FI60567B - Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents
Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning Download PDFInfo
- Publication number
- FI60567B FI60567B FI2099/73A FI209973A FI60567B FI 60567 B FI60567 B FI 60567B FI 2099/73 A FI2099/73 A FI 2099/73A FI 209973 A FI209973 A FI 209973A FI 60567 B FI60567 B FI 60567B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gel
- capa
- fraction
- cancer
- process according
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 108
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 80
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 59
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- -1 leuoin Chemical compound 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 2
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 238000012936 correction and preventive action Methods 0.000 description 86
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 8
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 7
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N diphenylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 101001041010 Conus radiatus Iota-conotoxin RXIA Proteins 0.000 description 1
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 1
- 241000948897 Ploceus cucullatus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 1
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
[mΓβΙ Μ1ν KUUUUTUSJULKAISU /ne/;'? «Tj IB] <11>UTLÄGGNINGSSKRIFT bUbt t ^(45) Patentti myönnetty 10 02 1932 Patent «eddelat (51) Kv.ik?/int.ci.3 C 07 G 7/00. A 61 K 39/00, - ; G 01 N 33/16 SUOMI —FINLAND (21) P»t*nttlh«k*mu» — Puuntamaknlnc 2099/73 (22) HakamtopUv· — AiwOknlnpdif 29-06.73 ^ (23) Alkuplhrt—Gllti|h«t*J*| 29-06-73 (41) Tulkit |utklMksl — Bllvlt offuntllg 11-01-7^ _ ' . (44) Nlhtlvliulpunon ja kuuLJullultur pvm. — „ , „
Patent- och registerttyrelsen v Antökan utlagd och utl.tkrlft«n publktrad 30.10.81 (32)(33)(31) Pyydetty «uoikous -Bajlrd prloriut 10-07-72 USA(US) 270273 (71) AB Bonnierföretagen, Torsgatan 21, S-105 UU Stockholm, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Knut Bertil Björklund, Bromma, Ruotsi-Sverige(SE) (7^+ ) Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab (5^+) Syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste ja menetelmä sen valmistamiseksi - Preparat för användning vid diagnostisering av kancer och förfarande för dess framställning
Toistuvasti on yritetty osoittaa kasvainreaktiivisten vasta-aineiden läsnäolo seerumeissa, joita on saatu eläimistä, joille on annettu ihmisen syöpäkasvainpreparaatteja. Jos tällaiset kokeet olisivat aina toistettavia, tämä olisi osoitus siitä, että ihmisen syöpäkudoksessa esiintyy tärkeitä antigeenejä, joita ei ole normaaleissa kudoksissa, ja voisi siten johtaa neoplastisen prosessin luonteen parempaan ymmärtämiseen. Syöpäsairauksien paremmaksi ymmärtämiseksi ihmisen syöpäkudosta on tutkittu monospesifisen, syöpäkudoksessa läsnäolevan.antigeenin olemassaolon toteamiseksi ja ennen- , kaikkea on pyritty toistettavan menetelmän aikaansaamiseen tämän antigeenin eristämiseksi ja puhdistamiseksi.
Paksunsuolen ja ruuansulatusjärjestelmän adenokarsinoomaan liittyvien antigeenien läsnäolon ovat osoittaneet Gold et ai: : J. expt. Med. 121 (1965) 439-462 ja J. expt. Med. 122, (1965) 467- ! 487. Näissä julkaisuissa viitataan B. Björklundin aikaisempiin j töihin, joissa on osoitettu että on olemassa sellaista ihmissyövän 1 yhteydessä esiintyvää antigeeniä, joka on yhteinen pääosalle kaikista ί i .. . ... j -2- 60567 tunnetuista epiteelistä alkuperää olevista pahanlaatuisista kasvaimista, Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1966, 8, 179 ja Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1958, 12, 24-1.
US-patenttijulkaisussa 5 665 684- selitetään karsinoembryonaalinen j antigeeni, jolla on nk. "CEA-aktiviteettia". Tämä antigeeni on i i kuitenkin täysin erilainen kuin tämän keksinnön mukaisessa valmis- ' teessä käytettävä antigeeni, joka on syöpäkudoksessa läsnäoleva polypeptidiantigeeni, eli CAPA, ja tämän erilaisuuden osoittamiseksi esitetään seuraavassa yhdistelmä tietyistä konkreettisista erilaisuuksista sekä antigeenin eristysmenetelmässä että antigeenin ominaisuuksissa. !
CEA CAPA
Lähde: syöpä paksusuolessa Lähde: kaikki syöpätyypit, syöpä- sikiö (lapsenpihka, suoli) solulinjat in vitro, istukka.
(sikiössä vähän jos lainkaan)
Uutto antigeenipitoisista kudok- Kudosten pesu vedellä neutraalis-sista glykoproteiiniliuottimelJ sa pH:ssa, uutto etyylieetterillä la alhaisessa pHrssa huoneailäm- (mahd.), uute hyljätään, kiinteiden
Potilassa: uute otetaan talteen aineiden uutto korkeassa pH:ssa
(9,5), uute otetaan talteen, lämpötila vesikäsittelyssä : £ 0°C
Isoelektrinen piste: ei ole il- Isoelektrinen piste: noin 5 moitettu tai ei esiinny (ennen loppuvaihetta) UV-valon absorptio 280 nm:ssa UV-valon absorptio 250 nm:ssa (hyvin pieni 280 nm:ssa)
Fluoresenssi : ei mainita Fluoresenssi: aktivoituminen 288 nm:ssa. Säteily 550 nm:ssa
Molekyylipaino 200 000 (voi olla -Molekyylipaino 25 000 ± 2 500 niinkin alhainen kuin 70 000)
Aktiivinen neutraalissa pH:ssa Tuhoutuu neutraalissa pH:ssa
Sisältää sokeria (Glykoproteiini) Ei sokeria kaasu-nestekromatogra- fi- ja raassaspektrografi-analyysien mukaan
Ei CAPA:n vasta-aineiden inhiboi- Inhiboi spesifisen vasta-aineensa tumista hemagglutinaatiokokeessa hemagglut.inaatiokokeessa
Ei saa aikaan parkkihapol.la käsi- Saa aikaan näiden verisolujen teltyjen lampaan punaverisolujen merkitsemisen merkitsemistä -3- 60567
CEA CAPA
Esiintyy syöpäsairauksissa muuta- Esiintyy seerumissa välillä 0,09-mista nanogrammoista 100-200 na- 9 yg/ml (vastaa 90-8000 ng/ml) nogrammaan ml kohti olevissa pi- olevissa pitoisuuksissa, eli noin toisuuksissa 20 kertaa suuremmissa pitoisuuk sissa kuin CEA .
Testimenettely: kallis, aikaa- Helppo, nopea, halpa, ei isotoop- vievä, vaatii radioaktiivisia peja, ei tarvita kallista kalus- isotooppeja toa Käytännöllistä ja kaupallisesti käyttökelpoista menetelmää antigeenin eristämiseksi per se ei tähän mennessä ole saatu aikaan, eikä antigeenin yhteyttä erilaisiin syöpäsairauksiin ole selvitetty. Niinpä tähän mennessä ei ole ollut mahdollista eristää ja karakterisoida ihmissyövän yhteydessä esiintyvää antigeeniä käytännöllisillä ja toistettavilla menetelmillä, eikä myöskään ole ollut mahdollista määrittää tai edes osoittaa antigeenin läsnäoloa piileviä tai todettuja syöpäsairauksia potevien henkilöiden veressä diagnostisella testillä, joka sopii suurimittakaavaiseen tutkimukseen.
Jotta kasvaimessa esiintyvälle antigeenille spesifisten vasta-aineiden läsnäoloa eläin-antiseerumeissa voitaisiin käyttää hyväksi diagnostisesti on kehitettävä testi, joka osoittaa kasvain-antigeenin läsnäolon potilaan veressä. Tähän mennessä tunnetut menetelmät eivät ole osoittautuneet tehokkaiksi varman syöpädiagnoosin tekemiseksi.
Keksinnön tarkoituksena on näinollen saada aikaan syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste, joka sisältää ihmisen syöpä-kudoksessa läsnäolevaa antigeeniä, sekoitettuna stabiloivan määrän kanssa inerttiä proteiiniä, kuten albumiinia, sekä tällaisen valmisteen valmistusmenetelmä,ja keksinnön tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.
Kuten jäljempänä selityksessä statistisista tutkimuksista selviää, sisältävät syöpäkasvaimet tyypistä ja sijaintipaista riippumatta CAPA:a ja tämä CAPA on yhteinen kaikille tunnetuille syöpätyypeille .
M» 60567
Aine, jolla on CAPA-aktiviteettia, eristetään ja puhdistetaan , homogenoimalla ruumiinavauksista saatuja pahanlaatuisia kudoksia, jolloin eri tyyppisiä ja eri paikoista peräisin olevia karsinooma- j j kudoksia kerätään kasvainvarastoksi ("pool"). Esimerkkeinä tutki- j tuista syöpätyypeistä mainittakoon paksusuoli-, peräsuoli-, keuhko-, ruokatorvi-, vatsa-, haima-, munuais-, virtsarakko-, rinta-, kohtu-, ! munasarja-, maksasyöpä, leukemia. Vaihtoehtoisesti lähtöaineina . i voidaan käyttää kudosta ihmisistukasta tai pahanlaatuisia solu- j viljelmiä in vitro (tällaisista viljelmistä tarkemmin katso B. <
Björklund, V. Björklund ja I. Hedlöf, J. Nat. Cancer. Instr. 26: 1961, "Antigenicity of»Pooled Human Malignant and Normal Tissues hy Cytoimmunological Technique. III. Distribution of Tumor Antigen"). Myös normaalikudoksia kerätään samanaikaisesti pahanlaatuisten kudosten kanssa. Kuviossa 1 on esitetty uusi testimenetelmä käyttökelpoisen puhtaan antigeenin eristämiseksi. Biokemiallisten erotusmenetelmien soveltamista ohjattiin näin ollen herkällä immunologisella määritysmenetelmällä, jolla pystyttiin havaitsemaan alle 1 ng (nano-gramma) suuruisia antigeenimääriä. Kuvion 1 mukaisen määritystekniikan suurin ansio on sen selektiivisyys. Verrattavien uutteiden erot antigeenivaikutuksessa määritettiin mitättömien samanlaisuuksien muodostamaa taustaa vasten, jolloin määritysjärjestelmä toimii feedback-kontrollina sarjassa kemiallisia menetelmiä, joita vaihdeltiin niin, että saatiin 1. kasvainfraktio, jolla oli maksimaalinen antigeeninen reaktivi-teetti normaalien antigeenien absorboimien anti-kasvainseeru-mien kanssa; 2. kasvainfraktio, jolla oli minimaalinen antigeeninen reaktivi-teetti kasvain-antigeenien absorboimien anti-kasvainseerumien kanssa. Lisäkontrollin vuoksi valmistettiin myös kasvainfrak-tioita, joilla oli minimaalinen reaktiviteetti normaalien tai kasvainantigeenien absorboimien anti-normaalien seerumien kanssa.
Karsinomakudosta ja normaalia kudosta sekoitetaan jäätyneinä erikseen veteen, jonka lämpötila on noin 0°C, ja homogenoidaan kehittämättä liikaa kitkalämpöä, joka aiheuttaisi asianomaisen CAPA:n inaktivoitumisen. Suspension lämpötilan ei saa antaa nousta yli noin 0°C.
Saatuun nestemäisen homogenaatin ja kiinteiden aineosien kylmään seokseen sekoitetaan orgaanista liuotinta, joka pystyy liuottamaan lipidejä, kuten neutraaleja rasvoja, esimerkiksi asetonia tai — 5 - 60567 etyylieetteriä, alle noin 0°C:n lämpötilassa, jonka liuotinkäsit- · telyn tarkoituksena on poistaa mm. lipidiaineet ja saattaa antigeeniset ryhmät alttiimmiksi käsittelylle. Kiinteät aineet erotetaan seoksesta, sopivasti sentrifugoimalla, ja vesi- ja liuotinkerrokset hylätään. Lämpötila ei saa nousta yli noin + 4°C.
Talteenotetut kiinteät aineet lyofilisoidaan ja lyofilisoitu kudosjauhe jauhetaan, esim. ruostumatonta terästä olevassa kuula-myllyssä, alhaisessa, mieluimmin alle noin 0°C:n ja sopivasti alle noin -70°C:n lämpötilassa. Jauhamalla saadaan hienoa, harmaanruskeata jauhetta.
Saatu jauhe voidaan haluttaessa uuttaa jollakin suolaliuoksella, kuten fysiologisella keittosuolaliuoksella, neutraalissa pH:ssa, alhaisessa, sopivasti noin 0°C:n lämpötilassa ja sentrifugoida, jonka jälkeen sakan päällä oleva neste hylätään. Näin saatu liete voidaan suspensoida uudelleen kylmään veteen, jolloin sakka otetaan talteen ja lyofilisoidaan. Saatua jauhetta voidaan säilyttää' vuosikausia suljetuissa pulloissa noin 4°C:ssa.
Kun edellämainittuja polypeptidipitoisia kasvain- ja normaali-jauheita uutetaan vedellä alkalisessa pH:ssa, uutteet tulevat sameiksi kun niihin lisätään NaCl:a neutraalissa tai lievästi alkalisessa pH: ssa. Tämä sameus johtuu pääasiassa nukleiinihappotyyppisten epäpuhtauksien läsnäolosta. Suolaliuoksella käsiteltyjen uutteiden sentrifug-oimisen jälkeen kaikki aktiiviteetti jää kirkkaaseen, sakan päällä olevaan nesteeseen. Tämä neste voidaan isoelektrisesti saos-taa happamassa pH: ssa, sopivasti pH:ssa noin t,8, ja saadut sakat liuottaa fosfaatilla puskuroituun vesiliuokseen, jonka pH on noin 7»0.
Edellä selitetyllä menettelyllä saadut liuokset suodatetaan sopivalla helmimäisellä molekyyl.iseulatyyppisellä geelillä, jolla g voidaan fraktioida yhdisteet, joiden molekyylipaino on 10*10 :sta 20*10^:een, erityisesti noin 15*10^, jolloin suodatusgeeli eluoidaan puskurilla, jonka pH on likimäärin neutraali, ja molekyylipai.no-fraktio 10-10^ — 20*10^, erityisesti noin 15*10^, otetaan talteen. Geeli eli molekyyliseula voi olla polyakryyliamidigeeli, ristikytketty dekstraanigeeli, agar- tai agaroosigeeli tai vastaava, geeli tai molc-kyyliseula, kuten esim. Bio-Gel A~50m (kauppanimi agaroosigeelille jota valmistaa Bio-Rad Laboratories, Munchen, Saksa-BRD; 100-200 mesh (0,1^9-0,074 mm) erotusraja 30*10^ daltonia, fraktioimisalue 10^ — 90-106 daltonia, likimääräinen agaroosipitoisuus 2 %) tai Sepharose 2B (kauppanimi agaroosigeelille jota valmistaa-Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi; 60-300 mikronia, helmiä, fraktioim.i.s- ~6' 60567 5 6 alue 10 — 20-10 , likimääräinen agaroosipitoisuus 2 %), ja
geeli tasapainotetaan sopivalla puskuriliuoksella, jonka pH on noin 7,0, kuten Sörensen'in puskurilla (1/15 N puskuriliuos, joka I
perustuu natrium- ja kaliumfosfaatteihin), laimennettuna suhteessa j 1:10. Tähän geelisuodatukseen käytetyn seulan eli geelin tyyppi ei j ole kriittinen, ja ainoa vaatimus tässä suhteessa on se, että sen on ^ pystyttävä saamaan aikaan edellä mainitulla molekyylipainoalueella olevien yhdisteiden fraktioiminen. Vielä eräs keksinnön tarkoitukseen käyttökelpoinen geeli on Bio-Gel A-150m (Bio-Rad Laboratories; 100-200 mesh, erotusraja 1^0-10^ daltonia, fraktioimisalue 10^ — >150-10^ daltonia). Lisätietoja geelisuodatustekniikasta saa H. Determann'in teoksesta "Gelchromatographie" , Springer. Verlag, Berliini,
Heidelberg, New York 1967· Suodatukseen käytetty eluentti on puskuri-liuos, jonka pH on noin 7, ja eluaatissa antigeeniaktiviteetti on siinä fraktiossa, joka sisältää mainitun molekyylipainoalueen ja joka otetaan talteen.
Edellä selitetystä geelisuodatuksesta saadut saostetut aktiiviset fraktiot liuotetaan sopivaan puskuriin, jonka pH on noin 7,0, kuten Sörensen'in puskuriin, laimennettuna suhteessa 1:10, ja saadut liuokset suodatetaan kolonnin läpi, joka on täytetty molekyyliseula-tyyppisellä heikolla ioninvaihtogeelillä, jolla on heikot ioninvaihto-ominaisuudet, esimerkiksi jollakin polyakryyliamidi-geelillä, kuten Bio-Gel P-2:lla (määritellään jäljempänä), ja kolonni tasapainotetaan samanlaisella puskurilla, jonka pH on noin 7,0. Fraktioksi, jolla on antigeeniaktiviteettia, todetaan liuoksen se fraktio, joka poistuu kolonnista ensimmäisenä, ja tämä fraktio otetaan talteen.
Edellä selitetystä Bio-Gel P-2:11a suoritetusta kromatograflasta talteenotettua fraktiota käsitellään sitten CAPA:n edelleen puhdistamista varten. Periaatteessa tässä käsittelymenetelmässä on seuraa-vat vaiheet: proteiinien tai konjugoitujen proteiinien seos saoste-taan säätämällä pH isoelektriseen pisteeseen. Näin saatu sakka sekoitetaan sopivaan geeliin, joka valitaan kyseessä olevan proteiinin mukaan. Näin saatu sakan ja geelin seos kerrostetaan kolonnin yläpäähän joka sisältää samaa geeliä samassa isoelektrisessa pH:ssa, so. siinä pH:ssa, joka on isoelektrinen proteiinien saostamiseksi edellisessä vaiheessa. Kolonni eluoidaan sitten vähitellen suurentaen tai pienentäen pH-arvoa. Eluaatista otetaan talteen se fraktio tai ne fraktiot, jotka sisältävät haluttua proteiinia tai proteiineja. Vaikkakaan tätä menetelmää ei haluta sitoa mihinkään nimenomaiseen teoriaan, pidetään todennäköisenä, että pxOteiiniseoksen erottuminen eri. molekyyliinjeihinsa on selitettävissä seuraavasti: - 7 - 60567
Seostetut proteiinit joutuvat ionivirtaukselle alttiiksi, joka saattaa yhden proteiinin toisensa jälkeen liukenemaan. Eri proteiinien solubilisoi-miseksi tarvittava aika riippuu ioniväkevyydestä, pHrsta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta. Koska kunkin liuenneen proteiinin jakaantumis-kerroin on alempi kuin ionigradientin jakaantumiskerroin, proteiini liikkuu geelissä nopeammin kuin ionigradientti. Tämän johdosta proteiini saostuu uudelleen ja jää liikkumattomaksi, kunnes sen liuottaa uudelleen lähestyvä ionirintama. Tämä prosessi toistuu lukemattomia kertoja saaden aikaan toisiinsa nähden vain hiukan poikkeavien molekyylilajien erottumisen toisistaan.
Bio-Gel P-2 on ristikytketty polyakryyliamidi (100-200 mesh), jonka molekyylipainon erotusraja on noin 2000, mutta tämä erotusraja ei ole kriittinen. Muita käyttökelpoisia geelejä ovat risfcikytketyt dekstraanigeelit, kuten Sephadex G-25, jonka molekyylipainon erotus-raja on noin 25000, mutta tämäkään erotusraja ei ole kriittinen. Nämä geelit ovat molekyyliseulatyyppisiä ja niitä käytetään tavallisesti helmimäisinä. Mitä tahansa tällaista molekyyliseulatyyppistä geeliä, jonka molekyylipainon erotusraja on vähintään noin 2000-3000, voidaan tyydyttävästi käyttää. Molekyyliseulatyyppisiä geelejä, jotka sopivat geelisuodatukseen tämän gradienttieluoinnin yhteydessä on seli- ! tetty Gellotte'n artikkelissa "Fractionation of Proteins, Peptides and Amino Acids by Gel Filtration", teoksessa "New Biochemical Separations", Van Nostrand, London/New York, 1964.
Edellä mainitusta kromatografoinmsta talteenotetuille normaalille ja CAPA-fraktiolle suoritetaan aktiivisen aineen saostus pHrssa i i noin 5, jolloin sakka otetaan talteen ja liuotetaan veteen, jonka pH on noin 8,5· Kirkkaiden liuosten pH saatetaan sitten happamalle puolelle sopivasti arvoon noin 5,0 muurahaishapolla,.mistä aiheutuu saostuminen. Kukin sakka sekoitetaan samanlaiseen geelilietteeseen kuin edellä, ja joka on saatettu tasapainoon HCOOH-HCOONH^r11a pH:ssa noin 5,0. Klikin seos siirretään sitten edellisen mukaisesti tasa- |
painotetun geelikolonnin yläpäähän. I
Sakkojen eluoimiseen käytetään pH-gradienttia, tässä tapauk- j sessa progressiivisesti alenevaa pH:ta. Sopiva puskurijärjestelmä on HCOOH-HCOONH^ tai NH^HCO^-NH^. Antigeeniaktiviteettia esiintyy eluaatissa alkuperäisen pH:n ja pH-arvoon noin 3 välillä.
Edellämainitulla pH-alueella talteenotettu eluaattifraktio j sisältää halutun CAPA:n, joka voidaan ottaa talteen kylmäkuivaarnalla. Mainitun eluaattifraktion CAPA:n molekyylipainon määrittämiseksi i fraktio voidaan suodattaa geelikolonnilla, joka on tasapainotettu HCOOH-HCOONH^r11a pHrssa noin 3,0, jolloin geeli on jokin edellä- m -8- 60567 mainituista geeleistä. Bio-Gel P-30 (kauppanimi polyakryyliamidi-geelille, jota valmistaa Bio-Rad Laboratories, Munchen, Saksa-BRD; 100-200 mesh, erotusraja 40000 daltonia, fraktioraisalue 2500-40000 daltonia) ja Sephadex G-75 tai G-50 (kauppanimi dekstraani-geeleille, joita valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi; 40-120 ja 50-150 mikronia, fraktioimisalueet 3-70000 ja vastaavasti 1-30000) ovat erityisen sopivia geelejä tähän suodatukseen. Eluoi- j dut CAPA-fraktiot joiden spektrofotometrinen absorptiohuippu on ' aaltopituus-alueella noin 229 - noin 233 nm ja molekyylipaino välillä ; 20000-27000, otetaan talteen.
CAPA voidaan ottaa talteen aktiivisesta fraktiosta suodatuksen jälkeen kylmäkuivaamalla ja voidaan säilyttää pitkän aikaa tyhjössä, kylmässä ja pimeässä.
Eristetty aine koostuu polypeptidista, joka perustuu yksinker- ! täiseen peptidiketjuun, mikä voidaan osoittaa permuurahaishappokäsit- ; telyllä. CAPA reagoi emäksisesti ja se on liukoinen pH-välillä noin ; 1-3,5- Suojaamaton polypeptidi denaturoituu palautumattomasti neutraalissa pH:ssa, s.o. pH:n ylittäessä noin 4,5- Antigeeni on hygroskooppinen, muuttuu keltaiseksi, inaktivoituu ja tiilee tahnamaiseksi kostuessaan.
Puhdistettu CAPA sisältää fluorisoivan ryhmän joka aktivoituu noin 288 nm:n aaltopituudessa ja lähettää valoa noin 350 nm:n aaltopituudessa. Fluoresenssi on suhteellinen CAPA:n määrään, joten sitä voidaan käyttää polypeptidin läsnäolon määrittämiseen sen eristämis-vaiheen aikana.
CAPA:11a on spektrofotometrinen absorptiohuippu aaltopituus-alueella noin 229-233 nm. Sillä on voimakas taipumus aggregoitumioeen eikä se ole suodatettavissa normaaleilla steriloimisessa käytetyillä suodatuskeinoilla. On osoitettu, että CAPA on peräisin syöpäsolujen seinämistä, koska vasta-aineet, joita on kehitetty ruiskuttamalla CAPA:a elävän eläimen kehoon, aiheuttavat syöpäsolujen täydellisen lyysin eli hajaantumisen in vivo kun nämä solut joutuvat näiden vasta-aineiden vaikutukselle alttiiksi.
Niin kuin edellä on mainittu, polypeptidin molekyylipaino on välillä 20000-27000, tarkemmin sanottu noin 24000. Analyysit osoittavat, että se ei sisällä hiilihydraatteja, ja spektrofotornetria osoittaa että siinä ei ole nukleiinihappoja. Aminohappo-analysaattorilla sekä hapetusta käyttäen että sitä käyttämättä suoritetut analyysit varmistavat sitä molekyylipa inoa, joka on määrätty suodattamalla Bio-Gel P-30:11a tai vastaavalla geelillä.
Eristettyä CAPA:a voidaan käyttää moniin ta rkoituksiin, kuten 60567 • - 9 - monospesifisten vasta-aineiden valmistukseen, diagnostisiin tarkoituksiin, immunoimismenetelmiin, ja aktiivisena aineosana seoksiin, joita voidaan käyttää immunoimiSaineina.
Antigeenin aktiviteetti in vitro neutraaleissa pH-arvoissa säilytetään kompleksoimalla CAPA:a jonkin inertin proteiinin, kuten ihmis- tai nauta-albumiinin kanssa, jolloin saadaan muodostetuksi kompleksi, joka on liukoinen neutraalilla pH-alueella samalla kun se säilyttää antigeenin aktiviteetin in vitro.
Syöpädiagnoosia varten on kehitetty modifioitu hemagglutinaatio-inhibitiotekniikka. Tällä tekniikalla voidaan määrittää CAPA.-n läsnäolo syövän eri kehitysvaiheissa tutkimalla esimerkiksi potilaan seerumia, kudoksia, eritteitä ja uutteita elävistä eläimistä, myös esimerkiksi ruuminavaus- ja leikkausnäytteitä, punktioita ja sively-valmisteita. Tämä modifioitu hemagglutinaatioinhibitiotekniikka käsittää menetelmän, jossa on seuraavat vaiheet: a) tutkittavasta aineesta valmistetaan sarja näytteitä laimennus- sarjana ; b) jokaiseen näytteeseen lisätään ennaltamäärätty määrä anti-seerumia, joka sisältää CAPA:an nähden spesifisia vasta-aineita; c) inkubaation jälkeen jokaiseen inkuboituun näytteeseen lisätään ennaltamäärätty määrä CAPA:a, käyttäen hienojakoista kantaja- ainetta ; d) näin saatua käsiteltyjen näytteiden sarjaa verrataan sarjaan vertausnäytteitä, joissa on pienenevät, tunnetut inhibition aikaansaavat määrät CAPA:a ja ennaltamäärätyt määrät mainittuja vasta-aineita sisältävää antiseerumia, ja sen jälkeen jokaiseen näytteeseen lisätään ennalta määrätty määrä CAPA:a samaa hienojakoista kantaja-ainetta käyttäen; ja e) verrataan mainittua näytesarjaa ja mainittua vertausnäyte- - 10 - 60567 sarjaa tutkittavan aineen sisältämän CAPA-määrän määrittämiseksi ja syövän osoittamiseksi ja sen kehitysvaiheen selville saamiseksi.
Sanonnalla "eläviä eläimiä" ymmärretään tässä selityksessä myös ihmistä.
Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla. Esimerkki Λ- ·
Puhtaan antigeenin eristäminen
Koska on osoitettu (Int. Arch. Allergy 56; 191-205 (1969), "Systematic Antigenic Change in Human Carcinoma Tissues by Hemagglutination Techniques", kirj. B. Björklund), että suurin osa syöpäkudok-sesta sisältää tämän keksinnön mukaisessa valmisteessa käytettävää antigeeniä, eri tyyppisiä ja eri paikoista peräisin olevia syöpäku-doksia kerättiin kasvainvarastoksi eli pooliksi. Tässä tapauksessa pooli koostui makroskooppisesti puhtaista, histologisesti' verifioiduista syöpäkudoksista, jotka olivat peräisin seuraavista elimistä t (ruumiinavauksista): rinta, keuhkoputki, umpisuoli, paksusuoli, pohju-kaissuoli, sappirakko, munuainen, kurkunpää, maksa, keuhko, ruokatorvi, munasarja, haima, eturauhanen, peräaukko, maha, emä. Normaaleja kudok-siä kerättiin lukuisilta yksilöiltä isoantigeeni-, kudosant.igeeni- ja yksilöantigeenipoolin muodostamiseksi. Käytettiin ruumiinavaustapauk-sia, ja kasvaindiagnoosit todettiin histologisesti. Lisäksi varmistettiin immunologisen ristireaktiviteetin perusteella tuoreiden kasvainkudosten ja elävien kasvainsolujen kanssa että asianomainen kas-vainantigeeni oli vahingoittumaton. Aseptisuutta ylläpidettiin aina kun se oli mahdollista. Ruumiinavauksista saadut syöpä- ja normaali-kudokset leikattiin puhtaiksi naapurikudoksesta ja paloiteltiin 2-5 cm:n kuutioiksi, joita pestiin 0,9 % NaCl:ssa 0°C:ssa, kunnes niistä ei enää lähtenyt veriväriä. Pestyt kuutiot jäädytettiin ja säily- ! tettiin -24-°C:ssa.
Vielä jäätyneinä kudoskuutioihin sekoitettiin 10 ml Η£θ 0°C:ssa kutakin jäätyneen kudoksen grammaa kohti, ja homogenoitiin jäähdytetyssä MSE Ato-^Mix-homogenoimislaitteessa (Measuring and Scientific Equipment Ltd, Lontoo, Englanti).
jossa oli pyörivät terät, "puolella nopeudella", kolmen kulloinkin yhden minuutin pitkän jakson aikana. Tässä yhteydessä huomattakoon, että suspension lämpötila on pysytettävä noin 0°C:ssa, mieluimmin hiukan sen alapuolella.
- 11 - 60567
Kylmä homogenaatti kaadettiin kylmiin 1000 ml:n polyeteeni- pulloihin, 4-00 ml suspensiota ja 400 ml etyylieetteriä -20°C:ssa (Aether ad narcosin pH Nord." sis. 0,002 % difenyyliamiinia, Skanska
Bomullskrutfabriken AB:lta, Dösjebro, Ruotsi) sekoitettiin kussakin pullossa ja hämmennettiin -2°C:ssa 120 minuuttia International PR-2 sentrifugi-täristyslaitteessa (international Equipment, Needham Ltd, Mags, USA) moottorin , . , . ,. _ , , . _ pyöriessä nopeudella 300 kierrosta minuutissa. Seosta sentnfugoi- tiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 5 minuuttia. Tämän vaiheen aikana lipidi-kerros ei sekoitu kudoskerroksen kanssa. Etyylieetteri ja lipidi-kerros hylättiin, ja uutettiin toisen kerran 60 minuuttia, sentrifu-goitiin 5 minuuttia, ja eetteri-lipidikerros poistettiin. Lopuksi sentrifugoitiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 30 minuuttia, ja vesikerros poistettiin, vaikka se sisälsi jonkin verran CAPA:a. Jäljellä olevat liukenemattomat aineet otettiin talteen. Jäljellä oleva etyylieetteri poistettiin käyttämällä alipainetta 5 minuuttia.
Antigeeniä sisältävä aines suspendoitiin 50 ml:aan HpO 0°C:ssa, siirrettiin 500 ml:n infuusiopulloihin ja jäädytettiin -70°C:ssa kuivajäällä ja etanolilla.
Lyofilisomti suoritettiin Texvac Type IV A lyofilisaattorissa (Textor, Bad Soden, Taunus, Saksa-BRD), säädetyssä lämpötilassa.
Lyofilisoitua kudosjauhetta jauhettiin ruostumatonta terästä olevassa kuulamyllyssä ("Cytolator", Lars Ljungberg Company, Tukholma, Ruotsi) noin -70°C:n lämpötilassa 1 tunti nopeudella 4-0 kierrosta minuutissa. Jauhamalla saatiin hienoa, harmaanruskeaa jauhetta. Tätä jauhetta uutettiin esijäähdytetyllä etyylieetterillä -2°C:ssa PR-2 tärytyslaitteessa nopeudella 300 kierrosta minuutissa 60 minuuttia ja sentrifugoitiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 30 minuuttia. Eetterdkerros poistettiin ja sedimentti kuivattiin tyhjössä. Saatua raakaa kudos-jauhetta (CTP) voidaan säilyttää vuosikausia 4-°C:ssa suljetuissa pulloissa aktiviteetin mainittavasti alenematta.
5 g CTP:tä suspendoitiin pH-arvon ollessa neutraali 500 ml:aan suolaliuosta, joka sisälsi steriilejä jääkuutioita. Suspensio homogenoitiin'MSE Ato-mix:issä "puolella nopeudella" kolmen, kulloinkin yhden minuutin pituisen jakson aikana. Lämpötila pysytettiin 0°C:ssa. Seos pidettiin 0°C: ssa 30 minuuttia samalla hitaasti hämznentäen. Sentrifugoi ti in 1000 x G:ssa 0°C:ssa 4-0 minuuttia. Sakan päällä oleva neste hylättiin.
Cod imeniti suspendoitiin uudelleen 500 ml:aan kylmää, tislattua vettä ja hämrncnnettiin hitaasti 0°C:ssa 30 minuuttia. Sontrifu-goitiin 1000 x G:ssa 0°C:ssa 40 minuuttia ja sakan päällä oleva neste hylättiin. Jäljellä oleva sedimentti suspendoitiin 25 ml:aan kylmää tislattua vettä ja jäädytettiin -70°C:ssa (kuivaiäätä ja _ 12 _ 60567 etanolia). Lyofilisoimalla saatiin pesty kudosjauhe (WTP), jota voidaan säilyttää vuosikausia suljetuissa pulloissa 4°C:ssa.
Valmistettiin vesiuutteet CAPA:sta ja normaalista WTP:stä pH:ssa 9,5 ja väkevöitiin 10 kertaisiksi isoelektrisellä saostuksella ; pH: ssa 4,8 ja liuottamalla sakka pH:ssa 9,5 kymmenesosaan käytetyn j veden tilavuudesta. Saatu väkevöity liuos stabiloitiin lämmittämällä se nopeasti 98-100°C:n lämpötilaan ja ylläpitämällä tämä lämpötila 5-10 minuuttia. Tämä lämpökäsittely hävittää entsyymit, jotka muutoin inaktivoisivat CAPA:n. Stabiloitu uute tuli sameaksi kun siihen lisättiin suolaliuosta pH:ssa 7,5, jäljellä olevien nukleiinihappotyyppis-ten epäpuhtauksien saostumisen johdosta. Näiden jäljellä olevien epäpuhtauksien saostamiseksi saostettiin erikseen 8,0 ml CAPA:a ja normaaleja vesiuutteita lisäämällä 0,8 ml 10 %:sta NaCl-liuosta. Sentrifugoitiin 27000 x G:ssa 0°C:ssa 1 tunti, minkä jälkeen kirkkaat, sakan päällä olevat nesteet saostettiin isoelektrisesti pH:ssa 4.8 (pH säädettiin 0,1-n HC1:11a tai 0,1-n HC00H:lla). Sakat liuotettiin 2-5 ml:aan'M/150-fosfaattipuskuria, pH 7,0.
Näin saadut kasvain- ja normaalista WTP:stä peräisin olevat liuokset suodatettiin jäähdytetyissä Bio-Gel A-50m (joka on määritelty sivulla 5), kolonneissa, joiden sisäläpimitta oli 2,50 cm ja p pituus 138 cm, virtausnopeudella 6,3 ml/cm /h. Geeli tasapainotettiin M/150-fosfaattipuskurilla, pH 7,0, 2 % n-butanolilla, ja eluoitiin samalla puskurilla. Jokaisessa ajossa käytettiin 4-8 ml uutetta, joka sisälsi yhteensä 50-100 mg proteiinia.
Antigeeniaktiviteetti löytyi kasvainuutteen keskifraktiosta.
1,0 ml:n näyteraäärä tästä jakeesta, yhteensä 160-180 ml, laimennettiin kolme kertaa ja saatettiin eri pH-arvoihin välillä 2,0-9,0.
Viiden minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa näytteet siirrettiin kyvetteihin ja niiden valonhajoitus 500 nm:ssa mitattiin 90° kulmassa. Hajoitusintensiteetit piirrettiin pH:n funktiona, jolloin todettiin maksimi pH:ssa 4,8, joka on fraktion isoelektrinen piste. Tämä menettely edustaa uutta tekniikkaa, joka on kehitetty jotta voitaisiin määrittää tarkat ja tarpeelliset olosuhteet CAPA:n puhdistamiselle. Tavanomaista tekniikka isoelektrisen pisteen määrittämiseksi ei voida käyttää alhaisen peptidipitoisuuden takia.
Aktiivisen keskijakeen jäljellä oleva osa saostettiin pH:ssa 4.8 0,1-normaalilla HCl:lla. Sentrifugoitiin 3800 x G:ssa 0°C:ssa 5 minuuttia, jolloin aktiviteetin saanto oli kvantitatiivinen.
CAPA:n edo!Icon puhdistamiseksi sodimentoidut, aktiiviset keskifraktiot viidestä Bio-Gel A-50m-kolonnista liuotettiin M/I5O-fosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH oli. 7,0 (Sorcnsen'Ln puskuri 2 % - u - 60567 n-butanolissa), 5 %:iin alkuperäisestä eluaattitilavuudesta. Tämä liuos, joka sisälsi 130 mg proteiinia 8,5 ml:ssa, suodatettiin (edellä määritellyn) Bio-Gel P-2-kolonnin läpi jonka läpimitan suhde korkeu-teen oli 1/35 virtausnopeuden ollessa 35/cm /h. Kolonni oli tasapainotettu M/150-fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 7,0 (Sorensen'in puskuri 2 % n-butanolissa). Kutakin proteiinin mg kohti sallittiin 10 ml:n kerrostilavuus.
Ensimmäinen fraktio oli aktiivinen ja se eluoitiin eluoimis-puskurilla, jonka pH oli 7,0, samalla kun epäpuhtaudet absorboituivat geeliin käytetyssä alhaisessa ioniväkevyydessä. Aktiivinen aine saos-tettiin pH:ssa 4,8 0,1-M HC00H:lla ja sentrifugoitiin 3800 x G:ssa 0°C:ssa 5 minuuttia. Sedimentti liuotettiin 8,5 mitään vettä ja pH saatettiin arvoon 8,5 0,1-M NH^QH:lla. Kirkas liuos saostettiin uudelleen kolme kertaa 0,1-M HC00H:lla pH:ssa 4,8, pestiin sentrifugissa samassa pH:ssa ja liuotettiin pHrssa 8,5· N-butanolin häviämistä seurattiin kaasu-neste-kromatografiällä. Lopullinen liuos varastoitiin ampulleihin, jäädytettiin ja lyofilisoitiin. Saatu tuote oli kuivaa, melkein valkeaa jauhetta ja tämä jauhe varastoitiin -24°C:ssa evakuoiduissa ja suljetuissa ampulleissa.
Identtistä menettelyä sovellettiin normaalista kudoksesta peräisin olevaan uutteeseen, eikä tällöin todettu aktiviteettia.
Edellä selitetystä kromatografoinnista saadun tuotteen edelleen puhdistamiseksi kehitettiin pH-gradie.ntti-eluointimenetelmä. Tämä menetelmä koostuu periaatteessa seuraavista vaiheista. Proteiiniseos, joka on puhdistettava aktiiviseen komponenttiinsa nähden, saostetaan säätämällä pH isoelektriseksi. .Sakka sekoitetaan sopivaan geeliin kuten Sephadex G-25:een (edellä määritelty) tai Bio-Gel P-2:een (edellä määritelty). Tämä seos kerrostetaan samaa geeliä samassa isoelektrisessä pH:ssa sisältävän kolonnin yläpäähän. Sitten kolonni pH-gradientti-eluoidaan pysyttäen virtausnopeus ja lämpötila vakioina. Kolonni eluoidaan täten väliaineella jonka pH nousee tai laskee jatkuvasti tai portaittain.
Puheena olevassa tapauksessa gradientti-eluointi suoritettiin 15 mg:lie lyofilisoitua, suolatonta CAPA-jauhetta ja aikaisemmin selitetyllä tavalla puhdistettua normaalia anti geen i, jauhetta, tässä tapauksessa alenevaa pH:ta käyttäen. Jauheet liuotettiin erikseen vetoon, jolloin pH asetettiin arvoon 8,5 0,1-n NH^OH:11a. Kirkkaat liuokset saa lottiin sitten pH-arvoon 5,0 0,1-11 1100011:1 la, inistä aiheutui saostuminen. Molemmat sakat sekoitettiin 10 ml:aan Rio-Gel P-2-1ietettä, joka oli tasapainotettu vesiliuoksella joka oli valmistettu 0,02-M HC00H:sta ja 0,02-M HC00NH^:sta niin että pH oli 5,0.
<#r .-,4 - 60567 •Molemmat seokset pantiin 15 ml silikonilla käsitellyn, sisäläpi-mitaltaan 16 mm ja pituudeltaan 150 mm olevan, edellä selitetyllä tavalla tasapainotetun Bio-Gel P-2-kolonnin yläpäähän. Geeliä kannatti pieni määrä lasivillaa.
Sakkojen eluoimiseen käytettiin pH-gradienttia. Gradientti-sekoittimen (Ultrograd, LKB, Ruotsi) avulla pH pysytettiin arvossa noin 5 vähän aikaa sakan pesemiseksi, minkä jälkeen pH vähitellen alennettiin arvoon 2,8. Lopuksi pH korotettiin arvoon 9· Puskurijärjestelmässä oli 0,02-M HCOOH - HCOONH^ ja 0,02-M NH^HCOO^ - NH^, ja eluointi suoritettiin huoneen lämpötilassa. Virtausnopeus pysytes- p täin arvossa 27,1 ml kolonnin poikkileikkauksen cm" kohti tunnissa.
Kasvainuutteen eluaatti analysoitiin fluoresenssi-spektrometri-sesti (aktivoitiin 238 nmrssa, fluoresenssi 550 nm:ssa). Alkuperäisen pH:n ja pH-arvon noin 3 välinen fraktio otettiin talteen edelleen käytettäväksi. Tuote lyofilisoitiin, kylmäkuivattiin, ja varastoitiin suljettuihin, evakuoituihin ampulleihin -24°C:seen.
Molekyylikoon karakterisoimiseksi ja puhtauden varmistamiseksi antigeeniaineen liuos suodatettiin Bio-Gel P-30.:lla (edellä määritelty) joka oli tasapainotettu puskurilla 0,02-M HCOOH - HCOONH^, pH 3,0. pH-eluoitu CAPA liuotettiin pieneen määrään samaa puskuria.
o
Virtausnopeus oli 3,25 ml/cm /h ja kerätyt fraktiot olivat 1,24 ml. Aktiivisilla fraktioilla oli spektrofotometrinen absorptiomaksimi aaltopituudessa 229-233 nm ja fluoresenssi 350 nm:ssa, aktivoituna 283 muissa.
Tyypillisessä ajossa 10,4 mg:sta CAPA:a, joka oli liuotettu 3,0 ml:aan edellämainittua puskuria', saatiin silikonoidusta Bio-Gel •P-30 kolonnista (sisähalkaisija 2,54 cm, pituus 50 cm) talteen sekä aine että aktiviteetti täydellisesti. Eluointitilavuus varmistaa molekyylipainoalueen 22000-24000. Nämä molekyylipainoluvut saatiin vertaamalla eluointitilavuuksia molekyylipainoltaan tunnettujen yhdisteiden, kuten, ribonukleaasin ja insuliinin eluointitilavuuk-siin. Kylmäkuivaamisen jälkeen saadaan valkea, hygroskooppinen jauhe, joka saadaan säilymään kylmässä, hapettomassa ja pimeässä tilassa. Tuotetta analysoitaessa ei löytynyt hiilihydraatteja eikä nukleiinihappoja. Aminohappo-analysaattorilla suoritetut analyysit antoivat geeli suodatuksol.1 a määritettyjen mol ekyyl ipaino j en kanssa yhtäpitävät tulokset. Aminohappo-analyyseillä saatiin seuraavat prosenttiluvut, joiden tarkkuus on ± 5 %· Laskettu molekyylipai.no oli 232ΟΟ ± 25ΟΟ (standardipoikkoama).
_ 15 _ 60567
Alaniinia 8,62
Arginiinia 4-,57
Asparagiinihappoa 10,39
Kysteiinia 0,95
Glutamiinihappoa 17,04
Glysiiniä 6,87
Histidiiniä 1,00
Isoleusiinia 4,75
Leusiinia 10,49
Lysiiniä 3,69
Merioiiniä 1,91
Fenyylialaniinia 2,75
Proliinia 3,79
Seriiniä 7,74
Treoniinia 5,92
Tyrosiinia 3,21
Valiinia 6,36 Tämä aminohappopitoisuus vastaa teoreettista typpipitoisuutta 16,2-17,8 %· Kokonaistypen määritys Dumas'in mukaan viittaa arvoon 17,0 + 0,5 %· •Permuurahaishappokäsittely osoittaa, että tämä poly-peptidi pohjautuu yhteen ainoaan peptidiketjuun. Lisäksi tämä poly-peptidi, ellei sitä suojata albumiinilla kompleksoimaila, denaturoituu palautumattomasti pH-arvossa yli noin 5-
Tarkalleen samalla tavoin kuin edellä on selitetty, polypeptidi valmistetaan ihmisen istukkakudoksesta.
Es imerkki 2: CAPA-albumiinikomoleksin valmistus ..... — -*-- —---------- s
Edellä selitetyn mukaisesti valmistettua CAPA:a liuotetaan muurahaishappoon (esimerkiksi 0,05-M; pH:n on oltava välillä 2-3). Saadaan kirkas liuos. Tähän liuokseen lisätään albumiinijauhetta tai albumiiniliuosta samassa pH:ssa kuin edellämainittu muurahaishappo-liuos (200 paino-osaa albumiinia yhtä CAPA-paino-osaa kohti), jolloin saadaan kirkas CAPA-albumiiniliuos. Sitten liuoksen pH korotetaan hitaasti lisäämällä jotakin emästä (esimerkiksi natriumhydroksidi-tai ammoniakki-vesiliuosta) kunnes pH nousee noin 7,5=een. Tällöin saadaan kirkas liuos, joka sisältää CAPA:n ja albumiinin, kompleksin rnuod ossa .
Tätä liuosta, joka sisältää 12 yg CAPA/ml, voidaan käyttää suoraan jäljempänä selitettävässä diagnoosimenetelmässä, tai kompleksi voidaan eristää valkeana jauheena kylmäkuivaamalla. Jauhe on stabiili kylmässä (f4°C) pitkän aikaa.
60567 - 16 -
Kokeilla on osoitettu, että CAPA-aktiviteetti saadaan maksi-maalisesti hyväksi käytetyksi, kun albumiinin ja CAPArn painosuhde on yhtä suuri tai suurempi kuin noin 200:1.
Esimerkki 3: I
- i
Parkittujen ja merkittyjen punaverisolujen valmistus j
Tuoretta lampaanverta (1 tilavuusosa) lisätään steriiliin Alsever'in liuokseen (1,2 tilavuusosaa) (Alsever'in liuos valmiste- taan 250 g:sta glukoosia, 80 g:sta natriumsitraattihydraattia, <4-2 g:sta NaCl ja vedestä 10 litraan asti ja pH saatetaan arvoon 6,1 10 % sitruunahappo-monohydraatilla). Seos sentrifugoidaan ja puna- , verisolut suspensoidaan uudelleen kerran Alsever'in liuokseen ja i kaksi kertaa puskuriliuokseen jonka pH on 6,8. Lopuksi valmistetaan punaverisolujen suspensio puskuriin jonka pH on 6,8, niin että puna-solupitoisuudeksi tulee 10^ solua/ml.
Yksi tilavuusosa edelläolevan mukaan valmistettua punaverisolu-suspensiota lisätään hämmentäen yhteen tilavuusosaan puskuriliuosta, jonka pH on 6,8 ja joka sisältää noin 18 yg parkkihappoa/ml. Tällä tavoin parkitut punaverisolut sentrifugoidaan ja suspensoidaan madelleen kahdesti puskuriin jonka pH on 7,5· Lopuksi punaverisolut suspensoidaan puskuriin, jonka pH on 7,5 niin, että solupitoisuudek-si tulee 10^ solua/ml.
Edellä selitetyn esimerkin mukaan valmistettua CAPA-kompleksia liuotetaan puskuriliuokseen, jonka pH on 7,5, niin että CAPA-pitoi-suudeksi tulee 3 pg/ml (puhtaana CAPA:ra laskettuna). Yksi tilavuus-osa edellisen kappaleen mukaan valmistettua parkittua punaverisolu-suspensiota lisätään tipoittain 0°C:ssa yhteen tilavuusosaan CAPA-kompleksiliuosta 10 minuutin aikana. Merkityt solut sentrifugoidaan ja suspensoidaan uudelleen puskuriliuokseen jonka pH on 7,5 ja joka sisältää stabiloivan määrän (noin 1,2 til/til) i.nerttiä ihmisen g seerumia, niin että saadaan suspensio joka sisältää 1,6 x 10 merkittyä solua ml kohti. Näitä merkittyjä soluja käytetään, niin kuin jäljempänä selitetään diagnoosimenetelmässä.
Γ VV a 17 - 60567
Esimerkki H:
Diagnostinen menettely a) Yksinkertainen sokeatutkimus
Eskilstunan Keskussairaalasta, Ruotsi, saatiin verinäytteitä, joista 4-2 oli peräisin infektioklinikan potilaista; yksi kirurgiselta klinikalta; kaksi radioterapiasta; 10 näytettä vastasynnyttäneistä äideistä; 10 napanuoraverestä ja 10 naisista, jotka olivat raskaina 1-trimesterissä, ja 6 näytettä naisista, jotka olivat raskaana 2-tri- i i mesterissä. Lisäksi saatiin 20 verinäytettä 10-vuotiaasta lapsesta Slottsskolan'ista ja 10 näytettä vanhemmista, terveistä henkilöistä tri Lundström'in yksityisklinikalta, Eskilstunassa, Ruotsi. Erstan sairaalan kirurgiselta ja sisätautiklinikalta, Tukholma, Ruotsi, saatiin näytteet 44 potilaasta, Akeshov'in sairaalasta saatiin näytteet 45 potilaasta ja Karolinska Sjukhuset-nimisen sairaalan kirurgiselta klinikalta, Tukholma, Ruotsi, saatiin näytteet 72 potilaasta, jotka oli otettu sairaalaan mahdollista leikkausta varten. Karolinska Sjukhuset-nimisen sairaalan verenluovutuskeskus, Tukholma, Ruotsi, antoi käytettäväksi 118 näytettä 20-67 vuoden, keski-iältään 57»2 vuoden (SD ± 11,5 vuotta) ikäisistä luovuttajista, ja sairaaloiden kliinisestä keskuslaboratoriosta saatiin seerumit 29 potilaasta, jotka olivat hoidossa Radiumhemmet'in yleisillä osastoilla ja 12 potilaasta sen gynekologisilta osastoilta.
Verinäytteiden kokonaismäärä oli 451. Eskilstunasta olevat 111 tapausta tutkittiin kliinisesti ja laadittiin sairaskertomus, ei kuitenkaan ilmeisen terveistä yksilöistä. Tukholman tapauksista tehtiin yksityiskohtaiset sairaskertomustutkimukset 101 tapauksessa. j
Muissa tapauksissa esiintyi muita kuin pahanlaatuisia kliinisiä diag-· j noose ja, eikä mitään epäilystä esiintynyt pahanlaatuisissa sairauk- ' sista.
Laskimoveri siirrettiin Wasserman-putkiin ilman lisäainetta ja . lähetettiin laboratorioon, eräissä tapauksissa ensin poistaen hyytymä ja verisolut sentrifugoimalla.
Verianalyysi perustui CAPA:n osoittamiseen modi fioi dull a hemag- glutinaation inhibitiotekniikalla (mikromenetelmä). Periaatteessa i käytettiin seuraavaa menettelyä; ; 25 μΐ potilaan seerumia, joka oli absorboitu punaisiin lampaan ' verisoluihin, titrattiin 8 vaiheessa laimennuksen ollessa 2-kertainen , (kertakäyttöisiä mikrotitrauslevynä) .. ! T.inbro IG-MRC-96 la i mennuslaatoi s 3 a/, minkä jälkeen 25 yi spesifistä j antiseerumia x-ajalaiinennuksessa (noin 1:2000) lisättiin jokaiseen ! Q .... . j kuoppaan. Inkuboitiin 22 C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen jokaiseen j kuoppaan lisättiin 50 yl parkittuja ja eristetyllä, ihmisalbumi.iniin sidotulla CAPArl-la merkittyjä, noin 6-8 miljoonaa punaisia lampaan verisoluja «f» f - is - 60567 sisältävää suspensiota, niinkuin edellä on selitetty (noin 2-4 yg/10^ verisolua).'Muitakin hienojakoisia kantaja-aineita kuten lateksia, bentoniittia ja kollodiumia, voidaan käyttää punaverisolujen sijasta. Reaktiotulos määritettiin kaltevan peilin ja standardisarjan avulla ' 4- 24 tunnin inkubaation jälkeen 1-2°C:ssa. Kontrollia varten käytet- i t iin: 1. CAPA:lla merkittyjä verisoulja ynnä antiseerumia; 2. CAPA:lla merkittyjä verisoluja ilman antiseerumia·;· 3· Potilaan seerumia ynnä ihmisalbumiinilla merkittyjä verisoluja; 4. Potilaan seerumia ja käsittelemättömiä verisoluja; 5- CAPA:lla merkittyjä verisoluja ja vasta-aineita sarjassa, jossa inhibointi saadaan aikaan portaittain pienenevillä, tunnetuilla CAPA-määrillä.
Verisolujen stabiloimiseksi käytetyt laimennusnesteet sisälsivät kerättyä (so. monista yksilöistä yhdistettyä), inaktivoitua, neutraalia ihmisseerumia. j CAPA-reagenssi valmistettiin kerätystä ihmissyöpäkudoksesta ja ! puhdisteltiin niin kuin edellä on selitetty käyttäen geelisuodatusta, j pH-gradientti-eluointia, suodatusta Bio-Gel P-30:n läpi ja kompleksin- ! muodostusta albumiinin kanssa.
Antiseerumina käytettiin hevos-anti-HeLa:a 19 päivältä marraskuuta 1962, joka oli absorboitu normaaliin kudokseen, ja poolattua ihmisseerumia. Immunointi suoritettiin pestyllä HeLa-solumurskalla, mitkä solut oli viljelty litteissä lasipulloissa Eaglen väliaineessa, joka sisälsi 20 % inaktivoitua ihmisseerumia. Solut oli otettu talteen i EDTA:lla, sentrifugoitu ja pesty kolme kertaa vedellä.
CAPA:n läsnäollessa potilasseerumissa hevos-vasta-aineet neutraloituivat, mikä johti agglutinaation poisjäämiseen, kun lisättiin polypeptidilla merkittyjä verisoluja. Arvostelu suoritettiin nousevan asteikon 0-6 mukaan, jossa 0 merkitsi inhibition poissaoloa ja 6 merkitsi agglutinaation maksimaalista inhibitiota. Asteikkoarvojen suhde CAPA:n pitoisuuteen seerumi-ml kohti käy ilmi taulukosta 1, joka on saatu kalibroimalla ennaltamäärättyjen CAPA-määrien laimennuksia neutraalissa seerumissa.
i t { ~ 19 ' 60567
Taulukko 1
Likimääräinen asteikon Ja CAPA-määrän kalibrointi Asteikkoarvo CAPA, p.g/ml 0 0,05 1 0,04 - 0,08 2 0,09 - 0,12 3 - 0,13 - 0,24 4 0,25 - 0,49 5 0,50 - 0,99 6 ' >1,0
Lukeminen suoritettiin tietämättä potilaiden terveydentilaa. Tutkimuksen kohteena ollut aines on ryhmitetty niin kuin seuraavasta taulukosta 2 näkyy.
Taulukko 2 CAPA-pitoisuus 431 seerumissa eri ryhmiin kuuluvista yksilöistä numeroasteikon 0-6 mukaan sekä keskimääräiset asteikkoarvot (M) Ja standardipoikkeamat (SD). "Radikaalisesti" tarkoittaa tässä yhteydessä, että syöpäkudos on pyritty poistamaan täydellisesti.
Ryhmät Numeroasteikko Luku-
_0 1- ?_3_4 8 6. määrä ·Μ_- SD
1. -Primäärisyöpä metastaaseineen 5412 12 3,00 - 1,13 2. Levinnyt syöpä 4214821 22 2,91 - 1,82 3. Radikaalisesti hoitamaton syöpä 6 ίο 15 8 39 1,64 - 0,99 4. Hoitamaton primäärisyöpä 3142 10 1,50 - 1,18 5- Radikaalisesti poistettu syöpä Ί9 1 1 21 0,14 - 0,19 6. ‘Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 731 11 0,45 - 0,68 7. Ei-pahanlaatuinen sairaus 118 3 3 7 1 152 0,26 - 0,22 8. Terveet aikuiset (M - 71 vuotta) 82 10 0,20 ± 0,42 9. Verenluovuttajat (M = 39 vuotta.) Ί16 2 118 0,02 - 0,13 - 20 - 60567
Taulukko 2 (jatk.)
Ryhmät : Numeroasteikko Luku- !
0 1 2 3 4'56 maara M ± SD
10. 10-vuotiaat yksilöt 19 1 20 0,10 - 0,44 11. Vastasyntyneet (napanuoraveri) 111421 10 2,80 - 1,48 12. Raskaana ole- .
vat naiset 12 2 2 16 0,38 - 0,72 13· Vastasynnyttäneet 811 10 0,40 - 0,97
Tuloksista käy ilmi että korkeimmat asteikkoarvot on saatu ryhmistä "primäärisyöpä metastaaseineen',1 (paikallisia) jä "levinnyt syöpä" sekä ryhmästä "vastasyntyneet" (napanuoraveri).
Alhaisia asteikkoarvoja on saatu verenluovuttajista. Väliasemassa on ryhmä "hoitamaton primäärisyöpä" ja "radikaalisesti hoitamaton syöpä". Verenluovuttajien arvoja lähellä olevia arvoja saadaan ryhmästä "radikaalisesti poistettu syöpä".
CAPA:n keskiarvoja kaikista ryhmistä on verrattu parittain ja esitetty seuraavassa taulukossa 3-
Taulukko 3
Yhdeksän koeryhmän seerumin CAPA-pitoisuuden asteikkoarvojen a) _erojen tilastollinen merkitys '_____
Ryhmät Ryhmien asteikkoarvojen erojen merkitys ^ ryhmiin verrattuna __M - SD 23456 7 89 · 1. Primäärisyöpä metastaaseineen 3,00 - 1,13 0 xx xx kkm xxx xxx xxx xxx 2. Levinnyt syöpä 2,91 - 1,82 xx xx 3ίχκ xxx xxx xxx xxx | 3. Radikaalisesti hoi- ! tamaton syöpä 1,64 - 0,99 0 xxx xx xxx xxx xxx |
4. Hoitamaton I
primäärisyöpä 1,50 - 1,18 xxx x xxx xx xxx 5- Radikaalisesti poistettu syöpä 0,14 - 0,19 0000 6. Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 0,45-0,68 000 7. Ei-puhunlaatuinen \ sairaus 0,26-0,22 0 xxx ; 8. Vanhahkot terveet yksilöt 0,20 - 0,42 0 j 9- Verenluovuttajat 0,02 - 0,13 - 21 - 60567 a) Erojen tilastolliset merkitykset määrättiin likimäärin normaalisti | jakautuneen muuttujan Z avulla, joka määritellään seuraavasti; j -·Μ2 Z =--- \ /sD* SD2 V + ^2~ b) jos Z >1,96, eron merkitys on x, mikä merkitsee 0,01 <P<0,05 " Z >2,6, eron merkitys on xx, mikä merkitsee 0,001 <P <0,01 " Z >5,5, eron merkitys on xxx, P <0,001 c) Tämä ryhmä käsittää 11 positiivista testiä, joista 8 koskee epäiltyä, mutta ei todettua syöpää.
Ylläolevasta taulukosta ilmenee että, ryhmissä "primäärisyöpä metastaaseineen" ja "levinnyt syöpä" on merkitsevästi korkeammat keskimääräiset asteikkoarvot kaikkiin muihin ryhmiin verrattuna, paitsi vastasyntyneisiin (katso myös taulukkoa 2).
Ryhmissä "radikaalisesta hoitamaton syöpä" ja "hoitamaton primäärisyöpä" keskimääräiset asteikkoarvot ovat merkitsevästi korkeammat kuin kaikissa muissa ryhmissä paitsi kahdessa edellä mainitussa ja ryhmässä "muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä", johon verrattuna erotus on merkitsevä (0,01<P <0,05)·
Ryhmissä 5-9 ei esiinny keskinäisiä merkitseviä eroja, paitsi ryhmien 7 ja 9 välillä. Tämän eron selityksenä voi olla se, että ' aitoja, piileviä syöpätapauksia voi esiintyä niiden tapauksien joukossa, joiden asteikkoarvot ovat välillä 1-4-.
Positiivinen indikaatio napanuoraveressä ansaitsee tiettyä huomiota. Sen määrittämiseksi, onko CAPA peräisin istukasta, uutet- f tiin palasia tästä kudoksesta. 500 mg:n eriä jäädytettyä istukka- 1 kudosta ml kohti puskuroitua fysiologista NaCl-liuosta pH:ssa 7,5 | homogenoitiin 0°C:ssa ja sentrifugoitiin 1000 x G:ssa 50 minuuttia , 0°C:ssa kartiomaisesti laajenevissa putkissa (Markham'in mukaan). j
Sakan päällä olevat liuokset testattiin CAPA;aan nähden edelläseli-tetyllä hemagglutinaatiotekniikalla. Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, että saadut inhibitioreaktiot olisivat johtuneet verisolu.iirin lisätyn CAPA:n epäspesifisestä inaktivoitumisesta, mainittuja verisoluja ravistettiin jokaisen mittauksen jälkeen ja niihin lisättiin standardimäärä CAPA:aan nähden spesifisiä vasta-aineita. Missään tapauksessa ei todettu antigeenin inaktivoitumista. Vertailuaineksena käytettiin eri lähteistä ja eri paikoista peräisin olevista ihmis- t a* - 22 - 60567 syöpäkudoksista valmistetun antigeenijauheen uutetta. Tulokset osoittavat, että 26 istukkaa yhtä monesta henkilöstä kaikki poikkeuksetta sisälsivät merkitseviä määriä CAPA:a. Näiden 26 istukan keskiarvo (geometrinen) oli 297 - 8 mikrogrammaa märän kudoksen grammaa kohti (0,03 %).
Koska, kuten edelläselitetystä tutkimuksesta käy ilmi, tässä keksinnössä käytettyä CAPAra syntetisoituu istukassa, ja koska niiden geenien, jotka sisältyvät istukkaan, täytyy myös sisältyä samasta munasolusta kehittyneeseen yksilöön, on taipumus tai kyky valmistaa CAPAra normaali ilmiö. Normaalisti tämä taipumus on tukahtunut, koska normaalit solut eivät sisällä mitattavia määriä CAPAra. Syöpäsoluissa sensijaan on tapahtunut taipumuksen aktivoituminen, jolle on ominaista merkitsevä CAPArn esiintyminen solujen sisässä ja ympärillä. Istukan trofoblastisolujen ja syöpäsolujen antigeeninen ja tietyissä suhteissa funktionaalinen yhtäläisyys.ja niiden erilaisuus verrattuna yksilön muihin soluihin näyttää pitävän yhtä sen käsityksen kanssa, että syöpä on ilmaus siitä, että normaalisti esiintyvien taipumustan hallinta on muuttunut.
Koetulosten tilastollinen analyysi osoittaa, että on olemassa varsin merkitsevä korrelaatio todetun syövän ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden (P <0,001) välillä. Sama pitää paikkansa kyseessä olevan j kasvainmassan suuruuden ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden väliseen suh- j teeseen nähden samoissa ikäryhmissä (P <0,001). Suurentunut CAPA-pi- i toisuus on todettu lukuisien erilaisten syövänsijaintipaikkojen yh- ' teydessä. Tyypistä ja sijaintipaikasta riippumatta syöpäkasvaimet ovat : osoittautuneet CAPAra sisältäviksi, minkä perusteella näyttäisiltä, . j että mainittu CAPA on yhteistä kaikille tunnetuille syöpätyypeille, : so. pahanlaatuisille, epiteelistä alkuperää oleville kasvaimille. ‘ b) Kaksinkertainen sokeatutkimus ;
Edellä mainittujen johtopäätösten edelleen vahvistamiseksi ! suoritettiin kaksinkertainen sokeatutkimus, erittäin tarkasti vai- · votuissa olosuhteissa. Koodattuja verinäytteitä saatiin Eskilstunan j
Keskussairaalan eri osastoilta, Ruotsi. Tässä tapauksessa mitattiin j kvantitatiivisesti potilaiden seerumin CAPA-pitoisuudet. i Tämän kaksinkertaisen sokeatutkimuksen, samoinkuin edellä seli- ! tetyn yksinkertaisen sokeatutkimuksen tulokset on yhdistetty seuraa- : viin taulokkoihin 1-8. Taulukot esittävät seuraavaar jj
Taulukko 4 tutkittujen henkilöiden kokonaislukumäärää ja niiden henkilöiden lukumäärää, joilla on syöpädiagnoosi;
Taulukko 6 henkilöiden lukumäärää eri ryhmissä sekä heidän keski-ikä ansa sekä tämän poikkeamaa; . 23 - 60567
Taulukko 6 CAPA:n läsnäoloa kaikkien tutkittujen potilaiden seerumeissa;
Taulukko 7 niiden henkilöiden prosenttimäärää joiden CAPA-pitoisuus oli - 0,l5yg/ml seerumia, taulukon 5 ryhmät 9, 10 ja 12 poisjätettyinä;
Taulukko 8 CAPArn läsnäoloa kasvainten sijaintipaikkojen mukaan taulukon 5 ryhmissä 1-3- "Site nr" tarkoittaa teosta "Cancer Incidence in Sweden 1968".
Taulukko 4-
Tutkittujen yksilöiden lukumäärä
Tutkimus Yksilöiden lukumäärä Niiden yksilöiden luku määrä, joiden diagnoosi osoitti syöpää
Yksinkertainen sokea 4-31 ' 104-
Kaksinkertainen sokea 503 4-9 934- 155 " 2U_ 60567
Taulukko 5
Yksilöiden lukumäärä eri ryhmissä sekä keski-ikä ja sen poikkeama
RvhrlMf Yksinkertainen Kaksi nkur tai nen ! y sokea tutkimus sokoatutk<aus
Luku- Keski- + Poikkea- Luku- Keski- + Poik-määrä ikä v. ma määrä il<ä v. kerma ! 1. Syöpä metastaa- seineen 3 4 72 + 9 14 66 + 10 ; 2. Hoitamaton syöpä ! ilman metastaasi- i oireita sekä rad i kaa- i
Insesti hoitamaton j syöpä 2+9 67 + 11 1/+ 66 + 12 j
3. Radikaalisesti . J
poistettu syöpä 21 66 + 15 21 64 + 12 4. Muu pahanlaatui- , nen sairaus kuin syöpä' 11 70 + 7 5 5β + 1β 5. Ei-pahanlaa- | tuinen sairaus 132 61 + 22 1β6 46 + 21 6. Terveet aikuiset 10 71 + 5 46 36 + 14 7. Verenluovuttajat 11Ö 30+11 - - Ö. 10-vuotiaat ja ! sitä nuoremmat ! yksilöt 20 10 + 0 62 2 + 1.5 9. Napanuoraveri 10 0 + 0 20 0 + 0 ! 10. Vastasynnyt- | täneet 10 21 + 3 20 25 + 4 ; 11. Raskaana olevat naiset 16 26 + 4 ilo 26 + 4.5 12. Syöpä in situ - - 5 27 + 6 ί
Yhteensä 431 503 | i j i t • 25 ' 60567
Taulukko 6 CAPA-pitoisuus 934 yksilöstä saaduissa seerumeissa
Ryhmät CAPA CAPA Yhteensä <0,00 pg/ml —0.09 pg/ml Lukumäärä (%) ____Lukumäärä (%) Lukumäärä (%)_ 1. Syöpä metastaa- seineen 9 (19) 39 (Öl) 46 (100) 2. Hoitamaton syöpä ilman metastaasioireita sekä radikaalisesta hoitamaton syöpä 2Ö (44) 35 (56) 63 (100) 3. Radikaalisesti poistettu syöpä 36 (66) 6 (14) 42 (100) 4. Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 15 (94) 1 (6) 16 (100) - 5· Ei-pahanlaatuinen sairaus' 269 (65) 49 (15) 31Ö (100) 6. Terveet aikuiset .54 (96) 2 (4) 56 (100) 7·. Verenluovuttajat II6 (100) 0 (0) llö (100) Ö. 10-vuotiaat' ja sitä nuoremmat yksilöt 79 (96) 3 (4) 62 (100) 9. Napanuoraveri 21 (70) 9 (30) 30 (100) 10. Vastasynnyttäneet 25 (63) 5 (17) 30 (100) 11. Raskaana olevat naiset 123 (96) 3 (2) 126 (100) 12. Syöpä in situ 4 (00) 1 (20) 5 (100)
Yhteensä 761 (64) 153 (16) 934 (100) ' 26 ” 6 0 5 6 7
Taulukko 7 '
Niiden yksilöiden lukumäärä prosenteissa, joilla CAPA-pitoisuus oli ^ 0.15· Taulukon 5 ryhmät 9, 10 ja 12 on jätetty pois.
_____;_____]___
Ryhmät % Lukumäärä 1. Syöpä metastaaseineen 64 48 2. Hoitamaton syöpä ilman metastaasi- j oireita sekä radikaalisesti hoitamaton syöpä 21 63 3. Radikaalisesti poistettu syöpä 10 42 41 Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 0 16 5. Ei-pahanlaatuinen sairaus 6 31Ö 6. Terveet aikuiset 0 56 7. Verenluovuttajat 0 11Ö 6. 10-vuotiaat ja sitä nuoremmat yksilöt 0 82 11. Raskaana olevat naiset 1 126
Yhteensä 869 i i i i i i i 27‘ 60567
Taulukko β CAPA-pitoisuus ryhmien 1-3 kasvaimen sijaintipaikan mukaan
Sijantipaikka Site 1.Syöpä meta- 2.Hoitamaton 3 •Radikaali- Yh-
Nox) staaseineen syöpä ilman sesti pois- teen- metastaasi- tettu syöpä sä oireita sekä radikaalisesti hoitamaton _syöpä_ ___gQ.oe —O.09 gQ.oe ^0.09 £0.06 SO.09__
Gingivae mandib. 144__ 1____1_2
Nasopharynx_11+6___2_1_·_2__
Oesophagus_150__1__2_1_1_;__6
Ventricle_151_1__2_1_2__2__β
Intestinum tenui 152_1_______1__
Colon_153__2_1_7 6__16
Rectum_1J34_1+ 1___2__1__11+ .
Ves «Fellea, etc. 155_;_1_1_1____3
Hepar_156 __1______1
Pancreas__157 _2_____1_2_6
Vestibul. nasi, etc.__l60 _ 1 < 1__2
Trachea, pulm etc. 162__1+__2__2__5__14 !
Mammae_170 _2__7___1_3 3_2_1β_ j
Cervix uteri_229_2__2__1__6_ j
Corpus uteri_196__1_1 _1__1__1_2__7 '
Ovarii, etc,__175_1__1+__1_1__2__9 j
Prostat e__177_2__2_3____2_ j
Testis__176__1 _1 1 _3 j
Penis, etc,_179_____1_1__2
Renes___1Ö0_1____3 1 5 i
Ves . urinaria , etc. l6l_ 1 g 3_^ 1 10
Malignant melancma 190____1 1 2
Thyreoidea 194 1 1 1 2 5 <
Primäärinen kas- vain, tuntematon \ alkuperä___1___ 1 ! ””” ‘ 1
Yhteensä 9 39 26 35 36 6 153 x) Julkaisun "Cancer Incidence in Sweden 1966" mukaan. | ! • i - 28 - 60567 Tämän kaksinkertaisen sokeatutkimuksen tulosten tilastollinen analyysi osoittaa sekin varsin merkitsevää korrelaatiota syöpädiag-noosin ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden (P <0,001) välillä. Tämä kaksinkertainen sokeatutkimus vahvistaa myös kysymyksessä olevan kas-vainmassan suuruuden ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden välisen yhtey- l den samoissa ikäryhmissä (P < 0,001). Seerumin suurentunut CAPA- pitoisuus on todettu noin 20 erilaisen syöpätyypin ja sijaintipaikan j yhteydessä. Kaksinkertainen sokeatutkimus vahvistaa näin ollen täy- ! dellisesti nämä uudet havainnot ja niiden käytännöllisen käyttökelpoisuuden. '
Seuraavassa esitetään yhdistelmänä lyhyet määritelmät keksintöön Ϊ liittyvästä polypeptidi-antigeenista ja diagnostisesta menetelmästä. I CAPA:n määritelmä
HeLa-soluja (peräisin v. 1952 esiintyneestä kohtusyöpätapauksesta), viljellään in vitro. Näitä soluja käytetään antigeenin lähteenä.
Saatuja soluja ruiskutetaan hevosiin jolloin kehittyy spesifinen vasta-aine, jota käytetään antigeenin tunnistamiseen kasvaimissa, seerumissa, istukassa jne. Viimemainitulla antigeenillä on oltava ja sillä on identtinen immunologinen reaktiokohta (kuin HeLa-antigeenilla) vaikkakin se voi luonnollisesti olla toisenlainen muissa suhteissa, kun se esiintyy luonnossa.
Diagnostisen menettelyn määritelmä
HeLa-soluviljelmistä in vitro saatua antigeeniä käytetään vasta-aineen kehittämiseen hevosissa. Ei-toivottujen vasta-aineiden absorption jälkeen hevosseerumia käytetään kasvaimista (tai istukasta tai HeLa- tai HEp-2- tai Detroit-6-viljelmistä) otetulla antigeenillä merkittyjen punasolujen agglutinoimiseen. Tämä on indikaattori järjestelmä. Jos tuntematon näyte sisältää antigeenistä aktiviteettia, se vaikuttaa vasta-aineeseen ja inhiboi agglutinaation.
m ' 29 " 60567
Kuvio 1.
Kasvaimeen liittyvän antigeenin puhdistus
Virtauskaavio haarautumineen, joka esittää puhd istusinenettelyn yleistä periaatetta
_ __/Normaali A
\kudokset I
_ _ v Erotus- ^_ menettely _iL:_s.
Immunologinen vertailu __ 'i',_
Onko eroa kasvain- ja normaali- _ kudoksen välillä? ,n — ~ ....... 1 =---- „. Onko erotus kasvain plus? _ -Ei---< * >--On - 1 _\L-_
Ei-Onko erotus optimaalinen? -On - >t- _ _' . *_jd . ..._
Modifioidaan ja__Menettely otetaan toistetaan_|_ N~ ~ [käyttöön____
Ei —-<Onko CAPA puhdasta >-On --- Loppuj
Menettelyä jatketaan --:--------— --— ... —. — Τ'
Mt
Claims (18)
1. Syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste, tunnet-t u siitä, että se aktiivisena aineosana sisältää ihmisen syöpäku-doksessa läsnäolevaa polypeptidiantigeenia (CAPA), jonka molekyyli-paino on 20 000 - 27 000 daltonia suodatettuna geelikolonnilla, joka on tasapainoitettu HCOOH-HCOONH^:llä pH-arvossa noin 3,0, geelin ollessa polyakryyliamidigeeli, jonka raekoko on 100-200 mesh (0,149-0,074 mm), ekskluusioraja 40 000 daltonia ja fraktioimisalue 2500-40 000 daltonia, jolloin polypeptidin spektrofotometrinen absorptio-huippu on aaltopituusalueella 229-233 nm ja se perustuu yksinkertaiseen polypeptidiketjuun, sisältää asparagiinihappoa, glutamiinihap-poa, leusiinia, fenyylialaniinia ja tyrosiinia oleellisina rakennusosina, muodostaa monospesifisesti antigeenin kanssa reagoivia vasta-aineita, ja denaturoituu eristetyssä tilassa palautumattomasti pH-arvossa yli 5, jolloin polypeptidiantigeeni on eristetty siten, että a) CAPA-pitoista ainetta homogenoidaan nesteessä lämpötilassa, joka ei ylitä 0°C, ja mahdollisesti käsitellään orgaanisella liuottimena, kuten etyylieetterillä tai asetonilla, kylmässä, b) kiinteät aineosat erotetaan vaiheesta a) peräisin olevasta nestemäisestä homogenaatin ja kiinteiden aineosien seoksesta, c) mainitut kiinteät aineosat uutetaan alkalisella vesiliuoksella, d) vaiheesta c) saadut uutteet suodatetaan helmimäisellä molekyyli- seulatyyppisellä suodatusgeelillä, joka kykenee fraktioimaan yh-disteet joiden molekyylipainoalue on 10*10 - 20*10 , erityisesti noin 15*10^, geeli eluoidaan ja 10*10^ - 20·lO^-fraktio, erityi- C sesti noin 15*10 -fraktio otetaan talteen, e) vaiheesta d) saatu fraktio kromatografoidaan molekyyliseula-tyyp-pisellä heikolla ioninvaihtajalla epäpuhtauksien absorboimiseksi siihen, ja mainitusta ioninvaihtajasta ensiksi poistuva fraktio otetaan.talteen, f) mainittu ensimmäinen fraktio säestetään isoelektrisesti, g) saatu sakka sekoitetaan molekyyliseulatyyppiseen geeliin ja sakan ja geelin seos pH-gradienttieluoidaan geelikolonnissa, h) pH:ta alentaen otetaan talteen pH-arvoon 3 saakka fraktio, joka sisältää CAPA:a, ja joka mahdollisesti geelisuodatetaan kolonnissa ja otetaan talteen antigeenifraktio, jonka spektrofotometrinen absorptiohuippuaaltopituus on 229-233 nm ja molekyylipaino 20 000 -27 000, 31 60 5 67 yhdessä polypeptidin denaturoitumista estävän määrän kanssa inerttiä proteiinia, mieluimmin albumiinia, jolloin inertin proteiinin ja CAPA:n välinen painosuhde on vähintään 200:1.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen valmisteet u n n e t t u siitä, että polypeptidi sisältää seuraavia aminohappoja, joiden moo-liprosenttimäärät ovat seuraavat: Alaniini 8,62 Arginiini 4,57 Asparagiinihappo 10,39 Kysteiini 0,95 Glutamiinihappo 17,04 Glysiini 6,87 Histidiini 1,00 Isoleusiini 4,75 Leusiini 10,49 Lysiini 3,69 Metioniini 1,91 Fenyylialaniini 2,75 Proliini 3,79 Seriini 7,74 Treoniini 5,92 Tyrosiini 3,21 Väliini 6,36
3. Patenttivaatimuksen '1 mukainen valmiste, tunnettu siitä, että polypeptidi sisältää fluorisoivan ryhmän, joka lähettää fluorisoivaa valoa alueella 350 nm, kun se on aktivoitunut 288 nm aaltopituudella.
4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen, ihmisen syöpäkudok-sessa läsnäolevaa polypeptidiantigeeniä (CAPA) sisältävän valmisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) CAPA-pitoista ainetta homogenoidaan nesteessä lämpötilassa, joka ei ylitä 0°C, ja mahdollisesti käsitellään orgaanisella liuottimena, kuten etyylieetterillä tai asetonilla, kylmässä, b) kiinteät aineosat erotetaan vaiheesta a) peräisin olevasta, nestemäisestä homogenaatin ja kiinteiden aineosien seoksesta, c) mainitut kiinteät aineosat·uutetaan alkalisella vesiliuoksella, d) vaiheesta c) saadut uutteet suodatetaan helmimäisellä molekyyli- seulatyyppisella suodatusgeelillä, joka kykenee fraktioimaan yh- G 6 disteet joiden molekyylipainoalue on 10*10 - 20*10 , erityisesti 32 6 0 5 6 7 noin 15*10^, geeli eluoidaan ja 10-10^ - 20·10^-fraktio, erityisesti noin 15·10^-fraktio otetaan talteen, e) vaiheesta d) saatu fraktio kromatografoidaan molekyyliseula-tyyp-pisellä heikolla ioninvaihtajalla epäpuhtauksien absorboimiseksi siihen, ja mainitusta ioninvaihtajasta ensiksi poistuva fraktio otetaan talteen, f) mainittu ensimmäinen fraktio saostetaan isoelektrisesti, g) saatu sakka sekoitetaan molekyyliseulatyyppiseen geeliin ja sakan ja geelin seos pH-gradienttieluoidaan geelikolonnissa, h) pH:ta alentaen otetaan talteen pri-arvoon 3 saakka fraktio, joka sisältää CAPA:a, ja joka mahdollisesti geelisuodatetaan kolonnissa ja otetaan talteen antigeenifraktio, jonka spektrofotometrinen absorptiohuippuaaltopituus on -229-233 nm ja molekyylipaino 20 000 -27 000, ja näin valmistettu CAPA sekoitetaan polypeptidin denaturoitumista estävän määrän kanssa inerttiä proteiinia, mieluimmin albumiinia, niin että proteiinin ja CAPA:n välinen painosuhde on vähintään 200:1.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että homogenointi a) suoritetaan vedessä.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta b) saadut kiinteät aineosat lyofilisoidaan ja jauhetaan sitten teräksisessä kuulamyllyssä kylmässä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jauhaminen suoritetaan -70°C:n lämpötilassa.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen d) suodatus suoritetaan fosfaattipuskurilla pH: ssa 7 tasapainoitettua polyakryyliamidigeeliä, ristikytkettyä dekstraa-nigeeliä, agar- tai agaroosigeeliä sisältävässä kylmässä kolonnissa.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen e) kromatografointi suoritetaan neutraalissa pH:ssa, kuten fosfaattipuskurilla pH:ssa 7 tasapainoitetussa kolonnissa.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografointi suoritetaan polyakryyliamidigeelikolon-nissa.
11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isoelektrinen saostus f) suoritetaan pH:ssa 5.
12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa g) käytetään polyakryyliamidigeeliä, ristikyt-
33. O 5 6 7 kettyä dekstraanigeeliä, agar- tai agaroosigeeliä.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelin molekyylipainon ekskluusioraja on ainakin 2000 ja on tasapainoitettu HCOOH-HCOONH^:llä pH:ssa 5, ja pH-gradienttieluoin-ti suoritetaan kolonnissa, joka on panostettu samalla tavoin tasapainotetulla, samanlaisella geelillä.
14. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta c) saatu vesiuute lämmitetään nopeasti lämpötilaan, joka on välillä 95-100°C, entsyymien tuhoamiseksi.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiuute lämmitetään 98-100°C:seen ja pysytetään tässä lämpötilassa 5-10 minuuttia.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuumennettu vesiuute käsitellään natriumkloridin vesi-liuoksella epäpuhtauksien saostamiseksi.
17. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CAPA:a ja albumiinia sekoitetaan happamassa liuoksessa ja että liuoksen pH:ta korotetaan komponenttien välisen vuorovaikutuksen aikaansaamiseksi.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiste lyofilisoidaan.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27027372A | 1972-07-10 | 1972-07-10 | |
US27027372 | 1972-07-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI60567B true FI60567B (fi) | 1981-10-30 |
FI60567C FI60567C (fi) | 1982-02-10 |
Family
ID=23030635
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI2099/73A FI60567C (fi) | 1972-07-10 | 1973-06-29 | Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JPS5817168B2 (fi) |
AR (1) | AR197243A1 (fi) |
AT (1) | AT336780B (fi) |
BE (1) | BE802126A (fi) |
BR (1) | BR7305142D0 (fi) |
CA (1) | CA1039650A (fi) |
CH (1) | CH617853A5 (fi) |
DD (2) | DD118946A5 (fi) |
DE (2) | DE2333740C2 (fi) |
DK (1) | DK139898B (fi) |
ES (1) | ES416726A1 (fi) |
FI (1) | FI60567C (fi) |
FR (1) | FR2191885B1 (fi) |
GB (2) | GB1443053A (fi) |
IL (1) | IL42594A (fi) |
IN (1) | IN138903B (fi) |
IT (1) | IT1009527B (fi) |
NL (1) | NL7309257A (fi) |
NO (1) | NO146338C (fi) |
SE (3) | SE440697B (fi) |
SU (1) | SU581842A3 (fi) |
ZA (1) | ZA734632B (fi) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4132769A (en) * | 1974-10-30 | 1979-01-02 | Osther Kurt B | Cancer antigen, cancer therapy, and cancer diagnosis |
US4146603A (en) * | 1977-02-18 | 1979-03-27 | Research Corporation | Tumor specific glycoproteins and method for detecting tumorigenic cancers |
US4172124A (en) * | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
JPS56145297A (en) * | 1980-04-11 | 1981-11-11 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Preparative method of glycoprotein having immunosupressing activity |
EP0087898A1 (en) * | 1982-02-22 | 1983-09-07 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Antibodies and antigens useful in the diagnosis and treatment of cancer |
-
1973
- 1973-06-25 IL IL42594A patent/IL42594A/en unknown
- 1973-06-25 SE SE7308917A patent/SE440697B/xx unknown
- 1973-06-25 IN IN1473/CAL/73A patent/IN138903B/en unknown
- 1973-06-29 FI FI2099/73A patent/FI60567C/fi active
- 1973-07-03 DE DE2333740A patent/DE2333740C2/de not_active Expired
- 1973-07-03 DE DE2366609A patent/DE2366609C2/de not_active Expired
- 1973-07-03 NL NL7309257A patent/NL7309257A/xx not_active Application Discontinuation
- 1973-07-06 AR AR248979A patent/AR197243A1/es active
- 1973-07-06 CH CH988073A patent/CH617853A5/de not_active IP Right Cessation
- 1973-07-06 DD DD186676*A patent/DD118946A5/xx unknown
- 1973-07-06 DD DD172110A patent/DD113918A5/xx unknown
- 1973-07-09 GB GB3263473A patent/GB1443053A/en not_active Expired
- 1973-07-09 CA CA175,995A patent/CA1039650A/en not_active Expired
- 1973-07-09 NO NO2807/73A patent/NO146338C/no unknown
- 1973-07-09 IT IT26346/73A patent/IT1009527B/it active
- 1973-07-09 ES ES416726A patent/ES416726A1/es not_active Expired
- 1973-07-09 DK DK380773AA patent/DK139898B/da not_active IP Right Cessation
- 1973-07-09 GB GB4980974A patent/GB1443054A/en not_active Expired
- 1973-07-09 AT AT600773A patent/AT336780B/de not_active IP Right Cessation
- 1973-07-10 JP JP48077839A patent/JPS5817168B2/ja not_active Expired
- 1973-07-10 SU SU7301949792A patent/SU581842A3/ru active
- 1973-07-10 BE BE133300A patent/BE802126A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-07-10 ZA ZA734632A patent/ZA734632B/xx unknown
- 1973-07-10 FR FR7325241A patent/FR2191885B1/fr not_active Expired
- 1973-07-10 BR BR5142/73A patent/BR7305142D0/pt unknown
-
1976
- 1976-09-06 SE SE7609836A patent/SE418186B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-09-06 SE SE7609837A patent/SE440597B/xx not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-01-14 JP JP56003331A patent/JPS6018011B2/ja not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4160018A (en) | Stabilized cancer associated polypeptide antigen and preparation thereof | |
US3960827A (en) | Cancer associated polypeptide antigen, process for its preparation, process for preparing antibodies, process of cancer diagnosis and composition useful as an immunizing agent | |
Carrico et al. | Isolation of human hepatocuprein and cerebrocuprein: their identity with erythrocuprein | |
US5310653A (en) | Tumor marker protein and antibodies thereto for cancer risk assessment or diagnosis | |
Sorof et al. | Zonal electrophoresis of the soluble proteins of liver and tumor in azo dye carcinogenesis | |
Kupchik et al. | Carcinoembryonic antigen (s) in liver disease: II. Isolation from human cirrhotic liver and serum and from normal liver | |
US4298590A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
Bhattacharya et al. | Immunologic studies of human serous cystadenocarcinoma of ovary. Demonstration of tumor‐associated antigens | |
US5866690A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
Goldenberg et al. | Antigens associated with normal and malignant gastrointestinal tissues | |
Imamura et al. | Analysis of human ovarian tumor antigens using heterologous antisera: detection of new antigenic systems | |
US4486538A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
Solomon | Molecular heterogeneity of immunoglobulin-M (γM-globulin) | |
US4211766A (en) | Cancer associated polypeptide antigen compositions | |
Alpert | Alpha-I-Fetoprotein: Serologic Marker of Hu-man Hepatoma and Embryonal Carcinoma¹2 | |
FI61192C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein | |
FI60567B (fi) | Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning | |
Neville et al. | Aspects of the structure and clinical role of the carcinoembryonic antigen (CEA) and related macromolecules with particular reference to urothelial carcinoma. | |
Harvey et al. | Demonstration of two molecular variants of carcinoembryonic antigen by concanavalin A sepharose affinity chromatography | |
Hamashige et al. | Immunologic and biologic study of human chorionic gonadotropin | |
CN102336828A (zh) | 一种多发性骨髓瘤特异性蛋白及其专用检测试剂盒 | |
Hirai | Carcinofetal proteins | |
Dickinson et al. | The chemical nature of cancer basic protein | |
Bauman | Lack of C5 convertase-generating activity in Naja haje cobra factor | |
Pusztaszeri et al. | The zinc glycinate marker in human colon carcinoma |