SU581842A3 - Способ получени антигенов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ

водой при щелочном рН среды экстракты мутнекгг после добавлени  NaC при нейтралвном или слегка щелочном рН. Эта мутность возникает из-за присутстви  примесей нуклеиновых кислот. После центрифугировани  обработанных рассолом экстрактов вс  активность остаетс  8 Прозрачном верхнем слое. Верхний слой осаждают нзоэлектрически прн кислом рН около 4,8 и полученный осадок раствор ют в водном фосфатном буферном растворе при рН около 7,0.

Полученный раствор фильтруют на соответствующем молекул рном сите гелевого типа в слое, позвол ющем фракционировать соединеми  по молекул рному весу в диапазоне от Ю-Ю до 20-10, предпочтительно 1510. Фильтрующий гель элюируют буферным раствором при нейтральном рН, при этом выдел ют молекул рные фракции 10-10 до 20-10, предпочтительно 15 10.

Выпавшую активную фракцию из гелевого фильтровани  раствор ют в буферном растворе рН около 7,0. Полученные растворы фильтруют через колонку, загруженную слабым ионообменным молекул рным ситом типа гел  со слабыми ионообменными свойствами, например полиакриламидным гелем Био-Гель Р-2, причем колонка уравновешена аналогичным буферным раствором рН около 7,0. Перва  фракци , выход ща  из колонки, которую выдел ют, обладает антигенной активностью.

Выделенную фракцию из хроматографии на Био-Геле Р-2 подвергают особой обработке дл  дальнейшей очистки СРПА. Эту обработку осуществл ют следующим образом. Смесь протеинов или сопр женных протеинов осаждают изоэлектрической регулировкой рН. Полученный осадок смешивают с соответствующим гелем, подобранным,исход  из имеющейс  протеиновой смеси. Полученную смесь осадка и гел  загружают в верх колонки, содержащей идентичный гель такого же изоэлектрического рН, т. е. рН, который  вл етс  изоэлектрическим дл  пр.отеинов при осаждении их в предыдущей стадии. Затем колонку элюируют при постепенно возрастающем или уменьщающемс  рН. В элюате выдел ют те фракции, в которых .содержатс  нужные протеины.

Нормальные и СРПА фракции, выделенные хроматографией, подвергают осаджению активного вещества, при рН около 5, осадок выдел ют и раствор ют в воде при рН около 8,5. Затем рН прозрачного раствора довод т до кислого рН около 5,0 при помощи муравьиной кислоты, така  обработка приводит к осаждению. Каждый осадок смешивают с шламом полиакриламидного гел , уравновешенного НСООН -HCOONH при рН около 5,0. Каждую из таких смесей помещают в верхнюю часть гелевой колонки, уравновещенной как указано.

Дл  элюировани  осадков-ггри.мен ют рНградиеит , и в этом случае с постепенно уменьщающимс  рП. Соответствующей буферной системой  вл етс  HCOOH-HCOONH и .i - NH.V Антигенна  активность установлено в выход щей жидкости в диапазоне рН от начального рН ди рН 3. Выделенна 

жидкость в этом диапазоне рМ содержит нужные СРПА, которые можно выделить вымораживанием . Дл  установлени  молекул рного веса СРПА этой фракции жидкости фракцию фильтруют на гелевой колонке, уравповещен ной HCOOH-HCOONl-b при рН около 3. Затем выдел ют элюированные фракции СРПА со спектрофотометрическим пиком попдощени  в диапазоне 229-233 мкм. и мол. вес. 20.000- 27.000. СРПА можно выделить после фильтроо вани  из активной фракции вымораживанием, их можно хранить длительное врем  в вакууме, на холоде, в темноте.

Выделенное вещество состоит из полипептида на основе одной полипептидной цепи. СРПА имеют основную реакцию и растворимы при рП

5 I-3,5. Незащищенный полинептид денатурируетс  необратимо при нейтральных рП, а именно при рН 4,6. Антиген гигроскопичен, переходит в желтую окраску и становитс  неактивным и в зким при поглощении влаги.

Очищенные СРПА содержат флуоресцирующую группу, эта группа активируетс  при длине волны около 288 мкм и излучает свет при длине волны около 350 мкм. Флуоресценци  пропорциональна количеству СРПА и может быть использована дл  определени  наличи  поли5 пептида при его выделении.

Спектрофотометрический пик поглощени  СРПА находитс  в диапазоне длин волн 220 - 233мкм. Кроме того, они склонны к агрегированию и не фильтруютс  на нормальной фильтровальной среде, примен емой дл  стерилизации,

0 они не содержат углеводов и, как показывает спектрофотометри , не содержат нуклеиновых кислот.

Выделенные СРПА можно щироко использовать , например при получении моноспецифич1 ых антител дл  диагностических целей, дл  иммунизации в качестве активного ингредиента в составах.

Пример {. Выделение чистого антигена. Карциномные и нормальные ткани из аутопсий раздельно чисто отрезают от соседних тканей и разрезают на кубики 2--3 см, эти кубики промывают в 0,9%-ном растворе NaCl при 0° С до тех пор, пока они не перестают выдел ть кровь. Промытые кубики замораживают и хран т при минус 24° С.

В замороженном состо нии тканевые кубики

смешивают с 10 мл воды при 0° С на 1 г замороженной ткани, затем их гомогенизируют в охлажденном гомогенизаторе. Температуру суспензии выдерживают при 0° С или несколько ниже.

Холодный гомогенат выливают в охлажденные полиэтиленовые бутылки 1000 мл. В каждой бутылке смешивают 400 мл суспензии и 400 мл этилового эфира при минус 20° С, перемешивание ведут при минус 2° С в течение 2 час в центрифуге-тр сучке (300 об/мин). Смесь

центрифугируют при минус 2° С в течение 5 мин. В этой стадии липидный слой не смешиваетс  с тканевым слоем. Этиловый эфир и липид выбрасывают и провод т вторую экстракцию в течение 1 час с последующим центр1 фугированием н теченг1е 5 мин и удаление.м

эфирлнпидного сло .

Затем провод т центрифугирование при минус 2° С в течение 30 мин, водный слой удал ют , хот  он содержит некоторое количество СРПА. Оставшиес  нерастворимые ващества сохран ют. Оставшийс  этиловый эфир удал ют вакуумом в течение 5 мин. Антигенный материал суспендируют в 50 мл воды при 0° С, перенос т в инфузионные бутылки на 500 мл и замораживают при 70° С (сухой лед в этаноле). Лиофилизацию ведут в лиофилизаторе при регулируемой температуре..

Лиофилизированный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70° С в течение 2 час при 40 об/мин. После размола получают тонкий серо-коричневый порошок. Этот порошок экстрагируют предварительно охлажденным до минус 2° С эфиром в центрифуге-тр сучке при 300 об/мин в течение 1 час и центрифугируют при минус 2° С в течение 30 мин. Эфирный слой удал ют и остаток сушат в вакууме. Полученный сырой тканевый пороиок (СТП) можно хранить годами при в гер.метичных бутылках без заметной потери активности.

Суспендируют 5 г СТП при нейтральном рН в 500 мл солевого раствора, содержащего стериальные кубики льда. Суспензию гомогенизируют , температуру выдерживают при 0° С в течение 30 мин при слабом перемешивании. Центрифугирование ведут при 0° С в течение 40 мин. Верхний слой выбрасывают. Осадок снова суспендируют в 500 мл холодной дистиллированной воды и медленно перемешивают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугировани  при 0°С в течение 40 мин верхний слой удал ют. Оставшийс  осадок суспендируют в 25 .мл холодной дистиллированной воды и замораживают при минус 70° С (сухой лед в этаноле ), После лиофилизации получают промытый тканевый порошок (ПТП), который можно хранить годами в герметичных бутылках при 4° С.

Приготавливают водные экстракты СРПА и нормального тканевого порошка (МТП) при рН 9,5 концентрируют их 10 раз изоэлектрическим осаждением при рН 4,8 и растворением осадка в 0,1 объема воды при рН 9,5. Полученный концентрат стабилизируют быстрым нагревом до 98-100° С и выдержкой при этой температуре в течение 5-10 мин. Така  термообработка разрушает энзимы, которые дезактивируют СРПА. Стабилизированный экстракт мутнеет после добавлени  солевого раствора при рН 7,5 вследствие осаждени  оставшихс  примесей нуклеиновых кислот. Дл  осаждени  оставшихс  примесей отдельно осаждают 8,0 мл водных экстрактов СРПА и нормальных добавлением 0,8 мл 10%-ного раствора NaCt. После центрифугировани  при 0° С в течение 1 час прозрачные вер.хние слои осаждают изоэлектрически при рН 4,8 (рН регулиПют 0,1 N НС1 или 0,i N НСООН). Осадки раствор ют в 2- S мл 1,150 М фосфатного буферного раствора рИ 7,0.

Питученные растворы из опухолевых и нор/n .ibrJM/ ПТП фильтруют через Био-Гель А .v м в охтаж-денных колонках. Гель уравновеа ifi-i.joT 1,{50 М фосфатны.м б ферны.м расTBopL рП 7,0 с 2/о бутанола и элюиоуют этим

же буферным раствором. В каждм.м опыте примен ют 4-8 мл экстракта, солерж шего всего 50--100 мл протеина.

Антигенную активность пбнаруживаип в федней фракции, выход ним к .жидкости опухолевого экстракта. Порции но 1 мл этой фракции , всего 160-180 мл, разбавл ют три раза и довод т до разных значений рП от 2,0 до 9,0. После 6 мин пребывани  при комнатной температуре пробы перенос т в кюветы н определ ют их светорассе ни  при 500 мкм пол углом 90° Зависимость интенсивности рассеивани  л рП показывает максимум при рН 4.8, это значение рН  вл етс  изоэлектричсской точкой этой фракции.

Оставшуюс  часть активной средней фракции осаждают при рН 4,8 с помощью 0,1 N НС1. Центрифугирование при О С в течение 5 мин дает количественный выход активности.

Дл  дальнейшей очистки СРПА осевшие активные средние фракции из п ти колонок БиГель-А-50 М раствор ют в 1/150 М фосфатном буферном растворе при рН 7,0 {буф(ф ппенсена . в2%-ном бутаноле) до 5% нач .)го жидкости. Этот раствор, содержащий 150 мл протеина в 8,5 мл фильтруют через колонку с Био-Гелем Р-2. Колонку уравновс1пив н-)1 1,150 М буферным раствором рН 7,0 (буфер

Па каждый

Соренсена в 2/п-ном бутаноле. обьем сло  протеина допускают

миллиграмм 10 мл.

Перва  фракци  активна, ее отвод т элюирующим буфсфным раствором рН 7,0, а примеси сорбируют па геле при низкой ионной силе. Активное вещество осаждают при р11 4,8 при помощи 0,1 М HCOOI-i и центрифугируют при в течение 5 мим. Осадок рнстнор кп в 8,5 мл воды, рП довод т до 8,5 с помпшьк 0,1 М N11,ОН. Прозрачный растнор снова осаждают три раза 0,1 М ПСОО11 iifni рП 4,, промывают в центрифуге при гаком же рП и раствор ют рН 8,5. Исчезновение бутанола прослеживают газо-жидкостной хро.матографией . Готовый раствор хран т в ампулах лиофилизироваины .м и замороженным. Полученный продукт представл ет собой сухой, почти белый порошок, который хран т при минус 24° С в эвакуированных герметичных а.мпулах.

Дл  дальнейшей очистки продукта, полученного в результате предыдуи ей хроматографической обработки, разработан способ элюировани  с градиентом рП. Этот способ заключаетс  в следующем. Подлежащую очистке от активного компонента протеиновую смесь осаждают изоэлектрическим регулированием рН. Осадок сме1инвают с соответствующим гелем. Эту смесь нанос т слоем в верх колонки, содержащей такой же гель с таким изоэлектрическим рН. Затем колонку элюируют с градиентом рН при посто нных расходе и те.мперагуре. Таким образо.м колонку элюируют средой с непрерывно и ступенчато возрастающим или снижающимс  рП.

Градиентное элюирование н)овод т с 15 мг лиофилиз1 рованного и обессоленного порошка СРПА и нормального антигенного tiopoiuKU, очищенного указанным способи.м, в данном случае при снцж;)к)|це.1с  .чначении pli. Коротки

раилсльмо раствор ют н воле, причем рИ регулируют ло 8,5 при помощи 0,1 N раствори NH,OH. Затем рИ прозрачного растиора довод т до 5,0 при помощи 0,1 М И(Х)()Н, при этом происходит осаждение. Каждый осадок смешивают с 10 мл суспензии Био-Гел  , уравновешенного водным раствором 0,02 М ИСООН и 0,2 М HCOOHNH с получением рИ 5,0. Каждую из этих смесей помешают в верх колонки с 15 мл Био-Гел  Р-2, обработанной силиконом. Гель находитс  на небольшом куске стекловолокна. Дл  элюировани  осадков примен ют градиент рН. С помощью |радиентного смесител выдерживают рН около 5 в течение короткого периода времени дл  промывки осадка, затем рН постепенно снижают до 2,8 и наконец увеличивают до 9,0. Буферна  система состоит из 0,02 М НСООН - HCOONM , и 0,02 М N -NHj, элюирование ведут при комнатной температуре. Расход составл ет 27,2 мл/см-час.

Выход щую жидкость после опухолевого экстракта анализируют флуоресцентной спект рометрией (активаци  при 288 мкм, флуоресценци  при 350 мкм). Фракцию элюировани  между начальным рН и рН около 3 выдел ют дл  дальнейшего использовани . После лиофилизации и вымораживани  продукт можно хранить в герметичных ампулах после откачки воздуха цри минус 24° С.

Дл  характеристики размера молекулы и подтверждени  чистоты антигенный материал в виде раствора фильтруют через Ьио-Гель Р-30, который уравновешивают буфером 0,02 М НСООН -HCOONH4 рН 3,0. Элюированный СРПА раствор ют в небольшом количестве этого же буфера. Расход 3,25 мл/см час, собранные фракции 1,25 мл. Активные фракции показывают максимум спектрофотометрического nopvioiueHMH при длине волны 229-233 мкм и флуоресценцию при 350 мкм, если активаци  шла при 288 мкм.

10,4 мг СРПА, растворенные в 3,0 мл указанного буферного раствора обрабатывают на силиконизированной колонке с Био-Гелем Р-30 и получают полное выделение обоих веществ и активности. Объем элюировани  сопоставим с молекул рным весом 22000-24000. После вымораживани  получают белый гигроскопический порошок, который можно хранить на холоде, в темноте, без доступа кислорода. В продукте отсутствуют углеводы и нуклеиновые кислоты. Анализ при помощи аминокислот показывает соответствие с молекул рным весом , определенным по гелевой фильтрации.

Анализ аминокислот показывает следующее распределение веществ по мол рным процентам с точностью до ±5%: аланин 8,62, аргинин 4,57, аспартовл  кислота 10,39, цистеин 0,95, глутамова  кислота 17,04, глицин 6,87, глистидинI ,О, изолейцин 4,75, лейцин 10,49, лизин 3,69, метионин 1,91, фенилаланин 2,75, промин 3,79, серин 7,74, треонин 5,92, тирозин 3,21, валин 6,36.

Содержание аминокислот соответствует теоретическому содержанию азота 16,2-17,8%.

Пример 2. Получение СРПА-альбуминового комплекса.

11г)1цмк1 С.РПА. по.пученнун) ап .киичпо примеру I, р;)ст1)ор н)г в муравьиной кис.ште (мгшримгр (),0,i Л, р11 2 3). Получают n|ioзр; )чный раствор. К этому раствору добавл ют порсчпюк альбумина или раствор а,чьбумина при таком же рН. как у раствора муравьиной кислоты (200 вес. ч. альбумина на I вес.ч. СРПА), и получают прозрачный раствор СРПА и альбумии . Затем рН раствора медленно увеличивают добавлением основани  (например водного

раствора едко1о натра или аммиака) до рН 7,5. Получают прозрачный раствор, содержащий СРПА и альбумин в виде комплекса.

Этот (lacTBop, содержащий 12 мкг СРП А/мл, может быть использован дл  диагностики или может быть В1)делен вымораживанием комплеке в виде белого порошка. Порошок стабилен на холоде (плюс 4° С) в течение длительного времени.

Максимальное использование активности достигаетс  при весовом соотношении ильбумина к СРПА равном или больше 200:1.

Получение дубленых и меченых красных кров ных телец.

Свежую кровь овцы (1 об. ч.) добавл ют к стерильному раствору Алсевера (1,2 об. ч.). Раствор Алсевера готов т из 250 г глюкозы,

80 г дигидрата цитрата натри , 42 г NaCI и воды до 10 л, рН довод т до 6,1 при помощи КЯ/о-ного моногидрата лимонной кислоты Смесь центрифугируют и эритроциты снова суспендируют в растворе Алсевера и дважды в буферном растворе при рН 6,8.

Создают суспензию эритроцитов в буферном растворе при рН 6,8 концентрацией 10 эритроцитов в I мл на 1 объем суспензии эритроцитов, полученной как указано, добавл ют при перемепшвании к I объему буферного раствора при рН 6,8, содержащему около

18 мкг дубильной кислоты на 1 мл. Дубленые таким образом эритроциты центрифугируют и дважды суспендируют в буферном растворе при рН 7,5. Далее эритроциты суспендируют в буферном растворе.при рН 7,5 концентрацией

lO эритроцитов на 1 мл.

Порцию полученного комплекса СРПА раствор ют в буферном растворе при рН 7,5 и получают концентрацию СРПА 3 мкг/мл (расчитано по чистому СРПА). Добавл ют 1 об. ч. суспензии дуб.пеных эритроцитов по

капл м при 0° С к I об. ч. раствора СРПА комплекса в течение 10 мин. Меченые эритроциты центрифугируют и снова суспендируют и буферном растворе при рН 7,5, содержащем стабилизирующее количество инертной человеческой сыворотки, и получают суспензию, содержащую 1,6-10® меченых клеток в 1 мл. Эти меченые клетки примен ют дл  методики диа1ноза .

Пример 3. Получение антител.

/1л  переноса полипептидов в активном состо нии к клеткам, продуцирующим антитела, необходимо содержать полипептиды в раствор при рП ниже 3 (0,02 .М НСООП, рП 2,8) и эмульгировать раствор в масле до обргшоипни  чрезвычайно малых капель, защишсппьк с о ем масла. Инъекци  такой эмул1 сии прниилш

Claims (1)

1. к обрпзон пию удов,,1рительного ко.щчсп 9, ва антител, которые специфичнореагируют с СРПА н реакци х склеивани  красных кров ных телец, в которых клетки крови мечены СРПА. Получение иммунизирующего реагента. 816 мкг чистых СРПА, полученных из хран щихс  раковых опухолей человека, раствор ют в 1 мл 0,02 М НСООН при рН 2,8. К этому раствору по капл м добавл ют 1,0 мл вспомогательного масла при эмульгировании. Эмульгирование ведут по Фройнду шприцем дл  инъекций . Смесь вт гивают и вьшускают из шприца до образовани  гомогенной эмульсии белого цвета, имеющей консистенцию взбитых сливок. Одна капл  этой эмульсии при испытании с лед ной водой отдельно плавает и остаетс  неповрежденной . Полученную полутвердую эмульсию примен ют дл  подкожных и внутримышечных инъекций кроликам. Иммунизаци  п ти кроликов. В первой инъекции примен ют, так называемое полное вспомогательное вещество, а в последующих инъекци х , неполное вспомогательное вещество. После начального отбора крови у каждого из п ти кроликов дл  установлени  О - величин, им подкожно ввод т справа и слева по 408 мкг эмульгированных СРПА при рН 2,8. С интервалами в дес ть дней ввод т еще три инъекции, первую внутримь1шечно в задние лапы, а вторую и третью соответственно в переднюю и заднюю часть.. Выбирают место инъекции, исход  из использовани  приемных участков региональных лимфатических желез. Всего каждый кролик получает около 1,6 мкг СРПА в виде эмульсии. Через 14 и 24 дн  после последней инъекции берут пробы крови дл  анализа на склеивание красных кров ных телец дл  определени  наличи  специфичных антител против СРПА. Через два дн  после отбора последней пробы спускают максимальное количество крови , выделенной в виде сыворотки, которую стерильно фильтруют и перенос т малыми порци ми в стерильные пробирки. Эти пробирки можно хранить на холоде при поддержании специфических условий. Процедура диагностики. Анализ крови основан на показании наличи  СРПА по модифицированной методике подавлени  слипани  красных кров ных телец {микрометод). Сыворотку пациента (25 мкл), сорбированную красными кров ными тельцами овцы, титруют в восемь стадий двум  разбавлени ми в разбавительных пластинах Линдро 15 MQ С - 96, затем в каж дую полость добавл ют 25 мкл специфичной иммунной сыворотки при предельном разбавлении (1:2000). После инкубации при 22° С в течение 10 мин в каждую полость добавл ют по 50 мкл суспензии около 6-8 миллионов красных телец крови овцы, задубленных и меченных выделенными СРПА, комплексированными с человеческим альбумином (2-4 мкг на 10 клеток крови). Вместо эритроцитов можно примен ть другие порошкообразные носители, например латекс, бентонит или коллодий. Реакцию записывают при помощи наклонного зеркала и стандартной серии через 4-24 час после инкубации при 1 -2° С. 42 Дл  контрол  примен ют: а) клетки крови, меченные СРПА, плюс иммунна  сыворотка; б) клетки крови, меченные СРПА, без иммунной сыворотки; в) сыворотку больного плюс клетки крови, меченные человеческим альбумином; г) сыворотку больного и необработанные клетки крови; д) клетки крови, меченные СРПА, и антитела в одной серии, где ингибирование обеспечено ступенчатым уменьшением известных количеств СРПА. Жидкости дл  разбавлени  содержат соединенную от многих людей инактивированную нейтральную сыворотку дл  стабилизации клеток крови. Реагент СРПА получают из хран щихс  раковых тканей человека, очищают его с помощью гелевой фильтрации, элюировани  рНградиентом , фильтрованием через Био-Гель Р-30 и комплексированием с альбумином. В качестве иммунной сыворотки примен ют лошадиную анти-Не-La, сорбированную нормальной тканью, и запасную человеческую сыворотку . Иммуннизацию провод т промытыми с}рагментами He-La клеток, выращенных на среде Игла, содержащей инактивированной человеческой сыворотки в плоских стекл нных бутылках. Клетки собирают с помощью ЕДТА, центрифугируют и три раза промывают водой. При наличии в сыворотке большого СРПА лощадиные антитела нейтрализуютс , при этом не наблюдаетс  склеивани  при последующем добавлении клеток крови, меченных полипептидами. Регистрацию ведут по.возрастающей шкале от О до 6, где О указывает на отсутствие ингибировани , а 6- на максимальное ингибирование склеивани . Записи делают без учета состо ни  здоровь  больного. Статистический анализ экспериментальных данных показывает, что существует важна  зависимость между диагнозом рака и увеличенной концентрацией СРПА (Р 0,001). То же относитс  к соотношению между размером массы рассматриваемой опухоли и увеличенной концентрацией СРПА (Р 0,001). Независимо от типа и локализации установлено, что раковые опухоли содержат СРПА, вследствие чего СРПА  вл ютс  общими дл  всех типов рака, т. е. злокачественных опухолей эпителийного происхождени . Формула изобретени  Способ получени  антигенов путем обработи гомогенизированных ткалей органическими астворител ми, лиофилизацией осадка и повторной гомогенизацией его при низкой температуре с последующим гидролизом гидрокисью натри , обработкой хлористым натрмем, саждением в и/сэлектрической точке и растворением осадка в буфере, отличающийс  тем, то, с целью повышени  специфичности антигенов , растворенные в буфере белки фииьтрут через гель собирают фракции мо  gee. 10-10 --20-10 U повторно фильтруют через ель, собирают первую активную порцию, довод т до мол. вес. рН около ,,581842,2 рН 5,и, соедин ют осадок с гелемгелем, элюируют растворами со снижающимс  2.000 ypaBFioBeiiieHHHM буфером приf радиентом рН и собирают фракцию, элюируе5 ,0. помещают на колонку с тем жемую при рН 3,0,