FI60567C - Preparat foer anvaendning vid diagnostisering av kancer och foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents

Description

[mΓβΙ Μ1ν KUUUUTUSJULKAISU /ne/;'? «Tj IB] <11>UTLÄGGNINGSSKRIFT bUbt t ^(45) Patentti myönnetty 10 02 1932 Patent «eddelat (51) Kv.ik?/int.ci.3 C 07 G 7/00. A 61 K 39/00, - ; G 01 N 33/16 SUOMI —FINLAND (21) P»t*nttlh«k*mu» — Puuntamaknlnc 2099/73 (22) HakamtopUv· — AiwOknlnpdif 29-06.73 ^ (23) Alkuplhrt—Gllti|h«t*J*| 29-06-73 (41) Tulkit |utklMksl — Bllvlt offuntllg 11-01-7^ _ ' . (44) Nlhtlvliulpunon ja kuuLJullultur pvm. — „ , „

Patent- och registerttyrelsen v Antökan utlagd och utl.tkrlft«n publktrad 30.10.81 (32)(33)(31) Pyydetty «uoikous -Bajlrd prloriut 10-07-72 USA(US) 270273 (71) AB Bonnierföretagen, Torsgatan 21, S-105 UU Stockholm, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Knut Bertil Björklund, Bromma, Ruotsi-Sverige(SE) (7^+ ) Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab (5^+) Syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste ja menetelmä sen valmistamiseksi - Preparat för användning vid diagnostisering av kancer och förfarande för dess framställning

Toistuvasti on yritetty osoittaa kasvainreaktiivisten vasta-aineiden läsnäolo seerumeissa, joita on saatu eläimistä, joille on annettu ihmisen syöpäkasvainpreparaatteja. Jos tällaiset kokeet olisivat aina toistettavia, tämä olisi osoitus siitä, että ihmisen syöpäkudoksessa esiintyy tärkeitä antigeenejä, joita ei ole normaaleissa kudoksissa, ja voisi siten johtaa neoplastisen prosessin luonteen parempaan ymmärtämiseen. Syöpäsairauksien paremmaksi ymmärtämiseksi ihmisen syöpäkudosta on tutkittu monospesifisen, syöpäkudoksessa läsnäolevan.antigeenin olemassaolon toteamiseksi ja ennen- , kaikkea on pyritty toistettavan menetelmän aikaansaamiseen tämän antigeenin eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Paksunsuolen ja ruuansulatusjärjestelmän adenokarsinoomaan liittyvien antigeenien läsnäolon ovat osoittaneet Gold et ai: : J. expt. Med. 121 (1965) 439-462 ja J. expt. Med. 122, (1965) 467- ! 487. Näissä julkaisuissa viitataan B. Björklundin aikaisempiin j töihin, joissa on osoitettu että on olemassa sellaista ihmissyövän 1 yhteydessä esiintyvää antigeeniä, joka on yhteinen pääosalle kaikista ί i .. . ... j -2- 60567 tunnetuista epiteelistä alkuperää olevista pahanlaatuisista kasvaimista, Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1966, 8, 179 ja Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1958, 12, 24-1.

US-patenttijulkaisussa 5 665 684- selitetään karsinoembryonaalinen j antigeeni, jolla on nk. "CEA-aktiviteettia". Tämä antigeeni on i i kuitenkin täysin erilainen kuin tämän keksinnön mukaisessa valmis- ' teessä käytettävä antigeeni, joka on syöpäkudoksessa läsnäoleva polypeptidiantigeeni, eli CAPA, ja tämän erilaisuuden osoittamiseksi esitetään seuraavassa yhdistelmä tietyistä konkreettisista erilaisuuksista sekä antigeenin eristysmenetelmässä että antigeenin ominaisuuksissa. !

CEA CAPA

Lähde: syöpä paksusuolessa Lähde: kaikki syöpätyypit, syöpä- sikiö (lapsenpihka, suoli) solulinjat in vitro, istukka.

(sikiössä vähän jos lainkaan)

Uutto antigeenipitoisista kudok- Kudosten pesu vedellä neutraalis-sista glykoproteiiniliuottimelJ sa pH:ssa, uutto etyylieetterillä la alhaisessa pHrssa huoneailäm- (mahd.), uute hyljätään, kiinteiden

Potilassa: uute otetaan talteen aineiden uutto korkeassa pH:ssa

(9,5), uute otetaan talteen, lämpötila vesikäsittelyssä : £ 0°C

Isoelektrinen piste: ei ole il- Isoelektrinen piste: noin 5 moitettu tai ei esiinny (ennen loppuvaihetta) UV-valon absorptio 280 nm:ssa UV-valon absorptio 250 nm:ssa (hyvin pieni 280 nm:ssa)

Fluoresenssi : ei mainita Fluoresenssi: aktivoituminen 288 nm:ssa. Säteily 550 nm:ssa

Molekyylipaino 200 000 (voi olla -Molekyylipaino 25 000 ± 2 500 niinkin alhainen kuin 70 000)

Aktiivinen neutraalissa pH:ssa Tuhoutuu neutraalissa pH:ssa

Sisältää sokeria (Glykoproteiini) Ei sokeria kaasu-nestekromatogra- fi- ja raassaspektrografi-analyysien mukaan

Ei CAPA:n vasta-aineiden inhiboi- Inhiboi spesifisen vasta-aineensa tumista hemagglutinaatiokokeessa hemagglut.inaatiokokeessa

Ei saa aikaan parkkihapol.la käsi- Saa aikaan näiden verisolujen teltyjen lampaan punaverisolujen merkitsemisen merkitsemistä -5- 60567

CEA CAPA

Esiintyy syöpäsairauksissa muuta- Esiintyy seerumissa välillä 0,09-mista nanogrammoista 100-200 na- 9 yg/ml (vastaa 90-8000 ng/ml) nogrammaan ml kohti olevissa pi- olevissa pitoisuuksissa, eli noin toisuuksissa 20 kertaa suuremmissa pitoisuuk sissa kuin CEA .

Testimenettely: kallis, aikaa- Helppo, nopea, halpa, ei isotoop- vievä, vaatii radioaktiivisia peja, ei tarvita kallista kalus- isotooppeja toa Käytännöllistä ja kaupallisesti käyttökelpoista menetelmää antigeenin eristämiseksi per se ei tähän mennessä ole saatu aikaan, eikä antigeenin yhteyttä erilaisiin syöpäsairauksiin ole selvitetty. Niinpä tähän mennessä ei ole ollut mahdollista eristää ja karakterisoida ihmissyövän yhteydessä esiintyvää antigeeniä käytännöllisillä ja toistettavilla menetelmillä, eikä myöskään ole ollut mahdollista määrittää tai edes osoittaa antigeenin läsnäoloa piileviä tai todettuja syöpäsairauksia potevien henkilöiden veressä diagnostisella testillä, joka sopii suurimittakaavaiseen tutkimukseen.

Jotta kasvaimessa esiintyvälle antigeenille spesifisten vasta-aineiden läsnäoloa eläin-antiseerumeissa voitaisiin käyttää hyväksi diagnostisesti on kehitettävä testi, joka osoittaa kasvain-antigeenin läsnäolon potilaan veressä. Tähän mennessä tunnetut menetelmät eivät ole osoittautuneet tehokkaiksi varman syöpädiagnoosin tekemiseksi.

Keksinnön tarkoituksena on näinollen saada aikaan syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste, joka sisältää ihmisen syöpä-kudoksessa läsnäolevaa antigeeniä, sekoitettuna stabiloivan määrän kanssa inerttiä proteiiniä, kuten albumiinia, sekä tällaisen valmisteen valmistusmenetelmä,ja keksinnön tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.

Kuten jäljempänä selityksessä statistisista tutkimuksista selviää, sisältävät syöpäkasvaimet tyypistä ja sijaintipaista riippumatta CAPA:a ja tämä CAPA on yhteinen kaikille tunnetuille syöpätyypeille .

M» 60567

Aine, jolla on CAPA-aktiviteettia, eristetään ja puhdistetaan , homogenoimalla ruumiinavauksista saatuja pahanlaatuisia kudoksia, jolloin eri tyyppisiä ja eri paikoista peräisin olevia karsinooma- j j kudoksia kerätään kasvainvarastoksi ("pool"). Esimerkkeinä tutki- j tuista syöpätyypeistä mainittakoon paksusuoli-, peräsuoli-, keuhko-, ruokatorvi-, vatsa-, haima-, munuais-, virtsarakko-, rinta-, kohtu-, ! munasarja-, maksasyöpä, leukemia. Vaihtoehtoisesti lähtöaineina . i voidaan käyttää kudosta ihmisistukasta tai pahanlaatuisia solu- j viljelmiä in vitro (tällaisista viljelmistä tarkemmin katso B. <

Björklund, V. Björklund ja I. Hedlöf, J. Nat. Cancer. Instr. 26: 1961, "Antigenicity of»Pooled Human Malignant and Normal Tissues hy Cytoimmunological Technique. III. Distribution of Tumor Antigen"). Myös normaalikudoksia kerätään samanaikaisesti pahanlaatuisten kudosten kanssa. Kuviossa 1 on esitetty uusi testimenetelmä käyttökelpoisen puhtaan antigeenin eristämiseksi. Biokemiallisten erotusmenetelmien soveltamista ohjattiin näin ollen herkällä immunologisella määritysmenetelmällä, jolla pystyttiin havaitsemaan alle 1 ng (nano-gramma) suuruisia antigeenimääriä. Kuvion 1 mukaisen määritystekniikan suurin ansio on sen selektiivisyys. Verrattavien uutteiden erot antigeenivaikutuksessa määritettiin mitättömien samanlaisuuksien muodostamaa taustaa vasten, jolloin määritysjärjestelmä toimii feedback-kontrollina sarjassa kemiallisia menetelmiä, joita vaihdeltiin niin, että saatiin 1. kasvainfraktio, jolla oli maksimaalinen antigeeninen reaktivi-teetti normaalien antigeenien absorboimien anti-kasvainseeru-mien kanssa; 2. kasvainfraktio, jolla oli minimaalinen antigeeninen reaktivi-teetti kasvain-antigeenien absorboimien anti-kasvainseerumien kanssa. Lisäkontrollin vuoksi valmistettiin myös kasvainfrak-tioita, joilla oli minimaalinen reaktiviteetti normaalien tai kasvainantigeenien absorboimien anti-normaalien seerumien kanssa.

Karsinomakudosta ja normaalia kudosta sekoitetaan jäätyneinä erikseen veteen, jonka lämpötila on noin 0°C, ja homogenoidaan kehittämättä liikaa kitkalämpöä, joka aiheuttaisi asianomaisen CAPA:n inaktivoitumisen. Suspension lämpötilan ei saa antaa nousta yli noin 0°C.

Saatuun nestemäisen homogenaatin ja kiinteiden aineosien kylmään seokseen sekoitetaan orgaanista liuotinta, joka pystyy liuottamaan lipidejä, kuten neutraaleja rasvoja, esimerkiksi asetonia tai -5- 60567 etyylieetteriä, alle noin 0°C:n lämpötilassa, jonka liuotinkäsit- · telyn tarkoituksena on poistaa mm. lipidiaineet ja saattaa antigeeniset ryhmät alttiimmiksi käsittelylle. Kiinteät aineet erotetaan seoksesta, sopivasti sentrifugoimalla, ja vesi- ja liuotinkerrokset hylätään. Lämpötila ei saa nousta yli noin + 4°C.

Talteenotetut kiinteät aineet lyofilisoidaan ja lyofilisoitu kudosjauhe jauhetaan, esim. ruostumatonta terästä olevassa kuula-myllyssä, alhaisessa, mieluimmin alle noin 0°C:n ja sopivasti alle noin -70°C:n lämpötilassa. Jauhamalla saadaan hienoa, harmaanruskeata jauhetta.

Saatu jauhe voidaan haluttaessa uuttaa jollakin suolaliuoksella, kuten fysiologisella keittosuolaliuoksella, neutraalissa pH:ssa, alhaisessa, sopivasti noin 0°C:n lämpötilassa ja sentrifugoida, jonka jälkeen sakan päällä oleva neste hylätään. Näin saatu liete voidaan suspensoida uudelleen kylmään veteen, jolloin sakka otetaan talteen ja lyofilisoidaan. Saatua jauhetta voidaan säilyttää' vuosikausia suljetuissa pulloissa noin 4°C:ssa.

Kun edellämainittuja polypeptidipitoisia kasvain- ja normaali-jauheita uutetaan vedellä alkalisessa pH:ssa, uutteet tulevat sameiksi kun niihin lisätään NaCl:a neutraalissa tai lievästi alkalisessa pH: ssa. Tämä sameus johtuu pääasiassa nukleiinihappotyyppisten epäpuhtauksien läsnäolosta. Suolaliuoksella käsiteltyjen uutteiden sentrifug-oimisen jälkeen kaikki aktiiviteetti jää kirkkaaseen, sakan päällä olevaan nesteeseen. Tämä neste voidaan isoelektrisesti saos-taa happamassa pH: ssa, sopivasti pH:ssa noin t,8, ja saadut sakat liuottaa fosfaatilla puskuroituun vesiliuokseen, jonka pH on noin 7»0.

Edellä selitetyllä menettelyllä saadut liuokset suodatetaan sopivalla helmimäisellä molekyyl.iseulatyyppisellä geelillä, jolla g voidaan fraktioida yhdisteet, joiden molekyylipaino on 10*10 :sta 20*10^:een, erityisesti noin 15*10^, jolloin suodatusgeeli eluoidaan puskurilla, jonka pH on likimäärin neutraali, ja molekyylipai.no-fraktio 10-10^ — 20*10^, erityisesti noin 15*10^, otetaan talteen. Geeli eli molekyyliseula voi olla polyakryyliamidigeeli, ristikytketty dekstraanigeeli, agar- tai agaroosigeeli tai vastaava, geeli tai molc-kyyliseula, kuten esim. Bio-Gel A~50m (kauppanimi agaroosigeelille jota valmistaa Bio-Rad Laboratories, Munchen, Saksa-BRD; 100-200 mesh (0,1^9-0,074 mm) erotusraja 30*10^ daltonia, fraktioimisalue 10^ — 90-106 daltonia, likimääräinen agaroosipitoisuus 2 %) tai Sepharose 2B (kauppanimi agaroosigeelille jota valmistaa-Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi; 60-300 mikronia, helmiä, fraktioim.i.s- 60567 5 6 alue 10 — 20-10 , likimääräinen agaroosipitoisuus 2 %), ja

geeli tasapainotetaan sopivalla puskuriliuoksella, jonka pH on noin 7,0, kuten Sörensen'in puskurilla (1/15 N puskuriliuos, joka I

perustuu natrium- ja kaliumfosfaatteihin), laimennettuna suhteessa j 1:10. Tähän geelisuodatukseen käytetyn seulan eli geelin tyyppi ei j ole kriittinen, ja ainoa vaatimus tässä suhteessa on se, että sen on ^ pystyttävä saamaan aikaan edellä mainitulla molekyylipainoalueella olevien yhdisteiden fraktioiminen. Vielä eräs keksinnön tarkoitukseen käyttökelpoinen geeli on Bio-Gel A-150m (Bio-Rad Laboratories; 100-200 mesh, erotusraja 1^0-10^ daltonia, fraktioimisalue 10^ — >150-10^ daltonia). Lisätietoja geelisuodatustekniikasta saa H. Determann'in teoksesta "Gelchromatographie" , Springer. Verlag, Berliini,

Heidelberg, New York 1967· Suodatukseen käytetty eluentti on puskuri-liuos, jonka pH on noin 7, ja eluaatissa antigeeniaktiviteetti on siinä fraktiossa, joka sisältää mainitun molekyylipainoalueen ja joka otetaan talteen.

Edellä selitetystä geelisuodatuksesta saadut saostetut aktiiviset fraktiot liuotetaan sopivaan puskuriin, jonka pH on noin 7,0, kuten Sörensen'in puskuriin, laimennettuna suhteessa 1:10, ja saadut liuokset suodatetaan kolonnin läpi, joka on täytetty molekyyliseula-tyyppisellä heikolla ioninvaihtogeelillä, jolla on heikot ioninvaihto-ominaisuudet, esimerkiksi jollakin polyakryyliamidi-geelillä, kuten Bio-Gel P-2:lla (määritellään jäljempänä), ja kolonni tasapainotetaan samanlaisella puskurilla, jonka pH on noin 7,0. Fraktioksi, jolla on antigeeniaktiviteettia, todetaan liuoksen se fraktio, joka poistuu kolonnista ensimmäisenä, ja tämä fraktio otetaan talteen.

Edellä selitetystä Bio-Gel P-2:11a suoritetusta kromatograflasta talteenotettua fraktiota käsitellään sitten CAPA:n edelleen puhdistamista varten. Periaatteessa tässä käsittelymenetelmässä on seuraa-vat vaiheet: proteiinien tai konjugoitujen proteiinien seos saoste-taan säätämällä pH isoelektriseen pisteeseen. Näin saatu sakka sekoitetaan sopivaan geeliin, joka valitaan kyseessä olevan proteiinin mukaan. Näin saatu sakan ja geelin seos kerrostetaan kolonnin yläpäähän joka sisältää samaa geeliä samassa isoelektrisessa pH:ssa, so. siinä pH:ssa, joka on isoelektrinen proteiinien saostamiseksi edellisessä vaiheessa. Kolonni eluoidaan sitten vähitellen suurentaen tai pienentäen pH-arvoa. Eluaatista otetaan talteen se fraktio tai ne fraktiot, jotka sisältävät haluttua proteiinia tai proteiineja. Vaikkakaan tätä menetelmää ei haluta sitoa mihinkään nimenomaiseen teoriaan, pidetään todennäköisenä, että pxOteiiniseoksen erottuminen eri. molekyyliinjeihinsa on selitettävissä seuraavasti: - 7 - 60567

Seostetut proteiinit joutuvat ionivirtaukselle alttiiksi, joka saattaa yhden proteiinin toisensa jälkeen liukenemaan. Eri proteiinien solubilisoi-miseksi tarvittava aika riippuu ioniväkevyydestä, pHrsta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta. Koska kunkin liuenneen proteiinin jakaantumis-kerroin on alempi kuin ionigradientin jakaantumiskerroin, proteiini liikkuu geelissä nopeammin kuin ionigradientti. Tämän johdosta proteiini saostuu uudelleen ja jää liikkumattomaksi, kunnes sen liuottaa uudelleen lähestyvä ionirintama. Tämä prosessi toistuu lukemattomia kertoja saaden aikaan toisiinsa nähden vain hiukan poikkeavien molekyylilajien erottumisen toisistaan.

Bio-Gel P-2 on ristikytketty polyakryyliamidi (100-200 mesh), jonka molekyylipainon erotusraja on noin 2000, mutta tämä erotusraja ei ole kriittinen. Muita käyttökelpoisia geelejä ovat risfcikytketyt dekstraanigeelit, kuten Sephadex G-25, jonka molekyylipainon erotus-raja on noin 25000, mutta tämäkään erotusraja ei ole kriittinen. Nämä geelit ovat molekyyliseulatyyppisiä ja niitä käytetään tavallisesti helmimäisinä. Mitä tahansa tällaista molekyyliseulatyyppistä geeliä, jonka molekyylipainon erotusraja on vähintään noin 2000-3000, voidaan tyydyttävästi käyttää. Molekyyliseulatyyppisiä geelejä, jotka sopivat geelisuodatukseen tämän gradienttieluoinnin yhteydessä on seli- ! tetty Gellotte'n artikkelissa "Fractionation of Proteins, Peptides and Amino Acids by Gel Filtration", teoksessa "New Biochemical Separations", Van Nostrand, London/New York, 1964.

Edellä mainitusta kromatografoinmsta talteenotetuille normaalille ja CAPA-fraktiolle suoritetaan aktiivisen aineen saostus pHrssa i i noin 5, jolloin sakka otetaan talteen ja liuotetaan veteen, jonka pH on noin 8,5· Kirkkaiden liuosten pH saatetaan sitten happamalle puolelle sopivasti arvoon noin 5,0 muurahaishapolla,.mistä aiheutuu saostuminen. Kukin sakka sekoitetaan samanlaiseen geelilietteeseen kuin edellä, ja joka on saatettu tasapainoon HCOOH-HCOONH^r11a pH:ssa noin 5,0. Klikin seos siirretään sitten edellisen mukaisesti tasa- |

painotetun geelikolonnin yläpäähän. I

Sakkojen eluoimiseen käytetään pH-gradienttia, tässä tapauk- j sessa progressiivisesti alenevaa pH:ta. Sopiva puskurijärjestelmä on HCOOH-HCOONH^ tai NH^HCO^-NH^. Antigeeniaktiviteettia esiintyy eluaatissa alkuperäisen pH:n ja pH-arvoon noin 3 välillä.

Edellämainitulla pH-alueella talteenotettu eluaattifraktio j sisältää halutun CAPA:n, joka voidaan ottaa talteen kylmäkuivaarnalla. Mainitun eluaattifraktion CAPA:n molekyylipainon määrittämiseksi i fraktio voidaan suodattaa geelikolonnilla, joka on tasapainotettu HCOOH-HCOONH^r11a pHrssa noin 3,0, jolloin geeli on jokin edellä- m -8- 60567 mainituista geeleistä. Bio-Gel P-30 (kauppanimi polyakryyliamidi-geelille, jota valmistaa Bio-Rad Laboratories, Munchen, Saksa-BRD; 100-200 mesh, erotusraja 40000 daltonia, fraktioraisalue 2500-40000 daltonia) ja Sephadex G-75 tai G-50 (kauppanimi dekstraani-geeleille, joita valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi; 40-120 ja 50-150 mikronia, fraktioimisalueet 3-70000 ja vastaavasti 1-30000) ovat erityisen sopivia geelejä tähän suodatukseen. Eluoi- j dut CAPA-fraktiot joiden spektrofotometrinen absorptiohuippu on ' aaltopituus-alueella noin 229 - noin 233 nm ja molekyylipaino välillä ; 20000-27000, otetaan talteen.

CAPA voidaan ottaa talteen aktiivisesta fraktiosta suodatuksen jälkeen kylmäkuivaamalla ja voidaan säilyttää pitkän aikaa tyhjössä, kylmässä ja pimeässä.

Eristetty aine koostuu polypeptidista, joka perustuu yksinker- ! täiseen peptidiketjuun, mikä voidaan osoittaa permuurahaishappokäsit- ; telyllä. CAPA reagoi emäksisesti ja se on liukoinen pH-välillä noin ; 1-3,5- Suojaamaton polypeptidi denaturoituu palautumattomasti neutraalissa pH:ssa, s.o. pH:n ylittäessä noin 4,5- Antigeeni on hygroskooppinen, muuttuu keltaiseksi, inaktivoituu ja tiilee tahnamaiseksi kostuessaan.

Puhdistettu CAPA sisältää fluorisoivan ryhmän joka aktivoituu noin 288 nm:n aaltopituudessa ja lähettää valoa noin 350 nm:n aaltopituudessa. Fluoresenssi on suhteellinen CAPA:n määrään, joten sitä voidaan käyttää polypeptidin läsnäolon määrittämiseen sen eristämis-vaiheen aikana.

CAPA:11a on spektrofotometrinen absorptiohuippu aaltopituus-alueella noin 229-233 nm. Sillä on voimakas taipumus aggregoitumioeen eikä se ole suodatettavissa normaaleilla steriloimisessa käytetyillä suodatuskeinoilla. On osoitettu, että CAPA on peräisin syöpäsolujen seinämistä, koska vasta-aineet, joita on kehitetty ruiskuttamalla CAPA:a elävän eläimen kehoon, aiheuttavat syöpäsolujen täydellisen lyysin eli hajaantumisen in vivo kun nämä solut joutuvat näiden vasta-aineiden vaikutukselle alttiiksi.

Niin kuin edellä on mainittu, polypeptidin molekyylipaino on välillä 20000-27000, tarkemmin sanottu noin 24000. Analyysit osoittavat, että se ei sisällä hiilihydraatteja, ja spektrofotornetria osoittaa että siinä ei ole nukleiinihappoja. Aminohappo-analysaattorilla sekä hapetusta käyttäen että sitä käyttämättä suoritetut analyysit varmistavat sitä molekyylipa inoa, joka on määrätty suodattamalla Bio-Gel P-30:11a tai vastaavalla geelillä.

Eristettyä CAPA:a voidaan käyttää moniin ta rkoituksiin, kuten • - 9 - 60567 monospesifisten vasta-aineiden valmistukseen, diagnostisiin tarkoituksiin, immunoimismenetelmiin, ja aktiivisena aineosana seoksiin, joita voidaan käyttää immunoimiSaineina.

Antigeenin aktiviteetti in vitro neutraaleissa pH-arvoissa säilytetään kompleksoimalla CAPA:a jonkin inertin proteiinin, kuten ihmis- tai nauta-albumiinin kanssa, jolloin saadaan muodostetuksi kompleksi, joka on liukoinen neutraalilla pH-alueella samalla kun se säilyttää antigeenin aktiviteetin in vitro.

Syöpädiagnoosia varten on kehitetty modifioitu hemagglutinaatio-inhibitiotekniikka. Tällä tekniikalla voidaan määrittää CAPA.-n läsnäolo syövän eri kehitysvaiheissa tutkimalla esimerkiksi potilaan seerumia, kudoksia, eritteitä ja uutteita elävistä eläimistä, myös esimerkiksi ruuminavaus- ja leikkausnäytteitä, punktioita ja sively-valmisteita. Tämä modifioitu hemagglutinaatioinhibitiotekniikka käsittää menetelmän, jossa on seuraavat vaiheet: a) tutkittavasta aineesta valmistetaan sarja näytteitä laimennus- sarjana ; b) jokaiseen näytteeseen lisätään ennaltamäärätty määrä anti-seerumia, joka sisältää CAPA:an nähden spesifisia vasta-aineita; c) inkubaation jälkeen jokaiseen inkuboituun näytteeseen lisätään ennaltamäärätty määrä CAPA:a, käyttäen hienojakoista kantaja- ainetta ; d) näin saatua käsiteltyjen näytteiden sarjaa verrataan sarjaan vertausnäytteitä, joissa on pienenevät, tunnetut inhibition aikaansaavat määrät CAPA:a ja ennaltamäärätyt määrät mainittuja vasta-aineita sisältävää antiseerumia, ja sen jälkeen jokaiseen näytteeseen lisätään ennalta määrätty määrä CAPA:a samaa hienojakoista kantaja-ainetta käyttäen; ja e) verrataan mainittua näytesarjaa ja mainittua vertausnäyte- - 10 - 60567 sarjaa tutkittavan aineen sisältämän CAPA-määrän määrittämiseksi ja syövän osoittamiseksi ja sen kehitysvaiheen selville saamiseksi.

Sanonnalla "eläviä eläimiä" ymmärretään tässä selityksessä myös ihmistä.

Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla. Esimerkki Λ- ·

Puhtaan antigeenin eristäminen

Koska on osoitettu (Int. Arch. Allergy 56; 191-205 (1969), "Systematic Antigenic Change in Human Carcinoma Tissues by Hemagglutination Techniques", kirj. B. Björklund), että suurin osa syöpäkudok-sesta sisältää tämän keksinnön mukaisessa valmisteessa käytettävää antigeeniä, eri tyyppisiä ja eri paikoista peräisin olevia syöpäku-doksia kerättiin kasvainvarastoksi eli pooliksi. Tässä tapauksessa pooli koostui makroskooppisesti puhtaista, histologisesti' verifioiduista syöpäkudoksista, jotka olivat peräisin seuraavista elimistä t (ruumiinavauksista): rinta, keuhkoputki, umpisuoli, paksusuoli, pohju-kaissuoli, sappirakko, munuainen, kurkunpää, maksa, keuhko, ruokatorvi, munasarja, haima, eturauhanen, peräaukko, maha, emä. Normaaleja kudok-siä kerättiin lukuisilta yksilöiltä isoantigeeni-, kudosant.igeeni- ja yksilöantigeenipoolin muodostamiseksi. Käytettiin ruumiinavaustapauk-sia, ja kasvaindiagnoosit todettiin histologisesti. Lisäksi varmistettiin immunologisen ristireaktiviteetin perusteella tuoreiden kasvainkudosten ja elävien kasvainsolujen kanssa että asianomainen kas-vainantigeeni oli vahingoittumaton. Aseptisuutta ylläpidettiin aina kun se oli mahdollista. Ruumiinavauksista saadut syöpä- ja normaali-kudokset leikattiin puhtaiksi naapurikudoksesta ja paloiteltiin 2-5 cm:n kuutioiksi, joita pestiin 0,9 % NaCl:ssa 0°C:ssa, kunnes niistä ei enää lähtenyt veriväriä. Pestyt kuutiot jäädytettiin ja säily- ! tettiin -24-°C:ssa.

Vielä jäätyneinä kudoskuutioihin sekoitettiin 10 ml Η£θ 0°C:ssa kutakin jäätyneen kudoksen grammaa kohti, ja homogenoitiin jäähdytetyssä MSE Ato-^Mix-homogenoimislaitteessa (Measuring and Scientific Equipment Ltd, Lontoo, Englanti).

jossa oli pyörivät terät, "puolella nopeudella", kolmen kulloinkin yhden minuutin pitkän jakson aikana. Tässä yhteydessä huomattakoon, että suspension lämpötila on pysytettävä noin 0°C:ssa, mieluimmin hiukan sen alapuolella.

- 11 - 60567

Kylmä homogenaatti kaadettiin kylmiin 1000 ml:n polyeteeni- pulloihin, 4-00 ml suspensiota ja 400 ml etyylieetteriä -20°C:ssa (Aether ad narcosin pH Nord." sis. 0,002 % difenyyliamiinia, Skanska

Bomullskrutfabriken AB:lta, Dösjebro, Ruotsi) sekoitettiin kussakin pullossa ja hämmennettiin -2°C:ssa 120 minuuttia International PR-2 sentrifugi-täristyslaitteessa (international Equipment, Needham Ltd, Mags, USA) moottorin , . , . ,. _ , , . _ pyöriessä nopeudella 300 kierrosta minuutissa. Seosta sentnfugoi- tiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 5 minuuttia. Tämän vaiheen aikana lipidi-kerros ei sekoitu kudoskerroksen kanssa. Etyylieetteri ja lipidi-kerros hylättiin, ja uutettiin toisen kerran 60 minuuttia, sentrifu-goitiin 5 minuuttia, ja eetteri-lipidikerros poistettiin. Lopuksi sentrifugoitiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 30 minuuttia, ja vesikerros poistettiin, vaikka se sisälsi jonkin verran CAPA:a. Jäljellä olevat liukenemattomat aineet otettiin talteen. Jäljellä oleva etyylieetteri poistettiin käyttämällä alipainetta 5 minuuttia.

Antigeeniä sisältävä aines suspendoitiin 50 ml:aan HpO 0°C:ssa, siirrettiin 500 ml:n infuusiopulloihin ja jäädytettiin -70°C:ssa kuivajäällä ja etanolilla.

Lyofilisomti suoritettiin Texvac Type IV A lyofilisaattorissa (Textor, Bad Soden, Taunus, Saksa-BRD), säädetyssä lämpötilassa.

Lyofilisoitua kudosjauhetta jauhettiin ruostumatonta terästä olevassa kuulamyllyssä ("Cytolator", Lars Ljungberg Company, Tukholma, Ruotsi) noin -70°C:n lämpötilassa 1 tunti nopeudella 4-0 kierrosta minuutissa. Jauhamalla saatiin hienoa, harmaanruskeaa jauhetta. Tätä jauhetta uutettiin esijäähdytetyllä etyylieetterillä -2°C:ssa PR-2 tärytyslaitteessa nopeudella 300 kierrosta minuutissa 60 minuuttia ja sentrifugoitiin 1000 x G:ssa -2°C:ssa 30 minuuttia. Eetterdkerros poistettiin ja sedimentti kuivattiin tyhjössä. Saatua raakaa kudos-jauhetta (CTP) voidaan säilyttää vuosikausia 4-°C:ssa suljetuissa pulloissa aktiviteetin mainittavasti alenematta.

5 g CTP:tä suspendoitiin pH-arvon ollessa neutraali 500 ml:aan suolaliuosta, joka sisälsi steriilejä jääkuutioita. Suspensio homogenoitiin'MSE Ato-mix:issä "puolella nopeudella" kolmen, kulloinkin yhden minuutin pituisen jakson aikana. Lämpötila pysytettiin 0°C:ssa. Seos pidettiin 0°C: ssa 30 minuuttia samalla hitaasti hämznentäen. Sentrifugoi ti in 1000 x G:ssa 0°C:ssa 4-0 minuuttia. Sakan päällä oleva neste hylättiin.

Cod imeniti suspendoitiin uudelleen 500 ml:aan kylmää, tislattua vettä ja hämrncnnettiin hitaasti 0°C:ssa 30 minuuttia. Sontrifu-goitiin 1000 x G:ssa 0°C:ssa 40 minuuttia ja sakan päällä oleva neste hylättiin. Jäljellä oleva sedimentti suspendoitiin 25 ml:aan kylmää tislattua vettä ja jäädytettiin -70°C:ssa (kuivaiäätä ja _ 12 _ 60567 etanolia). Lyofilisoimalla saatiin pesty kudosjauhe (WTP), jota voidaan säilyttää vuosikausia suljetuissa pulloissa 4°C:ssa.

Valmistettiin vesiuutteet CAPA:sta ja normaalista WTP:stä pH:ssa 9,5 ja väkevöitiin 10 kertaisiksi isoelektrisellä saostuksella ; pH: ssa 4,8 ja liuottamalla sakka pH:ssa 9,5 kymmenesosaan käytetyn j veden tilavuudesta. Saatu väkevöity liuos stabiloitiin lämmittämällä se nopeasti 98-100°C:n lämpötilaan ja ylläpitämällä tämä lämpötila 5-10 minuuttia. Tämä lämpökäsittely hävittää entsyymit, jotka muutoin inaktivoisivat CAPA:n. Stabiloitu uute tuli sameaksi kun siihen lisättiin suolaliuosta pH:ssa 7,5, jäljellä olevien nukleiinihappotyyppis-ten epäpuhtauksien saostumisen johdosta. Näiden jäljellä olevien epäpuhtauksien saostamiseksi saostettiin erikseen 8,0 ml CAPA:a ja normaaleja vesiuutteita lisäämällä 0,8 ml 10 %:sta NaCl-liuosta. Sentrifugoitiin 27000 x G:ssa 0°C:ssa 1 tunti, minkä jälkeen kirkkaat, sakan päällä olevat nesteet saostettiin isoelektrisesti pH:ssa 4.8 (pH säädettiin 0,1-n HC1:11a tai 0,1-n HC00H:lla). Sakat liuotettiin 2-5 ml:aan'M/150-fosfaattipuskuria, pH 7,0.

Näin saadut kasvain- ja normaalista WTP:stä peräisin olevat liuokset suodatettiin jäähdytetyissä Bio-Gel A-50m (joka on määritelty sivulla 5), kolonneissa, joiden sisäläpimitta oli 2,50 cm ja p pituus 138 cm, virtausnopeudella 6,3 ml/cm /h. Geeli tasapainotettiin M/150-fosfaattipuskurilla, pH 7,0, 2 % n-butanolilla, ja eluoitiin samalla puskurilla. Jokaisessa ajossa käytettiin 4-8 ml uutetta, joka sisälsi yhteensä 50-100 mg proteiinia.

Antigeeniaktiviteetti löytyi kasvainuutteen keskifraktiosta.

1,0 ml:n näyteraäärä tästä jakeesta, yhteensä 160-180 ml, laimennettiin kolme kertaa ja saatettiin eri pH-arvoihin välillä 2,0-9,0.

Viiden minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa näytteet siirrettiin kyvetteihin ja niiden valonhajoitus 500 nm:ssa mitattiin 90° kulmassa. Hajoitusintensiteetit piirrettiin pH:n funktiona, jolloin todettiin maksimi pH:ssa 4,8, joka on fraktion isoelektrinen piste. Tämä menettely edustaa uutta tekniikkaa, joka on kehitetty jotta voitaisiin määrittää tarkat ja tarpeelliset olosuhteet CAPA:n puhdistamiselle. Tavanomaista tekniikka isoelektrisen pisteen määrittämiseksi ei voida käyttää alhaisen peptidipitoisuuden takia.

Aktiivisen keskijakeen jäljellä oleva osa saostettiin pH:ssa 4.8 0,1-normaalilla HCl:lla. Sentrifugoitiin 3800 x G:ssa 0°C:ssa 5 minuuttia, jolloin aktiviteetin saanto oli kvantitatiivinen.

CAPA:n edo!Icon puhdistamiseksi sodimentoidut, aktiiviset keskifraktiot viidestä Bio-Gel A-50m-kolonnista liuotettiin M/I5O-fosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH oli. 7,0 (Sorcnsen'Ln puskuri 2 % --13 - 605 67 n-butanolissa), 5 %:iin alkuperäisestä eluaattitilavuudesta. Tämä liuos, joka sisälsi 130 mg proteiinia 8,5 ml:ssa, suodatettiin (edellä määritellyn) Bio-Gel P-2-kolonnin läpi jonka läpimitan suhde korkeu-teen oli 1/35 virtausnopeuden ollessa 35/cm /h. Kolonni oli tasapainotettu M/150-fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 7,0 (Sorensen'in puskuri 2 % n-butanolissa). Kutakin proteiinin mg kohti sallittiin 10 ml:n kerrostilavuus.

Ensimmäinen fraktio oli aktiivinen ja se eluoitiin eluoimis-puskurilla, jonka pH oli 7,0, samalla kun epäpuhtaudet absorboituivat geeliin käytetyssä alhaisessa ioniväkevyydessä. Aktiivinen aine saos-tettiin pH:ssa 4,8 0,1-M HC00H:lla ja sentrifugoitiin 3800 x G:ssa 0°C:ssa 5 minuuttia. Sedimentti liuotettiin 8,5 mitään vettä ja pH saatettiin arvoon 8,5 0,1-M NH^QH:lla. Kirkas liuos saostettiin uudelleen kolme kertaa 0,1-M HC00H:lla pH:ssa 4,8, pestiin sentrifugissa samassa pH:ssa ja liuotettiin pHrssa 8,5· N-butanolin häviämistä seurattiin kaasu-neste-kromatografiällä. Lopullinen liuos varastoitiin ampulleihin, jäädytettiin ja lyofilisoitiin. Saatu tuote oli kuivaa, melkein valkeaa jauhetta ja tämä jauhe varastoitiin -24°C:ssa evakuoiduissa ja suljetuissa ampulleissa.

Identtistä menettelyä sovellettiin normaalista kudoksesta peräisin olevaan uutteeseen, eikä tällöin todettu aktiviteettia.

Edellä selitetystä kromatografoinnista saadun tuotteen edelleen puhdistamiseksi kehitettiin pH-gradie.ntti-eluointimenetelmä. Tämä menetelmä koostuu periaatteessa seuraavista vaiheista. Proteiiniseos, joka on puhdistettava aktiiviseen komponenttiinsa nähden, saostetaan säätämällä pH isoelektriseksi. .Sakka sekoitetaan sopivaan geeliin kuten Sephadex G-25:een (edellä määritelty) tai Bio-Gel P-2:een (edellä määritelty). Tämä seos kerrostetaan samaa geeliä samassa isoelektrisessä pH:ssa sisältävän kolonnin yläpäähän. Sitten kolonni pH-gradientti-eluoidaan pysyttäen virtausnopeus ja lämpötila vakioina. Kolonni eluoidaan täten väliaineella jonka pH nousee tai laskee jatkuvasti tai portaittain.

Puheena olevassa tapauksessa gradientti-eluointi suoritettiin 15 mg:lie lyofilisoitua, suolatonta CAPA-jauhetta ja aikaisemmin selitetyllä tavalla puhdistettua normaalia anti geen i, jauhetta, tässä tapauksessa alenevaa pH:ta käyttäen. Jauheet liuotettiin erikseen vetoon, jolloin pH asetettiin arvoon 8,5 0,1-n NH^OH:11a. Kirkkaat liuokset saa lottiin sitten pH-arvoon 5,0 0,1-11 1100011:1 la, inistä aiheutui saostuminen. Molemmat sakat sekoitettiin 10 ml:aan Rio-Gel P-2-1ietettä, joka oli tasapainotettu vesiliuoksella joka oli valmistettu 0,02-M HC00H:sta ja 0,02-M HC00NH^:sta niin että pH oli 5,0.

<#r -14- 60567 •Molemmat seokset pantiin 15 ml silikonilla käsitellyn, sisäläpi-mitaltaan 16 mm ja pituudeltaan 150 mm olevan, edellä selitetyllä tavalla tasapainotetun Bio-Gel P-2-kolonnin yläpäähän. Geeliä kannatti pieni määrä lasivillaa.

Sakkojen eluoimiseen käytettiin pH-gradienttia. Gradientti-sekoittimen (Ultrograd, LKB, Ruotsi) avulla pH pysytettiin arvossa noin 5 vähän aikaa sakan pesemiseksi, minkä jälkeen pH vähitellen alennettiin arvoon 2,8. Lopuksi pH korotettiin arvoon 9· Puskurijärjestelmässä oli 0,02-M HCOOH - HCOONH^ ja 0,02-M NH^HCOO^ - NH^, ja eluointi suoritettiin huoneen lämpötilassa. Virtausnopeus pysytes- p täin arvossa 27,1 ml kolonnin poikkileikkauksen cm" kohti tunnissa.

Kasvainuutteen eluaatti analysoitiin fluoresenssi-spektrometri-sesti (aktivoitiin 238 nmrssa, fluoresenssi 550 nm:ssa). Alkuperäisen pH:n ja pH-arvon noin 3 välinen fraktio otettiin talteen edelleen käytettäväksi. Tuote lyofilisoitiin, kylmäkuivattiin, ja varastoitiin suljettuihin, evakuoituihin ampulleihin -24°C:seen.

Molekyylikoon karakterisoimiseksi ja puhtauden varmistamiseksi antigeeniaineen liuos suodatettiin Bio-Gel P-30.:lla (edellä määritelty) joka oli tasapainotettu puskurilla 0,02-M HCOOH - HCOONH^, pH 3,0. pH-eluoitu CAPA liuotettiin pieneen määrään samaa puskuria.

o

Virtausnopeus oli 3,25 ml/cm /h ja kerätyt fraktiot olivat 1,24 ml. Aktiivisilla fraktioilla oli spektrofotometrinen absorptiomaksimi aaltopituudessa 229-233 nm ja fluoresenssi 350 nm:ssa, aktivoituna 283 muissa.

Tyypillisessä ajossa 10,4 mg:sta CAPA:a, joka oli liuotettu 3,0 ml:aan edellämainittua puskuria', saatiin silikonoidusta Bio-Gel •P-30 kolonnista (sisähalkaisija 2,54 cm, pituus 50 cm) talteen sekä aine että aktiviteetti täydellisesti. Eluointitilavuus varmistaa molekyylipainoalueen 22000-24000. Nämä molekyylipainoluvut saatiin vertaamalla eluointitilavuuksia molekyylipainoltaan tunnettujen yhdisteiden, kuten, ribonukleaasin ja insuliinin eluointitilavuuk-siin. Kylmäkuivaamisen jälkeen saadaan valkea, hygroskooppinen jauhe, joka saadaan säilymään kylmässä, hapettomassa ja pimeässä tilassa. Tuotetta analysoitaessa ei löytynyt hiilihydraatteja eikä nukleiinihappoja. Aminohappo-analysaattorilla suoritetut analyysit antoivat geeli suodatuksol.1 a määritettyjen mol ekyyl ipaino j en kanssa yhtäpitävät tulokset. Aminohappo-analyyseillä saatiin seuraavat prosenttiluvut, joiden tarkkuus on ± 5 %· Laskettu molekyylipai.no oli 232ΟΟ ± 25ΟΟ (standardipoikkoama).

_ 15 _ 60567

Alaniinia 8,62

Arginiinia 4-,57

Asparagiinihappoa 10,39

Kysteiinia 0,95

Glutamiinihappoa 17,04

Glysiiniä 6,87

Histidiiniä 1,00

Isoleusiinia 4,75

Leusiinia 10,49

Lysiiniä 3,69

Merioiiniä 1,91

Fenyylialaniinia 2,75

Proliinia 3,79

Seriiniä 7,74

Treoniinia 5,92

Tyrosiinia 3,21

Valiinia 6,36 Tämä aminohappopitoisuus vastaa teoreettista typpipitoisuutta 16,2-17,8 %· Kokonaistypen määritys Dumas'in mukaan viittaa arvoon 17,0 + 0,5 %· •Permuurahaishappokäsittely osoittaa, että tämä poly-peptidi pohjautuu yhteen ainoaan peptidiketjuun. Lisäksi tämä poly-peptidi, ellei sitä suojata albumiinilla kompleksoimaila, denaturoituu palautumattomasti pH-arvossa yli noin 5-

Tarkalleen samalla tavoin kuin edellä on selitetty, polypeptidi valmistetaan ihmisen istukkakudoksesta.

Es imerkki 2: CAPA-albumiinikomoleksin valmistus ..... — -*-- —---------- s

Edellä selitetyn mukaisesti valmistettua CAPA:a liuotetaan muurahaishappoon (esimerkiksi 0,05-M; pH:n on oltava välillä 2-3). Saadaan kirkas liuos. Tähän liuokseen lisätään albumiinijauhetta tai albumiiniliuosta samassa pH:ssa kuin edellämainittu muurahaishappo-liuos (200 paino-osaa albumiinia yhtä CAPA-paino-osaa kohti), jolloin saadaan kirkas CAPA-albumiiniliuos. Sitten liuoksen pH korotetaan hitaasti lisäämällä jotakin emästä (esimerkiksi natriumhydroksidi-tai ammoniakki-vesiliuosta) kunnes pH nousee noin 7,5=een. Tällöin saadaan kirkas liuos, joka sisältää CAPA:n ja albumiinin, kompleksin rnuod ossa .

Tätä liuosta, joka sisältää 12 yg CAPA/ml, voidaan käyttää suoraan jäljempänä selitettävässä diagnoosimenetelmässä, tai kompleksi voidaan eristää valkeana jauheena kylmäkuivaamalla. Jauhe on stabiili kylmässä (f4°C) pitkän aikaa.

60567 - 16 -

Kokeilla on osoitettu, että CAPA-aktiviteetti saadaan maksi-maalisesti hyväksi käytetyksi, kun albumiinin ja CAPArn painosuhde on yhtä suuri tai suurempi kuin noin 200:1.

Esimerkki 3: I

- i

Parkittujen ja merkittyjen punaverisolujen valmistus j

Tuoretta lampaanverta (1 tilavuusosa) lisätään steriiliin Alsever'in liuokseen (1,2 tilavuusosaa) (Alsever'in liuos valmiste- taan 250 g:sta glukoosia, 80 g:sta natriumsitraattihydraattia, <4-2 g:sta NaCl ja vedestä 10 litraan asti ja pH saatetaan arvoon 6,1 10 % sitruunahappo-monohydraatilla). Seos sentrifugoidaan ja puna- , verisolut suspensoidaan uudelleen kerran Alsever'in liuokseen ja i kaksi kertaa puskuriliuokseen jonka pH on 6,8. Lopuksi valmistetaan punaverisolujen suspensio puskuriin jonka pH on 6,8, niin että puna-solupitoisuudeksi tulee 10^ solua/ml.

Yksi tilavuusosa edelläolevan mukaan valmistettua punaverisolu-suspensiota lisätään hämmentäen yhteen tilavuusosaan puskuriliuosta, jonka pH on 6,8 ja joka sisältää noin 18 yg parkkihappoa/ml. Tällä tavoin parkitut punaverisolut sentrifugoidaan ja suspensoidaan madelleen kahdesti puskuriin jonka pH on 7,5· Lopuksi punaverisolut suspensoidaan puskuriin, jonka pH on 7,5 niin, että solupitoisuudek-si tulee 10^ solua/ml.

Edellä selitetyn esimerkin mukaan valmistettua CAPA-kompleksia liuotetaan puskuriliuokseen, jonka pH on 7,5, niin että CAPA-pitoi-suudeksi tulee 3 pg/ml (puhtaana CAPA:ra laskettuna). Yksi tilavuus-osa edellisen kappaleen mukaan valmistettua parkittua punaverisolu-suspensiota lisätään tipoittain 0°C:ssa yhteen tilavuusosaan CAPA-kompleksiliuosta 10 minuutin aikana. Merkityt solut sentrifugoidaan ja suspensoidaan uudelleen puskuriliuokseen jonka pH on 7,5 ja joka sisältää stabiloivan määrän (noin 1,2 til/til) i.nerttiä ihmisen g seerumia, niin että saadaan suspensio joka sisältää 1,6 x 10 merkittyä solua ml kohti. Näitä merkittyjä soluja käytetään, niin kuin jäljempänä selitetään diagnoosimenetelmässä.

P . ... - 17 - 60567

Esimerkki H:

Diagnostinen menettely a) Yksinkertainen sokeatutkimus

Eskilstunan Keskussairaalasta, Ruotsi, saatiin verinäytteitä, joista 4-2 oli peräisin infektioklinikan potilaista; yksi kirurgiselta klinikalta; kaksi radioterapiasta; 10 näytettä vastasynnyttäneistä äideistä; 10 napanuoraverestä ja 10 naisista, jotka olivat raskaina 1-trimesterissä, ja 6 näytettä naisista, jotka olivat raskaana 2-tri- i i mesterissä. Lisäksi saatiin 20 verinäytettä 10-vuotiaasta lapsesta Slottsskolan'ista ja 10 näytettä vanhemmista, terveistä henkilöistä tri Lundström'in yksityisklinikalta, Eskilstunassa, Ruotsi. Erstan sairaalan kirurgiselta ja sisätautiklinikalta, Tukholma, Ruotsi, saatiin näytteet 44 potilaasta, Akeshov'in sairaalasta saatiin näytteet 45 potilaasta ja Karolinska Sjukhuset-nimisen sairaalan kirurgiselta klinikalta, Tukholma, Ruotsi, saatiin näytteet 72 potilaasta, jotka oli otettu sairaalaan mahdollista leikkausta varten. Karolinska Sjukhuset-nimisen sairaalan verenluovutuskeskus, Tukholma, Ruotsi, antoi käytettäväksi 118 näytettä 20-67 vuoden, keski-iältään 57»2 vuoden (SD ± 11,5 vuotta) ikäisistä luovuttajista, ja sairaaloiden kliinisestä keskuslaboratoriosta saatiin seerumit 29 potilaasta, jotka olivat hoidossa Radiumhemmet'in yleisillä osastoilla ja 12 potilaasta sen gynekologisilta osastoilta.

Verinäytteiden kokonaismäärä oli 451. Eskilstunasta olevat 111 tapausta tutkittiin kliinisesti ja laadittiin sairaskertomus, ei kuitenkaan ilmeisen terveistä yksilöistä. Tukholman tapauksista tehtiin yksityiskohtaiset sairaskertomustutkimukset 101 tapauksessa. j

Muissa tapauksissa esiintyi muita kuin pahanlaatuisia kliinisiä diag-· j noose ja, eikä mitään epäilystä esiintynyt pahanlaatuisissa sairauk- ' sista.

Laskimoveri siirrettiin Wasserman-putkiin ilman lisäainetta ja . lähetettiin laboratorioon, eräissä tapauksissa ensin poistaen hyytymä ja verisolut sentrifugoimalla.

Verianalyysi perustui CAPA:n osoittamiseen modi fioi dull a hemag- glutinaation inhibitiotekniikalla (mikromenetelmä). Periaatteessa i käytettiin seuraavaa menettelyä; ; 25 μΐ potilaan seerumia, joka oli absorboitu punaisiin lampaan ' verisoluihin, titrattiin 8 vaiheessa laimennuksen ollessa 2-kertainen , (kertakäyttöisiä mikrotitrauslevynä) .. ! T.inbro IG-MRC-96 la i mennuslaatoi s 3 a/, minkä jälkeen 25 yi spesifistä j antiseerumia x-ajalaiinennuksessa (noin 1:2000) lisättiin jokaiseen ! Q .... . j kuoppaan. Inkuboitiin 22 C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen jokaiseen j kuoppaan lisättiin 50 yl parkittuja ja eristetyllä, ihmisalbumi.iniin sidotulla CAPArl-la merkittyjä, noin 6-8 miljoonaa punaisia lampaan verisoluja «f» f - ie - 60567 sisältävää suspensiota, niinkuin edellä on selitetty (noin 2-4 yg/10^ verisolua).'Muitakin hienojakoisia kantaja-aineita kuten lateksia, bentoniittia ja kollodiumia, voidaan käyttää punaverisolujen sijasta. Reaktiotulos määritettiin kaltevan peilin ja standardisarjan avulla ' 4- 24 tunnin inkubaation jälkeen 1-2°C:ssa. Kontrollia varten käytet- i t iin: 1. CAPA:lla merkittyjä verisoulja ynnä antiseerumia; 2. CAPA:lla merkittyjä verisoluja ilman antiseerumia·;· 3· Potilaan seerumia ynnä ihmisalbumiinilla merkittyjä verisoluja; 4. Potilaan seerumia ja käsittelemättömiä verisoluja; 5- CAPA:lla merkittyjä verisoluja ja vasta-aineita sarjassa, jossa inhibointi saadaan aikaan portaittain pienenevillä, tunnetuilla CAPA-määrillä.

Verisolujen stabiloimiseksi käytetyt laimennusnesteet sisälsivät kerättyä (so. monista yksilöistä yhdistettyä), inaktivoitua, neutraalia ihmisseerumia. j CAPA-reagenssi valmistettiin kerätystä ihmissyöpäkudoksesta ja ! puhdisteltiin niin kuin edellä on selitetty käyttäen geelisuodatusta, j pH-gradientti-eluointia, suodatusta Bio-Gel P-30:n läpi ja kompleksin- ! muodostusta albumiinin kanssa.

Antiseerumina käytettiin hevos-anti-HeLa:a 19 päivältä marraskuuta 1962, joka oli absorboitu normaaliin kudokseen, ja poolattua ihmisseerumia. Immunointi suoritettiin pestyllä HeLa-solumurskalla, mitkä solut oli viljelty litteissä lasipulloissa Eaglen väliaineessa, joka sisälsi 20 % inaktivoitua ihmisseerumia. Solut oli otettu talteen i EDTA:lla, sentrifugoitu ja pesty kolme kertaa vedellä.

CAPA:n läsnäollessa potilasseerumissa hevos-vasta-aineet neutraloituivat, mikä johti agglutinaation poisjäämiseen, kun lisättiin polypeptidilla merkittyjä verisoluja. Arvostelu suoritettiin nousevan asteikon 0-6 mukaan, jossa 0 merkitsi inhibition poissaoloa ja 6 merkitsi agglutinaation maksimaalista inhibitiota. Asteikkoarvojen suhde CAPA:n pitoisuuteen seerumi-ml kohti käy ilmi taulukosta 1, joka on saatu kalibroimalla ennaltamäärättyjen CAPA-määrien laimennuksia neutraalissa seerumissa.

i t { 19 ' 60567

Taulukko 1

Likimääräinen asteikon Ja CAPA-määrän kalibrointi Asteikkoarvo CAPA, p.g/ml 0 0,05 1 0,04 - 0,08 2 0,09 - 0,12 3 - 0,13 - 0,24 4 0,25 - 0,49 5 0,50 - 0,99 6 ' >1,0

Lukeminen suoritettiin tietämättä potilaiden terveydentilaa. Tutkimuksen kohteena ollut aines on ryhmitetty niin kuin seuraavasta taulukosta 2 näkyy.

Taulukko 2 CAPA-pitoisuus 431 seerumissa eri ryhmiin kuuluvista yksilöistä numeroasteikon 0-6 mukaan sekä keskimääräiset asteikkoarvot (M) Ja standardipoikkeamat (SD). "Radikaalisesti" tarkoittaa tässä yhteydessä, että syöpäkudos on pyritty poistamaan täydellisesti.

Ryhmät Numeroasteikko Luku-

_0 1- ?_3_4 8 6. määrä ·Μ_- SD

1. -Primäärisyöpä metastaaseineen 5412 12 3,00 - 1,13 2. Levinnyt syöpä 4214821 22 2,91 - 1,82 3. Radikaalisesti hoitamaton syöpä 6 ίο 15 8 39 1,64 - 0,99 4. Hoitamaton primäärisyöpä 3142 10 1,50 - 1,18 5- Radikaalisesti poistettu syöpä Ί9 1 1 21 0,14 - 0,19 6. ‘Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 731 11 0,45 - 0,68 7. Ei-pahanlaatuinen sairaus 118 3 3 7 1 152 0,26 - 0,22 8. Terveet aikuiset (M - 71 vuotta) 82 10 0,20 ± 0,42 9. Verenluovuttajat (M = 39 vuotta.) Ί16 2 118 0,02 - 0,13 - 20 - 60567

Taulukko 2 (jatk.)

Ryhmät : Numeroasteikko Luku- !

0 1 2 3 4'56 maara M ± SD

10. 10-vuotiaat yksilöt 19 1 20 0,10 - 0,44 11. Vastasyntyneet (napanuoraveri) 111421 10 2,80 - 1,48 12. Raskaana ole- .

vat naiset 12 2 2 16 0,38 - 0,72 13· Vastasynnyttäneet 811 10 0,40 - 0,97

Tuloksista käy ilmi että korkeimmat asteikkoarvot on saatu ryhmistä "primäärisyöpä metastaaseineen',1 (paikallisia) jä "levinnyt syöpä" sekä ryhmästä "vastasyntyneet" (napanuoraveri).

Alhaisia asteikkoarvoja on saatu verenluovuttajista. Väliasemassa on ryhmä "hoitamaton primäärisyöpä" ja "radikaalisesti hoitamaton syöpä". Verenluovuttajien arvoja lähellä olevia arvoja saadaan ryhmästä "radikaalisesti poistettu syöpä".

CAPA:n keskiarvoja kaikista ryhmistä on verrattu parittain ja esitetty seuraavassa taulukossa 3-

Taulukko 3

Yhdeksän koeryhmän seerumin CAPA-pitoisuuden asteikkoarvojen a) _erojen tilastollinen merkitys '_____

Ryhmät Ryhmien asteikkoarvojen erojen merkitys ^ ryhmiin verrattuna __M - SD 23456 7 89 · 1. Primäärisyöpä metastaaseineen 3,00 - 1,13 0 xx xx kkm xxx xxx xxx xxx 2. Levinnyt syöpä 2,91 - 1,82 xx xx 3ίχκ xxx xxx xxx xxx | 3. Radikaalisesti hoi- ! tamaton syöpä 1,64 - 0,99 0 xxx xx xxx xxx xxx |

4. Hoitamaton I

primäärisyöpä 1,50 - 1,18 xxx x xxx xx xxx 5- Radikaalisesti poistettu syöpä 0,14 - 0,19 0000 6. Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 0,45-0,68 000 7. Ei-puhunlaatuinen \ sairaus 0,26-0,22 0 xxx ; 8. Vanhahkot terveet yksilöt 0,20 - 0,42 0 j 9- Verenluovuttajat 0,02 - 0,13 - 21 - 60567 a) Erojen tilastolliset merkitykset määrättiin likimäärin normaalisti | jakautuneen muuttujan Z avulla, joka määritellään seuraavasti; j -·Μ2 Z =--- \ /sD* SD2 V + ^2~ b) jos Z >1,96, eron merkitys on x, mikä merkitsee 0,01 <P<0,05 " Z >2,6, eron merkitys on xx, mikä merkitsee 0,001 <P <0,01 " Z >5,5, eron merkitys on xxx, P <0,001 c) Tämä ryhmä käsittää 11 positiivista testiä, joista 8 koskee epäiltyä, mutta ei todettua syöpää.

Ylläolevasta taulukosta ilmenee että, ryhmissä "primäärisyöpä metastaaseineen" ja "levinnyt syöpä" on merkitsevästi korkeammat keskimääräiset asteikkoarvot kaikkiin muihin ryhmiin verrattuna, paitsi vastasyntyneisiin (katso myös taulukkoa 2).

Ryhmissä "radikaalisesta hoitamaton syöpä" ja "hoitamaton primäärisyöpä" keskimääräiset asteikkoarvot ovat merkitsevästi korkeammat kuin kaikissa muissa ryhmissä paitsi kahdessa edellä mainitussa ja ryhmässä "muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä", johon verrattuna erotus on merkitsevä (0,01<P <0,05)·

Ryhmissä 5-9 ei esiinny keskinäisiä merkitseviä eroja, paitsi ryhmien 7 ja 9 välillä. Tämän eron selityksenä voi olla se, että ' aitoja, piileviä syöpätapauksia voi esiintyä niiden tapauksien joukossa, joiden asteikkoarvot ovat välillä 1-4-.

Positiivinen indikaatio napanuoraveressä ansaitsee tiettyä huomiota. Sen määrittämiseksi, onko CAPA peräisin istukasta, uutet- f tiin palasia tästä kudoksesta. 500 mg:n eriä jäädytettyä istukka- 1 kudosta ml kohti puskuroitua fysiologista NaCl-liuosta pH:ssa 7,5 | homogenoitiin 0°C:ssa ja sentrifugoitiin 1000 x G:ssa 50 minuuttia , 0°C:ssa kartiomaisesti laajenevissa putkissa (Markham'in mukaan). j

Sakan päällä olevat liuokset testattiin CAPA;aan nähden edelläseli-tetyllä hemagglutinaatiotekniikalla. Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, että saadut inhibitioreaktiot olisivat johtuneet verisolu.iirin lisätyn CAPA:n epäspesifisestä inaktivoitumisesta, mainittuja verisoluja ravistettiin jokaisen mittauksen jälkeen ja niihin lisättiin standardimäärä CAPA:aan nähden spesifisiä vasta-aineita. Missään tapauksessa ei todettu antigeenin inaktivoitumista. Vertailuaineksena käytettiin eri lähteistä ja eri paikoista peräisin olevista ihmis- t a* - 22 - 60567 syöpäkudoksista valmistetun antigeenijauheen uutetta. Tulokset osoittavat, että 26 istukkaa yhtä monesta henkilöstä kaikki poikkeuksetta sisälsivät merkitseviä määriä CAPA:a. Näiden 26 istukan keskiarvo (geometrinen) oli 297 - 8 mikrogrammaa märän kudoksen grammaa kohti (0,03 %).

Koska, kuten edelläselitetystä tutkimuksesta käy ilmi, tässä keksinnössä käytettyä CAPAra syntetisoituu istukassa, ja koska niiden geenien, jotka sisältyvät istukkaan, täytyy myös sisältyä samasta munasolusta kehittyneeseen yksilöön, on taipumus tai kyky valmistaa CAPAra normaali ilmiö. Normaalisti tämä taipumus on tukahtunut, koska normaalit solut eivät sisällä mitattavia määriä CAPAra. Syöpäsoluissa sensijaan on tapahtunut taipumuksen aktivoituminen, jolle on ominaista merkitsevä CAPArn esiintyminen solujen sisässä ja ympärillä. Istukan trofoblastisolujen ja syöpäsolujen antigeeninen ja tietyissä suhteissa funktionaalinen yhtäläisyys.ja niiden erilaisuus verrattuna yksilön muihin soluihin näyttää pitävän yhtä sen käsityksen kanssa, että syöpä on ilmaus siitä, että normaalisti esiintyvien taipumustan hallinta on muuttunut.

Koetulosten tilastollinen analyysi osoittaa, että on olemassa varsin merkitsevä korrelaatio todetun syövän ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden (P <0,001) välillä. Sama pitää paikkansa kyseessä olevan j kasvainmassan suuruuden ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden väliseen suh- j teeseen nähden samoissa ikäryhmissä (P <0,001). Suurentunut CAPA-pi- i toisuus on todettu lukuisien erilaisten syövänsijaintipaikkojen yh- ' teydessä. Tyypistä ja sijaintipaikasta riippumatta syöpäkasvaimet ovat : osoittautuneet CAPAra sisältäviksi, minkä perusteella näyttäisiltä, . j että mainittu CAPA on yhteistä kaikille tunnetuille syöpätyypeille, : so. pahanlaatuisille, epiteelistä alkuperää oleville kasvaimille. ‘ b) Kaksinkertainen sokeatutkimus ;

Edellä mainittujen johtopäätösten edelleen vahvistamiseksi ! suoritettiin kaksinkertainen sokeatutkimus, erittäin tarkasti vai- · votuissa olosuhteissa. Koodattuja verinäytteitä saatiin Eskilstunan j

Keskussairaalan eri osastoilta, Ruotsi. Tässä tapauksessa mitattiin j kvantitatiivisesti potilaiden seerumin CAPA-pitoisuudet. i Tämän kaksinkertaisen sokeatutkimuksen, samoinkuin edellä seli- ! tetyn yksinkertaisen sokeatutkimuksen tulokset on yhdistetty seuraa- : viin taulokkoihin 1-8. Taulukot esittävät seuraavaar jj

Taulukko 4 tutkittujen henkilöiden kokonaislukumäärää ja niiden henkilöiden lukumäärää, joilla on syöpädiagnoosi;

Taulukko 6 henkilöiden lukumäärää eri ryhmissä sekä heidän keski-ikä ansa sekä tämän poikkeamaa; - 23 - 60567

Taulukko 6 CAPA:n läsnäoloa kaikkien tutkittujen potilaiden seerumeissa;

Taulukko 7 niiden henkilöiden prosenttimäärää joiden CAPA-pitoisuus oli - 0,l5yg/ml seerumia, taulukon 5 ryhmät 9, 10 ja 12 poisjätettyinä;

Taulukko 8 CAPArn läsnäoloa kasvainten sijaintipaikkojen mukaan taulukon 5 ryhmissä 1-3- "Site nr" tarkoittaa teosta "Cancer Incidence in Sweden 1968".

Taulukko 4-

Tutkittujen yksilöiden lukumäärä

Tutkimus Yksilöiden lukumäärä Niiden yksilöiden luku määrä, joiden diagnoosi osoitti syöpää

Yksinkertainen sokea 4-31 ' 104-

Kaksinkertainen sokea 503 4-9 934- 155 " 2U_ 60567

Taulukko 5

Yksilöiden lukumäärä eri ryhmissä sekä keski-ikä ja sen poikkeama

RvhrlMf Yksinkertainen Kaksi nkur tai nen ! y sokea tutkimus sokoatutk<aus

Luku- Keski- + Poikkea- Luku- Keski- + Poik-määrä ikä v. ma määrä il<ä v. kerma ! 1. Syöpä metastaa- seineen 3 4 72 + 9 14 66 + 10 ; 2. Hoitamaton syöpä ! ilman metastaasi- i oireita sekä rad i kaa- i

Insesti hoitamaton j syöpä 2+9 67 + 11 1/+ 66 + 12 j

3. Radikaalisesti . J

poistettu syöpä 21 66 + 15 21 64 + 12 4. Muu pahanlaatui- , nen sairaus kuin syöpä' 11 70 + 7 5 5β + 1β 5. Ei-pahanlaa- | tuinen sairaus 132 61 + 22 1β6 46 + 21 6. Terveet aikuiset 10 71 + 5 46 36 + 14 7. Verenluovuttajat 11Ö 30+11 - - Ö. 10-vuotiaat ja ! sitä nuoremmat ! yksilöt 20 10 + 0 62 2 + 1.5 9. Napanuoraveri 10 0 + 0 20 0 + 0 ! 10. Vastasynnyt- | täneet 10 21 + 3 20 25 + 4 ; 11. Raskaana olevat naiset 16 26 + 4 ilo 26 + 4.5 12. Syöpä in situ - - 5 27 + 6 ί

Yhteensä 431 503 | i j i t 25 ' 60567

Taulukko 6 CAPA-pitoisuus 934 yksilöstä saaduissa seerumeissa

Ryhmät CAPA CAPA Yhteensä <0,00 pg/ml —0.09 pg/ml Lukumäärä (%) ____Lukumäärä (%) Lukumäärä (%)_ 1. Syöpä metastaa- seineen 9 (19) 39 (Öl) 46 (100) 2. Hoitamaton syöpä ilman metastaasioireita sekä radikaalisesta hoitamaton syöpä 2Ö (44) 35 (56) 63 (100) 3. Radikaalisesti poistettu syöpä 36 (66) 6 (14) 42 (100) 4. Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 15 (94) 1 (6) 16 (100) - 5· Ei-pahanlaatuinen sairaus' 269 (65) 49 (15) 31Ö (100) 6. Terveet aikuiset .54 (96) 2 (4) 56 (100) 7·. Verenluovuttajat II6 (100) 0 (0) llö (100) Ö. 10-vuotiaat' ja sitä nuoremmat yksilöt 79 (96) 3 (4) 62 (100) 9. Napanuoraveri 21 (70) 9 (30) 30 (100) 10. Vastasynnyttäneet 25 (63) 5 (17) 30 (100) 11. Raskaana olevat naiset 123 (96) 3 (2) 126 (100) 12. Syöpä in situ 4 (00) 1 (20) 5 (100)

Yhteensä 761 (64) 153 (16) 934 (100) ' 26 ” 6 0 5 6 7

Taulukko 7 '

Niiden yksilöiden lukumäärä prosenteissa, joilla CAPA-pitoisuus oli ^ 0.15· Taulukon 5 ryhmät 9, 10 ja 12 on jätetty pois.

_____;_____]___

Ryhmät % Lukumäärä 1. Syöpä metastaaseineen 64 48 2. Hoitamaton syöpä ilman metastaasi- j oireita sekä radikaalisesti hoitamaton syöpä 21 63 3. Radikaalisesti poistettu syöpä 10 42 41 Muu pahanlaatuinen sairaus kuin syöpä 0 16 5. Ei-pahanlaatuinen sairaus 6 31Ö 6. Terveet aikuiset 0 56 7. Verenluovuttajat 0 11Ö 6. 10-vuotiaat ja sitä nuoremmat yksilöt 0 82 11. Raskaana olevat naiset 1 126

Yhteensä 869 i i i i i i i ' 27‘ 60567

Taulukko β CAPA-pitoisuus ryhmien 1-3 kasvaimen sijaintipaikan mukaan

Sijantipaikka Site 1.Syöpä meta- 2.Hoitamaton 3 •Radikaali- Yh-

Nox) staaseineen syöpä ilman sesti pois- teen- metastaasi- tettu syöpä sä oireita sekä radikaalisesti hoitamaton _syöpä_ ___gQ.oe —O.09 gQ.oe ^0.09 £0.06 SO.09__

Gingivae mandib. 144__ 1____1_2

Nasopharynx_11+6___2_1_·_2___

Oesophagus_150__1__2_1_1_;__6

Ventricle_151_1__2_1_2__2__β

Intestinum tenui 152_1_______1__

Colon_153__2_1_7 6__16

Rectum_1J34_1+ 1_j>__2__L__11+ .

Ves«Fellea, etc. 155_;_1_1_1____3

Hepar_156 __1______1

Pancreas__157 _2_____1_2_6

Vestibul. nasi, etc.__l60 _ 1 < 1__2

Trachea, pulm etc. 162__1+__2__2__5__14 !

Mammae_170 _2__7___1_3 3_2_1β_ |

Cervix uteri_229_2__2__1__6_ j

Corpus uteri_196__1_1 _1__1__1_2__7 '

Ovarii, etc,__175_1__1+__1_1__2__9 j

Prostat e__177_2__2_3____2_ j

Testis__176__1 _1 1 _3 j

Penis, etc,_179_____1_1__2

Renes___1Ö0_1____3 1 5 i

Ves . urinaria , etc. l6l_ 1 g 3_^ 1 10

Malignant melancma 190____1 1 2

Thyreoidea 194 1 1 1 2 5 <

Primäärinen kas- vain, tuntematon \ alkuperä___1___ 1 ! ””” ‘ 1

Yhteensä 9 39 26 35 36 6 153 x) Julkaisun "Cancer Incidence in Sweden 1966" mukaan. | ! • i - 28 - 60567 Tämän kaksinkertaisen sokeatutkimuksen tulosten tilastollinen analyysi osoittaa sekin varsin merkitsevää korrelaatiota syöpädiag-noosin ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden (P <0,001) välillä. Tämä kaksinkertainen sokeatutkimus vahvistaa myös kysymyksessä olevan kas-vainmassan suuruuden ja suurentuneen CAPA-pitoisuuden välisen yhtey- l den samoissa ikäryhmissä (P < 0,001). Seerumin suurentunut CAPA- pitoisuus on todettu noin 20 erilaisen syöpätyypin ja sijaintipaikan j yhteydessä. Kaksinkertainen sokeatutkimus vahvistaa näin ollen täy- ! dellisesti nämä uudet havainnot ja niiden käytännöllisen käyttökelpoisuuden. '

Seuraavassa esitetään yhdistelmänä lyhyet määritelmät keksintöön Ϊ liittyvästä polypeptidi-antigeenista ja diagnostisesta menetelmästä. I CAPA:n määritelmä

HeLa-soluja (peräisin v. 1952 esiintyneestä kohtusyöpätapauksesta), viljellään in vitro. Näitä soluja käytetään antigeenin lähteenä.

Saatuja soluja ruiskutetaan hevosiin jolloin kehittyy spesifinen vasta-aine, jota käytetään antigeenin tunnistamiseen kasvaimissa, seerumissa, istukassa jne. Viimemainitulla antigeenillä on oltava ja sillä on identtinen immunologinen reaktiokohta (kuin HeLa-antigeenilla) vaikkakin se voi luonnollisesti olla toisenlainen muissa suhteissa, kun se esiintyy luonnossa.

Diagnostisen menettelyn määritelmä

HeLa-soluviljelmistä in vitro saatua antigeeniä käytetään vasta-aineen kehittämiseen hevosissa. Ei-toivottujen vasta-aineiden absorption jälkeen hevosseerumia käytetään kasvaimista (tai istukasta tai HeLa- tai HEp-2- tai Detroit-6-viljelmistä) otetulla antigeenillä merkittyjen punasolujen agglutinoimiseen. Tämä on indikaattori järjestelmä. Jos tuntematon näyte sisältää antigeenistä aktiviteettia, se vaikuttaa vasta-aineeseen ja inhiboi agglutinaation.

m ' 29 " 60567

Kuvio 1.

Kasvaimeen liittyvän antigeenin puhdistus

Virtauskaavio haarautumineen, joka esittää puhd istusinenettelyn yleistä periaatetta

_ __/Normaali A

\kudokset I

_ _ v Erotus- ^_ menettely _iL:_s.

Immunologinen vertailu __ 'i',_

Onko eroa kasvain- ja normaali- _ kudoksen välillä? ,n — ~ ....... 1 =---- „. Onko erotus kasvain plus? _ -Ei---< * >--On _ 1 _\L-_

Ei-Onko erotus optimaalinen? -On - >t- _ _' . *_jd . ..._

Modifioidaan ja__Menettely otetaan toistetaan_|_ N~ ~ [käyttöön____

Ei —-<Onko CAPA puhdasta >-On --- Loppuj

Menettelyä jatketaan --:--------— --— ... —. — Τ'

Mt

Claims (18)

30 6 0 5 6 7

1. Syövän diagnostisoimiseksi käytettävä valmiste, tunnet-t u siitä, että se aktiivisena aineosana sisältää ihmisen syöpäku-doksessa läsnäolevaa polypeptidiantigeenia (CAPA), jonka molekyyli-paino on 20 000 - 27 000 daltonia suodatettuna geelikolonnilla, joka on tasapainoitettu HCOOH-HCOONH^:llä pH-arvossa noin 3,0, geelin ollessa polyakryyliamidigeeli, jonka raekoko on 100-200 mesh (0,149-0,074 mm), ekskluusioraja 40 000 daltonia ja fraktioimisalue 2500-40 000 daltonia, jolloin polypeptidin spektrofotometrinen absorptio-huippu on aaltopituusalueella 229-233 nm ja se perustuu yksinkertaiseen polypeptidiketjuun, sisältää asparagiinihappoa, glutamiinihap-poa, leusiinia, fenyylialaniinia ja tyrosiinia oleellisina rakennusosina, muodostaa monospesifisesti antigeenin kanssa reagoivia vasta-aineita, ja denaturoituu eristetyssä tilassa palautumattomasti pH-arvossa yli 5, jolloin polypeptidiantigeeni on eristetty siten, että a) CAPA-pitoista ainetta homogenoidaan nesteessä lämpötilassa, joka ei ylitä 0°C, ja mahdollisesti käsitellään orgaanisella liuottimena, kuten etyylieetterillä tai asetonilla, kylmässä, b) kiinteät aineosat erotetaan vaiheesta a) peräisin olevasta nestemäisestä homogenaatin ja kiinteiden aineosien seoksesta, c) mainitut kiinteät aineosat uutetaan alkalisella vesiliuoksella, d) vaiheesta c) saadut uutteet suodatetaan helmimäisellä molekyyli- seulatyyppisellä suodatusgeelillä, joka kykenee fraktioimaan yh-disteet joiden molekyylipainoalue on 10*10 - 20*10 , erityisesti noin 15*10^, geeli eluoidaan ja 10*10^ - 20·lO^-fraktio, erityi- C sesti noin 15*10 -fraktio otetaan talteen, e) vaiheesta d) saatu fraktio kromatografoidaan molekyyliseula-tyyp-pisellä heikolla ioninvaihtajalla epäpuhtauksien absorboimiseksi siihen, ja mainitusta ioninvaihtajasta ensiksi poistuva fraktio otetaan.talteen, f) mainittu ensimmäinen fraktio säestetään isoelektrisesti, g) saatu sakka sekoitetaan molekyyliseulatyyppiseen geeliin ja sakan ja geelin seos pH-gradienttieluoidaan geelikolonnissa, h) pH:ta alentaen otetaan talteen pH-arvoon 3 saakka fraktio, joka sisältää CAPA:a, ja joka mahdollisesti geelisuodatetaan kolonnissa ja otetaan talteen antigeenifraktio, jonka spektrofotometrinen absorptiohuippuaaltopituus on 229-233 nm ja molekyylipaino 20 000 -27 000, 31 60567 yhdessä polypeptidin denaturoitumista estävän määrän kanssa inerttiä proteiinia, mieluimmin albumiinia, jolloin inertin proteiinin ja CAPA:n välinen painosuhde on vähintään 200:1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen valmisteet u n n e t t u siitä, että polypeptidi sisältää seuraavia aminohappoja, joiden moo-liprosenttimäärät ovat seuraavat: Alaniini 8,62 Arginiini 4,57 Asparagiinihappo 10,39 Kysteiini 0,95 Glutamiinihappo 17,04 Glysiini 6,87 Histidiini 1,00 Isoleusiini 4,75 Leusiini 10,49 Lysiini 3,69 Metioniini 1,91 Fenyylialaniini 2,75 Proliini 3,79 Seriini 7,74 Treoniini 5,92 Tyrosiini 3,21 Väliini 6,36

3. Patenttivaatimuksen '1 mukainen valmiste, tunnettu siitä, että polypeptidi sisältää fluorisoivan ryhmän, joka lähettää fluorisoivaa valoa alueella 350 nm, kun se on aktivoitunut 288 nm aaltopituudella.

4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen, ihmisen syöpäkudok-sessa läsnäolevaa polypeptidiantigeeniä (CAPA) sisältävän valmisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) CAPA-pitoista ainetta homogenoidaan nesteessä lämpötilassa, joka ei ylitä 0°C, ja mahdollisesti käsitellään orgaanisella liuottimena, kuten etyylieetterillä tai asetonilla, kylmässä, b) kiinteät aineosat erotetaan vaiheesta a) peräisin olevasta, nestemäisestä homogenaatin ja kiinteiden aineosien seoksesta, c) mainitut kiinteät aineosat·uutetaan alkalisella vesiliuoksella, d) vaiheesta c) saadut uutteet suodatetaan helmimäisellä molekyyli- seulatyyppisella suodatusgeelillä, joka kykenee fraktioimaan yh- G 6 disteet joiden molekyylipainoalue on 10*10 - 20*10 , erityisesti 32 6 0 5 6 7 noin 15*10^, geeli eluoidaan ja 10-10^ - 20·10^-fraktio, erityisesti noin 15·10^-fraktio otetaan talteen, e) vaiheesta d) saatu fraktio kromatografoidaan molekyyliseula-tyyp-pisellä heikolla ioninvaihtajalla epäpuhtauksien absorboimiseksi siihen, ja mainitusta ioninvaihtajasta ensiksi poistuva fraktio otetaan talteen, f) mainittu ensimmäinen fraktio saostetaan isoelektrisesti, g) saatu sakka sekoitetaan molekyyliseulatyyppiseen geeliin ja sakan ja geelin seos pH-gradienttieluoidaan geelikolonnissa, h) pH:ta alentaen otetaan talteen pri-arvoon 3 saakka fraktio, joka sisältää CAPA:a, ja joka mahdollisesti geelisuodatetaan kolonnissa ja otetaan talteen antigeenifraktio, jonka spektrofotometrinen absorptiohuippuaaltopituus on -229-233 nm ja molekyylipaino 20 000 -27 000, ja näin valmistettu CAPA sekoitetaan polypeptidin denaturoitumista estävän määrän kanssa inerttiä proteiinia, mieluimmin albumiinia, niin että proteiinin ja CAPA:n välinen painosuhde on vähintään 200:1.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että homogenointi a) suoritetaan vedessä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta b) saadut kiinteät aineosat lyofilisoidaan ja jauhetaan sitten teräksisessä kuulamyllyssä kylmässä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jauhaminen suoritetaan -70°C:n lämpötilassa.

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen d) suodatus suoritetaan fosfaattipuskurilla pH: ssa 7 tasapainoitettua polyakryyliamidigeeliä, ristikytkettyä dekstraa-nigeeliä, agar- tai agaroosigeeliä sisältävässä kylmässä kolonnissa.

9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen e) kromatografointi suoritetaan neutraalissa pH:ssa, kuten fosfaattipuskurilla pH:ssa 7 tasapainoitetussa kolonnissa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografointi suoritetaan polyakryyliamidigeelikolon-nissa.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isoelektrinen saostus f) suoritetaan pH:ssa 5.

12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa g) käytetään polyakryyliamidigeeliä, ristikyt-

33. O 5 6 7 kettyä dekstraanigeeliä, agar- tai agaroosigeeliä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelin molekyylipainon ekskluusioraja on ainakin 2000 ja on tasapainoitettu HCOOH-HCOONH^:llä pH:ssa 5, ja pH-gradienttieluoin-ti suoritetaan kolonnissa, joka on panostettu samalla tavoin tasapainotetulla, samanlaisella geelillä.

14. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta c) saatu vesiuute lämmitetään nopeasti lämpötilaan, joka on välillä 95-100°C, entsyymien tuhoamiseksi.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiuute lämmitetään 98-100°C:seen ja pysytetään tässä lämpötilassa 5-10 minuuttia.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuumennettu vesiuute käsitellään natriumkloridin vesi-liuoksella epäpuhtauksien saostamiseksi.

17. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CAPA:a ja albumiinia sekoitetaan happamassa liuoksessa ja että liuoksen pH:ta korotetaan komponenttien välisen vuorovaikutuksen aikaansaamiseksi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiste lyofilisoidaan.