PT100629A

PT100629A - Metodo para a estimulacao da resposta imune usando hormona de crescimento

Info

Publication number: PT100629A
Application number: PT100629A
Authority: PT
Inventors: Lena Mariana Susann Carlsson; Ross G Clark; Michael J Cronin; Paula M Jardieu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1993-09-30
Also published as: AU2147192A; WO1993000109A1

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO

Campo do Invento

Este invento está relacionado com métodos e composições melhorados para a utilização da hormona de crescimento (GH) que resultam na presença contínua de níveis de GH no soro terapeuti-camente eficazes para a estimulação de respostas â hormona de crescimento em mamíferos ou aves, incluindo 1) aumento de respostas imunes, tais como resposta de anticorpos a antigénios em doentes com sistema imune subóptimo; e 2) novos métodos de administração terapêutica da hormona de crescimento e composições que apresentam eficácia com administração intermitente.

Descrição de Trabalhos Relacionados

Hormona de crescimento

Um dos principais efeitos biológicos da hormona de crescimento é promover o crescimento em mamíferos jovens e manutenção de tecidos em mamíferos mais velhos. Os sistemas de orgãos afectados incluem o esqueleto, tecido conjuntivo, músculos e vísceras tais como fígado, intestino e rins. As hormonas de crescimento exercem o seu efeito através da interacção com receptores específicos na , membrana da célula alvo. hGH é um membro de uma família de hormonas homólogas que incluem lactogé-nios placentários, prolactinas e outras variantes genéticas e específicas de espécie da hormona de crescimento (Nicoll, c. s., et al., (1986) Endocrine Reviews Z, 169). hGH é invulgar entre estas por apresentar uma larga especificidade de espécie e se ligar ao receptor cromatogénico clonado (Leung, D.W., et al., [1987] Nature 330. 537) ou da prolactina (Boutin, J.M., et al., [1988] Cell 53. 69). 0 gene clonado da hGH foi expresso numa

forma secretada em Escherichia coli (Chang, C.N., et al.( [1987] Gene 55, 189) e descritos o seu DNA e sequência de aminoácidos (Goeddel, et al., Γ19791Nature 281, 544; Cray, et al., [1985] Gene 19, 247) . A hormona de crescimento humana (hGH) participa na regulação do crescimento e desenvolvimento normais humanos. Esta hormona pituitária (hGH) apresenta vários efeitos biológicos incluindo crescimento linear (somatogénese), lactação, activação de macrófagos, efeitos tipo insulina e efeitos diabetogénicos (Chawla, R., K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C. K. et al., (1988) Science 239. 769; Thomer, M. 0. et al., (1988) J. Clin. Invest. 81. 745). A deficiência na hormona de crescimento em crianças conduz ao nanismo que tem sido há mais de uma década tratado com êxito pela administração de hGH. A hormona de crescimento humana (hGH) é um polipeptídeo de cadeia simples consistindo em 191 aminoácidos (peso molecular 21500). Pontes dissulfureto ligam as posições 53 e 165 e as posições 182 e 189. Niall, Nature. New Bioloqy, 230: 90 (1971). hGH é um agente anabólico forte, especialmente devido à retenção de azoto, fósforo, potássio e cálcio. 0 tratamento de ratos hipófisectomizados com GH pode restaurar pelo menos uma fracção ^ da velocidade de crescimento dos ratos. Moore et al.,

Endocrinologv, 122: 2920-2926 (1988). Entre os seus efeitos mais evidentes em indivíduos hipopituitários (deficientes em GH) encontra-se o crescimento linear acelerado das cartilagens ósseas do crescimento em placas resultando numa maior estatura. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964). hGH provoca uma variedade de efeitos fisiológicos e metabólicos em vários modelos animais incluindo crescimento ósseo 4

linear, lactação, activação de macrófagos, efeitos do tipo insulina e diabetogénicos (R.K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34./ 519 (1983); O.G.P. Isaksson et al., Annu. Rev. Phvsiol. 47, 483 (1985); C.K. Edwards et al., Science 239. 769 (1988); M.O. Thomer e M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82, 745 (1988); J.P. Hughes e H.G. Frisen, Ann. Rev. Physiol. 47. 469 (1985)). Foi descrito que, especialmente em mulheres após a menopausa, a secreção de GH decresce com a idade. Millard et al., Neurobiol. Aaina: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinoloay 46: 137-142 (1987). Ver também Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) , ' e Blackman, Endocrinoloqy and Aging 16: 981 (1987). Exuiste ainda V—/ uma descrição de que algumas manifestações de envelhecimento, incluindo decréscimo da massa corporal, expansão da massa de tecido adiposo e diminuição da espessura da pele podem ser reduzidos por tratamento com GH três vezes por semana. Ver,, e.g. Rudman et al., N. Enq. J. Med.. 323: 1-6 (1990) e o artigo no mesmo jornal publicado pelo Dr Vance (pp. 52-54). Estes efeitos biológicos derivam da interacção entre hGH e receptores celulares específicos. Foram clonados dois receptores humanos diferentes, o receptor de hGH do fígado (D.W. Leung et al♦, Nature 330, 537 (1987)) e o receptor da prolactina humano (J.M. Boutin et al.. Mol. Endocrinol. 3, 1455 (1989)). No entanto, há provavelmente outros incluindo o receptor do lactogénio placentário humano (M. ^ Freemark, M. Comer, G. Korner e s. Handwerger, Endocrinol. 120. 1865 (1987). Estes receptores homólogos contêm um domínio extra-celular de ligação de hormonas, um único domínio transmembranar e um domínio citoplasmãtico que difere consideravelmente na sequên-) cia e tamanho. Assume-se que um ou mais receptores desempenhem um papel determinante na resposta fisiológica a hGH.

hGH é dada a crianças coro deficiências de crescimento e provou aumentar o crescimento. No entanto, a semi-vida da hGH injectada é tão curta que para se ter uma elevada eficácia farmacêutica, hGH tem de ser injectada pelo menos três vezes por v_/ semana e mais vulgarmente diariamente, o que torna a administração de hGH algo díficil de tolerar pelas crianças. Pensa-se que a curta semi-vida de hGH seja devida ao seu pequeno peso molecular (22000 daltons) e rápida eliminação pelo rim, a qual se encontrou ser proporcional ao peso molecular da proteína em circulação. A adição de PEG, ou seja a conjugação de polietilenoglicol (PEG) com uma proteína, encontrou-se ser uma excelente forma de aumentar o peso molecular da proteína. PEG um polímero sem carga, linear, não imunogénico com três moléculas de água por unidade de óxido de etileno que pode portanto alterar dramaticamente as propriedades hidrodinâmicas das moléculas conjugadas (Maxfield et al., Polymer 16, 505-509 [1975]; Bailey, F. E. et al., em

Nonionic Surfactants [Schick, M.J., ed.] pp. 794-821, 1967)). Várias enzimas para utilização farmacêutica foram PEGiladas para aumentar eficientemente a sua semi-vida in vivo (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al., Câncer Biochem. Biophys. 7, 175-186, 1984). A PEGilação de ^ IL-2 (interleuquina-2) foi também descrita como aumentando a vida de circulação assim como ,a sua potência (Katre, N.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 1487-1491, 1987; Goodson, R. et al.,

Bio/Technology, 8, 343-346, 1990). Foi descrita a PEGilação de outras moléculas como reduzindo a imunogenicidade e a toxicidade (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3578-3581, 1977).

Foram descritos métodos para a ligação covalentemente de polietilenoglicol por Davies et al.,, Pat. U.S. N2 4179337. Davies et al., descrevem polipeptídeos tais como enzimas e hormonas acopladas a polietilenoglicol ou polipropilenoglicol para se obter composições de polipeptídeos solúveis em água e não imunogénicos. Uma das hormonas designadas foi a hormona de crescimento, no entanto não houve exemplos mostrando quaisquer resultados com qualquer hormona de crescimento. As composições de polipeptídeos patenteadas foram preparadas por um processo •envolvendo os passos de reacção de pelo menos um átomo de carbono terminal portador de um grupo hidroxilo de polietilenoglicol ou poipropilenoglicol com um agente de acoplagem para proporcionar um polímero activado tendo um agente reactivo para proporcionar um polímero activado tendo um grupo terminal reactivo e reacção de um polipeptídeo imunogénico fisiologicamente activo com o polímero activado por acoplagem do polipeptídeo ao grupo terminal reactivo do polímero activado. Como agente de acoplagem, a patente descreve a utilização de cerca de 13 fracções de acoplagem polifuncionais incluindo (a) cloreto ou fluoreto cianúrico, (b) uma acilazida formada pela reacção do polímero com ácido cloroacético, depois com diazometano para se obter o éster metílico do éter carbometoxilo seguido de tratamento com hidra-zina que dá a correspondente hidrazida que é então tratada com ácido nitroso para dar a acilazida, (c) um anidrido di-halo-su-ccinico, (d) o grupo p-diazobenzilo, (e) o grupo 3-(p-diazofeni-loxi)-hidroxipropiloxilo, (f) o grupo l-glicidoxi-4(2-hidroxi-3--propil)butano, (g) ligação carboxiamino ou tiocarbonilaminoben-zilo, (h) a ligação 2-(hidroxi-3-carboxi)propilo, (i) um derivado w-aminoproduzido a partir de PEG alquilado como seja metoxipoli-etilenoglicol, subsequentemente reagido com um grupo carboxilo de um polipeptídeo e (j) acoplagem de um derivado w-amino de um PEG alquilado com anidrido maleico e subsequente reacção de um PEG alquilado com o polipeptídeo pretendido. A Enzon, Inc. catálogo "Enzymes For Biomedical Use" datado de Maio de 1983 descreve a disponibilidade comercial de certas enzimas modificadas com polietilenoglicol (referidas como "PEGzimas") tendo estabilidade no armazenamento melhorada, resistência à digestão proteolítica, maiores tempos de circulação no sangue e imunogenicidade reduzida. São também descritos dois produtos de polietilenoglicol activado para modificação de proteínas incluindo succinimidil succinato de monometoxipolieti-lenoglicol. Uma nota de rodapé estabelece que "Para enzimas tais como asparaginase este agente de acoplagem dá PEGzimas com actividades específicas mais elevadas".

Foi descrita a estabilização e modificação de enzimas e de outras proteínas por ligação covalente a açúcares e polietilenoglicol. Marshall e Rabinowitz, Arch. Biochem. Bioohvs. 167. 77 (1975) e J. Biol. Chem. 251 , 1081 (1976), descreveram inicialmente que as glicoproteínas (na maior parte das vezes enzimas) mostram características de estabilidade invulgares comparadas com proteínas sem açúcares, as primeiras sendo menos sensíveis ao calor e outras condições desnaturantes e mais resistentes à proteólise, descrevem a preparação de conjugados solúveis de enzima-açúcar por acoplagem (por meio de ligação covalente) de tripsina, alfa-amilase e beta-amilase a dextrano actibvado com brometo de cianogénio. os conjugados covalentes resultantes . apresentaram resistência marcada à inactivação pelo calor e desnaturação, maiores semi-vidas e redução da perda de actividade nas condições que favorecem autólise.

Formulações terapêuticas contendo hormonas em combinação com anticorpos específicos da hormona foram descritos como potenciando a actividade da hormona desde que a especificidade do epítopo do anticorpo fosse adequadamente escolhida. Esta potenciação ou mascaragem das hormonas, como seja da hormona de crescimento, está descrito em Astor et al. EP 137234B, 10 de Outubro de 1990. 8

Abuchowski et al> J. Biol. Chem. 252 (11) , 3578 e 3582 (1977), descrevem a modificação de proteínas, especificamente a dealbumina sérica bovina e a de catalase do fígado bovino, por ligação covalente de metoxietilenoglicóis não imunogénicos de 1900 Daltons (PEG-1900, Union Carbide Corp.) e 500 Daltons (PEG-5000), Union Carbide Corp.) usando cloreto cianúrico (2,4,6-^ -tricloro-s-triazina) como agente de acoplagem. A albumina sérica bovina modificada apresentou um tempo de circulação no sangue em coelhos semelhante à albumina sérica bovina nativa excepto não ser retirada da circulação por eventual desenvolvimento de , " anticorpos. Também, a albumina sérica bovina modificada apresen- ^ tou alterações substanciais nas propriedades, como seja solubili dade, mobilidade electroforética em gel de acrilamida, cromato-grafia de permuta iónica e sedimentação, comparado com a proteína não modificada. Os coelhos, foram imunizados pela administração intravenosa ou intramuscular de PEG-1900-catalase. O antigénio administrado por via intravenosa não deu anticorpos detectáveis contra PEG-1900-catalse ou catalase nativa enquanto que o anti--soro do antigénio administrado por via intramuscular continha anticorpos contra PEG-1900-catalase e catalase nativa. PEG-5000--catalase não reagiu com qualquer um dos anti-soros. PEG-1900-catalase e PEG-5000-catalase retiveram 93% e Ό 95%, respectivamente da sua actividade enzimática e PEG-5000-ca- talase resistiu à digestão pela tripsina, quimotripsina e uma protease de Streptomvces ariseus. PEG-1500-catalase e PEG-5000--catalase apresentam vidas de circulação maiores no sangue de " , murganhos acatalassémicos durante injecção intravenosa repetida e não se observou qualquer evidência de uma resposta imune a injecções das enzimas modificadas.

Factor de crescimento I tipo Insulina 0 factor de crescimento I tipo insulina (IGF-l) é polipeptídeo natural presente nos fluídos do corpo humano, por exemplo, sangue e fluido espinal cerebral humano. A maior parte dos tecidos, e especialmente o fígado, produzem IGF-I juntamente com proteínas específicas de ligação a IGF. A produção de IGF está sob a influência estimuladora dominante da hormona de crescimento (GH) e algumas das proteínas de ligação a IGF também são aumentadas pela GH. Ver Tanner et al.. Acta Endocrinol.. M:681-696 (1977); Uthne et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.f 39.; 548-554 (1974)). IGF-I foi isolado a partir de soro humano e produzido por via recombinante. Ver, e.cr. f EP 123 228 e 128 733.

Os níveis de IGF-I estão descritos como sendo reduzidos a metade em ratos de 20 meses de idade comparado com ratos de 6 meses de idade (Takahashi e Meiters, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.. 186: 229-233 (1987)). Ver também Florini e Roberts, J. Gerontol.. 35.:23-30 (1980) ; Florini et al. . Mech. Aoeinq Dev. . 15: 165-176 (1981); Chatelain et al., Pediatrie. 44: 303-308 (1989); Florini et al.. J. Gerontol.. 40: 2-7 (1985); Hall e Sara, Clinics in Endocrin. and Metabol. 13: 91 (1984); Baxter, Advances in Clinicai Chemistrv. 25: 49 (1986); Clemmons e Underwood, Clinics in Endocrin. and Metab.. 15: 629 (1986); Hintz, Advances in Pediatrics. 28: 293 (Year ,Book Medicai Publishers, Inc., 1981); Johansn e Blizzard, The Johns Hopkins Medicai Journal. 149: 115-117 (1981), as cinco últimas referências descrevendo níveis baixos de IGF-I em homens idosos. As referências de Hintz, Clemmons e Underwood e Baxter são revisões gerais sobre IGF-I.

Ainda, encontrou-se que entre fibroblastos diplóides humanos capazes de se dividirem em culturas velhas in vitro. houve poucas alterações na regulação da fracção de crescimento 10

'w' w pelo factor de crescimento derivado de. plaquetas (PDGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF), mas uma dependência grandemente aumentada relativamente a IGF-I quanto à regulação da velocidade de entrada na fase S (Chen e Rabinovitch, J. Cell. Phvsiol.. 144: 18-25 (1990)). Os autores concluíram que o crescimento mais baixo da população em divisão de células em culturas velhas pode estar .relacionado com uma necessidade de IGF-I em niveis que estão grandemente acima dos geralmente fornecidos. Isto pode ser devido à sobreprodução da proteína de ligação a IGF-I, IGFBP-3 e portanto uma redução na disponibilidade de IGF-I a este receptor. Goldstein et al.. "Cellular and Molecular Applications to Biology of Aging", AFCR Meeting Abstract, Seattle, May 4-5, 1991.

Foram identificadas várias actividades biológicas de IGF-I noutros mamíferos idosos. Por exemplo, IGF-I foi descrito como baixando os níveis de glucose do sangue em humanos (Guler et al.. N. Enal. J. Med.. 137: 137-140 (1987)). Ainda, IGF-I promove o crescimento em várias condições metabólicas caracterizado por níveis baixos de IGF-I, tais como ratos hipõfissectomizados [Scheiwiller et al., Nature, 323: 169-171 (1986)] e ratos anões [Skottner et al.. Endocrinoloqy, 124: 2519-2526 (1989)]. 0 peso do rim dos ratos hófissectomizados aumenta substancialmente quando das infusões prolongadas de IGF-1 subcutâneamente (Guler et al.r Proceedings of the lst European Conqress of Endocrinolo-qy. 103: resumo 12-390 (Copenhagen, 1987)). Os rins de murganhos anões Snell e ratos anões comportaram-se de forma semelhante (van Buul-Offers et al., Pewdiatr. Res.. 20: 825-827 (1986)); Skottner et al.. Endocrinoloqy. supra. Uma utilização adicional de IGF-I é aumentar a filtração glomerular e o fluxo de plasma renal (Guler et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. £6:2868-2872 (1989)). O efeito anabólico de IGF-I em ratos recem-nascidos em crescimento acelerado foi demonstrado in vivo (Philipps et al. , Pediatric 11

Res., 23: 298 (1988)). Em animais subalimentados, sob tensão ou doentes, sabe-se que os níveis de IGF-I estão diminuídos.

GH e IGF-I 'w' GH e IGF-I foram associados a propriedades imuno-regu-.ladoras. A resposta imune resulta da interacçao de antigénios (fracções estranhas ou não autólogas) com células hospedeiras (linfócitos) portadores de receptores específicos na membrana superficial para estes antigénios. Os linfócitos são agrupados em duas classes principais, células T e células B.

As células T derivadas do timo onde sofrem maturação e se diferenciam das células derivadas da medula óssea. As células T maduras deixam a glândula do timo para circularem continuamente do sangue para os nódulos linfáticos e do baço novamente para o sangue. As células T são ainda subdivididas em três classes principais: células T auxiliares, células T supressoras e célui-las T citolítícas. As células T auxiliares auxiliam outras células: células B para secretarem anticorpos, células citotóxi-cas para se tornarem funcionais e macrófagios para se tornarem activados. Esta população de células T é portadora do marcador de superfície CD^ que é usado para identificar esta subsérie nos tecidos e sangue. vj

As células T citolíticas são responsáveis pela morte de células alvo tais como células infectadas por vírus, células tumorais e enxertos. As células T supressoras actuam para limitar e terminar a resposta imune. As populações de células T citolíticas e supressoras são identificadas pela marca de superfície CD_.

O

As células B ou células formadoras de anticorpos, também derivam de precursores imaturos encontrados na medula óssea. Quando maduras, as células B migram para todos os orgãos linfóides excepto o timo. Quando maduras as células B migram para todos os orgãos linfóides excepto o timo. As células B interac-tuam com.antigénios através das moléculas de anticorpos ligadas à membrana plasmãtica que actuam como proteínas receptoras. Esta imunoglobulina de superfície é usada como marcador para identificar células B nos tecidos e no sangue. Após interacção com o antigénio e com as células T auxiliares, as células B diferenciam-se em céklulas formadoras de anticorpos designadas células do plasma. Estas células do plasma secretam anticorpos para a matrix extracèlular. 0 anticorpo difunde-se para os capilares e circula via fluxo sanguíneo normal. Assim, o nível de imunoglobulina do soro reflete as dinâmicas celulares da resposta imune.

Em muitos estados, as crianças necessitam de ser imunizadas de rotina contra doenças tais como difteria, tosse convulsa e febre tifoide (DPT), assim como sarampo, tétano, papeira, poliomielite e rubéola, através da administração de vacinas. A reacção de células B às vacinas é a produção das imunoglobulinas adequadas, as quais se destinam a conferir imundade contra a doença. De um modo geral, uma célula B particular diferenciar-se-ã para produzir um tipo particular de anticorpo e t-al produção é causada pela presença no corpo de um tipo particular de antigénio. Portanto, quando um animal ou pessoa é exposto a uma série de antigénios diferentes, o animal ou humano terá uma série de de células B diferentes que podem produzir as sua imunoglobulinas particulares quando o antigénio adequado está presente.

Nalgumas situações, a resposta imune ao antigénio é insuficiente para conferir imunidade. Ou seja, uma quantidade de imunoglobulinas é gerada (ou uma série de células B são potencia-das) que é insuficiente para conferir imunidade eficaz. É conhecido desde 1967 que existe uma ligação entre a pituitária anterior e o sistema imune e especificamente com GH. Dois grupos de investigadores concluíram dos seus estudos que GH controla o crescimento de tecido linfóide (Pierpaoli e Sorkin, Nature. 215: 834 (1967); Baroni, Exoerientia. 23.:282 (1967)). Subsequentemente, a função imunológica foi restaurada na pituitá-,ria de murganhos anões por uma combinação da hormona somatotró-pica bovina e tiroxina (Baroni et al. Immunol.. 17: 303-314 (1969)).

Numa estirpe de galinhas com nanismo ligado ao sexo, o tratamento com GH resultou em melhores respostas de anticorpos e crescimento da bursa en quanto que o tratamento com tiroxina estimulou o crescimento do timo (Marsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 175: 351-360 (1984)). No entanto, nenhum dos tratamentos alterou a função imune na. galinha anã autossómica. A terapia com GH bovina sozinha restaurou parcialmente a função imunológica ém cães Weimaraner imunodeficientes (Roth et al.. Ann. J. Vet. Res., 45: 1151-1155 (1984)).

Murganhos com deficiência em GH hereditária desenvolveram uma incapacidade do sistema imune associada a trofia tímica, imunodeficiência e perda de peso, resultando numa esperança de vida encurtada (Frabis et al.. Clin. Exp. Immunol.. 9: 209-225 (1971)). Mostrou-se que ocorre um declínio da concentração de timulina (uma hormona tímica) no plasma associada ã idade e a concentração de timulina no plasma aumenta em cães idosos e de meia idade tratados com bGH (Goff et al.. Clin. Exp. Immunol. 68 580-587 (1987)). Os autores sugerem que GH exógeno possa ser útil para restaurar algumas funções imunes em indivíduos idosos. Ainda, encontrou-se que a administração de hGH a murganhos C57/B1/6J reverte o efeito inibidor da prednilisona no timo e celularidade do baço e na actividade de células assassinas 14

naturais; a administração de hGH sem prednisolona não tem efeito, se bem que em doses mais altas tenha induzido um decréscimo dos parâmetros tímicos e a act.ividade de células assassinas naturais sem efeito na celularidade do baço e pesos relativos (Franco etal., Acta Endocrinilooica. 123: 339-344 (1990)).

Também se mostrou que GH induz a proliferação de células T no timo (Murphy et al.. FASEB Meetinq Abstract. Atlanta, Abril 1991; Duum et al. FASEB Meetinq Abstract. Atlanta, Abril 1991). Para -revisões recentes nos efeitos imunes de GH, ver Kelley, "Growth Hormone in Immunobiology", em Psychoneuroimmuno-loay II. 2§ ed., B. Ader et a1.. eds. Acad. Press 1990 e Ammann, "Growth Hormone and Immunity", em Human Growth Hormone Progress and Challenqes. L. Underwood, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, (1988), pp. 243-253; e Weigent e Blalock, Proq. NeurEndocrin-Iiamunology, 2: 231-241 (1990) . Foi descrito que a actividade dos principais tipos de células do sistema imune, incluindo as células T, células B, células assassinas naturais (NK) e maerôfa-gos podem ser alterados pela GH (Kelly, Biochem. Pharmacol.. 38: 705 (1989)).

Uma publicação descreve que o IGF-I gerado localmente medeia a-aeção de GH nos linfócitos T através do receptor de IGF tipo I (Geffner et al.. J. Clin. Endocrin. and Metab.. 71: 464 (1990)). Também, Franco et .al. na página 343, especula acerca de alguns efeitos de hGH sobre o sistema imune como ocorrendo via IGF-I. Timsit et al. no 73s Encontro anual da Endocrine Society, 19-22 de Junho, Resumo 1296 descreve hGH e IGF-I como estimulando a produção da hormona tímica.

Houve resultados publicados documentando a capacidade das células do sistema imune para produzir moléculas do tipo IGF-I. Aquelas incluem macrófagos alveolares activados [Rom et 15

al.. J. Clin. Invest.. 82: 1685 (1988)], linfócitos B humanos transformados com o vírus de Epstein-Barr [Merimee et al. . J. Clin. Endocrin. Metabol.. 69: 978 (1989)], tecidos do baço e do timoatravés da detecção de mRNA de IGF-I [Murphy et al.. Endocrinoloqy, 120: 1279 (1987)] e células T normais [Geffner et al.. supra 1.

Também foram apresentados resultados sugerindo que IGF-I produzido localmente em tecidos tais como o timo ou sítios de inflamação deve afectar o crescimento e função dos linfócitos T portadotes do receptor de IGF-I (Tapson et al. J. Clin. Invest. 82: 950-957 (1988)). Foi observado um aumento estatisticamente significativo no peso do timo e baço de ratos hipofissectomizados sujeitos a infusão durante 18 dias com IGF-I comparado com a testemunha ou tratamento dom GH (Froesch et al. em Growth Hormone Basic and Clinicai Aspects, eds. O. Isaksson et al.. p. 321-326 (1987)). Também foi descrito um aumento no tecido tímico em ratos jovens deficientes em GH tratados com IGF-I SGuler et al.. Proc. Na-tl. Acad. Sei. USA. 85: 4889-4893 (1988) ] e um aumento no baço de ratos anões [Skottner et al.. Endocrinoloqy. supra]. Outros mostraram repopulação do timo atrofiado em ratos diabéticos usando IGF-I ou insulina; no entanto, quando os ratos foram imunizados com albumina sérica bovina (BSA) e novamente sensibilizados, não houve efeito da insulina ou de IGF-I na resposta de anticorpos apesar dos efeitos no tamanho do timo e do baço (Binz et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. fU-SA) . 87: 3690-3694 (1990)). Foi descrito que IGF-I estimula a proliferação de linfócitos (Johnson et al., Endocrine Society 73rd Annual Meeting, 19-22 de Junho, 1991, Resumo 1073), 87.

Ainda, encontrou-se que IGF-I faz a repopulação da cavidade da medula óssea com células hematopoiéticas [Froesch et al.. supraT. estimula a eritropoiese em ratos hofisSectomizados 16 [Kurtz et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA). 85: 7825-7829 (1988)] e aumenta a maturação de progenitores granulocíticos e eritróides morfologicamente reconhecíveis em culturas em suspensão de células da medula óssea (Merchav et al. J. Clin. Invest.. 81: 791 (1988)).

Em concentrações nanomolares, IGF-I é um factor promotor do crescimento para linfócitos (Schimpff et al.. Acta Endocrinol. 102; 21-25 (1983)). Mostrou-se recentemente què as células B, mas não as células T, possuem receptores para IGF-I (Stuart et al.. J. Clin. Endo. and Met.. 72: 1117- 1122 (1991)). Também, IGF-I, como agente quimiotático para células T em repouso e activadas, estimula um aumento na incorporação de timidina nas células T em repouso e activadas. As linhas de células T normais apresentam aumento da formação basal de colónias como resposta a IGF-I (Geffner et al. , supra). Foi também estabelecido na página 955 de Tapson et al.. J. Clin. Invest.. 82: 950-957 (1988) que IGF-I produzido localmente em tecidos tais como o timo ou sítios inflamatórios deve afectar o crescimento e função de linfócitos T portadores do receptor de IGF-I. No entanto, IGF-I está descrito como suprimindo numa forma dependente da dose as respostas proliferativas induzidas por IL-2 e as respostas de esplenócitos a anticorpos-in vitro (Hunt e Eardley, J. Immunol.. 136: 3994--3999 (1986)).

Existe a necessidade de se conseguir um reagente que estimule o sistema imune de um mamífero ou ave, quer a resposta imune seja mediada por células quer seja mediada por anticorpos. Observa-se a necessidade particular de um reagente que reforce a resposta de anticorpos em doentes com sistemas imunocomprometidos a antigénios aos quais são expostos. Face à controvérsia envolvendo IGF-I, é pouco claro que os seus efeitos serão no aumento da função imune, em oposição a um mero aumento dos orgãos envolvidos na função imune como sejam o timo e o baço ou no aumento da actividade das células T ou B in vitro ou in vivo. É portanto um objectivo do presente invento estimular a resposta imune de um mamífero ou ave.

Constitui um objectivo particular aumentar a produção de imunoglobulinas aumentando o número de células produtoras de imunoglobulina e/ou aumentando a quantidade de imunoglobulina produzida pelas células produtoras de imunglobulina individuais em resposta ao' imunogénio predeterminado.

Constitui um objectivo mais particular aumentar as respostas de anticorpos em doentes com sistemas imunes gravemente atingidos, tais como doentes que receberam transplantes de medula óssea ou em doentes com AIDS.

Constitui'um objectivo do presente invento desenvolver um método da estimulação preferencial do crescimento ou desenvolvimento do sistema imune através da administração de composições contendo GH.

Constitui um objectivo do presente invento estabelecer métodos para a utilização terapêutica de composições contendo GH em que a composição pode ser administrada intermitentemente, como seja de três em três dias ou mais. Outros objectivos e caracte-rísticas do presente invento serão mais aparentes quando da consideração da descrição que se segue e reivindicações apensas. Estes e outros objectivos serão aparentes para os familiarizados com a matéria.

SUMÁRIO DO-INVENTO w É descrito um método para a utilização da hormona de crescimento compreendendo métodos terapêuticos que resultam na presença contínua de uma quantidade terapeutiçamente eficaz de GH. Numa aplicação deste método, a presença contínua de GH pode .ser conseguida pela utilização de um catétero, bomba de insulina ou sistema de difusão implantado que lentamente administra uma dose de GH que resulta na estimulação do sistema imune conduzindo a uma resposta imune melhorada. Numa segunda aplicação do método do presente invento, a presença contínua de GH é conseguida por acoplagem de GH a outras moléculas que resulta numa semi-vida melhorada de GH facilitando assim a presença contínua de uma quantidade terapeutiçamente eficaz de GH. Entre as macromoléculas preferidas que resultam na presença contínua de GH estão 1) proteína de ligação â hormona de crescimento; 2) polímeros ligados covalentemente tais como polietilenoglicol, polipropile-noglicol ou açúcarès; e 3) outras macromoléculas tais como proteínas, lípidos ou glicolípidos que reduzem a eliminação e que não são imunogénicos. A presença continua de GH quando combinada com uma macromolécula que p-rovoca uma maior semi-vida no soro resulta numa composição terapêutica que pode ser administrada intermitentemente. Tal administração.intermitente pode ser uma vez de três em três dias ou mais, de preferência de seis em seis dias ou mais. São descritas novas formas modificadas da hormona de crescimento humana (hGH) tendo resíduos de aminoácidos específicos modificados pela ligação covalente de polietilenoglicol (PEG).. É também descrita a utilização de PEG-GH para se conseguir crescimento óptimo com administração intermitente. Ê ainda divulgada a utilização terapêutica de PEG-GH ou GH, em combinação com IGH-I, na estimulação do desenvolvimento do sistema imune. - 19 -

São também descritas novos métodos para a administração terapêutica de hGH e composições que apresentam eficácia com administração intermitente. Assim, o presente invento proporciona um método paraa estimulação de um sistema imune de mamífero ou de ave compreendendo a administração a um mamífero ou ave de uma quantidade eficaz na estimulação do sistema imune de uma composição .contendo GH. GH pode ser usado em combinação com IGH-I num método de estimulação imune.

Num aspecto mais particular, o invento proporciona um método para aumentar uma resposta de anticorpos em mamífero ou ave a um imunogénio compreendendo a administração ao mamífero ou ave do imunogénio e uma quantidade eficaz de GH e IGF-I. Esta utilização de GH, PEG-GH, com ou sem IFG-I, pode ser considerada como um adjuvante endócrino ou hormonal para o processo de imunização. De preferência, esta administração é simultânea e seguida de reforços do imunogénio em intervalos de tempo encurtados relativamente, relativamente aos métodos de imunização quando não são dados GH e IGF-I. Portanto, o invento proporciona coadminis-tração de quantidades eficazes de IGF-I e GH para a estimulação do sistema imune. Este adjuvante hormonal, ou seja a utilização de GH ou de GH mais IGF-I como adjuvante para promover a resposta imune, é aplicável a qualquer substância antigénica. Mais preferencialmente, o antigénio deriva de microorganismos, vírus e tumores.

Ainda num outro aspecto, é proporcionado um método para aumentar a quantidade de imunoglobulina produzida pelas células B de um humano ou outro mamífero como resposta a um imunogénio, em que o referido individuo tem uma produção insuficiente de imunoglobulina, compreendendo a administração ao individuo de uma quantidade eficaz de GH e IGF-I, a quantidade sendo eficaz para aumentar a produção de imunoglobulina. V.

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona um método para aumentar a resposta de células T num humano ou outro mamífero a um imunogénio, onde o referido individuo sofre de actividade insuficiente T-auxiliar ou T-citolítica, compreendendo a administração ao individuo de uma quantidade eficaz de GH e de IGF-I, a quantidade sendo eficaz para aumentar a actividade .T-auxiliar ou T-citolítica.

Os estudos com GH mostraram que a medula óssea pode ser estimulada por doses regulares de bolus de GH, entre as doses de bolus a concentração de GH no soro decai para níveis muito baixos. Tais doses diárias de bolus de GH não são eficazes para se conseguir uma presença contínua de GH suficiente para estimular o sistema imune. 0 presente invento descobriu que a presença contínua de GH resulta na estimulação dos istema imune e que tal presença continua pode ser conseguida pela utilização de uma formulação de GH. A administração intermitente de GH não é uma utilização terapeuticamente eficaz de GH para estimular o sistema imune. A estimulação do sistema imune requere a presença contínua de GH. A administração intermitente de GH pode resultar na presença contínua de GH quando a GH é complexada com ela própria òu com ^ outra macromolécula de forma a que GH não seja eliminada do plasma. A utilização intermitente de GH é definida como a administração de três em três dias ou mais, de preferência de seis em seis ou mais dias. Esta utilização inesperada de GH em combinação com uma macromolécula tal como PEG ou a ligação covalente a outros polímeros igualmente grandes resulta numa composição terapêutica que pode ser administrada em intervalos intermitentes resultando no entanto na presença contínua de GH no plasma. A presença contínua de GH resulta na estimulação inesperada do sistema imune. Um segundo resultado inesperado da utilização de 21

• ,,'Λ · «*, Ν k' ‘ GH complexada com uma macromolécula é a estimulação do crescimento de outros tecidos tais como medula óssea e músculo quando comparado com GH não complexada com uma macromolécula e intermitentemente administrada de seis em seis ou mais dias. A administração de GH complexada com uma macromolécula, como seja PEG, resulta surpreendentemente na estimulação da medula e de outros .tecidos mesmo quando a administração de GH é intermitente.

ESTIMULAÇÃO DO SISTEMA IMUNE

Hormona de crescimento secretada por células tumorais secretoras de GH administradas mostrou anteriormente estimular o crescimento (Kelley, Biochem Pharmacol., 38 705, 1989). A hormona de crescimento e o receptor da hormona de crescimento encontrou--se estarem presentes dentro das células do sistema imune. No entanto, não há indicação de que a administração de GH resulte nuam estimulação terapeuticamente útil do sistema imune de mamíferos ou aves. A administração de GH por si só ou de GH em combinação com IGF-I estimula o sistema imune, mais preferencial-mente quando GH está continuamente presente no plasma sanguíneo e nos fluidos do corpo. Surpreendentemente, a presença contínua de GH resulta na estimulação dos tecidos imunes que respondem, tais como timo e baço. ! V-/

Uma forma preferida de GH é GH em combinação com uma macromolécula que aumente a semi-vida no plasma da GH. Tais macromoléculas incluem polietilenoglicol, polipropilenoglicol, açúcares, lípidos e proteínas. Entre as proteínas preferidas estão as proteínas de ligação a GH, anticorpos e albumina. A forma mais preferida de GH é GH ligada a PEG. As formulações preferidas para administração de forma a induzir uma concentrações continuas eficazes no plasma de GH incluem GH com um ou mais resíduos de lisina e metionina com PEG ligado.

Se bem que estudos recentes em animais vivos tenham mostrado que IGF-I pode causar um aumento de peso do baço e do timo em animais deficientes em GH, estes estudos não progrediram para além de descrever uma grande alteração no tamanho do timo e baço ou no número de células. Outras manipulações do tamanho do baço e do timo mostrou-se não estarem associadas a um efeito na .função (Jardieu e fraker, J. Immunol... 124: 2650-2655 (1980)), Ainda, o artigo de Binz et al. citado atrás utilizou um modelo de rato diabético em que a insulina e IGF-I afectaria os diabetes e portanto ajudaria todos os tecidos no corpo e encontrou-se que IGF-I e insulina não têm qualquer efeito funcional no título de anticorpos.

Face a isto, o presente invento representa um resultado esperado de que não só os pesos do baço e fígado aumentam quando da administração das composições contendo GH, mas também a função do timo, baço ou nódulos linfáticos, conforme indicado pelo aumento de tamanho é do número de células como resposta a IGF-I. O aumento do número celular e resposta traduz-se numa maior produção de anticorpos por estas células como resposta a um antigénio. Este método será útil no tratamento de doentes tendo sistemas imunes afectados como seja doentes com AIDS nos quais um aumento da resposta - de anticorpos a antigénios diminuirá a gravidade de doenças infecciosas e nos quais as vacinas serão mais eficazes.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

Figura 1: a figura IA é um gráfico do aumento de peso do baço em ratos após tratamento com várias doses de excipiente, GH ou GH mais GHBP durante 7 dias; a figura 1B é os mesmos dados do baço como percentagem do peso total do corpo. - 23

Figura 2: é um gráfico do peso do timo em ratos hipox após tratamento com várias doses de hGH, PEG-1 hGH ou PEG-1 hGH.

Figura 3: é um gráfico do aumento do peso total do corpo após 24 dias em ratos hipox que receberam tratamento com excipiente, PEG-5 diariamente, de três em três dias ou de seis em .seis dias; ou hGH diariamente, de três em três dias ou de seis em seis dias.

Figura 4: é um gráfico do peso do timo após o mesmo tratamento como na Figura 3.

Figura 5: é uma cinética durante 16 dias do aumento do peso total do corpo após tratamento com excipiente, hGH de seis em seis dias, hGH diariamente ou PEG-hGH diariamente ou PEG-hGH de seis em seis dias. Todos os grupos receberam 0,1 mg/Kg/dia de hGH.

Figura 6: é um gráfico do aumento de peso de corpo em ratos idosos tratados com excipiente, IGF-I, hGH ou IGF-I mais hGH. w

Figuras 7A, 7B e 7C:- proporcionam gráficos o número de esplenócitos, número da população dê células T do baço e número de células B do baço, respectivamente, após 7 dias de tratamento com IGF-I ou tratamento com excipiente. vy'

Figuras 8A, 8B e 8C: proporcionam gráficos sobre o número de esplenócitos, número da população de células T do baço e número das células B do baço, respectivamente, após 14 dias de tratamento com IGF-I, GH ou excipiente. 24

Figura 9: representa um gráfico do número de timócitos após 14 dias de tratamento com hGH, tratamento testemunha com IGH-I e tratamento testemunha com hGH.

Figura 10: representa um gráfico das respostas mitogé-noicas 14 dias após tratamento inicial com excipiente ou IGH-I ou .hGH de murganhos usando os mitogénios LPS (Fig. 10A), ConA (Fig. 10B) ou PWM (Fig. 10C) .

Figuras 11A, 11B e 11C: proporcionam gráficos sobre o número de esplenócitos, número da população de células T do baço e número da população das células B do baço, respectivamente, após 14 dias de tratamento com excipiente, IGH-I, hGH e IGF-I mais hGH.

Figura 12: representa um gráfico do número de timócitos após 14 dias de tratamento com IGH-I, tratamento com hGH e tratamento com IGF-I mais hGH.

Figuras 13A, 13B e 13C: representam gráficos do número de linfócitos do baço, número da subpopulação de células T do baço e número de células B do baço, respectivamente, 7 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGF-I, hGH e IGF-I mais hGH.

Figura 14: representa um gráfico do número de timócitos 7 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGH-I, hGH e IGF-I mais hGH. w

Figura 15: representa um gráfico das respostas mitogé-nicas 7 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGF-I, hGH ou IGF-I mais hGH dos murganhos usando os mitogénios LPS (Fig. 15A), ConA (Fig. 15B) ou PWM (Fig. 15C).

✓V 25

Figuras 16A e 16B: representam gráficos do número de células dos nódulos linfáticos e das populações de células T dos nódulos linfáticos, respectivamente, 7 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGF-I, hGH e IGF-I mais tratamento com hGH.

Figuras 17A, 17B e 17C: proporcionam gráficos sobre o .número de linfócitos do baço, número da populaçãop de células T do baço e número de células B do baço, respectivamente, 21 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGF-I, hGH e IGF-I mais hGH.

Figura 18: representa um gráfico do número de timócitos 21 dias após o fim do tratamento com excipiente, IGF-I, hGH e IGF-I mais hGH.

Figura 19: representa um gráfico das respostas mitogé-nicas 21 dias após o fim do tratamento de murganhos com excipiente, IGF-I, hGH ou IGF-I mais hGH 'usando os mitogénios LPS (Fig. 19A), ConA (FÍg.l9B) ou PWM (Fig.l9C).

Figura 20: mostra a concentração de IgG anti-dinotrefe-nilovalbumina (Fig. 20A) e IgG total (Fig. 20B) em Mg/ml no soro de murganhos em função do número de semanas a partir da primeira imunização com o conjugado dinitrofenil-ovalbumina (Dia 0, designado AG), em que na semana 3 (Dia 20) os murganhos receberam injecções de reforço de conjugado e dado excipiente ou IGF-I.

Figura 21: mostra as alterações do aumento de peso para murganhos com e sem medula óssea transplantada e tratado com excipiente ou 40 g ou 120 μg de IGF-I.

Figuras 22A, 22B, e 22C: mostram gráficos de subpopula-ções de células B e T do sangue periférico e razão H/S, 26

respectivamente, 14 dias após irradiação de murganhos com medula óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 Mg de IGF-I.

Figuras 23A, 23B e 23C: mostram gráficos do número de linfócitos do baço, subpopulações de células T do baço e número de células B do baço, respectivamente, 14 dias após irradiação de murganhos com medula óssea transplantada e tratada com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 μq de IGF-I.

Figura 24: representa um gráfico das respostas mitogé-nicas 14 dias após irradiação dos murganhos com medula óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 μq de IGF-I usando os mitogénios LPS (Fig. 24A), ConA (Fig. 24B) ou PWM (Fig. 24C).

Figuras 25A, 25B e 25C: mostram gráficos de células B do sangue periférico, subpopuláções de células T e a razão H/S, respectivamente, 21 dias após irradiação dos murganhos com medual óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 μq de IGF-I.

Figuras 26A, 26B e 26C mostram os gráficos do número de esplenócitos totais, subpopulações de células T e número de células B do baço, respectivamente, 21 dias após irradiação de murganhos com medual óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 Mg de IGF-I.

Figura 27 representa um gráfico das respostas mitogéni-cas 21 dias após irradiação de murganhos com medula óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μq de IGF-I ou 120 μq de IGF-I usando os mitogénios LPS (Fig. 27A), ConA (Fig. 27B) ou PWM (Fig. 27C). 27

Figura 28 representa um gráfico do número de linfócitos do timo 14 dias (Fig. 28A) ou 21 dias (Fig. 28B) após irradiação dos murganhos com medula óssea transplantada e tratados com excipiente, 40 μg de IGF-I ou 120 μς de IGF-I.

DESCRICÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

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A. DEFINIÇÕES

Como aqui é usado, "estimulação de um sistema imune" refere-se ao aumento da função imune de um mamífero ou ave, quer o aumento seja devido à mediação por anticorpos quer seja por células e quer o sistema imune seja endógeno para o hospedeiro tratado com GH ou GH mais IGF-I quer seja transplantado de um dador para o hospedeiro recipiente dado GH ou GH mais IGF-I (como sejam transplantes de medula óssea). Por exemplo, a estimulação pode resultar de um aumento do número de células do baço tais como número de linfócitos do baço, número da população de células T do baço (células T, CD4 e CDg) ou número de células B do baço ou a partir de um aumento do número de timócitos. Outras células envolvidas na resposta do sistema imune inclui células assassinas naturais, macrófagos e neutrófilos. Em adição, a estimulação pode ser devida a um aumento na produção de anticorpos como resposta a ^ um imunogénio.

Tal como aqui são usadas as expressões "sistema imune comprometido" e "condição em que ocorre produção insuficiente de imunoglobulina" significam que o sistema imune de humanos assim como o de animais que têm uma resposta de anticorpos antigénios inferior ao normal, quer devido ao tamanho do seu fígado ser menor do que deveria, quer o baço estar apenas parcialmente funcional, quer drogas tais como agentes quimioterapêuticos estarem a suprimir a função imune normal, quer o animal seja -\ - „ ,ί -ϊ C· ^ . funcionalmente deficiente em IGF-I (ou GH) ou devido a qualquer outro factor. Os exemplos incluem doentes idosos, doentes sujeitos a quimioterapia ou terapia de radiação, em recuperação de uma doença importante ou sujeitos a cirurgia, doentes com AIDS, doentes com deficiências em células B congénitas e adquiridas tais como hipogagaglobulinémia, agamaglobulinémia variada comum e deficiências selectivas de imunoglobulinas, e.g. deficiência em IgA, doentes infectados com um vírus como seja o vírus da raiva com um tempo de incubação mais curto do que a resposta imune do doente e doentes com perturbações hereditárias tais como o síndroma de diGeorge. Os mamíferos e aves potencialmente afecta-dos incluem mamíferos e aves de importância económica tais como bovinos, ovinos e suínos, assim como galinhas e perús. Os mamíferos podem apresentar uma atrofia do baço e subsequente perda do número e função das células B. 0 mamífero preferido aqui é o homem.

Tal como aqui é usado, "IGF-I" refere-se ao factor de crescimento tipo insulina derivado de qualquer espécie, incluindo bovinos, ovinos, porcinos, equinos, aves e preferencialmente humanos, na sequência nativa ou na forma variante e derivado de qualquer fonte, natural, sintética ou recombinante. É preferido neste caso para uso em animais a forma de IGF-I derivada da espécie particular a ser tratada, como seja IGF-I de suíno para tratar porcos, IGF-I ovina,para tratar de carneiros, IGF-I bovina para tratar de gado, etc. Neste caso é preferida para usar em humanos a sequência nativa de IGF-I madura, mais preferencialmente sem uma metionina N-terminal, preparada e.g. pelo processo descrito em EP 230869 publicado em 5 de Agosto, 1987; EP 128733 publicado em 19 de Dezembro de 1984; ou EP 288451 publicado em 26 de Outubro de 1988. Mais preferencialmente, esta sequência nativa de IGF-I é produzida por via recombinante e pode ser adquirida à Genentech, Inc. South San Francisco, CA para investigações clínicas. É também preferido para usar IGF-I que tenha uma actividade específica superior a cerca de 14000 unidades/mg conforme determinado pelo ensaio de radio-receptores usando membranas de placenta, como seja a que pode ser adquirida à KabiGen AB, Stockolm, Sweden.

As variantes de IGF-I mais preferidas são as descritas em PCT WO 87/01038 publicado em em 26 de Fevereiro, 1987 e em PCT wo 89/05822 publicado em 29 de Junho, 1989, i.e., aquelas em que pelo menos o resíduo de ácido glutâmico está ausente na posição 3 do extremo N da molécula madura ou aquelas que possuem uma deleção até cinco aminoácidos no extremo N. A variante mais preferida tem os três primeiros aminoácidos do extremo N eliminados (variadamente designada como IGF do cérebro, tIGF-I, des(l-3)--IGF-I ou des-IGF-I). IGF-I humana recombinante [que pode ser adquirida à KabiGen, Stockholm, Sweden (actividade específica > 14000 U/mg por ensaio de bio-receptores usando membranas de placenta) ou disponível para investigações clínicas na Genentech, Inc., South San Francisco] foi empregue em todas as experiências com IGF-I detalhadas nos exemplos. A IGF-I foi dissolvida a 5 mg/ml em tampão citrato 10 mM e 126 mM NaCl, pH 6-, 0. Esta IGF-I foi administrada a três espécies, i.e, rato, coelho e murganho, para se observar os seus efeitos no peso do baço e do timo. Os estudos de dose resposta foram realizados em murganho e rato e IGF-I foi dado ao coelho com efeitos semelhantes. Em adição os números de células B e T e as respostas a estimulação mitogénica foram avaliadas em murganhos. Dois modelos animais de deficiência em GH e portanto deficiência em IGF-I foram usados pará demonstrar o efeito de IGF-I no peso e tamanho do baço e do timo. Um terceiro modelo de deficiência em GH e em IGF-I é o animal idoso. Os ratos idosos (18 meses de idade) foram usados para demonstrar o efeito 30

de IGF-I no tamanho do baço e do timo, arquitectura celular e resposta in vitro a mitogénios. Também, ratos adultos ovariectomi-zados com concentrações normais de IGF-I no soro, foram usados para demonstrar o efeito de IGF-I no timo e baço num animal que não era deficiente em IGF-I.

Conforme aqui usado, "GH" refere-se à hormona de crescimento de qualquer espécie, incluindo bovinos, ovinos, equinos, aves e preferencialmente humanos (hGH), na sequência nativa ou na forma variante, quer seja natural, sintético ou recombinante. Isto inclui tanto Met-hGH [U.S. Pat. 4755465 publicado em 5 de Julho, 1988 e Goeddel et al., Nature. 282: 544

R Ο (1979)], a qual é vendida com o nome PROTROPIN pela Genentech, Inc. e é idêntica ao polipeptídeo natural, com excepção da presença de um resíduo de metionina N-terminal e hGH recombinante (rhGH), disponível para investigação clinica e investigação na Genentech, Inc. com a marca registada de Nutropin e podendo ser adquirido à Eli Lilly, a qual não possui" este resíduo metionina e tem uma sequência de aminoácidos idêntica â da hormona natural. Ver Gray et al., Biotechnoloav. 2.:161 (1984). Tanto met-hGH como rhGH têm potências e valores farmacocinéticos idênticos (MÓore et al., supra). Um outro hGH candidato adequado é uma variante hGH que é uma forma placentária de GH com-actividade somatogénica pura e sem actividade lactogénica. Pat. U.S. Na 4670393 publicada em 2 de Junho 1987. Outros exemplos de variantes de GH estão descritos em WO/90/04788 publicado em 3 de Maio 1990. Para além de GH, outras moléculas que têm a mesma actividade estão incluídas dentro do significado funcional da hormona de crescimento, por exemplo fragmentos de GH ou anticorpos específicos para o receptor de GH que estimula a resposta a GH. Em adição, qualquer outro agente terapêutico que provoque uma expressão continua de GH através da manipulação da secreção de GH endógena será incluído dentro da definição funcional de GH. Por exemplo, um aumento

da expressão contínua de GH pode ser conseguido pela administração de hormonas esteróides, por exemplo estrogénio e testoste-rona. A utilização de tais agentes que aumentam a produção endógena de GH resultando na presença contínua de GHJ estimulando assim o sistema imune e outros tecidos que respondem.

Tal como aqui é usado, a expressão "administração intermitente" ou o termo "intermitente" referem-se ambos à utilização terapêutica por injecção ou outros métodos adequados, como seja formulação para administração no pulmão ou nasal, de GH ou GH mais IGF-I num intervalo de tempo curto, geralmente menos de 60 minutos, preferencialmente menos de 30 minutos e mais preferencialmente em menos de 10 minutos. Pode-se fazer libertação de um bolus de GH ou de GH mais IGF-I. Esta libertação de bolus intermitente da composição terapêutica contendo GH pode ser de três em três ou mais dias, de preferência com intervalos de 4, 5, 6 ou mais dias e mais preferencialmente com intervalos de 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 24 ou mais dias.·

Tal como aqui é usada, a expressão "presença contínua" refere-se a uma concentração terapeuticamente eficaz no plasma, soro ou fluido intracelular de GH ou variante de GH. GH está presente em quantidades detectáveis, numa concentração suficiente para estimular os tecidos que respondem a GH e o nível presente não está abaixo de um nível de GH livre que provoque resposta nos tecidos que respondem a GH.

Tal como aqui é usada, a expressão "aumento da resposta de anticorpos a um imunogénio" refere-se a um aumento do título da imunoglobulina do soro /IgG, IgA ou IgM) de um animal como resposta a um reforço do antigénio contra o qual o anticorpo é dirigido. Os indicadores de uma maior resposta de anticoros incluem um aumento na produção de anticorpos a injecções de ί ? ν' ν,-’''' reforço do imunogénio, assim como um aumento rio número de células B do doente. O imunogénio pode ser qualquer um que induza anticorpos dirigidos contra ele, mas preferencialmente é um vírus, incluindo uma vacina ou uma bactéria. O invento é particularmente útil nos casos em que o mamífero ou ave é infectado com um vírus que tem um tempo dê incubação mais curto do que a resposta imune do mamífero ou ave, como seja, e.g., vírus da raiva., A IGF-I aqui tratada decresce o intervalo entre as imunizações primárias e secundárias ou entre as imunizações primária ou secundária ou entre a imunização secundária e subsequentes reforços do imunogénio. O invento é também útil na promoção da imunização através da utilização de GH ou GH mais IGF-I como adjuvantes hormonais para aumentar tanto a velocidade da produção de anticorpos como a grandeza da resposta imune. Este adjuvante hormonal também aumenta a resposta imune celular.

Tal como aqui é usado, a expressão "aumento da resposta de células T a um imunogénio" num indivíduo sofrendo de um estado em que ocorre actividade insuficiente T-auxiliar e T-citolítica refere-se a um aumento do nível de actividade. de células T auxiliares e/ou células T citoliticas do mamífero em resposta a um imunogénio ao qual as células T respondem, incluindo antigé-nios virais, tumores, bactérias, etc. Um indivíduo com actividade insuficiente T-auxiliar ou T-citolítica é um mamífero que tem um número inferior ao normal de células T-auxiliares e/ou T-citolí-ticas (conforme determinado, e.g., por marcas CD^/CDg) necessário por exemplo para secretarem anticorpos, activarem macrófagos e matarem células alvo tais como células infectadas por vírus ou células tumorais.

Tal como aqui é usada, a expressão "restaurar a imunidade" num mamífero significa levar o nível da imunidade do mamífero para valores normais, quer restaurando as células do X .- baço ou do timo ou aumentando a resposta das células T ou a quantidade de imunoglobulinas produzidas pelas células B.

Tal como aqui é usada, a expressão mamífero refere-se a qualquer mamífero mas especialmente primatas, bovinos, ovinos, caninos, felinos, equinos e roedores. Especificamente ele inclui humanos, vacas, cavalos, murganhos, coelhos, macacos, gatos, cães e porcos. B. MODOS PARA A REALIZAÇÃO DO INVENTO PEG-hGH Sumário

Fizemos hGH PEGilada e o complexo hGH PEGilada-proteína de ligação a hGH e mostrámos o aumento da semi-vida nos estudos de farmacocinética e maior potência nos estudos de aumento de peso em ratos. A imunogenicidade e toxicidade em murganhos foram igualmente estudadas. A PEGilação ao acaso e a PEGilação dirigida foram ambas usadas e caracterizadas. 0 presente invento mostra claramente que a administração s.c. de hGH como uma infusão contínua ou PEG-GH diariamente ou injecções intermitentes pouco frequentes são modos óptimos de libertação de GH para afectar o crescimento do timo e para estimular o sistema imune., PEG-GH é um método particularmente atractivo de realizar este invento. Num exemplo mostrámos que apenas 2 injecções de PEG-5 hGH com 6 dias de intervalo conduz a um grande aumento do crescimento do timo. Num outro exemplo, mostramos que pequenas doses de hGH dadas durante 24 dias são ineficazes na estimulação do cresciemnto do timo, apesar das mesmas doses de PEG-5 hGH aumentarem grandemente o tamanho do timo. De grande utilidade para a prática deste invento é a demonstração de que para se conseguir um tamanho do timo óptimo a PEG-5 hGH deverá ser libertada com injecções pouco frequentes, no rato em intervalos de 6 dias. De forma semellhante para as outras respostas dependentes de GH, a administração intermitente de GH de PEG-hGH resulta numa maior estimulação do crescimento. Num outro exemplo, mostramos que hGH sem metionina tem a eficácia pretendida quando está ligada a PEG. PHBP em combinação com GH resulta numa estimulação semelhante das respostas a GH pode ser administrado intermitentemente. A infusão contínua com níveis elevados de GH conseguirá estimulação semelhante mas com utilização de quantidades muito maiores de GH. 0 mecanismo do efeito aumentado de hGH contínuo no crescimento tímico é desconhecido. Sabe-se que as respostas óptimas a GH são observadas no corpo todo ou medula óssea após libertação pulsátil de GH. Deve-se portanto prever que o crescimento do timo será também óptimo com um método pulsátil da administração de hGH. Existem sistemas enzimáticos no fígado onde são produzidas diferentes isozimas dependendo do padrão de exposição a GH, alguns sendo facultativamente estimulados pela exposição contínua a GH. O mecanismo de como o fígado reage a padrões contínuos ou pulsáteis é desconhecido. A grandeza deste efeito foi surpreendente pois é possível administrar GH em diferentes padrões que têm ,um efeito semelhante no crescimento de todo o corpo ainda que não se observe um efeito de tudo ou nada no timo.

Mostrámos que o timo é restaurado no peso e na função pela administração de IGF-I, GH ou IGF-I + GH; ou seja um aumento na massa é acompanhado por um aumento no número de timócitos e as células produzidas são verdadeiras células precursoras das células T. 0 aumento da massa do timo, a sua renovação encontrada 35

-X de facto no presente invento é traduzido nunfefeito benéfico no sistema imune conforme determinado pela produção de anticorpos, contagem de células B ou contagem de células T.

Será de esperar que no homem GH tenha um efeito restaurador benéfico na função imune em doentes cujas células T do .sistema imune estão ausentes ou estão em número baixo. Este invento, proporciona pois a base de um modo de administração da met hGH, hGH sem metionina e particularmente de PEG-5 hGH (ambos met hGH e hH sem met) que parece ser a forma mais eficaz de hGH na produção desta resposta. Em adição, PEG-hGH, uma vez que pode produzir a resposta equivalente à de um modo contínuo de administração, mas usando injecções menos frequentes, parece a forma mais eficaz e prática de estimular os tecidos que respondem â presença contínua de hGH.

EFEITOS DE hGH NO TIMO

No presente invento, surpreendentemente encontrámos que a resposta do timo a GH está muito dependente do padrão de administração de GH. 0 aspecto surpreendente da descoberta de que a resposta do timo é óptimo sob exposição descontínua a GH. Outras respostas de crescimento a GH, por exemplo, as de todo o corpo ou da medula óssea, encontrou-se anteriormente serem óptimas quando GH foi administrado de uma forma pulsátil. Desconhecemos se existe qualquer outra resposta induzida por GH que seja optimizada por uma exposição contínua a GH. )

Inicialmente soubemos desta utilização de GH numa experiência comparando os efeitos das injecções diárias de GH e infusões contínuas de GH em ratos hipox. A GH contínua era muito mais eficaz na estimulação do crescimento do timo do que a mesma dose de GH dada por injecção diária. Em seguida estudámos mais de 36

perto os resultados obtidos da administração de PEG-GH a ratos hipox. Novamente PEG-GH deu muito maior crescimento tímico do que hGH não modificado. Observámos este efeito com met-hGH (protropi-na) tendo ligado PEG e hGH sem metionina (rhGH ou nutropina) com PEG. Métodos de adição de PEG a hGH 1. Adicao de PEG com metoxipolietilenoglicol aldeído (Me-PEG aldeído) por alauilacão redutora e purificação) i A 2 mg/ml de hGH em PBS pH 7,0, 5mM de Me-PEG aldeído--5000 (peso molecular 5000 daltons) e 20 mM de NaCNBH3 foram adicionados e suavemente misturados à temperatura ambiente durante 3 horas. Etanolamina foi então adicionada para 50 mM para fazer amidação redutora do restante Me-PEG não reagido. A mistura foi separada na coluna de permuta aniônica, FPLC Mono Q. Me-PEG que não reagiu não se liga à coluna e pode ser separado'então da mistura. Duas fracções principais de hGH com PEG foram obtidas com peso molecular aparente de 30 K e 40 K em SDS-PAGE redutora, vs 20 K de hGH que não reagiu. 0 complexo de HGH-proteína de ligação a hGH foi modificado com PEG do mesmo modo para dar um derivado de 150 Kd por filtração em gel. 2. Adição de’ PEG com N-rtiidroxissuccinimidilo PEG(NHS-PEG) e purificação A uma solução contendo 2 mg/ml de hGH em 50 mM de tampão Na-borato a pH 8,5 ou PBS a pH 7, NHS-PEG foi adicionado a um excesso molar de 5 vezes da concentração total de lisina de hGH e misturado à temperatura ambiente durante uma hora. Os produtos foram separados em coluna de fraccionamento por tamanho de Superose 12 ou Mono Q de FPLC. hGH com PEG varia de tamanho dependendo do pH da reacção entre aproximadãmente 250 Kd para a reacção que decorreu a pH 8,5 e 40 Kd para pH 7,0 conforme medido por filtração em gel. O complexo de hGH-proteína de ligação a hGH foi também modificado com PEG da mesma forma resultando num peso molecular de 400 a 600 Kd da filtração em gel. 3. Adição de PEG aos mutantes clsteina de hGH com PEG-maleimida

Um único mutante císteina de hGH foi feito por mutagé-nese dirigida, secretado pela estirpe de E. coli 16C9 e purificado numa coluna de permuta aniónica. Fez-se PEG-maleimida por reacção de monometoxi-PEG amina com sulfo-MBs em Na-fosfato 0,1M pH 7,5 durante uma hora à temperatura ambiente e o tampão mudado para tampão fosfato pH 6,2. Em seguida hGH eis livre extra foi misturado durante uma hora e a mistura final foi separada numa coluna Mono Q como em hGH com Me-PEG aldeído.

4. Caracterização de hGH com PEG ou complexo hGH-proteína de ligação a hGH O produto hGH foi caracterizado por SDS-PAGE, filtração em gel, NMR, mapeamento tríptico, LC-cromatografia de massa e ensaio biológico in vitro. 0 grau de acoplagem de PEG foi primeiro mostrado por SDS-PAGE e filtração em gel e depois analisado por NMR, a qual tem um pico de absorção específico para o hidrogénio do PEG e o número de grupos PEG em cada molécula pode ser calculado. A electroforese em gel de poliacrilamida em .10% de SDSfoi corrida em condições redutoras e a filtração em gel foi realizada em Superose 12 com PBS ou 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl como tampão de eluição. Para demonstrar qual o resíduo a que foi adicionado PEG, realizou-se o mapeamento tríptico. hGH com PEG foi digerido com tripsina numa proporção de proteína/enzima de 100 para 1 numa base de mg a 37°C durante 4 horas em acetato de sódio 100 mM, 10 mM Tris-HCl, 1 mM cloreto de cálcio, pH 8,3 e acidificado para pH<4 para parar a digestão antes da separação por HPLC Nucleosil C-18 (4,6 mm x 150 mm, 5u, 100A) e o cromato-grama foi comparado com o do material de partida sem PEG. Cada um dos picos pode então ser analisado por espectrometria de massa para verificar o tamanho do fragmento no pico. Encontrámos que os fragmento(s) portadores do grupo PEG geralmente não são retidos numa coluna de HPLC após injecção e desaparecem do cromatografo. Tal desaparecimento do cromatografo é uma indicação da adição de PEG àquele fragmento particular que deverá conter pelo menos um resíduo lisina. hGH com PEG foi testado quanto à sua capacidade para se ligar à proteína de ligação a hGH (hGHBP) e esta ligação foi comparada com a ligação de hGHBP sem PEG como descrito (REF) como um ensaio biológico in vitro.

Adição de PEG a hGH

Os vários métodos de adição de PEG usados produzem principalmente três tipos de hGH tipo selvagem com PEG com peso molecular de 30 K, 40K e 100K em SDS-PAGE redutora. Se bem que na cromatografia de exclusão por tamanho, o correspondente peso molecular destas três hGH com PEG seja de 35K, 51K e 250K que deverá estar perto do seu volume hidrodinâmico nativo. Estas foram designadas PEG-hGH-1, 2 e 3. Dos resultados do mapeamento tríptico o PEG-hGH-1 e 2 não têm ambos o fragmento de 9 aminoãci-dos N-terminal a partir do cromatograma e possivelmente com PEG, o qual poderá ser confirmado pela espectrometria de massa das espécies de alto peso molecular encontradas no volume de exclusão de LG. A partir do peso molecular em SDS-PAGE, PEG-hGH-1 pode ter um PEG na amina N-terminal e PEG-hGH-2 pode ter dois PEG na amina N-terminal, formando uma amida terciária. O PEG-hGH-3 tinha cerca de 5 grupos PEG por molécula baseado no resultado de NMR e no mapa tríptico, pelo menos 5 fragmentos peptídicos faltam, 39

significando que tinham PEG. Os sítios para ácfição de grupos PEG a hGH eram Met N-terminal, K38, K41, K70, K140, K145, K158 e K168. Duas lisinas (K) que pareceram não ter PEG eram K115 e K172. Se bem que as três hGH com PEG apresentem menor afinidade de ligação para aproteina de ligaçaõ a hGH nos ensaios de ligação in vitro em 2-3 vezes, os estudos de aumento de peso em ratos .surpreendentemente mostraram que são todas moléculas mais potentes do que o tipo Selvagem em pelo menos três vezes, o que é devido aparentemente a uma maior semi-vida no soro de GH. Fizemos dois tipos de complexo hGH com PEG-protelna de ligação a hGH com 2 ou 19 PEG por molécula de hGHBP e ambos apresentaram maior potência num ensaio de aumento de peso em ratos do que a hGH por si só, mas não significativamente superior ao complexo sem PEG. Esta ausência de um aumento da actividade de PEG-hGH relativamente ao complexo hGH-hGHBP pode ser devido ao próprio complexo ter um peso molecular bastante elevado acima do tamanho de exclusão da filtração do rim (70K) como descrito (Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem. 263. 15064-15070, 1988).

Para as várias finalidades deste invento, a GH ou GH mais IGF-I é administrada directamente ao mamífero ou ave por qualquer técnica adequada, incluindo parenteralmente e pode ser administrado local ou sistémicamente. A via de administração específica dependerá e.g. da história médica do doente, incluindo qualquer quaisquer efeitos .secundários observados ou antecipados usando IGF-I. Exemplos de administração parenteral incluem administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arte-rial e intraperitoneal. A administração de GH ou de GH mais IGF-I é por infusão contínua (usando, e.g. minibombas tais como bombas osmóticas ou bombas de insulina) ou por injecção usando, e.g., as vias intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Preferencialmente, · a - 40 -

administração é subcutânea para GH ou GH mais IGF-I. A administração pode também ser como um só bolus ou por formulação num depósito de libertação lenta. Mais preferencialmente, a GH ou GH mais IGF-I é administrada continuamente por infusão ou por bolus para as formulações que possuem uma semi-vida no plasma longa.

Em adição, a GH ou GH mais IGF-I é adequadamente administrada juntamente com uma ou mais das suas proteínas de ligação. Usada com IGF-I por exemplo, IGFBP-2, IGF-BP-4 ou mais preferencialmente, IGFBP-3, que está descrito em WO 89/09268pu-blicada em 5 de Outubro, 1989 e por Martin e Baxter, J. Biol. Chem.. 261: 8754-8760 (1986). Esta proteína glicosilada é um componente estável aos ácidos de cerca de 53 Kd num gel de SDS-PAGE não redutor de um complexo de glicoproteína de 125-150 Kd encontrada no plasma humano portador da maior parte da IGFs endógena e é também regulada, por GH. A IGF-I é também adequadamente acoplada a um receptor ou anticorpo ou fragmento de anticorpo para administração.

As composições de GH ou GH mais IGF-I a serem usadas na terapia serão formulados e doseados de forma consistentes tendo em conta o estado clínico do doente individual (especialmente os efeitos secundários do tratamento com GH ou GH mais IIGF-I), o local de libertação da composição de IGF-I, o método de administração, o calendário da adipinistração e outros factores conhecidos. A "quantidade eficaz" de IGF-I para os presentes fins (incluindo uma quantidade eficaz na estimulação imune) é pois I determinada por tais considerações.

Como proposição geral a quantidade total farmaceutica-mente eficaz da IGF-I administrada parenteralmente por dose será na gama de cerca de lMg/Kg/dia a 10 mg/Kg/dia de peso de corpo do doente, se bem que como referido atrás isto será sujeito a 41

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discreção terapêutica. Mais preferencialmen1:ê'T'· 'esta dose é pelo menos 0,01 mg/Kg/dia e mais preferencialmente para humanos entre cerca de 0,01 e 1 mg/Kg/dia para a hormona. Se dada continuamen-te, a IGF-I é tipicamente administrada numa dose de cerca de ^g/Kg/hora e cerca de 50μg/Kg/hora, quer por 1-4 injecções por dia quer por infusões subcutâneas continuas, por exemplo usando .uma mini-bomba. Pode também ser empregue uma solução intravenosa em saco. O factor chave na selecção de uma dose adequada é o resultado obtido, conforme medido por aumentos na produção de anticorpos, aumentos no número de esplenócitos e de timõcitos, aumentos nas células B do baço, etc. O tratamento com IGF-I para afectar o sistema imune parece ser óptimo se continuado durante mais tempo do que um certo número mínimo de dias, 7 dias no caso de murganhos. A duração do tratamento necessário para observar alterações e o intervalo após o tratamento para que as respostas ocorram parece variar dependendo do efeito pretendido. A IGF-I é também adequadamente administrada por sistemas de libertação controlada. Exemplos adequados de composições de libertação controlada incluem matrizes de polímeros semiper-meáveis em formas várias, e.g. filmes ou microcápsulas. As matrizes de libertação controlada incluem polilactidos (Pat. U.S. NS 3773919, EP 58481) copolimeros de ácido L-glutâmico e gama--etil-L-glutamato (U. Sidman et al.. Biopolvmers, 22. 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (R. Langer et al.. J. Biomed. Mater. Res.f 15: 167-277 (1981) e R. Langer, Chem. Tech.. 12: 98-105 (1982)), etilenovinilacetato (R. Langer et al.. Id)ou poli—D—(—)—3—hidroxibutirico (EP 183,988). Composições de IGF-I de libertação controlada também incluem IGF-I encapsulada em lipossomas. Lipossomas contendo IGF-I são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad.

Natl.

Proc. . .'Λ ^

Sei. U.S.A.. 82; 3688-3692 (1985); Hwang et ài..

Acad. Sei. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641: Péd. de Pat. Japonesa 83-118008; Pat U.S. N24485045 e 4544545; e EP 102324. Normalmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequenos (cerca de 200-800 Angstroms) em que o conteúdo lipídico é superior a cerca de 30 moles por cento .de colesterol, a proporção seleccionada sendo ajustada à terapia de IGF-I óptima.

Para a administração parenteral, numa realização, a GH ou GH mais IGF-I é formulada geralmente misturando-o no grau de pureza pretendido, numa forma de unidade de dosagem injectável (solução, suspensão ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável, i.e., um que não seja tóxico para os recipientes nas dosagens e concentrações empregues e é compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação preferencialmente não inclui agentes de oxidação e outros compostos que são conhecidos como sendo prejudiciais para os polipeptídeos.

De uma forma geral, as formulações são preparadas por contacto de GH ou GH mais IGF-I uniformemente e intimamente com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos. Em seguida, se necessário, o produto é moldado na formulação pretendida. Preferencialmente o veículo é um veículo parenteral, mais preferencialmente uma solução que é isotõnica com o sangue do recipiente. Exemplos de tais veículos incluem água, soro fisiológico, solução de Ringer e solução de dextrose. Os veículos não aquosos tais como óleos fixados e oleato de etilo são também úteis aqui, assim como lipossomas. O veículo adequadamente contem quantidades pequenas de aditivos como sejam substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química. Tais materiais não são tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgâncios ou seus sais; antioxidantes tais como ácido ascórbico; polipeptídeos de peso molecular baixo (menos de cerca de dez resíduos), e.g., poliarginina ou tripeptídeos; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobuli-.nas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros açúcares incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes de quelatação tais como EDTA; alcoóis de açúcares tais como manitol ou sorbitol; contraiões tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos tais como polissorbatos, poloxameros ou PEG. A GH ou GH mais IGF-I é tipicamente formulado em tais veículos numa concentração de cerca de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferencialmente 1-10 mg/ml a um pH entre cerca de 3 e 8. GH é geralmente estável a um pH de 6,5 a 8, mais preferencialmente 7,2 a 7,8. IGF-I de tamnho completo é geralmente estável a cerca de 3,2 a 5. Será entendido que a utilização de certos excipientes, veículos ou estabilizadores referidos atrás resultará na formação de sais de IGF-I.

Em adição,a IGF-I, preferencialmente a IGF-I de tamanho completo, é adequadamente formulada num veículo adequado para formar uma composição farmacêutica que não contenha células. Numa realização, o tampão usado na formulação dependerá da composição ser empregue imediatamente após a mistura ou guardada para usar mais tarde. Se empregue imediatamente, a IGF-I de tamanho completo pode ser formulada em manitol, glicina e fosfato, pH 7,4. Se esta mistura for guardada, ela é formulada num tampão a um pH de aproximadamente 6, como seja citrato, com um tensioactivo que aumente a solubilidade da GH neste pH, como sejà' 0,1% de polis-sorbato 20 ou poloxamero 188. A preparação final pode ser um líquido estável ou sólido liofilizado. GH ou GH mais IGF-I a serem usados para administração terapêutica deve estar estéril. A esterilidade é facilmente .conseguida por filtração através de membranas de filtração estéreis (e.g., membranas de 0,2 microns). As composições terapêuticas de IGF-I geralmente são colocadas num recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou ampola tendo uma rolha que pode ser perfurada por uma-agulha de injecção hipodérmica. GH ou GH mais IGF-I ou IGF-I sozinha será guardada em recipientes de dosagem unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas seladas ou frascos, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada frascos de 10 mlsão cheios com 5 ml de solução de IGF-I aquosa a 1% (p/v) e a mistura resultante é liofilizada. A solução para infusão é preparada por reconstituição da IGF-I liofilizada usando água para injecção bacteriostá-tica.

Deve-se notar que hGH é estável a um pH mais alto do que IGF-I, e.g., 7,4-7,8. Quando GH é administrado, ele é adequadamente administrado juntamente com uma ou mais das suas proteínas de ligação. Uma dessas proteínas bem caracterizadas é a proteína de ligação â hormona de crescimento de alta afinidade (GHBP) constituindo o domínio extracelular do receptor GH que circula no sangue e funciona como uma GHPBP em várias espécies [Ymer e Herington, Mol. Cell. Endocrino., 41: 153 (1985); Smith e Talamantes, Endocrinoloqy, 123; 1489-1494 (1988); Emtner e Roos, Acta Endocrinolooica Cooenh.') 122:296-302 (1990)] incluindo o homem (Bauman et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 62: 134-141 (1986); EP 366710 publicada em 9 de Maio 1990; Herington et al. J. Clin. Invest.. 77: 1817-1823 (1986); Leung et al.. Nature. 330: 537-543 (1987)). Também foi descrita uma segunda BP com menos afinidade para GH que parece não estar estruturalmente relacionada com o receptor de GH (Baumann e Shaw, J. Clin. .Endocrinol. Metab. , 7.0:686 (1990)),

As doses de GH e de IGF-I podem ser inferiores se usados em conjunto em vez de IGF-I ser administrado sozinho. Deve-se notar que a‘ determinação das doses de IGF-I e de GH deverá ter em conta os efeitos secundários do tratamento com estas hormonas. Para hGH os efeitos secundários incluem retenção de sódio e expansão do volume extracelular [Ikkos et al.. Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 (1959); Biglieri et al. J.

Clin. Endocrinol. Metab.. 21: 361-370 (1961)], assim como hiper- insulinémia e hiperglicémia. O principal efeito secundário aparente de IGF-I é hipoglicémia (Guler et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989, supra).

Preferencialmente, a GH e/ou IGF-I administrada conjuntamente com (i.e., antes, ao mesmo tempo ou após) uma vacina (por exemplo, uma vacina de gpl20 ou gpl60 ou uma mistura de vacinas baseadas no receptor de gp), quer durante a imunização inicial quer durante um reforço da. vacina,, para assegurar um aumento da resposta de anticorpos. Mais preferencialmente, GH sozinha ou com IGF-I é dado na altura do reforço. A utilização de GH sozinha ou com IGF-I e com vacina aumentará a eficácia da vacina, particularmente nos doentes com sistemas imunes comprometidos. GH, GH mais IGF-I ou IGF-I podem ser usados terapeutica-mente para estimular o sistema imune, particularmente a fraeção linfocitária do sistema imune após terapia 46

imunossupressiva/citotóxica associada a transplante, terapia do cancro e tratamento de doenças auto-imunes. Estes compostos foram usados para restaurar o braço linfocitário do sistema imune de forma análoga àquela que é usada para G-CSF para restaurar o braço fagocitário do sistema imune.

Os corticosteróides conduzem a um aumento marcado na propensão para infecções por fungos e vírus. GH, GH mais IGF-I, IGF-I sozinha poderão ser usados para diminuir esta maior propensão a infecções. Ainda, estes compostos poderão ser usados para melhorar o tratamento de outras doenças virais crónicas tais como hepatite crónica, citomegalovírus, miocardite e encefalite.

Numa outra realização deste invento para diagnosticar mamíferos imunodeficientes para determinar se eles possuem níveis baixos de GH ou IGF-I no soro que poderá causar a sua doença e que poderá ser revertido por tratamento com GH ou GH mais IGF-I. Tais doentes humanos podem incluir os idosos, subalimentados ou doentes. 0 diagnóstico do nível de GH ou IGF-I no soro de tais doentes imunodeficientes e a restauração das concentrações sanguíneas de GH ou IGF-I nos doentes com níveis séricos de GH ou IGF-I mais baixos do que o normal por administração de uma quantidade de GH ou GH mais IGF-I eficaz par-a aquele fim restaurará a imunidade no doente. Métodos para a O diagnóstico dos níveis de GH e IGF-I num doente pode ser conseguido por qualquer técnica convencional, mas é tipicamente feita sujeitando uma amostra de sangue a um teste de ELISA ou RIA usando anticorpos anti-IGF-I como é descrito em Furlanetto et al.. J. Clin. Invest.. 60: 648-657 (1977); Bala e Bhaumick, J. Clin. Endocrin. and Metabol.. 49: 770-777 (1979) ; e Zapf et al.. J. Clin. Invest.. 68: 1321-1330 (1981) . 47

determinação precisa da presença de GH e GHBP estão descritas em 07/615538, entregue em 19 de Novembro 1990. O invento será melhor compreendido por referência aos exemplos que se seguem. No entanto, eles não devem ser pensados como limitantes do âmbito do invento. ---/ EXEMPLO 1

ESTIMULAÇÃO COM HORMONA DE CRESCIMENTO DE TECIDOS QUE LHE RESPONDEM

A. Aumento de peso de orgãos comparando a irneccão continua de hGH Vs bolus de hGH

Em duas séries de experiências, foi demonstrada a resposta do baço e do timo a hGH contínua.

Numa primeira série de experiências usámos diferentes estratégias para libertar GH numa forma que provoca a exposição quase contínua a GH. No primeiro estudo demos hGH exógeno por injecção ou por minibomba osmótica. Neste estudo o efeito das injecções e infusões de hGH foram comparados directamente em ratos hipofissectomizados (85-105 g). Os ratos foram anestesiados e implantadas duas minibombas subcutâneas libertando hGH ou excipiente. Os ratos também receberam diariamente injecções subcutâneas de hGH ou excipiente. Formaram-se os seguintes grupos (n=5 por grupo): 1-4 receberam excioiente por inieccaò ' 1) hGH 5,0 mg/Kg/dia por bomba 2) hGH 1,0 mg/Kg/dia por bomba 3) hGH 0,2 mg/Kg/dia por bomba 4) hGH 0,04 mg/Kg/dia por bomba 5-9 receberam excioiente por Minibomba 5) hGH 25,0 mg/Kg/dia por injecção 6) hGH 5,0 mg/Kg/dia por injecção 7) hGH 1,0 mg/Kg/dia por injecção 8) hGH 0,2 mg/Kg/dia por injecção 9) hGH 0,04 mg/Kg/dia por injecção 10) Ratos testemunha tratados com excipiente (injecções e bombas de excipientes).

Encontrámos que GH administrado por minibomba induziu um aumento de peso muito maior e respostas de crescimento ligadas do que as mesmas doses de hGH dado por injecção. Por exemplo, o aumento de peso a 5,0 mg/Kg/dia de hGH por injecção foi de 19,5±1,7 g, comparado com 32,5±1,8 g por minibomba, quase duplica a resposta. Em adição, as infusões de hGH foram muito mais potentes na estimulação do crescimento do baço. Parece pela Tabela I que hGH é quase 5 vezes mais potente na estimulação do crescimento do baço quando é libertada por uma minibomba. Estes resultados mostram que a capacidade de hGH para estimular os tecidos imunes é ajudada pela libertação de hGH de forma contínua. V \ 50

Aumento de peso e peso do baço após administração de hGH por injecção ou minibomba 1----- |Grupo 1 |Aumento de |Injecção peso | Aumento de peso Bomba i- | Baço |Injecção 1 1 1 | Baço [ | Bomba | 1 1 |Excipi- 1- 1 I 1 —I I I | ente | 1,9±2,3 I | 203137 I I |hGH 0.04 i--- 1 10,412,4 1 10,612,1 -|- | 226118 I 1-1 I I I I |hGH 0.20 Ί 1 13,612,5 I 16,812,3 1 I 224141 1 I264133* | 1 1 |hGH 1.0 i | 16,913,1 1 24,812,4*** 1 | 264143 1 i-1 |320i32**| 1 1 |hGH 5.0 i- | 19,511,7 1 32,511,8*** 1- |· 299122 1 i-1 |382137**| 1 1 |hGH 25.0 Ί- | 29,812,1 1 i- | 389134 J_ i-1 1 1 1 1 Comparado com a mesma dose libertada por injecção *p<0, 1;**p<0,01 ***P<0,001

Nesta segunda série de experiências foi demonstrada a capacidade de uma infusão contínua de hGH de hGH sozinha ou de hGH+hGHBP por minibombas para estimular o crescimento do timo relativamente a outros orgãos. As injecções tipo bolus de hGH ou hGH+hGHBP não resultaram em qualquer preferência diferencial para o crescimento do timo. 35 ratos fêmea hipox (adquiridos à Tatonic, Germantown, New York) de 85-105 g, foram pesados 4 vezes durante 10 dias para 51

estabelecer a estase de crescimento (aumento de- peso ou perda de menos de 7 gramas). Eles comeram dieta de laboratório em pastilhas e beberam água à vontade. Foram agrupados em gaiolas (5/gaiola) numa sala com luz e temperatura controlada. Foram então divididos ao acaso em 5 grupos de 7 ratos baseado no seu peso de corpo inicial. Os ratos foram então tratados subcutanea-mente durante 7 dias com: 1) Bombas de excipiente implantada e injecções de excipiente 2) Injecções diárias de rhGH (0,1 mg/Kg/dia) 3) 2) atrás mais GHBP (1,55 mg/Kg/dia) por minibomba 4) Infusões continuas de rhGH por minibomba osmótica 5) 4) atrás mais GHBP (1,55 mg/Kg/dia) por minibomba. A hGH usada foi rhGH (Nutropin, Lote N9267AX, G042A) dissolvida em água estéril. A GHBP (1-238) usada foi expressa em E. coli e dissolvida no excipiente de rhGH. As minibombas de excipiente e as injecções de excipiente ambas continham o excipiente rhGH. Todas as injecções (0,1 ml) foram dadas subcutanea-mente na base do pescoço. As minibombas usadas foram adquiridas à Alza (minibombas Alzet, Modelo 2001, velocidade da bomba 1,03 μΐ/h) e foram implantados s.c. nas costas sob anestesia de cetamina/xilazina. Os ratos foram sacrificados após 7 dias (7 injecções) e os orgãos colhidos. As médias dos grupos foram comparadas por ANOVA seguido do teste de Duncan. Estão apresentadas as médias e desvios padrões. GH induziu aumento de peso nos 4 grupos que receberam GH, mas a resposta de aumento de peso de todo o corpo a GH não foi diferente entre os 4 grupos, todos os grupos ganhando cerca de 12 gramas. Os aumentos de peso foram pequenos mas estatisticamente significativos no fígado e rim, mas quando o peso destes orgãos foi corrigido ou normalizado relativamente ao peso do corpo não mostraram um aumento relativo de tamanho (de facto o fígado mostrou um decréscimo estatisticamente significativo no peso relativo).

Portanto, os 4 grupos tratados com GH tinham todos aumentos de peso semelhantes e não houve sobre crescimento do fígado, baço ou rim. Em contraste marcado o timo apresentou uma resposta grande de crescimento absoluto e relativo, mas apenas com GH contínua (Tabela II).

Tabela II

Aumentos de Peso e Pesos de Órgãos em Ratos Hipox 1 |Grupo i i r |Aumento |Fígado| |de peso(g)| (g) | J_1_L Fígado peso 1 Rim (mg) -Γ Rim [ %peso| Timo (mg) Timo %peso |1) Exci- 1 I 2,0 1 1 14,33 I 4,13 707 0,67 | — 288 0,276 |piente 1-2,3 _J_ I±0,3 5 | _J_L ±0,30 ±24 ±0,03| ±31 ±0,032 | 2) GH I 114,6 1 1 14,75 | 4,04 7 66 0,65 | 328 0,279 |Injecção 1-2,3 _J_ |±0,29 | ±0,24 ±59 ±0,04| ±33 ±0,027 | 3) 2) 1 | 12,7 1 1 |4,65 | 4,00 796 0,68 | 330 0,284 |+ GHBP | ±2,4 _|_ 1+0,09 I ±0,11 ±56 ±0,04I ±46 ±0,040 1 4) GH 1 114,6 1 1 I4,64 1 3,94 774 0,66 | 401** 0,340** |Infusão |±1,5 I |±0,40 I ......1 I ±0,32 ±0,4 ±0,03| ±67 ±0,055 I 5) 4) 1 | 14,8 1 1 14,73 I 3,97 776 0,65 [ 419*** 0,352** |+GHBP 1_ |-2,2 1 |±0,16 I 1 1 ±0,18 ±62 _ ±0,05| _L ±45 1 ±0,041

Durante um período de 7 dias a resposta de crescimento do timo a hGH contínua não, pareceu ser alterada pela infusão da hGHBP e a ausência de resposta a injecções contínuas de hGH não foi melhorada pela infusão contínua de hGHBP. Com base nestes resultados concluimos o seguinte: 1) Durante um período de 7 dias a pequena dose de hGH (0,1 mg/Kg/dia) restaurou a velocidade de crescimento para cerca de um terço do normal. Nesta dose não houve efeito do padrão de administração de GH no crescimento global do corpo (aumento de peso) e não foi afectado de forma marcada o crescimento dos "orgãos que respondem a GH", o baço, 54

rim ou fígado; 2) No entanto, o peso médio do timo aumentou em 45% após GH contínua, mas apenas em 14% (uma quantidade estatisticamente não significativa) após a mesma dose de GH dada por injecção.

Assim, é claro que nesta dose de hGH (0,1 mg/Kg/dia) a administração contínua e a injecção diária têm efeitos iguais no aumento global do corpo. Pelo contrário, o timo apresenta uma resposta de crescimento forte apenas a um modo contínuo de libertação de GH.

Na Figura IA e 1B estão apresentados o peso do baço em ratos que receberam.hGH ou hGH mais GHBP durante 7 dias. Nesta série de experiências mediu-se o crescimento do baço durante 7 dias em ratos anões (dw/dw) para hGH sozinha em 5 doese (32, 8, 4, 2, 0,5 & 0,125 mg/Kg/dia) ou hGH em 4 doses (8, 4, 2, 0,5 & 0. 125 mg/Kg/dia) mais.GHBP (a 2x as doses de GH numa base de peso

O 1. e. 16, 8, 4, 1, 0,5 mg/Kg/dia de GHBP). O baço mostra uma forte resposta de crescimento a GH+GHBP com a resposta a GH e GH+GHBP não sendo paralela. A dose elevada de complexo induziu um sobre-crescimento do baço, em 7 dias o baço cresceu entre 300 e 900 mg, os baços em ratos de 150g não deficientes em GH tinham em média 500 mg. A resposta máxima a GH mais GHBP foi superior a GH sozinha. Como a resposta máxima foi diferente e as curvas não são paralelas um cálculo exactç da potência não pode ser obtido. Mas 2 mg/Kg/dia de GH+GHBP deram respostas de crescimento equivalentes a 32 mg/Kg/dia de GH sozinha, sugerindo uma diferença de potência de 16 vezes. 0 não paralelismo sugere que a resposta a GH+GHBP é qualitativamente diferente da de GH sozinha e que a diferença poderá ser devida a GHBP dando uma exposição mais contínua a GH e uma maior resposta. Claramente a velocidade do aumento de peso para hGH mais GHBP é substancialmente superior. 55

Este maior aumento do peso do baço está também representado como percentagem do peso total do corpo (figura 1B). B. Dose Resposta 55 ratos fêmea hipox (adquiridos à Taconic, Germantown, New York) de 85-105 g, foram pesados 4 vezes durante 10 dias para estabelecer a estase do crescimento (aumento ou perda de peso de menos de 7 gramas). Eles comeram dieta de laboratório e beberam água à descrição. Eles foram agrupados em gaiolas (5/gaiola) numa sala com luz e temperatura controladas. Eles foram então agrupados ao acaso em ll grupos de 5 ratos por grupo baseado no peso inicial do seu corpo. Os ratos foram então tratados durante 7 dias com: 1) Injecções s.c. diárias de met-hGH (0,033, 0,1 e 0,3 mg/kg/dia) 2) Injecções s.c. diárias de peg-1 (0,033, 0,1 e 0,3 mg/Kg/dia) 3) Injecções s.'c. diárias de peg-2 (0,033, 0,1 e 0,3 mg/Kg/dia) 4) Excipiente. A hGH usada foi met-hGH (Protropin) dissolvido em água estéril. As injecções de excipiente continham o excipiente de rhGH. Todas as injecções (0,1 ml) foram dadas subcutaneamente na base do pescoço. Os ratos foram mortos após 7 dias (7 injecções) e colhidos os orgãos. As médias dos grupos foram comparadas por ANOVA seguido de teste de Duncan. Estão apresentadas as médias e desvios padrões. hGH induziu aumento de peso em todos os grupos que receberam GH, mas a resposta de aumento global do peso do corpo a ambas as formas de peg-GH mostrou grosso modo um aumento de 3 vezes na potência, dando um grande aumento (24 g) nos grupos de dose elevada de PEG.Com aumentos de peso semelhantes os grupos de PEG-hGH apresentaram sobrecrescimento relativo do timo. Apenas os .grupos tratados com PEG apresentaram sobrecrescimento relativo dos orgãos e os únicos orgãos que apresentaram crescimento relativo estatisticamente significativo comparado com testemunhas injectadas com excipiente foram o baço e o timo. As curvas de dose resposta apresentadas na figura 2 ilustram a natureza não paralela desta resposta (não paralela comparado com o tratamento com hGH).

Portanto, com aumentos de peso semelhantes as moléculas de PEG-hGH de longa actuação preferencialmente afectam o crescimento do timo. Esta grande resposta de crescimento absoluta e relativa pode ser devida à met-hGH libertada por injecções 'ser eliminada rapidamente do corpo enquanto as moléculas de PEG-hGH são eliminadas apenas lentamente e conduz a uma exposição contínua relativa de GH. Portanto estas observações apoiam as nossas observações anteriores, comparando minibombas e injecções de hGH, de que um padrão de exposição a GH é o meio preferido de libertação de hGH para afectar os componentes do sistema imune. 0 tratamento com Peg-5 hGH durante 16 dias resultou num aumento de peso em ratos hipofissectomizados. A mesma dose total de hGH ou de peg-hGH foi dada com intervalos de 1, 3 ou 6 dias. A maior resposta de crescimento foi conseguida com peg-hGH dado com intervalos de 6 dias, a maior resposta a seguir foi com peg-hGH dado com intervalos de 3 dias, seguido da injecção diária com peg-GH. Para hGH com um decréscimo da frequência das injecções a resposta de crescimento diminuiu em vez de aumentar. A injecção

- 57 - ' 3. s $ diária de hGH foi superior às injecções com intervalos de 3 dias seguido de injecções com intervalos de 6 dias. Esta maior eficácia inesperada de peg-hGH dada em injecções pouco frequentes foi inesperada uma vez que para uma molécula com uma semi-vida prolongada seria de esperar que as injecções diárias ou contínuas dessem um padrão óptimo de libertação.

C. Frequência de Administração de hGH 42 ratos fêmea hipox (Adquiridos à Taconic, Germantown, , New York) de 85-105 g, foram pesados 4 vezes durante 10 dias para estabelecer o extase de crescimento (aumento ou perda de peso inferior a 7 gramas). Eles comeram dieta de laboratório e beberam água â descrição. Eles foram agrupados em gaiolas (5/gaiola) numa sala com luz e temperaturas controladas. Foram então agrupados ao caso em 7 grupos de 6 ratos por grupo baseado no seu peso inicial do corpo. Os ratos foram então tratados durante 24 dias com: 1) Uma injecção s.c. de met-hGH (0,1 mg/Kg/dia) diariamente (10 jug/injecção) 2) Uma injecção s.c. de met-hGH (0,1 mg/Kg/dia) com intervalos de 3 dias (30 μg/injecção) 3) Uma injecção .s.c. de met-hGH (0,1 mg/Kg/dia) com intervalos de 6 dias (60 Mg/injecção) 4) Uma injecção s.c. de peg-5hGH (0,1 mg/Kg/dia) diariamente (10 μg/injecção) 5) Uma injecção s.c. de peg-5 hGH (0,1 mg/Kg/dia) com intervalos de 3 dias (30 μg/injecção) - 58 -

-V - 6) Uma injecção s. c. de peg-5 hGH (0,1 mg/Kg/dia) com intervalos de 6 dias (60 μg/injecção) 7) Injecções s.c. diárias de excipiente. A hGH usada foi met-hGH (Protropin) dissolvida em água .estéril. As injecções de excipiente continham o excipiente de rhGH. Todas as injecções (0,1 ml) foram dadas subcutaneamente na base do pescoço. Nos dias em que não foram dadas as injecções de GH (nos grupos 2, 3, 5 & 6) foram dadas injecções de soro fisiológico. Os ratos foram mortos após 24 dias e colhidos os orgãos. As médias dos grupos foram comparados por ANOVA seguido do teste de Duncan. Estão apresentados as médias e os desvios padrões. GH induziu aumento de peso em todos os grupos que receberam GH, mas a resposta de aumento de peso global do corpo a peg-GH foi grandemente aumentada, particularmente quando dada como injecções pouco frequentes e especialmente quando dado com intervalos de 6 dias. Em contraste marcado, a resposta de crescimento global do corpo a hGH diminuiu com injecções menos frequentes. w

Com aumentos de peso semelhantes os grupos de PEG-hGH apresentaram sobrecrescimento relativo do timo. Apesar de causar o aumento de peso de corpo.mostrado na Figura 3, as injecções de hGH a 0,1 mg/Kg/dia não aumentaram significativamente o tamanho absoluto ou relativo do timo. PEG-5hGH aumentou o tamanho absoluto do timo (em cerca de 100% quando dado com intervalos de 6 dias) e também aumentou o tamanho relativo do timo. Assim, a estimulação máxima do timo ocorreu com PEG-5 hGH administrado com intervalos de 6 d-ias. 59

Os resultados resumidos na Figura 4 indicam que 0,1 mg/Kg/dia de hGH libertado como injecção s.c, diária tem pouco efeito no timo, no entanto ele promove o crescimento global do corpo. A maior actividade de PEG-5 hGH foi confirmada neste tf estudo. Seria díficil usando tecnologia corrente, libertar de rotina hGH como infusão contínua. PEG-5 hGH dá ao método do ^ presente invento uma forma prática de libertar GH (injecções subcutâneas) de forma a o timo responder como no caso de injeção contínua, ainda que o "padrão contínuo" possa ser dado como injecções pouco frequentes. Esta abordagem obviamente dá ao método de administração do presente invento um meio rápido e eficaz de ser posto em prática para terapia. D. Resposta a PEG-hGH sem Met 48 ratos fêmea hipox (adquiridos à Taconic, Germantown, New York) de 85-105 g, foram pesados 5 vezes durante 9 dias para estabelecer a extase de crescimento (aumento ou perda de peso inferior a 7 gramas). Eles comeram dieta de laboratório e beberam água à descrição. Foram agrupados em gaiolas (6/gaiola) numa sala de luz e temperatura controladas. Foram então agrupados ao acaso em 8 grupos de 6 ratos baseado no seu peso inicial do corpo. rhGH sem Met (Nutropin) foi modificada com PEG pelo de Abuchowski ey al. (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al., Câncer Biochem. Biophys. 7, 175-186, 1984). Foram testadas quatro formas de PEG-5 rhGH, um conjunto largo assim como 3 conjuntos baseados em exclusões arbitrárias do fraccionamento precoce, médio e tardio por tamanho em coluna de Sepharose. O conjunto de fracções mais largo e os 3 conjuntos foram testados nos ratos durante 11 dias por injecções s.c. de material derivado de 4 lotes de PEG-5 hGH. 60

Cada rato recebeu uma injecção (a 0,1 ou 0,033 mg/Kg/dia) com intervalos de seis dias (60 ou 20 Mg/injecção). Cada rato recebeu portanto apenas 2 injecções. A hGH usada foi rhGH (Nutropin) dissolvida em água estéril. Todas as injecções (0,1 ml) foram dadas subcutaneamente na base do pescoço. Os ratos foram mortos apôs ll dias e colhidos os orgãos. As médias dos .grupos foram comparadas por ANOVA seguido do teste de Duncan. Estão apresentadas as médias e desvios padrões. GH induziu aumento de peso em todos os grupos que receberam GH e a resposta de aumento global do peso do corpo a diferentes formas de PEG-5 rhGH estava relacionada com a dose. Resultados anteriores com PEG-5 met-hGH foram confirmados com rhGH pois foi encontrado que as formas de PEG-5 deram grandes respostas de crescimento quando injectadas com intervalos de seis dias (27 e 18 g para doses altas ou baixas).

J

As respostas do peso do corpo foram semelhantes aos observados nos exemplos anteriores. Quando os pesos do fígado, baço, rim e coração foram expressos relativamente ao peso do corpo não houve efeito relacionado com a dose das formas de PEG-hGH. 0 único peso relativo dos orgãos mostrando uma relação de dose resposta foi o timo. 0 peso absoluto do timo foi grandemente aumentado por PEG-hGH, para o grupo de fracções alargado (equivalente às preparações de PEG-hGH usado nos exemplos anteriores) o peso absoluto do timo foi aumentado para 60 Mg de PEG-5 rhGH para 512183 mg e para 20 M9 deste material para 401±99 mg, com os pesos relativos sendo 0,41+0,05% e 0,3610,08% respectiva-mente.

Portanto, uma resposta de crescimento selectivo específica de orgãos para o timo foi também observada com hGH sem Met e 61

modificada com PEG libertada da forma mostrada nos exemplos atrás para ter uma eficácia óptima.

W

EXEMPLO II

Avaliação do Peso dos Órgãos, Número de Células B e T e Resposta à Estimulação Mitogénica com IGF-I IGF-I recombinante humana .[adquirida à KabiGen AB, Stockholm, Sweden (aetividade específica > 14000 U/mg por ensaio de radio-receptores usando membranas de placenta) ou disponível para investigações clínicas na Genentech, Inc., South San Francisco] foi empregue em todas as experiências com IGF-I detalhadas nos exemplos. A IGF-I foi dissolvida a 5 mg/ml em tampão citrato 10 mM e 126 mM NaCl, pH 6,0.

Esta IGF-I foi administrada a três espécies, i.e., rato, coelho e murganho, para observar os seus efeitos no peso do baço e do timo. Os estudos de dose resposta foram realizados no murganho e rato e IGF-I foi dada ao coelho com efeitos semelhantes. Em adição, os números das células B e T e as respostas à estimulação mitogénica foram avaliados em murganhos. I. Ratos

Dois modelos animais de deficiência em GH e portanto deficiência em IGF-I foram usados para demonstrar o efeito de IGF-I no peso e tamanho do baço e timo. Um terceiro modelo de deficiência em GH e IGF-I é o animal idoso. Ratos idosos (18 mese) foram usados para demonstrar o efeito de IGF-I no tamanho do baço e timo, arquitectura celular e resposta in vitro a mitogénios. Também, ratos adultos ovariectomizados, com concentrações normais de IGF-I no soro, foram usados para demonstrar o efeito de IGF-I no baço e timo num animal que não era deficiente em IGF-I.

Ratos Idosos

Em dois estudos in vitro separados, IGF-I, GH ou IGF-I mais GH foram administrados durante 14 dias a ratos de 18 meses de idade para determinar se IGF-I podia induzir alterações funcionais no baço e timo neste modelo de regressão tímica. (i) Protocolo

Ratos macho Fischer 344 de 18 meses de idade e 400-500 g foram adquiridos à Harlan Sprague Dawley (HSD). Estes ratos foram criados pela HSD para o NIH Institute for Aging e são o modelo de rato convencional usado nos estudos de envelhecimento. Na Experiência Um, foram empregues 7 ratos/grupo e na Experiência Dois, 8 ratos/grupo. Ratos jovens F344 (5-8 semanas de idade) que foram alojados de forma idêntica aos ratos das experiências foram usados como testemunhas positivas. Os grupos de tratamento foram: (1) bombas de excipiente, injecções de excipiente, (2) bombas de IGF-I, injecções de excipiente, (3) bombas de IGF-I, injecções de GH, (4) bombas de excipiente, injecções de GH e (5) ratos jovens. A IGF-I foi aplicada em duas minibombas de forma a ser libertado 1,150 mg/rato/dia de IGF-I ou 0,8 mg/Kg/dia de des-IGF-I sc como infusão contínua. A rhGH (marca Nutropin, Genetech, Inc. formulada a,2 mg/ml em 18 mg/ml de manitol, 0,68 mg/ml de glicina e 5 mM de fosfato, pH 7,4) ou bGH (Monsanto) foi dado na forma de injecção sc diária de 1 mg/rato/dia. Os grupos de bomba de excipiente receberam bombas idênticas cheias com o excipiente para IGF-I (tampão citrato 10 mM e NaCl 126 mM, pH 6,0), daqui em diante designado "excipiente sw IGF-I". Os tratamentos continuaram durante 14 dias. Os animais que não receberam GH foram injectados (0,1 ml) com o veículo de hGH diariamente. 64

„ ^ N ·

Na altura do sacrifício retirou-se uma amostra de sangue e o fígado, rins, coração, baço e timo foram removidos, secos com papel absorvente e pesados imediatamente. 0 baço e o timo foram imediatamente colocados em tampão e então as células foram obtidas por digestão ou ruptura física. As células foram contadas e depois semeadas numa densidade uniforme. As células do .timo foram cultivadas com IL-1 (2U/ml) e fito-hemaglutinina (PHA) (5 μ9/ιη1) e medida a incorporação de timidina como descrito por Maizel et al., J. Exp. Med.. 153: 470-476 (1981). Os baços foram tratados de forma semelhante e reálizados dois testes da função. íii) Resultados fa) Experiência Um IGF-I de tamanho completo e rhGH foram empregues nesta experiência. A Figura 6 mostra o aumento de peso do corpo. Após 14 dias os ratos testemunha não tinham aumentado de peso. Ratos tratados com GH aumentaram 9,6±11,4 g, ratos tratados com IGF-I aumentaram 45,5±9,9 g. A resposta a IGF-I foi claramente grande e a resposta a GH mais IGF-I pareceu ser aditiva. IGF-I nas doses usadas foi marcadamente.anabôlico. Um efeito muito dramático do tratamento com IGF-I foi a grande quebra dos níveis de azoto da ureia do sangue (BUN) de 20,7±2,4 mg/dl em testemunhas para 13,8±1,8 mg/dl após tratamento com IGF-I; hGH não tem efeito.Valores de BUN mais baixos indica um estado metabólico anabôlico. Os resultados de aumento do corpo, os pesos dos orgãos aumentados, os níveis de BUN mais baixos e os níveis de enzimas do sangue mais baixos indicam todos que IGF-I produziu um estado anabôlico onde a síntese proteica predominava relativamente à destruição das proteínas. 0 efeito de IGF-I foi claramente superior ao de hGH.

V

Houve um efeito claro de IGF-I nos pesos de todos os orgãos. 0 fígado aumentou em 6,6%, os rins em 16,6%, o coração em 18,5%, o timo em 27,0% e o baço em 80,8%. Todas as respostas foram estatisticamente significativas. O único efeito de hGH foi reduzir significativamente em 8,8% o peso do fígado. O tratamento combinado de GH e IGF-I não reduziu a grandeza do efeito de IGF-I nestes orgãos com uma excepção. 0 peso do baço foi reduzido para o tratamento com IGF-I mais GH comparado com o peso do baço no grupo de IGF-I sozinho.

Os níveis de IGF-I totais foram aumentados por administração de IGF-I com ou sem tratamento simultâneo com hGH. Por si só, hGH não elevou significativamente os níveis de IGF-I total no sangue.

As células dos orgãos colhidos foram dispersas e a sua resposta a mitogénios foi medida. A Tabela II mostra alguns dos dados para o timo e baço. 0 peso molhado do timo foi aumentado por IGF-I mas não por hGH. como testemunhas positivas usaram-se ratos Fischer, normais, jovens de 60 dias de idade.

J - Λ >

TABELA III 8 7 Número de Células em Baço (xlO ) e Timo(xlO ) τ

O \_y

Grupo Ns de Células do Baço Ne de Células do Timo j Ratos -r Jovens | 1 2,81±0,30 -1- | 4,43±0,79*** 1 |Ratos Γ Idosos | 1 1 |Excipiente | 1_L 2,72±0,68 | 0,19±0,15 I |Ratos r Idosos | 1 1 1IGF-I 1 3,58±0,86 | 0,09±0,66** I |Ratos r Idosos j 1 1 |IGF-1 + GH | I 3,27±1,47 | 0,82·±0,27*** I |Ratos 1 Idosos | 1 | GH 1 1 _L 2,50±0,51 | 0,3 6±0,28* 1

Os valores são médias e desvios padrões. (Significâncias: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs excipiente)

Nenhum dos timos de ratos idosos não tratados deram células suficientes para permitir uma análise completa da cultura de tecidos. Pelo contrário, 8 dos 13 ratos tratados com IGF-I ou IGF-I mais GH deu células de timo viáveis. O tratamento com IGF-I durante 14 dias causou uma aumento marcado de 5 vezes no número de células do timo, se bem que o timo de ratos mais jovens ainda contenham substancialmente mais células. A hormona de crescimento tendeu a aumentar o número de células do timo, mas o efeito (uma duplicação do número médio) foi estastisticamente mais significativo."Peio contrário, o número de células no baço não foi significativamente aumentado por tratamento com IGF-I ou GH, se bem que os valores médios do grupos tratados com IGF-I fosse superior. Portanto, IGF-I puderam aumentar o peso molhado do timo e também o número de células capazes de serem colhidas. Em seguida, qualquer efeito funcional .da massa de tecido aumentada e o número de células foi testado in vitro medindo as respostas dos timócitos a mitogénios, como se mostra na Tabela IV abaixo. 68

TABELA IV Células do timo de ratos F344 tratados tinham todos células os ensaios jovens de timo e idosos. Ratos idosos não insuficientes para realizar 1 |Tratamento I 1 |NS I Células 1 1 PHA I 1 r 1 IL-I | 1 1 PHA + IL- 1 i | 1 1 |Rato j ovem I 1 1 I 4,69 1 | 1764 I 1 1 | 1360 | I I 3349 1 1 I 1 |Rato jovem I 1 1 I 4,80 1 | 1790 I 1 1 | 989 | 3836 1 1 1 jRato jovem 1 1 1 I 3,52 1 1 2112 _]_ 1 1 [1462 | I I 3629 1 1 I 1 |Média 1_ 1 1 _1_ 1 | 18881193 1 1 1 |12701249 | J_L 36041244 1 1 _1 1 1 |Ratos Idosos | 1 1IGF-I I 1 1 1 0,37 1 | 3078 | 1 Γ 1 672 1 1 I 11273 1 1 I 1 |IGF-I I 1 1 I 1,72 1 | 3524 I 1 1 [1028 [ I I 3724 1 1 I 1 |IGF-I I 1 1 I 1,68 1 | 3032 I 1 1 1 854 I I I 6532 1 1 I 1 |IGF-I | 1 1 I 1,20 1 | 1523 _l_ 1 1 1 929 | - 1 1 | 1 |Média 1_ 1 1 _L .... \ 1 27891872 1 8701150 | J__ 1 717613815 1 1 1 1 |Ratos Idosos 1 1_._______ 1 l |IGF-I + GH I_ 1 1 I 0,92 1 | 10436 I 1 |153 6 | 1 1 18990 1 1 I 1 |IGF-I + GH 1 1 1,06 1 | 5120 1 1 | 283 6 | 17446 1 1 1 1 1 | ‘ V ' | | |IGF-I + GH 1 1 I 1,12 1 7432 J_ | 2316 I l |13429 I 1 1 |IGF-I + GH 1 1 0,78 1 | 5095 I 1 | 1796 I | 7865 I 1 1 I |Média Ί— 1 1 | ## Ί I * Ί 1 ## 1 1 1 02012526 1 | 21211576 1 |14432+4966 1 1 I |Ratos Idosos “Ί 1 I | GH 1 1 I 0,72 1 | 2005 I 1 1 581 I 1 | 4371 1 1 I | GH 1 1 I 0,82 1 |11263 I 1 | 1780 I 1 | 27021 I 1 I |Média 1 ........ \ 1 I - 1 1 - 1 1 1 1 I Para as respostas a PHA e IL- •1 e suas combianções, o tecido dos ratos velhos mostrou uma tendência no sentido de uma maior actividade com IGF-I sozinha comparado com o de animais mais jovens, se bem que este efeito não fosse estatisticamente significativo. Não houve efeito aditivo da combinação IGF-I mais GH no número de células colhidas. Foi portanto surpreendente que a combinação de IGF-I mais GH tivesse o efeito maior e mais significativo em todas as medições da função do timo. Comparado com as respostas do tecido mais jovem, a resposta a PHA para IGF-I mais GH foi aumentada 3,7 vezes e para a combinação de PHA mais IL-1 a resposta foi aumentada 4 vezes.

Estes dados mostram que uma maior massa de tecido do timo pode ser produzida num animal idoso usando IGF-I e após o período relativamente curto de apenas 14 dias de tratamento com IGF-I. Existem estudos anteriormente realizados em ratos igualmente idosos que mostram que GH e prolactiria podem aumentar o tamanho e alguns aspectos da função do timo (Kelley, em Psvchoneuroimmunúloqy II. Ed., B. Ader et al., eds., 1990, supra)

Mostrou-se também agora que o aumento de tecido de timo .produzido por IGF-I é tecido funcional, por poder responder a mitogénios. Houve quatro vezes células do timo do que em ratos jovens, mas as células de ratos idosos tratados com IGF-I tinham uma actividade in vitro que foi melhorada 4 vezes. Portanto, de acordo com os testes funcionais usados, o timo de ratos mais velhos foi essencialmente restaurado de acordo com o de um animal mais jovem. No timo o efeito do envelhecimento pareceu ter sido revertido. (b) Experiência Dois

Numa segunda série de ratos de 18 meses, realizou-se uma experiência semelhante, excepto serem empregues bGH e des-IGF-I. Também foi testada a actividade de des-IGF-I e se o efeito relativamnete fraco de hGH no primeiro estudo era devido a anticorpos contra hGH (GH é muito antigénico no rato, bGH é menos).

Os resultados estão apresentados na Tabela V.

TABELA V

Contagens no Sangue: Ratos idosos tratados com des-IGF-1 e GH; cf Ratos jovens

Groupo W3C No. de Linfócitos Hemato- crito No. de RBC MCV No. de Plaquetas Testemunhas idosas 7,35±1,42 4>32r0,75 38,0=1,8 7,59=0/9 50,1=1,1 676=29 bds-IGF-1 8,1200,76 4,23±0,41 37,8=13 7,29=0,38 51,8=0,5 726=59 C bGH 6,97±0j9ô 4,15±0,76 37,4=1,3 7,39=0,32 50,5=0,5 795=46 d destbGH 8,93=1,90 4,80=1,16 37,6=1,2 7,01=3,22 53,9=1,5 763=98 Ratos jovens 8,92=1,24 6,40±0,81 37,5=0,9 6,53±0,14 57,4±1,0 8S7±58

Os aumentos de peso com des-IGF-1 parecem inferiores aos do primeiro estudo, mas ainda foram superiores à resposta a bGH. O rim e o baço apresentaram respostas maiores a des-IGF-I e nehuma resposta significativa a GH. Em geral, des-IGF-I transformou as contagens de células do sangue nas de animais mais jovens, com a combinação de des-IGF-I e bGH sendo o tratamento mais eficaz. des-IGF-I tendeu a aumentar a contagem de glóbulos brancos (WBC) e o número de linfócitos quando combinado com bGH. Esta alteração é semelhante em quantidade à observada no Exemplo IV no homem.

Os resultados do peso do timo, número de células e percentagem de células que eram positivas para PNA (aglutinina de amendoim) como se mostra na Tabela VI.

Contagens de Células do Timo: Ratos F344 idosos tratados com des-IGF-1 e bGH; cf Ratos jovens 1 |Grupo Peso do Timo (mg) Nfi de Células (X106) 1 PNA+ | (%) 1 |a Excipiente | Idosos 80±35 0,6610,2 24112 | |b des-IGF-1 - 1 (0.64) 117127* 3,2712,1** 72114***| |c bGH(1.0) 66117 1,310,6 37118 | |d des+bGH 144139** 2,7911,5** 69123***| |e Ratos jovens 1_' 338130*** 2,8510,8** 94+2*** I _1 Médias e desvios padrões n=7&8, excepto para o grupo e (n=4).

Pode-se observar que o peso do timo estava aumentado na altura da morte nos ratos tratados com dès-IGF-I. Esta experiência foi projectada para testar a origem e o tipo do número de células aumentado no timo. Esta discriminação da origem e tipo de células foi conseguida por análise de FACS (descrito abaixo) usando PNA como marca específica para os timócitos verdadeiros. Os timócitos PNA positivos crê-se serem células precursoras jovens das células T.

Os ratos jovens tinham 5 vezes mais células do timo do que os ratos idosos. 0 número de células do timo foi aumentado 73

cerca de 4,5 vezes usando des-IGF-I sozinho ou em combinação com bGH. Por si só, bGH aumentou o número de células apenas duas vezes. Estas respostas confirmam as observações na Experiência Um. A percentagem das céluls que eram PNA positivas foi inesperado. Os ratos testemunha jovens tinham 95% células PNA positivas e os ratos idosos apenas 25% de células positivas.

Des-IGF-I por si só nestes idosos aumentou a percentagem de células PNA positivas para 72% das células. Um número semelhante (69%) foi observado para o grupo des-IGF-I mais bGH. bGH por si só não afectou significativamente a percentagem de células PNA positivas. Isto indica que a repopulação "real" do timo estava a ser gerada nos animais idosos, composta por células precursoras das células T.

Portanto, des-IGF-I produziu um efeito muito dramático revertendo tanto o número de células como a percentagem que eram PNA positivas para o normal, IGF-I parece ter um efeito marcado no rejuvenescimento do timo num rato idoso.

Na altura da morte na Experiência Dois nos ratos idosos, metade do timo foi. colocado em formol a 10% e preparadas secções histológicas. A morfologia geral do timo foi avaliada por ^ um patologista veterinário como sendo caracterizado por (1) inexistência de lesões significativas (os animais testemunha jovens) ou (2) involuçao (normal para animais idosos) ou (3) apresentando evidência de hiperplasia de linfócitos. Em adição, a quantidade de células linfocitárias dentro do timo foi graduada para todos os animais, pois este parece ser o componente celular que era diferente entre os grupos.

Usando este esquema característico, involuçao tímica foi observada nos grupos tratados com excipiente e com GH. No 74

entanto, houve clara evidência de hiperplasia linfocitária e restauração da arquitectura do timo nos grupos que receberam des-IGF-I e des-IGF-I mais bGH. 0 aumento dos linfócitos nos ratos tratados com des-IGF-I distinguiu-se facilmente. A classificação das lâminas relativamente ao grau de involução e a quantidade de hiperplasia linfocitária confirmou que a involução foi significativamente revertido por des-IGF-I (p<0,01, teste de Fisher) e que a quantidade de hiperplasia linfocitária foi grandemente aumentada por des-IGF-I (p<0,01). Assim, o exame histológico do timo confirmou que IGF-I pode rejuvenescer o timo de um animal idoso, mesmo, quando a involução do timo já ocorreu. II. Coelhos

Coelhos macho brancos da Nova Zelândia de 2,0-2,5 Kg foram anestesiados e causados danificação dos rins comprimindo ambas as artérias renais durante 120 minutos. Quando da compressão foram colocadas na cavidade abdominal uma bomba osmótica Alzet (Alza Corporation, Paio Alto, CA, Modelo 2ML-1) contendo 2 ml de 3,3 mg de des-IGF-I/ml de ácido acético (100 mM, pH 4,5) ou duas bombas osmóticas Azet contendo 2 ml cada de 5,0 mg de IGF-I/ml (em tampão cloreto de sódio/acetato de sódio, pH 6,0). As bombas libertaram 0,364 mg de des-IGF-I/Kg/dia ou 1,18 mg de ^ IGF-I/Kg/dia durante 7 dias. Os animais testemunha receberam bombas chéias com excipienbe. Os animias foram mortos no dia 7 e dissecados o timo e o baço. i Após sete dias de tratamento com IGF-I o peso médio molhado do timo em coelhos tratados com IGF-I (n=6) foi de 4,7±0,44 g, praticamente duas vezes superior aos animais testemunha (2,7±0,58 g, n=4, p=0,023). Quando o tamanho do timo foi expresso como percentagem do peso de corpo a significância estastística do efeito aumentou (p=0,014).

Após sete dias de tratamento com des-IGF-I o peso molhado médio do baço nos coelhos tratados (n=8, 2,43±0,44) foi maks de duas vezes superior aos coelhos testemunha (n=7, 1,17±0,21 gf p=0,028). III. Murganhos

Os estudos acima usando ratos e coelhos estabeleceram que IGF-I poderá causar alterações profundas no sistema imune. 0 murganho foi em seguida usado como sistema modelo, uma vez que nesta espécie as marcas das células do sistema imune e os ensaios estão melhor caracterizados e podem ser facilmenta conseguidas. Ainda, pretendeu-se estabelecer uma maior actividade do sistema imune se os efeitos no tamanho do timo e baço, número de células e respostas in vitro a mitogénios forem traduzidos funcionalmente.

Uma vez que se mostrou que em ratos idosos IGF-I teve actividade notável no restauro da arquitectura e citologia do timo para características de um animal jovem e que as células produzidas mostraram maior resposta mitogénica, ratos idosos foram escolhidos como modelo, neste caso murganhos macho para -criação já afastados, os quais são um modelo de aceleração do ^ envelhecimento. O efeito de IGF-Icomo agente anabólico assim como um efector do crescimento e função do sistema imune foi estudado em murganhos adultos idosos. Em adição, foi avaliado o efeito de hGH e uma combinação de IGF-I e hGH no número de células e ) estimulação mitogénica. ':V> * - 76

A. Planeamento l. Protocolo

Os estudos que se seguem usaram murganhos BALB/c procriadores afastados de 9 meses de idade ou mais e pesando cerca de 25 a 35 g (Harlan Sprague Dawley, San Diego, CA). Os animais foram engaiolados em gaiolas individuais e alimentados (Purina Rodent Chow 5010, St. Louis, MO) e agua à discrição. Todos os animais foram pesados antes de serem agrupados nos grupos de tratamento (baseado no seu peso do corpo) usando um programa de agrupamento ao acaso. Os animais forma identificados com etiquetas em aço onoxidável e ambientados durante pelo menos uma semana. IGF-I foi administrado por minibomba osmõtica implantadas sc (para estudos de 7 dias, Alzet Modelo 2001, a velocidade da bomba foi de aproximandamente Ιμΐ/hr; para estudos de 14 dias, duas minibombas Alzet Modelo 2002, velocidade da bomba aproxima-damente 0,5 μΐ/hr; Alza, Paio Alto, CA). As bombas foram cheias com solução seguindo as instruções do fabricante e as bombas cheias foram então incubadas com soro fisiológico durante a noite no frigorífico. 'w*1

As bombas foram cheias com excipiente de IGF-I ou com a concentração desejada de IGF-I (5 mg/ml formulado como descrito atrás), i.e., 7,5, 30 ou 120 Mg de lGF-I/dia/7 dias para 6 animais por grupo para o primeiro estudo de sete dias de tratamento e 120 Mg de IGF-I/dias/7 diaspara 5 animais por grupo para o segundo estudo de sete dias de tratamento e para o estudo de 14 dias de tratamento. i 77

Para os tratamentos com hGH, administrou-se rhGH. (marca Nutropin) sozinha numa quantidade de 9,6, 48 ou 240 μg de hGH/dia/14 dias via duas minibombas osmóticas Alzet Modelo 2002 (0,5 Ml/hr/14 dias) implantado sc em 5 animais por grupo ou 240 Mg de hGH durante 14 dias via injecção sc, 5 animais por grupo.

Para os estudos de combinação dè IGF-I e GH, IGF-I foi administrado numa dose de 120 μg por duas minibombas Alzet 2002 e GH foi administrado por injecções diárias subcutâneas de 240 μg em 5 animais por grupo. 2. Determinações do Peso do Corpo e dos Órgãos

Os murganhos foram anesteziados com ua injecção ip de aproximadamente 0,4 ml de avertin (2,2,2-tribromoetanol e álcool ter-amilíco em tampão de fosfatos salino (PBS)). A Rapou-se o pelo na região escapular dorsal e fez-se uma pequena incisão. Ihseriu-se então um pequeno hemostato fechado nesta incisão e empurrou-se no sentido posterior. Inseriu-se então uma minibomba no bolso e a incisão foi fechada com molas em aço inoxidável e deu-se uma injecção sc de 7500 U de penicilina. Os animais foram observados diariamente e registado o peso do seu corpo.

Os animais foram sacrificados a vários tempos após colocação da minibomba, retirou-se uma amostra substancial de sangue e removido assepticamente o timo, baço, coração, fígado, rim e nódulos linfáticos mandibulares e mesentéricos de cada grupo de tratamento e pesou-se. 0 baço, timo e nódulos linfáticos foram colocados em gelo em meio de cultura de tecidos em recipientes separados para ensaios posteriores. Todos os resultados estão expressos como média ± desvio padrão, sendo feitas comparações por análise da variância sendo as comparações feitas usando um Teste de Duncan. 3. Preparação das Células

Os nódulos linfáticos, baço e timo foram dispersos usando vidro triturado para se obter suspensões de células isoladas. As células foram então lavadas, em meio minímo essencial de Eagle (MEM, Gibco, Grand Island, NY) contendolO% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco), penicilina (100 unidades/ml), 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco) e 200 mM glutamina e ressus-penssas a 5 x 10 células viáveis/ml conforme determinado por exclusão com o corante azul tripano. B. Estudos de 7 e 14 Dias A finalidade destes estudos foi estabelecer se IGF-I era anabólico no murganho intacto e se tais doses anabólicas de IGF-I afectaram o peso do timo e do baço, o número de células, o tipo de células e a resposta in vitro a mitogénios. Nestes estudos foram usados cinco ou seis murganhos por grupo. Com base nas doses conhecidas como eficazes no rato, decidiu-se libertar IGF-I por infusão contínua sc a 140, 46 e 15 /íg/murganho/dia (aproximadamente 4, 1,33 e 0,44 mg/Kg/dia) C. Resultados

Efeito do Tratamento de 7 Dias

Houve um efeito relacionado com a dose no aumneto do peso de corpo durante 7 dias (excipiente 0,75±0,75 g, dose baixa 0,86±0,63 g, dose média 1,31±1,03 g e dose alta 3,42±1,24 g), com a resposta à dose elevada sendo altamente significativa estatisticamente para todos os outros grupos (p<0,001). Na experiência repetida com a dose alta de IGF-I deu-se um aumento de peso semelhante (3,5510,54 g) que novamente foi estatisticamente superior (p<0,001) do que o aumento do grupo tratado com exci-piente. IGF-I provocou crescimento significativo do baço e do timo após 7 dias de tratamento com IGF-I. Na primeira experiência houve um efeito claro relacionado com a dose de IGF'-! no baço (excipiente 105114, dose baixa 124121; dose média 145158; dose alta 193123 mg; excipiente vs. dose alta de IGF-I, p<0,001). Na experiência repetida, o aumento de peso do baço foi maior (excipiente 103118, dose alta 206168 mg, p=0,01). O peso do timo ficou inalterado na primeira experiência; isto foi provavelmente devido ao timo ser dissecado de forma diferente por dissecadores diferentes. Na experiência repetida, um dissecador removeu uniformemente o timo e foi detectado crescimento significativo do timo (excipiente, 15,211,3; dose elevada 26,216,4 mg, p=0,006). O aumento observado no peso do baço após sete dias de tratamento com 140 Gjiig de IGF-I/dia foi devido em parte a um aumento no número de linfócitos. Os linfòcitos viáveis, conforme

Q

determinado por exclusão com azul tripano, aumentaram de 2x10 para 5 xlO células/baço após 7 dias de tratamento com IGF-I (Figura 7). Este aumento no número de células pareceu ser devido a um aumento tando das células.B como das células T. Quando os números de células B e T foram quantificados por análise de FACS

de células Slg+ e Thy 1+, respectivamente, o número de células B 8 8 aumentou 3 vezes (1,3 x 10 excipiente vs. 3,5 x 10 IGF-I), se bem que o número de células T também tenha aumentado comparado 7 . 7 com testemunhas (0,7 x 10 excipientes vs. 1,1 x 10 IGF-I) (ver Figura 7). O aumento observado no peso do timo está correlacionado η com um aumento dos timócitos Thy 1+ (1 x 10 excipiente vs. 2,4 x 7 ' 10 IGF-I). Estes resultados sugerem que IGF-I tem um efeito mitogénico potente nas subpopulações de linfócitos.

Ao contrário do aumento dramático no número de linfócitos induzido por IGF-I, a resposta dos linfócitos do baço à estimulação por LPS (células B) e ConA (células T) diminuiu comparado com as testemunhas, se bem que a resposta a PWM fosse equivalente para ambos os grupos de murganhos (ver Figura 7). Esta resposta mitogénica diminuída sugere uma ausência de maturidade funcional na população de linfócitos após tratamento com IGF-I de curta duração (7 dias).

Portanto, na experiência de 7 dias o número de linfócitos aumentou mas a resposta mitogénica decresceu.

Efeito do Tratamento de 14 dias

Em seguida determinou-se se uma exposição maior a IGF-I era necessária para melhorar a função dos linfócitos em vez de ser necessária para aumentar o número de linfócitos. Portanto, o tratamento prolongou-se para 14 dias usando a dose alta de IGF-I (14 0 μg/murganho/dia) . Ainda, uma vez que se pensa que hGH actue em parte por indução da produção de IGF-I, foram comparados os efeitos de hGH vs. IGF-I nas respostas de linfócitos.

Houve um aumento de peso significativo após 14 dias de tratamento com IGF-I (excipiente 1,49±0,46; dose alta 3,87±0,45g, p<0,001). Em adição houve um crescimento do baço significativo (excipiente 96±12; dose elevada 163±9, p<0,001) e crescimento do timo significativo (excipiente 18,2±4,6; dose elevada 33,8±10,6, p=0,017). Pode-se observar que o timo e o baço atingiram pesos semelhantes após 7 ou 14 dias de tratamento. 81

Como se pode ver na experiência de 7 dias, o número de células do baço quase duplicou (1,3 x 10 vs. 2,4 x 10 ) comparado com as testemunhas usando o tratamento com IGF-I (Fig. 8). Se bem que tenha havido um aumento no número de células T nos murganhos tratados com IGF-, o único aumento estatisticamente . . . . . _ 7 significativo foi observado na populaçao CD. (3,1 x 10 vs. 4,9 x 7.. 4 .10 ) (Fig. 8), sugerindo que as células CD^ podem ser preferencialmente aumentadas por este regime de tratamento. Como se observou na experiência anterior, o tratamento com IGF-I resultou num aumento substancial do número de células B. IGF-I também mostrou um aumento no número de células T do timo quando o tratamento foi realizado durante 14 dias (ver Fig. 9).

Ao contrário da resposta diminuída observada aos 7 dias, após 14 dias de tratamento com IGF-I a resposta mitogénica dos esplenócitos derivados de murganhos tratados com IGF-I foi significativamente elevada comparado com as testemunhas (Fig. 10). Estès dados sugerem que a administração a curto prazo de IGF-I resulta em aumentos significativos no número de linfócitos, sendo necessário mais tempo para se ver alterações na resposta dos linfócitos.

Efeito da- Combinação Após 14 Dias de Tratamento a. Tratamento simultâneo

Uma vez que hGH e IGF-I têm efeitos diferentes nas populações de linfócitos, nas séries de experiências seguintes foram estudados os efeitos da hG'H administrada simultaneamente com IGF-I. Sozinha ou em combinação com hGH injectada subcuta-neamente, o tratamento com IGF-I produziu aumentos no número total de linfócitos no baço, o que novamente pareceu ser essencialmente devido a um aumento no número de células B (Figura 11). 82

A combinação de IGF-I e hGH teve um efeito pronunciado no número de timócitos relativamente ao tratamento com sô com IGF-I ou hGH (Figura 12).

Espera-se que a via de administração preferida da terapia de combinação seja a administração de IGF-I e hGH administrado por infusão contínua. b. Tratamento seauenciado

Quando GH (a 280 Mg/dia) foi administrado primeiro durante 14 dias seguido da administração de IGF-I (a 140 jug/dia) durante 14 dias, não foi observado qualquer efeito de IGF-I.

Efeitos a Longo Prazo do Tratamento de 14 Dias

Para determinar os efeitos a longo prazo de de IGF-I, hGH e da combinação, as populações de linfócitos dos animias testemunha e tratados foram observados aos 7 e 21 após 14 dias de tratamento com hGH, IGF-I ou combinação de iGF-I e hGH.

Sete dias após o tratamento com IGF-I e IGF-I mais hGH os murganhos tratados tiveram números de esplenócitos substancialmente aumentados comparado com a testemunha ou murganhos tratados com hGH (Fig. 13) ., Um aumento estatístico no número de células B foi observado em ambos os grupos tratados com IGF-I. O aumento no número de células T foi significativo no grupo de apenas IGF-I, mas não no grupo da combinação de hGH mais IGF-I. Ainda, tanto as populações de células CD.+ como CDQ+ foram elevadas neste grupo comparado com as testemunhas. Tal como no caso do tratamento de 14 dias, ambos os grupos de murganhos tratados com IGF-I tiveram números de timócitos elevadois comparado com murganhos tratados com hGH ou testemunha (Fig. 14). Em 83

: adição, IGF-I sozinho ou em combinação com hGH, produziu um aumento nos números de células dos nódulos linfáticos periféricos (Fig. 16). Não foi observada alteração no número de células T dos nódulos ou na razão CD.:CD0 , . , , . . 4 8 apos estes regimes de tratamento.

Ao contrário da resposta proliferativa aumentada a mitogénios observada aos 14 dias de tratamento, as respostas mitogénicas dos murganhos tratados com IGF-I voltou para os valores das testemunhas aos 7 dias após tratamento (Fig. 15). As maiores respostas mitogénicas foram observadas nos grupos tratava dos com hGH mais IGF-I comparado com testemunhas, mas estas diferenças não foram estatisticamente significativas.

Aos 21 dias após tratamento os quatro grupos de murganhos tinham números equivalentes de esplenócitos (Fig. 17) e timócitos (Fig. 18). Assim, 21 dias parece ser suficiente para restaurar o número de células normais e as proporções fenotipicas após tratamento com IGF-I.

No entanto, aos 21 dias após tratamento, tanto as respostas a LPS como a ConA do grupo tratado com hGH mais IGF-I foram estatisticamente elevados comparados com as testemunhas (Fig· 19)· Dê forma semelhante, as respostas aos três mitogénios foram elevados no grupo tratado apenas com IGF-I. Estes resultados sugerem que IGF-I teriha um efeito precoce e tardio nas respostas de linfócitos, enquanto que a combinação de IGF-I e hGH parece requerer algum tempo para efectuar a resposta de linfóci-^ tos. hGH injectado subcutaneamente sozinho não teve efeito estatisticamente significativo nas respostas mitogénicas em qualquer um dos tempos estudados.

EXEMPLO III

Respostas a Antigénios na Imunização Secundária A finalidade desta experiência foi avaliar a função .imune em murganhos macho (cruzador já não usado) imunizados com dinitrofenilovalbumina e tratado com IGF-I. Experiências anteriores indicaram que 14 dias de administração contínua de IGF-I a murganhos macho já não utilizados aumentou o peso do corpo e os pesos dos orgãos baço e timo. Mostrou-se que o aumento no peso do baço era atribuído a um aumento no número de células B e a um aumento na resposta a mitogénios. Foi também demonstrado poder ser aumentado o número de células T no timo e que estas células respondiam melhor a mitogénios. Estes resultados indicam que se IGF-I causou um maior número de de células B produtors de anticorpos e de células T auxiliares e uma maior resposta a mitogénios, èntão IGF-I deve ser capaz de dar uma maior resposta de anticorpos contra um antigénio. I. Protocolo

Quarenta e oito horas após a chegada todos os animais receberam uma única injecção ip (100 μΐ) de dinitrofenil-ovalbu-mina misturado com alum (DNPOA). ( O grupo dinitrofenilo é um hapteno que induz uma resposta dependente de células T e a ovalbumina é um veículo que induz uma resposta dependente de células T). O DNPOA foi misturado antes de usar pela adição de 50 μΐ de DNPOA (1 mg/ml) a 2,45 ml de PBS estéril, pH 7,0 e 2,50 ml de gel adsorvente. de hidróxido de alumínio (marca Rehsorptar , vendida por Armor Pharmaceutical Col., IL, 20 mg/ml). O DNPOA foi misturado aproximadamente 30 minutos antes da injecção. 0 dia da imunização com DNPOA foi designado Dia 0. 85

No Dia 19, dez animais foram agrupados pelo peso do corpo em dois grupos. (Um animal foi encontrado morto no dia 9). Dezanove minibombas osmòticas (Alzet Corp., Paio Alto, CA) modelo 2002 (0,5 μΐ/hr, 14 dias) foram cheias com excipiente de IGF-I como descrito no Exemplo I e colocados em solução salina esterilizada durante a noite a 4°C.

No Dia 20, cinco animais seleccionados ao acaso foram sangrados (na órbitra). O soro foi analisado relativamente à preença de de IgG específica de DNPOA, como descrito abaixo.

No Dia 20, dez animais foram anestesiados com uma injecção ip de aproximadamente 0,5 ml de avertina como descrito atrás. Os animais foram rapados numa área dorsal de aproximada- 2 mente 2 cm e desinfectada com etanol a 70%. Fez-se uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm na área rapada. Inseriu-se um hemostato na incisão e empurrou-se anteriormente para a base da cauda e inseridas as minibombas descritas atrás. Cinco animais foram submetidos a implantação de minibombas cada uma tendo tampão do excipiente. Cinco animais foram sujeitos à implantação de duas minibombas cada uma delas tendo IGF-I. A velocidade de libertação para as minibombas deu uma dose de IGF-I de 120 /xg de IGF-I/dia durante um máximo de 14 dias. Apõs recuperação da anestesia, cinco animais do grupo que recebeu excipiente e do grupo que recebeu IGF-I receberam uma injecção intraperitoneal de 100 μΐ de DNPOA.

No Dia 25, um animal no grupo do excipiente foi encontrado morto.

No Dia 34, os nove animais foram sangrados na órbita e o soro foi analisado relativamente à presença de IgG (ver Tabela VII para o esquema global de imunização).

TABELA VII

Murganhos Machos Procriadores Aposentados (BALB/c) Imunizados com DNPOA

Grupo Número is injecção DNPOA Composto (data do implante) 2ã injecção DNPOA 1 4 Dia 0 Excipiente Dia 20 Dia 20 2 5 Dia 0 IGF-1 Dia 20 Dia 20

II. Ensaio de Anticorpos Anti-DNP

IctG: IgG de anticorpos anti-DNP nos soros de murganhos a testar foràm medidos por ELISA (imunoensaio ligado a enzimas) usando soro anti-DNPOA de murganhos sensibilizados como padrão de referência. A ELISA foi realizada em placas de 96 cavidades. Cada uma das cavidades foi revestida com 0,1 ml de 2,5 μg/ml de DNPgHSA (albumina sérica humana modificada com dinitrofenilo) durante 24 horas a 4°C. Apôs bloqueio com 0,1% BSA, adicionou-se 0,1 ml de cada um dos soros a testar às placas revestidas com antigénio em triplicado e as placas foram incubadas durante duas horas à temperatura ambiente. As placas foram lavdas três vezes comm PBS/0,02% Tween 20 e 0,1 ml de uma diluição 1:2000 de OgG de coelho anti-murganho (Cappel Labs) foi adicionado a cada uma das cavidades. As placas foram novamente incubadas duas horas e lavadas. Em seguida, adicionou-se 0,1 ml de uma diluição 1:1600 de anti-soro de cabra contra coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre e incubado durante 1 hora à temperatura. Apôs lavagem, adicionou-se 0,1 ml de orto-fenilenodiamina (OPD), 0,01% v \ 87

de peróxido de hidrogénio em tampão citrato 0, 05M foi adicionado a cada uma das cavidades, a reacção foi parada com ácido sulfúri-co 2M após 30 minutos e a densidade õptica foi lida a 490 nm num leitor de placas Microtect, III. Ensaio de laG Total \~y

Anticorpos IgG nos soros de murganho a testar foram medidos por uma ELISA usando IgG de murganho como referência padrão. A ELISA foi realizada em placas de 96 cavidades. Cada uma das cavidades foi revestida com 0,1 ml de uma diluição a 1:200 de IgG de cabra anti-IgG de murganho específica de Fc (Cappel Labs, Westchester, Pa) durante 24 horas a 4°c. Após bloqueio com 0,1% de BSA, adicionou-se 0,1 ml de cada um dos soros a testar às placas revestidas com anticorpos em triplicado e as placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS/0,02% de Tween 20 e 0,1 ml de uma diluição a 1:250 de conjugado de cabra específico de Fab com proxidase de rábano silvestre anti-IgG de murganho (Cappel Labs) foi adicionado a cada uma das cavidades. As placas foram novamente incubadas duas horas e lavadas. Após lavagem, adicionou-se a cada uma das placas 0,1 ml de OPD a 0,2 mg/ml, 0,01% de peróxido de hidrogénio após 30 minutos e a densidade foi lida a 490 nm num leitor de placas de microtitulação Microtec. IV. Resultados A Figura 20 mostra a concentração de IgG total (Fig. 20B) e específica de OA (Fig. 20A) no soro de murganhos tratados com excipiente ou com IGF-I. O tratamento com IGF-I aumentou significativamente a resposta secundária de IgG ao antigénio em todos os pontos do tempo examinados. Se bem que houvesse uma tendência no sentido do aumento dos níveis de IgG totais no grupo 33

de IGF-I, os valores não foram estatisticamente aumentados comparado com as testemunhas. Assim, IGF-I funcina de forma a reforçar a resposta de memória de um mamífero. Nota-se que a exposição a IgG após uma imunização secundária produz um maior aumento na produção de anticorpos.

EXEMPLO IV

Efeito na resposta imune após transplante da medula óssea A finalidade desta experiência é determinar os efeitos do tratamento com IGF-I de murganhos na repopulação do baço e timo após transplante de medula óssea. I. Protocolo

Murganhos BALB/c macho, 19-26 g e 6-7 semanas de idade (Charles River, 'San Diego, CA), foram usados neste estudo. Os animais foram agrupados em gaiolas de polipropileno com comida (Purina Rodent Chow 5010, St. Louis, MO) e água à descrição. Todos os animais foram pesados no dia da implantação da bomba e agrupados ao acaso. Todos os animais foram identificados com etiquetas de aço-inoxidável colocadas na orelha.

Estudaram-se dez .animais por grupo. Os animais foram anestesiados com uma injecção ip de aproximadamente 0,4 ml de avertina antes do implante de minibombas osmóticas Alzet Modelo 2002 (0,58±0,03 μ1/ίΐΓ/14 dias)_ cheia com excipiente de IGF ou 200 μΐ de rIGF-I descrito atrás diluido para se conseguir uma libertação diária contínua de aproximadamente 40 ou 120 μg/dia/14 dias. 89

Registaram-se os pesos diários dos animais. Vinte e quatro horas após o implante todos os animais foram irradiados , i37 com 900 rads de radiação de Cesio (4,29 minutos). Uma hora após irradiação os animais receberam uma injecção intravenosa de 7 1 x 10 de células de medula óssea (250 μΐ).

J

Removeram-se fémures e tíbias de 40 animais dadores. A medula óssea foi lavada com BBS. As células foram centrifugadas e lavadas com soro fisiológico. As células viáveis foram contadas e diluídas com soro fisiológico para se conseguir 10 células/0,25 ml.

Metade dos animais foram sacrificados 14 dias após o tratamento com radiação. Todos os animais sobreviventes do grupo que foi irradiado e não receberam medula óssea foram mortos nesta altura. Os restantes animais foram mortos 23 dias após o tratamento de irradiação. Baços, timos, fígados e corações foram removidos e pesados. Os ossos longos foram retirados para histologia e os baços e os timos retirados para citologia e ensaios in vitro. 0 sangue foi retirado para análise de citologia periférica. 0 protocolo está apresentado na Tabela VIII.

TABELA VIII

Grupo Inl Via · 1 10 bomba sc 2 10 bomba sc 3 10 bomba sc 4 10 bomba sc

Dose de IGF-I (qq/dia) 0 sem medula 0 receberam medula 40 receberam medula 120 receberam medula X . II. Resultados A. Aumento de Peso

Os animais que não recebram medula óssea apresentaram uma elevada mortalidade, enquanto que três de dez animais sobreviveram durante 14 dias. Para todas as medições (sangue, tecidos e corpo total) este grupo de animais mostrou o efeito esperado de uma dose letal de radiação.

Os animais que tiveram a medula óssea substituída sobreviveram com apenas dois animais de 30 morrendo durante os 23 dias do estudo. Os aumentos de peso reais nos quatro grupos estão apresentados na Figura 21. Os pesos do timo e do baço estão apresentados na Tabela IX. , ,Λ Ν

TABELA TX 1 |Sem medula 18,6+0,9 I 1 -l· 18,6+2,5 | | |Apenas medula 112,6+1,0 1 1 [26,0+12,9 | I I -h 77,8+31,5 | 1 74,0+29,0 | |IGF-I baixa |22,5+6,2 1 τ-Ι 6,4+9,2 ' | -Ι- ΙΟΙ,2+35,4*1 1 92,0+8,3 | 1 1 |IGF-I elevada 1 _ |27,3+10,9 1 I I I I | 51,2+9,3** | J_1_ t_ 125,0+35,4*| _L 103,6+19,4| _1 1 |Peso do timo (g) 1 1 I Peso do baço -1 (g) i |Dia 14 1 1 Dia 23 1 1 1 Dia 14 | Dia 23 | *ρ<0,05 de Medula apenas no mesmo dia **p<0,01

Houve um efeito claro no aumento de peso do timo e baço por IGF-I neste modelo. -Parece que o efeito no timo foi superior ao efeito no baço uma vez que houve sistemática duplicação do tamanho do timo no grupo da dose elevada de IGF-I, sendo o efeito no baço inicialmente estatisticamente significativo mas não se manteve no dia 23. Não houve efeito global do tratamento no peso do fígado ou do coração. 0 efeito anabólico dramático no corpo todo de IGF-I neste ensaio confirma que IGF-I continua a ser anabólico no corpo todo. 0 efeito do aumento da massa do timo e baço por IGF-I foi surpreendente em todos os graus de imunodeficiência que este modelo representa. Deve-se esperar que noutros modelos de imuno-deficiência, i.e., AIDS, que IGF-I também apresente eficácias notáveis.

As alterações do peso do corpo para os quatro grupos stão apresentadas na Figura 21. A figura mostra claramente a grande perda de peso nos animais após exposição a radiação. Houve um efeito claro relacionado com a dose da protecção deste catabolismo por IGF-I em murganhos. A dose elevada de IGF-I tem um efeito anabólico significativo logo aos sete dias após tratamento e este efeito persistiu até ao fim do estudo. Doses baixas de IGF-I também causaram uma protecção significava nalguns pontos de tempo (p<0,05). B. Números de Células e Respostas Mitoaénicas

Quatorze dias após irradiação os animais que receberam 12 0 μg de IGF-I tinham maiores números de células T CD^+ rio sangue periférico comparado com o tratamento com a dose baixa de IGF-I (Fig. 22). De facto, a proporção de CD para CD aumentou de 2 para 4 neste grupo de tratamento comparado com as testemunhas. Estes resultados são consistentes com os aumentos preferenciais das células CD4 observados em animais idosos tratados com IGF-I durante 7 ou 14 dias. Não se observou qualquer efeito no número de células B periféricas após tratamento com IGF-I.

Quando os linfócitos do baço destes animais foram quantificados por análise de FACS, observou-se que o tratamento com IGF-I produziu um aumento dependente da dose no número de células B e T (Fig. 23) . No entanto, não se observou efeito na resposta mitogénica destas células do baço quando medido nesta altura (Fig. 24). 93

baço, o número de linfócitos murganhos tratados com IGF-I (Fig. 28).

Tal como aconteceu com o que fez a repopulação do timo dos aumentou comparado com testemunhas.

Quando examinado aos 21 dias pós-irradiação, IGF-I novamente induziu uma alteração na proporção linfócitos CD.:CD0 4 8 do sangue periférico devido a aumentos na população de células T CD4+ (Fig. 25). Nesta altura, o número de células totais do baço nos grupos tratados com IGF-I voltou para valores da testemunha mas ainda se podia observar uma aumento ligeiro na população de

células CD4+ j3aç0 (Fig. 26) . Este aumento nas células T reflectiu-se numa maior resposta mitogénica. A estimulação com ConA das células T do baço triplicou nos murganhos tratados com uma dose elevada de IGF-I (Fig. 27). As respostas mitogénicas das células B a LPS não foram afectadas pelo tratamento com IGF-I quando examinadas nesta altura.

Surpreendentemente, os números de linfócitos do timo dos murganhos tratados com doses baixas e altas de IGF-I foram ainda dramaticamente aumentados comparado com as testemunhas (Fig. 28). Tomado em conjunto com os aumentos no número de de CD4 do baço e com a resposta a ConA, estes dados sugerem que IGF-I aumente a velocidade de repopulação de células periféricas e apoia um papel terapêutico importante para esta molécula após transplante singeneico de'medula óssea. Pode-se prever que a utilização de GH para estimular a produção de IGF-I resulte numa resposta semelhante após transplante singeneico de medula. A administração de GH e de IGF-I espera-se que aumente a velocidade e grau de tal transplante de medula óssea.

EXEMPLO V

ADMINISTRAÇÃO DE IGF-I A HUMANOS

Esta investigação clínica proporciona evidência de que IGF-I também afecta o sistema imune de um humano. I.Protocolo

Realizou-se um estudo clínico Fase I sobre a segurança e farmacocinética após administração repetida (multidose) de IGF-I em machos adultos saudáveis. Cada indivíduo de 12 doentes humanos recebeu uma injecção bolus de 0,03 mg/Kg de rhIGF-I como descrito atrás todas as manhãs durante cinco dias consecutivos. No despiste e dez horas após o bolus no dia cinco, retiraram-se amostras de sangue para determinação da hematologia. II. Resultados

Encontrou-se que a hemoglobina, hematócrito e glóbulos vermelhos (RBCs) eram significativamente mais baixos no dia 5 comparado com o despiste semana 2 após o tratamento (p=0,Q01, 0,0004, 0,0005 e 0,0005). Pelo contrário, os glóbulos brancos (WBCs) aumentaram significativamente para o despiste no dia 5 (entre 6,1±1,5 e 7,5±1,9 M/CMM, p=0,0018). Ainda, na semana 2 após tratamento os WBCs baixaram significativamente do valor no dia 5 (de 7,5±1,9 para 6,4+1,6 M/CMM, p=0,003), de forma que os valores de WBC pré-tratamento e 2 semanas pós-tratamento não eram significativamente diferentes.

Portanto, apesar da queda de RBCs neste estudo, os WBCs aumentaram. Sabe-se que 25 a 30% das células brancas são linfó-citos. O amento de 23% no número total de de WBCs no sangue dos V/S - 95

indivíduos tratados cora IGF-I torna muito provável que houvesse também um aumento no número de linfócitos após este tratamento com IGF-I no homem. Comparado com a Figura 22B, a qual mostra alterações estatisticamente significativas no número de linfócitos CD4+ do sangue periférico após tratamento com 120 μg de IGF-I. Ver também Tabela V sobre os efeitos aumentados da combi-.nação de des-IGF-I e bGH no número de linfócitos e WBCs em ratos idosos.

CONCLUSÃO

Os estudos realizados por Isaksson et al. (Acta Physiol. Scand. 114:261-265. 1982) mostraram que 4 injecções diárias subcutâneas de GH eram mais eficazes do que 1 ou 2 injecções por dia ou uma infusão contínua a partir de minibombas osmóticas implantadas subcutaneamente. Por outro lado, Cotes et al. (J. Endocrinology 87.:303-312, 1980) encontraram que a infusão s.c. a partir de minibombas eram mais eficaz do que uma injecção diária e concluíram que a infusão contínua era mais eficaz do que a administração episódica. Jansson (em The Sexual Dimorphism of Pulsatile Growth Hormone Secretiona in Relation to Body Growth, University of Gotenburg, Gotenborg, Sweden, 1983 nas páginas 33-35) mostrou que 4 injecções s.c. de GH eram superiores à administração contínua de GH por minibombas osmóticas. No entanto, não houve estudos sobre a eficácia de diferentes padrões de administração de GH sobre o crescimento de diferentes orgãos do corpo ou sobre a função imunológica.

O

Descobrimos novas estratégias . para a administração de GH. Mostrámos que GH administrado continuamente é o padrão preferido de administração de GH para estimular os tecidos que respondem a GH, particularmente o tecido de resposta imune. Existe uma série de dados sugerindo diferentes respostas a GH X . ' . · Λ ν· >

x-J após uma exposição contínua ou uma exposição pulsátil (Clark e Rosinson, 1987). O presente invento contem os primeiros resultados experimentais que mostram que os tecidos da resposta imune preferem a presença contínua da hormona de crescimento e portanto que a presença contínua de GH é o método preferido de administração terapêutica.

Descobrimos também novas estratégias para a administração de GH em combinação com IGF-I. Para a co-administração de GH com IGF-I para afectar as funções imunes propusémos que GH fosse libertado para manter a presença contínua no sangue e fluídos intracelulares. O presente invento estabelece pela primeira vez que GH e IGF-I tenha uma efeito aditivo quando ambos são co-admi-nistrados. GH foi anteriormente administrado como injecção pulsátil ou bolus diária ou de 2 em 2 dias, uma vez que foi assumido e se mostrou superior â infusão' de GH contínua a curto prazo. Surpreendentemente, observou-se que a presença contínua a longo termo de GH no plasma é a melhor pará a estimulação de muitos senão da maior parte dos tecidos que respondem a GH. A presença contínua de GH durante 3 ou mais, de preferencialmente 6 ou mais e mais preferencialmente 14 ou mais dias estimula os tecidos que respondem a GH melhor do que a administração pulsátil. GH pode ser administrado continuamente por catétero ou diferentes minibombas que libertam uma quantidade constante de GH. No entanto, num outro aspecto do presente invento, GH formulado para ter uma semi-vida longa resulta numa maior resposta a GH, quando administrado de 6 em 6 dias ou mais. Surpreendentemente, os tecidos e células do sistema imune respondem a GH ou GH mais IGF-I de forma a aumentar a velocidade ou resposta e a grandeza da resposta imune. A administração intermitente de PEG-GH deu a melhor resposta a GH quando administrado de 6 em 6 dias.

Quando IGF-I foi isolado e designado inicalmente como "somatomedina" oara indicar que medeia a actividade de GH promotora do crescimento de todo o corpo de GH. Foi mais tarde desig-.nada IGF-I em reconhecimento das suas actividades metabólicas tipo insulina. É portanto surpreendente que IGF-I, uma molécula considerada como regulador metabólico do crescimento somático tenha-se mostrado possuir uma actividade de factor de crescimento semelhante em células do sistema imune como muitas das interleu-quinas.

Sabe-se que os receptores de GH, receptores de IGF-I e receptores de insulina estão presentes nas células do sistema imune. 0 efeito funcional in vivo destes receptores e a actividade dos seus lígandos no sistema imune era desconhecido até ao presente invento. Os efeitos da insulina e GH no sistema imune foi considerada significativa (ver, e.g., Snow, J. Immunol.. 135:776-778 (1985)). A maior parte dos tecidos no corpo possuem receptores de GH, IGF-I e insulina onde estas hormonas actuam de forma a regular as funções metabólicas básicas das células, por exemplo a internalização de glucose ou o transporte de aminoãci-dos. Os receptores que se demonstrou estarem presentes no tecido imune e que podem funcionar para controlar estas actividades, em vez de funcionarem para influenciar a suas actividades de diferenciação, crescimento e imunlógicas. Dados recentes reconhecem que o papel de IGF-I na influência da citologia ou função imune é desconhecida (ver Fu et al. J. Immunol.. 146: 1602-1608 (1991)).

Sabe-se que doentes idosos, subnutridos ou pessoas com uma ou mais doenças tornam-se imunodeficientes. Sabe-se ainda que estes doentes também se tornam deficientes em IGF-I. Os resultados aqui apresentados sugerem que esta imunodeficiência esteja relacionada directamente e exacerbada, senão mesmo causada, por este deficiência em IGF-I. Seria de esperar que o restauro das concentrações de IGF-I Tio sangue em doentes resulte numa melhoria desta imunodeficiência. IGF-I afecta dramaticamente o tamanho do timo em vários modelos animais. 0 crescimento do timo .foi observado em animais aos quais foi retirada a hipófise e ratos anões em ratos ratos jovens, adultos ou idosos, em murganhos e em coelhos, o timo regride com a idade na maior parte dos animais; ele atinge um tamanho máximo e então começa a diminuir no homem após a puberdade. Esta involução está associada a um declínio da actividade do sistema imune. Este invento proporciona pois, num aspecto, um meio de estimular o sistema imune de um ser humano idoso para restaurar o tecido do timo de forma a obter-se o de uma pessoa mais jovem. A combinação de um agente que tem actividade anabólica nos principais orgãos internos, com melhoria da hematologia e da função imune, torna GH ou GH mais IGF-I uma droga atractiva para o tratamento' de seres humanos adultos ou idosos. A capacidade de rejuvenescer o timo e portanto sensibilizar o sistema imune é encarada como proporcionando uma gama de oportunidades terapêuticas.

Tais oportunidades incl-uem agamaglobulinémia vulgar variada em que as células B não sofrem maturação para células secretoras de Ig e o soro contem menos de 250 mg/dl comparado com 1000 mg/dl que é a concentração normal. IGF-I produziu aumentos significativos dos níveis de Ig (Figura 20) e pode ser útil nesta doença.

Uma outra utilização do ivento será a administração de IGF-I a um doente que sofra de uma doença hereditária que resulte num mau funcionamento do sistema imune. Um exemplo de tal paciente será uma criança que sofra de aplasia congénita típica (síndroma diGeorge) no qual o timo está atrofiado 'é as células T estão gravemente reduzidas, conduzindo a infecções oportunísticas que são muitas vezes fatais. A razão para esta doença é desconhecida. Espera-se que IGF-I resulte num aumento de tamanho, um aumento do número de células e da resposta do timo nestes doentes. 0 curso do tratamento será intermitente, por exemplo com um .período de tratamento de 14 dias seguido de um período de repouso de mais de 21 dias entre as exposições a IGF-I. Nesta altura, as contages de células nos tecidos imunes terá voltado ao normal, mas a sua capacidade para responder a mitogénios ou para produzir anticorpos terá aumentado. Tal protocolo de tratamento intermitente de produção de ondas de desenvolvimento celular seria suportado e conduziria a um restauro a longo prazo da função imune em estados hereditários do tipo DiGeorge.

Uma terceira oportunidade é o síndroma da imunodeficên-cia adquirida (AIDS). Doentes com AIDS não têm imunidade de células T e tem as razões T4/T8 invertidas. Demonstrou-se que IGF-I aumenta a resposta mitogénica de células T e especificamen-te aumenta o número de células CD^+ (Figs. 5, 10, 11) e como tal pode ser uma droga útil no tratamento de AIDS.

Os resultados estabelecidos atrás sugerem que a administração de IGF-I seja benéfica para o aumento da produção de imunoglobulina em doentes que sofram de produção insuficiente de imunoglobulina. Espera-se que o intervalo entre as imunizações seja reduzido pelo invento aqui apresentado. A proliferação mais rápida das células in vitro derivadas de murganhos tratados com IGF-I sugeriu que pudessem ser conseguidas maiores respostas de anticorpos mais rapidamente. Por exemplo, no homem é comum dar imunizações primárias, secundárias e terciárias separadas por muitos mese. Durante este tempo está em risco de exposição ao agente do que está a ser protegido. Seria uma vantagem reduzir o intervalo entre as imunizações usando IGF-I para sensibilizar o sistema imune de forma a reduzir o risco acima referido.

Uma outra utilização do invento é dar a um doente um tratamento com IGF-I durante a sua recuperação de uma doença ou após cirúrgia quando uma infecção ou recaída pode surgir. .Espera-se que uma maior resposta imune auxilie tal doente a montar um desafio imune à infecção ou recaída.

Ainda uma outra utilização da administração de GH ou de IGF-I é como imunoadjuvante. Sempre que da imunização de um mamífero ou ave, a administração de GH ou IGF-I para acelerar o processo de imunização é claramente indicado no presente invento.

Nos exemplos atrás referidos, a eficácia de IGF-I foi demonstrada como se segue: (1) em três espécies (murganho, rato e coelho).; (2) em ambos os sexos (ratos macho e ratos fêmea); e (3) em vários modelos animais, inclundo animais que por um processo cirúrgico ficaram deficientes em GH e IGF-I (ratos a que foi retirada a hipófise), animais com deficiência hereditária em GH e IGF-I (ratos anões), animais normais (ratos a que foram retirados os ovários) animais com um envelhecimento natural e deficientes em IGF-I (ratos com 18 meses de idade.) , animais com envelhecimento acelerado (murganhos progenitores fora das suas funções) e animais com função imune reduzida (os animais idosos). Não deriva necessariamente dos estudos atrás realizados que seja necessário um mínimo de 14 dias de tratamento com IGF-I para induzir as alterações observadas. No murganho escolheu-se 14 dias de tratamento pois proporciona um meios reprodutível de induzir respostas em tecidos imunes. É possível que 7 dias de tratamento com IGF-I o qual induz um aumento no número de células, conduza eventualmente a linfócitos maduros funcionalmente 101

activos. Em adição, menos de 7 dias de tratamento (por exemplo os 5 dias usados no Exemplo IV no homem) poderá ser também um período eficaz de administração. Ainda, o tratamento com IGF-I por injecções em vez da infusão contínua espera-se que seja também eficaz. ο

Será razoável esperar que os dados sobre coelho, rato e murganho aqui apresentados possam ser extrapolados para aves, cavalos, vacas e outros mamíferos, corrigindo o peso do corpo da ave oii mamífero de acordo com processos clínicos e veterinários bem conhecidos. Espera-se que os seres humanos respondam igualmente desta forma. Foram encontrados receptores de IGF-I em linfócitos humanos [Kozak et al.. Cell Immunol.. 109:318 (1987)] e a evidênica de respostas semelhantes no homem está apresentada no Exemplo IV. Assim, seria razoável esperar que no homem IGF-I tem um efeito restaurador benéfico na função imune em todos os doentes,

Lisboa, 26 de Junho de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA ViCTOR CORDON, 10 r A 3.a 1200 LfSBQA

Claims

2* >β·

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REIVINDICAÇÕES li. - Método para a estimulação de tecidos que respondem à hormona de crescimento mamífera ou aviária, caracterizado por compreender a manutenção de uma concentração eficaz contínua de hormona de crescimento no plasma durante um período de três ou mais dias. 2§. - Método de acordo cóm a reivindicação 1, caracterizado por o referido método ser conseguido usando um sistema de infusão contínua. 3ã. - Método de acordo com a reivindicação l, caracterizado por o referido método ser conseguido usando uma hormona de crescimento complexada com uma ou mais macromoléculas para reduzir a eliminação de GH do plasma sanguíneo. 4ã. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida hormona de crescimento ser complexada com uma macromolécula seleccionada de entre as seguintes: proteína de ligação à hormona de crescimento, polietilenoglicol, polipropile-noglicol e açúcar. 5-. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos tecidos que respondem serem tecidos da resposta imune. 6ã. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida hormona de crescimento ser hormona de crescimento humana. - 2 - ^ΐ- ''

7a. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizado por a referida hormona de crescimento estar em combinação com uma ou mais das seguintes: proteína de ligação à hormona de crescimento ou IGF-1. 8s. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por a referida hormona de crescimento ter ligados covalen-temente um ou mais polímeros seleccionados de entre os seguintes: polietilenoglicol, polipropilenoglicol e açúcar. O 9a. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte-rizado por o referido polímero ser polietilenoglicol e o referido polímero ligado covalentemente ser polietilenoglicol ligado a um ou mais aminoácidos da hormona de crescimento humana, seleccionados de entre os seguintes: metionina N-terminal, lisina 38, lisina 41, lisina 70, lisina 140, lisina 145, lisina 158 e lisina 168. 10a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o referido período ser de 6 ou mais dias. 11a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por a referida dose da hormona de crescimento se situar entre 0,01 a 10 mg/Kg/dia. 12a. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizado por o sistema imune ser estimulado por um maior número de células do baço. 13a. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizado por o sistema imune ser estimulado por um maior número de timócitos. caracte- 14â. - Método de acordo com a reivindicação 5, rizado por os referidos tecidos de resposta imune resultarem numa maior síntese de anticorpos. 15a. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizado por os referidos tecidos da resposta imune causarem a .imunidade celular. 16 â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o mamífero ser um humano. O 17â. - Método de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado por o ser humano ser idoso. 18'a. - Método de acordo com a reivindicação 16, carácter izado por o ser humano ter um sistema imune comprometido. 19a. - Método de acordo com a reivindicação 18, carac-terizado por o ser humano ter SIDA. 2 0ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o mamífero ter sofrido um transplante de medula. 2ia. - Método para aumentar uma resposta de anticorpos em mamíferos ou aves a um imunogénio, caracterizado por compreender a administração ao mamífero ou ave do imunogénio e de uma quantidade eficaz de hormona de crescimento. 22ã. - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida hormona de crescimento ser administrada antes da imunização. 4 - ; » Λ % -λ

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23a. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por a referida hormona de crescimento ser administrada em simultâneo ou após a imunização. 24a. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por a referida hormona de crescimento ser administrada .em combinação com IGF-I. 25â. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por o referido mamífero ou ave ser infectado com um vírus que tenha um tempo de incubação inferior ao da resposta imune normal do mamífero ou ave. 26â. - Método de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado por a administração ser simultânea e por o imunogénio derivar de um vírus ou de um microorganismo e um reforço do imunogénio ser'dado ao mamífero ou ave. 27â. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por o imunogénio ser uma vacina compreendendo uma substância antigénica seleccionada de entre as seguintes: vírus, bactéria, fungo, levedura e célula tumoral.
28- Método para aumentar a resposta de células T num ser humano ou outro mamífero exposto a um imunogénio, em que o referido indíviduo apresenta uma actividade insuficiente de células T auxiliares ou T citolíticas, caracterizado por compreender a administração ao indíviduo de uma quantidade eficaz de hormona de crescimento, sendo a quantidade eficaz para aumentar a actividade de células T auxiliares ou T citolíticas. 5 .V- -Ψ

29ã. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizado por a referida hormona de crescimento conter mais de dois e menos de 10 polietilenoglicóis ligados covalentemente.. 30s. - Método de acordo com a reivindicação 29, carac-terizado por a referida hormona de crescimento conter mais de .dois e menos de 10 polietilenoglicóis.
313. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizado por a referida hormona de crescimento ser hormona de crescimento humana e a referida proteína de ligação à hormona de crescimento ser proteína de ligação à hormona de crescimento humana.
323. - Variante da hormona de crescimento humana, caracterizada por compreender hormona de crescimento humana nativa, em que o polietilenoglicol foi ligado covalentemente a um ou mais dos seguintes aminoácidos: Metionina 1, lisina 38, lisina 41, lisina 70, lisina 140, lisina 145, lisina 158 e lisina 168. Lisboa, 26 de Junho de 1992

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