DE4023201A1

DE4023201A1 - Mittel zur vorbeugung und behandlung der undurchsichtigkeit von linsen

Info

Publication number: DE4023201A1
Application number: DE4023201A
Authority: DE
Inventors: Susumu Sato; Norihiro Kakimoto; Kunie Nakamura; Mikio Miyata; Shigezo Uga
Original assignee: Asai Germanium Research Institute Co Ltd; Sato Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Asai Germanium Research Institute Co Ltd; Sato Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-07-20
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1991-01-24
Also published as: GB2233898B; GB2233898A; AU635045B2; IT9021002A1; KR910002440A; FR2649889B1; US5118679A; CH681598A5; IT9021002A0; GB9015631D0; KR960008314B1; FR2649889A1; AU5893890A; IT1244562B

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Vorbeugen und zur Behand lung der Undurchsichtigkeit von Linsen, insbesondere ein Mittel zur Vorbeugung und zur Behandlung der Undurchsichtigkeit von Lin sen, das als Wirkstoffkomponente eine spezifische Organoger manium Verbindung oder die spezifische Organogermanium Verbin dung zusammen mit Aminoguanidin enthält.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein hocheffizientes Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit von Linsen, das eine Kombination einer spezifischen Organogermanium Verbindung und eines spezifischen Phenoxazinderivats enthält.

Augenlinsen bestehen im wesentlichen aus ca. 65% Wasser und ca. 35% Protein, wobei der Proteinanteil in der Linse höher ist als in anderen Körpergeweben. Das hochkonzentriert vorliegende Pro tein erzeugt in der Linse verschiedenen biologischen Steuer mechanismen folgend zusammen mit dem Wasser innerhalb der Zellen einen hydrophilen kolloidalen Zustand, um die Transparenz der Linse zu erhalten, und hält diesen Zustand aufrecht. Wenn die Linse, die transparent sein sollte, aufgrund irgendeiner Ursache opak wird, nimmt die Lichtquantität, die auf die Retina auf trifft, ab. Dadurch verschlechtert sich die Sehschärfe durch die Linse im allgemeinen in Abhängigkeit von dem Betrag der erreich ten Undurchsichtigkeit.

Da sich die Ätiologie des Auftretens der Linsenundurchsichtig keit unterscheidet, ist es schwierig, dieses Problem allgemein zu diskutieren. Einer der angenommenen Mechanismen geht dahin, daß die wasserlöslichen, die Membran- und die wasserunlöslichen Linsenproteine, die zuvor angesprochen wurden, Verunreinigungen der SH-Gruppe (Thiol-Gruppe) enthalten, die durch eine biologisch oxidierende Reaktion in eine S-S-Bindung umgewandelt werden, so daß unlösliche Aggregatprodukte geformt werden, die zur Linsenundurchsichtigkeit führen. Die andere am ehesten nachvollziehbare Erklärung lautet, daß die zuvor genannten Pro teine mit Zuckern nichtenzymatisch und irreversibel reagieren, so daß eine Reaktionsmischung, die als Amadori-Produkte bezeich net wird, erzeugt wird. Diese Reaktionen sind im allgemeinen Reaktionen zwischen Amino-Gruppen der Proteine und Carbonyl-Grup pen der Zucker, welche als Mailard-Reaktion bezeichnet wird. Es wird angenommen, daß diese Mailard-Reaktion die zum Altern füh rende Schlüsselreaktion ist. Diese Deutung ist eine derjenigen der Ätiologie für opake Linsen.

Das typische Beispiel für eine Krankheit im Zusammenhang mit opaken Linsen ist als "grauer Star" bekannt, der in den angebore nen grauen Star und in den erworbenen grauen Star unterteilt wer den kann. Der letztere ist weiter unterteilt in den altersbeding ten grauen Star, den traumatischen grauen Star, den diabetisch bedingten grauen Star und andere. Bei jeder Art des grauen Stars wird die Bildung von Amadori-Produkten als Grund für die Undurch sichtigkeit angenommen.

Auf diesem Gebiet hat sich bis jetzt noch keine therapeutische Behandlung zur Vorbeugung der Undurchsichtigkeit der Linsen oder der Verminderung der Undurchsichtigkeit, falls diese schon begon nen hat, durchgesetzt.

Das heißt, daß viele Probleme bezüglich des Undurchsichtigwer dens von Linsen, einschließlich des grauen Stars - wie zuvor er klärt -, jetzt noch nicht gelöst sind, so daß spezifische Mittel zur Vorbeugung oder Behandlung der Undurchsichtigkeit der Linsen nicht entwickelt wurden. Daher sind derzeit nur Mittel gebräuch lich, die eine entscheidende Wirkung nur im Bereich des Erhal tens der Sehschärfe oder der Blockierung des Fortschreitens des Undurchsichtigwerdens ausüben.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ausgehend vom Stand der Technik, wie er zuvor beschrieben wurde, darin, ein Mittel an die Hand zu geben, das der Undurchsichtigkeit von Lin sen effizient vorbeugt und diese behandelt.

Dabei soll das Mittel keine Toxizität oder Nebenwirkungen aufwei sen, da diese Mittel für eine lange Zeitperiode verabreicht wer den sollten.

Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit von Linsen zur Verfügung, wobei das Mittel als wirksame Komponente die durch folgende Formel wiedergegebene Germanium Verbindung enthält:

in welcher R₁ bis R₃ Wasserstoffatome, niedrige Alkyl-Gruppen, die gleich oder unterschiedlich sind und aus einer Gruppe ausge wählt sind, die aus einer Methyl-Gruppe, einer Ethyl-Gruppe, usw. besteht, oder eine substituierte oder nicht substituierte Phenyl-Gruppe darstellen, in der X eine Hydroxyl-Gruppe, eine O-niedrige Alkyl-Gruppe, eine Amino-Gruppe oder O^-Y⁺ darstellt {Y stellt hier ein Metall, wie beispielsweise Natrium, Kalium, usw. dar oder eine Verbindung mit einer basischen Gruppe, wie beispielsweise Lysozym und eine basische Aminosäure, usw.}.

Eine weitere Lösung der zuvor gestellten Aufgabe besteht darin, ein Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit der Linse an die Hand zu geben, welches als wirksame Komponenten die Organogermanium Verbindung gem. der Formel 1 zusammen mit Aminoguanidin enthält.

Eine weitere Lösung der eingangs gestellten Aufgabe besteht darin, ein Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurch sichtigkeit von Linsen an die Hand zu geben, das die Organo germanium-Verbindung gemäß Formel (1) und ein spezifisches Phenoxazinderivat enthält.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der vorliegenden Erfindung wer den anhand von Beispielen und auf diese bezogene Zeichnungen er läutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Funktion, welche den Überlebensanteil von Mäusen mit beschleunigter Alterung zeigt,

Fig. 2 eine Funktion, welche die Überlebensrate zwi schen einer Gruppe mit getropften Augen und einer Kontrollgruppe zeigt,

Fig. 3 ein Diagramm, das die Prozentverteilung der Lin sensymptome zeigt,

Fig. 4 eine Fotografie einer opaken Linse eines Tieres vor der Augentropfbehandlung,

Fig. 5 eine Fotografie des Zustands derselben Linse des Tieres nach Fig. 4, einen Monat nach der Augen tropfbehandlung,

Fig. 6 eine Funktion, die den Fortschritt der Amadori- Produktbildung aus Rinderserum-Albumin und D-Glu kose, und der Wirkung des Mittels gem. der vor liegenden Erfindung auf die Amadori-Produktbil dung aus Rinderserum-Albumin und D-Glukose zeigt,

Fig. 7 eine Funktion, die die Wirkung des Mittels der vorliegenden Erfindung auf die Amadori-Produkte zeigt, die aus Rinderserum-Albumin und D-Glukose gebildet sind,

Fig. 8-13 die Prozentverteilung von Linsensymptomen in je der Augentropfgruppe,

Fig. 8-10 die Ergebnisse der Anwendung des Augentropfens mit dem vorliegenden Mittel bei Mäusen, die einen Monat alt sind und danach, und

Fig. 11-13 die Ergebnisse der Anwendung des Augentropfens mit dem vorliegenden Mittel bei Tieren, die fünf Monate alt sind und danach.

Das Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit von Linsen enthält als Wirkstoff die spezifische Organogermanium Verbindung, wie sie durch die Formel (1) beschrieben ist:

Zunächst wird die Verbindung erläutert.

Die Grundstruktur der Verbindung ist aus einer Germylpropion-Säu re zusammengesetzt, an der an das Germaniumatom ein Propionsäu rederivat, drei Substituenten R₁ bis R₃ und eine funktionale Gruppe, die Sauerstoff enthält, wie beispielsweise OX, gebunden ist, und in welcher die Germaniumatome der Hauptstruktur und die Sauerstoffatome im Verhältnis 2 : 3 gebunden sind.

Jeder der Substituenten R₁ bis R₃ repräsentiert hierbei ein Was serstoffatom, eine sogenannte niedrige Alkyl-Gruppe, wie bei spielsweise eine Methyl-Gruppe, eine Ethyl-Gruppe, eine Propyl- Gruppe, eine Butyl-Gruppe usw., oder eine Phenyl-Gruppe, die sub stituiert oder nicht substituiert ist. Der Substituent X reprä sentiert eine Hydroxyl-Gruppe, eine O-niedrige Alkyl-Gruppe, eine Amino-Gruppe oder O⁻Y⁺, welches für sich das Salz einer Car boxylsäure darstellt. Der Substituent Y stellt ein Metall, wie beispielsweise Natrium, Kalium oder dergleichen dar, wobei das Metall nicht notwendigerweise monovalent ist, oder eine basische Verbindung, die aus einer basischen Aminosäure oder dergleichen, wie beispielsweise Lysozym oder Lysin, bestehen kann.

Die Substituenten R₁ und R₂ und der Substituent R₃ sind jeweils mit dem Germaniumatom in α und β Position gebunden. Beispiele für Organogermanium Verbindungen, die entsprechend der vorliegen den Erfindung herangezogen werden, ergeben sich wie folgt:

Die Organogermanium Verbindungen der zuvor genannten Struktur formel können gem. unterschiedlicher Verfahren hergestellt wer den.

Beispielsweise kann die Verbindung, in welcher X ein OH in der Formel (1) ist, entsprechend der folgend dargestellten Reaktions gleichung hergestellt werden:

Reaktionsgleichung

Das bedeutet, daß Trihalogermylpropionsäure, an welche die Sub stituenten R₁ bis R₃ zuvor gebunden wurden, wie beispielsweise Trichlorogermylpropionsäure (2) und dergleichen, hydrolysiert werden können.

Andererseits kann beispielsweise die Verbindung, in welcher X eine O-niedrige Alkyl-Gruppe darstellt, dadurch erhalten werden, daß Thionylchlorid, usw. mit der vorher genannten Verbindung (2) reagiert, um die Verbindung in das entsprechende Säurehalid zu verwandeln, und in der Folge durch Reaktion eines Alkohols, der der zuvor genannten O-niedrigen Alkyl-Gruppe entspricht, gefolgt von einer Hydrolyse der resultierenden Verbindung. Und die Verbindung der Formel (1), in welcher X NH₂ darstellt, kann bei spielsweise durch Reaktion von Ammoniak mit dem zuvor genannten Säurehalid, gefolgt von einer Hydrolyse erhalten werden.

Die Verbindung der Formel (1), die die COO⁻Y⁺-Gruppe als Substituenten X enthält, in welcher Y ein Metall darstellt, kann beispielsweise dadurch erhalten werden, daß ein Metallhydroxyd mit der obigen Verbindung (1) reagiert, während die Verbindung, welche eine basische Gruppe als Y enthält, bekannten Säure-Base Reaktionen unterworfen werden kann.

Die auf die obengenannte Art und Weise erhaltenen Organoger manium Verbindungen wurden einer automatischen magnetischen Kern resonanzanalyse (NMR) und einer Infrarotabsorptionsspektrenana lyse (IR) unterworfen. Die Ergebnisse erhärten, daß die zuvor beschriebene Verbindung durch die eingangs genannte Formel (1) wiedergegeben werden kann.

Die obengenannten Formeln repräsentieren die Organogermanium Ver bindung in kristallinem Zustand, die in wäßriger Lösung an den Germanium-Sauerstoff Bindungen hydrolisiert werden. Beispiels weise transformiert die oben aufgeführte Verbindung (1-1) ihre Originalstruktur in die folgende Struktur:

Von den oben aufgeführten Verbindungen ist die Verbindung (1-1) vorzuziehen, da sie sehr leicht erhältlich ist.

Aminoguanidin, welches nach der vorliegenden Erfindung benutzt wird, wird durch die folgende Formel wiedergegeben:

Aminoguanidin ist eine der Verbindungen, die als stark nukleo philes Reagenz bekannt ist.

Das Phenoxazinderivat, das gem. der Erfindung Anwendung findet, ist durch folgende Prinzipstrukturformel wiedergegeben:

Insbesondere 1-hydroxy-5-oxo-5H-pyrido(3,2-a) Phenoxazin-3-Car boxylsäure mit dem allgemeinen Namen Pyrenoxin kann gem. fol gender Strukturformel dargestellt werden:

Sein Salz mit einem Metall wie beispielsweise Natrium, Kalium oder dergleichen kann vorzugsweise angewendet werden.

Diese Verbindung wurde bereits konventionell zur Behandlung von grauem Star angewandt. Der Erfolg einer solchen Behandlung wurde in der akademischen Fachliteratur beschrieben (beispielsweise in: Japanese Clinical Ophthalmology 11: 272, 1957).

Die anderen Phenoxazinderivate, die durch die oben wiedergegebe ne Grundstrukturformel dargestellt sind, sind in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 10 570/1980 veröffentlicht.

Das Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit von Linsen gem. der vorliegenden Erfindung enthält als Wirkstoff komponente die Organogermanium Verbindung, welche in der zuvor beschriebenen Art und Weise synthetisiert ist oder die Organoger manium Verbindung mit dem zuvor bereits erwähnten Aminoguanidin oder die Organogermanium Verbindung mit dem Phenoxazinderivat, das zuvor beschrieben wurde. Die Wirkstoffkomponenten werden zu Augentropfen verarbeitet, vorzugsweise zusammen mit bekannten Komponenten wie beispielsweise Borsäure, Natriumchlorid, Natrium hydroxyd oder Benzalkoniumchlorid, ε-Aminocapronsäure, Methyl p-Oxyaminobenzoesäure und Chlorobutanol.

Die Löslichkeit der Organogermanium Verbindung und dergleichen als Wirkkomponente der vorliegenden Erfindung kann in basischen Augentropfen ansteigen.

Da die Organogermanium Verbindung als Wirkkomponente der vorlie genden Erfindung charakteristische Eigenschaften wie extrem nie drige Toxizität und nur geringe Nebeneffekte aufweist, ist der Anteil dieser Wirkstoffkomponente, der in den Augentropfen ver wendet wird, frei wählbar. Der Anteil kann beispielsweise im Be reich von 0,5 bis 5% der Gesamtmenge der Augentropfen angegeben werden. Alternativ dazu kann für Augentropfen, die als Hauptmit tel die Organogermanium Verbindung und Aminoguanidin enthalten, die Organogermanium Verbindung in einem Bereich von z. B. 10^-5 bis 10^-7 des Aminoguanidingehalts verwendet werden.

Die Augentropfen, welche als Hauptwirkstoffe die Organogermanium Verbindung und das Phenoxazinderivat enthalten, können so herge stellt werden, daß 5-500 mg der Organogermanium Verbindung und 0,05-0,5 mg des Phenoxazinderivats in 1 ml der Augentropfen ent halten sind.

Phenoxazinderivat wurde zur Behandlung des grauen Stars schon lange Zeit verwendet, so daß dessen problemlose Anwendung inzwi schen nachgewiesen ist.

Darüber hinaus kann das Mittel, welches die Organogermanium Ver bindung enthält, und das Mittel, welches ein Phenoxazinderivat enthält, im voraus getrennt hergestellt werden, wonach sie ge mischt werden können, um das Mittel der vorliegenden Erfindung herzustellen.

Das Testen der Wirkung des Mittels gem. der vorliegenden Erfin dung in Mäusen, deren Alterung beschleunigt wurde, und die für die Undurchsichtigkeit der Linse anfällig waren, zeigt derartige Effekte wie eine Abnahme in der Anzahl der opaken Augen und ein Ansteigen der Anzahl der transparenten Augen infolge der Augen tropfen, die das Mittel gem. der vorliegenden Erfindung enthal ten.

In vitro-Experimente, die das α-Kristallin (die α-Augenlinse) der Rinderlinse und Glukose verwenden, zeigen derartige Wirkun gen, daß das vorliegende Mittel, welches als Wirkkomponente die vorbeschriebene Organogermanium Verbindung oder die Organoger manium Verbindung und Aminoguanidin enthält, dem Undurchsichtig werden der Linsen vorbeugt oder die Undurchsichtigkeit der Lin sen verbessert, indem die Amadori-Produktbildung unterdrückt wird und die bereits gebildeten Amadori-Produkte in niedermole kulare Substanzen zersetzt werden.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 1. Versuchsführung

18 zehn Monate alte Mäuse, deren Alterungsprozeß beschleu nigt wurde (5 männliche und 13 weibliche) wurden in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe, die aus 10 Mäusen bestand, wur de mit einem Tropfen der Augentropfen 4mal täglich, 6 Tage die Woche während 128 Tagen behandelt, wobei die Augen tropfen das Mittel gem. der vorliegenden Erfindung enthiel ten, in welchem die Organogermanium Verbindung (1-1) zu einem Anteil von 4% enthalten war. Die andere Gruppe, wel che aus 8 Mäusen bestand, wurde nicht mit Augentropfen behan delt, und diente als Kontrollgruppe. Beide Gruppen wurden unter gleichen Bedingungen gehalten und gefüttert. Die Linsen von jedem Versuchstier wurden mittels eines Mikroskops betrachtet, während das Versuchstier durch eine intraperitoneale Injektion von 0,7 ml/kg Natriumnembutal anästhesiert wurde. Die Überprüfung wurde 4mal durchgeführt, d.h. vor Beginn der Experimente und 39, 78 und 123 nach Beginn des Experiments.

2. Ergebnisse

Überleben der Mäuse, deren Alterung beschleunigt wurde:
Vor Beginn der Experimente betrug die Anzahl der Mäuse, deren Alterung beschleunigt wurde, insgesamt 18, wie in Fig. 1 dargestellt. Die Gesamtzahl der überlebenden Versuchstiere zeigte eine graduelle Abnahme bis zum Alter von 12 Monaten, d. h. eine Abnahme um 1 am Tag 39 und zusätzlich um 5 am Tag 78. Die Anzahl der Überlebenden nahm rapide im Alter von 14 Monaten entsprechend dem Tag 123 ab. Dadurch verminderte sich die Anzahl der Überlebenden um die Hälfte oder noch mehr.

Die Überlebenden am Tag 123 wurden entsprechend der "Augen tropfen"-Gruppe und der "Kontroll"-Gruppe verglichen. Wie in Fig. 2 dargestellt, wurden drei Todesfälle von 10 Mäusen in der "Augentropfen"-Gruppe festgestellt, während 6 Todesfälle von 8 in der "Kontroll"-Gruppe festgestellt wurden. Demzufol ge ist klar nachgewiesen, daß die "Augentropfen"-Gruppe län ger überlebte.

Linsensymptome der Mäuse, deren Alterung beschleunigt wurde, und Überlebenszustand:
Die Linsen der Mäuse im Alter von 10 Monaten, deren Alterung beschleunigt wurde, wurden einer mikroskopischen Untersu chung unterworfen. Es wurden grundlegende Unterschiede bezüg lich des Auftretens des Undurchsichtigwerdens der Linsen be obachtet. Die opaken Zustände der Linsen wurden in drei Klas sen eingeteilt, nämlich transparent, nukleuserhärtend und opak. Transparente Linsen zeigen keine annormalen Symptome, so daß der Netzhautboden (retinal vessel) hierdurch gesehen werden konnte. In einer Linse, bei der Nukleuserhärtung fest gestellt wurde, erstreckte sich die Nukleuserhärtung in der cortikalen Zwischenschicht, woran sich konzentrische Kreise in Form von Lichtwellen auf der polaren Oberfläche anschlos sen. Histologisch wurde eine bestimmte Grenzschicht mit un terschiedlicher Einfärbeigenschaft zwischen dem den Nukleus umgebenden Bereich und der kortikalen Oberflächenschicht beobachtet und es wurden zurückspringende und vorspringende Teile unterschiedlicher Größe an den Stellen der konzentrischen Kreise beobachtet.

Die Diagnose der opaken Linsen wurde erstellt auf der Be obachtung des Auftretens des Trübwerdens auf der normalen Kortex. Unter diesen konnten stark opake Linsen innerhalb von 78 Tagen nach Beginn der Experimente nicht beobachtet werden.

Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels über Augentropfen:
Tabelle 1 zeigt die Linsenbeobachtungen in der "Augentrop fen"-Gruppe und in der "Kontroll"-Gruppe am Anfang der Expe rimente, an deren 39., 78. und 123. Tag.

Tabelle 1

Behandelte Gruppe

Kontroll Gruppe

Fig. 3 zeigt die Prozentanteile der zuvor aufgeführten Lin senbeobachtungen. In der "Augentropfen"-Gruppe betrug vor der Augentropfenbehandlung der Anteil der opaken Linsen 20% Dieser nahm allerdings auf 11% ab. Der Anteil der trans parenten Linsen betrug 15% vor der Augentropfbehandlung. Dieser nahm auf 0 am Tag 39 ab und stieg anschließend wieder auf 38% am Tag 78. Damit sind die zuvor beschriebenen Wir kungen der Augentropfen mit dem Mittel der vorliegenden Er findung klar nachgewiesen.

Im Gegensatz dazu nahm der Anteil der transparenten Augen in der Kontrollgruppe ab, während der Anteil der opaken Augen mit Zunahme des Alters anstieg. Die Verschlimmerung der Symp tome ist bemerkenswert.

Die Fig. 4 und 5 zeigen einen Vergleich der Wirkungen des erfindungsgemäßen Mittels in derselben Augenstichprobe. Die Linse gem. Fig. 4 zeigt eine leichte Undurchsichtigkeit, wo hingegen diese Linse einen Monat später gem. Fig. 5 hinsicht lich der Transparenz beträchtliche Verbesserungen zeigt.

Darüber hinaus wurden lokal infolge des Augentropfens Symp tome verbessert. So nahm beispielsweise die Anzahl der kon zentrischen Kreise, die in der Linse bei Diagnostizierung der Nukleuserhärtung festgestellt worden waren, ab und die Änderung in der äquatorialen Bogenkonstruktion infolge des Alterns nahm ebenfalls ab.

Beispiel 2 1. Versuchsführung

Versuchsführung unter Verwendung von Rinder-α-Kristallin:
Gleiche Anteile von 20 mg/ml α-Kristallin, welches von Rin derlinsen gewonnen wurde (hergestellt durch die Sigma Corpo ration) und 200 mM D-Glukose wurden gemischt und 100 µl der so erhaltenen Mischung wurde in 96 gefäßförmige Mikrotitrier platten (96 well microtiter plate) eingefüllt. Jedem dieser Gefäße wurde eine Lösung von 200 mM Aminoguanidinchlorid und 20 mM Organogermanium Verbindung (1-1), wie sie zuvor be schrieben wurde, unter Verwendung der Boxtitriermethode zugefügt, wobei fünffach verdünnt wurde. Ein Anteil von 7µl der Lösung wurde von einem Gefäß über eine vorbe stimmte Zeit entnommen und mit 133 µl eines 50 mM Phosphat puffers verdünnt. Dann wurde die verdünnte Lösung einer TSK-G3000SW-Säule zugeführt, die mit einem hochwirksamen Flüssigkeitschromatographiesystem ausgerüstet war, in wel cher zur gleichzeitigen Detektierung ein Fluoreszenzdetektor für eine 350 nm Anregungswellenlänge und eine 440 nm fluores zierende Wellenlänge sowie ein Ultraviolettdetektor für 280 nm angeordnet waren.

In dieser Weise wurden die Amadori-Produkte, welche aus α- Kristallin und D-Glukose hergestellt wurden, gesammelt und gewaschen, wonach eine Re-suspendierung in einem 0,5 M Phosphatpuffer folgte und eine Wiederaufteilung in 96 gefäß förmige Mikrotitrierplatten, um die Wirkungen der Organo germanium Verbindung (1-1) und des Aminoguanidin zu untersu chen.

Versuchsführung unter Verwendung von Rinderserum-Albumin:
Gleiche Anteile von 200 mg/ml Rinderserum-Albumin wurden mit einem 0,5 M Phosphatpuffer (PH 7,4) und 400 mM D-Glukose un ter zugabe von drei 3 mM NaN₃ gemischt. Anminoguanidin und die Organogermanium Verbindung (1-1), die zuvor beschrieben wurde, wurden auf verschiedene vorgegebene Konzentrationen eingestellt, wobei dies mittels der Boxtitriermethode ge trennt geschah, und dann der zuvor beschriebenen Lösung zuge geben. Unter Beobachtung der Fluoreszenzintensität als Indi kator wurde ihre Wirkung auf die Amadori-Produktbildung un tersucht. Alternativ wurde eine Mischung von Rinderserum- Albumin und D-Glukose für eine längere Zeitspanne auf 37°C erwärmt, um Amadori-Produkte herzustellen. Die Zugabe der Organogermanium Verbindung (1-1) und des Aminoguanidin wurde während des Erwärmungsprozesses und der Messung nach und nach über die Zeit durchgeführt, um die Wirkung mittels der hochwirksamen Flüssigkeitchromatographie abzuschätzen.

2. Ergebnisse

Versuchsführung unter Verwendung von Rinder-αKristallin:
Obwohl eine Dosis von Aminoguanidin alleine bei einer niedri gen Konzentration die Amadori-Produktbildung eher begünstig te, konnte klar nachgewiesen werden, daß das erfindungsge mäße Mittel, welches die Organogermanium Verbindung (1-1) von einer niedrigen bis zu einer hohen Konzentration beinhal tet, die Amadori-Produktbildung effektiv unterdrückt. Dar über hinaus unterdrückte das erfindungsgemäße Mittel mit der Organogermanium Verbindung (1-1) und dem Aminoguanidin die unterstützte Amadori-Produktbildung, die in der Versuchsgrup pe beobachtet werden konnte, in welcher Aminoguanidin allei ne zugegeben wurde. Zusätzlich war der Grad der Amadori-Pro duktbildung über den gesamten Konzentrationsbereich niedri ger als in den Kontrollgruppen. Eine Dosis von Aminoguanidin alleine von 40 mM oder 200 mM führte zu einer reversiblen Solubisation von Amadori-Produkten, welche durch α-Kristal lin erzeugt wurden. Das Mittel der vorliegenden Erfindung, welches die Organogermanium Verbindung (1-1) in einer 20 mM Konzentration enthält, und das erfindungsgemäße Mittel, wel ches die Organogermanium Verbindung (1-1) und Aminoguanidin jeweils in der geringen Konzentration von 800 µM und 320 µM enthält, waren wirksam.

Die Ergebnisse sind teilweise in Tabelle 2 dargestellt.

Die Zahlen in Tabelle 2 zeigen Integralwerte der Fluores zenzintensität, welche durch ein Fluoreszenzmeßgerät für eine 350 nm Anregung und eine 440 nm Fluoreszenz-Wellenlänge gemessen wurde.

Tabelle 2

Der Wert, welcher durch α-Kristallin alleine erhalten wurde, betrug 137. Der Wert, welcher mit einem _* gekennzeichnet ist, wurde in dem Fall erhalten, in welchem die D-Glukose zu α-Kristallin zugegeben wurde.

Versuchsführung unter Verwendung von Rinderserum-Albumin:
Es wurde bestätigt, daß Rinderserum-Albumin und D-Glukose Amadori-Produkte mit eine Fluoreszenzintensität oberhalb 4×10⁴ für 50 Tage bildete. Das Experimentiersystem wurde mit tels hochwirksamer Flüssigkeitschromatographie untersucht und die Ergebnisse zeigen einen bemerkenswerten Anstieg der Dimere und Trimere des Serum Albumin.

Dem System wurde das erfindungsgemäße Mittel mit der Organo germanium Verbindung (1-1) (4 mM) und Aminoguanidin (200 mM) zugegeben, welches zu einer bemerkenswerten Verhinderung der Amadori-Produktbildung führte. Entsprechend der Ergebnisse wurde der synergetische Effekt zwischen der Organogermanium Verbindung (1-1) und Aminoguanidin bestätigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Das Experimentiersystem wurde einer Analyse mittels hochwirksamer Flüssigkeitschromato graphie unterworfen und die den Dimeren und Trimeren des Se rum Albumins entsprechenden Peaks flachten ab, während ein Peak im Bereich der niedermolekularen Substanzen erschien.

Eine Mischung von Rinderserum-Albumin und D-Glukose wurde während 9 Wochen auf 37°C erwärmt, um hinreichend viel Ama dori-Produkte zu erzeugen, zu welchen das erfindungsgemäße Mittel mit der Organogermanium Verbindung (1-1) (20 mM) und Aminoguanidin (200 mM) zugegegeben wurden. Wie in Fig. 7 dar gestellt, konnte eine bemerkenswerte Abschwächung einer Ama dori-Produktbildung beobachtet werden, die auch für dieses System das Vorliegen eines synergetischen Effekts zwischen der Organogermanium Verbindung (1-1) und Aminoguanidin nach weist.

Bei Analysieren des Systems durch die hochwirksame Flüssig keitschromatographie wurde der Peak entsprechend der Trimere des Serum Albumin der wichtigste, während der Peak für die niedermolekularen Bestandteile, der einen intensiven Ultra violettabsorptionspeak zeigte, in dem Maße erschien, in wel chem die Fluoreszenz abnahm. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Amadori-Produktbildung unterbrochen wurde und daß gebildete Proteine in niedermolekulare Substanzen umge wandelt wurden.

Beispiel 3

Als Experimentaltiere wurden Mäuse, deren Alterung beschleunigt worden war, im Alter von 1 Monat (12 Mäuse) und 5 Monaten (12 Mäuse) herangezogen. Beide Altersgruppen wurden in drei indivi duelle Gruppen unterteilt. Der Gruppe 1 wurde eine Lösung aus 0,05 mg/ml 1-hydroxy-5-oxo-5H-pyrido(3,2-a)Phenoxazin-3-Carboxyl säure (allgemeiner Name: Pyrenoxin - die Lösung wird in der Fol ge als Pyrenoxin-Lösung bezeichnet) verabreicht. Der Gruppe 2 wurden die 4%ige Organogermaniumverbindung (1-1) -Lösung (als Ge-Lösung bezeichnet) und die Pyrenoxin-Lösung beide verab reicht. Der Gruppe 3 wurde als Kontrollgruppe destilliertes Was ser mit einem die Oberflächenaktivität mindernden Mittel als Placebo-Lösung verabreicht. Die Verabreichung erfolgte über Augentropfen 4mal täglich, 6 Tage pro Woche. Vor dem Beginn des Augentropfens und 30, 60, 90 und 120 Tagen nach dem Versuchsbe ginn wurde unter Verwendung von Midorin P (Produktname) Mydriasis jedem Versuchstier verabreicht, welches durch intra peritonealer Injektion von 0,7 ml/kg Natriumnembutal anästhe siert war, bevor es jeweils einer Linsenuntersuchung unter einem Stereomikroskop unterworfen wurde.

Die Linsenuntersuchungsergebnisse der Mäuse, deren Alterung be schleunigt wurde, kann in diesem Beispiel grob in 4 Gruppen un terteilt werden, d.h. Transparenz, Bildung konzentrischer Krei se, Verwerfung und kortikale Undurchsichtigkeit. Mit dem Aus druck "Transparenz" ist gemeint, daß kein annormales Symptom in der Linse auftaucht, so daß die Retina hierdurch beobachtet wer den kann. Mit dem Ausdruck "Bildung von konzentrischen Kreisen" ist gemeint, daß 2-5 Ringe in konzentrischen Kreisen in einer Linse beobachtet werden können. Mit dem Ausdruck "Verwerfung" ist der Beginn der Verwerfung eines Bildes im Augengrund infolge der annormalen Strahlenbrechung der Linse gemeint.

Mit dem Ausdruck "kortikale Undurchsichtigkeit" ist der Beginn der keilförmigen oder diffusen Undurchsichtigkeit gemeint. Zwei dieser Symptome, die Bildung konzentrischer Kreise und die Ver werfung traten in manchen Linsen auf. In diesen Fällen wurde das Symptom, welches einen aprupteren Wechsel aufwies, als annorma les Symptom ausgewählt.

1. Augentropfenuntersuchungen beginnend 1 Monat nach der Geburt

Die Augen der Mäuse im Alter von einem Monat, deren Alterung beschleunigt worden war, wurden vor der Verabreichung der Augentropfen untersucht. Die meisten Augen einschließlich derjenigen der Kontrollgruppe, hatten transparente Linsen ohne annormale Symptome. In einem Versuchstier der Gruppe 2 (einer Gruppe, bei der die Ge-Lösung und die Pyrenoxin-Lösung gleichzeitig verabreicht wurden) wurde geringfügige kortikale Undurchsichtigkeit und keine Augenanophthalmie be obachtet.

Die Untersuchung, welche 30 Tage nach Versuchsbeginn der Augentropfbehandlung durchgeführt wurde, zeigte, daß die kor tikale Undurchsichtigkeit, welche vor Beginn der Augentropf behandlung beobachtet worden war, verschwand. Dennoch traten ringartige konzentrische Kreise in einem Auge der Gruppe 1 (die Pyrenoxin Behandlungsgruppe), bei einem Auge der Gruppe 2 (eine Gruppe mit gleichzeitiger Behandlung mit einer Ge-Lö sung und einer Pyrenoxin-Lösung) und zwei Augen der Gruppe 3 (als Kontrollgruppe) auf.

Die Untersuchung 60 Tage nach Beginn der Augentropfenbehand lung zeigt, daß die Annomalität in Linsen, wie beispielswei se die Bildung von konzentrischen Kreisen und Verwerfungen in einem Auge der Gruppe 1 und vier Augen der Gruppe 3 fest gestellt werden konnten.

Die Untersuchung 90 Tage nach Beginn der Augentropfenbehand lung zeigte, daß sechs Augen mit transparenten Linsen der Gruppe 1 die Bildung von konzentrischen Kreisen (in vier Augen) und Verwerfungen (zwei Augen) zeigten, was anzeigte, daß der graue Star im Anfangsstatium vorlag. Vier Augen der Gruppe 3 mit Linsen, die Verwerfungen aufwiesen, zeigten keine Änderung der bereits bei der frühen Untersuchung beobachteten Symptome. Im Gegensatz dazu waren die Linsen der Gruppe 2 in gutem Zustand, so daß sie als transparent angesehen werden konnten.

Die Untersuchung 120 Tage nach Beginn der Augentropfbehand lung zeigte, daß die Verwerfung, die in zwei Augen der Grup pe 1 nach 90 Tagen festgestellt worden waren, verschwunden waren. Die Verwerfung war in einer der vier Linsen der Grup pe 2 nicht mehr festzustellen, welche als im verworfenen Zu stand befindlich diagnostiziert worden war. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Verwerfung in Linsen nicht generell fi xiert werden kann. Aus der Gruppe 2 starb ein Versuchstier während der Experimente, während alle anderen verbleibenden Mäuse bei dieser Untersuchung als normal beurteilt werden konnten.

Die zuvor diskutierten Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten wiedergegeben. Die Verhältnisse eines jeden Symptoms bezogen auf die Grundgesamtheit sind in den Fig. 8-10 darge stellt.

Es kann gefolgert werden, daß diese Experimente die folgende Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels billigen.

2. Augentropfenuntersuchung beginnend 5 Monate seit Geburt

Eine Spur von konzentrischen Kreisen begann zu erscheinen in ein oder zwei Ringen um Linsen in Augen von 5 Monaten alten Mäusen, deren Alterung beschleunigt wurde, wobei je doch die Transparenz des Augengrundes der jeweiligen Lin sen als gut beurteilt wurde. Daher wurden diese vorüberge hend als transparente Linsen vor dem Beginn des Augentrop fens beurteilt.

Die Untersuchung, die am Tag 30 nach dem Beginn des Augen tropfens durchgeführt worden war, zeigte klare konzentri sche Kreise in zwei Linsen der Gruppe 2 und vier Linsen der Gruppe 3, während die Augen in Gruppe 1 keine Verände rungen zeigten.

Die Untersuchung 60 Tage nach Beginn der Augentropfbehand lung zeigt, daß die Gruppen 1 und 2 gute Fortschritte der art aufwiesen, daß alle Augen der Mäuse als transparent beurteilt werden konnten und daß die Bildung von konzentri schen Kreisen begleitet von Verwerfungen in vier Augen der Gruppe 3 auftraten.

Die Untersuchung 90 Tage nach Beginn der Augentropfbehand lung zeigt bezüglich der Gruppen 1 und 2 das Auftreten von schlimmen Veränderungen mit Beginn der Bildung von konzen trischen Kreisen (in 12 Augen) und Verwerfung (in zwei Au gen). Bei der Gruppe 3 wurde bei vier Augen diagnosti ziert, daß sie Verwerfungen und eine intensive Veränderung ihrer Linsen aufweisen.

Die Untersuchung 120 Tage nach Beginn der Augentropfbehand lung zeigte die Bildung konzentrischer Kreise in allen Lin sen der Gruppen 1 und 2 (14 Linsen). Insbesondere wurde eine Verschlimmerungstendenz begleitet von Verwerfungen in vier Augen der Gruppe 1 (die mit Pyrenoxin behandelte Gruppe) beobachtet. Auf der anderen Seite verschwand in der Kontrollgruppe in einem der vier Augen, in welchen Ver werfungen auftraten, die Verwerfung. Dennoch wurde in einem von diesem unterschiedlichen Auge dieser Gruppe das Auftreten der kortikalen Undurchsichtigkeit beobachtet, was das weitere Fortschreiten des grauen Stars anzeigt.

Die zuvor diskutierten Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten gezeigt. Die Verhältnisse von jedem Symptom zur Grundge samtheit sind in den Fig. 1-13 dargestellt.

Es kann festgestellt werden, daß diese Experimente die Wir kung des erfindungsgemäßen Mittels bezüglich der Verhütung des Fortschreitens der Krankheit und deren Behandlung be legt.

Wie deutlich in Beispiel 3 gezeigt, wurde die Wirkung bezüg lich der Vorbeugung und Beendigung des Fortschritts des grauen Stars bei Mäusen der Gruppen 1 und 2, deren Alterung beschleu nigt worden war, verglichen mit denen der Gruppe 3 beobachtet. Allerdings wurde in der Gruppe, die nur mit der Pyrenoxin-Lö sung behandelt wurde, eine geringe Anzahl von Mäusen beobach tet, in welcher der graue Star im fortgeschrittenen Stadium war. Das heißt, daß die obengenannten Wirkungen nicht notwen digerweise als absolut sichere Wirkungen bezeichnet werden kön nen. Im Gegenteil dazu blieben in der Gruppe 2, d. h. der Grup pe, in welcher eine Kombination der Ge-Lösung und der Pyrenoxin-Lösung verabreicht wurde, alle Linsen über eine lange Zeit transparent. Zusätzlich zu dieser Wirkung wurde eine bemerkenswerte Verbesserung der Wirkung dadurch erreicht, daß die Linsen mit schlimmen Symptomen, wie beispielsweise kortikaler Undurchsichtigkeit wieder transparent wurden. In dem obengenannten Beispiel zeigen auch die anderen Komponenten als die Komponente (1-1), falls sie verwendet werden, nähe rungsweise identische Wirkungen zu den oben beschriebenen.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß sich die vorliegende Erfindung ausgezeichnet als Mittel zur Vorbeugung und Behand lung der Undurchsichtigkeit von Linsen eignet.

Claims

1. Mittel zur Vorbeugung und Behandlung der Undurchsichtigkeit von Linsen, welches als wirksame Komponente, die in nachfol gender Formel wiedergegebener Germanium Verbindung enthält: in welcher R₁ bis R₃ Wasserstoffatome, niedrige Alkyl-Grup pen, die gleich oder unterschiedlich sind und aus einer Grup pe ausgewählt sind, die aus einer Methyl-Gruppe, einer Ethyl- Gruppe, usw. besteht, oder eine substituierte oder nicht substituierte Phenyl-Gruppe darstellen, in der X eine Hydroxyl-Gruppe, eine O-niedrige Alkyl-Gruppe, eine Amino- Gruppe oder O^-Y⁺ darstellt, wobei Y hier ein Metall, wie beispielsweise Natrium, Kalium, usw. oder eine Verbindung mit einer basischen Gruppe, wie beispielsweise Lysozym oder eine basische Aminosäure, usw., darstellt.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als weitere Wirkkomponente Aminoguanidin enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Organogermanium Verbindung gemäß der Formel (1) R₁ bis R₃ Wasserstoffatome und X eine Hydroxyl-Gruppe sind.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form von Augentropfen zusammen mit an sich bekann ten Komponenten, wie Borsäure, Natriumchlorid, Natrium hydroxyd oder Benzalkoniumchlorid, ε-Aminokapronsäure, Methyl-P-oxyaminobenzoesäure, Chlorobutanol und dergleichen verwendet wird.

5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wei tere Wirkkomponente ein Phenoxazinderivat enthalten ist.

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Organogermanium Verbindung gem. der Formel (1) R₁ bis R₃ Was serstoffatome und X eine Hydroxyl-Gruppe sind.

7. Mittel nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenoxazinderivat durch folgende Formel wiedergegeben wird: beispielsweise Natrium, Kalium oder dergleichen ist.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß es das Natriumsalz der Organogermanium Verbindung und/oder das Natriumsalz des Phenoxazinderivats enthält.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel in Form von Augentropfen zusammen mit bekann ten Komponenten, wie beispielsweise Borsäure, Natrium chlorid, Natriumhydroxyd oder Benzalkoniumchlorid, ε-Amino kapronsäure, Methyl-P-oxyaminobenzoesäure, Chlorobutanol und dergleichen verwendet wird.

10. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der An sprüche 5-9, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Or ganogermanium Verbindung und das Phenoxazinderivat getrennt hergestellt werden und daß die gebrauchsfertigen Endmischun gen nach Bedarf gemischt werden.