FI60567B

FI60567B - Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning

Info

Publication number: FI60567B
Application number: FI2099/73A
Authority: FI
Inventors: Knut Bertil Bjoerklund
Original assignee: Bonnierfoeretagen Ab
Priority date: 1972-07-10
Filing date: 1973-06-29
Publication date: 1981-10-30
Also published as: DE2366609C2; SE7609836L; GB1443053A; AU5728673A; DK139898C; DE2333740A1; JPS6018011B2; ES416726A1; AT336780B; NO146338C; SE7609837L; IL42594A; CH617853A5; FI60567C; IT1009527B; AR197243A1; CA1039650A; DD113918A5; IN138903B; BR7305142D0

Claims

1. Preparat för användning vid diagnostisering av kancer, k ä n-netecknat därav, att det som aktiv beständsdel innehäller ett i humankancervävnad närvarande polypeptidantigen (CAPA) med en molekylvikt av 20 000 - 27 000 dalton vid filtrering pä en gelkolonn som bringats i jämvikt med HCOOH-HCOONH^ vid ett pH-värde av ca 3,0, varvid gelet är ett polyakrylamidgel med en kornstorlek av 100-200 mesh (0,149-0,074 mm), en exklusionsgräns av 40 000 dalton och ett frak-tioneringsintervall av 2500 - 40 000 dalton, varvid polypeptiden har en spektrofotometrisk toppabsorption inom vaglängdsintervallet 229-233 nm, och baserar sig pk en enkel polypeptidked, innehäller aspara-ginsyra, glutaminsyra, leuoin, fenylalanin och tyrosin säsom väsent-liga byggstenar, bildar antikroppar som reagerar monospecifikt med antigenet, och vilken i isolerat tillständ denatureras irreversibelt vid pH över 5, varvid polypeptidantigenet isolerats genom att a) CAPA-haltigt material homogeniseras i en vätska vid en temperatur 34 6 0 5 6 7 av högst 0°C, och eventuellt behandlas med organiskt lösningsraedel, säsom etyleter eller aceton, i kylä, b) de fasta beständsdelarna frän blandningen av vätskeformigt homoge-nat och fasta beständsdelar frän steget a) avskiljes, c) nämnda fasta beständsdelar extraheras med en alkalisk vattenlösning, d) extrakten frän steget c) filtreras pä ett filtreringsgel av molekyl- sikttyp i pärlform med förmäga att fraktionera föreningar med ett molekylviktsintervall av 10*10® - 20*10®, speciellt ca 15*10®, ge- 6 6 let elueras och 10*10 - 20*10 -fraktionen, speciellt fraktionen ca 15*10®, tillvaratages, e) fraktionen frän steget d) kromatograferas pä en svag jonbytare av molekylsikttyp för absorption av kontaminanterna pä densamma, och den första fraktionen som lämnar nämnda jonbytare, tillvaratages, f) nämnda första fraktion utfälles isoelektriskt, g) nämnda fällning blandas med ett gel av molekylsikttyp och blandningen av fällning och gel pH-gradientelueras pä en gelkolonn, h) genom sänkning av pH ned tili pH 3 tillvaratages fraktionen inne-hällande CAPA och vilken fraktion eventuellt gelfiltreras pä en kolonn och den antigenfraktion tillvaratages som har en spektro-fotometrisk toppabsorptionsväglängd av 229-233 nm och en molekyl-vikt av 20 000 - 27 000, tillsammans med en polypeptidens denaturering förhindrande mängd av ett inert protein, företrädesvis albumin, varvid viktförhällandet inert protein till CAPA är minst 200:1.

2. Preparat enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden innehäller följande aminosyror med följande molprocenttal: Alanin 8,62 Arginin 4,57 Asparaginsyra 10,39 Cystein 0,95 Glutaminsyra 17,04 Glycin 6,87 Histidin 1,00 Isoleucin 4,75 Leucin 10,49 Lysin 3,69 Metjonin 1,91 Fenylalanin 2,75 Prolin 3,79 35 6 0 5 6 7 Serin 7,74 Treonin 5,92 Tyrosin 3,21 Valin 6,36

3. Preparat enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att polypeptiden innehäller en fluorescent grupp utgivande fluorescent ljus vid 350 nm vid aktivering vid en väglängd av 288 nm.

4. Förfarande för framställning av ett preparat enligt patentkravet 1, innehällande i humankancervävnad närvarande polypeptidanti-gen (CAPA), kännetecknat därav, att a) CAPA-haltigt material homogeniseras i en vätska vid en temperatur av högst 0°C, och eventuellt behandlas med organiskt lösningsmedel, säsorn etyleter eller aceton, i kylä, b) de fasta beständsdelarna frän blandningen av vätskeformigt homoge-nat och fasta beständsdelar frän steget a) avskiljes, c) nämnda fasta beständsdelar extraheras med en alkalisk vattenlösning, d) extrakten frän steget c) filtreras pä ett filtreringsgel av molekyl- sikttyp i pärlform med förmäga att fraktionera föreningar med ett 6 6 6 molekylviktsintervall av 10*10 - 20*10 , speciellt ca 15*10 , ge- 6 6 let elueras och 10*10 - 20*10 -fraktionen, speciellt fraktionen ca 15*10**, tillvaratages, e) fraktionen frän steget d) kromatograferas pä en svag jonbytare av molekylsikttyp för absorption av kontaminanterna pä densamma, och den första fraktionen som lämnar nämnda jonbytare, tillvaratages, f) nämnda första fraktion utfälles isoelektriskt, g) nämnda fällning blandas ned ett gel av molekylsikttyp och blandningen av fällning och gel pH-gradientelueras pä en gelkolonn, h) genom sänkning av pH ned tili pH 3 tillvaratages fraktionen inne-hällande CAPA och vilken fraktion eventuellt gelfiltreras pä en kolonn och den antigenfraktion tillvaratages som har en spektro-fotometrisk toppabsorptionsväglängd av 229-233 nm och en molekyl-vikt av 20 000 - 27 000, och sä franstallt CAPA blandas med en polypeptidens denaturering förhindran-de mängd av ett inert protein, förträdesvis albumin sä, att viktför-hällandet protein till CAPA är minst 200:1.

5. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att homogeniseringen a) utföres i vatten.

6. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att de frän steg b) erhällna fasta beständsdelarna lyofilise-ras och sedan males i en stälkulkvarn i kylä. 36 6 0 5 6 7

7. Förfarande enligt patentkravet 6, kännetecknat därav, att malningen äger rum vid en temperatur av -70°C,

8. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att under steg d) filtreringen utföres pl en kali kolonn inne-hällande polyakrylaraidgel, förnätat dextrangel, agar- eller agaros-gel och bringad i jämvikt med en fosfatbuffert vid pH 7.

9. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att under steg e) kroraatograferingen utföres vid neutralt pH t.ex. pä en kolonn bringad i jämvikt med fosfatbuffert vid pH 7.

10. Förfarande enligt patentkravet 9, kännetecknat därav, att kromatograferingen utföres pä en polyakrylamidgelkolonn.

11. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att den isoelektriska utfällningen f) sker vid pH 5.

12. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att under steg g) användes en polyakrylamidgel, förnätat dextrangel, agar- eller agarosgel.

13. Förfarande enligt patentkravet 12, kännetecknat därav, att gelen uppvisar en molekylviktsexklusionsgräns av minst 2000 och är bringad i jämvikt med HCOOH-HCOONH^ vid pH 5, och pH-gradientelueringen sker i en kolonn innehällande en identisk gel bringad i jämvikt pä samma sätt.

14. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att vattenextrakt frän steg c) upphettas snabbt tili en temperatur inom intervallet 95-100°C för förstöring av enzymer.

15. Förfarande enligt patentkravet 14, kännetecknat därav, att vattenextraktet upphettas tili en temperatur inom intervallet 98-100°C och hälles vid nämnda temperatur under 5-10 minuter.

16. Förfarande enligt patentkravet 15, kännetecknat därav, att det uppvärmda vattenextraktet behandlas med en natrium-kloridvattenlösning för utfällning av kontaminanter.

17. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat därav, att man i sur lösning blandar CAPA och albumin och höjer lös-ningens pH för ästadkommande av samverkan mellan komponenterna.

18. Förfarande enligt patentkravet 17, kännetecknat därav, att man lyofiliserar preparatet.