.
Die B-Zellen oder Antikörper-bildenden Zellen stammen ebenfalls aus unreifen Vorläufern, die im Knochenmark gefunden werden. Wenn sie reif sind, wandern die B- Zellen zu allen lymphatischen Organen mit Ausnahme des Thymus. B-Zellen wechselwirken mit Antigenen über an ihre Plasmamembranen gebundene Antikörpermoleküle, welche als Rezeptor-Proteine wirken. Dieses Oberflächen-Immunglobulin wird als Marker zur Identifizierung von B-Zellen im Gewebe und Blut eingesetzt. Nach der Wechselwirkung mit Antigen und T-Helferzellen differenzieren die B-Zellen in Antikörper-bildende Zellen, die Plasmazellen genannt werden. Diese Plasmazellen sekretieren Antikörper in die extrazelluläre Matrix. Der Antikörper diffundiert in Kapillargefäße und zirkuliert mit dem normalen Blutstrom. So reflektiert der Serum-Immunglobulinspiegel die zelluläre Dynamik der Immunantwort.
In vielen Staaten müssen Kinder routinemäßig gegen solche Krankheiten wie Diphtherie, Keuchhusten und Typhus (DPT) sowie Masern, Tetanus, Mumps, Polio und Röteln durch Verabreichung von Vakzinen immunisiert werden. Die B-Zell-Reaktion auf ein Vakzin ist die Produktion geeigneter Immunglobuline, welche Immunität gegen die Krankheit verleihen sollen. Im allgemeinen wird eine spezielle B-Zelle differenziert werden, um einen bestimmten Antikörpertyp zu produzieren, und eine derartige Produktion wird durch die Anwesenheit eines speziellen Antigentyps im Körper veranlaßt. Wenn somit ein Tier oder eine Person einer Anzahl verschiedener Antigene ausgesetzt worden ist, wird das Tier oder der Mensch eine Anzahl verschiedener B-Zellen aufweisen, welche ihre speziellen Immunglobuline produzieren können, wenn das geeignete Antigen vorhanden ist.
In einigen Fällen reicht die Immunantwort auf das Antigen zur Verleihung von Immunität nicht aus. Das bedeutet, es wird eine Menge an Immunglobulinen erzeugt (oder eine Anzahl von B-Zellen aktiviert), welche nicht ausreichend ist, um eine effektive Immunität zu verleihen.
Es ist seit 1967 bekannt, daß eine Verbindung zwischen dem Hypophysenvorderlappen und dem Immunsystem besteht, und insbesondere mit GH. Zwei Forschergruppen schlossen aus ihren Studien, daß GH das Wachstum von lymphatischem Gewebe kontrolliert. Pierpaoli und Sorkin, Nature, 215: 834 (1967); Baroni, Experientia, 23: 282 (1967). Anschließend wurde die immunologische Funktion bei der pituitären Zwergmaus durch eine Kombination von Rindersomatropin und Thyroxin wiederhergestellt. Baroni et al., Immunol., 17: 303-314 (1969).
Bei einem Geschlechtschromosom-bedingten Zwerghühnchenstamm resultierte die Behandlung mit Rinder-GH in erhöhten Antikörperantworten und Schleimbeutelwachstum, während die Thyroxinbehandlung das Thymuswachstum stimulierte. Marsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 175: 351-360 (1984). Keine der Behandlungen veränderte jedoch die Immunfunktion bei autosomalen Zwerghühnchen. Die Therapie mit Rinder- GH allein stellte die immunologische Funktion bei immundefizienten Weimaraner Hunden teilweise wieder her. Roth et al., Ann. J. Vet. Res., 45: 1151-1155 (1984).
Mäuse mit erblicher GH-Defizienz entwickeln eine Beeinträchtigung des Immunsystems, die mit Thymusatrophie, Immundefekt und Auszehrung assoziiert ist, was zu einer verkürzten Lebenserwartung führt. Frabris et al., Clin. Exp. Immunol., 9: 209- 225 (1971). Es wurde gezeigt, daß eine mit dem Alter verbundene Abnahme der Plasmakonzentration von Thymulin (einem Thymus-Hormon) auftritt und daß die Plasma-Thymulinkonzentration bei bGH-behandelten Hunden mittleren Alters und bGH-behandelten alten Hunden zunimmt. Goff et al., Clin. Exp. Immunol., 68: 580-587 (1987). Die Verfasser äußern die Ansicht, daß exogenes GH zur Wiederherstellung einiger Immunfunktionen bei Personen fortgeschrittenen Alters geeignet sein könnte. Ferner wurde festgestellt, daß die Verabreichung von hGH an C&sub5;&sub7;/B1/6J-Mäuse die hemmende Wirkung von Prednisolon auf den Zellreichtum von Thymus und Milz und auf die Aktivität natürlicher Killerzellen rückgängig machte; die Verabreichung von hGH ohne Prednisolon hatte keine Wirkung, obwohl sie bei höheren Dosen eine Abnahme der Thymus-Parameter und der Aktivität natürlicher Killerzellen ohne Auswirkung auf den Zellreichtum der Milz und die relativen Gewichte induzierte. Franco et al., Acta Endocrinologica, 123: 339- 344 (1990).
Es ist ebenfalls gezeigt worden, daß GH die T-Zell-Proliferation im Thymus induziert. Murphy et al., FASEB Meeting Abstract, Atlanta, April 1991; Durum et al., FASEB Meeting Abstract, Atlanta, April 1991. Für jüngere Überblicke hinsichtlich der Immunwirkungen von GH siehe Kelley, "Growth Hormone in Immunobiology", in Psychoneuroimmunology II, 2. Aufl., B. Ader et al., Hrsg., Acad. Press 1990, und Ammann, "Growth Hormone and Immunity", in Human Growth Hormone--Progress and Challenges, L. Underwood, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, (1988), S. 243- 253; Weigent und Blalock, Prog. NeuroEndocrinImmunology, 3: 231-241 (1990). Es wurde berichtet, daß die Aktivität aller hauptsächlichen Immunzelltypen, einschließlich T-Zellen, B-Zellen, natürlicher Killer (NK)-Zellen und Makrophagen, durch GH verändert werden kann. Kelly, Biochem. Pharmacol., 38: 705 (1989).
Ein Bericht stellt fest, daß lokal erzeugter IGF-I die GH-Wirkung auf T-Lymphozyten durch den IGF-Rezeptortyp I vermittelt. Geffner et al., J. Clin. Endocrin. and Metab., 71: 464 (1990). Franco et al. vermuten auf Seite 343 auch, daß einige der Wirkungen von hGH auf das Immunsystem über IGF-I geschehen. Timsit et al., 73rd Annual Meeting, Endocrine Society, 19.-22. Juni 1991, Abstract 1296, berichten, daß hGH und IGF-I die Thymushormonfunktion stimulieren.
Es wurden Daten veröffentlicht, welche die Fähigkeit von Zellen des Immunsystems zur Produktion IGF-I-ähnlicher Moleküle dokumentieren. Diese umfassen aktivierte alveolare Makrophagen [Rom et al., J. Clin. Invest., 82: 1685 (1988)], Human-B-Lymphozyten, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert worden waren [Merimee et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 69: 978 (1989)], Milz- und Thymusgewebe durch Nachweis von mRNA für IGF-I [Murphy et al., Endocrinology, 120: 1279 (1987)], und normale T-Zellen [Geffner et al., supra].
Es wurden auch Daten präsentiert, welche nahelegten, daß lokal in Geweben wie dem Thymus oder an Entzündungsstellen produzierter IGF-I das Wachstum und die Funktion von IGF-I-Rezeptor-tragenden T-Lymphozyten beeinflussen könnte. Tapson et al., J. Clin. Invest., 82: 950-957 (1988). Eine statistisch signifikante Erhöhung des Thymus- und Milzgewichts von hypophysektomierten Ratten, die 18 Tage lang eine IGF- I-Infusion erhielten, wurde im Vergleich zur Kontrolle oder Behandlung mit GH beobachtet. Froesch et al., in Growth Hormone Basic and Clinical Aspects, Hrsg. O. Isaksson et al., S. 321-326 (1987). Ebenfalls festgestellt wurde eine Zunahme des Thymusgewebes bei jungen GH-defizienten Ratten, die mit IGF-I behandelt worden waren [Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893 (1988)] und eine Zunahme der Milz von Zwergratten [Skottner et al., Endocrinology, supra]. Andere zeigten eine Wiederbevölkerung des atrophierten Thymus bei diabetischen Ratten bei Einsatz von IGF-I oder Insulin; wurden die Ratten jedoch mit Rinderserumalbumin (BSA) immunisiert und einer Auffrischungsgabe ausgesetzt, zeigten die Serum-Anti-BSA-Antikörper keine Wirkung des Insulins oder IGF-I auf die Antikörperantwort, trotz großer Auswirkungen auf die Größe von Thymus und Milz. Binz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87: 3690-3694 (1990). Es wurde berichtet, daß IGF-I die Lymphozyten-Proliferation stimuliert (Johnson et al., Endocrine Society 73rd Annual Meeting, Abstract 1073, 19.-22. Juni 1991).
Ferner wurde IGF-I befunden, die Markhöhle wieder mit hämopoetischen Zellen zu bevölkern [Froesch et al., supra], die Erythrozytenbildung bei hypophysektomierten Ratten zu stimulieren [Kurtz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85: 7825-7829 (1988)] und die Reifung von morphologisch erkennbaren Granulozyten- und Erythrozyten-Vorläufern in Suspensionskulturen von Knochenmarkszellen zu erhöhen. Merchav et al., J. Clin. Invest., 81: 791 (1988).
Bei nanomolaren Konzentrationen ist IGF-I ein wachstumsfördernder Faktor für Lymphozyten. Schimpff et al., Acta Endocrinol., 102: 21-25 (1983). B-Zellen, jedoch nicht T-Zellen, wurden kürzlich befunden, Rezeptoren für IGF-I zu besitzen. Stuart et al., J. Clinical Endo. and Met., 72: 1117-1122 (1991). IGF-I stimuliert als Chemotaktikum für ruhende und aktivierte T-Zellen auch eine Erhöhung der Thymidin-Inkorporation in ruhende und aktivierte T-Zellen. Normale T-Zellinien zeigen eine Steigerung der basalen Koloniebildung als Antwort auf IGF-I. Geffner et al., supra. Es wird auch auf Seite 955 von Tapson et al., J. Clin. Invest., 82: 950-957 (1988) festgestellt, daß lokal in Geweben wie dem Thymus oder Entzündungsstellen erzeugter IGF-I das Wachstum und die Funktion von IGF-I-Rezeptor-tragenden T-Lymphozyten beeinflussen könnte. Es wird jedoch berichtet, daß IGF-I in dosisabhängiger Weise IL-2-induzierte proliferative Antworten und in vitro-Antikörperantworten von Splenozyten unterdrückt. Hunt und Eardley, J. Immunol., 136: 3994-3999 (1986).
Im Stand der Technik besteht ein Bedarf für die Bereitstellung eines Reagenzes, welches das Immunsystem eines Säugers oder Vogels stimulieren wird, ganz gleich, ob die Immunantwort zellvermittelt oder antikörpervermittelt ist. Es besteht ein besonderes Bedürfnis für ein Reagenz, welches die Antikörperantwort von Patienten mit beeinträchtigten Immunsystemen gegen Antigene, denen sie ausgesetzt sind, verstärkt. Angesichts des kontroversen Standes der Technik bezüglich IGF-I ist es unklar, worin dessen Wirkungen bei der Erhöhung der Immunfunktion bestehen würde, ob in der bloßen Erhöhung der Größe von Organen, die an der Immunfunktion beteiligt sind, wie z.B. Thymus und Milz, oder im Gegensatz dazu in der Erhöhung der Aktivität von T- oder B-Zellen in vitro oder in vivo.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Immunantwort eines Säugers oder Vogels zu stimulieren.
Es ist eine spezielle Aufgabe, die Produktion von Immunglobulinen zu erhöhen durch die Erhöhung der Anzahl von Immunglobulin-produzierenden Zellen und/oder durch Erhöhung der Menge an Immunglobulin, welche von den individuellen Immunglobulin-produzierenden Zellen als Antwort auf das vorherbestimmte Immunogen produziert wird.
Eine noch speziellere Aufgabe ist die Verstärkungvon Antikörperantworten bei Patienten mit ernsthaft beeinträchtigten Immunsystemen, wie z.B. Patienten, welche Knochenmarkstransplantationen erhalten, oder bei AIDS-Patienten.
Diese und andere Aufgaben werden für Durchschnittsfachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von IGF-I zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation des Immunsystems eines Säugers oder eines Vogels.
In einem spezielleren Aspekt der Erfindung verstärkt das Medikament die Antikörperantwort eines Säugers oder eines Vogels auf ein Immunogen. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung des Medikaments und des Immunogens gleichzeitig und es folgen Imnunogenauffrischungen ("boosts") in kürzeren Abständen als wenn kein IGF-I gegeben wird.
Die gemeinsame Verabreichung von diesem Medikament und GH zur Stimulation des Immunsystems wird ebenfalls in Betracht gezogen.
In einem noch weiteren Aspekt erhöht das Medikament die Menge an Immunglobulin, die von B-Zellen eines Menschen oder eines anderen Säugers als Antwort auf ein Immunogen produziert wird, wobei der Betroffene unter einem Zustand leidet, in dem eine unzureichende Immunglobulin-Produktion vorliegt.
In einem noch weiteren Aspekt erhöht das Medikament die T-Zell-Ansprechbarkeit bei einem Menschen oder einem anderen Säuger als Antwort auf ein Immunogen (wobei dieser unter einem Zustand leidet, in dem eine unzureichende T-Helfer-Aktivität oder zytolytische T-Aktivität vorliegt).
Obwohl obenerwähnte jüngere Studien bei lebenden Tieren gezeigt haben, daß IGF-I erhöhte Milz- und Thymusgewichte bei GH-defizienten Tieren verursachen kann, sind diese Studien nicht über die Beschreibung einer allgemeinen Veränderung der Thymus- und Milzgröße oder der Zellanzahl hinausgekommen. Es ist gezeigt worden, daß andere Manipulationen der Größe der Milz und des Thymus nicht mit einer Auswirkung auf die Funktion verbunden sind. Jardieu und Fraker, J. Immunol., 124: 2650-2655 (1980). Ferner wurde im oben zitierten Artikel von Binz et al. ein Diabetikerratten- Modell eingesetzt, bei dem Insulin und IGF-I die Diabetes beeinflussen und deshalb alle Gewebe im Körper unterstützen wurden, und es wurde festgestellt, daß IGF-I und Insulin keine funktionelle Wirkung auf den Antikörper-Titer haben.
Angesichts dieses Standes der Technik repräsentiert die vorliegende Erfindung insofern einen unerwarteten Befund, als sich nach Verabreichung von IGF-I nicht nur die Milz- und Thymusgewichte erhöhten, sondern auch die Funktion des Thymus, der Milz oder der Lymphknoten, wie angezeigt durch eine erhöhte Splenozytenzahl, Größe der T- Zell-Population in der Milz, Anzahl der B-Zellen in der Milz und deren Antworten auf Mitogene in vitro. Es wird nun gezeigt, daß die Erhöhung der Anzahl der B-Zellen und der Ansprechbarkeit zu einer erhöhten Antikörperproduktion durch diese Zellen als Antwort auf ein Antigen führt. Dieses Verfahren wäre geeignet zur Behandlung von Patienten, die beeinträchtigte Immunsysteme aufweisen, wie z.B. AIDS-Patienten, bei denen die erhöhte Antikörperantwort auf Antigene Infektionen abwehren oder deren Schwere mindern würde und bei denen Vakzine wirksamer gemacht werden könnten. Wo immer IGF-I eingesetzt wird, steht vernünftigerweise zu erwarten, daß IGF-II eine ähnliche Funktion haben wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine graphische Darstellung des Milzgewichts von Zwergratten nach 7 Tagen unterschiedlicher Dosen von IGF-I, die mittels einer Minipumpe verabreicht wurden.
Die Figuren 2A und 2B repräsentieren graphische Darstellungen des Milz-zu- Körper-Gewichtsverhältnisses und Thymus-zu-Körper-Gewichtserhältnisses bei hypophysektomierten Ratten, die mittels einer Minipumpe 7 Tage lang mit IGF-I oder des-IGF- I behandelt wurden.
Figur 3 repräsentiert eine graphische Darstellung des Milz-zu-Körper-Gewichtsverhältnisses von erwachsenen weiblichen Ratten, die 14 Tage lang mit IGF-I behandelt wurden.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Körpergewichtszunahme bei Ratten fortgeschrittenen Alters, die mit Trägersubstanz, IGF-I, hGH oder IGF-I plus hGH behandelt wurden.
Die Figuren 5A, 5B und 5C zeigen graphische Darstellungen der Splenozytenzahl, der Größe der T-Zellpopulationen in der Milz, bzw. der Anzahl der B-Zellen in der Milz nach 7-tägiger IGF-I-Behandlung oder Trägersubstanz-Behandlung.
Figur 6 zeigt eine graphische Darstellung der Thymozytenzahl nach 7-tägiger IGF- I-Behandlung oder Trägersubstanz-Behandlung.
Figur 7 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten sieben Tage nach der ersten Trägersubstanz- oder IGF-I-Behandlung von Mäusen unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 7A), Con A (Fig. 7B) oder PWM (Fig. 7C).
Die Figuren 8A, 8B und 8C zeigen graphische Darstellungen der Splenozytenzahl, der Größe der T-Zellpopulationen in der Milz bzw. der Anzahl der B-Zellen in der Milz nach 14-tägiger IGF-I-Behandlung oder Trägersubstanz-Behandlung.
Figur 9 repräsentiert eine graphische Darstellung der Thymozytenzahl nach 14- tägiger IGF-I-Behandlung, hGH-Behandlung, IGF-I-Kontrollbehandlung und hGH-Kontrollbehandlung.
Figur 10 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten 14 Tage nach der ersten Trägersubstanz- oder IGF-I- oder hGH-Behandlung von Mäusen unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 10A), Con A (Fig. 10B) oder PWM (Fig. 10C).
Die Figuren 11A, 11B und 11C zeigen graphische Darstellungen der Splenozytenzahl, Größe der T-Zell-Populationen in der Milz bzw. der Anzahl der B-Zellen in der Milz nach 14-tägiger Behandlung mit Trägersubstanz, IGF-I, hGH und IGF-I plus hGH.
Figur 12 repräsentiert eine graphische Darstellung der Thymozytenzahl nach 14- tägiger IGF-I-Behandlung, hGH-Behandlung und IGF-I plus hGH-Behandlung.
Die Figuren 13A, 13B und 13C repräsentieren graphische Darstellungen der Splenozytenzahl, Größe der T-Zell-Subpopulationen in der Milz bzw. Anzahl der B- Zellen in der Milz 7 Tage nach dem Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- und IGF- I plus hGH-Behandlung.
Figur 14 repräsentiert eine graphische Darstellung der Thymozytenzahl 7 Tage nach dem Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- und IGF-I plus hGH-Behandlung.
Figur 15 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten 7 Tage nach Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- oder IGF-I plus hGH-Behandlung von Mäusen unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 15A), Con A (Fig. 15B) oder PWM (Fig. 15C).
Die Figuren 16A und 16B repräsentieren graphische Darstellungen der Lymphknoten-Zellanzahl bzw. der Lymphknoten-T-Zellpopulationen 7 Tage nach Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- und IGF-I plus hGH-Behandlung.
Die Figuren 17A, 17B und 17C zeigen graphische Darstellungen der Lymphozytenzahl in der Milz, Größe der T-Zellpopulationen in der Milz bzw. Anzahl der B-Zellen in der Milz 21 Tage nach Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- und IGF-I plus hGH- Behandlung.
Figur 18 repräsentiert eine graphische Darstellung der Thymozytenzahl 21 Tage nach Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- und IGF-I plus hGH-Behandlung.
Figur 19 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten 21 Tage nach Ende der Trägersubstanz-, IGF-I-, hGH- oder IGF-I plus hGH-Behandlung von Mäusen unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 19A), Con A (Fig. 19B) oder PWM (Fig. 19C).
Figur 20 zeigt die Konzentration von Anti-Dinitrophenyl-Ovalbumin-IgG (Fig. 20A) und Gesamt-IgG (Fig. 20B) in µg/ml im Serum von Mäusen als Funktion der Wochenzahl seit der ersten Immunisierung mit Dinitrophenyl-Ovalbumin-Konjugat (Tag 0, als AG bezeichnet), wobei in Woche 3 (Tag 20) die Mäuse eine Auffrischung des Konjugats erhielten und Trägersubstanz oder IGF-I bekamen.
Figur 21 zeigt die Gewichtszunahmeveränderungen für Mäuse mit und ohne transplantiertem(s) Knochenmark, die mit Trägersubstanz oder 40 µg oder 120 µg IGF- I behandelt worden waren.
Die Figuren 22A, 22B und 22C zeigen graphische Darstellungen von B-Zellen, T-Zell-Subpopulationen bzw. des H/S-Verhältnisses peripherer Blut-Lymphozyten 14 Tage nach der Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren.
Die Figuren 23A, 23B und 23C zeigen graphische Darstellungen der Milzlymphozytenzahl, T-Zell-Subpopulationen in der Milz bzw. Anzahl der B-Zellen in der Milz 14 Tage nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren.
Figur 24 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten 14 Tage nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren, unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 24A), Con A (Fig. 24B) oder PWM (Fig. 24C).
Die Figuren 25A, 25B und 25C zeigen graphische Darstellungen von B-Zellen, T-Zell-Subpopulationen bzw. des H/S-Verhältnisses peripherer Blut-Lymphozyten 21 Tage nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren.
Die Figuren 26A, 26B und 26C zeigen graphische Darstellungen der Gesamt- Splenozytenzahl, T-Zell-Subpopulationen und Anzahl der B-Zellen in der Milz 21 Tage nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren.
Figur 27 repräsentiert eine graphische Darstellung der mitogenen Antworten 21 Tage nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren, unter Einsatz der Mitogene LPS (Fig. 27A), Con A (Fig. 27B) oder PWM (Fig. 27C).
Figur 28 repräsentiert eine graphische Darstellung der Thymus-Lymphozytenzahl 14 Tage (Fig. 28A) oder 21 Tage (Fig. 28B) nach Bestrahlung von Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Trägersubstanz, 40 µg IGF-I oder 120 µg IGF-I behandelt worden waren.

Definitionen

"Stimulation eines Immunsystems", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Erhöhung der Immunfunktion eines Säugers oder Vogels, ganz gleich, ob die Erhöhung antikörpervermittelt oder zellvermittelt ist und ob das Immunsystem dem mit IGF-I behandelten Wirt endogen ist oder von einem Donor auf den Wirtsempfänger, dem IGF- I gegeben wird, übertragen wurde (z.B. Knochenmarkstransplantationen). Beispielsweise kann die Stimulation aus einer erhöhten Anzahl von Milzzellen wie der Milzlymphozytenzahl, Größe der T-Zellpopulationen in der Milz (T-Zelle, CD&sub4; und CD&sub8;) oder Anzahl der B-Zellen in der Milz oder aus einer erhöhten Zahl von Thymozyten resultieren. Andere Zellen, die bei der Antwort des Immunsystems beteiligt sind, umfassen natürliche Killerzellen, Makrophagen und Neutrophile. Darüber hinaus kann die Stimulation auf einer Erhöhung der Antikörperproduktion als Antwort auf ein Immunogen beruhen.
Wie hier verwendet, bezeichnen die Ausdrücke "beeinträchtigtes Immunsystem" und "Zustand, in dem eine unzureichende Immunglobulinproduktion vorliegt" das Immunsystem von Menschen wie auch von Tieren, welche eine geringere Antikörperantwort gegen Antigene als normal aufweisen, sei es, weil ihre Milzgröße kleiner ist als sie sein sollte, sei es, daß die Milz nur teilweise funktionsfähig ist, sei es, daß Medikamente wie Chemotherapeutika die normale Immunfunktion unterdrücken, sei es, daß das Lebewesen funktionell IGF-I- oder (GH-) defizient ist, oder aufgrund irgendeines anderen Faktors. Beispiele umfassen Patienten fortgeschrittenen Alters, Patienten, die eine Chemotherapie oder Strahlungstherapie erfahren, von einer schweren Krankheit rekonvaleszieren oder dabei sind, sich einem Eingriff unterziehen, Patienten mit AIDS, Patienten mit angeborenen und erworbenen B-Zelldefekten wie Hypogammaglobulinämie, allgemeine variable Agammaglobulinämie und selektive Immunglobulin-Defekte, z.B. IgA-Mangel, Patienten, die mit einem Virus wie Rabies mit einer kürzeren Inkubationszeit als die Immunantwort des Patienten infiziert sind, und Patienten mit Erbkrankheiten wie DiGeorge- Syndrom. Die hier potentiell betroffenen Säuger und Vögel umfassen Säuger und Vögel von wirtschaftlicher Bedeutung wie Rinder, Schafe und Schweine sowie Hühner und Puten. Die Säuger können eine Milzatrophie und als Folge eine Verminderung von Anzahl und Funktion der B-Zellen aufweisen. Der hier bevorzugte Säuger ist ein Mensch.
Wie hier verwendet, bezieht sich "IGF-I" auf Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor beliebiger Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd, Vogel und vorzugsweise Mensch, in Form der nativen Sequenz oder einer Variante, und beliebiger Herkunft, sei sie natürlich, synthetisch oder rekombinant. Zur Anwendung bei Tieren bevorzugt ist hier die IGF-I-Form der speziellen behandelten Spezies, z.B. Schweine-IGF-I zur Behandlung von Schweinen, Schaf-IGF-I zur Behandlung von Schafen, Rinder-IGF-I zur Behandlung von Rindern, etc. Zur Anwendung beim Menschen bevorzugt ist hier reifer Human- IGF-I der nativen Sequenz, noch bevorzugter ohne ein N-terminales Methionin, hergestellt z.B. durch das in EP 230,869, veröffentlicht am 5. August 1987; EP 128,733, veröffentlicht am 19. Dezember 1984; oder EP-288,451, veröffentlicht am 26. Oktober 1988, beschriebene Verfahren. Noch bevorzugter wird dieser IGF-I mit nativer Sequenz auf rekombinante Weise produziert und ist von Genentech, Inc., South San Francisco, CA für klinische Untersuchungen erhältlich. Ebenfalls zur Anwendung bevorzugt ist IGF- I mit einer größeren spezifischen Aktivität als etwa 14.000 Einheiten/mg, wie bestimmt durch einen Radiorezeptor-Assay unter Verwendung von Plazenta-Membranen, z.B. derjenige, welcher von KabiGen AB, Stockholm, Schweden erhältlich ist.
Die am meisten bevorzugten IGF-I-Varianten sind die in PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26. Februar 1987, und in PCT WO 89/05822, veröffentlicht am 29. Juni 1989, offenbarten, d.h. diejenigen, bei denen mindestens der Glutaminsäurerest an Position 3 des N-Terminus des reifen Moleküls fehlt, oder diejenigen mit einer Deletion von bis zu 5 Aminosäuren am N-Terminus. Die am meisten bevorzugte Variante weist eine Deletion der ersten drei Aminosäuren des N-Terminus auf (unterschiedlich als Hirn- IGF, tIGH-I, des(1-3)-IGF-I oder des-IGF-I bezeichnet).
"GH", wie hier verwendet, bezieht sich auf Wachstumshormon von irgendeiner Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd, Vogel und vorzugsweise Mensch (hGH) in Form der nativen Sequenz oder einer Variante und beliebiger Herkunft, sei sie natürlich, synthetisch oder rekombinant. Dies umfaßt sowohl met-hGH [U.S. 4,755,465, erteilt am 5. Juli 1988, und Goeddel et al., Nature, 282: 544 (1979)], das unter der Marke PROTROPIN von Genentech Inc. vertrieben wird und mit Ausnahme der Anwesenheit eines N-terminalen Methioninrests mit dem natürlichen Polypeptid identisch ist, als auch rekombinantes hGH (rhGH), für klinische Forscher und Grundlagenforscher von Genentech, Inc. unter der Marke NUTROPIN erhältlich, und im Handel erhältlich von Eli Lilly, dem dieser Methioninrest fehlt und eine mit dem natürlichen Hormon identische Aminosäuresequenz aufweist. Siehe Gray et al., Biotechnology, 2: 161 (1984). met- hGH und rhGH weisen beide äquivalente Wirkungen und pharmakokinetische Werte auf. Moore et al., supra. Ein weiterer geeigneter hGH-Kandidat ist eine hGH-Variante, die eine Plazenta-Form von GH mit rein somatogener und keiner laktogenen Aktivität darstellt. US-Patent Nr. 4,670,393, erteilt am 2. Juni 1987.
Der Ausdruck "Verstärkung der Antikörperantwort auf ein Immunogen", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Erhöhung des Serum-Immunglobulin(IgG)-Titers eines Lebewesens in Antwort auf eine Auffrischungsgabe des Antigens, gegen welches das IgG gerichtet ist. Indikatoren einer verstärkten Antikörperantwort umfassen einen Anstieg in der Produktion von Antikörpern gegen Auffrischungsimpfungen des Immunogens sowie eine Erhöhung der Anzahl von B-Zellen beim Patienten. Das Immunogen kann jedes sein, welches dagegen gerichtete Antikörper induziert, ist jedoch vorzugsweise ein Virus, einschließlich eines Vakzins, oder ein Bakterium. Die Erfindung ist besonders geeignet für solche Fälle, in denen der Säuger oder Vogel mit einem Virus infiziert ist, welches eine kürzere Inkubationszeit als die Immunantwort des Säugers oder Vogels aufweist, z.B. Rabies. Der IGF-I verringert hier das Intervall zwischen primären und sekundären Immunisierungen oder zwischen sekundärer Immunisierung und nachfolgenden Immunogenauffrischungen.
Der Ausdruck "Erhöhung der T-Zell-Ansprechbarkeit für ein Immunogen", wie hier verwendet, bei einem betroffenen Lebewesen, das unter einem Zustand leidet, in dem unzureichende T-Helfer-Aktivität oder zytolytische T-Aktivität vorliegt, bezieht sich auf die Erhöhung des Niveaus der T-Helfer-Aktivität und/oder zytolytischen T-Zellaktivität des Säugers als Antwort auf ein Immunogen, auf welches die T-Zellen ansprechen, einschließlich viraler Antigene, Tumore, Bakterien, etc. Ein Lebewesen mit unzureichender T-Helfer-Aktivität oder zytolytischer T-Aktivität ist em Säuger, der weniger als die normale Anzahl an T-Helferzellen und/oder zytolytischen T-Zellen aufweist (wie z.B. bestimmt durch CD&sub4;/CD&sub8;-Marker), die erforderlich sind, um z.B. Antikörper zu sekretieren, Makrophagen zu aktivieren und Target-Zellen wie viral infizierte Zellen oder Tumorzellen abzutöten.
Der Ausdruck "Wiederherstellung der Immunität" bei einem Säuger, wie hier verwendet, bedeutet, daß das Immunitätsniveau des Säugers auf das normale Niveau zurückgebracht wird, sei es durch Wiederherstellung von Milz- oder Thymuszellen oder durch Erhöhung der T-Zell-Ansprechbarkeit oder der Menge des von B-Zellen produzierten Immunglobulins.
Das Medikament, welches IGF-I umfaßt, kann dem Säuger oder Vogel direkt mit jeder geeigneten Methode, einschließlich parenteral, verabreicht werden und kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Der spezielle Verabreichungsweg wird beispielsweise von der medizinischen Vorgeschichte des Patienten abhängen, einschließlich etwaiger beobachteter oder erwarteter Nebenwirkungen der Verwendung von IGF-I. Beispiele parenteraler Verabreichung umfassen subkutane, intramuskuläre, intravenöse, interarterielle und interperitoneale Verabreichung.
Besonders bevorzugt erfolgt die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion (unter Verwendung von z.B. Minipumpen wie osmotischen Pumpen) oder durch Injektion unter Verwendung beispielsweise intravenöser oder subkutaner Mittel. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung für IGF-I subkutan. Das Medikament kann auch ein (einzelner) Bolus oder eine Depot-Formulierung zur langsamen Freisetzung sein. Besonders bevorzugt wird der IGF-I kontinuierlich durch Infusion, besonders bevorzugt subkutan, verabreicht.
Ferner wird der IGF-I geeigneterweise zusammen mit einem oder mehreren seiner bindenden Proteine verabreicht, z.B. IGFBP-2, IGF-BP-4, oder am meisten bevorzugt IGFBP-3, welches in WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989, und von Martin und Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986) beschrieben wird. Dieses glykosylierte Protein ist eine säurestabile Komponente von etwa 53 Kd auf einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gel eines Glycoprotein-Komplexes von 125 bis 150 Kd, der in Humanplasma gefunden wird, welches die meisten der endogenen IGF trägt und auch durch GH reguliert wird. Der IGF-I wird auch geeigneterweise mit einem Rezeptor oder Antikörper oder Antikörperfragment zur Verabreichung gekoppelt.
Die IGF-I-Zusammensetzung, welche in der Therapie angewandt werden soll, wird auf eine Weise formuliert und dosiert werden, die guter medizinischer Praxis entspricht, unter Berücksichtigung des klinischen Zustands des individuellen Patienten (insbesondere der Nebenwirkungen der Behandlung mit IGF-I allein), der Abgabestelle der IGF-I-Zusammensetzung, der Verabreichungsmethode, des Zeitplans der Verabreichung und anderer Faktoren, die Praktikern bekannt sind. Die "wirksame Menge" von IGF-I für die hier angesprochenen Zwecke (einschließlich einer immunstimulierenden wirksamen Menge) wird somit durch derartige Überlegungen bestimmt.
Als allgemeiner Vorschlag wird die pharmazeutisch wirksame Gesamtmenge des parenteral pro Dosis verabreichten IGF-I im Bereich von etwa 1 µg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag des Körpergewichts des Patienten liegen, obwohl, wie oben angemerkt, dies Gegenstand der therapeutischen Beurteilung sein wird. Bevorzugter beträgt diese Dosis für das Hormon mindestens 0,01 mg/kg/Tag und für Menschen besonders bevorzugt zwischen etwa 0,01 und 1 mg/kg/Tag. Bei kontinuierlicher Gabe wird der IGF-I typischerweise mit einer Dosisrate von etwa 1 µg/kg/Stunde bis etwa 50 µg/kg/Stunde, entweder durch 1-4 Injektionen pro Tag oder durch kontinuierliche subkutane Infusionen, z.B. unter Verwendung einer Minipumpe, verabreicht. Eine intravenöse Lösung in einem Beutel kann ebenfalls eingesetzt werden. Der Schlüsselfaktor bei der Wahl einer geeigneten Dosis ist das erhaltene Ergebnis, wie gemessen durch Erhöhungen der Antikörperproduktion, Erhöhung der Splenozyten- oder Thymozytenzahl, Erhöhung der B-Zellen in der Milz, etc.
Der Verlauf der IGF-I-Behandlung zur Beeinflussung des Immunsystems erscheint optimal, wenn diese länger als eine bestimmte minimale Anzahl von Tagen, 7 Tage im Falle von Mäusen, fortgesetzt wird. Die erforderliche Länge der Behandlung, um Veränderungen zu beobachten, und das Intervall nach der Behandlung bis zum Auftreten von Antworten scheint je nach der erwünschten Wirkung zu variieren.
Der IGF-I wird auch geeigneterweise durch Systeme zur verzögerten Freisetzung verabreicht. Geeignete Beispiele von Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung umfassen semipermeable Polymer-Matrices in Gestalt von Formkörpern, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Matrices zur verzögerten Freisetzung umfassen Polylactide (US- Patent Nr. 3,773,919, EP 58,481), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl- L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), und R. Langer, Chem. Techn., 12: 98-105 (1982)), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133,988). IGF-I-Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung umfassen auch in Liposomen eingeschlossenen IFG-I. Liposomen, die IGF-I enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; JP-A-83-118008; US-Patente Nr. 4,485,045 und 4,544,545; und EP 102,324. Gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen [etwa 20-80 nm (200-800 Å)] unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Molprozent Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil für die optimale IGF-I-Therapie eingestellt wird.
Zur parenteralen Verabreichung in einer Ausführungsform wird der IGF-I im allgemeinen formuliert, indem er mit dem gewünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Dosiseinheitsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt wird, d.h., einem, der für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise umfaßt die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, welche bekanntermaßen für Polypeptide schädlich sind.
Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der IGF-I gleichmäßig und innig mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern oder beiden in Kontakt gebracht wird. Dann wird erforderlichenfalls das Produkt in die Form der gewünschten Formulierung gebracht. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele solcher Träger-Vehikel umfassen Wasser, Salzlösung, Ringers Lösung und Dextroselösung. Nicht-wäßrige Vehikel wie fixierte Öle und Ethyloleat sind ebenfalls geeignet, sowie Liposomen.
Der Träger enthält geeigneterweise kleinere Mengen an Zusätzen wie Substanzen, welche die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen. Solche Materialien sind für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder deren Salze; Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
Der IGF-I wird typischerweise in solchen Vehikeln mit einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml, bei einem pH von etwa 3 bis 8 formuliert. IGF-I vollständiger Länge ist gewöhnlich bei einem pH von nicht mehr als etwa 6 stabil; des(1-3)-IGF-I ist bei etwa 3,2 bis 5 stabil. Es versteht sich, daß die Verwendung bestimmter vorgenannter Trägersubstanzen, Vehikel oder Stabilisatoren in der Bildung von IGF-I-Salzen resultieren wird.
Ferner wird der IGF-I, vorzugsweise der IGF-I vollständiger Länge, geeigneterweise in einem geeigneten Träger-Vehikel formuliert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, welche keine Zellen enthält. In einer Ausführungsform wird der zur Formulierung eingesetzte Puffer davon abhängig sein, ob die Zusammensetzung unmittelbar nach dem Mischen verwendet oder für die spätere Verwendung gelagert wird. Bei sofortiger Verwendung kann der IGF-I vollständiger Länge in Mannit, Glycin und Phosphat, pH 7,4, formuliert werden. Soll diese Mischung gelagert werden, wird sie in einem Puffer mit einem pH von etwa 6, z.B. Citrat, mit einem oberflächenaktiven Mittel, welches die Solubilität des GH bei diesem pH erhöht, z.B. 0,1 % Polysorbat 20 oder Poloxamer 188, formuliert. Das endgültige Präparat kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Der für die therapeutische Verabreichung einzusetzende IGF-I muß steril sein. Sterilität wird ohne weiteres mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z.B. 0,2 µm-Membranen) erreicht. Therapeutische IGF-I-Zusammensetzungen werden gewöhnlich in einen Behälter eingebracht, der eine sterile Zugangsöffnung enthält, z.B. ein Beutel einer intravenösen Lösung oder ein Gefäß mit einem Stopfen, der mit einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann.
IGF-I wird gewöhnlich in Einheits- oder Multidosis-Behältern gelagert werden, z.B. versiegelten Ampullen oder Gefäßen, als wäßrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Gefäße mit 5 ml steril filtrierter 1 %iger (w/v) wäßriger IGF-I-Lösung gefüllt und die resultierende Mischung lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstitution des lyophilisierten IGF-I unter Verwendung von bakteriostatischem Wasser für Injektionszwecke hergestellt.
GH kann auch mit dem IGF-I für diesen Zweck in einer Dosis kombiniert werden, wobei eine geeignete Verabreichung, wie oben für IGF-I eingesetzt, angewandt wird. Es ist festzuhalten, daß hGH bei einem höheren pH als IGF-I, z.B. 7,4-7,8, stabil ist. Wird GH verabreicht, wird es geeigneterweise zusammen mit einem oder mehreren seiner bindenden Proteine verabreicht. Ein derartiges, gut charakterisiertes bindendes Protein ist das hochaffin Wachstumshormon-bindende Protein (GHBP), welches die extrazelluläre Domäne des GH-Rezeptors ausmacht, die im Blut zirkuliert und bei verschiedenen Spezies als GHBP funktioniert [Ymer und Herington, Mol. Cell. Endocrino., 41: 153 (1985); Smith und Talamantes, Endocrinology, 123: 1489-1494 (1988); Emtner und Roos, Acta Endocrinologica (Kopenhagen), 122: 296-302 (1990)], einschließlich des Menschen. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 62: 134-141 (1986); EP 366,710, veröffentlicht am 9. Mai 1990; Herington et al., J. Clin. Invest., 77: 1817- 1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Ein zweites BP mit niedrigerer Affinität für GH wurde ebenfalls beschrieben, das mit dem GH-Rezeptor strukturell nicht verwandt zu sein scheint. Baumann und Shaw, J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 680- 686 (1990).
Die Dosen von sowohl GH als auch IGF-I können bei gemeinsamer Verabreichung geringer sein, als wenn IGF-I allein verabreicht wird. Es ist festzuhalten, daß Praktiker, welche die Dosen von sowohl IGF-I als auch GH festlegen, die bekannten Nebenwirkungen der Behandlung mit diesen Hormonen in Betracht ziehen sollten. Für hGH umfassen die Nebenwirkungen Natrium-Retention und Vergrößerung des extrazellulären Volumens [Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Kopenhagen), 32: 341-361 (1959); Biglieri et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 21: 361-370 (1961)] sowie Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Die hauptsächlich auftretende Nebenwirkung von IGF-I ist Hypoglykämie. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, supra.
Vorzugsweise wird das IGF-I in Verbindung mit (d.h. gleichzeitig oder danach) einem Vakzin verabreicht, z.B. einem AIDS-Vakzin (z.B. ein gp120- oder gp160-Vakzin oder eine Mischung von Vakzinen auf gp-Rezeptor-Basis), entweder während der ersten Immunisierung oder während einer Auffrischungsgabe des Vakzins, um eine erhöhte Antikörperantwort sicherzustellen. Besonders bevorzugt wird der IGF-I zum Zeitpunkt einer jeden Auffrischung gegeben. Der Einsatz von IGF-I mit einem Vakzin wird die Wirksamkeit des Vakzins erhöhen, insbesondere bei Patienten mit beeinträchtigten Immunsystemen.
Säuger mit einem Immundefekt können zuerst einer Diagnose unterzogen werden, um festzustellen, ob sie niedrige Serum-IGF-I-Spiegel aufweisen, welche deren Krankheit verursachen und durch Behandlung mit IGF-I rückgängig gemacht werden könnten. Solche menschliche Patienten könnten diejenigen einschließen, welche fortgeschrittenen Alters sind, unterernährt, falsch ernährt oder krank sind. Die Diagnose des Serum-IGF- I-Spiegels solcher immundefizienter Patienten und die Wiederherstellung der IGF-I-Blutkonzentrationen bei den Patienten mit geringeren Serum-IGF-I-Spiegeln als normal durch Verabreichung einer für diesen Zweck wirksamen Menge an IGF-I würde die Immunität bei den Patienten wiederherstellen.
Die Diagnose der IGF-I-Spiegel bei einem Patienten kann nach jedem Standardverfahren durchgeführt werden, wird aber typischerweise ausgeführt, indem eine Blutprobe einem ELISA- oder RIA-Test unter Verwendung von Anti-IGF-I-Antikörpern unterworfen wird, wie in Furlanetto et al., J. Clin. Invest., 60: 648-657 (1977); Bala und Bhaumick, J. Clin. Endocrin. and Metabol., 49: 770-777 (1979); und Zapf et al., J. Clin. Invest., 68: 1321-1330 (1981) beschrieben.

BEISPIEL 1

Bestimmung von Organgewichten B- und T-Zellzahlen und der Antwort auf mitogene Stimulation

Rekombinanter Human-IGF-I [im Handel erhältlich von KabiGen AB, Stockholm, Schweden (spezifische Aktivität > 14.000 E/mg gemäß Radiorezeptor-Assay unter Verwendung von Plazenta-Membranen) oder erhältlich für klinische Untersuchungen von Genentech, Inc., South San Francisco] wurde bei allen in den Beispielen detailliert ausgeführten IGF-I-Experimenten eingesetzt. Der IGF-I wurde mit 5 mg/ml in 10 mM Citrat-Puffer und 126 mM NaCl, pH 6,0, gelöst.
Dieser IGF-I wurde drei Spezies, d.h. Ratte, Kaninchen und Maus, verabreicht, um dessen Wirkungen auf das Milz- und Thymusgewicht zu beobachten. Bei der Maus und der Ratte wurden Dosis-Antwort-Studien durchgeführt und IGF-I dem Kaninchen mit ähnlichen Wirkungen gegeben. Ferner wurden bei den Mäusen die Anzahl der B- und T- Zellen und die Antworten auf mitogene Stimulation bestimmt.

I. Ratten

Zwei Tiermodelle für GH-Defizienz und folglich IGF-I-Defizienz wurden verwendet, um die Wirkung von IGF-I auf Milz- und Thymusgewicht und -größe zu demonstrieren. Ein drittes Modell für GH- und IGF-I-Defizienz ist ein Tier fortgeschrittenen Alters. Ratten fortgeschrittenen Alters (18 Monate alt) wurden eingesetzt, um die Wirkung von IGF-I auf Milz- und Thymusgröße, Zellaufbau und in vitro-Antwort auf Mitogene zu demonstrieren. Erwachsene ovarektomierte Ratten mit normalen Serum-IGF-I- Konzentrationen wurden ebenfalls eingesetzt, um die Wirkung von IGF-I auf Milz und Thymus bei einem Tier zu demonstrieren, das nicht IGF-I-defizient war.

A. Zwergratten

Weibliche Zwergratten (Simonsen Labs, Gilroy, CA) (100-140 g) erhielten eine Woche lang IGF-I-Dosen mittels subkutaner (sc) Infusion aus osmotischen Minipumpen. Figur 1 zeigt einen Dosis-Antwort-Graphen für IGF-I bezüglich der Milzgröße bei diesen Zwergratten). Offensichtlich ist IGF-I bei der Zwergratte ein sehr potentes Stimulans für das Milzwachstum.

B. Hypophysektomierte Ratten

Weiblichen hypophysektomierten Ratten (Taconic Farms, Germantown, NY) mit einem Gewicht von 85-105 g wurden sc osmotische Minipumpen implantiert, welche IGF-I und des-IGF-I [PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26. Februar 1987, und in PCT WO 89/05822, veröffentlicht am 29. Juni 1989] eine Woche lang abgaben. Die Behandlung mit IGF-I und des-IGF-I zeigt eine stark erhöhte Wachstumsantwort der Milz und des Thymus, wie in den Figuren 2A bzw. 2B gezeigt. Dieses Wachstum ist größer als dasjenige des ganzen Körpers, wird das Gewicht der Milz oder des Thymus pro Gramm Körpergewicht angegeben, liegt immer noch ein sehr signifikantes Wachstum der Milz und des Thymus vor. Sowohl IGF-I als auch des-IGF-I besitzen diese Aktivität, wobei des-IGF-I in dieser Hinsicht signifikant wirksamer ist als IGF-I.

C. Erwachsene weibliche Ratten

Erwachsene weibliche Ratten wurden ovarektomiert. Dreißig Tage später, als die Ratten 300 g wogen, wurden ihnen osmotische Minipumpen (Alza, Palo Alto, 2ML2) implantiert, die IGF-I (mit einer Abgabe von 1,33 oder 4 mg/kg/Tag IGF-I) oder Trägersubstanz enthielten. Nach der Tötung 14 Tage nach Implantation der Minipumpen wurden die Milzen seziert und gewogen (der Thymus wurde in diesem Versuch nicht seziert).
Figur 3 zeigt den Dosis-Antwort-Graphen für IGF-I bei diesem Rattenmodell. Es ist ersichtlich, daß es selbst bei einem Tier mit intakter Hypophyse mit normalem endogenen Wachstumshormon und IGF-I möglich war, eine große Wirkung von exogenem IGF- I auf das Körpergewicht (eine durchschnittliche Zunahme von 45 g) und Milzgewicht zu demonstrieren. Selbst bei Angabe des Milzgewichts als Prozentsatz des Körpergewichts konnte ein sehr signifikantes Wachstum der Milz demonstriert werden (***p > 0,001 gegenüber Trägersubstanz, ** p < 0,01 gegenüber Trägersubstanz).
Somit konnte bei der Ratte festgestellt werden, daß IGF-I das Wachstum von Geweben mit Immunfunktionen bei GH- und IGF-I-defizienten Tieren (immundefizienten Tieren) und bei Tieren mit normalen GH- und IGF-I-Konzentrationen (immunkompetenten Tieren) beeinflußt.

D. Ratten fortgeschrittenen Alters

In zwei separaten in vivo-Studien wurden IGF-I, GH oder IGF-I plus GH 14 Tage lang 18 Monate alten Ratten fortgeschrittenen Alters verabreicht, um festzustellen, ob IGF-I funktionelle Veränderungen in Milz und Thymus bei diesem Modell der Thymus- Regression induzieren konnte.

(i) Konzeption

Männliche Fischer 344-Ratten im Alter von 18 Monaten und mit 400-500 g wurden von Harlan Sprague Dawley (HSD) bezogen. Diese Ratten wurden von HSD für das NIH-Institut für Alterung gezüchtet und stellen das in Alterungsstudien verwendete Standard-Rattenmodell dar. Bei Versuch 1 wurden 7 Ratten/Gruppe eingesetzt und im Versuch 2 8 Ratten/Gruppe. Junge F344-Ratten (5-8 Wochen alt), die in gleicher Weise wie die Versuchsratten untergebracht waren, wurden als positive Kontrollen verwendet. Die Behandlungsgruppen waren: (1) Trägersubstanz-Pumpen, Trägersubstanz-Injektionen, (2) IGF-I-Pumpen, Trägersubstanz-Injektionen, (3) IGF-I-Pumpen, GH-Injektionen, (4) Trägersubstanz-Pumpen, GH-Injektionen, und (5) junge Ratten.
Mit IGF-I wurden zwei Minipumpen so beladen, daß 1,150 mg/Ratte/Tag an IGF- I oder 0,8 mg/kg/Tag an des-IGF-I subkutan als kontinuierliche Infusion abgegeben wurde. Das rhGH (Marke Nutropin , Genentech, Inc., formuliert mit 2 mg/ml in 18 mg/ml Mannit, 0,68 mg/ml Glycin und 5 mM Phosphat, pH 7,4) oder bGH (Monsanto) wurde als tägliche subkutane Injektion von 1 mg/Ratte/Tag gegeben. Die Gruppen mit der Trägersubstanz-Pumpe erhielten identische Pumpen, die mit der Trägersubstanz für IGF-I (10 mM Citratpuffer und 126 mM Natriumchlorid, pH 6,0) gefüllt waren, im folgenden "IGF-I-Trägersubstanz" genannt. Die Behandlungen wurden für 14 Tage fortgesetzt. Die Tiere, welche kein GH erhielten, erhielten jeden Tag hGH-Vehikel (0,1 ml) injiziert.
Bei der Tötung wurde eine Blutprobe entnommen und die Leber, Nieren, das Herz, die Milz und der Thymus entfernt, trockengetupft und sofort gewogen. Die Milz und der Thymus wurden sofort in Puffer gebracht und dann durch Verdauung oder physikalisches Aufbrechen Zellen erhalten. Die Zellen wurden gezählt und dann bei gleichmäßiger Dichte ausplattiert. Die Thymuszellen wurden mit IL-1 (2 E/ml) und Phytohämaglutinin (PHA) (5 µg/ml) kultiviert und die Thymidin-Inkorporation gemessen wie von Maizel et al., J. Exp. Med., 153: 470-476 (1981) beschrieben. Die Milzen wurden auf ähnliche Weise behandelt und zwei Funktionstests durchgeführt.

(ii) Ergebnisse

(a) Versuch 1

Es wurden IGF-I vollständiger Länge und rhGH bei diesem Versuch eingesetzt. Figur 4 zeigt die Zunahme des Körpergewichts. Nach 14 Tagen hatten die Kontrollratten nicht an Gewicht zugenommen. Die GH-behandelten Ratten nahmen 9,6 ± 11,4 g zu, die IGF-I-behandelten Ratten nahmen 34,5 ± 9,4 g zu, und die IGF-I- und GH- behandelten Ratten nahmen 45,5 ± 9,9 g zu. Die Antwort auf IGF-I war offensichtlich stark und die Antwort auf GH plus IGF-I schien additiv zu sein. IGF-I war bei den eingesetzten Dosen merklich anabol. Ein sehr dramatischer Effekt der IGF-I-Behandlung war das starke Absinken der Blutharnstoff-Stickstoff(BUN)-Spiegel von 20,7 ± 2,4 mg/dL bei Kontrollen auf 13,8 ± 1,8 mg/dL nach der IGF-I-Behandlung; hGH besaß keine Wirkung. Ein verringerter BUN zeigt einen anabolen Stoffwechselzustand an. Die Daten der Körpergewichtszunahme, die erhöhten Organgewichte, der abgesunkene BUN und die verringerten Blutenzymspiegel zeigen alle an, daß IGF-I einen anabolen Zustand erzeugte, bei dem die Proteinsynthese gegenüber dem Proteinabbau überwog. Die Wirkung von IGF-I war eindeutig größer als diejenige von hGH.
Es gab einen eindeutige Wirkung von IGF-I auf alle Organgewichte. Die Leber nahm um 6,6%, die Nieren um 16,6%, das Herz um 18,5%, der Thymus um 27,0% und die Milz um 80,8% zu. Alle Antworten waren statistisch signifikant. Die einzige Wirkung von hGH war die signifikante Verringerung des Lebergewichts um 8,8%. Die kombinierte GH- und IGF-I-Behandlung verringerte das Ausmaß der IGF-I-Wirkung auf diese Organe mit einer Ausnahme nicht. Das Milzgewicht war für die IGF-I plus GH-Behandlung reduziert im Vergleich zum Gewicht der Milz bei der Gruppe mit IGF-I allein.
Die Gesamt-IGF-I-Spiegel wurden durch IGF-I-Verabreichung mit oder ohne gleichzeitige(r) hGH-Behandlung erhöht. hGH allein erhöhte die Gesamt-IGF-I-Spiegel im Blut nicht signifikant.
Die Zellen aus den geernteten Organen wurden dispergiert und deren Antwort auf Mitogene gemessen. Tabelle I zeigt einige der Daten für Thymus und Milz. Das Naßgewicht des Thymus wurde durch IGF-I erhöht, jedoch nicht durch hGH. Normale junge 60 Tage alte Fischer-Ratten wurden als positive Kontrollen verwendet.
Kein Thymus der unbehandelten alten Ratten ergab ausreichend Zellen, um eine vollständige Analyse in Gewebekultur zu erlauben. Dagegen ergaben 8 der 13 Ratten, welche mit IGF-I oder IGF-I plus GH behandelt worden waren, ausreichend lebensfähige Thymuszellen. Die IGF-I-Behandlung für 14 Tage verursachte eine beachtliche 5-fache Erhöhung der Anzahl der Thymuszellen, obwohl der Thymus der jüngeren Ratten immer noch wesentlich mehr Zellen enthielt.
Das Wachstumshormon neigte zur Erhöhung der Anzahl der Thymuszellen, die Wirkung (eine Verdoppelung der mittleren Anzahl) war jedoch statistisch nicht signifikant. IGF-I plus hGH stellte ebenfalls einen effektiven Weg zur Erhöhung der Anzahl der Thymuszellen dar. Im Gegensatz dazu wurde die Anzahl der Zellen in der Milz durch IGF-I- oder GH-Behandlung nicht signifikant erhöht, obwohl die Mittelwerte der mit IGF-I behandelten Gruppen höher waren. Deshalb konnte IGF-I das Naßgewicht des Thymus erhöhen und auch die Anzahl der Zellen, die gewonnen werden konnten. Dann wurde eine etwaige funktionelle Wirkung der erhöhten Gewebemasse und der Zellzahl in vitro durch Messung der Antworten der dispergierten Thymozyten auf Mitogene, wie in Tabelle II unten gezeigt, getestet. Sowohl bei den PHA-Antworten als auch den IL- 1-Antworten und deren Kombination zeigte das Gewebe der alten Ratten im Vergleich zu dem der jüngeren Tiere eine Neigung zu erhöhter Aktivität mit IGF-I allein, obwohl dieser Effekt statistisch nicht signifikant war. Es ergab sich keine zusätzliche Wirkung der IGF-I plus GH-Kombination auf die Zahl der gewonnenen Zellen. Es war deshalb überraschend, daß IGF-I plus GH die größte und signifikanteste Wirkung auf alle Messungen der Thymusfunktion ausübte. Im Vergleich zu den Antworten des jüngeren Gewebes erhöhte sich die PHA-Antwort für IGF-I plus GH um das 3,7-fache und für die PHA plus IL-1-Kombination erhöhte sich die Antwort um das 4-fache. TABELLE I Zellzahl in Milz (x10&sup8;) und Thymus (x10&sup7;)
Die Werte sind Mittelwerte und Standardabweichungen (Signifikanzen: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001 gegenüber Trägersubstanz) TABELLE II Thymuszellen von jungen und alten F344-Ratten. Unbehandelte alte Ratten besaßen alle nicht genügend Thymuszellen, um die Assays durchzuführen
Die Werte sind CpM-Mittelwerte von einzelnen Tieren, wobei die Gruppenmittelwerte auf diesen Werten basieren.
Vergleiche (#IGF-1 + GH gegenüber Jungen; *IGF-1 gegenüber IGF-1 + GH) (Signifikanzen: *p< 0,05, **p< 0,01, #< 0,05, ##p< 0,01)
Diese Daten zeigen, daß bei einem Tier fortgeschrittenen Alters mit Hilfe von IGF-I eine erhöhte Thymusgewebemasse erzeugt werden kann und dies nach der relativ kurzen Zeitspanne von nur 14-tägiger IGF-I-Behandlung. Es gibt fühere Studien bei ähnlich alten Ratten, welche zeigen, daß sowohl GH als auch Prolactin die Größe und einige Aspekte der Thymusfunktion erhöhen können. Kelley, in Psychoneuroimmunology II, 2. Ausgabe, B. Ader et al., Hrsg., 1990, supra.
Es ist nun auch gezeigt worden, daß das mit IGF-I erzeugte erhöhte Thymusgewebe insofern funktionelles Gewebe ist, als es auf Mitogene antworten kann. Es gab viermal soviele Thymuszellen bei den jungen Ratten, die Zellen der IGF-I-behandelten alten Ratten besaßen jedoch eine Aktivität in vitro, die bis zu viermal erhöht war. Deshalb war nach den verwendeten Funktionstests der Thymus der älteren Ratten im wesentlichen in den Zustand eines viel jüngeren Tieres zurückversetzt worden. Beim Thymus schien die Wirkung des Alterns rückgängig gemacht worden zu sein.

(b) Versuch 2

Mit einem zweiten Satz von 18 Monate alten Ratten wurde ein ähnliches Experiment durchgeführt, mit Ausnahme, daß bGH und des-IGF-I eingesetzt wurden. Ebenfalls untersucht wurde die Aktivität von des-IGF-I und ob die relativ geringe Wirkung von hGH in der ersten Studie auf hGH-Antikörper zurückzuführen war (GH ist bei der Ratte sehr antigen, bGH viel weniger).
Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Die Gewichtszunahmen mit des-IGF- I schienen geringer als bei der ersten Studie, waren aber immer noch größer als die Antwort auf bGH. Niere und Milz zeigten starke Antworten auf des-IGF-I und keine signifikante Antwort auf GH. Im allgemeinen brachte des-IGF-I die Blutzellzahlen auf die Werte von jüngeren Tieren zurück, wobei die Kombination von des-IGF-I und bGH die effektivste Behandlung darstellte. des-IGF-I neigte bei Kombination mit bGH zur Erhöhung der weißen Blutzellen (WBC) und der Lymphozytenzahl. Das Ausmaß dieser Veränderung ist ähnlich dem, das in Beispiel IV beim Menschen zu beobachten ist.
Die Ergebnisse von Thymusgewicht, Zellzahl und Prozentsatz der Zellen, die PNA (Erdnuß-Agglutinin)-positiv waren, sind in Tabelle IV dargestellt. TABELLE III Blut-Zählungen: Ratten fortgeschrittenen Alters, die mit des-IGF-1 und GH behandelt worden waren, im Vergleich zu jungen Ratten
Mittelwerte und Standardabweichungen n=7 & 8, außer für Gruppe (e), worin (n=4) TABELLE IV Thymuszell-Zählungen: F344-Ratten fortgeschrittenen Alters, die mit des-IGF-1 und bGH bhandelt worden waren, im Vergleich zu jungen Ratten
Mittelwerte und Standardabweichungen n=7 & 8, außer für Gruppe e (n=4)
Es ist ersichtlich, daß das Thymusgewicht der mit des-IGF-I behandelten Ratten bei der Tötung erhöht war. Dieser Versuch wurde zu Untersuchung der Herkunft und des Typs der erhöhten Zellzahl im Thymus konzipiert. Diese Unterscheidung hinsichtlich Herkunft und Typ der Zellen wurde durch FACS-Analyse (weiter im folgenden beschrieben) unter Verwendung von PNA als spezifischer Marker für echte Thymozyten erreicht. Man nimmt an, daß PNA-positive Thymozyten junge Vorläuferzellen für T-Zellen sind.
Die jungen Ratten besaßen fünfmal mehr Thymuszellen als die alten Ratten. Die Anzahl der Zellen im Thymus wurde bei Einsatz von des-IGF-I allein oder in Kombination mit bGH etwa 4,5-fach erhöht. bGH allein erhöhte die Zellzahl nur um etwa das zweifache. Diese Antworten bestätigen die Beobachtungen in Versuch 1. Der Prozentsatz der PNA-positiven Zellen war unerwartet. Die jungen Kontrollratten besaßen 95 PNA-positive Zellen und die Ratten fortgeschrittenen Alters nur 25 % positive Zellen.
Des-IGF-I allein erhöhte bei diesen alten Ratten den Prozentsatz der PNA-positiven Zellen auf 72% der Zellen. Ein ähnliche Zahl (69%) wurde für die Gruppe mit des- IGF-I plus bGH beobachtet. bGH allein erhöhte den Prozentsatz der PNA-positiven Zellen nicht signifikant. Dies zeigt an, daß bei den alten Tieren eine "echte" neue Thymuspopulation, zusammengesetzt aus Vorläuferzellen für T-Zellen, regeneriert wurde.
Deshalb ergab des-IGF-I eine sehr dramatische Wirkung, indem sowohl die Anzahl der Zellen als auch der Prozentsatz der PNA-positiven Zellen im wesentlichen auf normale Werte zurückgebracht wurde. IGF-I scheint eine deutliche Wirkung hinsichtlich der Verjüngung des Thymus bei einer Ratte fortgeschrittenen Alters zu haben. Bei der Tötung der Ratten fortgeschrittenen Alters in Versuch 2 wurde die Hälfte des Thymus in 10% Formalin gebracht und Gewebeschnitte präpariert. Die allgemeine Morphologie des Thymus wurde durch einen tiermedizinischen Pathologen beurteilt als gekennzeichnet durch (1) keine signifikanten Läsionen (die jungen Kontrolltiere), oder (2) Rückbildung (normal für die Tiere fortgeschrittenen Alters) oder (3) Hinweise auf Lymphozyten- Hyperplasie. Ferner wurde das Ausmaß an Lymphozyten-Zellreichtum innerhalb des Thymus für alle Tiere bewertet, da dies die Zellkomponente zu sein schien, welche bei den Gruppen unterschiedlich war.
Unter Verwendung dieses Schemas war eine charakteristische Thymusrückbildung bei den Trägersubstanz- und den GH-behandelten Gruppen zu sehen. Es gab jedoch klare Befunde für eine Lymphozyten-Hyperplasie und die Wiederherstellung des Thymusaufbaus bei den Gruppen, welche des-IGF-I und des-IGF-1 plus bGH erhielten. Die Zunahme des Lymphozyten-Zellreichtums bei den Ratten, welche mit des-IGF-I behandelt worden waren, war leicht erkennbar. Die Beurteilung der Objektträger hinsichtlich des Grades der Rückbildung und des Ausmaßes an Lymphozyten-Hyperplasie bestätigte, daß die Rückbildung durch des-IGF-I signifikant rückgängig gemacht wurde (p< 0,01, Fisher's Test) und daß das Ausmaß an Lymphozyten-Hyperplasie durch des-IGF-I stark erhöht wurde (p< 0,001). Somit bestätigte die histologische Überprüfung des Thymus, daß IGF-I den Thymus eines Tieres fortgeschrittenen Alters verjüngen kann, selbst wenn bereits eine Thymusrückbildung eingetreten war.

II. Kaninchen

Männliche Kaninchen, New Zealand White, 2,0-2,5 kg, wurden narkotisiert und eine Nierenschädigung induziert, indem beide Nierenarterien für 120 Minuten abgeklemmt wurden. Bei der Abklemmung wurde entweder eine osmotische Alzet-Pumpe (Alza Corporation, Palo Alto, CA, Modell 2ML-1), die 2 ml an 3,3 mg des-IGF-I/ml Essigsäure (100 mM, pH 4,5) enthielt, oder zwei osmotische Alzet-Pumpen, die jeweils 2 ml an 5,0 mg IGF-I/ml (in Natriumchlorid/Natriumacetat-Puffer, pH 6,0) enthielten, in der Bauchhöhle untergebracht. Die Pumpen gaben entweder 0,364 mg des-IGF-I/kg/Tag oder 1,18 mg IGF-I/kg/Tag 7 Tage lang ab. Die Kontrolltiere erhielten mit Trägersubstanz gefüllte Pumpen. Die Tiere wurden am Tag 7 getötet und Thymus und Milz seziert.
Nach 7-tägiger Behandlung mit IGF-I war das durchschnittliche Naßgewicht des Thymus bei IGF-I behandelten Kaninchen (n=6) 4,7 ± 0,44 g, nahezu zweimal so groß wie dasjenige der Kontrolltiere (2,7 ± 0,58 g, n=4, p=0,023). Wurde die Thymusgröße als Prozentsatz des Kaninchenkörpergewichts angegeben, erhöhte sich die statistische Signifikanz der Wirkung (p=0,014).
Nach 7-tägiger Behandlung mit des-IGF-I war das durchschnittliche Naßgewicht der Milz bei behandelten Kaninchen (n=8, 2,43 ± 0,44 g) mehr als zweimal so groß als dasjenige der Kontrollkaninchen (n=7, 1,17 ± 0,21 g, p=0,028).

III. Mäuse

Die obigen Studien unter Verwendung von Ratten und Kaninchen bestätigten, daß IGF-I weitreichende Veränderungen im Immunsystem verursachen konnte. Als nächstes wurde die Maus als Modellsystem eingesetzt, da bei dieser Spezies Immunzellmarker und Assays besser charakterisiert und leichter erhältlich sind. Ferner sollte bei der Maus bestätigt werden, ob die Wirkungen auf Thymus- und Milzgröße, Zellzahl und in vitro- Antworten auf Mitogene in eine tatsächlich funktionell erhöhte Aktivität des Immunsystems umgesetzt wurden.
Nachdem gezeigt worden war, daß IGF-I bei Ratten fortgeschrittenen Alters eine bemerkenswerte Aktivität zur Wiederherstellung von Aufbau und Zytologie des Thymus in den Zustand eines jungen Tieres besaß, und daß die gebildeten Zellen eine erhöhte mitogene Antwort zeigten, wurden Mäuse fortgeschrittenen Alters als Modell gewählt, in diesem Falle männliche ehemalige Zuchtmäuse, die ein Modell beschleunigter Alterung darstellen. Die Wirkung von IGF-I als Anabolikum sowie als Effektor von Immungewebewachstum und Funktion wurde bei den erwachsenen Mäusen fortgeschrittenen Alters studiert. Ferner wurde die Wirkung von hGH und einer Kombination von IGF-I und hGH auf Zellanzahl und mitogene Stimulation bestimmt.

A. Konzeption

1. Versuchsprotokoll

In den folgenden Studien wurden ehemalige BALB/c-Zuchtmäuse von 9 Monaten oder älter und mit einem Gewicht von etwa 25 bis 35 g (Harlan Sprague Dawley, San Diego, CA) eingesetzt. Die Tiere wurden in Einzelkäfigen untergebracht und erhielten Nahrung (Purina Rodent Chow 5010, St. Louis, MO) und Wasser nach Belieben. Alle Tiere wurden gewogen, bevor sie in Behandlungsgruppen (basierend auf ihrem Körpergewicht) unter Verwendung eines Randomisierungsprogramms eingeteilt wurden. Die Tiere wurden mit Ohrmarken aus rostfreiem Stahl identifiziert und mindestens eine Woche lang eingewöhnt.
IGF-I wurde mittels subkutan implantierter osmotischer Minipumpen verabreicht (für 7 Tage-Studien, Alzet Modell 2001, Pumpengeschwindigkeit etwa 1 µl/h; für 14 Tage-Studien, zwei Alzet Modell-2002 Minipumpen, Pumpengeschwindigkeit etwa 0,5 µl/h; Alza, Palo Alto, CA). Die Pumpen wurden mit Lösung nach den Anweisungen des Herstellers gefüllt und die gefüllten Pumpen dann in steriler Salzlösung über Nacht im Kühlschrank inkubiert.
Die Pumpen wurden entweder mit der IGF-I-Trägersubstanz oder mit der gewünschten Konzentration an IGF-I (5 mg/ml, formuliert wie oben beschrieben) gefüllt, d.h., 7,5, 30 oder 120 µg IGF-I/Tag/7 Tage für 6 Tiere pro Gruppe für die erste siebentägige Behandlungsstudie und 120 µg IGF-I/Tag/7 Tage für 5 Tiere pro Gruppe für die zweite 7-tägige Behandlungsstudie und die 14-tägige Behandlungsstudie.
Für hGH-Behandlungen wurde rhGH (Marke Nutropin ) allein in einer Menge von 9,6, 48 oder 240 µg hGH/Tag/14 Tage lang mittels zweier subkutan implantierter osmotischer Alzet Modell 2002-Minipumpen (0,5 µl/h/14 Tage) 5 Tieren pro Gruppe verabreicht, oder allein als 240 µg hGH allein 14 Tage lang mittels subkutaner Injektion 5 Tieren/Gruppe verabreicht.
Für Kombinationsstudien von IGF-I und GH wurde IGF-I in einer Dosis von 120 µg mittels zweier Alzet 2002-Minipumpen verabreicht und GH wurde täglich durch subkutane 240 µg-Injektionen 5 Tieren/Gruppe verabreicht.

2. Körper- und Organgewicht-Bestimmungen

Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von etwa 0,4 ml Avertin (2,2,2-Tribromethanol und tert-Amylalkohol in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)) narkotisiert. Der dorsale Schulterblattbereich wurde dann mittels Clips von Haar befreit und ein kleiner Einschnitt vorgenommen. Ein geschlossener Hämostat wurde dann in den Einschnitt eingeführt und posterior vorgeschoben. Dann wurde eine Minipumpe in die Tasche eingeführt und der Einschluß mit Wundklammern aus rostfreiem Stahl geschlossen und eine subkutane Injektion von 7500 E Penicillin gegeben. Die Tiere wurden täglich inspiziert und ihre Körpergewichte aufgezeichnet.
Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeiten nach Einführung der Minipumpen getötet, eine große Blutprobe entnommen und Thymus, Milz, Herz, Leber, Niere und mandibulare und mesenterische Lymphknoten von jeder Behandlungsgruppe steril entnommen und gewogen. Die Milz, der Thymus und die Lymphknoten wurden auf Eis in Gewebekulturmedien in separaten Gefäßen für weitere Assays untergebracht. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, wobei Vergleiche durch Einweg- Varianzanalyse mit nachfolgenden Vergleichen unter Verwendung von Duncan's Range Test durchgeführt wurden.

3. Zellpräparation

Die Lymphknoten, Milz und Thymus wurden unter Verwendung von Sinterglas- Objektträgern dispergiert, um Einzelzellsuspensionen zu erzeugen. Die Zellen wurden dann in Eagle's Minimal Essential Medium (MEM, Gibco, Grand Island, NY) gewaschen, das 10% fötales Rinderserum (FBS) (Gibco), Penicillin (100 Einheiten/ml), 100 µg/ml Streptomycin (Gibco) und 200/mM Glutamin enthielt und mit 5x10&sup6; lebensfähigen Zellen/ml resuspendiert, wie durch Trypanblau-Farbstoffausschluß bestimmt.

4. Mitogen-Stimulation

Lipopolysaccharid (LPS - E. coli 055:B5) wurde von Difco Laboratories (Detroit, Michigan) erhalten. Kermesbeeren ("Pokeweed")-Mitogen (PWM) und Concanavalin A (Con A) wurden von Sigma (St. Louis, Missouri) erhalten. Die Antwort auf jedes Mitogen wurde in dreifacher Ausführung bei den folgenden Konzentrationen nachgewiesen: LPS (100, 10, 1 µg/ml), PWM (10, 5, 2,5 µg/ml), Con A (10, 5, 2,5 µg/ml). Zweihundert Mikroliter Zellen (2,5 x 10&sup6;/ml), welche die geeignete Mitogen-Verdünnung enthielten, wurden in flachbödigen Mikrotiterplatten (Falcon Plastics, Oxnard, CA) in Hepes (0,5 M)-NaHCO&sub3;-gepuffertem (0,24% w/v) MEM, das 10% FBS und Ergänzungen wie oben beschrieben enthielt, gezüchtet. Die Kulturen wurden in 10% CO&sub2; bei 37º inkubiert.
Nach 72 Stunden erhielten die Kulturen einen Puls von 1 mCi Methyl-³H-thymidin. 12 Stunden später wurden Kulturproben unter Verwendung eines Mehrfachprobensammlers auf Glasfaserfilter gebracht. Scheiben wurden getrocknet und in 3 ml Szintillationsflüssigkeit eingebracht. Die Menge des in DNA inkubierten ³H-Thymidins wurde mit Hilfe eines Beckman-Szintillationszählers gemessen. Es wurden nur optimale Antworten auf Mitogene, welche für alle Behandlungsgruppen gleich waren, festgestellt.

5. FACS-Analyse

Lymphozyten-Zellsuspensionen, hergestellt wie beschrieben, wurden auf 1x10&sup6; Zellen/ml in PBS mit 0,1 % BSA und 10 mM Natriumazid eingestellt. Zweihundert Mikroliter-Aliquots der Zellsuspensionen wurden eine Stunde lang bei 4ºC mit 5 µl der geeigneten Verdünnung des monoklonalen Anti-Maus-Ratten-FITC-Konjugats Anti-thy- 1, Anti-L3T4 oder Anti-Lyt-2 (Caltag, S. San Francisco, CA) inkubiert, um die T-Zell- Populationen anzufärben. Die B-Zellen in diesen Suspensionen wurden unter Verwendung von polyklonalem FITC-konjugiertem Anti-Maus-Ziegen-F(ab')&sub2;-Ig (M,G,A-spezifisch) (Becton Dickinson, Mountainview, CA) angefärbt. Nach drei Waschschritten mit kaltem Medium wurden die Zellen hinsichtlich des Grades an Fluoreszenzintensität mit Hilfe eines FACS 440 (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) analysiert. Die Fluroeszenzparameter wurden mit Hilfe eines logarithmischen Verstärkers nach Auswertung der Kombination von direkter und senkrechter Lichtstreuung gewonnen. Die Fluoreszenzdaten wurden als Prozentsatz fluoreszierender Zellen im Vergleich zu nicht relevanten momoklonalen Antikörpern (mab) identischer Isotypen angegeben. Die Fluoreszenz wurde als mittlere Fluoreszenzintensität der fluoreszierenden Zellen, angegeben als auf einer logarithmischen Skala aufgetragener Kanal-Mittelwert, bestimmt.

B. 7- und 14-Tage-Studien

Der Zweck dieser Studien war die Feststellung, ob IGF-I bei der intakten normalen Maus anabol wirkte und ob IGF-I bei solchen anabolen Dosen Thymus- und Milzgewicht, Zellreichtum, Zelltyp und Ansprechbarkeit in vitro für Mitogene beeinflußte. Bei diesen Studien wurden 5 oder 6 Mäuse pro Gruppe eingesetzt. Auf Grundlage der bekanntermaßen bei der Ratte wirksamen Dosen wurde entschieden, IGF-I durch kontinuierliche subkutane Infusion mit 140, 46 und 15 µg/Maus/Tag (etwa 4, 1,33 und 0,44 mg/kg/Tag) zu verabreichen.

C. Ergebnisse

1. Wirkung der 7-tägigen Behandlung

Es gab eine dosisbezogene Wirkung auf die Körpergewichtszunahme im Verlauf der 7 Tage (Trägersubstanz 0,75 ± 0,75 g, niedrige Dosis 0,86 ± 0,63 g, mittlere Dosis 1,31 ± 1,03 g und hohe Dosis 3,42 ± 1,24 g), wobei die Antwort auf die hohe Dosis im Vergleich zu allen anderen Gruppen statistisch hochsignifikant war (p < 0,001). Im Wiederholungsexperiment mit der hohen Dosis an IGF-I trat eine ähnliche Gewichtszunahme auf (3,55 ± 0,54 g), welche wiederum statistisch größer war (p < 0,001) als die Zunahme der mit Trägersubstanz behandelten Gruppe.
IGF-I verursachte ein signifikantes Wachstum der Milz und des Thymus nach 7- tägiger Behandlung mit IGF-I. Bei dem ersten Experiment gab es eine eindeutige dosisbezogene Wirkung von IGF-I auf die Milz (Trägersubstanz 105 ± 14, niedrige Dosis 124 ± 21; mittlere Dosis 145 ± 58; hohe Dosis 193 ± 23 mg; Trägersubstanz gegenüber hochdosiertem IGF-I, p < 0,001). Im Wiederholungsexperiment erhöhte sich das Milzgewicht wiederum (Trägersubstanz 103 ± 18, hohe Dosis 206 ± 68 mg, p = 0,01). Das Thymusgewicht war beim ersten Experiment unverändert; dies war wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß der Thymus von verschiedenen Dissektoren unterschiedlich seziert wurde. Bei dem Wiederholungsexperiment entfernte ein Dissektor den Thymus gleichmäßig und es wurde ein signifikantes Thymuswachstum festgestellt (Trägersubstanz 15,2 ± 1,3; hohe Dosis 26,2 ± 6,4 mg, p = 0,006).
Die beobachtete Erhöhung des Milzgewichts nach 7-tägiger Behandlung mit 140 µg IGF-I/Tag war teilweise auf eine Erhöhung der Lymphozytenzahl zurückzuführen. Lebensfähige Lymphozyten, wie durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt, nahmen von 2x10&sup8; auf 5x10&sup8; Zellen/Milz nach 7-tägiger Behandlung mit IGF-I zu (Figur 5). Diese Erhöhung der Zellzahl schien auf eine Erhöhung sowohl der B-Zellen als auch der T-Zellen zurückzuführen sein. Bei einer Quantifizierung der B- und T-Zellzahlen von SIg+ - bzw. Thy 1+ -Zellen mittels FACS-Analysen erhöhte sich die B-Zellzahl um das Dreifache (1,3x10&sup8; bei der Trägersubstanz gegenüber 3,5x10&sup8; bei IGF-I), während die T-Zellzahl im Vergleich zu Kontrollen ebenfalls erhöht war (0,7x10&sup7; bei der Trägersubstanz gegenüber 1,1x10&sup7; bei IGF-I). Siehe Fig. 5.
Die beobachtete Erhöhung des Thymusgewichts korrelierte mit einer Zunahme der Thy 1+ -Thymozyten (1x10&sup7; bei der Trägersubstanz gegenüber 2,4x10&sup7; bei IGF-I). Siehe Figur 6. Diese Daten legen nahe, daß IGF-I eine potente mitogene Wirkung auf Lymphozyten-Subpopulationen ausübt.
Im Gegensatz zu der durch IGF-I induzierten dramatischen Erhöhung der Lymphozytenzahl wurde die Antwort von Milzlymphozyten auf die Stimulation durch LPS (B-Zellen) und Con A (T-Zellen) im Vergleich zu Kontrollen herabgesetzt, während die Antwort auf PWM für beide Gruppen von Mäusen gleich war. Siehe Figur 7. Diese verringerte mitogene Antwort legt einen Mangel an funktioneller Reife bei der Lymphozyten-Population nach kurzzeitiger (7-tägiger)-IGF-I-Behandlung nahe.
Deshalb war bei dem 7-tägigen Experiment die Lymphozytenzahl erhöht, jedoch die mitogene Antwort verringert.

2. Wirkung der 14-tägigen Behandlung

Als nächstes wurde festgestellt, ob zur Beeinflussung der Lymphozytenfunktion eine längere Exposition gegenüber IGF-I erforderlich war als zur Beeinflussung der Lymphozytenzahl. Deshalb wurde die Behandlung auf 14 Tage verlängert unter Einsatz der hohen Dosis von IGF-I (140 µg/Maus/Tag). Nachdem ferner angenommen wird, daß hGH teilweise durch Induktion der IGF-I-Produktion wirkt, wurden die Wirkungen von hGH im Vergleich zu IGF-I auf die Lymphozytenantworten verglichen.
Es gab eine signifikante Gewichtszunahme nach 14-tägiger Behandlung mit IGF- I (Trägersubstanz 1,49 ± 0,46; hohe Dosis 3,87 ± 0,45 g, p < 0,001). Ferner gab es ein signifikantes Milzwachstum (Trägersubstanz 96 ± 12 hohe Dosis 163 ± 9, p < 0,001) und signifikantes Thymuswachstum (Trägersubstanz 18,2 ± 4,6; hohe Dosis 33,8 ± 10,6, p = 0,017). Es ist ersichtlich, daß Thymus und Milz ähnliche Gewichte nach 7 oder 14 Tagen Behandlung erreichten.
Wie im 7-Tage-Experiment zu beobachten, verdoppelte sich die Milzzellzahl nahezu (1,3 x 10&sup8; gegenüber 2,4 x 10&sup8;) im Vergleich zu Kontrollen mit IGF-I-Behandlung (Fig. 8). Obwohl es eine Erhöhung der T-Zellzahl bei den IGF-I-behandelten Mäusen gab, war die einzige statistisch signifikante Erhöhung bei der CD&sub4;-Population zu beobachten (3,1 x 10&sup7; gegenüber 4,9 x 10&sup7;) (Fig. 8), was nahelegt, daß CD&sub4; + -Zellen durch dieses Behandlungsprotokoll bevorzugt vermehrt werden könnten. Wie im vorigen Experiment zu sehen, resultierte die IGF-I-Behandlung in substantiellen Erhöhungen der B- Zellzahl. IGF-I zeigte auch eine Erhöhung der T-Zellzahl im Thymus, wenn die Behandlung 14 Tage lang durchgeführt wurde. Siehe Fig. 9.
Im Gegensatz zu der verringerten Antwort, die nach 7 Tagen beobachtet wurde, war nach 14-tägiger IGF-I-Behandlung die mitogene Antwort von Splenozyten aus IGF- I-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht (Fig. 10). Diese Daten legen nahe, daß die kurzzeitige Verabreichung von IGF-I in signifikanten Erhöhungen der Lymphozytenzahl resultiert, aber zusätzliche Zeit erforderlich ist, um Änderungen in der Ansprechbarkeit der Lymphozyten zu beobachten.

3. Wirkung einer Kombination nach 14-tägiger Behandlung

a. Gleichzeitige Behandlung

Nachdem hGH und IGF-I unterschiedliche Wirkungen auf Lymphozyten-Populationen ausübten, wurde bei der nächsten Folge von Experimenten die Wirkungen von gleichzeitig niit IGF-I verabreichtem hGH untersucht. Allein oder in Kombination mit subkutan injiziertem hGH erzeugte die IGF-Behandlung Erhöhungen der Gesamtlymphozytenzahl in der Milz, welche wiederum in erster Linie auf einer Erhöhung der B-Zellzahl zu beruhen schienen (Fig. 11). Die Kombination von IGF-I und hGH hatte eine ausgeprägte Wirkung auf die Thymozytenzahl im Vergleich zur Behandlung mit IGF-I oder hGH allein (Fig. 12).
Es steht zu erwarten, daß der bevorzugte Weg der Kombinationstherapie die Verabreichung von IGF-I und hGH als kontinuierliche Infusion sein wird.

b. Sequentielle Behandlung

Wurde zuerst GH (mit 280 µg/Tag) 14 Tage lang verabreicht, gefolgt von einer Verabreichung von IGF-I (mit 140 µg/Tag) für 14 Tage, wurde keine Wirkung von IGF- I beobachtet.

4. Langzeitwirkungen der 14-tägigen Behandlung

Zur Bestimmung der Langzeitwirkungen von IGF-I, hGH und der Kombination wurden Lymphozyten-Populationen von Kontrolltieren und behandelten Tieren 7 und 21 Tage nach der 14-tägigen Behandlung mit hGH, IGF-I oder der Kombination von IGF- I und hGH untersucht.
Sieben Tage nach der Behandlung besaßen die IGF-I- und IGF-I plus hGH-behandelten Mäuse signifikant erhöhte Splenozytenzahlen im Vergleich zu Kontrollmäusen oder hGH-behandelten Mäusen (Fig. 13). Bei beiden IGF-I-behandelten Gruppen wurde eine statistische Erhöhung der B-Zellzahl beobachtet. Die Erhöhung der T-Zellzahl war bei der Gruppe mit IGF-I allein signifikant, jedoch nicht bei der Gruppe mit der Kombination von hGH plus IGF-I. Ferner waren bei dieser Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen sowohl die CD&sub4;+ - als auch die CD&sub8;+ -T-Zellpopulationen erhöht. Wie bei der 14- tägigen Behandlung besaßen beide Gruppen von IGF-I-behandelten Mäusen erhöhte Thymozytenzahlen im Vergleich zu hGH-behandelten Mäusen oder Kontrollmäusen (Fig. 14). Ferner erzeugte IGF-I allein oder in Kombination mit hGH eine Erhöhung der Zellzahlen in den peripheren Lymphknoten (Fig. 16). Es wurde keine Veränderung der Knoten-T-Zellzahl oder CD&sub4;:CD&sub8;-Verhältnisse nach diesen Behandlungsprotokollen beobachtet.
Im Gegensatz zur erhöhten proliferativen Antwort auf Mitogene, die nach 14- tägiger Behandlung beobachtet wurde, waren die mitogenen Antworten der IGF-I-behandelten Mäuse 7 Tage nach der Behandlung zu den Kontrollwerten zurückgekehrt (Fig. 15). Die größten mitogenen Antworten waren bei der mit hGH plus IGF-I behandelten Gruppe im Vergleich zu Kontrollen zu sehen, diese Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant.
21 Tage nach der Behandlung besaßen alle 4 Gruppen von Mäusen äquivalente Splenozytenzahlen (Fig. 17) und Thymozytenzahlen (Fig. 18). So scheinen 21 Tage ausreichend zu sein, um die normale Zellzahl und phänotypischen Verhältnisse nach der IGF-I-Behandlung wiederherzustellen.
Jedoch waren 21 Tage nach der Behandlung sowohl die LPS- als auch die Con A- Antworten der mit hGH plus IGF-I behandelten Gruppe im Vergleich zu Kontrollen statistisch erhöht (Fig. 19). Gleichermaßen waren die Antworten auf alle drei Mitogene bei der Gruppe mit IGF-I allein erhöht. Diese Ergebnisse legen nahe, daß IGF-I eine frühe und späte Wirkung auf die Lymphozyten-Antworten besitzt, während die Kombination von IGF-I und hGH einige Zeit zu benötigen scheint, um die Ansprechbarkeit der Lymphozyten zu beeinflussen. Subkutan injiziertes hGH allein übte keine statistisch signifikante Wirkung auf die Mitogen-Antworten zu irgendeinem untersuchten Zeitpunkt aus.

BEISPIEL II

Antwort auf ein Antigen bei sekundärer Immunisierung

Der Zweck dieses Experiments war die Bestimmung der Immunfunktion bei männlichen Mäusen (ehemaligen Zuchttieren), welche mit Dinitrophenyl-Ovalbumin immunisiert und mit IGF-I behandelt worden waren. Frühere Experimente zeigten an, daß 14 Tage kontinuierlicher IGF-I-Verabreichung an männliche ehemalige Zuchtmäuse das Körpergewicht und die Organgewichte von Milz und Thymus erhöhte. Es wurde gezeigt, daß die Erhöhung des Milzgewichts auf eine Erhöhung der B-Zellzahl und eine Erhöhung der Ansprechbarkeit auf ein Mitogen zurückzuführen war. Es wurde auch gezeigt, daß erhöhte T-Zellzahlen im Thymus erzeugt werden konnten und daß diese Zellen auch besser auf Mitogene ansprachen. Diese Daten wiesen darauf hin, daß, falls IGF die Antikörper-produzierenden B-Zellen und die T-Helferzellen zur Vermehrung und größerer Ansprechbarkeit gegenüber Mitogenen veranlaßte, IGF-I dann in der Lage sein könnte, eine stärkere Antikörperantwort auf ein Antigen zu ergeben.

I. Versuchsprotokoll

48 Stunden nach der Ankunft erhielten alle Tiere eine einzelne intraperitoneale (ip) Injektion (100 µl) von Dinitrophenyl-Ovalbumin, gemischt mit Alaun (DNPOA). (Die Dinitrophenylgruppe ist ein Hapten, das eine B-Zell-abhängige Antwort hervorruft, und das Ovalbumin ist ein Träger, der eine T-Zell-abhängige Antwort hervorruft.) Das DNPOA wurde vor der Verwendung gemischt durch Zugabe von 50 µl DNPOA (1 mg/ml) zu 2,45 ml sterilem PBS, pH 7,0, und 2,50 ml Aluminiumhydroxid-Absorptionsgel (Marke Rehsorptar , vertrieben von Armor Pharmaceutical Col, IL, 20 mg/ml). Das DNPOA wurde etwa 30 Minuten vor der Injektion gemischt. Der Tag der DNPOA- Immunisierung wird als Tag 0 bezeichnet.
Am Tag 19 wurden zehn Tiere nach dem Körpergewicht in zwei Gruppen eingeteilt. (Ein Tier wurde am Tag 9 tot aufgefunden.) Neunzehn osmotische Minipumpen (Alzet Corp., Palo Alto, CA) Modell 2002 (0,5 µl/h 14 Tage) wurden mit IGF-I-Trägersubstanz oder IGF-I wie in Beispiel I beschrieben gefüllt und über Nacht bei 4ºC in sterile Salzlösung gebracht.
Am Tag 20 wurde fünf willkürlich gewählten Tieren Blut entnommen (aus der Augenhöhle). Das Serum wurde auf DNPOA-spezifisches IgG wie unten beschrieben analysiert.
Am Tage 20 wurden alle zehn Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von etwa 0,5 ml Avertin wie oben beschrieben narkotisiert. Bei den Tieren wurde auf einer dorsalen Fläche von etwa 2 cm² das Haar abgeklemmt und diese mit 70% Alkohol abgewischt. In dem freigelegten Gebiet wurde ein kleiner Einschnitt von etwa 1 cm gemacht. Es wurde ein Hämostat in den Einschnitt eingeführt und anterior zur Basis des Schwanzes geführt und die oben beschriebenen Minipumpen eingeführt. Fünf Tieren wurden zwei Minipumpen mit jeweils Trägersubstanz-Puffer implantiert. Fünf Tieren wurden zwei Minipumpen mit jeweils IGF-I implantiert. Die Abgabegeschwindigkeit für die Minipumpen ergab eine IGF-I-Dosis von 120 µg IGF-I/Tag für maximal 14 Tage. Nach der Erholung aus der Narkose erhielten jeweils 5 Tiere der Trägersubstanz- und IGF-I-Gruppen eine intraperitoneale 100-µl-Auffrischungsinjektion von DNPOA.
Am Tag 25 wurde ein Tier in der Trägersubstanz-Gruppe tot aufgefunden.
Am Tag 34 wurde allen neun Tieren aus der Augenhöhle Blut entnommen und das Serum auf IgG analysiert.
Siehe Tabelle V für das Immunisierungs-Gesamtschema. TABELLE V Männliche ehemaligeZuchtmäuse (BALB/c), die mit DNPOA immunisiert worden waren

II. Assay von Anti-DNP-Antikörpern

IgG: Anti-DNP-IgG-Antikörper bei den Testmaus-Seren wurden durch ELISA (Enzym-verknüpfter Immunoassay) unter Verwendung von Serum von Anti-DNPOA- geprimten Mäusen als Referenzstandard bestimmt. Der ELISA wurde in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung wurde mit 0,1 ml 2,5 µg/ml DNP&sub6;HSA (Dinitrophenyl-Humanserumalbumin) 24 Stunden lang bei 4ºC beschichtet. Nach der Blockierung mit 0,1 % BSA wurden 0,1 ml eines jeden Testserums den Antigen-beschichteten Platten in dreifacher Ausführung zugegeben und die Platten 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen und 0,1 ml einer 1:2000-Verdünnung von Anti-Maus-Kaninchen-IgG (Cappel Labs) jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden erneut 2 Stunden lang inkubiert und gewaschen. Anschließend wurden 0,1 ml einer 1:1600-Verdünnung von Anti-Kaninchen- Ziegen-Antiserum, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, jeder Vertiefung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben. Nach dem Waschen wurden 0,1 ml an 0,2 mg/ml Orthophenylendiamin (OPD), 0,01 % Wasserstoffperoxid in 0,05 M Citratpuffer jeder Vertiefung zugegeben, die Reaktion nach 30 Minuten mit 2 M Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte bei 490 nm mit einem Microtect-Plattenablesegerät abgelesen.

III. Assay von Gesamt-IgG

Die IgG-Antikörper bei den Testmaus-Seren wurden durch einen ELISA unter Verwendung von Maus-IgG als Referenzstandard bestimmt. Der ELISA wurde in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung wurde mit 0,1 ml von 1:200 Fc- spezifischem Anti-Maus-Ziegen-IgG (Cappel Labs, Westchester, PA) 24 Stunden bei 4ºC beschichtet. Nach Blockierung mit 0,1 % BSA wurden 0,1 ml eines jeden Testserums den Antikörper-beschichteten Platten in dreifacher Ausführung zugegeben und die Platten 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen und 0,1 ml einer 1:250-Verdünnung von mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem, Fab-spezifischem Anti-Maus-Ziegen-IgG (Cappel Labs) jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden wiederum 2 Stunden inkubiert und gewaschen. Nach dem Waschen wurden 0,1 ml an 0,2 mg/ml OPD, 0,01 % Wasserstoffperoxid in 0,05 M Citratpuffer jeder Vertiefung zugegeben, die Reaktion nach 30 Minuten mit 2 M Wasserstoffperoxid gestoppt und die optische Dichte bei 490 nm mit einem Microtect-Plattenablesegerät abgelesen.

IV. Ergebnisse

Figur 20 zeigt die Konzentration von Gesamt-IgG (Fig. 20B) und OA-spezifischem IgG (Fig. 20A) im Serum von Trägersubstanz- oder IGF-I-behandelten Mäusen. Die IGF-I-Behandlung erhöhte die sekundäre IgG-Antwort auf das Antigen zu jedem untersuchten Zeitpunkt signifikant. Obwohl es einen Trend zu einer Erhöhung der Gesamt- IgG-Niveaus bei der IGF-I-Gruppe gab, waren die Werte im Vergleich zu Kontrollen nicht statistisch erhöht. So wirkt IGF-I als Verstärkung der Gedächtnisantwort des Säugers. Es ist festzuhalten, daß die IgG-Exposition nach einer sekundären Immunisierung eine längere Verbesserung der Antikörperproduktion ergibt.

BEISPIEL III

Wirkung auf die Immunantwort nach einer Knochenmarkstransplantation

Der Zweck dieses Experiments ist die Bestimmung der Wirkungen der IGF-I- Behandlung von Mäusen auf die Wiederbevölkerung der Milz und des Thymus nach einer Knochenmarkstransplantation.

I. Versuchsprotokoll

Männliche BALB/c-Mäuse mit 19-26 g und 6-7 Wochen alt (Charles River, San Diego, CA) wurden in der Studie eingesetzt. Die Tiere wurden als Gruppen in Polypropylenkäfigen mit Nahrung (Purina Rodent Chow 5010, St. Louis, MO) und Wasser nach Belieben untergebracht. Alle Tiere wurden am Tag der Pumpenimplantation gewogen und statistisch in Gruppen eingeteilt. Die Tiere wurden durch Ohrmarken aus rostfreiem Stahl identifiziert.
Es wurden zehn Tiere pro Gruppe untersucht. Die Tiere wurden narkotisiert mit einer intraperitonealen (ip) Injektion von etwa 0,4 ml Avertin vor der Implantation von osmotischen Minipumpen Alzet Modell 2002 (0,58 ± 0,03 µl/h/14 Tage), gefüllt mit IGF-I-Trägersubstanz oder 200 Mikroliter des oben beschriebenen rIGF-I in einer Verdünnung, um eine tägliche kontinuierliche Abgabe von etwa 40 oder 120 µg/Tag/14 Tage zu erzielen.
Die Gewichte der Tiere wurden täglich aufgezeichnet. 24 Stunden nach der Implantation wurden alle Tiere mit 900 Rad ¹³&sup7;Cäsium-Strahlung (4,29 Minuten) bestrahlt. Innerhalb von 1 Stunde nach der Bestrahlung erhielten die Tiere eine intravenöse Injektion von 1x10&sup7; Knochenmarkszellen (250 µl).
40 Donor-Tieren wurden Femur und Schienbein entnommen. Das Knochenmark wurde mit PBS ausgespült. Die Zellen wurden zentrifugiert und mit Salzlösung gewaschen. Lebensfähige Zellen wurden gezählt und mit Salzlösung verdünnt, um 10&sup7; Zellen/0,25 ml zu erhalten.
Eine Hälfte der Tiere wurde 14 Tage nach der Bestrahlungsbehandlung getötet. Alle überlebenden Tiere aus der bestrahlten Gruppe, die kein Knochenmark erhielt, wurden zu diesem Zeitpunkt getötet. Die verbliebenen Tiere wurden 23 Tage nach der Bestrahlungsbehandlung getötet. Milz, Thymus, Leber und Herz wurde entfernt und gewogen. Die langen Knochen wurden für die Histologie entnommen und Milz und Thymus für zytologische und in vitro-Assays zurückbehalten. Das Blut wurde zur zytologischen Analyse der peripheren Zellen entnommen. Das Versuchsprotokoll ist in Tabelle VI dargestellt. TABELLE VI

II. Ergebnisse

A. Gewichtszunahme

Tiere, bei denen kein Knochenmark ersetzt worden war, zeigten eine hohe Sterblichkeitsziffer, wobei von 3 von 10 Tieren 14 Tage überlebten. Für alle Messungen (Blut, Gewebe und ganzer Körper) zeigte diese Gruppe von Tieren die erwartete Wirkung einer letalen Strahlungsdosis.
Tiere, bei denen Knochenmark ersetzt worden war, überlebten, wobei nur 2 Tiere von 30 während der 23-tägigen Studie starben. Die tatsächlichen Gewichtszunahmen in den vier Gruppen sind in Tabelle VII dargestellt. TABELLE VII Gewichtszunahmen
* p < 0,05 für nur Knochenmark am selben Tag
** p < 0,01
Es gab eine eindeutige IGF-I-Wirkung hinsichtlich der Erhöhung von Thymus- und Milzgewicht in diesem Modell. Es hatte den Anschein, daß die Wirkung auf den Thymus größer als die Wirkung auf die Milz war, nachdem bei der Gruppe mit hochdosiertem IGF-I eine Verdoppelung der Thymusgröße beibehalten wurde, während die Wirkung auf die Milz am Anfang statistisch signifikant war, am Tag 23 jedoch nicht erhalten blieb. Es gab keine Gesamtwirkung der Behandlung auf das Leber- oder Herzgewicht.
Die dramatische anabole Wirkung von IGF-I auf den Gesamtkörper bei diesem Ansatz bestätigt, daß IGH-I weiterhin auf den ganzen Körper anabol wirkt. Die Wirkung von IGF-I, welche die Masse des Thymus und der Milz erhöhte, war überraschend angesichts der sehr extremen Vorgabe eines Immundefekts, die dieses Modell darstellt. Es wäre zu erwarten, daß bei anderen Modellen eines Immundefekts, z.B. AIDS, IGF- I ebenfalls diese bemerkenswerten Wirkungen aufweisen könnte.
Die Körpergewichtsveränderungen für alle vier Gruppen sind in Figur 21 dargestellt. Die Figur zeigt klar den sehr großen Gewichtsverlust bei den Tieren nach der Strahlungsexposition. Es gab eine eindeutige dosisbezogene Wirkung von IGF-I hinsichtlich des Schutzes der Mäuse vor dieser Katabolie. Hochdosiertes IGF-I wies eine signifikante anabole Wirkung bereits 7 Tage nach der Behandlung auf und dieser Effekt dauerte bis zum Ende der Studie an. Niedrigdosiertes IGF-I verursachte ebenfalls einen signifikanten Schutz zu einigen Zeitpunkten (p < 0,05).

B. Zellzahlen und mitogene Antworten

14 Tage nach der Bestrahlung besaßen Tiere, die 120 µg IGF-I erhielten, im Vergleich zu Kontrollen oder niedrigdosierter IGF-I-Behandlung erhöhte Zahlen an CD&sub4;+ -T-Zellen im peripheren Blut (Fig. 22). In der Tat erhöhte sich das Verhältnis von CD&sub4; zu CD&sub8; bei dieser Behandlungsgruppe im Vergleich zu Kontrollen von 2 auf 4. Diese Daten sind konsistent mit den bevorzugten Zunahmen der CD&sub4;-Zellen, die in der Milz von Mäusen fortgeschrittenen Alters beobachtet wurden, welche 7 oder 14 Tage lang mit IGF-I behandelt worden waren. Nach der IGF-I-Behandlung war keine Auswirkung auf die Anzahl peripherer B-Zellen zu beobachten.
Bei zahlenmäßiger Bestimmung der Milzlymphozyten dieser Tiere durch FACS- Analyse zeigte die IGF-I-Behandlung eine dosisabhängige Erhöhung der Anzahl der T- Zellen und B-Zellen (Fig. 23). Es wurde jedoch keine Wirkung auf die mitogene Ansprechbarkeit dieser Splenozyten beobachtet, wenn sie zu diesem Zeitpunkt gemessen wurde (Fig. 24).
Wie im Falle der Milz, war die Zahl der Lymphozyten, welche den Thymus der IGF-I-Mäuse erneut bevölkerten, im Vergleich zu Kontrollen erhöht (Fig. 28).
Bei einer Untersuchung 21 Tage nach der Bestrahlung induzierte IGF-I wiederum eme Änderung im CD&sub4;:CD&sub8;-Verhältnis peripherer Blutlymphozyten aufgrund von Zunahmen in der CD&sub4; + -T-Zellpopulation (Fig. 25). Zu diesem Zeitpunkt waren die Gesamtsplenozytenzahlen in den IGF-I-behandelten Gruppen zu den Kontrollwerten zurückgekehrt, es war jedoch immer noch eine leicht erhöhte CD&sub4; + -T-Zellpopulation der Milz zu beobachten (Fig. 26). Diese Erhöhung der T-Zellen spiegelte sich in einer erhöhten mitogenen Ansprechbarkeit wieder. Die Con A-Stimulation von T-Zellen der Milz verdreifachte sich bei den mit hochdosiertem IGF-I behandelten Mäusen (Fig. 27). Die mitogenen B-Zellantworten auf LPS waren durch IGF-I-Behandlung bei der Untersuchung zu diesem Zeitpunkt nicht beeinflußt.
Überraschenderweise waren die Thymus-Lymphozytenzahlen der mit hochdosiertem und niedrigdosiertem IGF-I behandelten Mäuse im Vergleich zu Kontrollen immer noch dramatisch erhöht (Fig. 28).
Zusammen mit den Erhöhungen der CD&sub4;-Zahl in der Milz und Con A-Ansprechbarkeit legen diese Daten nahe, daß IGF-I die Geschwindigkeit der erneuten Bevölkerung mit peripheren Zellen erhöht, und bestätigen eine wichtige therapeutische Rolle für dieses Molekül nach einer syngenen Knochenmarkstransplantation.

BEISPIEL IV

IGF-I-Verabreichung an einen Menschen

Diese klinische Untersuchung erweist, daß IGF-I auch das Immunsystem eines Menschen beeinflußt.

I. Versuchsprotokoll

Es wurde eine klinische Phase I-Studie hinsichtlich der Sicherheit und Pharmakokinetik nach wiederholter Verabreichung (Multidosis) von IGF-I bei gesunden männlichen Erwachsenen durchgeführt. Zwölf menschliche Patienten erhielten eine Bolus-Injektion von 0,03 mg/kg rhIGF-I wie oben beschrieben, jeden Morgen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen. Beim Screening und 10 Tage nach dem Bolus am Tag 5 wurden Blutproben zur hämatologischen Bestimmung entnommen.

II. Ergebnisse

Es wurde festgestellt, daß Hämoglobin, Hämatokrit und rote Blutzellen (RBC) am Tag 5 im Vergleich zum Screening oder in Woche 2 nach der Behandlung signifikant geringer waren (p = 0,001, 0,0004, 0,0005 und 0,0005). Im Gegensatz dazu erhöhten sich die weißen Blutzellen (WBC) signifikant vom Screening bis zu Tag 5 (von 6,1 ± 1,5 auf 7,5 ± 1,9 M/CMM, p = 0,0018). Ferner fielen die WBC in Woche 2 nach der Behandlung signifikant vom Wert am Tag 5 (von 7,5 ± 1,9 auf 6,4 ± 1,6 M/CMM, p = 0,003), so daß sich die WBC-Werte vor der Behandlung und 2 Wochen nach der Behandlung nicht signifikant unterschieden.
Deshalb stiegen die WBC trotz der Abnahme der RBC in dieser Studie an. Es ist bekannt, daß 25 bis 30% der weißen Blutzellen Lymphozyten sind. Die 23%-ige Zunahme der Gesamtzahl an WBC im Blut der IGF-I-behandelten Personen macht es sehr wahrscheinlich, daß es nach diesem Verlauf der IGF-I-Behandlung beim Menschen auch eine Erhöhung der Lymphozytenzahl gab. Man vergleiche Fig. 22B, welche statistisch signifikante Veränderungen in den CD&sub4;+-Lymphozytenzahlen des peripheren Bluts bei Mäusen nach einer Behandlung mit 120 µg IGF-I zeigt. Siehe auch Tabelle III hinsichtlich der erhöhten Wirkungen der Kombination von des-IGF-I und bGH auf die Lymphozytenzahl und WBC bei Ratten fortgeschrittenen Alters.

SCHLUSSFOLGERUNG

IGF-I wurde isoliert und zuerst als ein "Somatomedin" bezeichnet, um anzuzeigen, daß er die Gesamtkörperwachstums-fördernde Aktivität von GH vermittelt. Er wurde später mit Erkenntnis seiner Insulin-ähnlichen metabolischen Aktivitäten als IGF-I bezeichnet. Es ist deshalb überraschend, daß IGF-I, ein Molekül, das als metabolischer Regulator des somatischen Wachstums angesehen wurde, bei Zellen des Immunsystems eine ähnliche Wachstumsfaktor-Aktivität aufweist wie viele Interleukine.
Es ist bekannt, daß GH-Rezeptoren, IGF-I-Rezeptoren und Insulin-Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems vorhanden sind. Die funktionelle in vivo-Wirkung dieser Rezeptoren und die Aktivität ihrer Liganden auf das Immunsystem waren bis zur vorliegenden Erfindung unbekannt. Die Wirkungen von Insulin und GH auf das Immunsystem wurden als unbeachtlich angesehen. Siehe z.B., Snow, J. Immunol., 13: 776-778 (1985). Die meisten Gewebe im Körper besitzen Rezeptoren für GH, IGF-I und Insulin, wo diese Hormone bei der Regulierung der grundlegenden Stoffwechselfunktionen von Zellen, z.B. Glucoseaufnahme oder Aminosäuretransport, wirksam sind. Die Rezeptoren, deren Anwesenheit im Immungewebe demonstriert wurde, könnten eher zur Kontrolle dieser Aktivitäten dienen als zur Beeinflussung ihrer Differenzierung, ihres Wachstums und ihrer immunologischen Aktivitäten. Die jüngere Literatur hat anerkannt, daß die Rolle von IGF-I bei der Beeinflussung der Immunzytologie oder -funktion unbekannt ist. Siehe Fu et al., J. Immunol., 146: 1602-1608 (1991).
Es ist allgemein anerkannt, daß das Patienten fortgeschrittenen Alters, unterernährte oder fehlernährte Patienten, oder Patienten, die unter Krankheiten oder Störungen leiden, immundefizient werden. Es ist ferner bekannt, daß diese Patienten auch IGF-I- defizient werden. Die hier vorliegenden Befunde legen nahe, daß dieser Immun-Defekt in direktem Zusammenhang mit diesem IGF-I-Defekt steht und dadurch verschlimmert, wenn nicht sogar verursacht wird. Es steht zu erwarten, daß die Wiederherstellung der IGF-I-Blutkonzentrationen bei den Patienten zu einer Verbesserung ihres Immun-Defekts führen würde. IGF-I beeinflußt die Größe des Thymus bei verschiedenen Tiermodellen dramatisch. Thymuswachstum wurde bei hypophysektomierten Ratten und Zwergratten, bei jungen Ratten, erwachsenen Ratten und Ratten fortgeschrittenen Alters, bei Mäusen und bei Kaninchen beobachtet. Der Thymus bildet sich mit dem Alter bei den meisten Lebewesen zurück; er erreicht eine maximale Größe und beginnt sich dann beim Menschen nach der Pubertät zurückzubilden. Diese Rückbildung ist assoziiert mit einer Abnahme der Aktivität des Immunsystems. Die Verwendung von IGF-I gemäß der vorliegenden Erfindung bietet deshalb ein Mittel zur Stimulation des Immunsystems eines Menschen fortgeschrittenen Alters, um das Thymusgewebe bis zum Zustand einer viel jüngeren Person wiederherzustellen. Die Kombination eines Agens, das eine anabole Aktivität auf die hauptsächlichen inneren Organe ausübt, mit einer Verbesserung der Hämatologie und Immunfunktion macht IGF-I zu einem attraktiven Arzneimittel zur Behandlung von Erwachsenen oder Menschen fortgeschrittenen Alters. Dieses Vermögen zur Verjüngung des Thymus und somit zur Stimulation des Immunsystems wird als Zugang zu einem Spektrum therapeutischer Möglichkeiten angesehen.
Solche Möglichkeiten umfassen die allgemeine variable Agammaglobulinämie, bei der B-Zellen nicht mehr in der Lage sind, zu Ig-sekretierenden Zellen zu reifen, und das Serum weniger als 250 mg/dl enthält, im Vergleich zu 1000 mg/dl, welches die normale Konzentration ist. IGF-I erzeugt signifikante Erhöhungen der Serum-Ig-Spiegel (Fig. 20) und kann bei dieser Krankheit nützlich sein.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von IGF-I wäre die Verabreichung des IGF- I an einen Patienten, der unter einer Erbkrankheit leidet, welche zu einem beeinträchtigten Immunsystem führt. Ein Beispiel eines solchen Patienten wäre ein Kind, das unter angeborener Thymusaplasie (DiGeorge-Syndrom) leidet, wobei der Thymus atrophiert ist und die T-Zellen stark verringert sind, was zu opportunistischen Infektionen führt, die oft tödlich sind. Der Grund für diese Krankheit ist unbekannt. Es wäre zu erwarten, daß IGF-I Verbesserungen hinsichtlich Größe, Zellreichtum und Ansprechbarkeit des Thymus bei diesen Patienten ergeben würde. Die Behandlung würde in Unterbrechungen stattfinden, z.B. eine vorgeschriebene 14-tägige Behandlungsperiode, gefolgt von einer Ruheperiode von mehr als 21 Tagen zwischen den IGF-I-Expositionen. Zu diesem Zeitpunkt würden die Zellzahlen in den Immungeweben auf die Normalwerte zurückgekehrt sein, deren Fähigkeit zur Antwort auf Mitogene oder zur Erzeugung von Antikörpern jedoch erhöht sein. Ein derartiger unterbrochener Verhandlungsverlauf, der Wellen der Zellentwicklung erzeugt, könnte beibehalten werden und zu einer langfristigen Wiederherstellung der Immunfunktion bei erblichen Zuständen vom DiGeorge-Typ führen.
Eine dritte Anwendungsmöglichkeit ist das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS). Patienten mit AIDS besitzen keine T-Zell-Immunität und umgekehrte T4/T8- Verhältnisse. Es ist gezeigt worden, daß IGF-I die T-Zell-Ansprechbarkeit auf Mitogene erhöht und spezifisch die CD&sub4; + -Zellzahl erhöht (Fig. 5, 10, 11), und dieser könnte somit ein nützliches Arzneimittel zur Behandlung von AIDS sein.
Die oben angegebenen Daten legen nahe, daß die Verabreichung von IGF-I zur Erhöhung der Immunglobulinproduktion bei Patienten, die unter unzureichender Immunglobulinproduktion leiden, vorteilhaft ist. Das Intervall zwischen Imunisierungen könnte erwartungsgemäß durch die Verabreichung von IGF-I verringert werden. Die schnellere Proliferation von Zellen in vitro von IGF-I-behandelten Mäusen legte nahe, daß verstärkte Antikörperantworten schneller erreicht werden könnten. Dies würde kürzere Immunisierungsprotokolle erlauben. Beispielsweise ist es beim Menschen üblich, primäre, sekundäre und tertiäre Immunisierungen vorzunehmen, die durch viele Monate getrennt sind. Während dieser Zeit ist der Patient oder die Patientin dem Risiko durch das Agens ausgesetzt, vor dem er oder sie geschützt werden soll. Es würde vorteilhaft sein, das Intervall zwischen den Immunisierungen zu verringern, indem IGF-I zur Stimulation des Immunsystems eingesetzt wird, so daß das obige Risiko damit verringert werden könnte.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von IGF-I ist die Durchführung einer IGF- I-Behandlung bei einem(r) Patienten(in) während seiner oder ihrer Erholung von schweren Krankheiten oder nach einem Eingriff, wenn eine Infektion oder ein Rückfall zu erwarten steht. Eine erhöhte Immunantwort würde erwartungsgemäß einen solchen Patienten beim Aufbau einer Immunherausforderung gegen die Infektion oder den Rückfall unterstützen.
Bei den obigen Beispielen wurde die Wirksamkeit von IGF-I wie folgt demonstriert: (1) bei drei Spezies (Maus, Ratte und Kaninchen); (2) bei beiden Geschlechtern (männlichen und weiblichen Ratten); und (3) bei mehreren Tiermodellen, einschließlich Tieren, die chirurgisch GH- und IGF-I-defizient gemacht wurden (hypophysektomierte Ratten), Tieren mit erblichem GH- und IGF-I-Defekt (Zwergratten), normalen Tieren (ovarektomierten Ratten), normalen Tieren fortgeschrittenen Alters, die IGF-I-defizient sind (18 Monate alte Ratten), Tiere, welche beschleunigte Alterung zeigen (ehemalige Zuchtmäuse) und Tiere mit verringerter Immunfunktion (die Tiere fortgeschrittenen Alters).
Aus den obigen Studien folgt nicht notwendigerweise, daß ein Minimum von 14 Tagen IGF-I-Behandlung zur Induzierung der beobachteten Veränderungen erforderlich ist. Bei der Maus wurde die 14-tägige Behandlung gewählt, da sich dies als verläßliches Mittel zur Induktion von Immungewebe-Antworten erwies. Es ist möglich, daß die 7- tägige IGF-I-Behandlung, welche eine Erhöhung der Zellzahl induzierte, schließlich zu funktionell aktiven reifen Lymphozyten führen würde. Ferner könnten weniger als 7 Tage Behandlung (z.B. die 5 Tage, die in Beispiel IV beim Menschen eingesetzt wurden) ebenfalls einen effektiven Verabreichungszeitraum darstellen. Ferner steht zu erwarten, daß eine IGF-Behandlung mittels Injektionen statt kontinuierlicher Infusion ebenfalls wirksam sein würde.
Es wäre durchaus zu erwarten, daß die vorliegenden Daten mit Kaninchen, Ratten und Mäusen für Vögel, Pferde, Kühe und andere Tiere extrapoliert werden können, unter Berücksichtigung des Körpergewichts des Vogels oder Säugers gemäß anerkannten tiermedizinischen und klinischen Verfahren. Es wird angenommen, daß Menschen ebenfalls auf diese Weise reagieren. IGF-I-Rezeptoren wurden auf Human-Lymphozyten [Kozak et al., Cell Immunol., 109: 318 (1987)] nachgewiesen und Befunde von ähnlichen Antworten beim Menschen in Beispiel IV demonstriert. So steht durchaus zu erwarten, daß IGF-I beim Menschen eine vorteilhafte wiederherstellende Wirkung der Immunfunktion bei allen Patienten aufweisen würde.

Claims

1. Verwendung von IGF-I zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation des Immunsystems emes Säugers oder eines Vogels.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Stimulation durch Antikörper vermittelt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Stimulation durch Zellen vermittelt wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Säuger AIDS hat.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Säuger eine Knochenmarkstransplantation erfahren hat.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin IGF-I in Kombination mit Wachstumshormon eingesetzt wird.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die Antikörperantwort eines Säugers oder eines Vogels auf ein Immunogen verstärkt.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die Menge an Immunglobulin erhöht, die von B-Zellen eines Menschen oder eines anderen Säugers als Antwort auf ein Immunogen erzeugt wird.

9. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die T-Zell-Ansprechbarkeit bei einem Menschen oder einem anderen Säuger als Antwort auf ein Immunogen erhöht.

10. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die Immunität bei einem Säuger mit Immundefekt wiederherstellt.