JPH06508830A - 免疫応答の刺激方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫応答の刺激方法 発明の分野 本発明は哺乳類または鳥類の免疫応答を刺激する方法に関するものであり、低下 した免疫系を有する患者の抗原に対する抗体応答を増強させることを包む。

発明の背景 インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）は、ヒト体液、例えば血液およびヒト脳 をＭ液中に天然に存在するポリペプチドである。大部分の組織、特に肝臓は、■ ＧＦ−１を特異的なＩＣＦ−１結合タンパク質と共に産生ずる。ｒＧＦ−１は成 長ホルモン（ＧＦ）の主な刺激的作用の下に産生され、いくつかのＩＧＦ−Ｉ結 合ＩＧＦ−１はヒト血清から単離され、組換え法により製造されている。例えば 、ＥＰ　１２３．２２８および１２８．７３３を参照。

ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、１９］個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチ ド（分子１２１．５００）である。ジスルフィド結合により、位置５３と１６５ および位置１８２と１８９か結合されている。Ｎ１ａｌｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　 Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　２３０：９０　（＋９７１）。ｈＧＨは、特に窒素 、リン、カリウムおよびカルシウムの貯留による、強力な同化作用物質である。

下垂体切除されたラットをＧＨで処置することで、の最も著しい効果の中には、 促進された骨成長プレート軟骨の直線増殖の結果としての身長の増加がある。Ｋ ａｐｌａｎ、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ　 ａｎｄ　Ａｄｏｌｅｓｅ特に閉経期以降の女性において、ＧＨ分泌が年齢と共に 低下することが報告されている。Ｍｉｌｌａｒｄら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、Ａｇ ｉｎｇ＋　１１：２２９−２３５　（１９９０）；　Ｔａｋａｈａｓｈｉら、神 ｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　４６：１３７−１４２　（１９８７）。

さらにＲｕｄｍａｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｍｖｅｓｔ、、　U７： １３６１−１３６９　（１９８１）およびＢｌａｃｋｍａｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ、　１６：９８１　（１X８７）を 参照。さらに、やせて減少する体重、脂肪組織塊の膨張および皮膚か薄くなるこ とを含むいくつかの老化の発現を、１週間に３回のＧＨ冶療により減少させるこ とかできるという報告がある。例えば、Ｒｕｄ＋＋＋ａｎら、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ 、Ｍｅｄ、、　３２３：ｌ−６（１９９０）および同じ唯誌発行物中のＤｒ、　 Ｖｎａｃｅによる添付の論文（ｐｐ、　５２−５４）を参照。

ＩＧＦ−１の４度は、２０か月齢のラットにおいては６か月齢のラットに比べて 半分に減少することか報告されている。ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＭｅｉｔｅｒ ｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｉ）、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、　１８６：２２９− ２３３　（１９８７）。さらにＦｌｏｒｉｎｉおよびＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ、Ｇ ｅｒｏｎ狽盾戟B Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ、、１５：６ ２９　（１９８６）；　Ｈｉｎｔｚ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　奄氏@Ｐｅｄｉ つの文献は老齢ヒトにおける低ＩＧＦ−１濃度について開示しているコを参照。

Ｈｉｎｔｚ、　ＣｌｅｍｍｏｎｓおよびＬｉｎｄｅｒｗｏｏｄおよびＢａｘｔｅ ｒの参考文献はＩＧＦ−１についての総論である。

さらに、インビトロでの加齢培養物中で周期進行し得るヒト二倍体線維芽細胞中 で、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）による増殖 分画の調節の変化はほとんどないか、８期へ入る速度の調節のためにＩＧＦ−］ に２４する依存性の大きな上昇かあることが見いだされた。ＣｈｅｎおよびＲａ ｂｉｎｏｖｉ　ｔｃｈ。

ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１４４：１ｇ−２５（＋９９０）。著者らは 、加齢培養物中の細胞の分裂集団の比較的ゆるやかな増殖は、通常供給されるレ ベルを大きく上回るレベルのＩＧＦ−１が必要であることと関連している可能性 があると結論付けている。これはＩＧＦ−１結合タンパク質であるＩＧＦＢＰ− ３の生産過剰、そしてこれゆえのレセプターに対するＩＧＦ−１の利用可能性の 減少によるものであろう。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、「老化の生物学への細胞およ び分子的な応用」、＾ＦＣＲＭｅｅｔｉｎｇ　ａｂｓｔｒａｃｔ。

５ｅａｔｔｌｅ、　Ｍａｙ　４−５．１９９１０老齢哺乳動物以外におけるＩＧ Ｆ−１の様々な生物学的活性が同定されている。

例えば、ＩＧＦ−１はヒトにおいて血糖濃度を低下させることが報告されている 。

Ｇｕｌｅｒら、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　３１７：１３７−１４０　（ １９８７）。さらにＩＧＦ−Ｉは、低いＩＧＦ−Ｉｆｉ度を特徴とするいくつか の代謝条件、例えば下垂体切除ラッｌ−［５ｋｏｔｔｎｅｒら、Ｊ、Ｅｎｄｏｃ ｒ、、１１２：１２３−１３２　（１９８７）］、糖尿病ラット［５ｃｈｅｉｖ ｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ。

３２３：１６９−１７１　（１９８６）］、および矯矯小ット［５ｋｏｔｔｎｅ ｒら、　勤東凹１刈騰訂、１２４：２５１９−２５２６　（１９８９）］におい て成長を促進させる。下垂体切除ラットの腎臓重量は、ｅｎ、１９ｇ？）。５ｎ ｅｌｌ矯小マウスおよび短小ラットの腎臓も同様に反応した。ｖａｎ　Ｂｕｕｌ −Ｏｆｆｅｒｓら、Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ、、２０：８２５−８２７　（１９ ８６）；　５ｋｏｔｔｎｅｒら、ＥｎｄｏｃｒｉｎＯhＯｇｙ。

上記。ＩＧＦ−１の別の用途は、糸球体濾過および腎臓血漿流を改善することで ある。Ｇｕｌｅｒら、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ６：２８６８−２８７２　（１９８９）。急速に成長している新生ラットにおけ るＩＧＦ−１の同化作用効果がインビボで示された。

Ｐｈ１ｌｉｐｐｓら、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、、　２３：２９８　（１ ９８８）。栄養不足、ストレス下、不調または病気の動物においては、ＩＧＦ− １濃度が低下していることがよく知られている。

ＧＨおよびＩＧＦ−１は免疫調節的性質と関連している。免疫応答は、抗原（外 来性または非自己部分）と、これらの抗原に対して特異的なレセプターを表面膜 上に有している宿主細胞（リンパ球）との相互作用の結果生じる。リンパ球は２ つの主なりラス、Ｔ細胞およびＢ細胞に分類される。

Ｔ細胞は、骨髄由来細胞から成熟して分化する場所である胸腺から生じる。成熟 Ｔ細胞は、胸腺を離れ血液からリンパ節および肺臓へそして血液に戻り、連続的 に循環する。Ｔ細胞はさらに３つの主なサブセット・ヘルパーＴ細胞、サブレ。

サーＴ細胞、そして細胞溶解性Ｔ細胞に分けられる。ヘルパーＴ細胞は他の細胞 を１助ける」が、これはすなわちＢ細胞が抗体を分泌し、細胞障害性細胞が機能 的になり、そしてマクロファージが活性化されるのを「助ける」ものである。こ のＴ細胞集団は、組織および血液中でこのサブセットを同定するために用いられ るＣＤ４表面マーカーを有する。

細胞溶解性Ｔ細胞は、標的細胞、例えばウィルスに感染した細胞、腫瘍細胞、お よび同種移植片の殺傷を担う。サプレッサーＴ細胞は免疫応答を制限して終結さ せるために作用する。細胞溶解性およびサブレ／サーＴ細胞群はＣＤ、表面マー カーにより同定される。

また、Ｂ細胞または抗体−産生細胞は骨髄において見られる未成熟な前駆体由来 である。Ｂ細胞は成熟したなら、胸腺を除くすへてのリンパ系器官に移動する。

Ｂ細胞は、レセプタータンパク質として作用するその原形質膜に結合されている 抗体分子を通して抗原と相互作用する。この表面免疫グロブリンは組織および血 液中のＢ細胞を同定するためのマーカーとして用いられる。抗原およびヘルパー Ｔ細胞との相互作用の後に、Ｂ細胞は形質細胞と称される抗体産生細胞へと分化 する。これらの形質細胞は抗体を細胞外マトリックス中に分泌する。抗体は毛細 管中へ放散して正常な血液流を通って循環する。ゆえに、血清免疫グロブリン濃 度は免疫応答の細胞力学を反映している。

多（の軟管において、小児には、ジフテリア、百日咳、および腸チフス（ＤＰＴ ）、ならびに麻疹、破傷風、おたふくかぜ、ポリオおよび風疹などの病気に対し てワクチンを投与することによりごく普通に免疫することが必要とされる。ワク チンに対するＢ細胞の反応は適当な免疫グロブリンの産生であり、これは疾病に 対する免疫を付与することを目的としている。通常、特定のＢ細胞が１つの特定 の型の抗体を産生ずるように分化されるであろうし、このような産生は１つの特 定のヤの抗原の体内での存在によりひき起こされる。ゆえに、動物またはヒトが 多くの異なる抗原に暴露された場合には、動物またはヒトはその適当な抗原が存 在する場合にその特定の免疫グロブリンを産生じ得る多くの異なるＢ細胞を有す るであろう。

ある状況下では、抗原に対する免疫応答が免疫付与に不十分である。すなわち、 効果的な免疫を付与するには不十分な量の免疫グロブリンが産生される（または 数のＢ細胞が強化される）場合である。

特にＧＨについて下垂体前葉と免疫系の間に関係があることが１９６７年から知 られている。２つのグループの研究者らが、ＧＨがリンパ系組織の成長を制御は 、下垂体性短小マウスにおいてつ／ソマトトロピンおよびチロキシンの組み合わ せにより回復した。Ｂａｒｏｎｉら、１ｍｍｕｎｏ１．、１７：３０３−３１４ 　（１９６９）。

弾性の短小ニワトリ株において、チロキシン処置が胸腺の成長を刺激した一方で 、ウシＧＨ処置の結果、抗体反応の増強および嚢の成長が生じた。Ｍａｒｓｈら 、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、　＋７５：３５１−３６１ ）　（１９８４）。しかし、常染色体性嬌小ニワトリにおいてはどちらの処置も 免疫機能を改変しなかった。ウシＧＨ治療単独では免疫不全Ｗｅｉｍａｒａｎｅ ｒイヌにおける免疫学的機能を一部回復させた。Ｒｏｔｈら、ハムＪ−Ｖｅｔ、 Ｒｅｓ、、　４５：ｌ１５１−１１５５　（１９８４）。

遺伝的なＧＨ欠損を有するマウスは、胸腺萎縮、免疫不全、および衰弱と関係す る免疫系の障害が発現し、結果として平均余命の短縮が生じる。Ｆｒａｂｒｊｇ ら、β１ｉｎ、Ｅｘｐ、ｌ＋＋＋ｍｕｎｏ１．、９：２０９−２２５　（１９７ １）。チムリン（胸腺ホルモン）の血漿濃度において年齢に関係した低下が起こ り、血漿チムリン濃度は、ｂＧＨ処置された中年および老齢のイヌにおいて上昇 することが示されている。Ｇｏｆｒら、ｄｕｎｏｌ、、　６８：５８０−５８７ 　（１９８７）。著者らは、老齢の個体においていくらかの免疫機能を回１鉦さ せるために外因性のＧＨが有用であろうことを示唆している。さらに、Ｃ、、／ Ｂ　ｌ　／６　ＪマウスへのｈＧＨの投与は、胸腺および肺臓細胞性に対するな らびにナチュラルキラー活性に対するプレドニソロンの阻害効果を逆転させるこ とが見いだされ；プレドニソロンを伴わないｈＧＨの投与ではいかなる効果も有 さなかったが、比較的高用量では胸腺のパラメーターおよびナチュラルキラー活 性の減少を誘導し、牌臓の細胞質および相対的重量にはいかなる効果も及ぼさな かった。Ｆｒａｎｃｏら、Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ、１２３ ：３３９−３４４　（１９９０）。

さらに、ＧＨは胸腺におけるＴ細胞の増殖を誘導することが示されている。

Ｍｕｒｐｈｙら＋　ＦＡＳＥＢ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ、Ａｔ１ａ ｎｔａ、＾ｐｒｉｌ　１９９１；　Ｄｕｒｕ＋＋＋ら、ＦＡrＥＢ　Ｍｅ ｅｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ、＾ｔｌａｎｔａ、＾ｐｒｉｌ　１９９１゜ＧＨ の免疫効果に対する最近の論評については、Ｋｅｌｌｅｙ、　ｒ免疫生物学にお ける成長ホルモンＪ＋　Ｐｇｙｃｈｏｎｅｕｒｏｉｓｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｉｆ、 　２ｎｄ　Ｅｄ、、　Ｂ、Ａｄｅｒら編、＾ｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ　１９９０中お よびＡｍｍａｎｎ、　ｒ成長ホルモンおよび免疫性Ｊ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｒｏｖ ｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ、　 Ｌ、Ｕｎｄｅｒｖ潤B ６編、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１ ９８８）中、　ｐＰ、２４３−２５３；　Ｗｅｉｇｅｎｔお謔■aｌ ａｌｏｃｋ、　Ｐｒｏｇ、ＮｅｕｒｏＥｎｄｏｃｒｉｎｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 　３：２３１−２４１　（１９９０）。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（Ｎ Ｋ）細胞およびマクロファージを含むすべての主な免疫細胞ヤの活性は、ＧＨに よりすへて改変し得ることが報告されている。Ｋｅｌｌｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　３８ニア０５　（１９８９）。

局所的に産生されるＩＧＦ−１は、Ｉ型ＩＧＦレセプターを介してＧＨの１９２ ８球に対する作用を媒介するという１つの報告がある。Ｇｅｆｆｎｅｒら、　Ｊ 、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ、、　７１：４６４　（ １９９０）。また、Ｆ　ｒａｎｃｏらは３４３頁に、免疫系に対するｈＧＨのい くつかの効果がＩＧＦ−１を介して起こることを推測している。１１ｍ５ｉｔら （７３ｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅ ｔｙ、Ｊｕｎｅ　１９−２２．　１９９１．　≠ｂ唐狽窒■ ｃｔ　１２９６）はｈＧＨおよびＩＧＦ−１か胸腺ホルモン機能を刺激すること を報告している。

ＩＧＦ−１様分子を産生ずる免疫系細胞の能力についての証拠を提供するデータ か開示されている。これらには、活性化された肺胞マクロファージ［Ｒｏｍら、 ＬＣ１ｉｎヨ１ｎシｅｓｔ、、η１６８５　（１９８８）：、エプスタイン・バ ールウィルスで形質転換されたとトＢリンパ球ＥＭｅｒｉｍｅｅら、Ｊ、Ｃｌ１ ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、Ｍｅｔａｂ、、６９：９７８　（１９８９）］、■ＧＦ 　ｌに対するｍＲＮＡの検出による肺臓および胸腺組織［Ｍｕｒｐｈｙら、　Ｅ ｎｄｏｃｔｉｎｏｌｏｇｙ、１２０：１２７９　（１９ｇ？）コ、および正常Ｔ 細胞［Ｇｅｆｆｎｅｒら、上記コが含まれる。

さらに胸腺または炎症部位などの組織中で局所的に産生されたＩＧＦ−１はＩＧ Ｆ−ルセブターを有している１９２８球の増殖および機能に影響を及ぼしている 可能性があることを示すデータが提出されている。Ｔａｐｓｏｎら＋　Ｊ、Ｃｌ １ｎ、１ｎｖｅｓし、牲：９５０−９５７　（１９８８）。ＩＧＦ−１を１８日 間注入した下垂体切除ラットの胸呻および肺臓重量は、対照またはＧＨで処置し たものと比較して、統計学的に有意に増加していることが観察された。Ｆｒｏｅ ｓｃｈら＋　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉ ｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ、　０．　ｌ５ａｋｓｓｏｎら編中、ｐ、３２１−３２ ６　（１９８７）。また、ＩＧＦ−１で処置した若齢のＧＨ欠損う、トにおける 胸腺組織の増大［Ｇｕｌｅｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

リンのどちらかを用いた糖尿病ラットにおける萎縮した胸腺の再集団化を示して いるが：ＷＲ腺および牌臓の大きさに対する大きな効果にもかかわらず、該う、 トをつ／血清アルブミン（ＢＳＡ）て免疫および追加免疫した場合には、血清抗 ＢＳＡ抗体は、抗体反応に対するインスリンまたはＩＧＦ−１の効果を全く示さ なかった。Ｂｉｎｚら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳ Ａ）、　８７：３６９０−３６９４　（１９９０）。　ＩＧＦ−１■ リンパ球の増殖を刺激することが報告されている［Ｊｏｈｎｓｏｎら、　Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅｔη−ヱ３ｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、ａ ｂｓｔｒａｃｔ　Ｉ（１７３，Ｊｕｎｅ　１９−’２２．　１９９１コ。

さらに、ＩＧＦ−１は、骨髄腔を造血細胞で再度占膏させ［Ｆｒｏｅｓｃｈら、 上記］、下垂体切除されたラットにおける赤血球生成を刺激し［Ｋｕｒｔｚら、 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８５ニア８２５−７８２９　（１９ｇ！ｌ）］、骨髄細 胞の懸濁培養物において形態学的に認識可能な顆粒球および赤血球の前駆体の成 熟を増強することが見いだされた。

Ｍｅｒｃｈａｖら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、８１ニア９１　（１４１ ８８）。

ナノモル濃度で、１ＧＦ−■はリンパ球に対する増殖−促進因子である。Ｓｃｈ ｉｍｐｆｒら、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　＋０２：２１−２５　 （１９８３）。Ｔ細胞ではなく、Ｂ細胞が［ＧＦ−１に対するレセプターを有す ることが最近示されている。５ｔｕａｒｔら、シ叶堕び活性化Ｔ細胞のための化 学走性物質として、休止および活性化Ｔ細胞へのチミン／の取り込みの増加を刺 激する。正常なＴセルラインはＩＧＦ−１に応答して基礎的なコロニー形成の増 大を示す。また、胸腺または炎症部位などの組織において局所的に産生されたＩ ＧＦ−１が、ＩＧＦ−ルセブターをａするＴリンパ量依存的な様式で、Ｉ　Ｌ− ２誘導性増殖反応およびインビトロでの肺細胞の抗体反応を抑制することが報告 されている。ＨｕｎｔおよびＥａｒｄｌｅｙ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３ ６Ｊ９９４−３９９９　（１９８６）。

当分野で、哺乳類または鳥類の免疫系（細胞介在性または抗体介在性の免疫応答 ）を刺激するであろう薬物を供給する必要がある。暴露されている抗原に対して 妥協した（損なわれた）免疫系を有する患者の抗体反応を高めるであろう薬物に 対する必要性が特に存在する。ＩＧＦ−［を取り巻く分野における論議から見て 、胸腺および肺臓などの免疫機能に関与する器官の大きさの単なる増加とは対照 的に、免疫機能の増強におけるその効果、またはインビトロもしくはインビボで のＴもしくはＢ細胞の活性の上昇におけるその効果がどのようなものであるかは 明らかでない。

即ち、本発明の目的は哺乳類または鳥類の免疫応答を刺激することである。

免疫グロブリン産生細胞の数の増加および／またはあらかじめ決定された免疫原 に応答して個々の免疫グロブリン産生細胞により産生される免疫グロブリンの電 の増加により免疫グロブリンの産生を増強させることが特定の目的である。

入きく阻害された免疫系を有する患者、例えば骨髄移植を受けた患者またはＡＩ 　Ｄ　Ｓ　を者における抗体反応の増強がさらに特定の目的である。

これらおよび他の目的は当業者には明らかであろう。

発明の要旨 即ち本発明は、免疫刺激に有効な量のＩＧＦ−１を哺乳類または鳥類に投与する ことからなる哺乳類または鳥類の免疫系を刺激するための方法を提供するもので ある。

さらに特定の態様において、本発明は、哺乳類または鳥類に免疫原およびＩＧＦ −１の有効量を投与することからなる免疫原に対する哺乳類または鳥類の抗体反 応を増強させるための方法を提供する。好ましくは、この投与は同時に行い、後 にＩＣＦ−１を与えない場合と比べて短縮された間隔で免疫原の追加免疫を行う 。

別の態様において、本発明は免疫系を刺激するためにＩＧＦ−１およびＧＨＯ何 効量を共に投与することを提供する。

さらに別の態様において、免疫原に応答してヒトまたは他の哺乳動物被験体（こ の対象は不十分な免疫グロブリン産生が起こる症状を有する）のＢ細胞により産 生される免疫グロブリンの量を増加させる方法であって、免疫グロブリンの産生 を増強させるのに有効な量のＩＧＦ−１を該被験体に投与することからなる方法 を提供する。

さらに他の態様において、本発明は免疫原に応答するヒトまたは他の哺乳動物被 験体（この対象はヘルパーＴまたは細胞溶解性Ｔ細胞の不十分な活性が発生する 症状を有する）におけるＴ細胞の反応性を増強させる方法であって、ヘルパーＴ または細胞溶解性Ｔ細胞活性を上昇させるのに有効な量のＩＧＦ−Ｉを該被験体 に投与することからなる方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は免疫不全の哺乳類または鳥類を治療するため の方法であって、 （ａ）哺乳類の血清ＩＧＦ−１ｆｉ度を測定し：そして（ｂ）血ｆｉｌＧＦ−１ １度がその哺乳類または鳥類の正常濃度より低い場合には、免疫性を回復させる ためにＩＧＦ−１の有効量を哺乳類または鳥類に投与する：ことからなる方法を 提供する。

上記の全動物における最近の研究により、ＩＧＦ−１はＧＨ欠損動物においてｌ ｌｌ＠および胸腺重量の増加をひき起こし得ることが示されているが、これらの 研究は胸腺および肺臓の大きさまたは細胞数における大きな変化を記載する以上 には進んでいない。肺臓および胸腺の大きさの他の操作は機能に対する効果とは 関連がないことが示されている。ＪａｒｄｉｅｕおよびＦｒａｋｅｒ、　Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、↓２４　：２６５０−２６５５　（１９８０）。さらに、Ｂｉ ｎｚら（上記）は糖尿病ラットモデルを使用し、このモデルにおいてインスリン およびＩＧＦ−１が糖尿病に影響を及ぼし、それゆえに体内のすべての組織を救 うであろうが、ＩＧＦ−１およびインスリンが抗体力価にはいかなる機能的効果 も及ぼさないことが見いだされた。

この分野の観点に立てば、本発明は、ＩＧＦ−１の投与による肺臓および胸腺重 量の増加だけではなく、胸腺、肺臓またはリンパ節の機能についても、増大した 胛細胞数、肺臓子細胞群数、肺臓Ｂ細胞数、およびインビトロでのマイトジェン に対するそれらの反応により示される予想外の発見を表す。ここで示されるＢ細 胞数および反応性の増大は、抗原に応答したこれら細胞による抗体産生の増大と 解釈される。この方法はＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　患者なとの妥協したく損なわれた）免 疫系を有する患者の治療において有用であろうと考えられ、そのような患者にお いては抗原に対して増強された抗体反応が感染性疾患を防ぎ、またはその重篤間 を軽減するであろうし、さらにワクチンがより有効なものとなるであろう。ＩＧ Ｆ−１が用いられる場合には必ずＩＧＦ−１１が同様に機能するであろうと予測 することは妥当なことである。

図面の簡単な説明 ［；ｌ］ｌ　ハ、種々の用ｆｆｉのＩＧＦ−１のミニポンプによる投与７日後の 短小うｙトの肺臓重電のグラフである。

図２Ａおよび２Ｂは、ミニポンプにより７日間、ＩＧＦ−１またはｄｅｓ　−Ｉ 　ＧＦ−１で処置した下垂体切除ラットにおける肺臓重量一対一体重比および胸 腺重量一対一体重比のグラフを各々表す。

図３は、ＩＧＦ−１で１４日間処置した成体雌性ラットの肺臓重量一対一体重比 のグラフを表す。

図４は、賦形剤、ＩＧＦ−１，ｈＧＨまたはＩＧＦ−１＋ｈＧＨで処置した老齢 ラットにおける体重増加のグラフである。

図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＩＧＦ−１処置または賦形剤処置７日後の胛細胞数 、肺臓Ｔ細胞群数、および肺臓Ｂ細胞数の各々についてのグラフを提供する。

図６は、ＩＣＦ−１処置または賦形剤処置７日後の胸腺細胞数についてのグラフ を提供する。

図７は、マウスの最初の賦形剤またはＩＧＦ−１処置７日後の、ＬＰＳ（図７Ａ ）、ＣｏｎＡ（図７Ｂ）、またはＰＷＭ（図７Ｇ）のマイトジェンを用いたマイ トジェン性の反応のグラフを表す。

図８Ａ、８Ｂおよび８ＣはＩＧＦ−１処置または賦形剤処置１４日後の、牌細胞 数、肺臓Ｔ細胞群数および肺臓Ｂ細胞数の各々についてのグラフを提供する。

図９は、ＩＧＦ−１処置、ｈＧＨ処置、ＩＧＦ−［対照処置、およびｈＧＨ対照 処置の１４日後の胸腺細胞数についてのグラフを表す。

図１０は、マウスの最初の賦形剤またはＩＧＦ−１またはｈＧＨ処置の１４日後 の、ＬＰＳ（図１０Ａ）、ＣｏｎＡ（図１０Ｂ）、またはＰＷＭ（図１０Ｃ）の マイトツエンを用いたマイトジェン性反応のグラフを表す。

図１１ＡＳ　ＩＩＢおよびＩＩＣは、賦形剤、ＩＧＦ−［、ｈＧＨ，およびＩＧ Ｆ−１＋ｈＧＨての処置１４日後の、牌細胞数、肺臓子細胞群数および肺臓Ｂ細 胞数の各々についてのグラフを提供する。

図１２は、ＩＧＦ−１処置、ｈＧＨ処置およびＩＧＦ−１＋ｈＧＨ処置の１４日 後の胸腺細胞数のグラフを表す。

図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、賦形剤、ＩＧＦ−１、ｈＧＨ，およびＩＧＦ −１＋ｈＧＨての処置の終了の７日後の、肺臓リンパ球数、膵臓Ｔ細胞亜群数お よび肺臓ＢＩＩＢＩＩＩ数の各々についてのグラフを提供する。

図１４は、賦形剤、ＩＧＦ−ＩＳｈＧＨ，およびＩＧＦ−１＋ｈＧＨでの処置の 終了の７日後の胸腺細胞数のグラフを表す。

図１５は、マウスの賦形剤、ＩＧＦ−１，ｈＧＨ，およびＩＧＦｌ＋ｈＧＨでの 処置の終了の７日後の、ＬＰＳ（図１５Ａ）、ＣｏｎＡ（図１５Ｂ）、またはｐ ｗ＼４（図１５Ｃ）のマイトジェンを用いたマイトジェン性反応のグラフを表す 。

図１６Ａおよび１６Ｂは、賦形剤、ＩＧＦ−１，ｈＧＨ，およびＩＧＦ−１＋ｈ ＧＨでの処置の終了の７日後のリンパ節細胞数およびリンパ節Ｔ細胞群数の各々 についてのグラフを表す。

図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｇは、賦形剤、ＩＣＦ−１、ｈＧＨ，およびＩＧＦ −１＋ｈＧＨでの処置の終了の２１日後の肺臓リンパ球数、肺臓子細胞群数およ び肺臓Ｂ細胞数の各々についてのグラフを提供する。

図１８は、賦形剤、ＩＧＦ−１、ｈＧＨｌおよびＩＧＦｉ＋ｈＧＨでの処置の終 了の２１日後の胸腺細胞数のグラフを表す。

図１９は、マウスの賦形剤、ＩＧＦ−１，ｈＧＨ，またはＩＧＦ−１＋ｈＧＨで の処置の終了の２１日後の、ＬＰＳ（図１９Ａ）、ＣｏｎＡ（図１９Ｂ）、また はＰＷＭ（図１９０）のマイトジェンを用いたマイトジェン性反応のグラフを表 す。

図２０は、ジニトロフェニルーオバルブミンコンジュゲートによる最初の免疫（ ０日、ＡＧと表示）からの退散の関数としてマウス血清中の抗ジニトロフェニル ーオバルブミン１ｇＧ（図２ＯＡ）および全１８Ｇ（図２０Ｂ）の濃度（μｇ／ ｍｌ）を示し、３週目（２０日）にフンンユゲートおよび与えられた賦形剤また はＩＧＦ−１を用いてマウスに追加免疫している。

図２１は、移植された骨髄を有するマウスおよび有さないマウスを賦形剤または ４０ｇｇもしくは１２０μｇのＩＣＦ−１で処置した場合の体重増加の変化を示 す。

図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｇは、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇも しくはＩＧＦ−１１２０μｇで処置したマウスへの照射１４日後の、末梢血り／ バ球Ｂ細胞、Ｔ細胞亜群、およびＨ／Ｓ比の各々についてのグラフを示す。

図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇも しくはＩＧＦ−１１２０μｇで処置したマウスへの照射１４日後の、肺臓リンパ 球数、肺臓Ｔ細胞亜群および肺臓Ｂ細胞数の各々についてのグラフを示す。

図２４は、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇもしくはＩＧＦ−１１２０ μｇで処置したマウスへの照射１４日後の、ＬＰＳ（図２４Ａ）、ＣｏｎＡ（図 ２４Ｂ）、またはＰＷＭ（図２４０）のマイトジェンを用いたマイトジェン性反 応のグラフを表す。

図２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃは、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇも しくはＩＧＦ−１１２０μｇで処置したマウスへの照射２１日後の、末梢血リン パ球Ｂ細胞、Ｔ細胞亜群、およびＨ／Ｓ比の各々についてのグラフを示す。

図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃは、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−Ｉ　４Ｑμｇ もしくはＩＧＦ−■　１２０μｇで処置したマウスへの照射２１日後の、金牌細 胞数、Ｔ細胞亜群および肺臓Ｂ細胞数についてのグラフを示す。

図２７は、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇもしくはＩＧＦ−１１２０ μｇで処置したマウスへの照射２１日後の、ＬＰＳ（図２７Ａ）、ＣｏｎＡ（図 ２７Ｂ）、またはｐｗＭ（図２７Ｃ）のマイトジェンを用いたマイトジェン性反 応のグラフを表す。

図２８は、骨髄移植して賦形剤、ＩＧＦ−１４０ｇｇもしくはＩＧＦ−１１２０ μｇで処置したマウスへの照射１４日後（図２８Ａ）または２１日後（図２８Ｂ ）の胸腺リンパ球数のグラフを表す。

本明細書中で用いる「免疫系を刺激する」とは、哺乳類または鳥類の免疫機能を 増強することを意味し、該増強は抗体の媒介によるものかまたは細胞の媒介によ るものであり、該免疫系はＩＧＦ−１で処置される宿主にとって内因性であるか または提供者からＩＧＦ−Ｔが与えられる宿主受容者に移植される（例えば骨髄 移植など）ものである。例えば、該刺激は肺臓リンパ球数、肺臓子細胞群数（Ｔ 細胞、ＣＤ４およびＣＤ、）、または肺臓Ｂ細胞などの肺臓細胞数の増加の結果 生じるかまたは胸腺細胞数の増加の結果生じるであろう。免疫系応答に関与する 他の細胞には、ナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび好中球が含まれる 。さらに、該刺激は免疫原に応答した抗体産生の増加によることもある。

本明細書中で用いる「妥協した（損傷した）免疫系」および［不十分な免疫グロ ブリン産生が起こる疾患」の表現は、抗原に対する抗体の正常より小さな反応を 有するヒトならびに動物の免疫系を意味し、これは、その肺臓サイズがあるべき サイズより小さいためであるか、肺臓が部分的にしか機能しないため、化学療法 物質などの薬物が正常な免疫機能を抑制しているため、該動物が機能的にＩＧＦ −１（またはＧＨ）欠損であるためであるか、または他のあらゆる因子による。

その例には、老齢の轡者、化学療法または照射療法を受けている患者、重い病気 から回ｔＫしつつある患者、または手術を受けようとしている患者、ＡＩＤＳ患 者、先天性および後天性Ｂ細胞欠乏症、例えば低ガンマグロブリン血症、通常の 様々な無カンマグロビリン血症、および選択的免疫グロブリン欠乏症、例えばＩ ｇＡ欠乏症の轡者、中、者の免疫応答よりも短い潜伏期間を有する狂犬病などの ウィルスに感染した轡者、およびディ・ジコージ症候群などの遺伝性の疾患を有 する患者か含まれる。本明細書中で用いられる可能性のある哺乳類および鳥類に は、経済的に重要な哺乳類および部類、例えばウシ、ヒツジおよびブタなどの動 物、ならびにニワトリおよび七面鳥が含まれる。哺乳類は肺臓の萎縮およびその 後のＢ細胞の数および機能の損失を呈することがある。本明細書中での好ましい 哺乳類はヒトである。

本明細書中で用いられるｒｌＧＦ−ＩＪは、ウシ、ヒンジ、ブタ、ウマ、鳥類お よび好ましくはヒトを含むあらゆる種由来であり、天然配列または変異体型であ り、天然、合成または組換えによるあらゆる供給源から得られるインスリン様増 殖因子を書味する。動物への使用のために本明細書中で好ましいＩＧＩ”−１は 、処置される特定の種由来のＩＧＦ−１の型であり、例えばブタを処置するため のブタＩＧＦ−１、ヒツジを処置するためのヒツジＩＧＦ−１、ウシを処置する ためのつ／ＩＧＦ−１なとである。本明細書中でヒトへの使用のために好ましい Ｉｃ、　Ｆ　−１は、ヒト天然配列、成熟ＩＧＦ−１であり、より好ましくはＮ 末端メチオニンを持たず、例えばＥＰ　２３０．８６９（１９８７年８月５日発 行）　；　ＥＰ　１２ｇ、　７３３（１９８４年１２月１９日発行）、またはＥ Ｐ　２８８．４５１（１９８８年１０月２６日発行）に記載の方法により製造さ れるＩ　Ｇ　Ｆ−川である。さらに好ましくは、この天然配列ＩＧＦ−１は、組 換え法により製造され、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　ｌ　ｎｃ、　（Ｓｏｕｔｈ　Ｓ ａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）から臨床調査のために入手可能なＩＧＦ− １である。さらに使用に好ましいＩＧＦ−１は、例えばＫａｂｉＧｅｎ　ＡＢ（ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）から入手可能な、胎盤膜を用いたラジオ レセプターアッセイにより測定したときに約１４，０００単位／■ｇより大きな 比活性を有するＩＧＦ−１である。

最も好ましＬｌ［ＧＦ−１変異体は、ＰＣＴ　１０１１７１０１０３ｇ（１９８ ７年２月２６日発行）およびＰＣＴ　Ｗｏ　８９１０５８２２（１９８９年６月 ２９日発行）に記載の変異体、すなわち成熟分子のＮ末端からの位置３で少なく ともグルタミン酸残基が欠如している変異体、またはＮ末端に５個までのアミノ 酸の欠失を有する変異体である。最も好ましい変異体は、Ｎ末端から最初の３Ｍ のアミノ酸が欠失している変異体（脳ＩＧＦ、ｔＩＧＦ−１，ｄｅｓ（１３）− １ＧＦ−１、またはｄｅｓ−ＩＧＦ−Ｉと様々に表示される）である。

本明細書中て用いられるｒＧＨＪは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、鳥類および好 ましくはヒト（ｈｃＨ）を含むあらゆる種由来であり、天然配列または変異体型 であり、天然、合成または組換えによるあらゆる供給源から得られる成長ホルモ ンを意味する。これには、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮｌｌの商標の下にＧｅｎｅｎｔｅ ｃｈ、　Ｉ　ｎｃ、により販売されておりＮ末端メチオニン残基の存在を除いて 天然のポリペプチドに同一なＭｅｔ−ｈＧＨ［Ｕ、Ｓ、　４，７５５，４６５（ １９８８年７目５日発行）およびＧｏｅｄｄｅ　ｌら、廁ｅ、　２８２：５４４ 　（１９７９）］、およびＮｕｔｒｏｐｉｎ”の商標の下にＧｅｎｅｎＬｅｃｈ 、　Ｉｎｃ、から臨床的および学術的な研究者らに対して入手可能であって、さ らにＥｌｉ　Ｌｉ１ｌｙから市販品として入手可能な、メチオニ／残基が欠如し ており天然のホルモンの配列に同一なアミノ酸配列を有する組換えｈＧ　Ｈ（ｒ ｈＧ　Ｈ）の両方が含まれる。Ｇｒａｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　２ ：１６１　（１９８４）を参照。ｍｅｔ−ｈＧＨおよびｒｈＧ　Ｈの両方は同等 の有効性および薬物動力学の値を有する。Ｍｏｏｒｅら、上記。別の適当なｈＧ Ｈ候補物質は、純粋な体細胞原性活性を有し、乳腺刺激性の活性を有さないＧＨ の胎盤型であるｈＧＨ変異体である。Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、Ｎｏ、　４，６７０，３ ９３（１９８７年６月２日発行）。

本明細書中で用いられる「免疫原に対する抗体反応を増強する」という表現は、 ＩｇＧが指向性である抗原の追加免疫に応答して動物の血清免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ）力価が上昇することを意味する。増強された抗体反応の舟橋には、免疫原 の追加免疫注射に対する抗体産生の増強、ならびに患者におけるＢ細胞数の増加 が含まれる。該免疫原はそれに指向性の抗体を増加させるいかなる免疫原であっ てもよいが、好ましくはワクチンを含むウィルス、または細菌である。本発明は 、哺乳類または鳥類が、例えば狂犬病などの哺乳類または鳥類の免疫応答よりも 短い潜伏期間を有するウィルスに感染した場合に特に有用である。本明細書中の ■ＧＦ−１は、第一および第二の免疫の間または第二の免疫とその後の免疫原の 追加免疫の間の間隔を減少させる。

不十分なヘルパーＴまたは細胞溶解性Ｔ細胞活性が発生する疾患に罹患している 被験体において「免疫原に対するＴ細胞反応性を増強させる」という本明細書中 で用いる表現は、ウィルス抗原、腫瘍、細菌などを含むＴ細胞が反応する免疫原 に応答した哺乳動物のヘルパーＴおよび／または細胞溶解性Ｔ細胞活性の程度を 上昇させることを意味する。不十分なヘルパーＴまたは細胞溶解性Ｔ細胞活性を 有する被験体は、例えば抗体の分泌、マクロファージの活性化およびウィルスに より感染した細胞または腫瘍細胞などの標的細胞の殺傷のために必要な、ヘルパ ーＴおよび／または細胞溶解性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ、／ＣＤ、マーカーにより 測定される）が正常な数より少ない哺乳動物である。

本明細書中で用いる、哺乳動物における「免疫性を回復する」という表現は、肺 臓または胸腺細胞の回復により、またはＴ細胞反応性の増強もしくはＢ細胞によ り産生される免疫グロブリンの量の増加により、哺乳動物の免疫性の程度を正常 へと戻すことを意味する。

（以下、余白） Ｂ２本発明を実施するための方法 本発明の様々な目的のために、ＩＧＦ−１は非経口を含むあらゆる適当な方法に より哺乳類または鳥類に直接投与し、局所または全身に投与することができる。

投与の特定の経路は、例えばＩＧＦ−１を用いた、知覚されるまたは予想される 副作用を含む患者の医学的経歴に依存するであろう。非経口投与の例には、皮下 、筋肉内、静脈内、動脈内および腹腔内投与が含まれる。

最も好ましくは、投与は連続注入（例えば浸透ポンプなどのミニポンプを用いる ）により、または例えば静脈内または皮下の手段を用いた注射により行う。好ま しくは、投与をＩＣＦ−１のために皮下により行う。また、単一ボーラスとして 、または低速−放出貯蔵物製剤であってもよい。最も好ましくは、ＩＧＦ−１を 注入により連続的に、最も好ましくは皮下に投与する。

さらにＩＧＦ−１は、任意の１またはそれ以上のその結合タンパク質、例えばＩ ＧＦＢＰ−２、ＩＧＦ−ＢＰ−４または最も好ましくはＩＧＦＢＰ−３［１０８ ９１０９２６ｇ（１９８９年１０月５日発行）およびＭａｒｔｉｎおよびＢａｘ ｔｅｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、　２６１：８７５４−８７６０　（＋９８ ６）に開示されている］と共に適当に投与する。このグリコジル化タンパク質は 、内因性ＩＧＦの大部分を運搬するヒト血漿中に見られる１２５〜１５０Ｋｄの 糖タンパク質複合体の、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約５３Ｋｄを有する酸 −安定な成分であり、さらにＧＨにより一調節されている。また、ＩＧＦ−［を 投与のためにレセプターまたは抗体または抗体フラグメントに適当に結合させる 。

治療において用いるべきＩＧＦ−１組成物は、個々の患者の臨床的状態（特にＩ ＧＦ−［単独による治療の副作用）、ＩＧＦ−１組成物の供給部位、投与方法、 投与計画、および実施者に既知の他の因子を考慮に入れて、良い医療の実施と一 致する様式で製剤化して投与されるであろう。従って、本明細書中での目的のた めのＩＧＩ−１の「有効量」（免疫刺激性の有効量を含む）は、このような考慮 により決定する。

一般的な提案として、非経口的に投与されるＩＧＦ−１の１用量あたりの薬学的 に有効な全体量は、患者の体重に対して約１μｇ／ｋｇ／日〜ｌ　Ｏｍｇ／ｋｇ ／日の範囲にあるであろうが、上記のようにこれは治療上の裁量の下にあるであ ろう。より好ましくは、この用量は少なくとも０　、０１　ｓａｇ／ｋｇ／日で あり、そしてヒトにとって最も好ましくはホルモンのために約領０１と１　ｍｇ ／ｋｇ／日の間である。連続的に与えるなら、ＩＧＦ−１は通常約ｌμｇ／ｋｇ ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の用量速度で、１日当たり１〜４注射または例えば ミニポンプを用いた連続皮下注入のどちらがて投与する。静脈内バッグ溶液を用 いてもよい。適当な用量の選択における重要な因子は、抗体産生の増強、肺細胞 または胸腺細胞数の増加、肺臓Ｂ細胞の増加などにより測定して得られる結果で ある。

免疫系に影響を及ぼすｌ　ＧＦ−１処置の経過は、マウスの場合には７日である 特定の最小日数より長く続けた場合に最適であると思われる。変化の観察に必要 な処置の長さおよび反応が起こるための処置後の間隔は、所望の効果に依存して 変化すると思われる。

さらにＩＧＦ−１は、持続放出系により投与するのが適している。持続放出組成 物の適当な例には、成型された物品の形態にある半透性の重合体マトリックス、 例えばフィルムまたはマイクロカプセルが含まれる。持続放出マトリックスには 、ポリラクチド（Ｕ、　Ｓ、　Ｐｕｔ、　Ｎｏ、　３．７７３．９１９、ＥＰ　 ５ｇ、　４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγヒドロキシ醋酸（ＥＰ　１３３． ９１ｔ８）か含まれる。また、持続放出ＩＧＦ−１組成物にはリポソームにより 包入されたＩＧＦ−１が含まれる。ＩＧＦ−１を含有するリポソームは、本質的 に既知の方法　ＤＥ　３．２１ｇ、　１２１；　Ｅｐｓｔｅｉｎら、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ其じ　Ｓ、Ａ、、８２：３６８８−３６９２　（１ ９８５）：　Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、、７V：４０ ３０−４０３４　（１９８０）；　ＥＰ　５２．３２２：　ＥＰ　３６，６７６ ：　ＥＰ　８ｇ、０４６；　ＥＰ　１４３，９４９；　ＥＦf　１４２，６４１ ： Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｐａｔ、＾ｐｐｌｎ、　８３−１１８００８；　Ｕ、Ｓ、Ｐ ａｔ、Ｎｏ、　４，４８５，０４５および４．５４４．５４T； およびＥＰ　１０２．３２４により調製する。通常、該リポソームは、脂質含量 が約３０モル％コレステロールより多い、小さな（約２００〜８ｏｏオングスト ローム）単層状型であり、選択された比率は最適なＩＧＦ−１治療のために調整 する。

１つの態様において、非経口投与のためにＩＧＦ−１を単位投与量の注射可能な 形態（溶液、懸濁液または乳濁液）に所望の純度で、薬学的に許容し得る担体、 すなわち用いられる投薬量および濃度で受容者に対して非毒性であって製剤の他 の成分と融和性である担体と混合することにより製剤化するのが普通である。例 えば、該製剤は好ましくは酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが 知られている他の化合物を含まない。

通常、該製剤はＩＧＦ−１を液体の担体または細かく分割された固体の担体また はこれら両方と一様にそして完全に接触させることにより調製する。次いで、必 要ならば、その生成物を所望の製剤へと成型する。好ましくは該担体は非経口的 な担体であり、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。このような担 体媒体の例には、水、食塩水、リンガ−液、およびデキストロース溶液が含まれ る。さらに非水性の媒体、例えば固定油およびオレイン酸エチル、ならびにリポ ソームが本明細書中で有用である。

担体には、等張性および化学的安定性を増強させる物質などの添加物の少量を含 有させるのが適している。このような物質は、用いられる投薬量および濃度で受 容者に対して非毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸 および他の有機酸またはこれらの塩：抗酸化物質、例えばアスコルビン酸；低分 子量（約ｌＯ残基以下）のポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプ チド：タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親 水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グル タミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖、三糖およびセルロースまた はその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、またはデキストリ ン：キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソ ルビトール：対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性 剤、例えばポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧを含む。

ＩＧＦ−１は通常、このような媒体中に約０．１ｍｇ／鋼ｌ〜１００　ｍｇ／１ １の濃度でｐＨ約３〜８で製剤化する。標準の長さのＩＧＦ−１は通常約６以下 のｐＨで安定であり；　ｄｅｓ（１〜３）−１０Ｆ−１は約３．２〜５で安定で ある。上記のある種の賦形剤、担体または安定化剤の使用の結果、ＩＧＦ−１の 塩が形成されることは理解されるであろう。

さらに、ＩＧＦ−Ｉ、好ましくは標準の長さのＩＧＦ−１は適当な担体媒体中に 適当に製剤化して、細胞を含まない医薬組成物を得るのが好ましい。１つの態様 におて、製剤化に用いる緩衝剤は、組成物が混合の直後に用いられるかまたは後 の使用のために保存されるかによるであろう。直ちに用いる場合には、標準の長 さのＩＧＦ−１をマンニトール、グリシンおよびリン酸（ｐＨ７，４）中に製剤 化することができる。この混合物を保存すべきであるなら、約６のｐＨで緩衝剤 、例えばクエン酸中に、このｐＨでＧＨの溶解性を上昇させる界面活性剤、例え ば０点１％ポリソルベート２０またはボロキサマー１８８と共に製剤化する。最 終の調製物は安定な液体または凍結乾燥された固体であってよい。

治療的投与のために用いられる［ＧＦ−１は無菌性でなければならない。無菌性 は、無菌性の濾過膜（例えば０２μ膜）での濾過により容易になし遂げられる。

通常、治療用のＩＧＦ−１組成物は、無菌性の利用口を有する容器、例えば静脈 内溶液バッグまたは皮下注射用の注射針により貫通可能なストッパーを有するバ イアル中に入れる。

通常、ＩＣＦ−１は単回または多回投与用容器、例えば密封したアンプルまたは バイアル中に水性の溶液または再組成のための凍結乾燥製剤として保存されるで あろう。凍結乾燥製剤の例として、無菌的に濾過した１％（ｖ／ｖ）水性ＩＧＦ −１溶液（５ｍｌ）で１ｏａｆのバイアルを満たし、得られた混合物を凍結乾燥 する。その注入溶液は、凍結乾燥されたＩＧＦ−１を静菌性の注射用水を用いて 再組成することにより調製する。

さらに、本発明の目的のためにＧＨを１回投与量としてＩＧＦ−１と混合するこ とができ、上記でＩＧＦ−１のために用いた適当な投与を用いる。ｈＧＨはＩＧ Ｆ−１よりも高いｐＨ，例えば７．４〜７．８で安定であることに注目される。

ＧＨを投与する場合には、１またはそれ以上のその結合タンパク質と共に投与す るのが適している。良く特徴付けられたこのような結合タンパク質は、血液中を 循環するＧＨレセプターの細胞外ドメインの構成要素であり、ヒトを含むいくつ かの種［ＹｓｅｒおよびＨｅｒｉｎｇｔｏｎ、　ｋｌｏｌ、ｃｅｌｌ、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏ、、　４１：１５３　（１９８５）；　Ｓｍ１ｔ■■ よびＴａ１ａｓａｎｔｅｓ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２３：１４８ ９−１４９４　（１９８８）；　ＥｓｔｎｅｒおよびＲｏｏ刀{　Ａ ｅｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ　（Ｃｏｐｅｎｈ、）、　１２２：２ ９６−３０２　（１９９０）］においてＧＨＢＰとして機能する高親和性成長ホ ルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）である。Ｂａｕｍａｎｎら、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、、　６２：１３４−１４１　（ １９８６）；　ＥＰ　３６６．７１０（１９９０年５月９日■s）； Ｈｅｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、７７：１８１７−１ ８２３　（１９８６）；　Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３R０： ５３７−５４３　（１９８７）。また、ＧＨに対して比較的低い親和性を有する 第二のＢＰは、構造的にＧＨレセプターに関連がないようであることが開示され ている。Ｂａｕａａｎｎおよび５ｈａｖ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ、Ｍｅｔａｂ、、　７０：６８０−６８６　（１９９０）。

ＧＨおよびＩＧＦ−１の両投存置は、共に使用する場合にはＩＧＦ−１を単独で 投与する場合よりも少なくてよい。ＩＧＦ−１およびＧＨの両投存置を案出する 実施者は、これらのホルモンによる治療の既知の副作用を考慮にいれるべきであ る。ｈＧＨについての副作用には、ナトリウム貯留および細胞外容積の拡大［Ｉ ｋｋｏｓら、Ａｅｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、３ ２：３４１−３６１　（１９５９）；　Ｂｉｇｌｉｅｒｉら１C １ｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、、　２１：３６１−３７０　（１ ９６１）］、ならびに高インシスン血症および高血糖が含まれる。ＩＧＦ−１の 主な見かけの副作用は低血糖である。Ｇｕｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳ＾、＋９８９．上記。

好ましくは、ＩＧＦ−１をＡＩＤＳワクチン（例えば、ｇｐ１２０またはａｐ１ ６０ワクチンまたはｇｐレセプターを基本とするワクチンのカクテル）などのワ クチンと共に（すなわち、ワクチンと同時またはワクチン後に）、最初の免疫の 間またはワクチンの追加免疫の間のどちらかに、抗体反応の増強を確実にするた めに投与する。最も好ましくは、各追加免疫の時点でＩＧＩ−１を与える。ワク チンを伴うＩＧＦ−１の使用は、ワクチンの有効性を、特に妥協した免疫系を有 する患者において増大させるであろう。

免疫不全の哺乳動物を診断して、それら疾患の原因となり、ＩＧＦ−１を用いた 処置により逆転させ得る、低い血清ＩＣＦ−１濃度をそれらが宵するか否かを決 定することは本発明の別の態様である。このようなヒト患者には、老齢、栄養不 足、栄養不良または病気の患者が含まれるであろう。このような免疫不全の患者 の血清ＩＧＦ−１濃度を診断して、その目的のために有効なＩＧＦ−１の量を投 与することによって、正常より低い血清ＩＧＦ−１濃度を有する患者のＩＧＦｉ ［ｆｌｌｉ＆濃度を回復させることにより、患者の免疫性は回復するであろう。

患者におけるＩＧＦ−１濃度の診断はあらゆる常法により行うことができるが、 通常、Ｆｕｒｉａｎｅｔｔｏら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　６０： ６４８−６５７　（１９７７）；　Ｂａ１ａおよびＢｈａｕ＝{ｉｃ ｋ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌ、、　４９ ニア７０−７７７　（１９７９）；およびＺａｐｒら、しり■ ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、　６８：１３２１−１３３０　（１９ｇりに記載のように 、抗ＩＧＩ−１抗体を用いるＥｌ、ｌｓＡまたはＲＩＡ試験に血液サンプルを供 することにより行う。

大奥Δ土　器官重量、ＢおよびＴ細胞数ならびにマイトジェン刺激に対する応答 の評価 組換えヒトｌ　Ｇ　Ｆ　−Ｉ　ＪＫａｂｉＧｅｎ　ＡＢ、　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ 、　Ｓｗｅｄｅｎから市販品として入手可能（胎盤嗅を用いるラジオレセプター アッセイによる比活性＞１４，０ＯＯＵ／ｍｇ）またはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ、　 Ｉｎｃ、、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉａｃｏから臨床研究用に入手可 能］を、実施例に詳述する全てのｌ　ＧＦ−１実験において用いた。ｌ　ＧＦ− １を５ａｇ／ｍｌて１０ｍＭクエン酸緩衝液および１２６ｓ＋ＭＮａｃｌ、ｐＨ ６，０中に溶解した。

このＩＧＦ−Ｉを、３つの種、即ちラット、ウサギおよびマウスに投与し、肺臓 および胸腺重電に対するその効果を観察した。用量−反応実験をマウスおよびラ ットて行い、ＩＧＦ−１を同様の効果を有するウサギに与えた。さらに、Ｂ細胞 およびＴ細胞数およびマイトジェノ刺激に対する反応をマウスで評価した。

Ｉ　九ムよ ＧＨ欠損およびそれによるＩＧＦ−１欠損の２つの動物モデルを用いて、肺臓お よび胸障の重量および大きさに対する［ＧＦ−１の効果を示した。ＧＨおよびＩ ＧＦ−１欠損の第三のモデルは老齢の動物である。老齢（１８か月齢）のラット を用いて肺臓および胸腺の大きさ、細胞の構造、およびインビトロでのマイトジ ェンへの反応に対するＩＧＦ−１の効果を示した。さらに、正常な血清ＩＣＦ− １濃度を有する成体卵巣摘出ラットを用いて、ＩＧＦ−１欠損でない動物におけ る肺臓および胸腺に対するＩＧＦ−１の効果を示した。

Ａ、短小ラット 雌性短小ラット（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　Ｌａｂｓ、　Ｇ１１ｒｏｙ＋　Ｃ＾）（１ ００〜１４０ｇ）に浸透ミニポンプからの皮下（ｓｃ）注入により１週間ＩＧＦ ｉを投与した。図１は、これらの短小ラットにおける肺臓サイズに対するＩＧＦ −１についての用量−反応グラフを提供する。明らかに、ＩＧＦ−１は、短小う ｙ）における肺臓の成長に対する非常に強力な刺激物質である。

Ｂ　下垂体切除ラット 雌性下垂体切除ラット（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、　Ｇｅｒｓ＋１ｎｔｏｖ ｎ＋　ＮＹ）（体重８５〜１０５ｇ）に、ＩＧＦ−１およびｄｅｓ　−Ｉ　Ｇ　 Ｆ　−１［ＰＣＴ　１０８７１０１０３Ｂ（１９８７年２月２６日発行）および ＰＣＴ　［０８９１０５８２２（１９８９年６月２９日発行）］を供給する浸透 ミニポンプを一週間、皮下に移植した。各々図２Ａおよび２Ｂに示されるように 、ＩＧＦ−１およびｄｅｓ−ＩＧＦ−１での処置により肺臓および胸腺の成長反 応の大きな増大が示されている。肺臓または胸腺の重量を体重１グラム当たりで 表したときに、この成長は体全体の成長よりも大きく、さらに非常に有意な肺臓 および胸腺の成長がある。

ＩＧＦ−１およびｄｅｓ−ＩＧＦ−１の両方がこの活性を有しており、ｄｅｓ　 −Ｉ　Ｇ　Ｆ−１はこの点において１ＧＦ−１よりも有意に強力である。

μｍがμｍ１性ラツト 成体雌性ラットの卵巣摘出を行った。３０日後、ラットが体重３００ｇになった とき、それらにＩＧＦ−１（ＩＧＦ−１の１．３３または４　ｍｇ／ｋｇ／日を 供給する）または賦形剤を含有している浸透ミニポンプ（Ａｌｚａ、　Ｐａ１ｏ 　Ａｌｔｏ、　２ＭＬ　２）を移植した。ミニポンプ移植の１４日後、動物を屠 殺した時点て肺臓を切除して重量を計測したくこの実験では胸腺は切除しなかっ た）。

図３は、このラットモデルにおけるＩＧＦ−１に対する用量−反応グラフを示す 。正常な内因性成長ホルモンおよびＩＧＦ−１を有する、下垂体が無傷の動物に おいてでさえ、体重（平均増加量４５ｇ）および肺臓重量に対する外因性のＩＧ Ｆ−１の大きな効果を示すことができたことがわかる。肺臓重量を体重に対する 百分率として表した場合でもなお、肺臓の非常に有意な成長を示すことができた （賦形剤に対して＊Ｎｐ＜　０．００１、賦形剤に対して＊＊ｐ＜　０．０１　 ）。

従って、ラットにおいて、ＧＨ−およびＩＧＦ−Ｔ−欠損動物（免疫不全動物） および正常なＧＨおよびＩＧＦ−１濃度を有する動物（免疫−十分な動物）にお ける免疫機能を有する組織の成長にＩＧＦ−Ｉは影響を及ぼすことがわかった。

Ｄ、老齢ラット ２つの別のインビボ実験において、ｒＧＦ−ＩＳＧＨまたは［ＧＦ−１＋ＧＨを １８か月齢の老齢ラットに１４日間投与し、胸腺の退行を有するこのモデルにお いてＩＧＦ−■が肺臓および胸腺の機能的変化をひき起こすか否かを決定した。

胚用頂 １８か月齢および４００〜５００ｇの雄性Ｆ　１ｓｈｅｒ３４４ラツトを、Ｈａ ｒｌａｎ　５ｐｒａｑｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ（ＨＳ　Ｄ）から購入した。これらの ラットはＨ３Ｄにより老化のためにＮ　Ｉ　ＨＩ　ｒｕ＋ｔｉｔｕｔｅに対して 繁殖されており、老化実験において用いられる標準的なうｙトモデルである。実 験１において、７ラツト／群を用い、実験２において８ラット／群を用いた。実 験用ラットとして同様に飼っていた若齢のＦ３４４ラット（５〜８週齢）を陽性 対照として用いた。治療群は、（１）賦形剤ポンプ、賦形剤注射、（２）ＩＧＦ −１ポンプ、賦形剤注射、（３）ＩＧＦ−１ポンプ、ＧＨ注射、（４）賦形剤ポ ンプ、ＧＨ注射および（５）若齢ラットであった。

ＩＧＦ−１を２つのミニポンプに充填し、１．１５０ｍｇ／ラット７日のＩＧＦ −Ｉまたは０　、８　ｍｇ／ｋｇ／日のｄｅｓ−ＩＧＦ−１を連続注入として皮 下に供給した。ｒｈＧ　Ｈ（Ｎｕｔｒｏｐｉｎｌｌ商襟、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、 Ｉｎｃ、１８ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．６８１１１ｇ／ｍｌグリシンおよび ５ｍＭリノ酸、ｐＨ７，４中に２ｍｇ／ｓｌで製剤化）またはｂＧ　Ｈ（Ｍｏｎ ｓａｎｔ）を毎日１ｍｇ／ラット／日の皮下注射として与えた。賦形剤ポンプ群 には、ＩＧＦ−■のための賦形剤（１０ｓＭクエン酸緩衝液および１２６ｍＭ　 ＮａＣ１，ｐｔ−ｉ　６．　Ｏ）（本明細書中、以下ｒｌＧＦ−［賦形剤」と称 する）を充填した同一のポンプを与えた。

処置は１４日間続けた。ＧＨを与えない動物にはｈＧＨ媒体を毎日注射（０，１ ■ｌ）した。

動物を屠殺した時点で、血液サンプルを採取し、肝臓、腎臓、心臓、肺臓および 胸腺を除去し、吸い取り乾燥して、直ちに重量を測定した。肺臓および胸腺を緩 衝液中に直ちに入れ、次いで細胞を消化または物理的な破砕により得た。この細 胞を計測し、次いで均一な濃度で培養した。胸腺細胞はｒ　Ｌ　−１（２Ｕ／ｇ ＋１）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡＸ５μｇ／ｍｌ）と共に培養し、Ｍ ａｉｚｅｌら［し巨ＬＭｅｄ、、　１５影４７０−４７６　（１９８１）］によ り開示されているようにチミジンの取り込みを測定した。肺臓は同様に処置し、 ２つの機能試験を行った。

ｔｊｉ準の長さの［ＧＦ−ＩおよびｒｈＧＨをこの実験で用いた。図４は、体重 の増加を示す。ＧＨ処装したラットは９．６±１１．４ｇ増加し、ＩＧＦ−１処 置したラットは３４．５±９．４ｇ増加し、そしてＩＧＦ−１およびＧＨ−処置 したラットは４５５±９．９ｇ増加した。［ＧＦ−１に対する反応は明らかに大 きく、ＧＨ＋ＩＧＦ−Ｉに対する反応は相加的であることが明らかであった。用 いた用量でのＩＧＦ−１は明らかに同化を促進した。ＩＧＦ−１処置による非常 に劇的な効果は、血液尿素窒素（ＢＵＮ）濃度における対照の２０．７±２．４ ｍｇ／ｄＬから■ＧＦ−１処置後の１３．８±１．８ｍｇ／ｄＬへの大きな降下 であり；ｈＧＨは効果を有さなかった。低下したＢＵＮは同化作用の代謝状態を 示す。体重増加のデータ、増加した器官重量、低下したＢＵＮ、および低下した 血液酵素濃度の全ては、タンパク質合成がタンパク質分解より優勢である同化作 用状態をＩＧＦ−１が生み出していることを示している。ＩＧＦ−１の効果はｈ ＧＨの効果より明らかに大きかった。

器官重量の全てに対するＩＧＦ−１の明らかな効果が見られた。肝臓は６，６％ 増加し、腎臓は１６．６％、心臓は１８．５％、胸腺は２７．０％そして肺臓は ８０８％増加した。全ての反応は統計学的に有意であった。ｈＧＨの効果のみが 肝臓重量を８，８％有意に減少させるものであった。ＧＨおよびＩＧＦ−１を組 み合わせた処置によりこれらの器官に対するＩＧＦ−１の効果の大きさは１例を 除いて減少しなかった。肺臓重量は、ＩＧＦ−Ｉ＋ＧＨ処置に対しては、ＩＧＦ −Ｉ単独群における肺臓重量に比較して減少した。

全てのＩＧＦ−１濃度は、共に行うｈＧＨ処置を伴うかまたは伴わないＴＧＦ− １投与により増加した。出穂では、ｈＧＨは血液全ＩＧＦ−１濃度を有意に上昇 させなかった。

採収した器官由来の細胞を分散させて、マイトジェンに対するそれらの反応を測 定した。表Ｉは胸腺および肺臓についてのいくつかのデータを示す。胸腺の湿重 量はＩＧＦ−１により増加したがｈＧＨによっては増加しなかった。正常な、若 齢の、６０日齢Ｆ　１ｓｃｈｅｒラツトを陽性対照として用いた。

未処置の老齢ラットから得た胸腺は、組織培養において完全な分析をし得るのに 十分な細胞をいずれももたらさなかった。対照的に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ− Ｉ　十ＧＨで処理した１３ラツトのうち８ラツトは、十分な生存能力のある胸腺 細胞をもたらした。１４日間の１ＧＦ−１処置により、胸腺細胞数において５倍 の著しい増加がひき起こされたが、若齢ラットの胸腺はなお十分に、より多くの 細胞を含んでいた。

成長ホルモンは胸腺細胞数を増加させる傾向があったが、効果（平均数の倍増） は統計学的には有意ではなかった。また、ＩＧＦ−１＋ｈＧＨは胸腺細胞数を増 加させる効果的な方法であった。対照的に、肺臓における細胞数はＩＧＦ−１ま たはＧＨ処装により有意に増加しなかったが、ＩＧＦ−１処置群の平均値は比較 的高かった。ゆえに、ＩＧＦ−１は胸腺の湿重量そして採収し得る細胞数もまた 増加させることができた。次いで、増大した組織の質量および細胞数による任意 の機能的効果は、以下の表１１に示すように、分散させた胸腺細胞のマイトジェ ンに対する反応を測定することによりインビトロで試験した。ＰＨＡおよびＩＬ −１の反応の両方およびそれらの組み合わせに対して、老齢ラットから得た組織 は若齢の動物から得た組織と比較するとｒＧＦ、Ｉ単独により活性の増大へ向か う傾向が示されたが、この効果は統計学的には有意ではなかった。ＩＧＦ−１＋ ＧＨの組み合わせでは採収された細胞数への相加的な効果はなかった。ゆえに、 ■ＧＦ−１＋ＧＨが胸腺機能の全ての尺度に対して最も大きなそして最も有意な 効果を有することは驚くべきことであった。若齢の組織の反応に比べて、ＩＧＦ −１；ＧＨに対してＰＨＡの反応は３．７倍上昇し、ＰＨＡ＋ＩＬ−１の組合せ については反応は４倍上昇した。

表■ 若齢ラット　２．８１±０．３０　４．４３士領７９＊Ｈ老齢ラット賦形剤　２ ．７２±０．６８　０．１９±０．１５老齢ラツト　［ＧＦ−［３，５８±０． ８６　０．９６±０．６６＊＊老齢ラツト　ＩＧＦ−１＋ＧＨ３，２７±１．４ ７　０．８２±０．２７＊＊＊老齢う２トＧＨ２，５０±０．５１　０．３６± ０．２８＊値は平均および［９偏差である。

（有意性　賦形剤に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜　０ ．００１）若齢および老齢Ｆ３４４うｙ）から得た胸腺細胞。未処置老齢ラット の全てはアッセイを行うためには不十分な胸腺細胞しか有していなかった。

処置　細胞数　ＰＨＡ　ＩＬ−Ｉ　ＰＨＡ＋ＩＬ−１若齢ラツト　４．９６　＋ ７６４　１３６０　３３４９若齢ラツト　４．８０　１７９０　９８９　３８３ ６若齢ラツト　３．５２　２１１２　１４６２　３６２９平均　１８８８±１９ ３　１２７０±２４９　３８０４±２４４老齢ラツト ＩＧＦ−１０，３７３０７８６７２１１２７３１Ｇ　Ｆ　−１１，７２３５２４ １０２８３７２４ＩＧＦ−１１，６８３０３２８５４６５３２ＩＧＦ−１１，２ ０１５２３９２９ 平均　２７８９±８７２＊　８７０±１５０＊＊　７１７６±３８１５＊老齢ラ ツト ＩＧＦ−１よＧＨ０，９２１０４３６１５３６１８９９０ＩＣＦ−１＋ＧＨ１， ０６５１２０２８３６１７４４６ＩＧＦ−１↓ＧＨ１，１２７４３２２３１６１ ３４２９ＩＧＦ−１＋ＧＨＱ、７８　５０９５　１７９６　７８６５平均　７０ ２０±２５２６＃＃　２＋２１±５７６＃　１４４３２±４９６６＃＃老齢ラツ ト Ｇ　ＨＱ、　７２　２００５　５８１　４３７＋Ｇ　ＨＱ、　８２　１１２６３ 　１７８０　２７０２１平均　−−□−−− 値は個々の動物から得た平均ｃ、　ｐ、　ｍ、であり、群の平均はこれらの値を 基にしている。

比較（ＩｉＩＣＦ−１−ｉ−ＧＨ対若齢：＊１ＧＦ−１対ＩＧＦ−１＋ＧＨ）（ 有意性・＊Ｐ＜ｏ、ｏ！５、＊＊ｐ＜０．０１、ｕｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０． ０１）これらのデータは、ＩＧＦ−１を用いた老齢動物において、ＩＧＦ−１処 置のほんの１４日後という比較的短い期間の後に、胸腺組織の大きさの増大を生 じさせることができることを示している。同様な老齢ラットにおいて、ＧＨおよ びプロラクチンの両方が胸腺の大きさおよび胸腺機能のいくつかの性状を上昇さ せ得ることを示した以前の研究がある。Ｋｅｌｌｅｙ、　Ｐｇｙｃｈｏｎｅｕｒ ｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ＩＬ　２ｎｄ　Ｅｄ。

、Ｂ、Ａｄｅｒら編、　１９９０．上記中。

さらにここで、ＩＧＦ−１により生じた増大した胸腺組織は機能的な組織であり 、この組織中でマイトジェンに対して反応し得ることが示されている。若齢う。

トにおいては４倍多くの胸腺細胞が存在するが、ＩＧＦ−１処置老齢う、トから 得た細胞は４倍まで向上されるインビトロ活性を有していた。従って、用いた機 能的試験によれば、老齢ラットの胸腺は、はるかに若い動物の胸腺へと本質的に 回復した。胸腺において老化の効果は逆転されたことが明らかであった。

（ｂ）実験２ １８か月齢のラットの第二の組において、ｂＧＨおよびｄｅｓ−ＩＧＦ−１を用 いた以外は同様の実験を行った。ざらにｄｅｓ−ＩＣＦ−１の活性、および最初 の実験におけるｈＧＨの比較的弱い効果がｈＧＨ抗体によるものであるが否かに ついて試験した（ＧＨはラットにおいて非常に抗原性であり、ｂＧＨははるかに 抗原性でない）。

結果を表■に示す。ｄｅｓ−ＩＧＦ−１による重量の増加は最初の実験における ものより小さいようであったが、ｂＧＨに対する反応よりはまだ上であった。腎 臓オよび肺臓はｄｅ＋＋−ＩＧＦ−１に対して大きな反応を示し、ＧＨに対して はいかなる有意な反応も示さなかった。全般的に、ｄｅｓ−ＩＧＦ−１は血液細 胞数を若齢動物における数へと戻し、ｄｅｓ−ＩＧＦ−１およびｂＧＨの組み合 わせは最も有効な処置であった。ｄｅｓ−ＩＧＦ−１はｂＧＨと組み合わせたと きに、白血球細胞（ＷＢＣ）およびリンパ球数を増加させる傾向があった。この 変化は、実施例■のヒトにおいて見られるものと量において同様である。

胸腺重量、細胞数およびＰＮＡ（ビーナツツ凝集素）陽性であった細胞の百分率 の結果を表■に示す。胸腺重量がｄｅｓ−ＩＧＦ−１処置ラツトにおいて屠殺時 に増大していたことがわかる。この実験は胸腺において数が増加した細胞の起源 および型を試験するために計画した。この細胞の起源および型の識別は、真正な 胸腺細胞のための特異的マーカーとしてＰＮＡを用いるＦＡＣ３分析（以下にさ らに説明する）により行った。ＰＮＡ陽性の胸腺細胞は、Ｔ細胞に対する未熟な 前駆体細胞であると考えられる。

表■ 血球算定・ｄｅｓ−ＩＧＦ−１およびＧＨで処置した老齢ラット；若齢ラット（ 対照）Ｉｆｆ　ＷＢＣリンパ球　ヘマト　ＲＢＣ数　ＭＣＶ　血小板数　クリッ ト　数 ３老齢対照　７３６±１．４２４．３２±０．７５３８．０±１．８７．５９± ０．４９５０．１±１．１６７６±２９ｂ　ｄｅｓ−ＩＧＦ−１８，１２±０． ７６４．２３±０．４１３７．８±１．８７．２９±０．３８５１．８±０．５ ７２６±６９ｃ　ｂＧＨ６，９７±０．９６４．１５±０゜７６３７．４±１． ３７．３９±０．３２５０．６±０．５７９５±４６ｄ　ｄｅｓ４ｂＧＨ８，９ ３±１．９０４．８０±１．１６３７．６±１．２７．０１±０．２２５３．９ ±１．６７８３±９８ｅ　若齢ラット　８．９２ｔｈ１．２４６．４０±０．８ １３７．５±０．９６．５３±０．１４５７．４±１．０８９７±６８ｅ０（ｎ −４）を除いてｎ＝７および８の平均および標準偏差。

表■ 胸腺細胞数　ｄｅｓ−Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１およびｂＧＨで処置した老齢Ｆ３４４ラ ット；ａ賦形剤老齢　８０±３５　０．６６±０．２　２４±１２ｂ　ｄｅｓ　 −Ｉ　ＣＦ　−１（０，６４）　１１７±２７＊　３．２７±２．ＩＨ７２±１ ４＊＊＊ｃ　ｂＧＨ（１，０）　６６±１７　１．３０±０．６　３７±１８ｄ 　ｄｅｓ−”ｂＧＨ１４４±３９＊＊　２．７９±１．５＊＊　６９±２３＊＊ ＊若齢ラツトは老齢ラットより５倍多い胸腺細胞を有していた。ｄｅｓ−ＩＧＦ 　−１単独またはｂＧＨとの組み合わせを用いることにより、胸腺中の細胞数は 約４゜５倍に増加した。ｂＧＨは単独で細胞数を２倍にしか増加させなかった。

これらの反応により実験ｌにおける観察が確認された。ＰＮＡ陽性である細胞の 百分率は、予期しないものであった。若齢の対照ラットは９５％のＰＮＡ陽性細 胞を有し、老齢ラットは陽性細胞を２５％しか有していなかった。

これらの老齢ラットにおいて、ｄｅｓ−ＩＧＦ−１は単独でＰＮＡ陽性細胞の百 分率を細胞の７２％まで上昇させた。同様の数字（６９％）がｄｅｓ−ＩＧＦ− １＋ｂＧ　Ｈ群について見られた。ｂＧＨは単独でＰＮＡ陽性細胞の百分率に有 意な影響を皮はさなかった。これにより、■細胞のための前駆細胞から成る「真 正な」胸腺再集合か老齢動物において再生されることが示された。

従って、ｄｅｓ−ＩＧＦ−１は、細胞数およびＰＮＡ陽性である百分率の両方を 本質的に正常なものへと回復させることにより非常に劇的な効果を生み出した。

ＩＧＦＩは老齢ラットにおける胸腺の若返りに対して著しい効果を有することか 明らかである。実験２において老齢ラットを屠殺した時に、胸腺の半分を１０％ 士ルマリンに入れて組織学的切片を調製した。胸腺全体の組織は獣医学の病理学 者が評価を行い、（１）重大な病変なしく若齢対照動物）、または（２）退化（ 老齢動物にとっては正常）、または（３）リンパ球性の過形成の形跡の外観によ り特徴付けた。さらに、胸腺内のリンパ球細胞質は群の間で異なる細胞成分であ るようだったので、その量を全ての動物について等縁付けした。

この特徴化の方法を用いることにより、胸腺の退化は賦形剤およびＧＨ処置群に おいて見られた。しかし、ｄｅｓ−ＩＧＦ−１およびｄｅｓ−ＩＧＦ−１＋ｂＧ Ｈを投与した群においてリンパ球性過形成および胸腺構造の再生の明らかな証拠 があった。ｄｅｓ−ＩＧＦ−１で処置したラットにおけるリンパ球細胞質の増加 は容易に区別できるものであった。退化の程度およびリンパ球性過形成の量につ いてスライドグラスを評価することにより、退化はｄｅｓ−ＩＧＦ−１により有 意に逆転され（ｐ＜０．０１、フィッシャー検定）、リンパ球性過形成の量はｄ ｅｇ−ＩＧＦ−Ｉにより大きく上昇する（ｐ＜０．００１）ことが確認された。

従って、胸腺の組織学的検査により、胸腺の退化が既に起こっている場合でさえ 、ＩＧＦ−１は老齢動物の胸腺を若返らせることができることが確認された。

■・ｚ１土 雄性ニューシーラント白色家兎（２，０ｇ〜２．５ｇ）に麻酔をかけ、両方の腎 臓動脈を１２０分間クランプではさむことにより腎臓の損傷をひき起こした。ク ランプではさんだ時点て、３．３ｍｇ　ｄｅｓ　−Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１／ａｌ酢酸 （１００ｍＭ、ｐＨ４，５）の２ｍｌを含有するＡｌｚｅｔ浸透ポンプ（Ａｌｚ ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、モデル２ＭＬ−１ ）、または５．０ｍｇ　Ｉ　ＧＦ　−１重ｍｌ（塩化ナトリウム／酢酸ナトリウ ム緩衝液、ｐＨ６，０中）を各々２　、ｌ　含む２　Ａ　１ｚｅｔ浸透ポンプの どちらが１つを腹腔内に置いた。このポンプは０．３６４ｍｇｄｅｓ−ＩＧＦ− １重ｋｇ／日または１．１８ｇｇｄｅｓ−Ｉ　Ｇ　Ｆ−１／ｋｇ／日のとちらか を７日間供給した。対照動物には賦形剤で満たしたポンプを与えた。動物は７日 目に層殺し、胸腺および肺臓を切除した。

ＩＧＦ−１での７日間の処置の後に、ＩＧＦ−１処置家兎（ｎ＝６）の胸腺の平 均湿重量は４７±０４４ｇとなり、対照動物（２，７±０．５８ｇ、ｎ＝４、ｐ −０、０２３）のおよそ２倍の大きさであった。胸腺の大きさを家兎の体重の百 分率として表した場合に、効果の統計学的有意性は上昇した（ｐ＝ｏ、ｏ　１４ ）。

ｄｅｓ−ＩＧＦ−１での処置の７日後に、処置した家兎の肺臓の平均湿重量（ｎ ＝８．２．４３±０．４４ｇ）は対照家兎（ｎ−７，１，１７±０．２１ｇ、　 ｐ＝０．０２８）の２倍以上の大きさであった。

■・ヱグス ラットおよびウサギを用いた上記の実験により、ＩＧＦ−１が免疫系において十 分な変化をひき起こすことができることが確認された。次にマウスをモデル系と して用いたが、これは、この種において免疫細胞マーカーおよびアッセイが比較 的良く特徴付けられており容易に利用可能であることを理由とする。さらに、胸 腺および肺臓の大きさ、およびマイトジェンに対するインビトロでの反応に関す る効果が、免疫系の真に機能的に増強された活性と解釈されるか否かをマウスに おいて確認することが望まれた。

老齢ラットにおいてＩＧＦ−１は胸腺の構造および細胞学を若齢の動物のものへ と回復させる著しい活性を有することが示され、生じた細胞はマイトジェン性反 応の増強を示したので、老齢マウスをモデルとして選択し、この場合において加 速された老化のモデルである引退した種畜雄性マウスを用いた。同化作用物質と してならびに免疫組織成長および機能のエフェクターとしてのＩＧＦ−１の効果 を成体の老齢マウスにおいて実験した。さらに、細胞数およびマイトジェン性刺 激に対するｈＧＨの効果およびＩＧＦ−１およびｈＧＨの組み合わせの効果を評 価した。

（以下、余白） Ａ　計画 以下の実験では９か月齢またはそれ以上の、体重が約２５〜３５ｇの引退した種 畜ＢＡＬＢ／ｃ７ウス（Ｈａｒｌａｎ　５ｐｒａｑｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ、　Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を用いた。動物を個別のケージで飼い、飼料（Ｐｕｒ ｉｎａ　Ｒｏｄｅｎｔ　Ｃｈｏｖ　５０１０５．　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）お よび水を任意に与えた。無作為化計画を用いて処置群に分ける（動物の体重に基 づいて）前に全ての動物の体重を測定した。動物をステンレス鋼の耳標識で識別 し、少なくとも１週間順応させた。

ＩＧＦ−Ｔは皮下移植された侵透ミニポンプにより投与した（７日間の実験のた めに、Ａｌｚｅｔモデル２００１、ポンプ速度約１μｍ／時：１４日間の実験の ために、２つのＡｌｚｅｔモデル２００２ミニポンプ、ポンプ速度的０，５μｌ ／時：Ａｌｚａ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡを使用）。製造者の指示に従っ てこのポンプに溶液を充填し、次いて充填されたポンプを無菌性食塩水中で一晩 、冷蔵庫内でインキュベートした。

このポンプを、ＩＧＦ−１賦形剤または、最初の７日間処置実験のための１群当 たり６匹の動物のためにＩＧＦ−１（上記のように配合された５ｍｇ／ｍｌ）の 所望のンａ度、スナワチ、７．５．３０ｔたは１２０μｇ　ＩＧＦ−１／Ｂ／７ Ｂ間、オヨび第二の７日間処置実験および１４日処置実験のための１群当たり５ 匹の動物のために１２０μｇｌＧＦ−１．／ロ／７日間のどちらかで満たした。

ｈＧＨ処置のために、ｒｈＧ　Ｈ（商標名Ｎ　ｕｔｒｏｐｉｎ″）は単独で９． ６．４８または２４０μｇｈＧＨ／日／１４日間の量を、皮下に移植されたＡｌ ｚｅｔモデル２００２浸透ミニポンプ（０，５μｍ７時川４日間）により１群当 たり５匹の動物に投与し、または２４０μｇｈＧＨを単独で１４日間皮下注射に より１群当たり５匹の動物に投与した。

ＩＧＦ−１およびＧＨの組み合わせの実験のために、１群当たり５匹の動物にＩ ＧＦ−１は２つのＡＩｚｅｔ２００２ミニポンプにより１２０μｇの用量で投与 し、ＧＨは皮下に毎日２４０μｇの注射をすることにより投与した。

２　体重および器官重量の測定 約１４ｍ１のアベルチン（リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中の２．２．２−）リ ブロモエタノールおよびｔ−アミルアルコール）の腹腔的注射によりマウスに麻 酔をかけた。次いて背側の肩甲骨領域の毛を刈り込み、小さな切開を作った。次 いで、閉じた止血鉗子を切開に挿入して後方に押した。次いでミニポンプをこの ポケットに挿入し切開をステンレス鋼創クリップで閉じ、皮下注射により７５０ ０Ｕのベニ／リンを与えた。動物を毎日検査し、それらの体重を記録した。

ミニポンプの設置の後の種々の時期に動物を層殺して、大量の血液サンプルを採 取し、胸腺、肺臓、心臓、肝臓、腎臓および下顎および腸間膜リンパ節を各処置 群から無菌的に除去して重量を測定した。後のアッセイのために肺臓、胸腺およ びリンパ節を、別々のバイアル中の組織培養培地中の水上に置いた。全てのデー タは平均上標準偏差として表し、分散の１方向分析により比較を行い、引き続い てダンカンのランゲ試験（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ　Ｒａｎｇｅ　Ｔｅ５ｔ）を用いて 比較を行った。

３　細胞の調製 リンパ節、肺臓および胸腺を、焼結されたガラススライドを用いて分散させて、 １個の細胞懸濁液を得た。次いで細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　５ＸＧｉ ｂｃｏ）、ベニ／リン（１００単位／ｍｌ）、１００　μｇ／ｍｌストレプトマ イシン（Ｇｉｂｃｏ）および２００／ｍＭグルタミンを含むイーグルの最小必須 培地（ＭＥＭ、　Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　１ｓｌａｎｄ、　ＮＹ）中で洗浄 し、トリバンブルー色素排除により測定したときの生存可能な細胞５　Ｘ　Ｉ　 Ｏ＠１０＋Ｉで再懸濁した。

４　マイトジェン刺激 リボポリサツカリド（ＬＰＳ−Ｅ、ｃｏｌｉ　０５５　：　Ｂ５）はＤｉｆｃｏ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から得た 。ポークライードマイトジェン（ＰＷＭ）およびフンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ） はＳ　ｉｇｍａ（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｇｓｏｕｒｉ）から得た。各マイ トジェンに対する反応は次の濃度で３重にアッセイした・ＬＰＳ（１００，１０ ，１重ｇ、／ｍｌ）、ＰＷＭ（１０，５，２，５μｇ／ｍｌ）、ＣｏｎＡ（１０ ，５，２，５μｇ／ｍｌ）。マイト／エンの適当な希釈物を含む２００μｌの細 胞（２，５Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ｍｌ）を、平底微量滴定プレー）（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐ ｌａｓｔｉｃｓ、　０ｘｎａｒｄ、ＣＡ）中、１０％ＦＢＳおよび上記の追加物 を含むＨｅｐｅｓ（０，５Ｍ）ＮａＨＣＯ，−緩衝化（０，２４％ｖ／ｖ）ＭＥ Ｍ中で培養した。培養物は１０％ＣＯ２中、３７°Ｃでインキュベートした。

７２時間後、この培養物を１ｍＣ１のメチル３Ｈ−チミジンでパルスした。１２ 時間後、培養物をグラスファイバーフィルター上に多重サンプル・ハーベスｙ− を用いて採収した。ディスクを乾燥させてシンチレーション液（３ｍｌ）中に入 れた。

ＤＮＡに取り込まれた３Ｈ−チミジンの量をＢ　ｅｃｋｍａｎンンチレーション カウンターを用いて測定した。全ての処置群に対して同じであった、マイトジェ ンに対する最適の反応のみを報告した。

５、ＦＡＣ３分析 上記のように調製したリンパ球細胞懸濁液を、０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭア ジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中でｌＸｌ０’細胞／ｍｌに調節した。細胞懸濁液 の２００μｌずつを、Ｔ細胞群の染色のための５μｌのモノクローナルなラット 抗−マウスＦＩＴＣコンジュゲート抗ｔｈｙ−１，抗Ｌ３Ｔ４または抗Ｌｙｔ　 −２（Ｃａｌｔａｇ。

Ｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の適当な希釈物と共に４℃で１時間 インキュベートした。

これらの懸濁液中のＢ細胞は、ＦＩＴＣコンジュゲート化Ｆ　（ａｂ’　）ｙボ リクローナルヤキ抗マウスＩｇ（ＭＳＧ、Ａ特異的）（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｖ、ＣＡ）を用いて染色した。低温培地 で３回洗浄した後に、細胞をＦ　Ａ　ＣＳ　４４０　（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉ ｎｓｏｎ、　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ）を用いて蛍光強度の度合いについて 分析した。前方および垂直の光の散乱の組み合わせについてゲート制御した後に 蛍光パラメーターを対数増幅器を用いて集めた。蛍光データは、同一イツタイブ の非関連ｍａｂに比較した蛍光性細胞の百分率として表した。蛍光は、対数スケ ール上でプロットされた平均チャネル数として表したときの蛍光性細胞の平均蛍 光強度として測定した。

胞−Ｊおよび１４日実験 これらの実験の目的は、無傷の正常なマウスにおいてＩＧＦ−１が同化作用性で あるか否か、そしてそのような同化作用的な用量でＩＧＦ−１は胸腺および肺臓 重量、細胞質、細胞型およびインビトロでのマイトジェンに対する反応性に影響 を及ぼすか否かを確認することである。１群当たり５または６匹のマウスをこれ らの実験において用いた。ラットにおいて有効であることが知られている用量を 基にして、ＩＧＦ−１を連続皮下注入により１４０，４６および１５ｇｇ／マウ ス７日（約４．１．３３および０　、４４　ｍｇ／ｋｇ／日）で供給することを 決定した。

７日間の体重増加に対して用量相関性の効果（賦形剤０．７５±０．７５ｇ、低 用量領８６士領６３ｇ、牛用ｊ１１．３１±１．０３ｇ、および高用量３．４２ ±１．２４ｇ）があり、高用量の反応は他の全ての群と比較して非常に統計学的 に有意（ｐ＜０．００１）であった。商用１ｔｌＧＦｌを用いた反復実験におい て、再び起こった同様の体重増加（３，５５±０．５４ｇ）は賦形剤処置群の増 加よりも統計学的に大きかった（ｐ＜０．００１）。

ＩＧＦｉは、肺臓および胸腺の有意な成長をＩＧＦ−１処置の７日後に引き起こ した。最初の実験において、ＩＧＦ−［の肺臓に対する明らかな用量相関性効果 （賦形剤＋０５±１４、低用量１２４±２１；中用量１４５±５８、高用量１９ ３±２３ｍｇ：賦形剤対高用量ＩＣＦ−１：ｐ＜０．００１）が存在した。反復 実験において、肺臓重量は再び増加した（賦形剤１０３±１８、高用量２０６± ６８ｍｇ、　ｐ＝０．ｏ　ｌ）。胸腺重量は最初の実験において変化しなかった が、これはおそらく胸腺を異なる解剖者が異なる様に解剖したことによるもので あった。

反１莫実験において、１名の解剖者が同様に胸腺を除去し、有意な胸腺の成長が 検出された（賦形剤１５．２±１．３．商用ＩＥ２６．２±６．４ｍｇ、　ｐ＝ ０．００６）。

１４０μｇｌＧＦ−１／日での７日間の処置の後に肺臓重量において観察された 増加はリンパ球数の増加に一部よるものであった。トリバンブルー排除により測 定した生存可能なリンパ球は、ＩＧＦ−１での７日の処置の後に２Ｘ１０＠から ５Ｘ１０’細胞／Ｎ臓へと上昇した（図５）。この細胞数の増加はＢおよびＴ細 胞両方の増加によるものと思われた。ＢおよびＴ細胞数をＳ１ｇ＋およびＴｈｙ ｌ＋細胞各々のＦＡＣ３分析により定量したときに、Ｂ細胞数は３倍増加しく１ ．３Ｘ１０８賦形剤対３．５Ｘ１０”１ＧＦ−１）、Ｔ細胞数もまた対照に比べ て増加したく０．７ＸＩＯ７賦形剤対１．ＩＸ　１０’１ＧＦ−１）。図５を参 照。

観察された胸腺重量の増加は、Ｔｈｙｌ＋胸腺細胞の増加と相関していた（ＩＸ １０’賦形剤対２．４Ｘ１０’ＴＧＦ−１）。図６を参照。これらのデータによ り、ＩＧＦ−１はリンパ球亜群に対する強力なマイトジェン作用を有することが 示される。

ＩＧＦ−１により誘発されるリンパ球数の劇的な増加とは対照的に、ＬＰＳ（Ｂ 細胞）およびＣｏｎ　Ａ（Ｔ細胞）による刺激に対する肺臓リンパ球の反応は対 照に比べて減少したが、ＰＷＭに対する反応は、両群のマウスに対して同等であ った。

図７を参照。この低下したマイトジェン性反応により、短期間（７日）のＩＧＦ −１処置の後のリンパ球群における機能的な成熟の不足が示された。

従って、７日実験においては、リンパ球数は増加したが、マイトジェン性反応次 に、リンパ球機能に効果を与えるためにはリンパ球数に効果を与えるために必要 とされるより長いＩＧＦ−１に対する暴露が必要であるか否かを決定した。

ゆえに、処置は高用量のＩＧＦ−１（１４０μｇ／マウス７日）を用いて１４日 間まで延長した。さらに、ｈＧＨはＩＧＦ−１産生を誘導することにより一部作 用すると考えられるので、ｌ　ＧＦ−１に対するｈＧＨのリンパ球反応に及ぼす 効果を比較した。

ＩＧＦｉによる１４日間の処置の後に有意な重量増加があった（賦形剤１．４９ ：”：０．４６；高用量３８７±０．４５ｇ、　ｐ＜Ｏ，ＯＯｌ）。さらに、有 意な肺臓の成長（賦形剤９６土１２．高用量１６４±９、ｐ＜０．００１）、お よび有意な胸腺の成長（賦形剤１８．２＝４．６；高用量３３．８±１Ｏ３６、 ｐ＝ｏ、　ＯＩ　７）があった。＠啄および肺臓は処置の７日または１４日後に 同様の重量に達したことかわかる。

７日間の実験において観察されたように、肺臓細胞数はＩＧＦ−１処置により対 照に比ヘテ約２倍（１，３Ｘ１０＠対２．４×１ｏｓ）になった（図８）。ＩＣ Ｆ−１処置マウスにおいてＴ細胞数の増加があったが、唯一統計学的に有意な増 加はＣＤ４群ニオイテ見ラレ（３，Ｉ　Ｘ　１０’対４．９Ｘ１０’Ｘ図８）、 ＣＤ、＋細胞カコノ処置法により優先的に増加し得ることが示された。前の実験 において見られたように、ＩＧＦ−１処置の結果Ｂ細胞数の大きな増加が生じた 。さらに、ｒＧＦ−Ｉは処置を１４日間行ったときに胸腺におけるＴ細胞数の増 加を示した。図９を蓼照。

７日で見られた反応の低下とは対照的に、ＩＧＦ−１処置の１４日後にＩＧＦ− １処置マウスから得た肺細胞のマイトジェン性反応は対照に比べて有意に上昇し た（図１０）。これらのデータにより、短期間のＩＧＦ−１の投与の結果リンパ 球数の有意な増加が生じるが、リンパ球の反応性の改変を見るためにはさらに時 間が必要であることが示された。

ｈＧＨおよびＩＧＦ−１はリンパ球群に対して異なる効果を有していたので、次 の一連の実験においてはＩＧＦ−１と同時に投与されたｈＧＨの効果を調べた。

単独または皮下注射されたｈＧＨとの組み合わせのどちらでも、ＩＧＦ−１処置 により肺臓における全リンパ球数の増加が生じ、再びこれは主にＢ細胞数の増加 によるものであると思われる（図１１）。ＩＧＦ−１およびｈＧＨの組み合わせ は胸腺細胞数に対してＩＧＦ−１またはｈＧＨ単独処置よりも十分な効果を有し ていた（図１２）。

組み合わせ治療の好ましい経路はＩＧＦ−１およびｈＧＨの連続注入の投与であ ろうことが予想された。

ｂ　連続的処置 ＧＨ（２８０μｇ／日）を最初に１４日間投与し、次いでＩＧＦ−１（１４０Ｉ ｉｇ／日）を１４日間投与した場合にはＩＧＦ−１のいかなる効果も見られなか った。

４．１４日処置の長期効果 ＩＧＦ−１、ｈＧＨおよヒソレらの組み合わせの長期に持続する効果を測定する ために、対照および処置動物から得たリンパ球群を、ｈＧＨ，ＩＧＦ−１または ＩＧＦ−１およびｈＧＨの組み合わせによる１４日処置の７および２１日後に調 べた。

処置の７日後に、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１＋ｈＧＨ処置されたマウスは、対 照またはｈＧＨ処置マウスに比べて好意に増加した肺細胞数を有していた（図１ ３）。Ｂ細胞数の統計学的な増加はＩＣＦ−１処置群の両方において観察された 。

■細胞数の増加はｒＧＦ−１単独群において有意であったが、ｈＧＨ＋ＩＧＦ− ｒの組み合わせ群においては有意でなかった。さらに、この群においてＣＤ４＋ およびＣＤ、十のＴ細胞群の両方は対照に比べて増加した。１４日処置の場合と 同様に、ＩＧＦ−１処置マウスの両群は、ｈＧＨ処置または対照マウスに比べて 増加した胸腺細胞数を有していた（図１４）。さらに、ＩＧＦ−１の単独または ｈＧＨとの組み合わせにより、末梢リンパ節細胞数の増加が生じた（図１６）。

これらの処置法の後に、節Ｔ細胞数またはＣＤ、：ＣＤＪ、における変化は観察 されなかった。

１４日間の処置で見られた増強されたマイトジェンに対する増殖反応とは異なり 、ＩＣＦ−１処置マウスのマイトジェン性反応は処置後７日で対照値まで戻った （図１５）。対照と比較して最も大きいマイトジェン性反応はｈＧＨ＋ＩＧＦ− １処置群において見られたが、これらの差異は統計学的に有意ではなかった。

処置後２１日で、４つ全ての群のマウスは同等の肺細胞数（図１７）および胸腺 細胞数（図１８）を有していた。従って、２１日はＩＧＩ−１処置の後に正常な 細胞数および表現型比を回復するのに十分であることが明らかである。

しかし、処置後２１日では、ｈＧＨ−ｚＧＦ−１処置群のＬＰＳおよびＣｏｎＡ 反応の両方は対照に比べて統計学的に上昇していた（図１９）。同様に、３つ全 てのマイトジェンに対する反応はＩＧＦ〜■単独群において上昇していた。ＩＧ Ｆ−ＩおよびｈＧＨの組み合わせによりリンパ球反応性に効果を及ぼすにはいく らかの時間が必要であることが明らかである一方で、これらの結果により、ＩＧ Ｆ−Ｉはリンパ球反応に対して初期から後期までの作用効果を有することが示さ れる。皮下注射されたｈＧＨ単独では、調べたどの時点でもマイトジェン反応に 対して統計学的に有意な効果を有さなかった。

（以下、余白） 実施例２２次免疫化における抗原に対する応答この実験の目的は、ジニトロフェ ニル−卵アルブミンで免疫されＩＧＦ−１で処置された雄性マウス（退役した繁 殖動物）における免疫機能を評価することであった。先の実験は、退役した雄性 繁殖マウスにＩＧＦ−１を１４日間継続投与すると体重、肺臓および胸腺の器官 重量が増加したことを示した。肺臓重量の増加はＢ細胞数の増加およびマイトジ ェン応答性の増加に帰属させうろことがわかった。

また、胸腺におけるＴ細胞数の増加を引き起こすことができ、これらの細胞もマ イトジェンに対してさらに高い応答性を有することもわかった。これらのデータ は、ＩＧＦ−１が抗体産生Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞の一層大きな数およびマ イトジェンに対する一層高い応答性を引き起こすときには、ｒＧＦ−１が抗原に 対する一層高い抗体応答を与えうるかもしれないことを示した。

Ｉ　プロトコール 到！して４８時間後に、全動物にアルミニウムと混合したジニトロフェニル−卵 アルブミン（ＤＮＰＯＡ）の１回のｉｐ注射（１００μｍ）を与えた（ジニトロ フェニル基はＢ細胞に依存する応答を誘導するハブテンであり、卵アルブミンは Ｔ細胞に依存する応答を誘導する担体である）。］ｍｇ／ｍｌ　ＤＮＰＯＡ（５ ０μｌ）を、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７，０）（２，４５ｍ１）および２０ｍｇ／ｍｌ 水酸化アルミニウム吸収ゲルｃＲｅｈｓｏｒｐｔａｒＴＭブランド；　Ａｒｍｏ ｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｌ、ＩＬにより市販］（２，５０ｍ１ ）に加えることによって、ＤＮＰＯＡを使用前に混合した。このＤＮＰＯＡを約 ３０分間混合した後に注射した。このＤＮＰＯＡ免疫化の日を０日とした。

１９９日目、１０匹の動物を体重により２つの群にした（１匹の動物は９日目に 死んでいることがわかった）。１９のミニ浸透ポンプ（＾１ｚｅｔ　Ｃｏｒｐ、 、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ。

ＣＡ）モテル２００２（０，５μｌ／ｈｒ、１４日間）を実施例１の記載のよう にＩＧＦ−Ｉ賦形剤またはＩＧＦ−１で充填し、４°Ｃで一晩、滅菌食塩溶液中 に置いた。

２０日間に、５匹のランダムに選択した動物から採血したく眼窩から）。以下の 記載のように、ＤＮＰＯＡに特異的なＩｇＧについて血清を分析した。

２０日間に、全１０匹の動物を上記のようにアベルチン（約０．５＋ｎｌ）のｉ ｐ注射によって麻酔した。これら動物を背部の約２０ｆｆ１１面積において毛が ないように刈込み、７０％アルコールで拭取った。小さな切傷（約１　ａｍ）を 刈込み領域中に作った。止血鉗子をこの切傷中に挿入し、尾部の基部に向がって 前方に押し、上記のミニポンプを挿入した。５匹の動物にはそれぞれが賦形剤緩 衝液である２個のミニポンプを埋込んだ。５匹の動物にはそれぞれがＩＧＦＩで ある２個のミニポンプを埋込んだ。これらミニポンプの供給速度は、最大１４日 間にわたって１２０μｇ　ＩＧＦ−１／日のＩＧＦ−１投与を与えた。麻酔から 醒めた後、賦形剤およびＩＧＦ−１群のそれぞれ５匹の動物＋：ＤＮＰＯＡのブ ー７、ｊ−ｉｐ注射（１００μｌ）を行なった。

２５日間に、賦形剤群の１匹の動物が死んでいることがわかった。

３４日間に、全９匹の動物の眼窩から採血し、血清のＩｇＧを分析した。

全体の免疫化計画については表Ｖを参照。

表Ｖ　ＤＮＰＯＡで免疫された退役雄性繁殖マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）群　数　１ 回目の　化合物　２回目のＤＮＰＯＡＤＮＰＯＡ注射　（埋込み日）　注射 １　４　０日目　賦形剤　２０日間 （２０日間） ２　５　０日目　ＩＧＦ−１２０日間 被験マウス血清中のＩｇＧ抗ＤＮＰ抗体をＥＬｒＳＡ（酵素結合免疫検定）によ り測定した。このＥＬＩＳＡは９６ウエルのプレートにおいて設定した。それぞ れのウェルを、４°Ｃて２４時間、２．０　μｇ／　ｍｌ　Ｄ　Ｎ　Ｐ　ｍＨＳ 　Ａ（ジニトＣ’　７　エ：’−ルヒト（ｍＩｉ４Ｎアルブミン）（０，１ｍ１ ）で被覆した。０．１％ＢＳＡでプロ、りした後、それぞれの被験血清（０，１ ｍ１）をこの抗原被覆したプレートに三重に加え、プレートを室温で２時間イン キコベートした。このプレートをＰＢＳｌｏ、０２％ツ（−ン２０で３回洗浄し 、ウサギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ）の１　：　２０００希 釈Ｍ（０，１ｍ１）を各ウェルに加えた。もう一度プレートを２時間インキニペ ートト化抗血清の１　：　１６００希釈液（０，１ｍ１）を各ウェルに室温で１ 時間加えた。

洗浄した後、０．０５Ｍクエン酸緩衝液中の０．２ｓｇ／ｍｌオルトフェニレン ジアミン（ＯＰＤ）、０．０１％過酸化水素（０，１ｍ１）を各ウェルに加え、 ３０分後に２Ｍ硫酸でこの反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｔｅｃｔプレートリーダ ーで４９０ｎｍの光学密度を読み取った。

■、全１ｇＧの検定 参照標準としてネズミ［ｇＧを用いて、被験マウス血清中のＩｇＧ抗体をＥＬＩ ＳＡにより測定した。このＥＬＩＳＡは９６ウエルのプレートにおいて設定した 。

それぞれのウェルを、４°Ｃで２４時間、１　：　２００のヤギ抗ネズミ１ｇＧ −Ｆｃ特異的（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ、　Ｗｅｓｔｅｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡＸ Ｏ，１ｍ１）で被覆した。０．１％ＢＳＡでブロックした後、それぞれの被検面 ？１ｆ（０，１ｍ１）をこの抗体被覆したプレートに三重に加え、プレートを室 温で２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳｌｏ、　０２％ツイーン ２０で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼーコンンユゲ−１・化Ｆａｂ特 異的ヤギ抗マウスｌ　ｇＧ　（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ）の１　：　２５０希釈 液（Ｏｌ　ｍｌ）を各ウェルに加えた。もう一度プレートを２時間インキュベー トし、洗浄した。洗浄後、０．０５Ｍクエン酸緩衝液中の０．２ｍｇ／ｍｌ　Ｏ Ｐ　Ｄ、０．０１％過酸化水素（０，１ｍ１）を各ウェルに加え、３０分後に２ Ｍ過酸化水素でこの反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｔｅｃｔプレートリーダーで４ ９０ｎｍの光学密度を読み取った。

■、精米 図２０は、賦形剤処置またはＩＧＦ−１処置したマウスの血清中の全ＩｇＧ（図 ２０Ｂ）およびＯＡ特異的１ｇＧ（図２０Ａ）の濃度を示すものである。ＩＧＦ −１処置は、調べたあらゆる時点において抗原に対する２次的なＩｇＧ応答を有 意に増加させた。ＩＧＦ−１群においては全１ｇＧレベルが上昇する傾向が存在 したが、その値は対照と比較して統計学的に増加するものではなかった。即ち、 ＩＧＦ−■は哺乳類の記憶応答を高めるように機能する。２次免疫化の後のＩｇ Ｇへの暴露により抗体産生の一層長い改善が得られることが注目される。

実施例３　骨髄移植後の免疫応答に及ぼす作用この実験の目的は、骨髄移植後の 肺臓および胸腺の再増加に及ぼすマウスの■ＧＦ−１処置の効果を測定すること である。

ｌ、プロトコール １９〜２６ｇの６〜７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃｖウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖ ｅｒ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）をこの研究に用いた。これら動物をポリ プロピレン製ケージ中にグループで入れ、食物（Ｐｕｒｉｎａ　Ｒｏｄｅｎｔ　 Ｃｈｏｖ　５０１１Ｌ　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）と水を任意に与えた。

全動物をポンプ移植の日に体重測定し、群に任意抽出した。ステンレス鋼製の耳 札によって動物を識別した。

群あたり１０匹の動物を調べた。動物をアベルチン（約０．４論１）のｉｐ注射 によって麻酔し、次いで、約４０または１２０μｇ／日／１４日の毎日の連続供 給が得られるように希釈した上記のｒｌＧＦ−１（２００μｍ）またはＩＧＦ賦 形剤を充填したＡ　１ｚｅｔ浸透ミニポンプモデル２００２（０，５８±０．０ ３μｌ／時／１４日）を移植した。

毎日の動物体重を記録した。移植の２４時間後に、全動物に１３７センウムから の９００ラドの放射に暴露した（４．２９分）。照射後の１時間以内に、動物に １ｘｔｏ’骨髄細胞の静脈内注射（２５０μｌ）を行なった。

４０匹の供与動物から大腿骨と脛骨を取出した。骨髄をＰＢＳで流し出した。

細胞を遠心し、食塩水で洗浄した。生存細胞を計数し、食塩水により１０’細胞 １０．２５ｍ＋となるように希釈した。

動物の半分を照射処置の１４日後に犠牲にした。照射されたが骨髄投与を受けな かった群からの生存動物の全てをこの時点で犠牲にした。残りの動物は照射処置 の２３日後に犠牲にした。肺臓、胸腺、肝臓および心臓を取出し、重量測定した 。長骨を組織学用に採取し、肺臓および胸腺を細胞学的およびインビトロ検定用 に保持した。血液を末梢細胞学分析用に採取した。このプロトフールを表■に示 す。

１　１０　ｓｃポンプ　Ｏ骨髄を投与せず２　１０　ｓｃポンプ　０　骨髄を投 与３　１０　ＳＣポンプ　４０　骨髄を投与骨髄置換されなかった動物は高い致 死率を示し、１０匹の動物のうち３匹が１４日間生存した。全ての測定（血液、 組織および全身）に対して、この群の動物は予想される致死量照射の効果を示し た。

骨髄置換した動物は、２３日の研究期間で死亡した３０匹のうち２匹の動物だけ か生存した。これら４つの群の実際の体重増を表■に示す。

１４日目　２３日目　１４日目　２３日目間髄なし　８．６±０．９　−　１８ ．６±２．５＝骨髄のみ　１２．６±１．０　２６．０±１２．９　７７．８± ３１．５　７４．０±２９．０低ＩＧＦ−１２３，５±６．２　３６．４±９． ２　１０１．２±２０．５　９２．０±８．３邑ＩＧ旦ヨー−一づ汚１坪吋壮− −廷」旭」林−−」漫Ｊ杢】士ヨー削り畦琢４嚢同日の骨髄のみのｐ＜０．０５ 　；　＊＊　ｐ＜０．０１このモデルにおいて胸腺および肺臓の重量を増加させ るＩＧＦ−１の明瞭な効果が存在した。胸腺の効果は肺臓の効果よりも大きいよ うであった。これは、高用量の［ＧＦ−１群において胸腺サイズの持続性の倍増 が存在し、当初は統計学的に有意であるが２３日目に持続していない肺臓に対す る効果を有するためである。肝臓または心臓の重量に対する処置の全体効果はな かった。

この設定におけるＩＧＦ−１の劇的な全身同化作用により、ＩＧＦ−１が全身に 対して持続的に同化促進性であることが裏付けられる。胸腺および肺臓の大きさ を増加させるＩＧＦ−１の作用は、このモデルが提供する免疫不全の極めて極端 な設定において驚くべきものであった。免疫不全の他のモデル、即ちＡＩＤＳに おいても、ＩＧＦ−１がこれらの顕著な作用を示すことが予想されるであろう。

４つ全ての群の体重変化を図２１に示す。この図は、放射暴露後の動物における 極めて大きな体重減を明瞭に示す。この異化作用からマウスを保護するＩＧＦ− ■の明瞭な用量に関係した作用が存在した。高用量の１ＣＦ−１は処置の７日後 程度の早い時点で有意の同化作用を有しており、この作用は本研究の最後まで持 続していた。また、低用量のＩＧＦ−１もいくつかの時点で有意の保護を引き起 照射の１４日後に、１２０μｇのＩＧＦ−１を投与された動物は、対照または低 用１１ＧＦ−＋処置に比べて末梢血液中のＣＤ、＋Ｔ細胞の数の増加を有してい た（図２２）。ＣＤ、のＣＤ、に対する比は、対照と比較してこの処置群におい ては２から４に増加した。これらのデータは、ＩＧＦ−１で７または１４日間処 置した老齢マウスの肺臓において観察されるＣＤ、細胞の優先的増加に一致する 。ＩＣＦ−１処置後に末梢Ｂ細胞数に対する作用は観察されなかった。

これら動物からの肺臓リンパ球をＦＡＣ３分析によって定量すると、ＩＧＦ−Ｉ 処置によってＴおよびＢ細胞数の用量応答性の増加が生じることがわかった（図 ２３）。しかし、この時点て測定したときには、これら牌細胞のマイトジェン応 答性に対する作用は観察されなかった。

仲臓の場合と同様に、ＩＧＦ−１マウスの胸腺を再増加させるリンパ球の数が対 照に比べて増加した（図２８）。

照射の２１日後に調べると、再びＩＧＦ−１はＣＤ、＋Ｔ子細胞集団の増加によ り末梢血液リンパ球ＣＤ、：ＣＤｓ比の変化を誘導した（図２５）。この時点ま でに、ＩＧＦ−１処置群における金牌細胞数は対照値まで復帰していたが、肺臓 ＣＤ、＋Ｔ子細胞集団においてわずかの増加がなお測定可能であった（図２６） 。このＴ細胞の増加は、マイトジェン応答性の増加に反映していた。肺臓子細胞 のＣｏｎＡ刺激は高用量の１ＣＦ−１処置マウスにおいて３倍になった（図２７ ）。ＬＰＳに対するＢ細胞マイトジェン応答は、この時点で調べたときにはＩＧ Ｆ−１処置によって影響されなかった。

驚くべきことに、高用量および低用量のＩＧＦ−１で処置されたマウスの胸腺リ ンパ球数は、対照に比へてなお劇的に増加していた（図２８）。

ＣｏｎＡ応答性および肺臓ＣＤ４数の増加と一緒になって、これらのデータは、 ＩＧＦ−１が末梢細胞の再増加速度を高め、同系骨髄移植後のこの分子の重要な 治療学的役割を支持することを示唆するものである。

実権例４　男性に対するＩＧＦ−［投与本臨床研究は、Ｉ　Ｇ　Ｆ　、−１がヒ トの免疫系にも影響を与える証拠を提供するも健康な成人男性にｌ　ＣＦ−１を 反１夏投与（複数投与ルた後に、安全性および薬物速度論についてフェーズＩ臨 床研究を行なった。１２人のヒト患者に、５日間連続して毎朝、上記のように０ ．０３ｍｇ／　ｋｇ　ｒｈ　ｌ　Ｇ　Ｆ　−］のポーラス注射を行なった。スク リーニング時および５日目のポーラスの１０時間後に、血液学的測定用に血液試 料を採取した。

ＩＩ　持坐 ヘモグロビン、ヘマトクリ、トおよび赤血球（ＲＢＣ）は、スクリーニングまた は処置後第２週と比較すると５日口に存意に低下したことがわかった（ｐ＝０． ００１．０．０００４．０．０００５、およびＯ，ＯＯＯ５）。対照的に、白血 球（ＷＢＣ）は、スクリーニングから５日目まで有意に増加した（６．１±１． ５から７゜５±１．９Ｍ／ＣＭＭ、ｐ＝ｏ、ｏｏ　１８）。さらに、処置後第２ 週目１．ニーＷＢＣＩ；！５日目の値から有意に低下しく７．５±１，９がら６ ．４±１．６Ｍ／ＣＭＭ、ｐ＝０、　ＯＯ３）、従って処置前および処置後第２ 週のＷＢＣ値は存意に異なっていなかった。

即ち、本研究においてＲＢＣ低下にもがかわらずＷＢＣは上昇した。２５〜３０ ％の白血球がリンパ球であることがわがっている。ＩＧＦ−Ｉ処置対象の血液中 のＷＢＣの合計数の２３％の増加は、この男性のｒＧＦ−１処置過程に続いてリ ンパ球数の増加も存在していた可能性を極めて高いものにする。１２０μｇｌＧ Ｆ−１で処置した後のマウスにおける末梢血液ＣＤ４＋リンパ球数の統計学的に 有意な変化を示す図２２Ｂと比較せよ。また、老齢ラットのリンパ球数とＷＢＣ に及ぼすｄｅｓ−ＴＧＦ−１とｂＧＨの組合せの増大作用に関する表■を参照の こと。

精−輪 ＩＧＦ−１が単離され、当初はそれがＧＨの全身成長促進活性を媒介することを 示すために「ソマトメジンｊと命名された。その後、そのインスリン様の代謝活 性の認識によりＩＧＦ−１と命名された。従って、体細胞増殖の代謝し＋″コレ ーター考えられている分子であるＩＧＦ−？が免疫系細胞に対して多くのインタ ーロイキン類と同様の成長因子活性を有することが示されたのは驚くべきことで ある。

ＧＨ受容体、ＩＧＦ−１受容体およびインスリン受容体が免疫系細胞上に存在す ることが知られている。免疫系に対するこれら受容体のインビボでの機能的作用 およびそれらのリガンドの活性は、本発明までは未知であった。免疫系に対する インスリンおよびＧＨの作用は有意なものではないと考えられている［例えば、 Ｓｎｏｗ、月ｍｍｕｎｏ１．１３５：　７７６−７７８　（１９８５）を参照］ 。身体中のほとんどの組織がＧＨｌＩＧＦ−１およびインスリンの受容体を有し ており、これらのホルモンは細胞の基本的な代謝機能、例えばグルコース取込み またはアミノ酸輸送を調節するように働く。免疫組織中に存在することが示され ているこれら受容体は、それらの分化、成長および免疫学的活性に影響を与える ように働くよりむしろこれら活性を制御するように機能することかできた。最近 の文献は、免疫細胞学または免疫機能に影響を与えるＩＧＦ−１の役割は未知で あると認めている［Ｆｕら、Ｊ、ｌｍｌｌ１ｕｎｏ１．１４６：　１６０２−１ ６０８　（１９９１）］。

老齢、栄養不足または栄養失調の患者あるいは疾患または病気に罹患している患 者は免疫不全になることがよく認められている。さらに、これらの患者がＩＧＦ −１欠損になることも知られている。本研究における知見により、この免疫不全 がこのＩＧＦ−１欠損に直接関係しており、この欠損に引き起こされるものでは ないにしてもこれによって悪化することが示唆される。患者のＩＧＦＩ血中、騎 度を回復させることにより、患者の免疫不全が改善される結果になることが予測 されるであろう。Ｉ　ＧＦ−１はいくつかの動物モデルにおいて胸腺の大きさに 劇的な影響を与える。胸腺の成長が、下垂体切除および短小ラットにおいて、若 齢、成体および老齢ラットにおいて、マウスにおいて、およびウサギにおいて観 察された。胸腺はほとんどの動物において年齢とともに退縮する（最大の大きさ に到達した後、ヒトにおいては青春期後に退縮し始める）。この退縮は免疫系の 活性の低下に関係している。従って、本発明は１つの態様において、老齢ヒトの 免疫系を刺激して胸腺組織をもっと若い人の組織まて回復させる手段を提供する ものである。主要な内部器官に同化活性を有する薬物を血液学および免疫機能の 改善と組合せることが、ＩＧＦ−１を成人または老齢ヒトを治療するための魅力 ある薬物にする。胸腺を若返らせ、従って免疫系を高めるこの能力は、一連の治 療機会を与えるしのと考えられる。

このような機会には、Ｂ細胞がＩｇ分泌細胞に成熟せず、血清が２５０ｍｇ／ｄ １未満（正常濃度である１　０００ｎｇ／ｄｌと比較して）を含有する通常の種 々の無ガンマグロブリン面層が含まれる。ＩＧＦ川は血／！ｖ１ｇレベルの有意 の増加を生み出い図２０）、この疾轡において有用であろう。

本発明の別の用途は、入隅免疫系の結果になる遺伝病に罹患している患者に■Ｃ Ｆ−１を投与することであろう。このような患者の例は、先天性胸腺形成不全症 （ディ・ジヲージ症候群）に罹患している子供であろう（胸腺が萎縮しており、 Ｔ細胞が大きく減少しており、致命的であることが多い日和見感染を導く）。こ の病気の原因は未知である。ＩＧＦ−１は、これら患者の胸腺の大きさ、細胞充 実性および応答性の改善を与えることが予測されるであろう。治療過程は断続的 であり、例えば予想として１４日間の処置を与え、次いでＩＧＦ−１への暴露の 間に２１日以上の休止期間を設けるであろう。このときに、免疫組織中の細胞計 測数は正常に復帰するであろうが、マイトジェンに応答するがまたは抗体を産生 ずるそれらの能力は高められるであろう。このような細胞発生の波を生成する断 続的処置過程は持続性であり、ディ・ジョージ型の遺伝的症状における長期の免 疫機能回復を導くであろう。

第３の機会は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。ＡＩＤＳの患者はＴ 細胞免疫を持たず、Ｔ４／Ｔ８比が逆転している。ｒＧＦ−［はＴ細胞マイトジ ェン応答性を増加させ、ＣＤ４＋細胞数を特異的に高め（図５．１０，１１）、 従ってＡＩＤＳの治療において有用な薬物となるであろう。

上記のデータは、ＩＧＦ−１の投与が不十分な免疫グロブリン産生に苦しむ患者 において免疫グロブリン産生を増加させるのに有益であることを示唆する。免疫 化の間の間隔を本発明によって短縮させることが予測されるであろう。ＩＧＦ− Ｉ処置したマウスからのインビトロでの細胞の一層迅速な増殖により、増強され た抗体応答を一層迅速に達成しうることが示唆された。これは、一層圧縮された 免疫化プロトコールを可能にするであろう。例えば、男性ｊこおいて多くの月数 を隔てて１次、２次および３次免疫化を行なうのが普通である。この期間中に、 患者は保護されるべき物質にａ露される危険にされされる。ＩＧＦ−１を用いて 免疫系を強めることにより免疫化の間の間隔を短縮させ、従って上記の危険を減 少させうろことが利点となるであろう。

本発明の別の用途は、感染または再発が予測されうる手術後または大病がらの回 復中にＩＧＦ−１処置の過程を患者に与えることである。増強された免疫応答は 、このような患者を助けて感染または再発への免疫チャレンジに立たせることが 予測されるであろう。

上記の例において、ＩＧＦ〜■の有効性は次のように示されている：（１）３つ の種（マウス、ラットおよびウサギ）において；（２）両方の性（雄性および雌 性ラット）において、および（３）いくつかの動物モデルにおいて［手術によっ てＧＨおよび■ＧＦｉ欠損にした動物（下垂体切除したラット）、遺伝的ＧＨお よびＩＧＦ−１欠損を有する動物（項生ラット）、正常動物（卵巣摘出されたラ ット）、ＩＧＦ−１欠損している正常な老齢動物（１８力月齢ラット）、促進さ れた老化を示す動物（退役した繁殖マウス）、および免疫機能の減退を有する動 物（老齢動物）を含む］。

観察される変化を誘導するために最低１４日のＩＧＦ−［処置が必要であること が必ずしも上記研究から導かれるものではない。マウスにおける１４日間の処置 は、これが免疫組織応答を誘導する信頼できる手段であることがわかったので選 択したものである。細胞数の増加を誘導する７日間のＩＧＦ−１処置が機能的に 活性な成熟リンパ球を最終的に導くことが可能である。また、７日未満の処置（ 例えば、実施例４の男性に用いた５日間）が有効な投与期間となることもある。

さらに、連続注入に代わる注射によるＩＧＦ−１処置も有効であることが予測さ れる。

本明細書中のウサギ、ラットおよびマウスのデータを、鳥類、ウマ、ウシおよび 他の哺乳類に対して外挿しうることは合理的に予測されるであろう（認められて いる獣医学的および臨床的操作に従って鳥類または哺乳類の体重について補正す る）。ヒトもこのようにして同様に応答するものと考えられる。ＩＧＦ−［受容 体はヒトリンパ球上に示されており［Ｋｏｚａｋら、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１０９：　３１ｇ　（１９８７）］、男性における同様の応答の証拠が実施 例４において示されている。従って、男性におけるＩＧＦ−１が全生者の免疫機 能に対して有益な回復作用を有するであろうことは合理的に予測されるであろう 。

ＩＣＦ−１用量　（ｍ９／に９） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２Ａ −１，５−１，０−０，５０，００，５Ｌｏｇ用量（ｍａｌ／に９） ＦＩＧ、２Ｂ −１，５−１，０−０，５０，００，５Ｌｏｇ用量（ｍｃ＋／に９） ＩＧＦ−１用量（ｍ９／ｋｑ／ｄａｙ）胸腺細胞 ＦＩＧ、６ 時間（日） ＦＩＧ、４ 胸腺 ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１２ 牌臓細胞 ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、ｉ６Ｂ ＰＷＭ ＦＩＧ、２０Ａ ＦＩＧ、２０Ｂ ＧＦ−１ 日 ＦＩＧ、２２Ａ　Ｂ細胞 ＦＩＧ、２２Ｂ ＦＩＧ、２２Ｃ ＦＩＧ、２８Ａ ＦＩＧ、２８Ｂ 、　＆ｌ＋　ＰＣＴルＳ９２／口５１８９

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類または鳥類の免疫系を刺激するための方法であって、免疫刺激有効量 のＩＧＦ−Ｉを哺乳類または鳥類に投与することからなる方法。
2. ２．刺激が抗体によって媒介される請求項１に記載の方法。
3. ３．刺激が細胞によって媒介される請求項１に記載の方法。
4. ４．ヒトがＡＩＤＳを有している請求項７に記載の方法。
5. ５．哺乳類が骨髄移植を受けている請求項１に記載の方法。
6. ６．哺乳類または鳥類に成長ホルモンを有効量で投与することをさらに含む請求 項１に記載の方法。
7. ７．免疫原に対する哺乳類または鳥類の抗体応答を高めるための方法であって、 哺乳類または鳥類に免疫原および有効量のＩＧＦ−Ｉを投与することからなる方 法。
8. ８．不十分な免疫グロブリン産生が生じる症状を有するヒトまたは他の哺乳類対 象のＢ細胞によって産生される免疫グロブリンの量を免疫原に応答して増加させ る方法であって、免疫グロブリンの産生を増加させるに有効な量のＩＧＦ−Ｉを 該対象に投与することからなる方法。
9. ９．不十分なＴ−ヘルプまたはＴ−細胞溶解活性が生じる症状を有するヒトまた は他の哺乳類対象におけるＴ−細胞応答性を免疫原に応答して増強する方法であ って、Ｔ−ヘルプまたはＴ−細胞溶解活性を増強するに有効な量のＩＧＦ−Ｉを 該対象に投与することからなる方法。
10. １０．免疫不全哺乳類を処置する方法であって、（ａ）該哺乳類の血清ＩＧＦ− Ｉレベルを測定し；そして（ｂ）この血清ＩＧＦ−Ｉレベルが該哺乳類の正常レ ベル以下であるときには、該哺乳類の免疫性を回復させるために該哺乳類に有効 量のＩＧＦ−Ｉを投与する；ことからなる方法。