DE3784852T2

DE3784852T2 - Test fuer sulfhydrylaminosaeure und verfahren zum nachweis und zur unterscheidung von cobalamin und folsaeure.

Info

Publication number: DE3784852T2
Application number: DE8787310138T
Authority: DE
Inventors: Robert H Allen; John Lindenbaum; Sally P Stabler
Original assignee: University Patents Inc
Current assignee: Competitive Technologies Inc
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-11-18
Also published as: JP2577878B2; DE3751840T2; ATE139344T1; JP2574339B2; ATE87104T1; JPS63221249A; JPH0749348A; DE3751840D1; EP0269352B1; EP0486118A1; CA1298536C; DE3784852D1; JPH0854398A; HK1007799A1; EP0269352A3; US4940658A; EP0486118B1; EP0269352A2; JP2579434B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit von Sulfhydrylaminosäure-Arten in einer Probe, zum Beispiel Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Gesamthomocysteins in Proben vom Körpergewebe eines warmblütigen Tieres, sowie Verfahren zum Testen, ob das warmblütige Tier einen Mangel an Cobalamin einen Mangel an Folat, beides oder keines von beidem hat.
Die Sulfhydrylaminosäure-Arten sind Stoffwechselprodukte gemäß einer komplexen Struktur die auf der nächsten Seite gezeigt ist. Methioninsynthease METHIONIN S-ADENOSYLMETHIONIN S-Adenosylhomocystein Betain N,N,-Dimethylclycerin 5,10-MethylenTHF HOMOCYSTEIN Cystationin g-Synthease CYSTATIONIN CYSTEIN a-KETOBUTYRAT PROPIONYL-CoA METHYLMALONYL-CoA METHYLMALONSÄURE Deoxyadenosyl-B&sub1;&sub2; Methylmalonyl-CoA-Mutase SUCCINYL-CoA
Wie aus der Darstellung zu erkennen ist, wird bei der Methylierung von Homocystein zur Bildung von Methionin über eine Methionin-Synthease, der Stoff Methylcobalamin (Me-Cbl), auch unter der Bezeichnung Methyl-B&sub1;&sub2; bekannt, benötigt. Die Methylgruppe ist ein Derivat des N&sup5;-Methyltetrahydrofolats (N&sup5;-MTHF), die in Tetrahydrofolat (THF) umgewandelt wird. Bei der Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA über Methylmalonyl-CoA-Mutase wird Adenosyl-Cobalamin, auch unter der Bezeichnung Adenosyl-B&sub1;&sub2; bekannt, als Kofaktor benötigt. Also sind Cobalamin und Folsäure wichtige Kofaktoren im Sulfhydryl-Metabolismus und Cobalamin allein, d.h. ohne Folsäure, ist ein wichtiger Kofaktor im Methylmalonyl-CoA Metabolismus.
Die genaue und schnelle Diagnose eines Cobalamin- und Folatmangels bei warmblütigen Tieren ist besonders wichtig, da diese Mangelerscheinungen zu lebensbedrohlichen hämatologischen Anomalien führen können, die jedoch durch Behandlung mit Cobalamin beziehungsweise Folat vollständig reversibel sind. Eine akkurate und frühe Diagnose eines Cobalamin-Mangels ist besonders wichtig, da eine solche Mangelerscheinung zu lebensbedrohlichen neuropsychiatrischen Anomalien führen kann. Eine äußere Anwendung von Cobalamin stoppt in jedem Fall die fortschreitende Entwicklung der Anomalien, in den meisten Fällen führt sie sogar zu einer signifikanten Verbesserung der Symptome und manchmal zu ihrer vollständigen Linderung. Die Unterscheidung zwischen Cobalamin- und Folatmangel ist oftmals sehr schwer, da beide Mangelerscheinungen zu gleichartigen hämatologischen Anomalien führen. Die Unterscheidung ist jedoch wichtig, denn die Anwendung der richtigen Vitamine zeitigt die größten Erfolge bei der Beseitigung der hämatologischen Anomalien, und, was noch wichtiger ist, nur Cobalamin kann die neuropsychiatrischen Anomalien, die nur bei einem Cobalaminmangel entstehen, beseitigen. Die Anwendung von Folsäure zur Behandlung eines Cobalaminmangels ist sehr gefährlich, denn einige oder alle der hämatologischen Anomalien könnten sich verbessern oder beseitigt werden, die neuropsychiatrische Anomalien dagegen verbessern sich nicht und schreiten fort.
Ganze Kapitel in führenden medizinischen Büchern und Artikel in führenden medizinischen Journalen widmen sich der Lehre, daß ein Cobalaminmangel bei Individuen mit einer signifikanten Anämie (d.h. verkleinertes Hämatokrit oder Hämoglobin), d.h. bei denen die roten Blutzellen makrozytisch sind (d.h. ein mittleres Zellvolumen (MCV) von > 100 fl) oder bei Individuen die neurologische Anomalien bestehend aus einem Nervenleiden und/oder einer Ataxie aufweisen, zu vermuten ist. Viele dieser Buchkapitel oder Journalartikel führen weiterhin aus, daß die Anämie typischerweise sehr stark ist, d.h. Hämoglobin ≤ 8 g%, Hämatokrit ≤ 25%, sowie Volumen der roten Blutzellen ist stark vergrößert auf Werte ≥ 110 fl. [siehe z.B. B.M. Babior und H.F. Bunn im Harrison's Principles of Internal Medicine (R.G. Petersdorf, R.F. Adams, E. Braunwald, K.J. Isselbacher, J.B. Martin, and J.D. Wilson, eds.) (McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), Seiten 1853-1860; G.R. Lee, und H.J. Gardner, im Textbook of Family Practice, 3rd Ed. (R.E. Rakel, ed.) (W.B. Saunders & Co., Philadelphia, 1984), Seiten 1082- 1091.]
Verschiedene Labortests haben ergeben, daß sich ungewöhnliche Resultate bei Patienten mit Cobalaminmangel und Folatmangel ergeben. Diese Tests beinhalten Messungen der roten Blutzellen Folate [Hoffbrand, A.V., et al., J. Clin. Path. 19:17 (1966)], weitergehende Auswertungen wurden jedoch nicht vorgenommen. Es ist seit mehr als zwanzig Jahren bekannt, daß Methylmalonsäure in größeren Mengen im Urin der meisten an Cobalaminmangel leidenden Patienten mit ausgeschieden wird und daß diese Anomalie offensichtlich nur bei wenigen Patienten mit Folatmangel vorkommt. Da davon ausgegangen und auch gelehrt wurde, daß Cobalaminmangel erwartet und auch akkurat diagnostiziert werden kann, basierend auf dem Vorhandensein und dem Ausmaß einer Anämie, dem Vorhandensein und Ausmaß einer Makrozytosis sowie dem Vorhandensein und Ausmaß eines niedrigen Cobalamingehalts im Serum, wurde die Methylmalonsäure nur selten gemessen, wenn bei Patienten ein Cobalaminmangel erwartet wurde. In einem führenden medizinischen Buch sowie einem führenden hämatologischen Buch wurde in der Tat gelehrt, daß ein Test des Methylmalonats im Urin nur selten nötig ist. [W.S. Beck, in Hematology, 3rd Ed. (W.J. Williams, E. Beutler, A.J. Erslev, and M.A. Lichtman, eds.) (McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), Seiten 893-900.] Dagegen wurde kürzlich in einem Artikel eines Journals für die Messung der Methylmalonsäure im Urin eingetreten [Norman, E.J., O.J. Martelo, and M.D. Denton, Blood 59(6):1128-1131 (1982). Die Analyse der Daten in diesem Papier zeigen auf, daß 26 von 27 Cobalaminmangel-Patienten anämisch sind, daß 23 von 27 Patienten ein erhöhtes MCV haben und daß 12 von 12 Patienten, deren Serum-Cobalamin mit dem erweiterten Standard-Serum-Cobalamin-Test gemessen wurde, Werte unter 100 pg/ml aufwiesen. Auf der Basis diagnostischer Standardmethoden folgt, daß all diese Patienten unter Cobalaminmangel leiden, und daß zusätzliche Untersuchungen normalerweise als unnötig angesehen werden.
Untersuchungen von Cobalamin und Folat im Serum oder Plasma sind die am meisten verbreiteten und empfohlenen Tests für die Diagnose und Unterscheidung von Cobalamin- und Folatmangel. Während der normale Cobalamingehalt im Serum zwischen 200-900 pg/ml liegt, geben einige führende Autoren an, daß ein Cobalaminmangel nur dann vorliegt, wenn die Werte unter 100 pg/ml liegen [siehe z.B. - Babior, supra; Lee & Gardner, supra; Beck, im Textbook of Medicine, supra; und Beck, in Hematology, supra].
1978 wurde entdeckt, daß Cobalanin-Analogien im menschlichen Plasma vorhanden sind und daß ihr Vorhandensein Cobalaminmangel verdecken könnte, denn die mit radioaktiven Isotopen verdünnten Proben für Serum- Cobalamin, die damals zur Anwendung kamen, waren nicht speziell für echtes Cobalamin geschaffen. Dieses Problem konnte dadurch gelöst werden, daß ein reiner oder gereinigter Eigenfaktor als Bindungsprotein in der radioisotopisch verdünnten Probe für Cobalamin benutzt wurde. Diese Änderung hat 1978 alle Tests ersetzt, die ein nichtspezifisches Cobalamin-Bindeprotein benutzten. Siehe z.B. U.S. Patent 4, 188, 189 (Allen), U.S. Patent 4,351,822 (Allen), U.S. Patent 4,451,571 (Allen), sowie J.F. Kolhouse, H. Kondo, N.C. Allen, E. Podell, sowie R.H. Allen, N. Eng. J. Med. 299:785-792 (1978). Diese verbesserten Tests für Serum-Cobalamin werden mittlerweile in tausenden von Laboratorien weltweit benutzt und ergeben niedrige Werte für alle bzw. fast alle Patienten mit Cobalaminmangel.
Die verbesserten Tests wurden heftig kritisiert, weil sie manchmal niedrige Werte bei Patienten aufzeigen, die keinerlei Cobalaminmangel aufweisen. Aus diesem Grund lehrten die Fachleute auf diesem Gebiet daß ein Cobalaminmangel nur in Erwägüng gezogen werden und Serum-Cobalamin-Einheiten verabreicht werden sollten, bei Patienten, die hämatologische oder neurologische Anomalien aufweisen, die, wie oben beschrieben, typisch sind für Cobalaminmangel.
Schilling und seine Mitarbeiter, Fachleute auf dem Gebiet des Cobalaminmangels und der Labordiagnosis, äußern sich wie folgt:
Wir stellen fest, daß die 'verbesserten' Vitamin B&sub1;&sub2; Testsätze eine gesteigerte Zahl von klinisch nicht erklärbar niedrigen Resultaten für Serum B&sub1;&sub2; ergeben.
Aus ökonomischen und wissenschaftlichen Gründen scheint es sinnvoll, Serum Vitamin B&sub1;&sub2; nur bei den Patienten zu messen, die hämatologische oder neurologische Befunde aufweisen, die eine akzeptable Wahrscheinlichkeit für einen Vitamin- B&sub1;&sub2; Mangel bieten. Die Messung von Serum B&sub1;&sub2; in Form eines Rastertests bei der anämischen oder geriatrischen Bevölkerung resultiert in einer hohen Zahl von niedrigen Werten, die nicht mit den klinischen Krankheiten in Beziehung gebracht werden können.
R.F. Schilling, V.F. Fairbanks, R. Miller, K. Schmitt, sowie M.J. Smith, Clin. Chem. 29(3):582-583 (1983). Daraus folgt, daß die zur Zeit verfügbaren und weitgehend benutzten Cobalamin-Tests häufig niedrige Cobalamingehalte bei Patienten aufweisen, die nicht wirklich an Cobalaminmangel leiden. Solche Befunde sind für die Ärzte verwirrend bzw. irreführend und führen zu unnötigen und kostenspieligen weiteren Untersuchungen.
Daher wird auf diesem Wissensgebiet im allgemeinen gelehrt, daß das klinische Spektrum des Cobalaminmangels relativ schmal und wohl definiert ist und daß die Möglichkeit eines Cobalaminmangels nur in den Fällen in Erwägung gezogen werden sollte, in denen übereinstimmende hämatologische und neurologische Symptome vorliegen, d.h. für gewöhnlich solche Patienten, die eine ziemlich heftige Anämie gepaart mit einer ziemlich heftigen Makrozytosis aufweisen und Patienten mit einem peripheren Nervenleiden und/oder einer Ataxie. Routineuntersuchungen der gesamten Bevölkerung oder auch nur der unter akzeptabler Anämie oder akzeptabler Makrozytosis oder anderen neuropsychiatrischen Anomalien leidenden Bevölkerung würde zu einer hohen Zahl von falschen positiven Ergebnissen führen.
Es wurde nun festgestellt, daß das klinische Spektrum des Cobalaminmangels sehr viel breiter ist, als vormals angenommen, und daß viele unter Cobalaminmangel leidende Patienten nicht oder nur schwach anämisch sind, daß in vielen Fällen ihre roten Blutzellen nicht oder nur schwach makrozytotisch sind, und daß in vielen Fällen die verschiedensten neurologischen Anomalien, die nichts mit einem periphären Nervenleiden oder einer Ataxie zu tun haben, vorhanden sind, sowie daß in vielen Fällen der Serum-Cobalamingehalt nur leicht erniedrigt ist und somit normal erscheint, selbst bei der Anwendung der oben beschriebenen fortentwickelten Tests auf der Basis gereinigter Eigenfaktoren. Daraus folgt, daß ein neues Testverfahren für den Nachweis eines Cobalaminmangels, besser noch ein Verfahren mit der Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen Cobalaminmangel und Folatmangel, nötig ist.
Es wurde nun festgestellt, daß ein erhöhter Wert von Gesamthomocystein im Gewebe warmblütiger Tiere gleichzeitig mit einem Cobalaminmangeln und einem Folatmangel korelliert; ein Tier mit einem erhöhten Wert von Gesamthomocystein kann entweder eine oder beide Mangelerscheinungen aufweisen, der Test bietet jedoch keine Möglichkeit zur Unterscheidung.
Bei Untersuchungen des Sulfhydrylaminosäuren-Stoffwechsels zeigte sich, daß normales menschliches Serum kleine Einheiten von Homocystein-Cystein-Dimer und proteingebundene Homocysteine enthält. Homocystein wurde im normalen Serum nicht festgestellt, ist jedoch in kleinen Einheiten im Serum von Patienten vorhanden, die unter einer renalen Insuffiziens leiden.
Es ist bekannt, daß Mengen an Homocystein im Serum und im Urin von Kindern vorhanden sind, die einen vererbten Defekt bei der Cystationinsynthase aufweisen, bei dem Homocystein und Serin nicht in Cystathionin umgewandelt werden kann. Bei diesen Patienten sind zudem erhöhte Mengen von Methionin im Serum vorhanden [siehe z.B. Sh.H. Mudd und H.L. Levy, in The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th Ed. (J.B. Stanbury, J.B. Wyngaarden, D.S. Fredrickson, J.L. Goldstein, sowie M.S. Brown, eds.) (McGraw-Hill Book Co., New York, 1983) Seiten 522-559]. Große Mengen an Homocystein sind auch im Serum und Urin von einigen Kindern vorhanden, die vererbte Defekte bei der Methioninsynthease aufweisen, zum Beispiel mit Sicherheit solche Kinder, die Homocystein und N&sup5;-Methyltetrahydrofolat nicht in Methionin und Tetrahydrofolat umwandeln können. Diese Patienten weisen niedrige Mengen von Methionin in ihrem Blut auf. Bei diesen Patienten sind die vererbten Defekte zurückzuführen auf 1) 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktasemangel (Unfähigkeit N&sup5;-Methyltetrahydrofolat, eines der Substrate für die Methioninsynthease, zu synthetisieren); 2) Unfähigkeit Methyl-Cobalamin zu synthetisieren, das ein notwendiger Kofaktor für die Methioninsynthease ist; und 3) Defekte in der Methioninsynthease selbst [siehe z.B. S.H. Mudd in Heritable Disorders of Amino Acid Metabolism: Patterns of Clinical Expression an Genetic Variation, (W.L. Nyhan, ed.) (John Wiley & Sons, New York 1974), Seiten 429-452]. Andererseits wurde Homocystein vormals nicht im Urin oder Serum von anderen Kindern entdeckt, die einen vererbten Defekt in der Methioninsynthease aufweisen, aufgrund eines vererbten Defekts in der Fähigkeit des Körpers Cobalamin zu den Zellen zu transportieren (z.B. Transcobalamin II Mangel) oder wegen eines vererbten Defekts im interzellularen Transport von Cobalamin bei dem Cobalamin in Lysosom- Körperchen eingeschlossen wird. Große Mengen von Homocystein oder Homocystin wurden im Urin oder Serum von einigen Kindern gefunden, die einen lebensbedrohlichen Mangel an Cobalamin aufwiesen [siehe z.B. R.T. Shipman, R.R.W. Townley, sowie D.M. Danks, Lancet 1(2):693-694 (1969); J. Frader, B. Reibman and D. Turkewitz, N. Eng. J. Med. 299:1319 (1978); S.H. Mudd, in Heritable Disorders, supra; S.H. Mudd, in Metabolic Basis, supra; J.G. Hollowell, Jr., W.K. Hall, M.E. Coryell, J. McPhearson, Jr., D.A. Hahn, Lacet Dec. 27, 1969, Seite 1428; Higgenbottom, M.C., L. Sweetman, und W.L. Nyhan, N. Eng. J. Med. 299(7):317-323 (1978); J.R. Davis, J. Goldenring, sowie B.H. Lubin, Am. J. Dis. Child. 135:566(1981); Hoey, H., J.C. Linnell, V.G. Oberholzer, sowie B.M. Laurance, J. Royal Soc. Med. 75:656 (1982)]. Bei anderen Kindern mit lebensbedrohlichem Cobalaminmangel wurden Aminosäuren im Urin und/oder Serum in normaler Größenordnung gefunden, Homocystein wurde nicht gefunden [siehe z.B. R. Graesbeck, R. Bordin, I. Kantero sowie B. Kuhlbaeck, Acta Medica Scandinavica 167(4):289 (1960); B.C. Lampkin, sowie A.M. Mauer, Blood 30(4):495 (1967); H.P. Lambert, T.A.J. Prankerd, sowie J.M. Smellie, Q.J. Med. 30(117):71 (1961); C.J. Sievens., Ugesk. laeger 125:1744 (1963)], auch im Urin von Kindern mit lebensbedrohlichem Folatmangel wurde es nicht gefunden [L. Corbeel, G. Van den Berghe, J. Jaeken, J. van Tornout, N.R. Eeckles, Eur. J. Ped. 143:284-290 (1985)]. Homocystein wurde bis dato weder im Serum oder Urin von Kindern mit akzeptablem oder leichtem Cobalaminmangel noch im Serum oder Urin von Erwachsenen mit lebensbedrohlichem, akzeptablem oder leichtem Cobalamin- oder Folatmangel nachgewiesen.
Zudem wurde festgestellt, daß der Serum-Folatgehalt bei vielen unter Alkoholismus leidenden Patienten mit Folatmangel nicht reduziert ist und daß die Messung des Gesamthomocysteins eine zusätzliche und genauere Indikation eines Folatmangels bei diesen Patienten ermöglicht. Es ist bekannt, daß das Homocystein im Urin und/oder Serum einiger Kinder mit vererbtem Mangel an Folat im Stoffwechsel erhöht ist [siehe z.B. S.H. Mudd, in Heritable Disorders, supra; S.H. Mudd in Metabolic Basis, supra], aber es war nicht bekannt, daß das Homocystein im Urin oder Serum von Kindern oder Erwachsenen mit einem Folatmangel erhöht war.
Außerdem wurde entdeckt, daß es möglich ist, zu bestimmen, ob ein Tier einen Cobalaminmangel, einen Folatmangel, beides oder keines von beidem aufweist, basierend auf einem Kombinationstest, bei dem das Gesamt-Gewebe-Homocystein und der Methylmalonsäurewert mit den normalen Werten verglichen wird. Während sowohl Folsäuremangel als auch Cobalaminmangel in einem erhöhten Wert des Gesamthomocysteins resultieren, steigert ein Cobalaminmangel zusätzlich den Methylmalonsäurewert, wogegen ein Folsäuremangel diesen Wert nicht erhöht. Es ist bekannt, daß die Methylmalonsäure im Serum und/oder Urin von Kindern mit vererbten Defekten im Cobalaminstoffwechsel oder Cobalamintransport und im Urin von Kindern und Erwachsenen mit unterschiedlichen Ausprägungen eines Cobalaminmangels erhöht ist [siehe z.B. W.S. Beck in Hematology, supra]. Wie auch immer, es war nicht bekannt oder wurde vorgeschlagen, einen Test für Methylmalonsäure in Kombination mit einem Test für Homocystein zur Diagnose und/oder Unterscheidung von Cobalamin- und Folatmangel zu benutzen. Wir haben nun entdeckt, daß dieser kombinierte Test tatsächlich sehr nützlich ist bei der Diagnose eines Cobalaminmangels bei Patienten mit verschieden starker Ausprägung einer Anämie, Makrozytosis, vermindertem Serum-Cobalaminwert und verschiedenen Arten von neuropsychiatrischen Anomalien.
Es wurde entdeckt, daß erhöhte Werte von Homocystein im Körpergewebe mit den erniedrigten Werten von Cobalamin und/oder Folsäure im Körpergeweben korrelieren. Entsprechend können Tests für Homocysteinwerte im Körpergewebe, vorzugsweise in Körperflüssigkeiten wie Urin oder Blut im Speziellen Serum oder Plasma, benutzt werden, um das Vorhandensein oder die Nichtexistenz eines Cobalamin- oder Folsäuremangels bei warmblütigen Tieren festzustellen.
Es sind verschiedene unterschiedliche Tests bekannt, die benutzt werden können, um den Homocysteinwert im Blut oder Urin festzustellen, keiner wurde jedoch bis dato benutzt, um einen Cobalamin- oder Folsäuremangel festzustellen. Siehe z.B. R. Saetre sowie D.L. Rabenstein, Anal. Biochem. 90:684-692(1978), die eine Methode zum Messen des reduzierten und gesamten Cysteins im Urin und des gesamten Cysteins und Homocysteins im nichtprotein-Teil des Plasmas beschreiben, um nach mit Sicherheit angeborenen Störungen des Schwefelstoffwechsels wie zum Beispiel Cystinurie, Cystinose und Homocystinurie zu suchen sowie die Behandlung zu beobachten. Bei dieser Methode wird eine Probe der Körperflüssigkeit in einem Hochenergie-Flüssigkeitschromatographen mit einem elektrochemischen Detektor, der auf Thiolgruppen reagiert, untersucht. Die Ergebnisse werden mit einer Standardkurve verglichen, um die Anzahl der Zielsubstanzen in der Originalprobe zu bestimmen. Bei dieser Methode werden die Stapdards separat gemessen, statt sie mit den Zielsubstanzen zu mischen; es ist daher nicht möglich, sicherzustellen, daß die Erholung von Standard und Zielsubstanz äquivalent sind. Eine andere geeignete Methode, beschrieben durch H. Refsum, S. Helland, sowie P.M. Ueland, Clin. Chem 31(4):624-628 (1985) umfaßt die Konvertierung aller in der Probe vorhandener Homocysteine in gekennzeichnete S-Adenosylhomocysteine, indem sie radioaktiv gekennzeichneten S-Adenosinen und S-Adenosylhomocysteinhydrolase ausgesetzt werden und einer Auszählung der gekennzeichneten S-Adenosylhomocysteine durch entsprechend geeignete Detektoren. Vorgeschlagene Anwendungen beinhalten die Beobachtung des Homocysteinstoffwechsels während der Behandlung bösartiger Erkrankungen und während der Behandlung mit dem Antifolat-Arzneimittel Methotrexat, Beobachtung der vererbten Mangelerscheinung Homocystinurie und Beobachtung des Serum-Homocysteins im Plasma von post-menopausalen Frauen. Diese Meßmethode wurde niemals zur Beobachtung des Homocysteins benutzt um einen Cobalamin- oder Folsäuremangel festzustellen oder zu messen. Um es noch einmal zu wiederholen, das Verfahren verwendet keine internen Standards, und es ist somit nicht möglich, sicherzustellen, daß die Erholung von Standard und Zielsubstanz äquivalent sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir ein sehr viel empfindlicheres und genaueres Verfahren für die Überprüfung auf das Vorhandensein einer oder mehrerer unterschiedlicher Sulfhydrylamino-Arten in einer Probe entwickelt, das zum Beispiel angewendet werden kann, um akkurat den Homocysteinwert im Blut oder Serum zu bestimmen. Sulfhydrylaminosäuren weisen sich dadurch aus, daß sie eine -SH Hälfte aufweisen, d.h. Homocystein (Hcys) in der Formel:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-CH&sub2;-SH
und Cystein (Cys) in der Formel:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-SH
Sulfhydryl-Komponenten zeichnen sich durch die natürliche Tendenz aus, Dimer zu bilden, indem sie sich durch Bildung von Disulfidbrücken binden, d.h. Cystin in der Formel:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-S-S-H&sub2;C-(H&sub2;N)HC-COOH
Homocystein in der Formel:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-H&sub2;C-H&sub2;C-(H&sub2;N)HC-COOH
und Homocystein-Cystein in der Formel:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-H&sub2;C-(H&sub2;N)HC-COOH
In der Gegenwart von Proteinen formen sowohl Homocystein als auch Cystein Komplexe mit freien Sulfhydrylgruppen auf den Proteinmolekülen; bei entnommenen Gewebeproben haben solche Proteinkomplexe den Großteil des vorhandenen Cysteins und Homocysteins gebunden. Tests auf den Anteil der Sulfhydrylaminosäuren werden durch die Leichtigkeit, mit der diese Aminosäuren derartige Komplexe bilden, erschwert. Eine Reduktion ist für die Trennung notwendig sowie darauf folgende Tests auf proteingebundene Sulfhydrylkomponenten. Aber es ist offensichtlich, daß beide Aminosäuren mit großer Kraft neue Disulfide für die Brückenbildung nach ihrer ursprünglichen Reduktion bilden werden. Die Umbildung der Disulfidbänder könnte sehr variabel sein und kann weder abgeschätzt noch kompensiert werden, durch die Anwendung eines Nicht-Sulfhydryls, daß Aminosäure als internen Standard enthält. Jeder Test auf Gesamt- Sulfhydrylaminosäuren in einer Probe muß diesen Dimern und Komplexen Rechnung tragen.
Das Testverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird in Anspruch 1 definiert. In einer bestimmten Ausführungsform sorgt die vorliegende Erfindung für eine Methode zum Testen des Gesamtcysteins und/oder Gesamthomocysteins in einer gegebenen Probe unter Benutzung der Massenspektroskopie. Die Bezeichnung "Gesamtcystein" oder "Gesamthomocystein" bedeutet die gesamte Menge des Cysteins bzw. Homocysteins die in beiderlei Formen, d.h. frei und komplex vorhanden sind. Zur Vereinfachung wird in der folgenden Beschreibung Homocystein als Beispiel angeführt, die gleiche Vorgehensweise funktioniert jedoch auch mit Cystein. Die gegebene Probe, die endogene Homocysteine enthält, wird zuerst mit einem internen Referenzstandard kombiniert, der eine bekannte Menge einer Verbindung enthält, die sich analog zum Homocystein verhält, jedoch mit einer stabilen Isotopenmarkierung gekennzeichnet ist. Eine hinreichend große Menge eines reduzierenden Agens wird zugegeben, um eine absolute Zufallsverteilung des endogenen Homocysteins und des gekennzeichneten Referenzstandards zu erreichen, und die vorhandene Menge des Homocysteins und des gekennzeichneten Referenzstandards wird mit einem Massenspektrometer gemessen. Wenn davon ausgegangen wird, daß das endogene Homocystein und der Referenzstandard während des gesamten Vorganges im gleichen relativen Verhältnis vorhanden sind, kann dieses Verhältnis aus den Massenspektrometer-Ablesungen errechnet werden, indem die Menge des Standards in der Originalprobe zur Berechnung des anfangs vorhandenen endogenen Homocysteins benutzt wird. Wie oben bereits beschrieben, funktioniert diese Methode auch mit Cystein; es ist auch möglich, gleichzeitig Tests für Homocystein und Cystein (oder jede andere Aminosäure) durchzuführen, sofern für jede ein eigener interner Standard benutzt wird.
Beim internen Referenzstandard kann es sich um jede geeignete Verbindung handeln, die sich identisch wie die zu untersuchende endogene Komponente durch die gesamte Prozedur bis zur Analyse im Massenspektrometer verhält, die jedoch bei der massenspektrometrischen Analyse unterscheidbar und separat meßbar ist. Beispiele für passende interne Referenzen sind deuterierte oder tritiummarkierte Analogien der zu untersuchenden Aminosäure oder deuterierte oder tritiummarkierte Verbindungen, die der zu untersuchenden Aminosäure hinreichend ähnlich genug für die Durchführung dieses Tests sind oder andere Analogien der zu untersuchenden Aminosäure, die eine hinreichend große Menge an C¹³ oder N¹&sup5; oder einer anderen stabilen Isotopenmarkierung enthalten. Die gekennzeichnete Referenz muß also ununterscheidbar von der nicht-gekennzeichneten Zielsubstanz der Untersuchung während der Verarbeitung sein, muß jedoch eindeutige Ionen für die Quantitätsbestimmung im Massenspektrometer liefern. Beispiele für besonders geeignete Verbindungen für Cystein und/oder Homocystein sind deuterierte Arten des Cysterins, d.h. D,L- [3,3,3',3'-²H&sub4;]Cystein und deuteriertes Homocystein, d.h. D,L-[3,3,3 ,3 ,4,4,4 ,4 -²H&sub8;]Homocystein. Brauchbare Verbindungen als interne Standards liefert z.B. Merck Sharp & Dohme.
Die Quantitätsbestimmung beruht auf der Annahme, daß das Verhältnis der gemessenen Zielsubstanz zum gemessenen internen Standard das gleiche ist, wie das Verhältnis der gesamten unbekannten Menge der Zielsubstanz in der Anfangsprobe zur gesamten Menge des anfänglich hinzugegebenen internen Standards. Es wird von der gleichen Erholungsrate bei der Zielsubstanz sowie beim internen Standard ausgegangen. Im Falle von Sulfhydrylverbindungen beruht die Erholung zum Teil auf den verschiedenen möglichen Formen, frei und komplex, die die Sulfhydrylaminosäuren annehmen können. Dementsprechend ist es für jeden Test von entscheidender Wichtigkeit, daß das relative Verhältnis von Zielsubstanz und internem Standard in jedem freien und jedem möglichen komplexen Zustand dasselbe ist; dadurch wird sichergestellt, daß der gleiche relative prozentuale Anteil von Zielsubstanz und internem Standard verloren geht (bzw. erzeugt wird). Dafür wird ein Reduktionsmittel zur ursprünglichen Probe addiert, die gleichermaßen die Zielsubstanz als auch den internen Standard enthält. Es muß genügend von der Reduktionsverbindung hinzugefügt werden, um alle vorhandenen Disulfidbrücken aufzubrechen, so daß alle Sulfhydrylaminosäuren in freie Säuren umgewandelt werden. Eine Verbindung, die die Neubildung der Disulfidbrücken verhindert, kann ebenfalls hinzugegeben werden. z.B. Jodacetat, Jodacetamid oder Jodpropan, um sicherzustellen, daß alle Sulfhydrylaminosäuren in ihrer freien Form verbleiben. Alternativ dazu dürfen die Komponenten durchaus neue Disulfidbrücken bilden, ausgehend von der Annahme, daß die Zielsubstanz und die Standard-(markierte) Sulfhydrylaminosäure identische Arten und Anzahl solcher Komplexe bilden, so daß das Verhältnis für die Menge der Zielsubstanz zur Menge der internen Standard- Sulfhydrylaminosäure im freien Zustand, in jedem möglichen komplexen Zustand, sowie während der Auswertung im Massenspektrometer das gleiche wie bei der ursprünglichen Probe ist. Brauchbare Reduktionsmittel sind dergestalt, daß sie in der Lage sind, die Disulfidbänder aufzubrechen ohne den Rest des Moleküls zu zerstören. Beispiele dafür sind 2-Mercaptoäthanol, Dithiothreitol und Sodiumborohydride.
Möglicherweise ist es notwendig oder wünschenswert die Zielaminosäure und den internen Standard vor oder nach der Zuführung des Reduktionsagens teilweise zu reinigen. Alle bekannten Mittel, die für die Reinigung und Separation von Aminosäuren bekannt sind, z.B. Filtrierung, Spaltenchromatographie, Anionen- und/oder Kationenaustauschchromatographie, Gas-Chromatographie, Flüssigchromatographie, Hochdruckflüssigchromatographie, Molekularsiebung usw. können angewendet werden. Methoden für die Auswahl geeigneter Separations- und Reinigungstechniken und Wege zu deren Ausführung sind im Fachbereich hinreichend bekannt. Siehe z.B. D. Labadarios, I.M. Moodie, sowie G.S. Shephard, J. Chrom. 310:233-231 (1984) und darin angeführte Referenzen; F. Shahrokhi, sowie C.W. Gehrke, J. Chrom. 36:31-41(1986).
Möglicherweise ist es ebenfalls notwendig oder wünschenswert, die Zielsubstanz und den internen Standard zu modifizieren, um einige Charakteristika zu ändern oder zu vergrößern, um die Reinigung und/oder Separation zu erleichtern. Diese Praxis ist wohlbekannt im Fachbereich als Derivatisation. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, die Zielsubstanz und die Referenzverbindung in analoge Verbindungen umzuwandeln, die eine größere Löslichkeit, eine andere Ladung, eine erhöhte Verdampfbarkeit usw. haben, um die Reinigung und/oder Separation vor der Analyse im Massenspektrometer zu erleichtern. Siehe z.B. D.R. Knapp Handbook of Analytical Derivatization Reactions (John Wiley & Sons, New York, 1979). Bei einer bevorzugten Methode wird der komplizierte Weg beschritten, die Zielsubstanz und die Referenzverbindungen in ihre Sylilderivate zu überführen, um die Separation und Identifikation auf einem kombinierten Gas-Chromatographen/Massenspektrometer zu ermöglichen. Wege und Methoden für die Silierung von Verbindungen für diesen Zweck sind im Fachbereich hinreichend bekannt. Siehe z.B. Knapp, supra; C.J. Bierman, C.M. Kinoshita, J.A. Marlett, sowie R.D. Steele, J. Chrom. 357:330-334 (1986). Bei einer bevorzugten Methode werden Zielsubstanz und interne Referenz verbunden, ein Reduktionsmittel wird für die zufällige Verteilung hinzugegeben, die resultierende Mixtur wird teilweise von freien und komplexen Sulfhydrylaminosäuren gereinigt, das Produkt wird in Actetonitril gelöst und N-Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)-trifluoracetamid wird zugegeben, um die Silierung zu erhalten. Das resultierende silierte Sulfhydril-Ziel und die Referenzverbindung werden hiernach konzentriert um eine Probe für den Gas-Chromatographen/Massenspektrometer zu erhalten.
Wenn man dieses Verfahren auf ein Serum anwendet, ist es möglich, eine Sensitivität von bis zu einem nmol/L für den Gesamtgehalt an Homocystein zu erreichen, und der Test verläuft linear innerhalb des Bereiches 1- 1000 umol/L; im menschlichen Urin von 1 bis 20 umol/L. Homocysteinwerte oberhalb dieses Bereiches sind ein Indiz für einen Cobalamin- und/oder Folatmangel; je höher der Wert ist, desto größer ist die Indikation.
Es wurde auch entdeckt, daß es möglich ist, durch Durchführung eines zweiten Tests auf Methylmalonsäurewerte (MMA), entweder gleichzeitig zu einem Homocysteintest oder darauf folgend, zwischen Cobalamin- und Folsäuremangel zu unterscheiden. Während Cobalamin- als auch Kolsäuremangel den Homocysteinwert erhöhen, ist der Methylmalonsäurewert bei einem Cobalaminmangel für gewöhnlich ebenfalls erhöht, bei einem Folatmangel für gewöhnlich jedoch nicht. Wenn die Homocysteinwerte bei Individuen ohne angeborene Defekte erhöht sind, liegen Mangelerscheinungen an Folat oder Cobalamin vor. Wenn die MMA ebenfalls erhöht ist, liegt für gewöhnlich ein Cobalaminmangel vor. Demgemäß, wenn gleichzeitig die Homocystein- und MMA-Werte erhöht sind, dann ist es sehr wahrscheinlich, daß ein Cobalaminmangel vorliegt (sonst wäre die MMA normal), aber es ist nicht sicher, ob ein Folatmangel vorliegt oder nicht (denn jeder Einfluß durch einen Folatmangel auf eine Homocysteinwerterhöhung kann durch die Wirkung des Cobalaminmangels verdeckt werden). Umgekehrt, wenn Homocystein erhöht, MMA jedoch normal ist, dann ist der erhöhte Homocysteinwert wahrscheinlich auf einen Folatmangel zurückzuführen, denn wenn es sich um einen Cobalaminmangel handeln würde, müßte der MMA-Wert ebenfalls erhöht sein. Es ist in seltenen Fällen möglich, daß die MMA-Werte bei einem Cobalaminmangel erhöht sind, bevor die Homocysteinwerte steigen oder daß die Homocysteinwerte bei einem Cobalaminmangel erhöht sind, bevor die MMA-Werte angefangen haben zu steigen. Die Informationen, die durch dieses Schriftstück zur Verfügung gestellt werden, sind daher eine wertvolle Hilfe, für eine frühe, genaue Diagnose dieser Mangelerscheinungen.
Bei diesem kombinierten Homocystein/MMA-Test werden die Homocysteinwerte durch die Methode der vorliegenden Erfindung getestet. Ein geeigneter MMA-Test kann mit den Methoden von z.B. E.J. Norman, O.J. Mertelo, sowie M.D. Denton, Blood 59(6):1128 (1982) oder P.D. Marcell, S.P. Stabler, E.R. Podell, sowie R.H. Allen, Anal. Biochem. 150:58-66 (1985) durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Probe mit einem internen Referenzstandard, der eine bekannte Menge von mit einem stabilen Isotop gekennzeichneter Methylmalonsäure enthält, vorzugsweise ein deuteriertes Ahalogon des MMA, kombiniert. Das vorhandene Gemisch der gekennzeichneten und nichtgekennzeichneten MMA wird dann in einem Massenspektrometer gemessen, und die Menge des MMA, die in der ursprünglichen Probe vorhanden war, wird aus der bekannten Menge der ursprünglich hinzugefügten gekennzeichneten MMA berechnet. Wie beim Homocystein kann an der gekennzeichneten und nicht-gekennzeichneten MMA eine partielle Reinigung und/oder Derivatisierung vorgenommen werden, bevor die Analyse im Massenspektrometer durchgeführt wird. Die vorzuziehenden Derivate sind Sinylanalogien; Analogien des N-Methyl-N(t-butyldimethylsilyl)trifluoroacetamid werden besonders bevorzugt.
Es ist auch möglich, eine oder mehrere nicht- Sulfhydrylaminosäuren, z.B. Methionin, gleichzeitig mit der Sulfhydrylaminosäure zu messen, vorausgesetzt die entsprechenden internen Standards werden hinzugefügt. Ein brauchbarer interner Standard für nicht-Sulfhydrylaminosäuren ist Norleucin oder ein entsprechend gekennzeichnetes Analogon der nicht-Sulfhydrylaminosäure.
Nachdem der Folat- und/oder Cobalaminmangel einmal festgestellt wurde, kann der Fortschritt der Behandlung durch einen periodischen Test während und nach der Behandlung beobachtet werden. Ein Rückgang der Homocysteinwerte im Serum und/oder Urin nach der oralen oder parenteralen Verabreichung von Cobalamin und/oder Folat, wie gewünscht, bestätigt die Diagnose.
Ein tiefergehendes Verständnis dieser Erfindung kann durch die folgenden uneingeschränkten Beispiele erreicht werden. Wenn kein gesonderter Hinweis erfolgt, so sind alle hier gemachten Temperaturangaben und Temperaturbereiche im Grad-Celsius-System zu verstehen, und die Angaben Umgebungstemperatur und Raumtemperatur bedeuten einen Bereich von 20-25ºC. Die Bezeichnung Prozent oder % bezieht sich auf Gewichtsprozent und die Bezeichnung Mol bezieht sich auf Gramm-Mol.

Beispiel I

Korrellation zwischen verschiedenen klinischen Anzeichen und einem Cobalaminrnangel

Über einen Zeitraum von 24 Monaten (zwischen September 1983 und September 1985) haben wir den Serum- Cobalamingehalt bei 7747 Patienten, im Auftrag von zwei Medizinern an zwei New Yorker Krankenhäusern (Columbia- Presbyterian Medical Center und Harlem Hospital Center), gemessen. In dieser Gruppe hatten 301 Patienten Serumwerte unterhalb der 200 pg/ml Untergrenze, die vom Hersteller des "erweiterten" Radioprobenkits unter Benutzung eines gereinigten Eigenfaktors (BioRad Laboratories, Richmond, CA), angegeben wird. Um zu bestimmen, wie viele der Patienten mit niedrigen Serum- Cobalaminwerten wirklich unter diesem Vitaminmangel leiden, versuchten wir, die Patienten gründlich zu untersuchen. So oft wie möglich bestanden wir auf eine komplette klinische (inklusive neurologische) Untersuchung, Blut- und Knochenmarkabstriche, Schillingtests und Serumtests auf Antikörper des Eigenfaktors. Und dann beobachteten wir die Reaktion der Patienten während einer Behandlung mit Cyanocobalamin.
Bei 138 der 301 Patienten konnten wir zu der sicheren Schlußfolgerung kommen, ob ein Cobalaminmangel vorlag oder nicht. Bei 79 der 138 Patienten lag ein klinisches oder hämatologisches Syndrom oder beides vor, das eindeutig auf die Verabreichung von Cyanocobalamin ansprach. Diesen Patienten konnte eine Mangelerscheinung zugeordnet werden. Eine Analyse der klinischen Befunde dieser Patienten mit Mangelerscheinungen zeigte eine Anzahl von überraschenden Ergebnissen. Viele Patienten hatten nicht die klassischen Anzeichen einer makroplastischen Anämie, die bei einem Cobalaminmangel zu erwarten wären. Das Hämatokrit war normal (d.h. es war keine Anämie vorhanden) bei 34 (43%), d.h. nahezu der Hälfte der Patienten. Eine mäßig starke Anämie (HcT < 24% oder Hämoglobin < 8 g/dl) war bei nur 16 (oder ein fünftel) der 79 Patienten vorhanden. Bei 36 Patienten (45.6%) konnten keine Symptome gefunden werden, denen ein Cobalaminmangel zugeordnet werden könnte. Die weißen Blutkörperchen waren normal bei 85%, die Blutplättchenwerte waren normal bei 76%, das Serum-Bilirubin war normal bei 74% und die Serum-Lactatdehydrogenase (LDH) war normal bei 40%. Die der Lehrmeinung entsprechenden Laborwerte, die bei einer makroplastischen Anämie vorliegen müßten, entsprachen also für gewöhnlich nicht denen, die bei den Patienten gemessen wurden. Zudem war der Serum-Cobalaminwert bei 23 Mangelpatienten (bzw. 29%) > 100 pg/ml, was darauf hindeutet, daß der Grad der Erniedrigung des Serumcobalamingehalts nicht als eindeutiges Zeichen für einen Cobalaminmangel beim Patienten herangezogen werden kann. Selbst ein erhöhtes MCV, das als eindeutiges Zeichen für einen Cobalaminmangel gehalten wurde, war bei 15 (19%) der Patienten mit Mangelerscheinungen nicht festzustellen. Bei den Patienten mit einem erhöhten MCV war der Grad der Erhöhung des MCV nur klein: 28 (oder 35%) der 79 Patienten hatten MCV's im Bereich von 100-110 fl. Nur 36 Patienten (oder 46%) hatten ein deutlich erhöhtes MCV (> 110 fl).
Unter den 138 Patienten, bei denen wir eine sichere Aussage machen können, waren 59, bei denen sich eindeutig keinerlei Wirkung auf die Verabreichung von Cyanocobalamin zeigte. Bei diesen Patienten sollte in Erwägung gezogen werden, daß kein Cobalaminmangel vorliegt. Bei dieser nichtdefizienten Gruppe hatten 13 (oder 22%) von 59 ein erhöhtes MCV und 6 (oder 10%) hatten einen Serum-Cobalaminwert unter 100 pg/ml. Das kann als weiteres Zeichen dafür angesehen werden, daß das MCV oder der Grad der Erniedrigung des Serum- Cobalamins nicht als sichere Indikatoren für einen Cobalaminmangel beim Patienten gelten können.
Nachdem wir festgestellt hatten, daß eine erhebliche Anzahl der Patienten mit Mangelerscheinungen nur leicht erniedrigte Serum-Cobalaminwerte hatte (d.h. im Bereich zwischen 100-200 pg/ml), betrachteten wir erneut alle Patienten mit Serum-Cobalaminwerten im Bereich zwischen 200 und 300 pg/ml (niedriger Normalwert). Dabei stellten wir fest, daß einige Patienten, die eindeutig einen Cobalaminmangel aufwiesen, Serum-Cobalaminwerte > 200 pg/ml hatten.
Diese Ergebnisse ließen uns zu dem Schluß kommen, daß eine große Ahzahl von Patienten mit Cobalaminmangel die "typischen" klinischen und hämatologischen Befunde, die normalerweise bei einem Cobalaminmangel erwartet werden, nicht aufweisen und daß eindeutig neue Tests zur Feststellung eines Mangels benötigt werden.
Wir haben daraufhin die Serumwerte des Homocysteins und der Methylmalonsäure in den Proben der 79 Patienten mit Mangelerscheinungen und 59 Patienten ohne Mangelerscheinungen gemessen. Die Werte von Homocystein und Methylmalonsäure waren eindeutig erhöht bei 60 (76%) der 79 Patienten mit Mangelerscheinungen (Homocystein oberhalb von 30 uM und Methylmalonsäure oberhalb vom 150 ng/ml). Bei 10 (oder 13%) der 79 Patienten waren die Homocysteinwerte eindeutig erhöht (ohne eindeutige Erhöhung der Methylmalonsäurewerte), und die Methylmalonsäurewerte waren bei 4 (oder 5%) der Patienten eindeutig erhöht (ohne eindeutige Erhöhung der Homocysteinwerte). Bei den verbleibenden 5 der 79 Patienten (oder 6%) waren beide Werte nicht eindeutig erhöht.
Im Gegensatz dazu waren beide Werte bei den 59 nicht unter Mangelerscheinungen leidenden Patienten bei nur bei einem Patienten (2%) eindeutig erhöht; nur der Homocysteinwert war eindeutig bei 6 (10%) Patienten erhöht und nur der Methylmalonsäurewert war eindeutig bei 9 (15%) erhöht. Bei den verbleibenden 43 Patienten (73%) war keiner der Werte erhöht. Trotz der kleinen Zahl von Patienten ohne Mangelerscheinungen, bei denen beide Tests eindeutig erhöhte Werte lieferten, erscheint dieser Test diagnostisch sinnvoll. Bei 11 der 16 Patienten mit eindeutiger Erhöhung einer oder beider Werte ergaben Tests, daß Störungen in der Cobalaminabsorbtion vorliegen, wie zum Beispiel krankhafte Anämie, einige atropische Gastritisarten und ileale Krankheiten mit der Möglichkeit, einen Cobalaminmangel zu einem späteren Zeitpunkt hervorzurufen. Solche Patienten sollten eine prophylaktische Behandlung mit Cyanocobalamin erhalten. Bei 2 der 16 Patienten konnte ein zugrundeliegender Folsäuremangel den erhöhten Serum-Homocysteinwert erklären.
Diese Tests erweisen sich auch bei der Diagnose eines Folsäuremangels als nützlich. Bei 120 aufeinanderfolgend beobachteten Alkoholikern mit Anämie wurden Knochenmarksuntersuchungen vorgenommen. Bei 38 Patienten war der Knochenmarksabstrich makroblastisch. Nachdem ein Patient mit einem Cobalaminmangel von der Untersuchung ausgenommen wurde, konnte bei den verbleibenden 37 Patienten mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Folsäuremangel angenommen werden. Die Serum-Folatkonzentration (der am weitesten verbreitete diagnostische Test für einen Folatmangel) war nur bei 15 der 37 Patienten (41%) niedrig, wogegen das Serum-Homocystein eindeutig bei 27 (73%) der 37 Patienten erhöht war. Daraus folgt, daß die Serum-Homocysteinkonzentration einen sehr viel besseren Test zur Erkennung eines Folatmangels darstellt, als die Serum-Folatkonzentration. Bei 15 Patienten mit makroblastischem Knochenmark, bei denen die Folatkonzentration der roten Blutzellen (RCF) gemessen wurde, war die RCF bei 10 von 15 (67%) niedrig und der Serum-Honocysteinwert bei 13 (87%) eindeutig erhöht. Daraus folgt, daß der Serum-Homocystein-Test sehr viel sensitiver ist, als der rote-Blutzellen-Folattest.

Beispiel II

Repräsentative bevorzugte Methode zur Messung des Homocysteins im menschlichen Serum

Menschliches Blutserum wird mit einem passenden internen Referenzstandard kombiniert, d.h. mit D,L- [3,3,3',3',4,4,4',4'-²H&sub8;]Homocystein, welches von Merck Sharp and Dohme Isotopes (Montreal, Canada) fertig gemischt bezogen werden kann.
Ein stark reduzierendes Reagens (z.B. 2-Mercaptoäthanol, Ditiothreitol oder Sodiumbrohydrid) wird addiert, um sicherzustellen, daß das gesamte Homocystein in seine freie Form reduziert wird. Ein Chelatagens wie zum Beispiel EDTA oder EGTA kann bei Bedarf hinzugefügt werden um alle Metallionen zu entfernen, die sich sonst an die freien Sulfhydrylgruppen binden. Die Reaktionsmischung wird in einem Rührwerk vermengt und bei Bedarf auf 25 bis 150 ºC für einen Zeitraum von 1 Minute bis zu 60 Minuten erhitzt, um sicherzustellen, daß die gekennzeichneten und die nicht-gekennzeichneten Homocysteine zufällig verteilt sind.
Protein wird danach entzogen, z.B. durch Hitzedenaturierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrierung oder vorzugsweise durch Addition einer Komponente, die das Protein ausfällt, z.B. Sulfosalicylsäure, Picrinsäure, Ammoniumsulfat etc. Die resultierende Mischung wird gerührt und zentrifugiert, um den Proteinniederschlag zu entfernen. Wenn nicht bereits sauer, wird der Überstand angesäuert und einer Kationenaustauschsäule zugeführt, z.B. BioRad AG 50W-X8 (200-400 mesh) Wasserstoffbildner (BioRad Laboratories, Richmond, CA), um alle negativ geladenen Salze zu entfernen. Die Aminosäuren werden dann eluiert, auf einen Basis-pH-Wert abgeglichen und einer Anionenaustauschsäule zugeführt, z.B. Biorad AGI-X8 (100-200 mesh) Acetatbildner, um alle positiven Salze zu entfernen. Die Aminosäuren werden danach eluiert, getrocknet und dann in luftdicht versiegelbare Ampullen, vorzugsweise mit teflonbeschichteten Scheidewandkappen abgefüllt. N-Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid in Acetonitril wird danach addiert, die Ampullen werden versiegelt und über einen Zeitraum von 5 Minuten bis über Nacht einer Temperatur von 20 bis 150ºC ausgesetzt, um die Silierungsreaktion zu vollenden. Vorzugsweise werden die Ampullen über Nacht liegengelassen oder 1 Stunde lang auf eine Temperatur von 80ºC erhitzt. Überschüssiges derivatisierendes Agens kann durch die Zugabe von Wasser (das Wasser schließt das derivatisierende Agens auf) und jedem flüchtigen Lösungsmittel neutralisiert werden. Die Mischung wird danach zentrifugiert um die Emulsion und den nichtwasserlöslichen Teil zu trennen, der den größten Teil der derivatisierenden Komponente enthält, in eine neue Ampulle gegeben und getrocknet (z.B. unter Stickstoff), um das Volumen zu reduzieren.
Das resultierende Präparat wird dann in einen Gas- Chromatographen / Massenspektrometer injiziert, der eine Injektionsporttemperatur von Raumtemperatur bis 350ºC und einen Säulendruck von 5 psi (ca. 0,345 Bar) bis 45 psi (ca. 3,1 Bar) haben sollte. Die Kapillarsäule wird auf 20 bis 250ºC für 1 bis 20 Minuten gebracht. Die genaue Zeit und Temperatur, in der das Homocystein eluiert, wird durch einen ersten Test mit einer bekannten Menge an Homocystein bestimmt. Danach wird die Probe getestet und die Daten werden im Scanmodus oder vorzugsweise im Ionenselektionsmodus gesammelt.

Beispiel III

Repräsentatives spezielles Verfahren zur Messung von Homocystein im menschlichen Serum

L-Homocystein und L-Cystein wurden bei Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen, L-Methionin, andere Aminosäuren und N-Methyl-N-[t- butyldimethylsilyl]trifluor- acetamid wurden bei Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) bezogen, D,L-[3,3,3',3',- 4,4,4',4'-²H&sub8;]Homocystein (98,4%) wurde als eine spezielle Synthese von Merck, Sharp and Dome Isotopes (Montreal, Canada) bezogen, und D,L-[3,3,3',3'- ²H&sub4;]Cystein (98%) und L-[Methyl-²H&sub3;]methionin (98%) wurden von Cambridge Isotope Laboratories (Woburn, MA) bezogen. Blutproben wurden von normalen, gesunden Blutspendern von der Belle Bonfils Blood Bank, Denver, CO, zum Zeitpunkt der Blutspende bezogen. Es wurden fortlaufende Blutspenden ausgewählt, so daß Proben von fünf männlichen und fünf weiblichen Personen in den Altersgruppen 18-26, 27-35, 36-45, 46-55 und 56-65 (zusammengenommen 50 Proben) vorhanden waren. Die Proben wurden zwischen 9 und 13 Uhr entnommen. Vor der Zentrifugierung bei 4ºC durften die Proben bei Raumtemperatur für 0 bis 24 Stunden gerinnen, oder sie wurden zu Zeparin oder EDTA gegeben und bei Raumtemperatur für 0 bis 24 Stunden belassen, bevor das Plasma durch zentrifugieren bei 4ºC gesammelt wurde. Spraque-Dawley-Ratten mit 250-350 g wurden von SASCO Inc. (Omaha,NB) beschafft, und das Blut wurde unter einer Äthernarkose durch eine Herzpunktierung entnommen. Das Serum wurde wie bei den menschlichen Blutspendern beschrieben gesammelt und archiviert.
Eine Volumen von 50 ul H&sub2;O, die 5 nmol D,L- [3,3,4',4',4,4,4',4'-²H&sub8;]Homocystein, 25 nmol D,L- [3,3,3',3'-²H&sub4;]Cystein und 15 nmol L-[Methyl- ²H&sub3;]methionin enthält, wurde zu 100 ul des Serums hinzugegeben. Nach der Durchmischung wurden 2,5 ml H&sub2;O, die 158 ug Na&sub2;EDTA und 100 ul 2-Mercaptoäthanol enthielten, hinzugegeben, wiederum gemischt und bei 100ºC für 15 Minuten gekocht. Nach der Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 100 ul H&sub2;O, die 25 ug Sulfosalicylsäure enthielten, und 25 ul 6 N HCl hinzugegeben; darauf folgte ein Mischungsvorgang und eine Zentrifugierung bei 1000g für 15 Minuten. Der Überstand wurde danach in Einweggläser, die 200 ul des Kationenaustauschharzes AG 50W-X8 (200-400 mesh) sowie Wasserstoffbildner (BioRad Laboratories, Richmond, CA), der mit H&sub2;O vorabgeglichen wurde, enthalten, gegeben. Nach der Waschung mit 6 ml H&sub2;O wurden die Aminosäuren mit 2 ml 8M(8N) NH&sub4;OH eluiert. Die Eluate wurden direkt in Einweggläser, die 200 ul des Anionenaustauschharzes AG1-X8 (100-200 mesh) und Acetatbildner (BioRad Laboratories, Richmond, CA), die gewaschen und mit H&sub2;O abgeglichen wurden, enthalten, gegeben. Nach der Waschung mit 9 ml H&sub2;O wurden die Aminosäuren in 0,2 ml von 0,1 ml HCl eluiert und in einem Speed Vac Vakuumkonzentrator (Savant Instruments Inc., Hicksville, NY) getrocknet. Die getrockneten Proben wurden danach in 250 ul H&sub2;O aufgelöst, in 300 ul Reaktionsgläser (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) abgefüllt und im Vakuumkonzentrator getrocknet.
Die t-Butyldimethylsilylderivate der Aminosäuren wurden durch Addition von 10 ul Acetonitril und 10 ul N- Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)-trifluoracetamid zu jedem Reaktionsglas und Versiegeln der Gläser mit teflon-beschichteten Scheidewandkappen, mit darauf folgender Lagerung bei Raumtemperatur (22 ºC) über Nacht oder Erhitzen auf 80ºC für eine Stunde, präpariert. 100 ul Hexan wurde hinzugefügt und nach Verwirbelung für 10 Sekunden wurden 20 ul H&sub2;O hinzugefügt, um alle derivaten Agentien, die nicht reagiert haben, aufzuschließen. Nach einer Verwirbelung für weitere 10 Sekunden wurden die Proben für 5 Minuten bei 1000g zentrifugiert und die obere Hexanschicht dekantiert, in Mikrozentrifugenröhren abgefüllt und auf etwa 10 ul unter Benutzung eines Stickstoffstromes getrocknet. Es muß sorgfältig darauf geachtet werden, daß eine komplette Trocknung vermieden wird, da das zu einem Verlust eines Großteils der Derivate führt. Ungefähr 2 ul wurden in ein Kapillargefäß unter Benutzung eines Fallnadel-Injektors eingegeben.
Die Probenanalyse wurde auf einem Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) 5992B Gas-Chromatographen/Massenspektrometer durchgeführt, der mit einem 9825B Computer, einem 9876A Drucker und einem Molekularstrahlseparator ausgerüstet ist. Der Injektionsport wurde modifiziert, um einen Fallnadel-Injektor benutzen zu können. Eine zusätzliche verkleidete Gasträgerleitung wurde an den Strahlseparator angeschlossen. Die Testlösung wurde erzeugt in einer Durabond DB-1 Quarzglas Kapillarsäule (30 m * 0,25 mm i.D., 0,25um Filmdicke) von J & W Scientific Inc. (Rancho Cordova, CA).
Der Gas-Chromatograph/Massenspektrometer wurde mit automatischer Abstimmung betrieben, die Injektionsport- Temperatur betrug 250ºC und der Säulendruck 26 psi (1,79 Bar). Die Kapillarsäule wurde auf 180ºC abgeglichen und eine Minute nach der Probenzugabe mit 8ºC/Min auf 276ºC erhitzt. Die Daten wurden von 4,8 bis 9,6 Minuten unter Benutzung des Ionenauswahlmonitormodus gesammelt. Die folgenden [M-57]+ Ionen wurden mit einer jeweiligen Verweildauer von 50 msec beobachtet: Homocysteinmonomer, m/z 420.2; [3,3,4,4-²H&sub4;]Homocysteinmonomer, m/z 424,2; Cysteinmonomer, m/z 406,2; [3,3-²H&sub2;]Cysteinmonomer, m/z 408,2; Methionin, m/z 320,2; und [Methyl-²H&sub3;]methionin, m/z 323,2. Die gesamte Homocysteinmenge wurde bestimmt, indem der integrierte Bereich des m/z 420,2 Peaks, der bei ca. 8,9 Min eluierte (die exakten Zeiten werden täglich mit Standards bestimmt), durch den integrierten Bereich des m/z 424,2 Peaks, der zur gleichen Zeit eluierte, geteilt wurde und dann mit 100 umol/L, das die äquivalente Menge des [3,3,4, 4-²H&sub4;]Homocysteinmonomers, das zu jeder Probe addiert wird, multipliziert wurde. Die gesamte Cysteinmenge wurde in der gleichen Weise bestimmt, unter Benutzung der m/z 406,2 und m/z 408,2 Peaks, die ca. bei 7,7 Min eluierten, und Multiplikation des Verhältnisses mit 500 umol/L, was der äquivalenten Menge des zur Probe hinzugefügten [3,3- ²H&sub2;]Cysteinmonomers entspricht. Die gesamte Methioninmenge wurde in der gleichen Weise bestimmt, unter Benutzung der m/z 320,2 und m/z 323,2 Peaks die bei ca. 5,4 Min eluierten, und Multiplikation des Verhältnisses mit 150 umol/L, was der äquivalenten Menge des zur Probe hinzugefügten [Methyl-²H&sub3;]methionins entspricht. Die integrierten Bereiche der drei internen Standardpeaks, d.h. die m/z 424,2, m/z 408,2 und m/z 323,2 Peaks die bei ca. 8,9, 7,7 und 5,4 Min eluierten, wurden korrigiert gemäß der Menge, die sie zum gesamten Homocystein, zum gesamten Cystein und zum gesamten Methionin gemäß des natürlich vorkommenden Isotopenüberschusses beitragen. Diese Korrekturen die täglich mit unangereichertem Homocystein, Cystein und Methionin bestimmt wurden lauteten folgendermaßen: i) ungefähr 1,5% des Bereiches des m/z 420,2 Peaks bei 8,9 Min werden von einem m/z 424,2 Peak bei 8,9 Min überlagert, ii) ungefähr 21,4% des Bereiches des m/z 406,2 Peaks bei 7,7 Min werden von einem m/z 408,2 Peak bei 7,7 überlagert, und iii) ungefähr 3,1% des Bereiches des m/z 320,2 Peaks bei 5,4 Min werden von einem m/z 323,2 Peak bei 5,4 Min überlagert.
Bei Versuchen, bei denen Cystein-2-Mercaptoäthanol, Homocystein-Cystein-Dimer und Homocystein erkannt und beobachtet wurden, wurde die Laufzeit auf 20 Min verlängert und die Endtemperatur auf 335ºC erhöht. Die Spektren des Cysteins und Homocysteins wurden durch die direkte Derivatisierung ohne die Standardreduktion mit 2-Mercaptoäthanol erhalten. Die Spektren für Cystein-2- Mercaptoäthanol und Homocystein-2-Mercaptoäthanol wurden vom Cystein bzw. Homocystein durch Versuche, bei denen diese Verbindungen mit 2-Mercaptoäthanol reduziert wurden, gefolgt von einer Derivatisierung, erzeugt. Die letztgenannte Technik wurde benutzt, um das Spektrum von Homocystein-Cystein-Dimern zu erhalten, ausgenommen, daß eine gleiche Mischung von Homocystein und Cystein durch 2-Mercaptoäthanol reduziert wurde, gefolgt von einer Derivatisierung. Die Sensitivität dieser Tests wurde durch Messung vom Verhältnis des Monocysteinmonomers zum [3,3,4,4-²H&sub4;]Monocysteinmonomers, bei dem die Standardkurven von der Linearität abweichen, bestimmt. Das wird beschrieben durch A.B. Zinn, D.G. Hine, M.J. Mahoney sowie K. Tanaka, Pediatr. Res. 16:740-745 (1982).
Die Harnstoffclearance des Gesamthomocystein, Methionin und Gesamtcystein wurde bestimmt mit der folgenden Gleichung, hier dargestellt für das Gesamthomocystein:
Gesamthomocystein/Kreatinin Clearanceverhältnis = 100*[Urin-Gesamtwert des Homocystein (umol/L) / Urin- Kreatinin (umol/L)] / [Serum-Gesamtwert des Homocysteins (umol/L) / Serum-Kreatinin umol/L)]
Die extensive Natur der partiellen Probenreinigung, die bei diesem Vorgang vorgenommen wurde, war wegen der komplexen Mischung der Aminosäuren und anderer organischer Verbindungen, die im Serum und Urin vorhanden waren und wegen der relativ niedrigen Konzentration des vorhandenen gesamten Homocysteins notwendig. Versuche, bei denen bekannte Mengen von [Methyl-¹&sup4;C]methionin oder [U¹&sup4;C]Cystin zum Serum oder zu den Urinproben addiert wurden, zeigten, daß ungefähr 70% der Radioaktivität beider Aminosäuren in der schließlichen Hexanlösung am Ende der extensiven partiellen Reinigung und Derivatisierung erhalten geblieben sind. Vergleichbare Studien für Homocystein konnten nicht durchgeführt werden, da radioaktiv gekennzeichnetes Homocystein nicht kommerziell erhältlich ist.
Die Struktur und m/z Werte des t-Butyldimethylsilylderivats des Homocysteins wird im Folgenden zusammen mit einigen der Fragmentpositionen und der m/z Werte der entsprechenden Fragmente bei [M]', [M-15]&spplus;, [M-57]&spplus; und [M-159]&spplus; gezeigt: m/z-Struktur 1
Die Molekulargewichte der Homocysteinmonomere, Cysteinmonomere, Homocysteine, Cysteine, Homocystein-2- Mercaptoäthanole, Cystein-2-Mercaptoäthanole, Homocystein-Cystein-Dimer und Methionine sind in Abbildung 1 zusammen mit den Massenspektren ihrer t- Butyldimethylsilylderivate aufgeführt. Das Molekulargewicht eines speziellen Derivates ist gleich dem Molekulargewicht der Aminosäure oder des Disulfids plus 114 für jede t-Butyldimethylsilylgruppe, die angebunden an jede freie -COOH, -NH&sub2;, -SH und -OH Gruppe ist. Im Falle des Homocysteinmonomers, Cysteinmonomers, Homocystein-2-Mercaptoäthanols, Cystein-2-Mercaptoäthanols und Methionins ist ein großer Peak bei [M-57]&spplus; vorhanden. Im Fall der Homocysteine, Cysteine und Homocystein-Dimer ist der Peak bei [M/2]&spplus; vorhanden. Ein [M-57]&spplus; Peak wurde bei Homocystein nicht und nur kleine [M-57]&spplus; Peaks wurden bei Cystein und Homocystein- Cystein-Dimern beobachtet.
Abbildung 2 zeigt Chromatogramme der t- Butyldimethylsilylderivate der Aminosäuren, die beobachtet wurden nach der Reduktion von (A) einer Mischung bestehend aus Methionin, Cystein und Homocystein im Verhältnis 1:3:1, (B) 100 ul von normalem menschlichem Serum, (C) 100 ul von normalem Rattenserum und (D) 100 ul von normalen menschlichen Urin. Die beobachteten Aminosäuren waren: Methionin (MET), Cysteinmonomer (CYS), Homocysteinmonomer (HCYS), [Methyl-²H&sub3;]methionin (Met*), [3,3-²H&sub2;]Cysteinmonomer (Cys*) und [3,3,4,4-²H&sub4;]Homocysteinmonomer (HCYS*). MET*, CYS* und HCYS* wurden nicht zur Probe A addiert, und die Peaks, die dem zugeordnet werden können, repräsentieren die Menge des MET, CYS und HCYS, die das Ergebnis einer natürlichen Isotopenbildung sind. Die Zahlen in den Klammern stellen die m/z Werte dar, die durch eine Ionenauswahlbetrachtung ermittelt wurden. Die Werte für "F.S" sind relative Werte für die volle Skala bei der ungedämpften Aufzeichnung. Bei der gedämpften Aufzeichnung wurde um den Faktor 10 abgeschwächt. Die Werte, die für endogenes Gesamthomocystein ermittelt wurden, waren 18,9, 6,5 und 3,6 umol/L für B, C und D, in dieser Reihenfolge. Die Werte, die für endogenes Gesamtcystein ermittelt wurden, waren 369, 173 und 238 umol/L für B, C und D, in dieser Reihenfolge. Die Werte, die für endogenes Methionin ermittelt wurden, waren 16,8, 60,4 und 3,2 umol/L für B, C und D, in dieser Reihenfolge. Abbildung 2A zeigt, daß die Kapillarsäule eine komplette Separation für diese drei Aminosäuren erzeugt. Das Eluierungsprofil des Cystein-2-Mercaptoäthanol, Homo-cystein-2-Mercaptoäthanol, Cystein, Homocystein-Cystein und Homocystein ist nicht aufgeführt, jedoch vorhanden und eluierte als einzelne symmetrische Peaks mit Eluierungszeiten von 11,8, 12,9, 16,3, 17,4 und 18,4 Minuten.
Untersuchungen mit Proben von menschlichem Serum und Urin und Rattenserum, bei denen [3,3,3',3',4,4,4',4'-&sub2;H&sub8;] Homocystein, {3,3,3',3'- ²H&sub4;]Cystein und [Methyl-&sup8;H&sub3;] methionin nicht addiert wurden, zeigten, daß keine Substanzen vorhanden waren, die mit den internen Standards für die Mengenbestimmung in Interferenz traten. Die Empfindlichkeit der Untersuchungen war 1 umol/L für Gesamthomocystein, 5 umol/L für Gesamtcystein und 2 umol/L für Methionin unter Standardbedingungen, bei denen 50 umol/L [3,3,3',3',4,4,4',4'-²H&sub8;]Homocystein, 250 umol/L [3,3,3',3'-²H&sub4;]cystein und 150 umol/L [Methyl- ²H&sub3;]methionin benutzt wurden, obwohl die Empfindlichkeit in jedem Einzelfall dadurch erhöht werden könnte, daß eine kleinere Menge der internen Standards addiert wird. Tests, die unter Standardbedingungen durchgeführt wurden, zeigten, daß die Tests für jede der drei Aminosäuren linear über einen Bereich von 1 bis 1000 umol/L für Gesamthomocystein, 5 bis 5000 umol/L für Gesamtcystein und 2 bis 2000 umol/L für Methionin verlaufen.
Ein Chromatogramm, daß mit 100 uL von normalem menschlichem Serum erzeugt wurde, ist in Abbildung 2B aufgeführt. Endogenes Gesamtcystein war in der größten Menge vorhanden, gefolgt vom endogenen Methionin und dann dem endogenen Gesamthomocystein. Etwa 70% des Gesamtcysteins waren im Cysteinmonomer-Peak bei 7,7 Min vorhanden. Die verbleibenden, vorhandenen 30% (Daten werden nicht aufgeführt) lagen vor als Cystein-2- Mercaptoäthanol (20%), Cystein (9%) und Homocystein- Cystein-Dimer (1%) Peaks, die zu späteren Zeitperioden eluierten (siehe oben). Etwa 60% des Gesamthomocystenmonomers waren im Peak, der bei ca. 8,9 Min eluierte, vorhanden. Die verbleibenden, vorhandenen 40% (Daten werden nicht aufgeführt) lagen vor als Homocystein-2- Mercaptoäthanol (25%), Homocystein-Cystein-Dimer (14%) und Homocystein (1%) Peaks, die später eluierten (siehe oben).
Die prozentualen Anteile der verschiedenen Formen von Cystein und Homocystein variierten beträchtlich von Probe zu Probe; für eine gegebene Probe änderten sie sich jedoch nicht, als die Siedetemperatur mit 2- Mercaptoäthanol zwischen 1 und 60 Minuten oder als die Menge des 2-Mercaptoäthanols zwischen 5 und 100 uL variiert wurde. Das Verhältnis des endogenen Cysteins zum [3,3-²H&sub2;]Cystein war im wesentlichen identisch bei allen Formen der Peaks, die Cystein enthielten. Das Verhältnis von endogenem Homocystein zum [3,3,4,4- ²H&sub4;]Homocystein war im wesentlichen identisch bei allen Formen der Peaks, die Homocystein enthielten. Diese Beobachtung zeigt, daß die endogenen und internen Standardformen von Cystein und Homocystein komplett reduziert und wieder hergestellt werden von ihren verschiedenen Disulfidformen, inklusive der Formen, die an Proteine gebunden waren, durch die anfängliche 15 Minuten Reduktion mit 100 uL des 2-Mercaptoäthanol, und daß kleine, aber signifikante Mengen der verschiedenen Disulfide während der aufeinanderfolgenden Stadien der Reinigungs- und Derivatisierungsvorgänge reformiert werden. Die aufeinanderfolgenden partiellen Disulfidreformationen ver- oder behindern nicht die mengenmäßige Bestimmung der endogenen Gesamtcysteine und endogenen Gesamthomocysteine, denn die benutzten internen Standards für Cystein und Homocystein, d.h. [3,3,3',3'-²H&sub4;]Cystein und [3,3,3',3',4,4,4',4'-²H&sub8;] Homocystein werden ebenfalls komplett reduziert und parti-zipieren von der partiellen Disulfidreformation in der gleichen mengenmäßigen Weise wie die endogenen Gesamtcysteine und endogenen Gesamthomocysteine. Es ist möglich, das endogene Gesamtcystein zu quantifizieren unter Benutzung der Verhältnisse von deuteriertem Cystein zu endogenem Cystein in jedem der Cysteinmonomere, Cystein-2-Mercaptoäthanole, Cysteine oder Homocystein-Cystein-Dimer Peaks, denn die Werte für diese Verhältnisse sind bei allen vier Peaks der gegebenen Probe die selben. Wir haben uns dazu entschieden, die Verhältnisse, die sich aus den Cysteinmonomer- und Homocysteinmonomerpeaks ergeben, bei unseren Standardtests zu messen und zu verwenden, weil diese Peaks für gewöhnlich die längsten sind und weil sie früher eluieren, als die anderen Peaks.
Vorausgehende Untersuchungen zeigten, daß es möglich ist, nach dem anfänglichen Reduktionsschritt Jodacetamide an Cysteinmonomere und Homocysteinmonomere zu binden und dann mit dem Reinigungs- und Derivatisierungsvorgang in der standartisierten Art (Daten werden nicht gezeigt) fortzufahren. Diese Modifikation, die die Reformation der Disulfide verhindert, wurde jedoch nicht im Einzelnen untersucht.
Wenn die Reduktion mit 2-Mercaptoäthanol von der Standardprozedur mit menschlichem Serum ausgenommen wird, können Cystin, Homocystin und Homocystein-Cystein- Dimer Peaks beobachtet werden, die endogene Formen des Cysteins, Homocysteins bzw. beides als Cystin und Homocystein enthalten. Cystein-2-Mercaptoäthanol und Homocystein-2-Mercapto-äthanol sind unter diesen Bedingungen nicht erkennbar (Daten sind nicht vorhanden).
Chromatogramme, die mit 100 uL normalem Rattenserum und 100 uL normalem menschlichem Urin erzeugt wurden, werden in den Figuren 2C und 2D gezeigt und ähneln den Chromatogrammen, die mit normalem menschlichem Serum erzeugt wurden (Figur 2B).
Untersuchungen, die mit einer Einzelprobe durchgeführt wurden, bestehend aus einer Mischung aus normalem menschlichen Serum, daß wiederholt gefroren und aufgetaut und bei 16 verschiedenen Gelegenheiten über einen Zeitraum von einem Monat gemessen wurde, ergaben Koeffizientenvariationen von 19,7%, 17,4% und 5,6% für die Tests von Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin, in dieser Reihenfolge. Keine signifikanten Änderungen oder Trends bei den Werten dieser drei Aminosäuren wurden über einen Zeitraum von einem Monat festgestellt, noch wurden Änderungen beobachtet als dasselbe Serum bei anderen Gelegenheiten über einen Zeitraum von 12 Monaten getestet wurde.
Die Werte für Serum-Gesamthomocystein, die von Blutproben ermittelt wurden, die direkt nach der Entnahme bei 4ºC zentrifugiert wurden, waren die gleichen (10% Differenz), wie die Werte, die von einem Teil der gleichen Blutprobe, der vor der Zentrifugierung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde, ermittelt wurden. Die Werte waren jedoch um etwa 35% bzw. etwa 75% erhöht, wenn die Inkubationszeit vor dem Zentrifugieren auf 4 bzw. 24 Stunden erhöht wurde. Die Werte für Serum-Gesamtcystein änderten sich nicht bei einer Inkubationszeit von bis zu 24 Stunden. Die Werte für Serum-Methionin änderten sich innerhalb einer Stunde nicht, erhöhten sich jedoch um 10% bzw. 25% nach 4 bzw. 24 Stunden. Plasma, daß mit EDTA oder Heparin gebunden wurde, ergab die gleichen Werte, wie die des Serums für alle drei Aminosäuren während aller Zeitperioden mit Ausnahme des Methionins, bei dem die Werte für beide Arten des Plasmas innerhalb der 4 und der 24 Stunden Inkubationszeit nicht angestiegen sind. Inkubationsuntersuchungen, die mit Rattenserum durchgeführt wurden, ergaben Resultate, die ähnlich derer waren, die mit menschlichem Serum ermittelt wurden. Die Werte für Urin- Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Gesamtmethionin änderten sich bei Inkubationszeiten von 0 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur nicht.
Die Werte für das tatsächliche Mittel (umol/L) und den Bereich, die gemessen wurden für Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin in Serumproben von 50 menschlichen Versuchspersonen und 50 normalen Ratten, die berechnet wurden als Mittel ± 2 S.A. nach logarithmischer Transformation um die Verzerrung in Richtung höherer Werte zu korrigieren, sind: menschliches Serum-Gesamthomocystein 13,0 (7,2-21,7), menschliches Serum Methionin 25,5 (13,7-43,5), menschliches Serum-Gesamtcystein 261 (174-378), Rattenserum-Gesamthomocystein 5,6 (3,2-9,6), Rattenserum Methionin 56 (39-83) und Rattenserum-Gesamtcystein 190 (131-283). Die Werte für das tatsächliche Mittel (umol/L oder umol/10 nmol Kreatinin) und den Bereich, die für Urinproben von 50 normalen menschlichen Versuchspersonen gemessen und wie oben beschrieben berechnet wurden, sind: menschliches Urin Gesamthomocystein 7,2 (1,4- 24,7), menschliches Urin Gesamthomocystein / 10 nmol Urin Kreatinin 11,2 (2,0-36,7), menschliches Urin Methionin 5,9 (0,4-35,1), menschliches Urin Methionin / 10 nmol Kreatinin 6,3 (1,5-19,1), menschliches Urin Gesamtcystein 260 (68-729), menschliches Urin Gesamtcystein / 10 nmol Kreatinin 344 (158-655). Die Standardbereiche für Gesamtcystein und Methionin im Urin sind schmaler, wenn sie als umol/10 nmol Kreatinin angegeben werden, als wenn sie als umol/L angegeben werden.
Die Werte für Gesamthomocystein und Gesamtcystein sind im menschlichen Serum entscheidend höher (p < 0,05) als im Rattenserum. Die Werte für Methionin sind im Rattenserum entscheidend höher (P < 0,05) als im menschlichen Serum.
Die Werte für menschliches Serum-Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin konnten nicht aussagekräftig mit Urin Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin in Übereinstimmung gebracht werden, unabhängig davon, ob die Urinwerte als umol/L oder als umol/10 nmol Kreatinin angegeben wurden. Die Werte für Serum-Gesamthomocystein und Serum Methionin waren bei Männern 20% bzw. 22% höher als bei Frauen (P < 0,05). Die Werte für Serum- Gesamtcystein, Urin Gesamthomocystein, Urin Gesamtcystein und Urin Methionin waren bei Männern und Frauen nicht wesentlich unterschiedlich. Die Werte für Serum-Gesamthomocystein korrelierten nicht signifikant mit dem Alter, Hämoglobin, mittlerem Korpuskularvolumen, weißer Blutzellenanzahl, Plättchenanzahl, Serum- Cobalamin, Serum-Folat, Serum-Methionin, Serum- Gesamtcystein oder der Serum-Methylmalonsäure. Die größten Korrelations-koeffizienten betrugen 0,37 zwischen Serum-Gesamthomocystein und Hämoglobin (P = 0,06) und -0,34 zwischen Serum-Gesamthomocystein und Serum-Folat (P = 0,06) . Die Korrelationskoeffizienten zwischen Serum-Homocystein und Serumcobalamin betrugen 0,14 (P = 0,44). Die Werte für Serum-Methionin korrelierten nicht signifikant mit einem der oben aufgeführten Parameter mit Ausnahme des Hämoglobins bei dem der Korrelationskoeffizient 0,44 (P < 0,5) betrug. Die Korrelationskoeffizienten zwischen Serum-Methionin und Serum-Folat sowie Serum-Methionin und Serum- Cobalamin betrugen -0,09 (P = 0,64) und 0,20 (P = 0,29). Serum-Gesamtcystein korrelierte nicht signifikant mit einem der oben aufgeführten Parameter mit Ausnahme des Alters und der Serum-Methylmalonsäure. Die Korrelationskoeffizienten zwischen Serum-Gesamtcystein und dem Alter betrugen 0,38 (P < 0,01), die zwischen Serum- Gesamtcystein und Serum-Methylmalonsäure betrugen 0,30 (P < 0,05). Die Werte des Urin Gesamthomocysteins, Urin Gesamtcysteins und Urin Methionins ausgedrückt in umol/L oder umol / 10 nmol Kreatinin korrelierten nicht signifikant mit dem Alter, Hämoglobin, mittlerem Korpuskularvolumen, weißer Blutzellenanzahl, Plättchenanzahl, Serum-Cobalamin, Serum-Folat, Serum-Methylmalonsäure, Serum-Gesamthomocystein, Serum-Methionin oder dem Serum-Gesamtcystein.
Wir haben errechnet, daß der mittlere Harnstoffclearance von Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin des menschlichen Serums relativ zum Clearance des Kreatinins bei 0,3%, 9,6% und 0,1% lag. Diese Beobachtungen zeigen auf, daß nur kleine Teile des Gesamthomocysteins, Gesamtcysteins und Methionins, das im Serum vorhanden ist, im Urin ausgeschieden werden und daß die Werte und relativen Änderungen in der Konzentration dieser Aminosäuren zwischen Serum und Urin bei verschiedenen Krankheitsformen variieren können.
Wir haben Techniken entwickelt und demonstriert, die es ermöglichen, das Gesamthomocystein und Gesamtcystein im Serum von normalen Menschen und Ratten sowie im Urin von normalen Menschen zu erkennen und mengenmäßig zu bestimmen. Eine Reduktion mit einer passenden Sulfhydrylkomponente wie zum Beispiel 2- Mercaptoäthanol ist für die Messung des Gesamthomocysteins und Gesamtcysteins unentbehrlich, da 50% bzw. 70% dieser Aminosäuren kovalent an Serumproteine via Disulfidbindungen gebunden sind. Unsere Untersuchungen und die von anderen ergaben, daß die Freisetzung dieser gebundenen Homocysteine und Cysteine sehr schnell vor sich geht, unsere Untersuchungen ergaben jedoch auch, daß neue Disulfide nach der Reduktion zu einem erheblichen Grad gebildet werden. Die Erkennung und mengenmäßige Bestimmung mittels der Massenspektrometrie ist in dieser Situation sehr hilfreich unter Verwendung stabiler Isotopenformen des Homocysteins und Cysteins als interne Standards. Diese internen Standards verhalten sich während des Reduktionsschrittes und der teilweisen Neubildung von Disulfiden genauso wie endogenes Gesamthomocystein und endogenes Gesamtcystein. Es sollte möglich sein, unsere Methode zum separaten Messen des proteingebundenen Homocysteins und Cysteins zu benutzen, wir haben das jedoch nicht untersucht. Es ist auch möglich, andere Aminosäuren zur gleichen Zeit unter Verwendung passender interner Standards zur messen. Wir haben dies im Falle von Methionin getan und erkannt, daß diese Methode auch für andere Aminosäuren anwendbar ist.
Wir haben die normalen Bereiche für Gesamthomocystein im menschlichen Serum, im Rattenserum und im menschlichen Urin bestimmt. Die Werte für menschliches Serum und Urin gleichen denen, die von H. Refsum, S. Helland und P.M. Ueland, Clin. Chem. 31(4):624-628 (1985) berichtet wurden. Unsere Werte für menschliches Serum sind etwa 30% höher als ihre Werte, was daran liegen könnte, daß wir stabile Isotopenformen des Homocysteins als interne Standards mit den oben beschriebenen Vorteilen bei unseren Messungen verwendet haben und daran, daß die Gesamthomocysteinwerte in den Proben steigen, wenn, wie bei unserem Test, zugelassen wird, daß die Proben bei Raumtemperatur einige Stunden gerinnen.
Wir haben auch die normalen Bereiche für Gesamtcystein im menschlichen Serum und menschlichen Urin bestimmt. Unsere Werte hinsichtlich des menschliches Serums stehen in guter Übereinstimmung zu den Werten, die berichtet wurden von M.H. Malloy, D.K. Rassin und G.E. Gaull, Anal. Biochem. 113:407-415 (1981), die eine Reduktion mit Dithiothreitol, gefolgt von einer spektrometrischen Bestimmung der endogenen Gesamtcysteine durchführten. Die Tatsache, daß unsere Werte etwa 30% höher liegen, könnte daran liegen, daß wir bei unserer Messung ein stabiles Isotop als internen Standard, wie oben beschrieben, benutzt haben. Unsere Werte für Gesamtcystein im menschlichen Urin ähneln denen, die von J. Martensson, Metabolism 31:487-492 (1982), der einen Standard-Aminosäurenanalysator benutzte, berichtet wurden.
Die normalen Bereiche für Methionin, die wir im menschlichen Serum und Rattenserum und im menschlichen Urin bestimmt haben, stehen in ausgezeichneter Übereinstimmung zu den Werten, die eine Anzahl anderer Forscher, die einen Aminosäureanalysator benutzt haben, festgestellt haben.
Unsere Werte für Gesamthomocystein, Gesamtcystein und Methionin im Rattenserum ähneln der begrenzten Anzahl von Angaben anderer Forscher.
Für die Verfügbarkeit und Sensitivität einer speziellen Methode zum Messen des Gesamthomocysteins im menschlichen Serum gibt es mehrere klinische Anwendungen wie folgt: (i) Bestimmung der erhöhten Werte für Serum- Gesamthomocystein bei Patienten, die unter klinisch bestätigtem Cobalamin- oder Folatmangel leiden, (ii) Bestimmung der Gesamthomocystein-Werte im Serum von Patienten mit niedrigen, grenzwertigen oder niedrig normalen Werten von Serum-Cobalamin oder Serum-Folat zur Abschätzung der diagnostischen Sensitivität und Spezifizierung der Serum-Cobalamin- oder Serum-Folat- Untersuchungen, (iii) Bestimmung der Gesamthomocysteinwerte im Serum von Patienten mit einer Anzahl von neuropsychiatrischen Anomalien und im Alter, um das Vorkommen von Cobalamin- und Folatmangel in diesen Gruppen besser zu erkennen und (iv) Bestimmung der Gesamthomocysteinwerte bei heterozygoten Patienten für die Bestimmung eines Cystathioninsyntheasedefekts, um zu versuchen, einen besseren diagnostischen Test für diesen heterozygotischen Zustand, der mit einem erhöhten Vorkommen von periphärer vaskularer und zerebrovaskularer Krankheiten einhergeht, zu entwickeln. Die Untersuchung auf Gesamthomocystein im menschlichen Serum ist eine relativ sensitive Messung von gleichermaßen Cobalamin- als auch Folatmangel. Die Fähigkeit, das Homocystein im Serum von Tieren, wie zum Beispiel Ratten, zu messen, ist sehr hilfreich bei Untersuchungen, die sich mit Lachgas, Cobalaminanalogien, Folatanalogien wie zum Beispiel Methotrexate und cobalamin- oder folatarmer Nahrung beschäftigen, d.h. von allen Erscheinungen, die mit den verschiedenen Aspekten des Cobalamin- oder Folatmetabolismus in Verbindung stehen.

Beispiel IV

Repräsentativer Test auf Methylmalonsäure

Entsprechend der Methode von P.D. Marcell, S.P. Stabler, E.R. Podell sowie R.H. Allen, Anal Biochem. 150:58-66 (1985).
Methylmalonsäure, Bernsteinsäure und Glutarsäure wurden bezogen von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Malonsäure wurde bezogen von J.T. Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ) und Dimethylmalonsäure, Athylmalonsäure und Brenzweinsäure wurden bezogen von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI). [Methyl- ²H&sub3;]methylmalonsäure (> 99% via Sondersynthese) und [1,4-¹³C&sub2;]Bernsteinsäure (> 99%) wurden bezogen von Merck Sharpe & Dohme Isotopes (Montreal, Canada). [Methyl-¹&sup4;C&sub2;]methylmalonsäure (via Sondersynthese) und [1,4-¹&sup4;C&sub2;]Bernsteinsäure wurden bezogen von der New England Nuclear Corp. (Boston, MA). N-Methyl-N(t-butyldimethylsilyl)trifluoracetamit wurde bezogen von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Alle Lösungsmittel wurden auf einem Hochleistungsflüssig-chromatographen von Burdick & Jackson Laboratories Inc. (Muskegon, MI) klassifiziert. Blutproben wurden von normalen, gesunden Blutspendern von der Belle Bonfils Blood Bank, Denver, CO, zum Zeitpunkt der Blutspende bezogen. Es wurden fortlaufende Blutspenden ausgewählt, so daß Proben von fünf männlichen und fünf weiblichen Personen in den Altersgruppen 18-26, 27-35, 36-45, 46-55 und 56-65 (zusammengenommen 50 Proben) vorhanden waren. Die Proben wurden zwischen 9 und 13 Uhr entnommen. Die Proben konnten 1 bis 4 Stunden gerinnen und wurden danach bei 1500g für 30 Minuten zentrifugiert, das Serum wurde entzogen und bei -20ºC gelagert. Zusätzlich konnten andere Proben 0 bis 24 Stunden gerinnen, bevor sie zentrifugiert wurden. Stichproben vom Urin wurden von den gleichen Personen innerhalb von 30 Minuten oder bei der Blutabnahme gesammelt und ebenfalls bei -20ºC gelagert. Spraque-Dawley-Ratten mit 250-350 g wurden von SASCO Inc. (Omaha, NB) beschafft, und das Blut wurde unter einer Äthernarkose durch eine Herzpunktierung entnommen. Das Serum wurde wie bei den menschlichen Blutspendern beschrieben gesammelt und archiviert.
Ein Volumen von 50 uL H&sub2;O, das 200 ng [Methyl- ²H&sub3;]methylmalonsäure und 2000 ng [1,4- ¹³C&sub2;]Bernsteinsäure enthielt, wurde zu 500 uL des Serums oder 100 uL des Urins gegeben, weitere 400 uL H&sub2;O wurden zu den Urinproben gegeben. Der pH-Wert wurde danach auf 12 angehoben durch Zugabe von 50 uL 2M(N)NaOH, dann wurden 5 ml Diäthyläther hinzugegeben, gefolgt von einer intensiven Durchmischung und Zentrifugierung bei 1000g für 3 Minuten. Hiernach wurde die obere Ätherschicht dekantiert und verworfen. Der pH-Wert wurde dann auf 1 abgesenkt durch Zugabe von 50 uL 6M(N)HCl und die Proben wurden zum zweiten Mal mit 5 ml Diäthyläther, wie oben beschrieben, extrahiert. Die Ätherextrakte wurden durchmengt, in einem Wasserbad bei 40ºC unter Anwendung eines Stickstoffstromes getrocknet und danach in 500 uL H&sub2;O aufgelöst. Die gesamte Probe wurde danach abgefüllt in einem Waters Associates (Milford, MA) Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographen-Anionenaustauschsystem, das aus einem 720er Systemcontroller, einem 730er Data- Modul, zwei 6000A-Pumpen, einem U6K-Injektor und einem Z-Modul, ausgestattet mit einer Radial-Pak-SAX-Kassette (10 um, 8 mm * 10 cm) und einem Precolumn (4 * 23 mm) gefüllt mit einem Pellicular-Anionenaustauscher, bezogen von Whatman Inc. (Clifton NJ), besteht. Die mobile Phase besteht aus 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;-H&sub3;PO&sub4; mit einem pH von 2,0, und 2 ml Teile wurden mit einer Durchflußrate von 2 ml/Min gesammelt. Die Teile 3-5 enthielten mehr als 95% der zugeführten Methylmalonsäure und Bernsteinsäure basierend auf separaten Versuchen, die mit [Methyl- ¹&sup4;C]methylmalonsäure und [1,4-¹&sup4;C&sub2;]Bernsteinsäure, die benutzt wurden, um täglich das Chromatographensystem zu überprüfen, durchgeführt wurden. Diese Teile wurden vermengt, 50 uL 6 N HCl wurde hinzugegeben um den pH- Wert auf etwa 1 einzustellen, und die Proben wurden ein weiteres Mal mit 5 ml Diäthyläther, wie oben beschrieben, extrahiert. Diese Ätherextrakte wurden vermischt, in einem Wasserbad bei 40ºC unter Anwendung eines Stickstoffstromes getrocknet, in 150 uL Methanol aufgelöst und in 300-uL Reaktionsampullen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) zusammen mit einem 150 uL Methanolspülmittel gegeben. Die Proben wurden dann in einem Speed Vac Vakuum-Konzentrator (Savant Instruments Inc., Hicksville, NY) getrocknet.
Die t-Butyldimethylsilylester der Dicarbonsäure wurden durch Addition von 100 pL Acetonitril und 10 uL N-Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid zu jeder Ampulle präpariert. Die Ampullen wurden mit teflonbeschichteten Scheidewandkappen versiegelt und bei Raumtemperatur (22 ºC) über Nacht gelagert. Danach wurden 100 uL H&sub2;O hinzugefügt, um alle Derivate, die nicht reagiert haben, aufzuschließen. Hiernach wurden 250 uL Hexan hinzugegeben, gefolgt von einer intensiven Durchmischung und Zentrifugierung bei 1000g. Die obere Hexanschicht wurde dekantiert, in eine separate Reaktionsampulle gegeben und unter einem Stickstoffstrom bis auf etwa 5 uL getrocknet. Es wurde sorgfältig darauf geachtet, daß der Trocknungsvorgang nicht vollständig abgeschlossen wurde, denn das hätte zu einem Verlust eines Großteils der Derivate geführt. Etwa 2 uL wurden in die Kapillarsäule eines Hewlett Packard (Palo Alto, CA) 599B Gas-Chromatographen-Massenspektrometer durch einen Fallnadelinjektor eingegeben. Der Gas- Chromatograph-Massenspektrometer war ausgerüstet mit einem 9825B-Computer, einem 9876A-Drucker und einem Molekularstrahlseparator. Der Injektionsport wurde modifiziert, um einen Fallnadelinjektor benutzen zu können. Eine zusätzliche verkleidete Gasträgerleitung wurde an den Strahlseparator angeschlossen. Die Testlösung wurde erzeugt in einer Durabond DB-1 Quarzglas Kapillarsäule (30 m * 0,25 mm i.D., 0,25um Filmdicke) von J & W Scientific Inc. (Rancho Cordova, CA). Der Gas-Chromatograph-Massenspektrometer wurde mit automatischer Abstimmung betrieben, die Injektionsport- Temperatur betrug 250ºC und der Säulendruck 22 psi (1,52 Bar). Die Kapillarsäule wurde auf 160ºC abgeglichen und 6,5 Minuten nach der Probenzugabe mit 8ºC/Min auf 188ºC erhitzt. Die Daten wurden von 5,8 bis 12,5 Minuten unter Benutzung des Ionenauswahlmonitormodus gesammelt. Die folgenden [M-57]&spplus; Ionen wurden mit einer jeweiligen Verweildauer von 50 msec beobachtet: Malonsäure, m/z 275,2; Methylmalonsäure m/z 289,2; [Methyl- ²H&sub3;]methylmalonsäure, m/z 292,2; Bernsteinsäure m/z 289,2; [1,4-¹³C&sub2;]Bernsteinsäure, m/z 291,2; Dimethylmalonsäure, m/z 303,2; Äthylmalonsäure, m/z 303,2; Methylbernsteinsäure, m/z 303,2; Glutarsäure, m/z 303,2. Die quantitative Bestimmung der Methylmalonsäure erfolgte, indem der integrierte Bereich des m/z 289,2 Peaks, der bei etwa 6,8 Minuten eluierte (die genauen Zeiten werden täglich mit Standards bestimmt), durch den m/z 292,2 Peak, der zur gleichen Zeit eluierte, geteilt wurde, mit darauf folgender Multiplikation mit 200 ng, das der Menge der [Methyl-²H&sub3;]methylmalonsäure entspricht, die zu jeder Probe hinzugegeben wurde. Bernsteinsäure wurde in der gleichen Weise bestimmt unter Benutzung der m/z 289,2 und m/z 291,2 Peaks, die bei etwa 9,3 Minuten eluierten, mit darauf folgender Multiplikation mit 2000 ng, das der Menge der [1,4- ¹³C&sub3;]Bernsteinsäure entspricht. Die integrierten Bereiche der beiden internen Standardspeaks, d.h. der m/z 292,2 Peak und der m/z 291,2 Peak, die bei 6,8 bzw. 9,3 Minuten eluierten, wurden korrigiert gemäß der Menge, die sie zur endogenen Methylmalonsäure und Bernsteinsäure gemäß des natürlich vorkommenden Isotopenüberschusses beitragen. Diese Korrekturen, die täglich mit unangereicherter Methylmalonsäure und Bernsteinsäure bestimmt werden, waren folgende: (i) etwa 1,9% des Bereiches des m/z 289,2 Peaks bei 6,8 Minuten waren vorhanden im m/z 292,2 Peak bei 6,8 Minuten und (ii) etwa 10,8% des Bereiches des m/z 289,2 Peaks bei 9,3 Minuten waren vorhanden im m/z 291,2 Peak bei 9,3 Minuten.
Die Sensitivität dieser Tests wurde durch Messung vom Verhältnis der Methylmalonsäure zur [Methyl- ²H&sub3;]Methylmalonsäure, bei dem die Standardkurven von der Linearität abweichen, bestimmt. Das wird beschrieben von A.B. Zinn, D.G. Hine, M.J. Mahoney sowie K. Tanaka, Pediatr. Res. 16:740-745 (1982).
Die Harnstoffclearance der Methylmalonsäure und der Bernsteinsäure vom Serum relativ zu der des Kreatinins wurde mit der folgenden Gleichung, die hier als Beispiel Methylmalonsäure verwendet, bestimmt.
Methylmalonsäure/Kreatinin-Clearanceverhältnis = 100 * [Urin-Methylmalonsäure (ng/ml) / Urin-Kreatinin (ng/ml)] / [Serum-Methylmalonsäure (ng/ml) / Serum-Kreatinin (ng/ml)
Die extensive Natur der partiellen Probenreinigung, die bei diesem Vorgang vorgenommen wurde, war wegen der komplexen Mischung der organischen Verbindungen, die im Serum vorhanden waren und wegen der relativ niedrigen Konzentration der vorhandenen Methylmalonsäure notwendig. Verfahren, bei denen verschiedene organische Lösungsmittel zur Extraktion benutzt wurden, gefolgt von weiteren Reinigungsvorgängen mit kleinen Anionenaustausch- oder Phasenumkehrsäulen waren nicht zufriedenstellend. Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Benutzung eines Anionenaustauschharzes erwies sich als sehr vorteilhaft, denn die niedrigen pKa-Werte der Dicarbonsäure, die wir beobachtet haben, resultierten in einer Verzögerung bei pH 2, während die anderen Verbindungen nicht-verzögert wurden. Bei der Analyse von Urinproben wird nicht der gleiche Grad einer partiellen Reinigung benötigt, wie bei der Analyse von Serumproben. Versuche, bei denen bekannte Mengen von [Methyl- ¹&sup4;C]methylmalonsäure und [1,4-¹&sup4;C]Bernsteinsäure zu den Serum- und Urinproben hinzugegeben wurden, zeigten, daß 10 bis 20% beider Dicarbonsäuren in der endgültigen Hexanlösung nach den intensiven partiellen Reinigungs- und Derivatisierungsschritten zurückgewonnen werden.
Anfängliche Versuche, die t- Butyldimethylsilylderivate mit Dicarbonsäure unter Verwendung einer Mischung von t- Butyldimethylchlorosilan/N,N-Dimethylformamid/imidazol (Applied Science Laboratories Inc. State College, PA) herzustellen, wie durch A.P.J.M. Jong, J. Elema und B.J.T van de Berg, Biomed. Mass Spectrom. 7:359-364 (1980) beschrieben, erwiesen sich nicht als vorteilhaft wegen der ausgeprägten Variationen im Grad der Derivatisierung und wegen der relativ instabilen Derivate. In der Vergangenheit stellte sich die Frage, warum einige t-Butyldimethylsilylderivate, wie zum Beispiel Ester und einige organische Säuren, so einfach aufschließen. Wir haben herausgefunden, daß der pH der Reaktionsmischung, die bei Jong usw. beschrieben wird, bei ungefähr 1 liegt und daß dieser Wert in der Hydrolyse der neugebildeten t-Butyldimethylsililderivate der Dicarbonsäuren resultiert, wegen der Unfähigkeit der Imidazole, das HCl vollständig herauszuspülen, das durch die Reaktion, die durch die Chlorosilane hervorgerufen wurde, entstanden ist. Dieses Problem wurde nur teilweise durch die Zugabe anderer Säurespülmittel, wie zum Beispiel Pyridin, korrigiert. Wir sind zu dem Schluß gekommen, daß die t-Butyldimethylsilylderivate, die mit N-Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid präpariert wurden, sehr erfolgreich und reproduzierbar herstellbar sind und für mehr als eine Woche nach ihrer Extraktion in Hexan, wie oben beschrieben, stabil sind. Diese Vorgehensweise haben wir daher als Standardmethode gewählt.
Die Struktur und der m/z Wert der t-Butyldimethylsilylderivate der Methylmalonsäure wird unten angezeigt, zusammen mit den Fragmentierungspositionen und m/z Werten der wichtigsten Fragmente, die von Interesse sind ([M-57]&spplus; und [M-15]&spplus;): m/z-Struktur 2
Die Molekulargewichte von Malonsäure, Methylmalon-Säure, Bernsteinsäure, Dimethylmalonsäure, Äthylmalonsäure, Methylbernsteinsäure und Glutarsäure werden in Abbildung 3 zusammen mit den Massenspektren ihrer t-Butyldimethylsilylderivate gezeigt. Das Molekulargewicht eines speziellen Derivats ist gleich dem Molekulargewicht der Dicarbonsäure plus 228 aufgrund der Addition der zusätzlichen beiden t- Butyldimethylsilylgruppen. Peaks, die alle Derivate repräsentieren, d.h. [M]&spplus;, wurden für keine der Dicarbonsäuren beobachtet. Zum Großteil war der Hauptpeak [M-57]&spplus;, der 35-45% der Summe aller Peaks im m/z Bereich 100 bis 400 repräsentiert. Kleinere Peaks, die [M-15]&spplus; repräsentieren, wurden ebenso für jedes Derivat einer Dicarbonsäure beobachtet, auch wenn sie nur 3-6% des Betrages der [M-57]&spplus; Peaks betrugen. Peaks mit dem m/z Wert 147 wurden bei allen Dicarbonsäurederivaten, und Peaks mit dem m/z Wert 189 wurden bei allen Dicarbonsäurederivaten mit Ausnahme des Glutarsäurederivats beobachtet. Die beiden Peaks sind ein Resultat der Fragmentierung und Neuordnung von Teilen der t-Butyldimethylsilylgruppen selbst und werden nicht von den Dicarbonsäuren ausgelöst, denn sehr viele m/z 147 und m/z 189 Peaks können auch beobachtet werden bei [Methyl-²H&sub3;]methylmalonsäure und bei [1,4- ¹³C&sub2;] Bernsteinsäure
Figur 4 zeigt Chromatogramme der Butyldimethylsilylderivate von Dicarbonsäuren, die erzeugt wurden, von (A) einer Mischung, die 1 ug jeder Säure enthält; (B) 500 uL einer Mischung von normalem menschlichen Serum; (C) 500 uL von normalem Rattenserum; und (D) 100 uL von menschlichem Urin. Die untersuchten Säuren waren Malonsäure (MA), Methylmalonsäure (MMA), Bernsteinsäure (SA), [1,4-¹³C&sub2;]Bernsteinsäure (SA*), [Methyl-²H&sub3;]methylmalonsäure (MMA*), Dimethylmalonsäure (DMMA), Äthylmalonsäure (EMA), Methylbernsteinsäure (MSA) und Glutarsäure (GA). Die Zahlen in Klammern sind die m/z Werte, die durch eine Ionenauswahlbetrachtung gewonnen wurden. Die Werte für "F.S" sind relative Werte für die volle Skala bei der ungedämpften Aufzeichnung. Bei der gedämpften Aufzeichnung wurde um den Faktor 10 abgeschwächt. Die für MMA bestimmten Werte waren 56 für B, 92 für C und 3400 ng/ml für D. Die für SA bestimmten Werte waren 1110 für B, 9200 für C und 19000 ng/ml für D.
Figur 4A zeigt, daß die Kapillarsäule eine komplette Separation für alle Derivate die das gleiche Molekulargewicht haben, erzeugt, d.h. Methylmalonsäure und Bernsteinsäure werden vollkommen voneinander separiert, und Dimethylmalonsäure, Äthylmalonsäure, Methylbernsteinsäure und Glutarsäure werden vollkommen voneinander separiert. Weder werden Methylmalonsäure komplett von Dimethylmalonsäure noch Bernsteinsäure komplett von Methylbernsteinsäure separiert, das ist jedoch kein Problem, denn, wie in Figur 3 gezeigt, haben diese ungelösten Dicarbonsäurederivate unterschiedliche Molekulargewichte und Massenspektren und daher gibt es bei der Ionenauswahlbetrachtung keine Interferenzen.
Untersuchungen mit Proben von menschlichem Serum und Urin und Rattenserum, bei denen die [Methyl²H&sub3;]methylmalonsäure und [1,4¹³C&sub2;] Bernsteinsäure nicht addiert wurden, zeigten auf, daß keine Substanzen vorhanden sind, die mit den internen Standards für die Mengenbestimmung interferieren. Die Empfindlichkeit der Untersuchung ist 5 ng für Methylmalonsäure und 150 ng für Bernsteinsäure unter den Standardbedingungen, bei denen 2000 ng [Methyl²H&sub3;]methylmalonsäure und 2000 ng [1,4¹³C&sub2;]Bernsteinsäure verwendet werden. Die Empfindlichkeit kann in jedem Fall dadurch erhöht werden, indem kleinere Mengen der internen Standards benutzt werden. Untersuchungen, die unter Standardbedingungen durchgeführt wurden, zeigten, daß der Test für Methylmalonsäure linear von 5 bis 5000 ng verläuft, und daß der Test für Bernsteinsäure linear von 150 bis 150000 ng, in Wasserproben und Serumproben, zu denen bekannte Mengen der erwarteten Säuren hinzugegeben wurden, verläuft.
Ein Chromatogramm, daß mit 500 uL einer Mischung von normalem menschlichen Serum erzeugt wurde, zeigt die Figur 4B. Bernsteinsäure ist in der größten Menge vorhanden, und Malonsäure, Methylmalonsäure, Äthylmalonsäure, Methylbernsteinsäure und Glutarsäure sind in kleineren, jedoch eindeutig erkennbaren Mengen vorhanden. Dimethylmalonsäure konnte nicht mit Sicherheit bestimmt werden. Die Figuren 4C und D zeigen Chromatogramme, die mit 500 uL normalem Rattenserum und 100 uL normalem menschlichen Urin erzeugt wurden; sie ähneln den Chromatogrammen, die mit einer Mischung von normalem menschlichen Serum (Figur 4B) erzeugt wurden.
Untersuchungen, die mit einer Einzelprobe durchgeführt wurden, bestehend aus einer Mischung von normalem menschlichen Serum, daß wiederholt gefroren und aufgetaut und bei 17 verschiedenen Gelegenheiten über einen Zeitraum von zehn Monaten gemessen wurde, ergaben Koeffizientenvariationen von 26% und 19% für die Tests von Methylmalonsäure und Bernsteinsäure, in dieser Reihenfolge. Es konnten während der Periode von zehn Monaten keine signifikanten Änderungen oder Trends bei den Werten dieser beiden Dicarbonsäuren beobachtet werden. Die Werte für Serum-Methylmalonsäure, die von Blutproben ermittelt wurden, die direkt nach der Entnahme bei 4ºC zentrifugiert wurden, waren die gleichen, wie die Werte, die von einem Teil der gleichen Blutprobe, der vor der Zentrifugierung 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde, ermittelt wurden. Die Werte für Serum-Bernsteinsäure erhöhten sich während dieser Periode um etwa 10% nach einer Inkubationszeit von einer Stunde und um etwa 90% nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. Die Werte für Methylmalonsäure und Bernsteinsäure änderten sich nicht, wenn Urinproben über einen Zeitraum von 0 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
Die Werte für das tatsächliche Mittel (ng/ml) und den Bereich, die gemessen wurden für Methylmalonsäure und Bernsteinsäure in Serumproben von 50 menschlichen Versuchspersonen und 95 normalen Ratten, die berechnet wurden als Mittel ± 2 S.A. nach logarithmischer Transformation um die Verzerrung in Richtung höherer Werte zu korrigieren, sind: menschliche Serum- Methylmalonsäure 41 (19-76); menschliche Serum- Bernsteinsäure 1270 (580-2420); Ratten-Serum-Methylmalonsäure 128 (42-295); und Ratten-Bernsteinsäure 11900 (5420-22800). Die Werte für das tatsächliche Mittel (ng/ml oder ng/mg Kreatinin) und den Bereich, die gemessen und wie oben beschrieben, berechnet wurden in Urinproben von 50 normalen menschlichen Versuchspersonen, waren: Methylmalonsäure im menschlichen Urin 1840 (270-7190); menschliche Urin- Methylmalonsäure/mg Urin-Kreatinin 2010 (810-3830); Bernsteinsäure im menschlichen Urin 25400 (4620-85600); und menschliche Urin-Bernsteinsäure/mg Urin-Kreatinin 28200 (8360-75100). Die Standardbereiche für Methylmalonsäure und Bernsteinsäure im Urin sind schmaler, wenn sie als ng/mg Kreatinin angegeben werden, als wenn sie als ng/ml angegeben werben.
Die Werte für Methylmalonsäure und Bernsteinsäure sind beide im Rattenserum signifikant höher als im menschlichen Serum. Weder menschliche Serum- Methylmalonsäure noch menschliche Serum-Bernsteinsäure pro Milligramm Serum-Kreatinin korrelieren signifikant mit Urin-Methylmalonsäure oder Urin-Bernsteinsäure pro Milligramm Urin-Kreatinin. Die Werte für Serum- und Urin-Methylmalonsäure unterschieden sich nicht signifikant bei Männern und Frauen und korrelierten nicht signifikant mit dem Alter, Hämoglobin, mittlerem Korpuskularvolumen, weißer Blutzellenanzahl, Plättchenanzahl, Serum-Cobalamin, Serum-Folat, Serum- Kreatinin, Serum-Bernsteinsäure oder Urin- Bernsteinsäure. Der höchste Korrelationskoeffizient betrug -0,25 zwischen Serum-Methylmalonsäure und Serum- Cobalamin (P = 0,08). Die Serum- und Urin- Bernsteinsäurewerte korrelierten nicht signifikant mit irgendeinem der für Methylmalonsäure aufgeführten Parameter.
Wir haben berechnet, daß der mittlere der Methylmalonsäure des menschlichen Serums relativ zum Abstand des Kreatinins 28% und der mittlere Harnstoffclearence der Bernsteinsäure des menschlichen Serums relativ zum Abstand des Kreatinins 13% betrug. Diese Beobachtung legt den Gedanken nahe, daß der Großteil der Methylmalonsäure im Serum über unbekannte Wege metabolisiert wird, wie bei Versuchen beobachtet wurde, bei denen Ratten [Methyl-¹&sup4;C]methylmalonsäure via intrakardialer Injektion verabreicht wurde.
Unsere Untersuchungen unterstützen die Vorschläge von Jong et al., denn wir haben gezeigt, daß die t- Butyldimethylsilylderivate einer Zahl von Dicarbonsäuren hervorragende gas-chromatographische und massenspektrometrische Eigenschaften aufweisen. Anfänglich stießen wir auf ernste Probleme wegen des variablen Grades der Derivatisierung und der hydrolytischen Instabilität. Diese Probleme konnten dadurch gelöst werden, daß wir N-Methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid als derivatisierendes Reagens benutzten, statt der von Jong et al. benutzten t-Butyldimethylchlorsilan/N,N-Dimethylformamid/imidazol- Mischung. Ferner ist diese Verbesserung sowohl anwendbar bei dar Präparierung und Quantifizierung von t- Butyldimethylsilylderivaten anderer biologisch interessanter Verbindungen - die Carboxylgruppen oder andere Gruppen enthalten die auf eine Hydrolyse empfindlich reagieren - als auch zur Derivatisierung und Quantifizierung anderer Aminosäuren.
Wir haben Techniken entwickelt, die es ermöglichen, Methylmalonsäure im Serum normaler Menschen und Ratten zu erkennen und mengenmäßig zu bestimmen. Wir haben ebenfalls den normalen Bereich für Methylmalonsäure im menschlichen Urin definiert, und unsere Werte stehen in genereller Übereinstimmung mit den Werten, die mit anderen Gas-Chromatographie-Massenspektrometrie- Techniken ermittelt wurden. Unsere Methode ist auch anwendbar, um Malonsäure, Dimethylmalonsäure, Äthylmalonsäure, Methylbernsteinsäure, Glutarsäure und andere Dicarbonsäuren im Serum und im Urin mengenmäßig zu bestimmen, obgleich für jede Dicarbonsäure ein stabiles Isotop all interner Standard benötigt wird, um eine optimale quantitative Genauigkeit zu erhalten.
Die Verfügbarkeit einer empfindlichen und spezifischen Methode für die Messung der Methylmalonsäure im menschlichen Serum hat eine Anzahl klinischer Anwendungen, die folgendes beinhalten: (i) Bestimmung des Vorkommens erhöhter Werte von Methylmalonsäure im Serum bei Patienten mit klinisch bestätigtem Cobalaminmangel, (ii) Bestimmung der Methylmalonsäurewerte im Serum von Patienten mit niedrigen, grenzwertigen oder normalen Werten von Serum- Cobalamin zur Abschätzung der diagnostischen Sensitivität und Genauigkeit der Serum-Cobalamintests und (iii) Bestimmung der Methylmalonsäurewerte im Serum von Patienten mit einer Anzahl neuropsychiatrischer Anomalien und im Alter zur besseren Erkennung des Auftretens von Cobalaminmangel bei diesen Gruppen. Bei dem Test auf Methylmalonsäure im menschlichen Serum handelt es sich um ein relativ empfindlich reagierendes Verfahren zur Messung eines Cobalaminmangels, und die Fähigkeit Methylmalonsäure im Serum von Tieren, wie zum Beispiel Ratten, zu messen, ist sehr hilfreich bei Untersuchungen, die sich mit Lachgas, Cobalaminanalogien, Cobalaminmangel in der Nahrung oder all den verschiedenen Aspekten des Cobalaminmetabolismus oder -nutzens beschäftigen.

Beispiel V

Untersuchung der Methylmalonsäure im Serum von Patienten mit Cobalaminmangel

Serumproben von 50 normalen Blutspendern, 25 männlichen und 25 weiblichen im Altersbereich zwischen 18 und 65 Jahren wurden, wie beim Beispiel II beschrieben, bereitgestellt. Die Patientenproben wurden ausgewählt aus einer umfangreichen Serum-Sammlung, die über die letzten 15 Jahre aufgebaut wurde. Die Diagnose eines Cobalaminmangels basierte auf niedrigen Serum- Cobalamin Werten, makroblastischen Knochenmarksmorphologien, passenden hämatologischen oder neurologischen Anomalien und einem signifikanten Ansprechen auf eine parenterale Behandlung mit Cobalamin. Die Diagnose krankhafter Anämie basierte auf einem abweichenden Schillingtest [siehe z.B. W.S. Beck in Hematology (W.J. Williams, E. Beutler, A.J. Ersler und M.A. Lichtman eds.) (McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), Seiten 444-445], der mit einem exogenen Eigenfaktor und/oder der Gegenwart von anti-Eigenfaktor blockierenden Antikörpern im Serum verbessert wurde. Die Diagnose Folatmangel basierte auf niedrigen Serumfolatwerten, normalen oder erhöhten Serum-Cobalaminwerten, makroblastischen Knochenmarksmorphologien, passenden hämatologischen Anomalien und einer Alkoholismus- Vergangenheit und schlechter Ernährung. Die Versuchspersonen, die aus der Gruppe der unregelmäßig auf Cobalaminmangel behandelten Patienten stammen, wurden gebildet aus Patienten mit krankhafter Anämie, die vormals, wie oben beschrieben, unter Cobalaminmangel litten, die jedoch nur mit Unterbrechungen Cobalamin parenteral in Zeitintervallen von 6-9 Monaten verabreicht bekamen wegen schlechter Befolgung oder als Teil anderer Studien von Cobalaminbedürfnissen. Sie hatten niedrige, im Grenzwert liegende oder normale Serum-Cobalaminwerte, zeigten keine hämatologischen und neurologischen Anomalien und waren asymptomatisch zum Zeitpunkt der Probensammlung. Die Serum-Cobalaminwerte wurden bestimmt durch Benutzung der Lactobacillus leichmannii Methode [siehe z.B. D.M. Matthews, Clin. Science 22:101 (1962)] oder durch eine Zahl von: Radioverdünnungstests unter Benutzung eines gereinigten Eigenfaktors oder Magensäften mit mehr als 95% Cobalaminbindeaktivität wegen eines Eigenfaktors [J.F. Kolhouse, H. Kondo, N.C. Allen, E. Podell und R.H. Allen, N. Eng. J. Med. 299:785-792 (1978)]. Serum-Folat wurde bestimmt mit der Lactobacillus casei Methode [M. Goulian und W.S. Beck, Am. J. Clin. Path. 46:390 (1966)] oder dem Milchbinde-Radioverdünnungstest Rothenberg und andere, N. Eng. J. Med. 286:1335 (1972)]. Alle Proben der Patienten wurden in einer Form kodiert, daß dem Personal, das die Methylmalonsäure- und Bernsteinsäure-Untersuchungen durchführte, die Kategorie, zu der ein Patient gehörte sowie die Anzahl der Patienten in jeder Kategorie unbekannt blieb.
Eine Anzahl Faktoren wurde individuell betrachtet, um mögliche Beziehungen zwischen Methylmalonsäure und Bernsteinsäure festzustellen. Bei Faktoren, die trennend wirkten, wie zum Beispiel Geschlecht, Rasse und Diagnose, wurde der Wilcoxon Zweiprobentest [R.G.D. Steel, und J.H. Torrie, Principles and Procedures of Statistics (McGraw-Hill Book Co. Inc., New York 1960)] benutzt, um die Signifikanz der Beziehungen zu bestimmen. Um die möglichen Beziehungen mit neurologischer Genauigkeit feststellen zu können, wurden die Gruppen 0,1 und 2 (wie in Tabelle 1 definiert) kombiniert und mit den kombinierten Gruppen 3 und 4 verglichen. Faktoren, die sich als kontinuierlich erwiesen, wie zum Beispiel Alter oder mittleres Zellvolumen (MCV) wurden unter Benutzung der Spearman Korrelationskoeffizienten [Steel, supra] untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I angeführt: Tabelle 1 Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Bernsteinsäure ng/ml Serum MMA ng/ml Normale Tabelle 1 (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Bernsteinsäure ng/ml Serum MMA ng/ml Tabelle 1 (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Bernsteinsäure ng/ml Serum MMA ng/ml Tabelle 1 (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Bernsteinsäure ng/ml Serum MMA ng/ml a 4 = schwere fortgeschriettene kombinierte Krankheiten des Organismus; = kombinierte Krankheiten des Organismus oder schwere Funktionsstörung, Ansprechen auf Cobalaminbehandlung (Nummern 2 und 63); 2 = keine neurologischen Symptome aber Beeinträchtigung der Positions- und/oder Bewegungssinne bei der Überprüfung; 1 = Parestesiasis mit negativer neurologischer Bestätigung b IR = ileale Resektion; MJD = multiple jejunale Divertikulose; PA = krankhafte Anämie; PG = Postagastrektomie; TS = tropische Sprue
Die Werte, die für Serum-Methylmalonsäure und Bernsteinsäure für das Standardthema ermittelt wurden, von Patienten aus den verschiedenen Kategorien, zeigt die Abbildung 5. Darin werden die Werte für Serum- Methylmalonsäure (unten) und Serum-Bernsteinsäure (oben) für Patienten mit klinisch bestätigtem Cobalaminmangel, Patienten mit Folatmangel und Patienten, die unregelmäßig auf Cobalaminmangel behandelt wurden und die keine hämatologischen oder neurologischen Anomalien aufweisen, angegeben. Der normale Bereich für Methylmalonsäure ist 19-76 ng/ml und 580-2420 ng/ml für Bernsteinsäure. Die Werte wurden als Mittel ± 2 S.D. nach logarithmischer Transformation um die Verzerrung in Richtung höherer Werte zu korrigieren, berechnet. In der Cobalaminmangel-Gruppe hatten 69 der 73 Patienten Methylmalonsäurewerte, die oberhalb des normalen Bereiches von 19-76 ng/ml liegen. Der höchste Wert war 22300 ng/ml, und der mittlere Wert betrug 1100 ng/ml. Fünf der 16 unter Folatmangel leidenden Patienten hatten eine leichte Erhöhung der Serum-Methylmalonsäure mit einem höchsten Wert von 140 ng/ml. Sieben der 15 Proben der unregelmäßig auf Cobalaminrnangel behandelten Patienten, die keine hämatologishen oder neurologischen Anomalien aufwiesen, hatten erhöhte Werte, die bis zu 175 ng/ml reichten. Bei diesen sieben Proben war die Serum L. Leichmannii Cobalaminkonzentration bei sechs Proben niedrig (88-165 pg/ml) und normal bei einer Probe (275 pg/ml). Beim Radioverdünnungstest unter Benutzung eines gereinigten Eigenfaktors ergaben alle sieben Proben niedrige Cobalaminwerte (85-155 pg/ml). Von den acht Proben mit normalen Methylmalonsäurewerten war der Serum-L.Leichmannii-Cobalaminwert bei vier Proben niedrig.
Erhöhte Werte für Serum-Bernsteinsäure wurden bei 19 der 73 Cobalaminmangel-Patienten, 10 der 16 Folatmangel-Patienten und 8 der 15 unregelmäßig auf Cobalaminmangel behandelten Patienten festgestellt. Der Grund für diese Erhöhungen ist unbekannt, er könnte jedoch damit zusammenhängen, daß das Blut unterschiedlich lange gelagert wurde, bevor das Serum separiert wurde, denn wir haben festgestellt, daß sich die Werte für Bernsteinsäure verdoppeln, wenn das Blut vor dem Zentrifugieren 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagert wird. Die Werte der Serum-Methylmalonsäure ändern sich innerhalb dieser Zeitperiode nicht.
Die klinischen Daten betreffend der 73 Patienten mit Cobalaminmangel sind in Tabelle I aufgeführt. Sie sind in absteigender Reihenfolge mit Rücksicht auf ihre Serum-Methylmalonsäurewerte sortiert. Es besteht eine signifikante Korrelation zwischen Serum-Methylmalonsäure und Serum-Folat (r = 0,46; P < 0,001). Die Korrelation war sowohl in Proben, die mit der L. casei Serum-Folat Methode (r = 0,46; P < 0,01) gemessen wurden, als auch in Proben, die mit der Radiotest-Technik gemessen wurden (r = 0,66; P < 0,001), vorhanden. Patienten mit schwereren neurologischen Anomalien (Gruppen 3 und 4) hatten höhere Serum-Methylmalonsäurewerte (Mittelwert ± S.D, 5077 ± 6073, Median 3685 ng/ml) als Patienten mit milderen Anomalien (Gruppen 1 und 2, Mittelwert 2083 ± 2866, Median 879 ng/ml) oder Patienten ohne beweisbare neurologische Belastungen (Gruppe 0, Mittelwert 1154 ± 1468, Median 409 ng/ml) (P < 0,01 für Gruppen 3 und 4 versus 0-2)
Die Serum-Folatwerte korrelierten mit der Serum- Methylmalonsäure unabhängig vom neurologischen Status (r für Methylmalonsäure versus Folat bei Patienten ohne neurologische Anomalien, 0,58; n = 27; P < 0,01). Die Serum-Folatkonzentrationen waren bei Patienten mit schweren neurologischen Anomalien jedoch höher (mittleres Serum-Folat in den Gruppen 3 und 4, 20,9 ± 16,9 versus 10,1 + 8,7 ng/ml in den Gruppen 0 bis 2, P < 0,005), die Verbindung von erhöhten Serum- Methylmalonsäurewerten mit fortgeschrittenen neurologischen Anomalien scheint unabhängig vom Folatstatus zu sein. Bei Patienten mit Serum-Folatwerten unter 15 ng/ml, betrug die mittlere Serum- Methylmalonsäure in den Gruppen 3 und 4 3198 ± 2317 ng/ml versus 1030 ± 1795 ng/ml in den Gruppen 0 bis 2 (P < 0,005); die Serum-Folate unterschieden sich nicht wesentlich zwischen den beiden Untergruppen (7,5 ± 3,3 versus 6,0 ± 3,8 ng/ml, in dieser Reihenfolge, P < 0,25).
Es war eine negative Korrelation zwischen der Plättchenzahl und den Serum-Methylmalonsäurewerten (r = -0,20; P < 0,05) zu verzeichnen. Diese Korrelation ist jedoch nicht weiter signifikant, wenn die Patienten mit schwereren neurologischen Anomalien (Gruppen 3 und 4) von der Analyse ausgenommen werden (r = -0,26; P > ,0,05) oder wenn die Patienten mit erhöhtem Serum-Folat ausgelassen werden (r = -0,23; P > 0,05). Patienten mit krankhafter Anämie hatten höhere Werte für Methylmalonsäure (Mittel, 2968 ± 4387 ng/ml) als Patienten mit tropischer Sprue (714 ± 1007, P < 0,004 unter Benutzung des Mann-Whitney-Tests [Steel, supra]; die Differenz war jedoch nicht länger signifikant, wenn die Werte unter Berücksichtigung der generell geringeren Serum-Folatwerte und kleineren neurologischen Anomalien bei Patienten mit tropischer Sprue korrigiert wurden. Patienten mit Glossitis hatten höhere Serum- Methylmalonsäurewerte als Patienten ohne Zungenentzündungen oder Symptome; 13 der 18 Patienten mit Glossitis mit Serumwerten der Methylmalonsäure oberhalb dem Mittel der gesamten Gruppe von 73 Patienten hatten schwere neurologische Anomalien, erhöhte Serum- Folatwerte oder beides.
Die Serum-Methylmalonsäure korrelierte nicht mit dem Serum-Cobalamin (r = -0,09 aller Patienten; r = 0,12 bei mikrobiologischen Proben und r = -0,09 bei Radioproben, P > 0,4 in jedem Fall). Die Serum- Methylmalonsäure korrelierte nicht signifikant mit dem MCV (r = 0,7, P > 0,05), weißen Blutkörperchen (r = -0,08; P > 0,3) oder dem Hämatokrit (r = -0,12; P > 0,4). Alle 12 Patienten mit normalem Hämatokrit hatten erhöhte Serum-Methylmalonsäurewerte (Bereich 116-4800 ng/ml) . Es existierte keine Korrelation zwischen Serum-Methylmalonsäure, Alter, Geschlecht, Rasse, Häufigkeit der Symptome, Gewichtserhöhung oder -verlust, den Eisenwerten des Serums, der Laktatdehydrogenase (LDH), dem Bilirubin oder Albumin.
Vier Patienten mit unbehandeltem Cobalaminmangel (Zahlen 70-73, Tabelle I) hatten Serum-Methylmalonsäurewerte im normalen Bereich. Drei Patienten hatten tropische Sprue. Einer der vier Patienten hatte beeinträchtigte Propriozeptoren und zitternde Sinne ohne neurologische Symptome. Es gab keine klinischen oder laboratorischen Merkmale, die diese Patienten von denen mit erhöhten Serum-Methylmalonsäurewerten trennen.
Die Werte für Serum-Bernsteinsäure korrelierten mit keinem der untersuchten Parameter inklusive der Serum- Methylmalonsäure, und signifikante Unterschiede zwischen den Verschiedenen Untergruppen konnten nicht beobachtet werden.
Abbildung 6 zeigt aufeinanderfolgende Werte von Serum- (--.--) und Urin- (--o--) Methylmalonsäure bei einem Patienten mit klassischer krankhafter Anämie, beginnend zum Zeitpunkt der Diagnose und fortlaufend über die ersten 13 Tage nach der parenteralen Verabreichung von Cobalamin. Der Patient war ein 32 Jahre alter weißer Mann mit Panzytopenie makroblastischen Knochenmarksabstrich-Befunden, einem Serum-Cobalaminwert von 43 pg/ml, nichtkörpereigenen Serumantikörpern mit faktorblockierender Eigenschaft und einem abweichenden Schilling-Test mit einem exogenen Eigenfaktor. Beide Werte waren vor der Behandlung markant erhöht, und beide Werte lagen nur noch knapp über der Obergrenze des normalen Bereiches nach dem 13 Tag. Das deutet darauf hin, daß Messungen von Serum- und Urin-Methylmalonsäure gut mit anderen diagnostischen Tests auf Cobalaminmangel korrelieren, es muß jedoch noch eine große Zahl weiterer Patienten untersucht werden, um diesen Schluß mit Sicherheit zuzulassen.
Tabelle II enthält die Daten einer 95 Jahre alten weißen Frau, bei der erhöhte Serum-Methylmalonsäurewerte niedrigen Serum-Cobalaminwerten vorausgingen: Tabelle II normal Serum Cobalamin (pg/ml)a Serum Folat antieigenfaktorblockierende Antikörper Serum Methylmalonsäure (ng/ml) Urin Methylmalonsäure (ng/mg Kreatinin) nicht vorhanden vorhanden b keine Probe * Der Patient bekam monatliche intramuskuläre Injektionen von 1 mg CN-Cobalamin ab dem 23.08.1983, nachdem das Serum und der Urin entnommen wurden. b Radioverdünnungstest unter Benutzung eines gereinigten Eigenfaktors (> 95 %) als Cobalmin- Bindeprotein a Diese Werte wurden mit den Serumproben, die am 30.09.1982 entnommen und Anfang August 1983 getestet wurden, ermittelt
Im September 1982 war sie asymptomatisch, hatte jedoch ein MCV von 105, was dazu führte, daß die Cobalamin- und Folattests normale Werte ergaben. Das Serum wurde für ein Jahr gelagert, während der Serum- Methylmalonsäuretest entwickelt wurde, und lieferte erhöhte Werte von 269 ng/ml als es schließlich im August 1983 getestet wurde. Wiederholte Tests auf Serum-Cobalamin und Serum-Folat im August 1983 mit der Probe vom August 1983 auf Serum-Cobalamin und Serum-Folat waren wieder normal und nichtkörpereigene Serumantikörper mit faktorblockierender Eigenschaft wurden getestet und gefunden. Im August 1983 wurde die Patientin in die Klinik zurückgerufen, und der MCV- Zustand wurde als im Wesentlichen unverändert festgestellt. Die Serum-Methylmalonsäurewerte waren weiterhin erhöht auf 228 ng/ml und im Urin war die Methylmalonsäure ebenfalls erhöht, der Serum- Cobalaminwert war jedoch nicht deutlich herabgesetzt. Drei Wochen, nachdem eine Injektion mit Cobalamin verabreicht wurde, waren die Serum- und Urin- Methylmalonsäurewerte bin in den normalen Bereich gefallen, und die Überprüfung des MCV nach einem weiteren Jahr ergab 94. Eine hochgradig ungesättigte Cobalamin-Bindekapazität ist eine unwahrscheinliche Erklärung bei dieser Patientin, denn die Anzahl der weißen Blutzellen war niemals (September 1982 bis Mitte 1986) erhöht, und ihre ungesättigte Cobalamin-Bindekapazität war kurz vor der Behandlung mit Cobalamin (23 August 1983) normal (2,1 ng/ml). Unglücklicherweise wurde die Cobalamin-Bindekapazität nicht im Serum vom September 1982 gemessen.
Unsere Untersuchungen belegen, daß der Test von Methylmalonsäure im Serum nützliche Informationen bei Patienten mit Cobalaminmangel liefert. Die Tatsache, daß der Serum-Methylmalonsäurewert bei 69 von 73 Patienten mit klinisch bestätigtem Cobalaminmangel erhöht war und bei 7 von 15 Proben einer Gruppe von auf Cobalaminmangel unregelmäßig behandelten Personen, die frei von hämatologischen oder neurologischen Anomalien waren, lassen den Schluß zu, daß seine Empfindlichkeit der der Serum-Cobalaminwerte ähnelt, obwohl noch Untersuchungen bei Patienten mit grenzwertigen oder niedrig-normalen Cobalaminwerten durchgeführt werden müssen, bevor ein vollständiger Vergleich der beiden Tests vorgenommen werden kann. Die Tatsache, daß wir einen Patienten beobachtet haben, bei dem eine moderate Erhöhung der Serum-Methylmalonsäurewerte der Entwicklung niedriger Serum-Cobalaminwerte vorausging, läßt vermuten, daß die Serum-Methylmalonsäurewerte bei einigen Patienten einen Cobalaminmangel besser erkennen lassen, als die Serum- Cobalaminwerte. Folglich ist es wahrscheinlich, daß die Serum-Methylmalonsäuretests und die Serum-Cobalamintests sich gegenseitig ergänzen, und daß die Anwendung beider Tests zusammen es ermöglichen, daß echte Auftreten eines Cobalaminmangels bei den verschiedensten Patiententypen genauer festzustellen, als mit einem der beiden Tests alleine. Die Genauigkeit der Serum-Methylmalonsäuretests für den Nachweis von Cobalaminmangel erweist sich bei Patienten ohne klinisch belegten Mangel oder bei Patienten mit einer zugrundeliegenden Bedingung, die das Cobalamingleichgewicht stört, als größer als die Serum- Cobalaminwerte. Der Test erweist sich auch als nützlich bei Patienten mit makroblastischer Anämie, bei denen die Serum-Werte von sowohl Cobalamin als auch Folat unter normal liegen.
Der Serum-Methylmalonsäurewert hat einen Vorteil, den der Serum-Cobalaminwert nicht hat, und der darin liegt, daß man einen Patienten, bei dem ein Cobalaminmangel vermutet wird, mit Cobalamin behandeln und den resultierenden Effekt auf die Serum- Methylmalonsäurewerte beobachten kann. Wenn eine solche Behandlung darin resultiert, daß die Serum- Methylmalonsäurewerte vom erhöhten in den normalen Bereich sinken, ist das ein sehr naheliegender Beweis dafür, daß der Patient unter Cobalaminmangel leidet, wie das bei dem Patienten war, der ausführlich in diesem Bericht beschrieben wurde. Diesen Vorteil weist der Serum-Cobalaminwert nicht auf, denn die Serum- Cobalaminwerte sind nach der parenteralen Verabreichung von Cobalamin essentiell entweder erhöht oder mindestens normal, unabhängig davon, ob der Patient unter Cobalaminmangel leidet oder nicht.
Eine leichte jedoch erkennbare Erhöhung der Serum- Methylmalonsäure konnte bei 5 von 16 Patienten, die unter Folatmangel litten, jedoch normale Serum- Cobalaminwerte hatten, festgestellt werden. Zwei der fünf Patienten hatten Hepatomegalie und/oder anormale Leberfunktionstests und drei hatten keine beweisbare Leberstörung. Untersuchungen unter Einbeziehung von Messungen der urinären Methylmalonsäure haben ebenfalls leicht erhöhte Werte bei Patienten mit Folatmangel gezeigt, es ist jedoch nicht bekannt, ob das an einem leichten zufälligen Cobalaminmangel liegt oder an anderen unbekannten Ursachen. Jüngst durchgeführte Untersuchungen zeigten, daß die Menge an Cobalamin in verschiedenen Gewebetypen unzureichend ist, um beide cobalaminabhängigen Enzyme zu sättigen. Es ist möglich, daß bei einem Folatmangel der Versuch unternommen wird, den Wert der Methioninsyntheaseaktivität zu erhöhen, indem die Menge des Cobalamins, das an Methioninsyntease gebunden ist erhöht wird, mit dem Resultat, daß die Menge an Cobalamin, das an L-Methylmalonyl-CoA-Mutase gebunden ist, verringert wird, und daß dies in einer erhöhten Bildung der Methylmalonsäure resultiert (siehe Figur 1).
Die Werte der Serum-Methylmalonsäure korrelierten nicht mit den Werten des Serum-Cobalamins in der Gruppe der Patienten, die unter Cobalaminmangel litten. Eine Korrelation zwischen den Cobalaminwerten und den Werten den Urin-Methylmalonsäure wurde vormals bei einigen Untersuchungen beobachtet bei einigen anderen jedoch nicht. Das Versagen beim Finden von Korrelationen zwischen Serum-Methylmalonsäurewerten und irgend einem der hämatologischen Parameter, abgesehen von einer kleinen umgekehrten Korrelation bei der Plättchenanzahl, steht in Übereinstimmung mit Untersuchungen, die sich mit den Werten der urinären Methylmalonsäure beschäftigen.
Frühere Arbeiter, die eine kleine Zahl von Patienten mit neurologischen Anomalien untersucht haben, haben keine Korrelation mit Urinwerten der Methylmalonsäure gefunden oder eine mögliche Beziehung vorgeschlagen. Die positive Korrelation zwischen Serum- Methylmalonsäurewerten und dem Vorhandensein von neurologischen Anomalien bei unserer großen Serien von Patienten ist interessant, denn der biochemische Mechanismus, der für die neurologischen Anomalien bei Cobalaminmangel zuständig ist, ist immernoch unbekannt. Die positive Korrelation zwichen Serum-Folatwerten und Serum-Methylmalonsäurewerten wurde ebenfalls nicht bei Untersuchungen der urinären Methylmalonsäurewerte festgestellt. Diese Korrelation könnte zurückzuführen sein auf die Tatsache, daß Patienten, die eine relativ folathaltige Diät zu sich nehmen, weniger hämatologische Anomalien aufweisen, möglicherweise resultierend in einer Verzögerung einer Diagnose von Cobalaminmangel. Die Tatsache, daß die Werte für Serum-Folat nicht positiv mit irgend einem der hämatologischen Parameter korrelierten, macht dies jedoch unwahrscheinlich. Es ist auch möglich, daß einige unbekannte Stoffwechsel- oder Regulationsbeziehungen zwischen L-Methylmalonyl-CoA- Mutase und Metioninsynthease existieren, zusätzlich zu der Tatsache, daß beide Cobalamin für ihre Aktivität benötigen.
Die Angaben in der Tabelle I zeigen, daß viele der Patienten mit Cobalaminmangel keine oder nur moderate Anämie haben, nicht oder nur moderat makrozytisch sind und keine markant verringerten Serum-Cobalaminwerte unterhalb von 100 pg/ml aufweisen. Diese Beobachtungen stehen nicht in Übereinstimmung mit dem derzeitigen Glauben und der Lehrmeinung der Experten im medizinischen Bereich (siehe oben) und wird am Ende des nächsten Beispiels näher erörtert.

Beispiel VI

Anwendung des Tests für Homocystein allein oder des kombinierten Homocystein-Methylmalonsauretests bei der Diagnose und Unterscheidung von Cobalarnin- und Folatmangel

Es wurden Serumproben von 78 Patienten mit bestätigtem Cobalaminmangel und 19 Patienten mit bestätigtem Folatmangel auf Serum-Cobalamin und Serum- Folat getestet, wie im Beispiel V beschrieben, auf Serum-Methylmalonsäure, wie im Beispiel IV beschrieben und auf Serum-Methionin, Serum-Cystein und Serum- Homocystein, wie im Beispiel II beschrieben. Die Resultate sind in der Tabelle III angegeben. Tabelle 1II Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Serum MMA ng/ml Serum Met umol/L Bernstein-Gesamt-Cys umol/L Serum Gesamt-Hcys umol/L Normale Cobalaminmangel Tabelle 1II (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Serum MMA ng/ml Serum Met umol/L Bernstein-Gesamt-Cys umol/L Serum Gesamt-Hcys umol/L Tabelle 1II (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Serum MMA ng/ml Serum Met umol/L Bernstein-Gesamt-Cys umol/L Serum Gesamt-Hcys umol/L Tabelle 1II (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Serum MMA ng/ml Serum Met umol/L Bernstein-Gesamt-Cys umol/L Serum Gesamt-Hcys umol/L Folatmangel Tabelle 1II (Fortsetzung) Patient Alter Serum Cbl pg/ml Serum Folat ng/ml Neuroanomalien a Diagnose b Serum MMA ng/ml Serum Met umol/L Bernstein-Gesamt-Cys umol/L Serum Gesamt-Hcys umol/L a 4 = schwere fortgeschriettene kombinierte Krankheiten des Organismus; 3 = kombinierte Krankheiten des Organismus oder schwere zerebrale Funktionsstörungen, Ansprechen auf Cobalaminbehandlung; 2 = keine neurologischen Symptome aber Beeinträchtigung der Positions- und/oder Bewegungssinne bei der Überprüfung; 1 = Parestesiasis mit negativer neurologischer Bestätigung; PN = Periphäre Neuropatie verbunden mit Alkoholismus b IR = ileale Resektion; MJD = multiple jejunale Divertikulose; PA = krankhafte Anämie; PG = Postgastrektomie; TS = tropische Sprue; ALC, P = Alkoholismus in Verbindung mit schlechter Ernährung; PD = schlechte Ernährung * empfängt Folsäure
Einige, aber nicht alle der in Tabelle III angeführten Patienten sind auch in Tabelle I gezeigt. Das Serum-Homocystein war erhöht (normal 7-22 umol/L) bei 77/78 (99%) der Patienten mit Cobalaminmangen und bei 18/19 (95%) der Patienten mit Folatmangel. Bei den Patienten mit Cobalaminmangel war die Serum- Methylmalonsäure (normal 19-76 pg/ml) bei 74/78 (95%) erhöht. Bei 3 Patienten mit Cobalaminmangel, bei denen die Serum-Methylmalonsäurewerte normal waren, war das Serum-Gesamthomocystein erhöht (im Bereich 34-93 umol/L), und bei nur einem Patienten waren sowohl die Serum-Methylmalonsäurewerte als auch die Serum-Gesamthomocysteinwerte in ihrem jeweiligen Bereich. Bei den Patienten mit Folatmangel hatten 5/19 (26%) eine leichte Erhöhung der Serum-Methylmalonsäure (Bereich 92-195 ng/ml). Die Serum-Methioninwerte waren bei der Diagnose von Cobalamin- oder Folatmangel nicht hilfreich, da nur 2/78 (3%) der Patienten mit Cobalaminmangel und keiner der Patienten mit Folatmangel niedrige Werte (normaler Bereich 14-44 umol/L) aufwiesen. Weiterhin waren die Werte für Serum-Gesamtcystein diagnostisch nicht hilfreich, weil nur 6/78 (8%) der Patienten mit Cobalaminmangel einen leicht erhöhten und nur 1/19 (5%) der Patienten mit Folatmangel einen erhöhten Wert (normaler Bereich 174-378 umol/L) hatten.
Wie aus Tabelle III hervorgeht, hatten nur 32/78 (41%) der Patienten eine mäßig starke Anämie (Hct < 25%), 28/78 (36%) hatten eine mäßige Anämie (25-24% waren weiblich und 25-39% waren männlich), und 18/78 (23%) hatten überhaupt keine Anämie. Nur 45/78 (58%) hatten ein ausgeprägt erhöhtes MCV (> 110 fl), 24/78 (31%) hatten ein leicht erhöhtes MCV (101-110 fl), und 9/78 (11%) hatten ein normales MCV (80-100 fl). Die Serum-Cobalaminwerte waren bei nur 48/78 (62%) der Patienten deutlich gesenkt (< 100 pg/ml) bei 20/78 (38%) der Patienten waren sie nur mäßig gesenkt (100-200 pg/ml). Daraus folgt, daß das Spektrum der Befunde bei Cobalaminmangel sehr viel ausgedehnter ist, als vormals angenommen wurde, und daß man sich nicht darauf verlassen kann, daß die Befunde einer gemäßigt starken Anämie, einen ausgeprägt niedrigen Cobalaminwert und ein ausgeprägt erhöhtes MCV ausreichen, um eine Diagnose zu stellen zu können. Wie dem auch sein, durch die Messung des Serum-Gesamthomocysteins allein oder in Verbindung mit der Serum-Methylmalonsäure bei diesen Patienten kann man eine Diagnose auf Cobalaminmangel aufstellen, selbst wenn sie sie verbunden ist mit leichten oder nicht vorhandenen Anomalien beim Hct, MCV oder den Serum- Cobalaminwerten. Die Messung anderer Aminosäuren wie Serum-Methionin oder Gesamtcystein erwies sich bei Cobalaminmangel als diagnostisch nicht sinnvoll, obwohl vormals die Lehrmeinung vertreten wurde, daß die Serum- Methioninwerte bei Patienten mit Cobalaminmangel niedrig sind [siehe z.B. T.E. Parry, Brit. J. Haemat. 16:221 (1969)].

Beispiel VII

Bestätigung der Diagnose von Cobalaminmangel bei Patienten mit neurologischen Anomalien und leichten oder keinen hämatologischen Befunden unter Benutzung des Tests auf Homocystein oder den kombinierten Homocystein- Methylmalonsäure-Test

Es wurde davon ausgegangen, daß neurologische Anomalien späte Symptome eines Cobalaminmangels sind, und daß sie nur selten auftreten, wenn weder Anämie noch Makrozytose vorhanden sind. Um diesen Gedanken zu überprüfen, haben wir 143 aufeinanderfolgende Patienten mit neurologischen Anomalien in Bezug auf Cobalaminmangel getestet. Wir haben herausgefunden, daß bei 42 (29%) dieser Patienten das Hämatokrit (35/42) oder MCV (26/42) oder beides (19/42) normal waren. Andere hämatologische Werte waren, sofern sie gemessen wurden, ebenfalls für gewöhnlich normal: WBC (42/42), Plättchen (40/42), LDH (25/38) und Bilirubin (30/31) Bei diesen 42 Patienten enthielten die neurologischen Anomalien distale sensorische Defekte (35), Parästhesie (29), Ataxie (21), Gedächtnisverlust (12), Persöhnlichkeitswandlung (4), spastische Paraparese (3), Halluzinationen (2), Stuhlinkontinenz (2), herabgesetzte Sensibilität (2), optische Atropie (1) und Selbstmord (1). Die Serum-Cobalaminwerte (normal = 200- 1000 pg/ml) variierten beträchtlich wie folgt: < 50 pg/ml (6); 50-100 pg/ml (19), 100-150 pg/ml (12); 150- 200 pg/ml (3); und 200-250 pg/ml (2). Die Diagnose Cobalaminmangel wurde bei allen 42 Patienten durch folgende Tatsachen belegt: eine eindeutige Erhöhung der Serum-Methylmalonsäure (MMA) auf > 150 ng/ml, gemessen nach dem Verfahren aus Beispiel IV, normal = 18-76 ng/ml, (36/38); eine eindeutige Erhöhung des Serum-Homocysteins (Hcys) auf > 30 umol/L, gemessen nach dem Verfahren aus Beispiel III, normal = 7-22 umol/L, (37/38); eine deutliche Verminderung der Serum- Methylmalonsäure (28/28) und des Serum-Homocysteins (27/28) nach einer Cobalaminbehandlung; eine Verminderung auf 5 fl oder weniger beim MCV nach einer Cobalaminbehandlung (29/35) inklusive der meisten Patienten (13/16), bei denen das MCV vor der Cobalaminbehandlung nicht erhöht war; und eine Verbesserung der neurologischen Anomalien nach einer Cobalaminbehandlung (39/39).
Wie aus dem obigen ersichtlich ist, hatten nur 108 (76%) der 143 aufeinanderfolgende Patienten mit neurologischen Anomalien wegen eines Cobalaminmangels Anämie (Hct < 35 bei Männern, < 40 bei Frauen) und 35/143 (24%) waren überhaupt nicht anämisch. Bei 26 (18%) dieser 143 Patienten war das MCV normal und bei 19/143 (13%) waren sowohl Hämatokrit als auch MCV normal. Bei jenem Teil der 42 Patienten, bei denen entweder das Hämatokrit normal war oder das MCV normal war oder beides, hatten nur 5/42 (12%) eine deutliche Erhöhung des MCV (> 110 fl), 11/42 (26%) hatten ein leicht erhöhtes MCV (101-110 fl) und 26/42 (62%) hatten ein normales MCV (80-100 fl). Die Serumwerte des Cobalamins waren bei nur 24/42 (57%) der Patienten deutlich vermindert (< 100 pg/ml) und bei 16/42 (38%) gering vermindert (100-200 pg/ml). Daraus folgt, daß bei den Patienten mit neurologischen Anomalien, die von einem Cobalaminmangel herrühren, das Spektrum der hämatologischen Anomalien sehr viel breiter ist, als vormals angenommen, und daß man sich nicht auf Befunde einer gemäßigt schweren Anämie, ein deutlich erhöhtes MCV und einen deutlich gesenkten Serum-Cobalaminwert stüzen kann, um eine Diagnose auf Cobalaminmangel zu erstellen. Wie dem auch sein mag, durch Messung des Serum-Gesamthomocysteins allein oder in Kombination mit der Serum-Methylmalonsäure, bei diesen Patienten kann die Diagnose eines Cobalaminmangels auch bei Patienten mit leichten Anomalien beim Homocystein, MCV und Serum- Cobalaminwert gesichert werden. Durch zusätzliche Beobachtung der fallenden Werte des Serum-Gesamthomocysteins und der Serum-Methylmalonsäure kann die Diagnose eines Cobalaminmangels und der Erfolg einer Behandlung mit Cobalamin bestätigt werden.
Wir kommen zu folgendem Schluß: 1) neurologische Aflomalien auf der Basis eines Cobalaminmangels treten für gewöhnlich ohne Anämie oder ein erhöhtes MCV auf; 2) Messungen der Serum-Methylmalonsäure, des Serum-Homocysteins und des MCV und Veränderungen der Serum- Methylmalonsäure, des Serum-Homocysteins und des MCV nach Verabreichung von Cobalamin sind hilfreich, um einen Cobalaminmangel bei Patienten festzustellen; 3) alle Patienten mit unerklärbaren neurologischen Anomalien sollten auf Cobalaminmangel untersucht werden, selbst wenn weder Anämie noch Makrozytose noch andere hämatologische Anomalien vorhanden sind; und 4) das klinische Spektrum eines Cobalaminmangels ist breiter, als vormals angenommen und kann bei Patienten mit neurologischen Krankheiten, die weder Anämie, noch ein erhöhtes MCV aufweisen, neben dem Cobalaminmangel, der durch einen Fall der erhöhten Serum- Gesamthomocysteinwerte oder Serum-Methylmalonsäurewerte nach einer Behandlung bestätigt wird, gesehen werden.

Claims

1. Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit einer oder mehrerer verschiedener Sulfhydrylaminosäure-Arten in einer Probe, wobei dieses Verfahren umfaßt:

(a) Kombinieren der gegebenen Probe mit einem internen Referenzstandard mit einer bekannten Menge jeder der zu testenden Sulfhydrylaminosäure-Arten, gekennzeichnet mit einem stabilen Isotopenmarkierer;

(b) Addieren einer ausreichenden Menge eines Reduktionsrnittels, das zur Spaltung von Disulfidbrücken ohne Zerstörung des Molekülrests in der Lage ist, um alle vorhandenen Sulfhydrylaminosäuren wenigstens anfangs in freie Säuren umzuwandeln, wodurch die zufällige Verteilung der gekennzeichneten und nicht-gekennzeichneten Sulfhydrylaminosäuren sichergestellt wird;

(c) Messen der Menge der für jede Art vorhandenen gekennzeichneten und nicht-gekennzeichneten Sulfhydrylaminosäure mit einem Massenspektrometer;

(d) Berechnen des Verhältnisses von für jede Art vorhandener gekennzeichneter zu nicht-gekennzeichneter Sulfhydrylaminosäure; und

(d) Ableiten der Menge der für jede Art in der besagten gegebenen Probe vorhandenen nicht-gekennzeichneten Sulfhydrylaminosäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte gekennzeichnete und nicht-gekennzeichnete Sulfhydrylaminosäuren nach Schritt (b) und vor Schritt (c) in geeignete Derivate umgewandelt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei besagte Derivate Silylderivate sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei besagte Silylderivate durch Versetzen der besagten Aminosäuren mit N- Methyl-N-(t-Butyldimethylsilyl)-Trifluor-Azetamid erhalten werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagte gegebene Probe ein Körpergewebe eine Warmbluttiers enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, umfassend den zusätzlichen Schritt der partiellen Reinigung der Sulfhydryl enthaltenden Aminosäure nach Schritt (b) und vor Schritt (c).

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei besagte Sulfhydryl enthaltende Aminosäure Homocystein ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei besagter interner Referenzstandard eine bekannte Menge von deuteriertem Homocystein enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, umfassend den zusätzlichen Schritt der partiellen Reinigung des Homocysteins nach Schritt (b) und vor Schritt (c).

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend den zusätzlichen Schritt des gleichzeitigen Testens auf eine oder mehrere Nicht-Sulfhydrylaminosäuren durch Liefern eines geeigneten internen Referenzstandards für Nicht-Sulfhydrylaminosäuren in Schritt (a), Messen der Menge von vorhandenen gekennzeichneten und nicht-gekennzeichneten Nicht-Sulfhydrylaminosäuren mit einem Massenspektrometer in Schritt (c), Berechnen des Verhältnisses des Standards zu allen vorhandenen nicht-gekennzeichneten Nicht- Sulfhydrylaminosäuren in Schritt (d) und Ableiten der Menge der in der besagten gegebenen Probe vorhandenen nicht-gekennzeichneten Nicht-Sulfhydrylaminosäure in Schritt (e).

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei besagte Nicht- Sulfhydrylaminosäure Methionin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, wobei besagter interner Referenzstandard für Nicht-Sulfhydrylaminosäure in Schritt (a) Norleucin ist.

13. Verfahren zum Erfassen eines Mangels an Cobalamin oder Folat in Warmbluttieren durch Testen der Körperflüssigkeiten auf die Anwesenheit von erhöhten Niveaus von Homocystein entsprechend dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9.

14. Verfahren zum Erfassen eines Mangels an Cobalamin und/oder Folat in Warmbluttieren und zum Unterscheiden zwischen diesen durch Testen der Körperflüssigkeiten auf die Anwesenheit von erhöhten Niveaus von Gesamt- Homocystein und Methylmalonsäure, wobei der Test auf Gesamt-Homocystein entsprechend dem Verfahren nach einein der Ansprüche 7 bis 9 durchgeführt wird und wobei normale Niveaus von Gesamt-Homocystein keinen Mangel an Cobalamin oder folischer Säure anzeigen, erhöhte Niveaus von Gesamt-Homocystein und Methylmalonsäure einen Mangel an Cobalamin anzeigen und erhöhte Niveaus von Gesamt-Homocystein kombiniert mit normalen Niveaus von Methylmalonsäure einen Mangel an folischer Säure anzeigen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Methylmalonsäure mit folgendem Prozeß getestet wird:

(a) Kombinieren einer Gewebeprobe mit einem internen Referenzstandard mit einer bekannten Menge von mit einem stabilen isotopenmarkierer gekennzeichneter Methylmalonsäure;

(b) Messen der Menge der vorhandenen gekennzeichneten und nicht-gekennzeichneten Methylmalonsäure mit einem Massenspektrometer;

(c) Berechnen des Verhältnisses von gekennzeichneter zu nicht-gekennzeichneter Methylmalonsäure; und

(c) Ableiten der Menge der in der besagten gegebenen Probe vorhandenen nicht-gekennzeichneten Methylmalonsäure.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei besagte gekennzeichnete und nicht-gekennzeichnete Methylmalonsäure nach Schritt (a) und vor Schritt (b) in geeignete Derivate umgewandelt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei besagte Derivate Silylderivate sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei besagte Silylderivate durch Versetzen der besagten Methylmalonsäure mit N-Methyl-N-(t-Butyldimethylsilyl)-Trifluor-Azteamid erhalten werden.

19. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei besagter Referenzstandard in Schritt (a) eine bekannte Menge von deuterierter Methylmalonsäure enthält.

20. Verfahren nach Anspruch 18, umfassend den zusätzlichen Schritt der partiellen Reinigung der Methylmalonsäure nach Schritt (a) und vor Schritt (b).