JP2579434B2 - コバラミンおよび葉酸の欠乏を検出および区別する方法 - Google Patents
コバラミンおよび葉酸の欠乏を検出および区別する方法Info
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Description
【0001】本発明に導いた研究は、米国政府からの許
可によって部分的に資金を提供された。本発明は、試料
中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を定量する方法、例
えば、温血動物からの体の組織の試料中の合計のホモシ
ステインの濃度を定量する方法、および前記温血動物が
コバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、またはそれらの両者を
有するかどうかを決定する方法に関する。
可によって部分的に資金を提供された。本発明は、試料
中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を定量する方法、例
えば、温血動物からの体の組織の試料中の合計のホモシ
ステインの濃度を定量する方法、および前記温血動物が
コバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、またはそれらの両者を
有するかどうかを決定する方法に関する。
【0002】スルフヒドリルアミノ酸類は、次に示すよ
うな通路の複雑な組に従って代謝される。
うな通路の複雑な組に従って代謝される。
【0003】
【化1】
【0004】理解できるように、メチオニンシンセター
ゼによりホモシステインをメチル化してメチオニンを生
成することは、メチルコバラミン(Me−Cbl)、ま
た、メチル−B12としても知られている、を必要とす
る。メチル基はN5 −メチルテトラヒドロフォレート
(N5 −MTHF)によって共与され、後者はテトラヒ
ドロフォレート(THF)に転化される。メチルマロニ
ル−CoAムターゼを介するメチルマロニル−CoAの
スクシニル−CoAへの転化は、アデノシル−コバラミ
ン、またコファクターとして知られたアデノシル−
B12、を必要とする。こうしてコバラミンおよび葉酸は
スルフヒドリルの代謝において極めて重要なコファクタ
ーであるが、葉酸でなくコバラミンはメチルマロニル−
CoAの代謝において極めて重要なコファクターであ
る。
ゼによりホモシステインをメチル化してメチオニンを生
成することは、メチルコバラミン(Me−Cbl)、ま
た、メチル−B12としても知られている、を必要とす
る。メチル基はN5 −メチルテトラヒドロフォレート
(N5 −MTHF)によって共与され、後者はテトラヒ
ドロフォレート(THF)に転化される。メチルマロニ
ル−CoAムターゼを介するメチルマロニル−CoAの
スクシニル−CoAへの転化は、アデノシル−コバラミ
ン、またコファクターとして知られたアデノシル−
B12、を必要とする。こうしてコバラミンおよび葉酸は
スルフヒドリルの代謝において極めて重要なコファクタ
ーであるが、葉酸でなくコバラミンはメチルマロニル−
CoAの代謝において極めて重要なコファクターであ
る。
【0005】温血動物におけるコバラミンおよび葉酸の
欠乏の精確な初期の診断は、これらの欠乏が、それぞ
れ、コバラミンまたは葉酸の処置によって完全に逆転す
る、生命に危険を及ぼす血液学的異常に導きうるので、
重要である。コバラミンの欠乏は、また、無能および生
命を脅かす神経精神病学的異常に導くことがあるので、
コバラミンの欠乏の精確な初期の診断はことに重要であ
る;外因性のコバラミンの投与は、常に、これらの異常
の進行を停止し、ほとんど常に症候の有意の改良に導
き、そして頻繁にそれらの完全な修正に導く。コバラミ
ンの欠乏および葉酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常
に導くので、それらの区別はしばしば困難である;適切
なビタミンの使用は血液学的異常を大きく改良し、そし
て、より重要なことには、コバラミンのみが、コバラミ
ンの欠乏においてのみ見られる、神経精神病学的異常を
補正するので、区別は重要である。コバラミンの欠乏を
処置するための葉酸の使用は極めて危険である。なぜな
ら、血液学的異常があるもの、あるいはすべては改良さ
れるが、血液学的異常は改良されず、進行することがあ
り、あるいは沈降することさえあるからである。
欠乏の精確な初期の診断は、これらの欠乏が、それぞ
れ、コバラミンまたは葉酸の処置によって完全に逆転す
る、生命に危険を及ぼす血液学的異常に導きうるので、
重要である。コバラミンの欠乏は、また、無能および生
命を脅かす神経精神病学的異常に導くことがあるので、
コバラミンの欠乏の精確な初期の診断はことに重要であ
る;外因性のコバラミンの投与は、常に、これらの異常
の進行を停止し、ほとんど常に症候の有意の改良に導
き、そして頻繁にそれらの完全な修正に導く。コバラミ
ンの欠乏および葉酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常
に導くので、それらの区別はしばしば困難である;適切
なビタミンの使用は血液学的異常を大きく改良し、そし
て、より重要なことには、コバラミンのみが、コバラミ
ンの欠乏においてのみ見られる、神経精神病学的異常を
補正するので、区別は重要である。コバラミンの欠乏を
処置するための葉酸の使用は極めて危険である。なぜな
ら、血液学的異常があるもの、あるいはすべては改良さ
れるが、血液学的異常は改良されず、進行することがあ
り、あるいは沈降することさえあるからである。
【0006】先導医学教科書中の章および先導医学雑誌
中の論文が教示するように、コバラミンの欠乏は有意の
貧血(すなわち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの
減少)を有する個体(赤血球はマクロクリットである、
すなわち、平均細胞体積(MCV)が一般に>100fl
である)において、あるいは末梢神経病および/または
失調症から成る神経学的異常を有する個体において、疑
いが持たれる。多くのこのような教科書の章または雑誌
の論文が、さらに、述べているように、貧血は典型的に
は重度であり、すなわち、ヘモグロビン≦8g%、ヘマ
トクリット<25%であり、そして赤血球の大きさはレ
ベル>110まで大きく増加する。〔参照、Babior, B.
M.およびH.F.Bunn, Harrison's Principles of Interna
l Medicine (R.G.Petersdorf, R.F.Adams, E.Braunwal
d, K.J.Isselbacher, J.B.MartinおよびJ.D.Wilson編)
(McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.1853−
1860;Lee, G.R. および H.J.Gardner, Textbook of Fa
mily Practice, 3rd E d.(R.E.Rakel編) (W.B.Saunders
& Co., Philadelphia, 1984), pp.1082−1091〕。
中の論文が教示するように、コバラミンの欠乏は有意の
貧血(すなわち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの
減少)を有する個体(赤血球はマクロクリットである、
すなわち、平均細胞体積(MCV)が一般に>100fl
である)において、あるいは末梢神経病および/または
失調症から成る神経学的異常を有する個体において、疑
いが持たれる。多くのこのような教科書の章または雑誌
の論文が、さらに、述べているように、貧血は典型的に
は重度であり、すなわち、ヘモグロビン≦8g%、ヘマ
トクリット<25%であり、そして赤血球の大きさはレ
ベル>110まで大きく増加する。〔参照、Babior, B.
M.およびH.F.Bunn, Harrison's Principles of Interna
l Medicine (R.G.Petersdorf, R.F.Adams, E.Braunwal
d, K.J.Isselbacher, J.B.MartinおよびJ.D.Wilson編)
(McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.1853−
1860;Lee, G.R. および H.J.Gardner, Textbook of Fa
mily Practice, 3rd E d.(R.E.Rakel編) (W.B.Saunders
& Co., Philadelphia, 1984), pp.1082−1091〕。
【0007】いくつかの実験室の試験は、コバラミンの
欠乏または葉酸の欠乏を有する患者において異常な結果
を与えるとして報告された。このような試験は赤血球の
葉酸塩の測定〔Hoffbrand, A.V., et al., J.Clin.Pat
h. 19:17 (1986)〕および「dUの抑制試験」〔Metz,
J., et al., Brit.J.Haem. 14 : 575 (1968)〕を含有
するが、いずれも広く利用されていない。20年以上に
わたって知られているように、メチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を有する大抵の患者の尿中に増大した量で分
泌され、そしてこの異常は葉酸の欠乏を有するほんのわ
ずかの患者によってのみ証明される。コバラミンの欠乏
は、貧血の存在および程度、大赤血球症の存在および程
度、および低下した血清コバラミンレベルの存在に基づ
いて疑われかつ診断することができることが信じられか
つ教示されているので、メチルマロン酸はコバラミンの
欠乏が疑われている患者においてめったに測定されな
い。事実、医学の先導教科書および血液学の先導教科書
において、実際には、尿のメチルマロネートのアッセイ
はめったに必要ではないことが教示されている。〔Bec
k, W.S., Hematology, 3rd Ed. (W.J.Williams, E.Beut
ler, A.J.ErslevおよびM.A.Lichtman編) (McGraw-Hill
Book Co., New York, 1983), pp.434−465 ; Beck, W.
S., Cecil Textbook of Medicine, Vol.1 (J.B.Wyngaar
den およびL.H.Smith, Jr.編) (W.B.Saunders Co., Phi
ladelphia, 1985), pp.893−900 。〕1つの最近の雑誌
の論文は尿のメチルマロン酸の測定を事実支持している
〔Norman, E.J., O.J.Martelo およびM.D.Denton, Bloo
d 59 (6):1128−1131 (1982) 〕が、この論文のデータ
を分析すると、27人のコバラミンの欠乏の患者のうち
26人は貧血であり、27人の患者のうち23人はMC
Vが増大しており、そして血清コバラミンを標準の改良
された血清コバラミンアッセイで測定した12人の患者
のうち12人は100pg/mlより低い値を有したことを
証明する。こうして、これらの患者は標準の診断手順に
従って皆コバラミンの欠乏であり、そして追加のアッセ
イは通常不必要であると判定されている。
欠乏または葉酸の欠乏を有する患者において異常な結果
を与えるとして報告された。このような試験は赤血球の
葉酸塩の測定〔Hoffbrand, A.V., et al., J.Clin.Pat
h. 19:17 (1986)〕および「dUの抑制試験」〔Metz,
J., et al., Brit.J.Haem. 14 : 575 (1968)〕を含有
するが、いずれも広く利用されていない。20年以上に
わたって知られているように、メチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を有する大抵の患者の尿中に増大した量で分
泌され、そしてこの異常は葉酸の欠乏を有するほんのわ
ずかの患者によってのみ証明される。コバラミンの欠乏
は、貧血の存在および程度、大赤血球症の存在および程
度、および低下した血清コバラミンレベルの存在に基づ
いて疑われかつ診断することができることが信じられか
つ教示されているので、メチルマロン酸はコバラミンの
欠乏が疑われている患者においてめったに測定されな
い。事実、医学の先導教科書および血液学の先導教科書
において、実際には、尿のメチルマロネートのアッセイ
はめったに必要ではないことが教示されている。〔Bec
k, W.S., Hematology, 3rd Ed. (W.J.Williams, E.Beut
ler, A.J.ErslevおよびM.A.Lichtman編) (McGraw-Hill
Book Co., New York, 1983), pp.434−465 ; Beck, W.
S., Cecil Textbook of Medicine, Vol.1 (J.B.Wyngaar
den およびL.H.Smith, Jr.編) (W.B.Saunders Co., Phi
ladelphia, 1985), pp.893−900 。〕1つの最近の雑誌
の論文は尿のメチルマロン酸の測定を事実支持している
〔Norman, E.J., O.J.Martelo およびM.D.Denton, Bloo
d 59 (6):1128−1131 (1982) 〕が、この論文のデータ
を分析すると、27人のコバラミンの欠乏の患者のうち
26人は貧血であり、27人の患者のうち23人はMC
Vが増大しており、そして血清コバラミンを標準の改良
された血清コバラミンアッセイで測定した12人の患者
のうち12人は100pg/mlより低い値を有したことを
証明する。こうして、これらの患者は標準の診断手順に
従って皆コバラミンの欠乏であり、そして追加のアッセ
イは通常不必要であると判定されている。
【0008】血清または血漿中のコバラミンおよび葉酸
塩についてのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
の欠乏を診断および区別するための、最も広く利用さ
れ、推奨されている試験である。血清コバラミンの正常
範囲が約200〜900pg/mlである、コバラミンの欠
乏の場合において、いく人かの先導著者らが述べている
ように、患者は血清コバラミンレベルが低いばかりでな
く、かつまたこれらの値は100pg/mlより低いであろ
う。〔参照、例えば、 Babior, supra;Lee & Gardner,
supra;Beck, Textbook of Medicine, supra ; および
Beck, Hematology,supra〕。
塩についてのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
の欠乏を診断および区別するための、最も広く利用さ
れ、推奨されている試験である。血清コバラミンの正常
範囲が約200〜900pg/mlである、コバラミンの欠
乏の場合において、いく人かの先導著者らが述べている
ように、患者は血清コバラミンレベルが低いばかりでな
く、かつまたこれらの値は100pg/mlより低いであろ
う。〔参照、例えば、 Babior, supra;Lee & Gardner,
supra;Beck, Textbook of Medicine, supra ; および
Beck, Hematology,supra〕。
【0009】1978年において、コバラミン類自体が
ヒト血漿中に存在すること、およびその時使用する血清
コバラミンについてのラジオアイソトープの希釈アッセ
イが真のコバラミンに対して特異的でないので、それら
の存在はコバラミンの欠乏をマスクしうることが発見さ
れた。この問題は、コバラミンについてのラジオアイソ
トープの希釈アッセイにおいて結合性蛋白質として、純
粋なまたは精製された固有の因子の使用によって補正で
き、そしてこの修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質
を使用した1978年に存在したアッセイをほとんど完
全に置換した。参照、例えば、米国特許第4,188,
189号(Allen)、米国特許第4,351,822号
(Allen)、米国特許第4,451,571号(Allen)お
よびKolhouse, J.F., H.Kondo, N.C.Allen, E.Podellお
よび R.H.Allen, N.Eng.J.Med. 299: 785−792 (197
8)。これらの血清についての改良されたアッセイは、世
界を通じて数千の研究室において現在利用されており、
そしてコバラミンの欠乏を有する患者のすべて、あるい
はほとんどすべてについて低い値を与えるように見え
る。
ヒト血漿中に存在すること、およびその時使用する血清
コバラミンについてのラジオアイソトープの希釈アッセ
イが真のコバラミンに対して特異的でないので、それら
の存在はコバラミンの欠乏をマスクしうることが発見さ
れた。この問題は、コバラミンについてのラジオアイソ
トープの希釈アッセイにおいて結合性蛋白質として、純
粋なまたは精製された固有の因子の使用によって補正で
き、そしてこの修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質
を使用した1978年に存在したアッセイをほとんど完
全に置換した。参照、例えば、米国特許第4,188,
189号(Allen)、米国特許第4,351,822号
(Allen)、米国特許第4,451,571号(Allen)お
よびKolhouse, J.F., H.Kondo, N.C.Allen, E.Podellお
よび R.H.Allen, N.Eng.J.Med. 299: 785−792 (197
8)。これらの血清についての改良されたアッセイは、世
界を通じて数千の研究室において現在利用されており、
そしてコバラミンの欠乏を有する患者のすべて、あるい
はほとんどすべてについて低い値を与えるように見え
る。
【0010】しかしながら、改良されたアッセイはコバ
ラミンの欠乏のなんらかの証拠に欠ける患者において、
しばしば低い値を与えるので、かなり批判されてきてい
る。これらの理由のため、この分野における専門家は、
コバラミンの欠乏を考慮すべきであること、そして前述
のように、コバラミンの欠乏をもつ患者に典型的である
血液学的および神経学的異常を有する患者においての
み、血清コバラミン値を得るべきであることを教示し
た。 Schillingおよび彼の共同研究者ら、コバラミンの
欠乏および実験室の診断の分野における専門家、は次の
ように述べた。
ラミンの欠乏のなんらかの証拠に欠ける患者において、
しばしば低い値を与えるので、かなり批判されてきてい
る。これらの理由のため、この分野における専門家は、
コバラミンの欠乏を考慮すべきであること、そして前述
のように、コバラミンの欠乏をもつ患者に典型的である
血液学的および神経学的異常を有する患者においての
み、血清コバラミン値を得るべきであることを教示し
た。 Schillingおよび彼の共同研究者ら、コバラミンの
欠乏および実験室の診断の分野における専門家、は次の
ように述べた。
【0011】「われわれは、改良されたB12のアッセイ
キットが血清B12について臨床的に説明されない結果の
増大した比率を生成するであろうことを結論する。科学
的および経済的理由で、ビタミンB12の合理的な確率を
示唆する血液学的または神経学的発見を有する患者にお
いてのみ、血清ビタミンB12を測定することは、賢明で
あろうと思われる。貧血または老人医学の人口における
スクリーニングテストとして血清B12を測定すること
は、臨床的病気と相関関係をもたせることのできない、
低い値を高い比率で生ずるであろう。」:Schilling,
R.F., V.F.Fairbanks, R.Miller, K.Schmitt およびM.
J.Smith, Clin.Chem. 29 (3):582, 583 (1983) 。
キットが血清B12について臨床的に説明されない結果の
増大した比率を生成するであろうことを結論する。科学
的および経済的理由で、ビタミンB12の合理的な確率を
示唆する血液学的または神経学的発見を有する患者にお
いてのみ、血清ビタミンB12を測定することは、賢明で
あろうと思われる。貧血または老人医学の人口における
スクリーニングテストとして血清B12を測定すること
は、臨床的病気と相関関係をもたせることのできない、
低い値を高い比率で生ずるであろう。」:Schilling,
R.F., V.F.Fairbanks, R.Miller, K.Schmitt およびM.
J.Smith, Clin.Chem. 29 (3):582, 583 (1983) 。
【0012】こうして、現在入手可能な広く利用されて
いるコバラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏で
はない患者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁
に提供することがある。このような発見は医者を困惑さ
せ、あるいは誤らせ、そして不必要な、経費を要する、
それ以上の試験を生ずることがある。こうして、この分
野において、一般に、教示されているように、コバラミ
ンの欠乏の臨床的スペクトルは比較的狭くかつ良好に限
界が定められており、そしてコバラミンの欠乏の可能性
は、現在血液学的または神経学的症候を有する患者、す
なわち、通常、適度に重度の大赤血球症を伴う適度に重
度の貧血を有する患者、および末梢の神経病および/ま
たは失調症を有する患者においてのみ考慮すべきであ
る。一般の人口あるいは適度の貧血、または適度の大赤
血球症、または他の神経精神学的異常をもつものの日常
のスクリーニングは高い数の誤った陽性の結果に導くで
あろう。
いるコバラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏で
はない患者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁
に提供することがある。このような発見は医者を困惑さ
せ、あるいは誤らせ、そして不必要な、経費を要する、
それ以上の試験を生ずることがある。こうして、この分
野において、一般に、教示されているように、コバラミ
ンの欠乏の臨床的スペクトルは比較的狭くかつ良好に限
界が定められており、そしてコバラミンの欠乏の可能性
は、現在血液学的または神経学的症候を有する患者、す
なわち、通常、適度に重度の大赤血球症を伴う適度に重
度の貧血を有する患者、および末梢の神経病および/ま
たは失調症を有する患者においてのみ考慮すべきであ
る。一般の人口あるいは適度の貧血、または適度の大赤
血球症、または他の神経精神学的異常をもつものの日常
のスクリーニングは高い数の誤った陽性の結果に導くで
あろう。
【0013】今回、コバラミンの欠乏の臨床的スペクト
ルは従来認識されていたものよりも非常に広いこと、そ
して多くのコバラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あ
るいは適度にのみ貧血であること;多くの場合におい
て、それらの赤血球は大赤血球でないか、あるいは適度
にのみ大赤血球であること;多くの場合において、末梢
の神経病および失調症以外の種々の神経学的異常が存在
すること;多くの場合において、精製した固有の因子を
使用する上の改良されたアッセイを使用してさえ、血清
コバラミンレベルはわずかに減少するだけであり、そし
て実際には正常でありうることが発見された。したがっ
て、コバラミンの欠乏についての改良されたアッセイ、
好ましくはコバラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と区別可能
であるアッセイが要求されている。
ルは従来認識されていたものよりも非常に広いこと、そ
して多くのコバラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あ
るいは適度にのみ貧血であること;多くの場合におい
て、それらの赤血球は大赤血球でないか、あるいは適度
にのみ大赤血球であること;多くの場合において、末梢
の神経病および失調症以外の種々の神経学的異常が存在
すること;多くの場合において、精製した固有の因子を
使用する上の改良されたアッセイを使用してさえ、血清
コバラミンレベルはわずかに減少するだけであり、そし
て実際には正常でありうることが発見された。したがっ
て、コバラミンの欠乏についての改良されたアッセイ、
好ましくはコバラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と区別可能
であるアッセイが要求されている。
【0014】今回、温血動物における合計のホモシステ
インの増大したレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の
欠乏の両者と相関関係があり;増大したレベルの合計の
ホモシステインを有する動物は一方または双方の欠乏を
有するようであるが、アッセイは2つの間の区別しない
ことが発見された。スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研
究において、正常のヒト血清は少量のホモシステイン−
システイン二量体および蛋白質結合ホモシステインを含
有することが示された。ホモシステインは正常試料にお
いて検出されなかったが、腎不全を有する患者において
少量で存在する。
インの増大したレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の
欠乏の両者と相関関係があり;増大したレベルの合計の
ホモシステインを有する動物は一方または双方の欠乏を
有するようであるが、アッセイは2つの間の区別しない
ことが発見された。スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研
究において、正常のヒト血清は少量のホモシステイン−
システイン二量体および蛋白質結合ホモシステインを含
有することが示された。ホモシステインは正常試料にお
いて検出されなかったが、腎不全を有する患者において
少量で存在する。
【0015】従来知られているように、ホモシステイン
およびセリンをシスタチオニンに転化できない、シスタ
チオニンシンセターゼを遺伝的に欠く子供の血清および
尿の中に大量のホモシスチン(ホモシスティン)が存在
する。これらの患者は、また、血清中に存在するメチオ
ニンを増大した量を有する〔参照、例えば、Mudd, S.H.
およびH.L.Levy, The Metabolic Basis of Inherited D
isease, 5th Ed. (J.B.Stanbury およびWyngaarden, D.
S.Fredrickson, J.L.Goldsteinおよび M.S.Brown編) (M
cGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.522−559
。大量のホモシスチンは、また、メチオニンシンセタ
ーゼを含む遺伝欠陥を有するある子供、例えば、ホモシ
ステインおよびN5 −メチルテトラヒドロフォレート
を、それぞれ、メチオニンおよびテトラヒドロフォレー
トに転化できないある子供の血清および尿中に存在す
る。これらの患者は、血清中に低いレベルのメチオニン
を有する。これらの患者において、遺伝した欠陥の理由
は、1)5,10−メチレンテトラヒドロフォレートリ
ダクターゼの欠乏(N5 −メチルテトラヒドロフォレー
ト、メチオニンシンセターゼのための基質の1つの合成
の不能);2)メチオニンシンセターゼのための必要な
コファクターであるメチル−コバラミンの合成の不能;
および3)メチオニンシンセターゼ自体における欠陥で
ある〔参照、例えばMudd, S.H., Heritable Disorders
of Amino Acid Metabolism:Patterns of Clinical Exp
ression and Genetic Variation, (W.L.Nyhan 編) (Jo
hn Wiley & Sons, New York, 1974), pp.429−451 〕。
他方において、ホモシスチンは、コバラミンを細胞へ輸
送する能力の遺伝欠陥(例えば、トランスコバラミンII
の欠乏)、またはコバラミンがリボソーム内に捕捉され
るようなコバラミンの細胞内輸送の遺伝欠陥による、メ
チオニンシンセターゼ能を含む遺伝欠陥を有する他の子
供の尿または血清中にはこれまで検出されていない。大
量のホモシステインまたはホモシスチンは、生命を脅か
すコバラミン欠乏を有する数人の子供の血清および尿中
に見出されている〔参照、例えば、Shipman, R.T., R.
R.W.TownleyおよびD.M.Dnaks, Lancet 1 (2): 693−694
(1969);Frader, J., B.ReimanおよびD.Turkewitz, N.
Eng.J.Med. 299 : 1319 (1978); Mudd, S.H., Heritab
le Disorder, supra ; Mudd, S.H., Metabolic Basis,
supra;Hollowell, J.G., Jr., W.K.Hall, M.E.Coryel
l, J.McPhereson, Jr., D.A.Hahn, Lancet Dec. 27, 19
69, p.1428;Higgenbottom, M.C., L.SweetmanおよびW.
L.Nyhan, N.Eng.J.Med. 299 (7): 317−323 (1978);Da
vis, J.R., J.Goldenring およびB.H.Lubin, Am.J.Dis.
Child. 135:566 (1981);Hoey, H.J.C.Linnell, V.G.O
berholzer およびB.M.Laurance, J.Royal Soc.Med. 75
: 656 (1982)〕。生命を脅かすコバラミンの欠乏を有
する他の幼児において、尿および/または血清中のアミ
ノ酸は正常であることが発見され、そしてホモシスチン
は発見されず〔参照、例えば、Graesbeck, R.Bordin,
I.KanteroおよびB.Kuhlbaeck, Acta Medica Scandinavi
aca 167 (4):289 (1960);Lampkin, B.C. およびA.M.M
auer, Blood 30 (4): 495 (1967); Lambert, H.P., T.
A.J.PrankerdおよびJ.M.Smellie, Q.J.Med. 30 (117):
71 (1961); Sievend, C.J., Ugesk.Laeter 125:174 (1
963)〕生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子供の尿中に
それは発見されなかった〔 Corbeel, L., G.Van den Be
rghe, J.Jaeken, J.van Tornout, N.R.Eeckles, Eur.J.
Ped. 143 : 284−290 (1985)〕。従来ホモシスティンは
中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有す
る子供の血清または尿中に報告されていず、生命を脅か
す、中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を
有する大人の血清または尿中にも従来報告されていな
い。
およびセリンをシスタチオニンに転化できない、シスタ
チオニンシンセターゼを遺伝的に欠く子供の血清および
尿の中に大量のホモシスチン(ホモシスティン)が存在
する。これらの患者は、また、血清中に存在するメチオ
ニンを増大した量を有する〔参照、例えば、Mudd, S.H.
およびH.L.Levy, The Metabolic Basis of Inherited D
isease, 5th Ed. (J.B.Stanbury およびWyngaarden, D.
S.Fredrickson, J.L.Goldsteinおよび M.S.Brown編) (M
cGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.522−559
。大量のホモシスチンは、また、メチオニンシンセタ
ーゼを含む遺伝欠陥を有するある子供、例えば、ホモシ
ステインおよびN5 −メチルテトラヒドロフォレート
を、それぞれ、メチオニンおよびテトラヒドロフォレー
トに転化できないある子供の血清および尿中に存在す
る。これらの患者は、血清中に低いレベルのメチオニン
を有する。これらの患者において、遺伝した欠陥の理由
は、1)5,10−メチレンテトラヒドロフォレートリ
ダクターゼの欠乏(N5 −メチルテトラヒドロフォレー
ト、メチオニンシンセターゼのための基質の1つの合成
の不能);2)メチオニンシンセターゼのための必要な
コファクターであるメチル−コバラミンの合成の不能;
および3)メチオニンシンセターゼ自体における欠陥で
ある〔参照、例えばMudd, S.H., Heritable Disorders
of Amino Acid Metabolism:Patterns of Clinical Exp
ression and Genetic Variation, (W.L.Nyhan 編) (Jo
hn Wiley & Sons, New York, 1974), pp.429−451 〕。
他方において、ホモシスチンは、コバラミンを細胞へ輸
送する能力の遺伝欠陥(例えば、トランスコバラミンII
の欠乏)、またはコバラミンがリボソーム内に捕捉され
るようなコバラミンの細胞内輸送の遺伝欠陥による、メ
チオニンシンセターゼ能を含む遺伝欠陥を有する他の子
供の尿または血清中にはこれまで検出されていない。大
量のホモシステインまたはホモシスチンは、生命を脅か
すコバラミン欠乏を有する数人の子供の血清および尿中
に見出されている〔参照、例えば、Shipman, R.T., R.
R.W.TownleyおよびD.M.Dnaks, Lancet 1 (2): 693−694
(1969);Frader, J., B.ReimanおよびD.Turkewitz, N.
Eng.J.Med. 299 : 1319 (1978); Mudd, S.H., Heritab
le Disorder, supra ; Mudd, S.H., Metabolic Basis,
supra;Hollowell, J.G., Jr., W.K.Hall, M.E.Coryel
l, J.McPhereson, Jr., D.A.Hahn, Lancet Dec. 27, 19
69, p.1428;Higgenbottom, M.C., L.SweetmanおよびW.
L.Nyhan, N.Eng.J.Med. 299 (7): 317−323 (1978);Da
vis, J.R., J.Goldenring およびB.H.Lubin, Am.J.Dis.
Child. 135:566 (1981);Hoey, H.J.C.Linnell, V.G.O
berholzer およびB.M.Laurance, J.Royal Soc.Med. 75
: 656 (1982)〕。生命を脅かすコバラミンの欠乏を有
する他の幼児において、尿および/または血清中のアミ
ノ酸は正常であることが発見され、そしてホモシスチン
は発見されず〔参照、例えば、Graesbeck, R.Bordin,
I.KanteroおよびB.Kuhlbaeck, Acta Medica Scandinavi
aca 167 (4):289 (1960);Lampkin, B.C. およびA.M.M
auer, Blood 30 (4): 495 (1967); Lambert, H.P., T.
A.J.PrankerdおよびJ.M.Smellie, Q.J.Med. 30 (117):
71 (1961); Sievend, C.J., Ugesk.Laeter 125:174 (1
963)〕生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子供の尿中に
それは発見されなかった〔 Corbeel, L., G.Van den Be
rghe, J.Jaeken, J.van Tornout, N.R.Eeckles, Eur.J.
Ped. 143 : 284−290 (1985)〕。従来ホモシスティンは
中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有す
る子供の血清または尿中に報告されていず、生命を脅か
す、中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を
有する大人の血清または尿中にも従来報告されていな
い。
【0016】血清葉酸塩レベルは葉酸塩の欠乏をもつ多
くのアルコール患者において減少しないこと、および合
計のホモシステインの測定はこれらの患者の多くにおけ
る葉酸塩の欠乏の追加の、より精確な指示を提供するこ
とが、また、発見された。ホモシステインは葉酸塩の代
謝の遺伝的欠陥をもつある子供の尿および/または血清
において増大することが従来知られていた〔参照、例え
ば、Mudd, S.H., Heritable Disorder, supra ; Mudd,
S.H., Metabolic Basis, supra〕が、ホモシステインが
葉酸塩の欠乏をもつ子供または大人の尿または血清中に
おいて増大することは、従来、知られていなかった。
くのアルコール患者において減少しないこと、および合
計のホモシステインの測定はこれらの患者の多くにおけ
る葉酸塩の欠乏の追加の、より精確な指示を提供するこ
とが、また、発見された。ホモシステインは葉酸塩の代
謝の遺伝的欠陥をもつある子供の尿および/または血清
において増大することが従来知られていた〔参照、例え
ば、Mudd, S.H., Heritable Disorder, supra ; Mudd,
S.H., Metabolic Basis, supra〕が、ホモシステインが
葉酸塩の欠乏をもつ子供または大人の尿または血清中に
おいて増大することは、従来、知られていなかった。
【0017】さらに、ある動物がコバラミンの欠乏、葉
酸の欠乏、両者を有するか、あるいはいずれももたない
かを、合計の組織のホモシステインおよびメチルマロン
酸のレベルを正常なレベルと比較する組み合わせのアッ
セイに基づいて決定することが可能であることが発見さ
れた。葉酸の欠乏およびコバラミンの欠乏の両者は増大
した合計のホモシステインのレベルを生ずるが、コバラ
ミンの欠乏は、また、メチルマロン酸のレベルを増大
し、これに対して葉酸の欠乏は増大しないであろう。メ
チルマロン酸はコバラミンの代謝またはコバラミンの輸
送の遺伝的欠陥を有する、多くの子供の血清および/ま
たは尿において、および変化する程度のコバラミンの欠
乏をもつ子供および大人の尿において増大することが、
従来、知られていた〔参照、例えば、Beck, W.S., Hema
tology, supra 〕。しかしながら、従来、ホモシステイ
ンのアッセイと組み合わせてメチルマロン酸のアッセイ
を使用して、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診断
および/または区別することは、知られていず、また示
唆されていない。今回、われわれは、この組み合わせた
アッセイは、変化する程度の貧血、大赤血球症、血清コ
バラミンのレベルの低下、および変化する種類の神経精
神学的異常をもつ患者におけるコバラミンの欠乏の診断
において、事実、きわめて有用であることを発見した。
酸の欠乏、両者を有するか、あるいはいずれももたない
かを、合計の組織のホモシステインおよびメチルマロン
酸のレベルを正常なレベルと比較する組み合わせのアッ
セイに基づいて決定することが可能であることが発見さ
れた。葉酸の欠乏およびコバラミンの欠乏の両者は増大
した合計のホモシステインのレベルを生ずるが、コバラ
ミンの欠乏は、また、メチルマロン酸のレベルを増大
し、これに対して葉酸の欠乏は増大しないであろう。メ
チルマロン酸はコバラミンの代謝またはコバラミンの輸
送の遺伝的欠陥を有する、多くの子供の血清および/ま
たは尿において、および変化する程度のコバラミンの欠
乏をもつ子供および大人の尿において増大することが、
従来、知られていた〔参照、例えば、Beck, W.S., Hema
tology, supra 〕。しかしながら、従来、ホモシステイ
ンのアッセイと組み合わせてメチルマロン酸のアッセイ
を使用して、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診断
および/または区別することは、知られていず、また示
唆されていない。今回、われわれは、この組み合わせた
アッセイは、変化する程度の貧血、大赤血球症、血清コ
バラミンのレベルの低下、および変化する種類の神経精
神学的異常をもつ患者におけるコバラミンの欠乏の診断
において、事実、きわめて有用であることを発見した。
【0018】体の組織におけるホモシステインの増大し
たレベルは前記体の組織におけるコバラミンおよび/ま
たは葉酸の減少したレベルと相関関係をもつことが、発
見された。したがって、ホモシステインのアッセイを使
用して、温血動物におけるコバラミンおよび/または葉
酸の欠乏の存在または不存在を決定することができる。
この目的に対して適当なアッセイは、体の組織、好まし
くは体液、好ましくは尿または血液におけるホモシステ
インのレベルを決定できるアッセイを包含する。血清お
よび血漿はとくに好ましい。
たレベルは前記体の組織におけるコバラミンおよび/ま
たは葉酸の減少したレベルと相関関係をもつことが、発
見された。したがって、ホモシステインのアッセイを使
用して、温血動物におけるコバラミンおよび/または葉
酸の欠乏の存在または不存在を決定することができる。
この目的に対して適当なアッセイは、体の組織、好まし
くは体液、好ましくは尿または血液におけるホモシステ
インのレベルを決定できるアッセイを包含する。血清お
よび血漿はとくに好ましい。
【0019】尿または血液中のホモシステインのレベル
の決定における使用に適当な、いくつかの異なる既知の
アッセイが存在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の
欠乏の検出に、いずれも使用されてきていない。参照、
例えば、Saetre, R.およびD.L.Rabenstein, Anal.Bioch
em. 90 : 684−692 (1978)、この文献は、尿中の減少し
た合計のシステイン、および血漿の蛋白質以外の分画中
の合計のシステインおよびホモシステインを測定して、
イオウの代謝のある種の先天的疾患、例えば、シスチン
(システィン)尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチ
ン尿症についてスクリーニングし、そしてそれらの処置
を監視する方法を記載している。この方法は、体液の試
料をチオール基に応答するようにセットされた化学的検
出器を有する高性能体クロマトグラフィーにかけ、そし
て結果を標準曲線と比較して、もとの試料中に存在する
標的化合物の量を決定することからなる。この手順にお
いて、標準は標的化合物と同時に混合するのではなく、
むしろ別々に実験する;こうして、標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
の決定における使用に適当な、いくつかの異なる既知の
アッセイが存在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の
欠乏の検出に、いずれも使用されてきていない。参照、
例えば、Saetre, R.およびD.L.Rabenstein, Anal.Bioch
em. 90 : 684−692 (1978)、この文献は、尿中の減少し
た合計のシステイン、および血漿の蛋白質以外の分画中
の合計のシステインおよびホモシステインを測定して、
イオウの代謝のある種の先天的疾患、例えば、シスチン
(システィン)尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチ
ン尿症についてスクリーニングし、そしてそれらの処置
を監視する方法を記載している。この方法は、体液の試
料をチオール基に応答するようにセットされた化学的検
出器を有する高性能体クロマトグラフィーにかけ、そし
て結果を標準曲線と比較して、もとの試料中に存在する
標的化合物の量を決定することからなる。この手順にお
いて、標準は標的化合物と同時に混合するのではなく、
むしろ別々に実験する;こうして、標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
【0020】Refsum.H., S.HellandおよびP.M.Ueland,
Clin.Chem. 31 (4): 624−628 (1985)に記載されてい
る、他の適当な手順は、試料中に存在するホモシステイ
ンを、放射性標識したS−アデノシンおよびS−アデノ
シルホモシステインヒドラーゼに暴露することによっ
て、標識されたS−アデノシルホモシステインに転化
し、そして前記標識されたS−アデノシルホモシステイ
ンを適当な検出系によって定量することからなる。示唆
された用途は、悪性の病気の管理におけるホモシステイ
ンの代謝の監視、および抗葉酸塩薬物メトキシレートを
使用する処置の間における、遺伝的病気のホモシスチン
尿症の監視、および閉経期後の女性の血漿中の血清ホモ
システインの監視を包含する。この手順は、ホモシステ
インを監視して、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出ま
たは測定に決して使用されてきていない。再び、この手
順は内部標準を使用せず、こうして標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
Clin.Chem. 31 (4): 624−628 (1985)に記載されてい
る、他の適当な手順は、試料中に存在するホモシステイ
ンを、放射性標識したS−アデノシンおよびS−アデノ
シルホモシステインヒドラーゼに暴露することによっ
て、標識されたS−アデノシルホモシステインに転化
し、そして前記標識されたS−アデノシルホモシステイ
ンを適当な検出系によって定量することからなる。示唆
された用途は、悪性の病気の管理におけるホモシステイ
ンの代謝の監視、および抗葉酸塩薬物メトキシレートを
使用する処置の間における、遺伝的病気のホモシスチン
尿症の監視、および閉経期後の女性の血漿中の血清ホモ
システインの監視を包含する。この手順は、ホモシステ
インを監視して、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出ま
たは測定に決して使用されてきていない。再び、この手
順は内部標準を使用せず、こうして標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
【0021】血清または尿中のホモシステインのレベル
を測定する、非常に、いっそう感受性でありかつ精確な
手順は、合計のスルフヒドリルアミノ酸についての次の
新規なアッセイである。スルフヒドリルアミノ酸は、−
SH部分を含有するもの、例えば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −SH のホモシステイン(Hcys)および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −SH のシステイン(Cys)である。スルフヒドリル化合物
は、ジサルファイド結合を介して化合して二量体、例え
ば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −S−S−H2C −(H2N)HC −COOH のシスティン、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −S−S−H2C −H2C −(H
2N)HC −COOH のホモシスティン、および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −S−S−H2C −(H2N)HC
−COOH のホモシステイン−システインを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
インおよびシステインの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフヒドリル基と複合体を形成する;組織から誘導され
た試料において、このような蛋白質の複合体は存在する
システインおよびホモシステインの大部分を結合するこ
とができる。合計のスルフヒドリルアミノ酸についての
アッセイは、これらのアミノ酸がこのような化合物を形
成する容易さによって複雑化される。還元は放出のため
および引続く蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセ
イのために要求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還
元後、新しいジサルファイドを有意な程度に再形成する
可能性があるように思われる。ジサルファイド結合の再
形成は、非常に変動することがあり、そして非スルフヒ
ドリル含有アミノ酸を内部標準として使用することによ
っては評価または補償されることができない。試料中の
合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、このよう
な二量体および複合体を考慮に入れなくてはならない。
を測定する、非常に、いっそう感受性でありかつ精確な
手順は、合計のスルフヒドリルアミノ酸についての次の
新規なアッセイである。スルフヒドリルアミノ酸は、−
SH部分を含有するもの、例えば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −SH のホモシステイン(Hcys)および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −SH のシステイン(Cys)である。スルフヒドリル化合物
は、ジサルファイド結合を介して化合して二量体、例え
ば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −S−S−H2C −(H2N)HC −COOH のシスティン、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −S−S−H2C −H2C −(H
2N)HC −COOH のホモシスティン、および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −S−S−H2C −(H2N)HC
−COOH のホモシステイン−システインを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
インおよびシステインの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフヒドリル基と複合体を形成する;組織から誘導され
た試料において、このような蛋白質の複合体は存在する
システインおよびホモシステインの大部分を結合するこ
とができる。合計のスルフヒドリルアミノ酸についての
アッセイは、これらのアミノ酸がこのような化合物を形
成する容易さによって複雑化される。還元は放出のため
および引続く蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセ
イのために要求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還
元後、新しいジサルファイドを有意な程度に再形成する
可能性があるように思われる。ジサルファイド結合の再
形成は、非常に変動することがあり、そして非スルフヒ
ドリル含有アミノ酸を内部標準として使用することによ
っては評価または補償されることができない。試料中の
合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、このよう
な二量体および複合体を考慮に入れなくてはならない。
【0022】したがって、本発明は、所定の試料中の合
計のシステインおよび/または合計のホモシステインを
質量分析計を使用してアッセイする好ましい方法を提供
する。用語「合計のシステイン」および「合計のホモシ
ステイン」は、遊離の形態および複合化した形態の両者
で存在する、それぞれ、システインおよびホモシステイ
ンの合計量を意味する。便宜上、以下の説明は、例とし
て、ホモシステインを使用するが、同一の手順はシステ
インに同様にはたらく。内因性のホモシステインを含有
する所定の試料を、内因性のホモシステインの完全なラ
ンダム化を補償するために十分な量の還元剤と一緒に
し、そして合計のホモシステインを適当な手段によって
測定する。好ましくは、所定の試料をまず内部参照標準
と一緒にし、前記内部参照標準はホモシステインと同様
に挙動するが、安定なアイソトープのマーカーで標識さ
れた化合物の既知量からなる。内因性ホモシステインお
よび参照標準の完全な均質化を補償するために十分な量
の還元剤を添加し、そして存在するホモシステインおよ
び標識参照標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシ
ステインおよび参照標準がこの手順を通じて同一の相対
比で発生すると仮定すると、この比を質量分析計の読み
から計算し、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用
して、本来存在する内因性ホモシステインの合計量を計
算することができる。前述のように、同一の手順はシス
テインに対して有効である;また、ホモシステインおよ
びシステイン(または他のアミノ酸)の各々がそれ自体
の適当な内部参照標準を有するかぎり、それらについて
のアッセイを同時に実施することができる。
計のシステインおよび/または合計のホモシステインを
質量分析計を使用してアッセイする好ましい方法を提供
する。用語「合計のシステイン」および「合計のホモシ
ステイン」は、遊離の形態および複合化した形態の両者
で存在する、それぞれ、システインおよびホモシステイ
ンの合計量を意味する。便宜上、以下の説明は、例とし
て、ホモシステインを使用するが、同一の手順はシステ
インに同様にはたらく。内因性のホモシステインを含有
する所定の試料を、内因性のホモシステインの完全なラ
ンダム化を補償するために十分な量の還元剤と一緒に
し、そして合計のホモシステインを適当な手段によって
測定する。好ましくは、所定の試料をまず内部参照標準
と一緒にし、前記内部参照標準はホモシステインと同様
に挙動するが、安定なアイソトープのマーカーで標識さ
れた化合物の既知量からなる。内因性ホモシステインお
よび参照標準の完全な均質化を補償するために十分な量
の還元剤を添加し、そして存在するホモシステインおよ
び標識参照標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシ
ステインおよび参照標準がこの手順を通じて同一の相対
比で発生すると仮定すると、この比を質量分析計の読み
から計算し、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用
して、本来存在する内因性ホモシステインの合計量を計
算することができる。前述のように、同一の手順はシス
テインに対して有効である;また、ホモシステインおよ
びシステイン(または他のアミノ酸)の各々がそれ自体
の適当な内部参照標準を有するかぎり、それらについて
のアッセイを同時に実施することができる。
【0023】内部参照標準は、この手順を通じて質量分
析計の分析まで内因性標的化合物と同一に挙動するが、
質量分析計の分析のもとで区別することができ、かつ別
々に測定できる、任意の化合物である。適当な内部参照
標準は、測定すべき標的アミノ酸の重水素化またはトリ
チウム化類似体、またはこのアッセイの目的に効果的に
同一であるために十分に標的アミノ酸に類似する重水素
化またはトリチウム化化合物、あるいはC13またはN15
または他の適当なアイソトープのマーカーを十分な量で
含有する標的アミノ酸の他の類似体である。こうして、
標識した参照化合物は、取扱いの間非標識標的と区別不
可能であるが、質量分析計の定量のために異なるかつ明
確なイオンを提供するであろう。このアッセイのための
好ましい化合物の例は、システィンの重水素化形態、例
えば、D,L−〔3,3,3′,3′−2 H4 〕システ
ィンおよび重水素化ホモシスティン、例えば、D,L−
〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕
ホモシスティンである。内部標準として使用するために
適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・アンド・
ドーム (Merck Sharp & Dohme)から入手可能である。
析計の分析まで内因性標的化合物と同一に挙動するが、
質量分析計の分析のもとで区別することができ、かつ別
々に測定できる、任意の化合物である。適当な内部参照
標準は、測定すべき標的アミノ酸の重水素化またはトリ
チウム化類似体、またはこのアッセイの目的に効果的に
同一であるために十分に標的アミノ酸に類似する重水素
化またはトリチウム化化合物、あるいはC13またはN15
または他の適当なアイソトープのマーカーを十分な量で
含有する標的アミノ酸の他の類似体である。こうして、
標識した参照化合物は、取扱いの間非標識標的と区別不
可能であるが、質量分析計の定量のために異なるかつ明
確なイオンを提供するであろう。このアッセイのための
好ましい化合物の例は、システィンの重水素化形態、例
えば、D,L−〔3,3,3′,3′−2 H4 〕システ
ィンおよび重水素化ホモシスティン、例えば、D,L−
〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕
ホモシスティンである。内部標準として使用するために
適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・アンド・
ドーム (Merck Sharp & Dohme)から入手可能である。
【0024】定量は、測定した標的化合物対内部標準の
比が、最初の試料中の標的化合物の合計の未知量対添加
した内部標準の合計量の比と同じであるという仮定に基
づく。これは、標的および内部標準の両者についての同
一回収割合を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合に
おいて、回収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリル
アミノ酸が取ることのできる、種々の可能な形態、遊離
および複合化した形態に依存する。したがって、各アッ
セイについて、遊離な状態および各可能な複合化した状
態における標的および内部標準の相対比は、同一である
ことが非常に重要である;これは、標的および内部標準
の同一の相対百分率が失われる(および回収される)こ
とを保証する。そのため、本発明では均質化を行う。具
体的には、標的および内部標準の両者を含有する初期の
試料に還元剤を添加する;十分な還元化合物を添加して
ジサルファイド架橋のすべてを破壊し、こうしてスルフ
ヒドリルアミノ酸のすべてを遊離な状態にする。ジサル
ファイド架橋の再結合を防止する化合物、例えば、ヨー
ドアセテート、ヨードアセトアミド、またはヨードプロ
パンを添加して、スルフヒドリルアミノ酸のすべてが遊
離な状態にとどまるであろうことを保証することができ
る。標的および標準のスルフヒドリルアミノ酸が同一の
タイプおよび数のこのような複合化を形成するであろう
ことを仮定して、任意に化合物がジサルファイド架橋を
再形成し、こうして遊離の状態、各可能な複合化状態、
質量分析計によって測定される標的および内部標準の量
において、もとの試料中に存在したのと、同一の比で標
的および内部標準スルフヒドリルアミノ酸の量が存在す
ることができる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊
しないでジサルファイド結合を破壊できるもの、例え
ば、2−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールお
よびホウ水素化ナトリウムである。
比が、最初の試料中の標的化合物の合計の未知量対添加
した内部標準の合計量の比と同じであるという仮定に基
づく。これは、標的および内部標準の両者についての同
一回収割合を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合に
おいて、回収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリル
アミノ酸が取ることのできる、種々の可能な形態、遊離
および複合化した形態に依存する。したがって、各アッ
セイについて、遊離な状態および各可能な複合化した状
態における標的および内部標準の相対比は、同一である
ことが非常に重要である;これは、標的および内部標準
の同一の相対百分率が失われる(および回収される)こ
とを保証する。そのため、本発明では均質化を行う。具
体的には、標的および内部標準の両者を含有する初期の
試料に還元剤を添加する;十分な還元化合物を添加して
ジサルファイド架橋のすべてを破壊し、こうしてスルフ
ヒドリルアミノ酸のすべてを遊離な状態にする。ジサル
ファイド架橋の再結合を防止する化合物、例えば、ヨー
ドアセテート、ヨードアセトアミド、またはヨードプロ
パンを添加して、スルフヒドリルアミノ酸のすべてが遊
離な状態にとどまるであろうことを保証することができ
る。標的および標準のスルフヒドリルアミノ酸が同一の
タイプおよび数のこのような複合化を形成するであろう
ことを仮定して、任意に化合物がジサルファイド架橋を
再形成し、こうして遊離の状態、各可能な複合化状態、
質量分析計によって測定される標的および内部標準の量
において、もとの試料中に存在したのと、同一の比で標
的および内部標準スルフヒドリルアミノ酸の量が存在す
ることができる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊
しないでジサルファイド結合を破壊できるもの、例え
ば、2−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールお
よびホウ水素化ナトリウムである。
【0025】必要に応じて、還元剤の添加の前または後
に、標的アミノ酸および内部標準を部分的に精製するこ
とが必要であるか、あるいは望ましいことがある。アミ
ノ酸の精製および分離のための既知の手段、例えば、濾
過、カラムクロマトグラフィー、陰イオンおよび/また
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグ
ラフィー、分子篩、などを使用できる。適当な分離およ
び精製技術を選択する方法、およびそれらを実施する手
段はこの分野において知られている。参照、例えば、La
badarios, D.,I.M.MoodieおよびG.S.Shephard, J.Chro
m. 310 : 223−231 (1984)およびその中の参考文献;Sh
ahroshi, F. およびC.W.Gehrke, J.Chrom. 36 : 31−41
(1968)。
に、標的アミノ酸および内部標準を部分的に精製するこ
とが必要であるか、あるいは望ましいことがある。アミ
ノ酸の精製および分離のための既知の手段、例えば、濾
過、カラムクロマトグラフィー、陰イオンおよび/また
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグ
ラフィー、分子篩、などを使用できる。適当な分離およ
び精製技術を選択する方法、およびそれらを実施する手
段はこの分野において知られている。参照、例えば、La
badarios, D.,I.M.MoodieおよびG.S.Shephard, J.Chro
m. 310 : 223−231 (1984)およびその中の参考文献;Sh
ahroshi, F. およびC.W.Gehrke, J.Chrom. 36 : 31−41
(1968)。
【0026】必要に応じて、また、標的化合物および内
部標準を変性して、精製および/または分離を促進する
ために、ある種の特徴を変更または改良することが必要
であるか、あるいは望ましいことがある。この実施は誘
導体化としてこの分野においてよく知られている。例え
ば、標的および参照化合物を、改良された溶解性、異な
る電荷、増大した揮発性などを有する類似体に転化し
て、質量分析計の分析前の精製および/または分離を促
進することが望ましいことがある。参照、例えば、 Kna
pp, D.R., Handbook of Analytical Dervatatization R
eactions (John Wiley & Sons, New York, 1979)。好ま
しい手順は、標的および参照化合物をそれらのシリル誘
導体に転化して、ガスクロマトグラフィー/質量分析計
の装置の組み合わせによる分離および同定を促進するこ
とを包含する。この目的に対して化合物をシリル化する
手段および方法は、この分野において知られており、参
照、例えば、Knapp, supra;Bierman, C.J., C.M.Kinos
hita, J.A.Marlett およびR.D.Steele, J.Chrom. 375 :
330−334 (1986)。好ましい方法は、標的化合物を内部
参照と一緒にし、還元剤を添加してランダム化を実施
し、得られる遊離および複合化したスルフヒドリルアミ
ノ酸の混合物を部分的に精製し、生成物をアセトニトリ
ル中に溶解し、そしてN−メチル−N−(t−ブチルジ
メチルシリル)トリフルオロアセトアミドを添加してシ
リル化を達成することを包含する。次いで、得られるシ
リル化スルフヒドリル標的化合物および参照化合物を濃
縮して、G
部標準を変性して、精製および/または分離を促進する
ために、ある種の特徴を変更または改良することが必要
であるか、あるいは望ましいことがある。この実施は誘
導体化としてこの分野においてよく知られている。例え
ば、標的および参照化合物を、改良された溶解性、異な
る電荷、増大した揮発性などを有する類似体に転化し
て、質量分析計の分析前の精製および/または分離を促
進することが望ましいことがある。参照、例えば、 Kna
pp, D.R., Handbook of Analytical Dervatatization R
eactions (John Wiley & Sons, New York, 1979)。好ま
しい手順は、標的および参照化合物をそれらのシリル誘
導体に転化して、ガスクロマトグラフィー/質量分析計
の装置の組み合わせによる分離および同定を促進するこ
とを包含する。この目的に対して化合物をシリル化する
手段および方法は、この分野において知られており、参
照、例えば、Knapp, supra;Bierman, C.J., C.M.Kinos
hita, J.A.Marlett およびR.D.Steele, J.Chrom. 375 :
330−334 (1986)。好ましい方法は、標的化合物を内部
参照と一緒にし、還元剤を添加してランダム化を実施
し、得られる遊離および複合化したスルフヒドリルアミ
ノ酸の混合物を部分的に精製し、生成物をアセトニトリ
ル中に溶解し、そしてN−メチル−N−(t−ブチルジ
メチルシリル)トリフルオロアセトアミドを添加してシ
リル化を達成することを包含する。次いで、得られるシ
リル化スルフヒドリル標的化合物および参照化合物を濃
縮して、G
【0027】C/質量分析計に注入する試料を準備す
る。血清についてのこの手順を使用すると、合計のホモ
システインについて1μモル/1の感度を達成すること
が可能であり、そしてアッセイは合計のホモシステイン
について1〜1000μモル/1モルの範囲にわたって
直線である。ヒト血清におけるホモシステインの正常の
範囲は約7〜約22μモル/1であり、そしてヒトの尿
において約1〜約20μモル/1である。これらの範囲
より上のホモシステインのレベルはコバラミンの欠乏お
よび/または葉酸塩の欠乏を指示する;このレベルが高
いほど、指示はより強い。
る。血清についてのこの手順を使用すると、合計のホモ
システインについて1μモル/1の感度を達成すること
が可能であり、そしてアッセイは合計のホモシステイン
について1〜1000μモル/1モルの範囲にわたって
直線である。ヒト血清におけるホモシステインの正常の
範囲は約7〜約22μモル/1であり、そしてヒトの尿
において約1〜約20μモル/1である。これらの範囲
より上のホモシステインのレベルはコバラミンの欠乏お
よび/または葉酸塩の欠乏を指示する;このレベルが高
いほど、指示はより強い。
【0028】また、メチルマロン酸(MMA)のレベル
について、ホモシステインのアッセイと同時に、あるい
はそれに引続いて、第2アッセイを実施することによ
り、コバラミンの欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが
可能であることが発見された。コバラミンの欠乏および
葉酸の欠乏の両者はホモシステインのレベルを上昇させ
るが、コバラミンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベル
を上昇させ、これに対して葉酸の欠乏は通常上昇させな
いであろう。ホモシステインのレベルは遺伝的欠陥のな
い個体において増大するとき、葉酸塩またはコバラミン
の少なくとも一方は欠乏する。MMAが、また、増大す
るとき、コバラミンは通常欠乏する。したがって、ホモ
システインおよびMMAの両者が増大するとき、コバラ
ミンは欠乏する(そうでなければ、正常である)が、葉
酸塩が、また、欠乏するか否かは明らかでない(なぜな
ら、合計のホモシステインの増大への葉酸塩の欠乏の寄
与はコバラミンの欠乏の作用によってマスクされうるか
らである)。逆に、ホモシステインが高いが、MMAが
正常であるとき、増大したホモシステインは葉酸塩の欠
乏のためであるように思われる。なぜなら、コバラミン
の欠乏のためであった場合、MMAも通常高いであろう
からである。ある場合において、MMAレベルは、ホモ
システインのレベルが上昇しはじめる前にさえ、コバラ
ミンの欠乏のために増大すること、あるいはホモシステ
インは、MMAのレベルが上昇しはじめる前に、コバラ
ミンの欠乏のために増大することが、起こりうる。こう
して、このアッセイによって供給される情報は、これら
の欠乏の早期の適切な診断に関連して価値がある。
について、ホモシステインのアッセイと同時に、あるい
はそれに引続いて、第2アッセイを実施することによ
り、コバラミンの欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが
可能であることが発見された。コバラミンの欠乏および
葉酸の欠乏の両者はホモシステインのレベルを上昇させ
るが、コバラミンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベル
を上昇させ、これに対して葉酸の欠乏は通常上昇させな
いであろう。ホモシステインのレベルは遺伝的欠陥のな
い個体において増大するとき、葉酸塩またはコバラミン
の少なくとも一方は欠乏する。MMAが、また、増大す
るとき、コバラミンは通常欠乏する。したがって、ホモ
システインおよびMMAの両者が増大するとき、コバラ
ミンは欠乏する(そうでなければ、正常である)が、葉
酸塩が、また、欠乏するか否かは明らかでない(なぜな
ら、合計のホモシステインの増大への葉酸塩の欠乏の寄
与はコバラミンの欠乏の作用によってマスクされうるか
らである)。逆に、ホモシステインが高いが、MMAが
正常であるとき、増大したホモシステインは葉酸塩の欠
乏のためであるように思われる。なぜなら、コバラミン
の欠乏のためであった場合、MMAも通常高いであろう
からである。ある場合において、MMAレベルは、ホモ
システインのレベルが上昇しはじめる前にさえ、コバラ
ミンの欠乏のために増大すること、あるいはホモシステ
インは、MMAのレベルが上昇しはじめる前に、コバラ
ミンの欠乏のために増大することが、起こりうる。こう
して、このアッセイによって供給される情報は、これら
の欠乏の早期の適切な診断に関連して価値がある。
【0029】この組合わされたホモシステイン/MMA
アッセイにおいて、ホモシステインのレベルは前述の手
段のいずれによっても適当にアッセイされる。本発明の
手順は好ましい。MMAは、例えば、次の文献に記載さ
れる方法によって適当にアッセイされる:Norman, E.
J., O.J.Martelo および M.D.Dento, Blood 59 (6):11
28 (1982) またはMarcel, P.D., S.P.Stabler, E.R.Pod
ell およびR.H.Allen, Anal.Biochem. 150:58−66 (19
85) 。好ましくは、試料は内部参照標準と一緒にする。
この内部参照標準は、安定なアイソトープマーカー、好
ましくはMMAの重水素化類似体で標識されたメチルマ
ロン酸の既知量からなる。次いで、存在する標識された
MMAおよび標識されないMMAの量を質量分析計で測
定し、そしてもとの試料中のMMAの量をはじめ添加し
た標識されたMMAの既知量から計算する。ホモシステ
インの場合と同様に、標識したMMAおよび標識されな
いMMAを、質量分析計による分析前に、部分的精製お
よび/または誘導体化にかけることができる。好ましい
誘導体はシリル類似体である;N−メチル−N−(t−
ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドの類
似体はとくに好ましい。
アッセイにおいて、ホモシステインのレベルは前述の手
段のいずれによっても適当にアッセイされる。本発明の
手順は好ましい。MMAは、例えば、次の文献に記載さ
れる方法によって適当にアッセイされる:Norman, E.
J., O.J.Martelo および M.D.Dento, Blood 59 (6):11
28 (1982) またはMarcel, P.D., S.P.Stabler, E.R.Pod
ell およびR.H.Allen, Anal.Biochem. 150:58−66 (19
85) 。好ましくは、試料は内部参照標準と一緒にする。
この内部参照標準は、安定なアイソトープマーカー、好
ましくはMMAの重水素化類似体で標識されたメチルマ
ロン酸の既知量からなる。次いで、存在する標識された
MMAおよび標識されないMMAの量を質量分析計で測
定し、そしてもとの試料中のMMAの量をはじめ添加し
た標識されたMMAの既知量から計算する。ホモシステ
インの場合と同様に、標識したMMAおよび標識されな
いMMAを、質量分析計による分析前に、部分的精製お
よび/または誘導体化にかけることができる。好ましい
誘導体はシリル類似体である;N−メチル−N−(t−
ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドの類
似体はとくに好ましい。
【0030】また、1種または2種以上の非スルフヒド
リルアミノ酸、例えば、メチオニンをホモシステイン、
MMA、または両者と同時に測定することが可能である
が、ただし適当な内部標準を含める。非スルフヒドリル
アミノ酸のための適当な内部標準は、ノルロイシンまた
は非スルフヒドリルアミノ酸の適当に標識された類似体
である。
リルアミノ酸、例えば、メチオニンをホモシステイン、
MMA、または両者と同時に測定することが可能である
が、ただし適当な内部標準を含める。非スルフヒドリル
アミノ酸のための適当な内部標準は、ノルロイシンまた
は非スルフヒドリルアミノ酸の適当に標識された類似体
である。
【0031】いったん葉酸塩の欠乏および/またはコバ
ラミンの欠乏が決定されると、処置の進行は処置の間ま
たは後に周期的にアッセイを反復することによって監視
することができる。場合に応じてコバラミンおよび/ま
たは葉酸塩の経口的または非経口的投与後における、血
清および/または尿中のホモシステインのレベルの低下
は、診断を確証することができる。
ラミンの欠乏が決定されると、処置の進行は処置の間ま
たは後に周期的にアッセイを反復することによって監視
することができる。場合に応じてコバラミンおよび/ま
たは葉酸塩の経口的または非経口的投与後における、血
清および/または尿中のホモシステインのレベルの低下
は、診断を確証することができる。
【0032】本発明のそれ以上の理解は、以下の非制限
的実施例から得られるであろう。上において使用したよ
うに、そして以下において特記しないかぎり、すべての
温度および温度範囲はセ氏であり、そして周囲温度およ
び室温は約20〜25℃である。用語百分率または
(%)は重量%であり、そして用語モルはグラムモルで
ある。
的実施例から得られるであろう。上において使用したよ
うに、そして以下において特記しないかぎり、すべての
温度および温度範囲はセ氏であり、そして周囲温度およ
び室温は約20〜25℃である。用語百分率または
(%)は重量%であり、そして用語モルはグラムモルで
ある。
【0033】実施例I種々の臨床的指数とコバラミンの欠乏との間の相関関係 24か月の期間(1983年9月〜1985年9月)に
わたって、われわれは7,747人の患者における血清
コバラミンのレベルを、2つのニューヨーク市の病院
(Columbia-Presbyterian Medical CenterおよびHarlem
Hospitial Center)の医師からのこの試験の要求に答え
て測定した。この群のうちで、301人の患者は200
μモル/1より低い血清レベルを有し、このレベルは精
製した固有の因子を使用する「改良された」ラジオアッ
セイキット(BioRad Laboratories,Richmond, CA) の製
造業者が述べている正常の下限である。低いコバラミン
レベルをもつ患者のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏
しているかを決定するために、すべての患者を完全に研
究することを試みた。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的
(神経学的を包含する)評価、血液および骨髄の塗抹標
本、固有因子に対する抗体についてのシリング(Schilli
ng) テストおよび血清テストを得、次いでシアノ−コバ
ラミンによる処置の課程に対する患者の応答を観察し
た。
わたって、われわれは7,747人の患者における血清
コバラミンのレベルを、2つのニューヨーク市の病院
(Columbia-Presbyterian Medical CenterおよびHarlem
Hospitial Center)の医師からのこの試験の要求に答え
て測定した。この群のうちで、301人の患者は200
μモル/1より低い血清レベルを有し、このレベルは精
製した固有の因子を使用する「改良された」ラジオアッ
セイキット(BioRad Laboratories,Richmond, CA) の製
造業者が述べている正常の下限である。低いコバラミン
レベルをもつ患者のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏
しているかを決定するために、すべての患者を完全に研
究することを試みた。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的
(神経学的を包含する)評価、血液および骨髄の塗抹標
本、固有因子に対する抗体についてのシリング(Schilli
ng) テストおよび血清テストを得、次いでシアノ−コバ
ラミンによる処置の課程に対する患者の応答を観察し
た。
【0034】コバラミンの欠乏が301人の患者のうち
138人に存在するか否かに関して確固とした結論に到
達することができた。138人のうち79人において、
臨床的症候群または血液学的症候群、または両者が存在
し、シアノ−コバラミン処置に対して明瞭に応答した。
これらの患者は欠乏であると考えた。これらの患者の臨
床的表示の分析は、ある数の驚くべき発見を示し、ここ
で多くはコバラミンの欠乏のための巨大赤芽球性貧血の
古典的特質を有さなかった。ヘマトクリットは34人
(43%)、患者のほぼ半分において正常(すなわち、
貧血は存在しない)であった。中程度に重度の貧血(H
ct<24%またはヘモグロビン<8g/dl)は79人
の患者のうち16人(すなわち1/5)において存在し
たのみであった。36人の患者(45.6%)におい
て、コバラミンの欠乏の起因させうる症候は存在しなか
った。白血球の数は85%において正常であった;血小
板の数は76%において正常であった;血清ビリルビン
は74%において正常であった;そして血清ラクテート
デヒドロゲナーゼ(LDH)は40%において正常であ
った。したがって、これらの実験室の発見は、巨大赤芽
球性貧血をもつ患者において典型的であると考えられ、
欠乏の群においてしばしば、または通常見失われてい
た。また、血清コバラミンは欠乏患者のうち23人(す
なわち29%)において>100pg/mlであり、血清コ
バラミンの低下の程度を、また、信頼性をもって使用し
て、ある患者が欠乏であるかどうかを精確に予測するこ
とができるであろうことが示された。増大したMCVで
さえ、コバラミンの欠乏のそのような特性であると考え
られるが、欠乏患者のうち15人(19%)において見
られなかった。高いMCVをもつ患者において、MCV
の増大の程度はしばしばわずかであった:79人の患者
のうち28人(すなわち35%)は100〜110flの
範囲のMCVを有した。こうして、わずかに36人(す
なわち46%)の患者は顕著に増大したMCV(>11
0fl)を有した。
138人に存在するか否かに関して確固とした結論に到
達することができた。138人のうち79人において、
臨床的症候群または血液学的症候群、または両者が存在
し、シアノ−コバラミン処置に対して明瞭に応答した。
これらの患者は欠乏であると考えた。これらの患者の臨
床的表示の分析は、ある数の驚くべき発見を示し、ここ
で多くはコバラミンの欠乏のための巨大赤芽球性貧血の
古典的特質を有さなかった。ヘマトクリットは34人
(43%)、患者のほぼ半分において正常(すなわち、
貧血は存在しない)であった。中程度に重度の貧血(H
ct<24%またはヘモグロビン<8g/dl)は79人
の患者のうち16人(すなわち1/5)において存在し
たのみであった。36人の患者(45.6%)におい
て、コバラミンの欠乏の起因させうる症候は存在しなか
った。白血球の数は85%において正常であった;血小
板の数は76%において正常であった;血清ビリルビン
は74%において正常であった;そして血清ラクテート
デヒドロゲナーゼ(LDH)は40%において正常であ
った。したがって、これらの実験室の発見は、巨大赤芽
球性貧血をもつ患者において典型的であると考えられ、
欠乏の群においてしばしば、または通常見失われてい
た。また、血清コバラミンは欠乏患者のうち23人(す
なわち29%)において>100pg/mlであり、血清コ
バラミンの低下の程度を、また、信頼性をもって使用し
て、ある患者が欠乏であるかどうかを精確に予測するこ
とができるであろうことが示された。増大したMCVで
さえ、コバラミンの欠乏のそのような特性であると考え
られるが、欠乏患者のうち15人(19%)において見
られなかった。高いMCVをもつ患者において、MCV
の増大の程度はしばしばわずかであった:79人の患者
のうち28人(すなわち35%)は100〜110flの
範囲のMCVを有した。こうして、わずかに36人(す
なわち46%)の患者は顕著に増大したMCV(>11
0fl)を有した。
【0035】確固とした結論に到達できた138人の患
者の中に、シアノ−コバラミンに対していかなる方法に
おいても明瞭に応答しない59人の患者が存在した。こ
れらの患者は欠乏であると考えなかった。これらの欠乏
でない群において、6人(すなわち10%)は100pg
/mlより低い血清コバラミンを有し、MCVまたは血清
コバラミンの抑制の程度を患者がコバラミンに欠乏して
いるかどうかの信頼性ある指示として使用できないこと
がさらに示された。
者の中に、シアノ−コバラミンに対していかなる方法に
おいても明瞭に応答しない59人の患者が存在した。こ
れらの患者は欠乏であると考えなかった。これらの欠乏
でない群において、6人(すなわち10%)は100pg
/mlより低い血清コバラミンを有し、MCVまたは血清
コバラミンの抑制の程度を患者がコバラミンに欠乏して
いるかどうかの信頼性ある指示として使用できないこと
がさらに示された。
【0036】われわれは、実質的の数の欠乏患者がほん
のわずかに低い血清コバラミンレベル、すなわち、10
0〜200pg/mlの範囲とすることを発見した後、20
0〜300pg/ml(低い正常)の範囲の血清コバラミン
をもつ患者のすべてを再検討した。このようにして、わ
れわれは、>200pg/mlの血清コバラミンレベルを有
する、コバラミンが明瞭に欠乏した、いく人かの患者を
発見した。
のわずかに低い血清コバラミンレベル、すなわち、10
0〜200pg/mlの範囲とすることを発見した後、20
0〜300pg/ml(低い正常)の範囲の血清コバラミン
をもつ患者のすべてを再検討した。このようにして、わ
れわれは、>200pg/mlの血清コバラミンレベルを有
する、コバラミンが明瞭に欠乏した、いく人かの患者を
発見した。
【0037】これらの発見により、われわれは、コバラ
ミンの欠乏をもつ多数の患者は、通常コバラミンの欠乏
において存在することが期待される「典型的な」臨床的
および血液学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在する
かどうかを確立することを促進する、新しい試験が明ら
かに必要であるという結論に到達した。次いで、79人
の欠乏患者および59人の非欠乏患者からの標本中のホ
モシステインおよびメチルマロン酸の血清レベルを測定
した。ホモシステインおよびメチルマロン酸の両者のレ
ベルは、79人の患者のうち60人(76%)において
明瞭に増大していた(ホモシステイン、30μモル以上
およびメチルマロン酸、150ng/ml以上)。ホモシス
テインレベルは79人の患者のうち10人(13%)に
おいて明瞭に増大しており(メチルマロン酸レベルは明
瞭に増大しないで)、そしてメチルマロン酸レベルは7
9人の患者のうち4人(5%)において明瞭に増大して
いた(ホモシステインレベルは明瞭に増大しないで)。
79人の欠乏患者の残りの5人(6%)において、いず
れの試験も明瞭に増大しなかった。
ミンの欠乏をもつ多数の患者は、通常コバラミンの欠乏
において存在することが期待される「典型的な」臨床的
および血液学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在する
かどうかを確立することを促進する、新しい試験が明ら
かに必要であるという結論に到達した。次いで、79人
の欠乏患者および59人の非欠乏患者からの標本中のホ
モシステインおよびメチルマロン酸の血清レベルを測定
した。ホモシステインおよびメチルマロン酸の両者のレ
ベルは、79人の患者のうち60人(76%)において
明瞭に増大していた(ホモシステイン、30μモル以上
およびメチルマロン酸、150ng/ml以上)。ホモシス
テインレベルは79人の患者のうち10人(13%)に
おいて明瞭に増大しており(メチルマロン酸レベルは明
瞭に増大しないで)、そしてメチルマロン酸レベルは7
9人の患者のうち4人(5%)において明瞭に増大して
いた(ホモシステインレベルは明瞭に増大しないで)。
79人の欠乏患者の残りの5人(6%)において、いず
れの試験も明瞭に増大しなかった。
【0038】対照的に、59人の欠乏でない患者におい
て、両者の試験は1人(2%)患者において明瞭に増大
した;ホモシステインのみは6人(10%)において明
瞭に増大した;そしてメチルマロン酸レベルは9人(1
5%)において明瞭に増大した。残りの43人(73
%)の患者において、いずれの試験も明瞭に増大しなか
った。一方または双方の試験が明瞭に増大した、欠乏で
ない患者の小部分においてさえ、試験は診断的に有用で
あることを示した。一方または双方の試験が明瞭に増大
した16人の患者のうち11人は、コバラミンの吸収の
隠れた疾患、例えば、悪性の貧血、重度の萎縮性胃炎お
よび回腸の病気を有し、ある後の時においてコバラミン
の欠乏の潜在的原因を有することが証明された。このよ
うな患者は予防的シアノ−コバラミン処置を受ける必要
がある。16人のうち追加の2人の患者は、血清ホモシ
ステインの増大を説明する隠れた葉酸の欠乏を有した。
て、両者の試験は1人(2%)患者において明瞭に増大
した;ホモシステインのみは6人(10%)において明
瞭に増大した;そしてメチルマロン酸レベルは9人(1
5%)において明瞭に増大した。残りの43人(73
%)の患者において、いずれの試験も明瞭に増大しなか
った。一方または双方の試験が明瞭に増大した、欠乏で
ない患者の小部分においてさえ、試験は診断的に有用で
あることを示した。一方または双方の試験が明瞭に増大
した16人の患者のうち11人は、コバラミンの吸収の
隠れた疾患、例えば、悪性の貧血、重度の萎縮性胃炎お
よび回腸の病気を有し、ある後の時においてコバラミン
の欠乏の潜在的原因を有することが証明された。このよ
うな患者は予防的シアノ−コバラミン処置を受ける必要
がある。16人のうち追加の2人の患者は、血清ホモシ
ステインの増大を説明する隠れた葉酸の欠乏を有した。
【0039】これらの試験は、また、葉酸塩の欠乏の診
断において有用であると思われる。貧血をもつ連続的に
研究した120人のアルコールの患者において、骨髄を
検査した。38人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨
大赤芽球性であった。コバラミンの欠乏を有する1人の
患者を分析から排除した後、残りの37人の患者は葉酸
の欠乏を有する可能性が高度に大きいと考えられた。血
清葉酸塩濃度(葉酸塩の欠乏について最も広く使用され
ている診断)は37人の患者のうち15人(41%)に
おいて低く、これに対して血清ホモシステインは37人
の患者のうち27人(73%)において明瞭に増大して
いた。こうして、血清ホモシステインは血清葉酸塩濃度
よりも葉酸塩の欠乏の検出について感度のある試験であ
ることがわかった。赤血球の葉酸塩濃度(RCF)を測
定した、巨大赤芽球性骨髄をもつ15人の患者におい
て、RCFは15人のうち10人(67%)において低
く、そして血清ホモシステインは13人(87%)にお
いて明瞭に増大していた。こうして、血清ホモシステイ
ンのアッセイは、また、赤血球葉酸塩アッセイよりも感
度が高かった。
断において有用であると思われる。貧血をもつ連続的に
研究した120人のアルコールの患者において、骨髄を
検査した。38人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨
大赤芽球性であった。コバラミンの欠乏を有する1人の
患者を分析から排除した後、残りの37人の患者は葉酸
の欠乏を有する可能性が高度に大きいと考えられた。血
清葉酸塩濃度(葉酸塩の欠乏について最も広く使用され
ている診断)は37人の患者のうち15人(41%)に
おいて低く、これに対して血清ホモシステインは37人
の患者のうち27人(73%)において明瞭に増大して
いた。こうして、血清ホモシステインは血清葉酸塩濃度
よりも葉酸塩の欠乏の検出について感度のある試験であ
ることがわかった。赤血球の葉酸塩濃度(RCF)を測
定した、巨大赤芽球性骨髄をもつ15人の患者におい
て、RCFは15人のうち10人(67%)において低
く、そして血清ホモシステインは13人(87%)にお
いて明瞭に増大していた。こうして、血清ホモシステイ
ンのアッセイは、また、赤血球葉酸塩アッセイよりも感
度が高かった。
【0040】実施例IIヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な好まし
い手順 ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、D,L−
〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕
ホモシスティン〔これは、現在、Merck Sharp andDohme
Isotopes (Montreal, Canada) から入手可能である〕
と一緒にし、そしてよく混合する。
い手順 ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、D,L−
〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕
ホモシスティン〔これは、現在、Merck Sharp andDohme
Isotopes (Montreal, Canada) から入手可能である〕
と一緒にし、そしてよく混合する。
【0041】次いで、過剰の還元剤(例えば、2−メル
カプトエタノール、ジチオスレイトールまたはホウ水素
化ナトリウム)を添加して、すべてのホモシステインが
遊離の形態に確実に還元されるようにする。必要に応じ
て、キレート化剤、例えば、EDTAまたはEGTAを
添加して、そうでなければ遊離のスルフヒドリル基に結
合しうる、金属イオンを除去することができる。この反
応混合物を菌株し、必要に応じて約25〜約150℃に
約1分〜約60分間加熱して、標識されたホモシステイ
ンおよび標識されないホモシステインのランダム化を確
実にする。
カプトエタノール、ジチオスレイトールまたはホウ水素
化ナトリウム)を添加して、すべてのホモシステインが
遊離の形態に確実に還元されるようにする。必要に応じ
て、キレート化剤、例えば、EDTAまたはEGTAを
添加して、そうでなければ遊離のスルフヒドリル基に結
合しうる、金属イオンを除去することができる。この反
応混合物を菌株し、必要に応じて約25〜約150℃に
約1分〜約60分間加熱して、標識されたホモシステイ
ンおよび標識されないホモシステインのランダム化を確
実にする。
【0042】次いで、蛋白質を、例えば、加熱変性、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により、あるい
は蛋白質を沈殿させる化合物、例えば、スルホサリチル
酸、ピクリン酸、硫酸アンモニウムなどを添加すること
によって除去する。得られる混合物を攪拌し、そして遠
心して蛋白質の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場
合、上澄みを酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例
えば、 BioRad AG50W−X8(200〜400メッ
シュ)、水素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)
に添加して、負に帯電した塩類を除去する。次いで、ア
ミノ酸を溶離し、塩基性のpHに調節し、そして陰イオン
交換カラム、例えば、 BioRad AG1−X8(200〜
400メッシュ)、酢酸塩型に添加して、正に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、乾燥し、
そして小型の密閉可能なバイアル、好ましくはテフロン
でライニングした隔膜のふたをもつバイアルに移す。次
いで、アセトニトリル中のN−メチル−N−(t−ブチ
ルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを添加
し、バイアルを密閉し、そして約20〜約150℃にお
いて約5分間〜約1夜放置して、シリル化反応を完結さ
せる。好ましくは、バイアルは室温において1夜放置す
るか、あるいは約80℃に約1時間加熱する。次いで、
過剰の誘導体化剤を、水(これは攪拌化剤を加水分解す
る)および揮発性溶媒の添加によって除去できる。この
混合物を遠心して乳濁液を透明にし、そして誘導体剤の
大部分を含有する非水性層を透明なバイアルに移し、そ
して例えば、窒素の下で、ほとんと蒸発乾固して体積を
減少させる。
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により、あるい
は蛋白質を沈殿させる化合物、例えば、スルホサリチル
酸、ピクリン酸、硫酸アンモニウムなどを添加すること
によって除去する。得られる混合物を攪拌し、そして遠
心して蛋白質の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場
合、上澄みを酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例
えば、 BioRad AG50W−X8(200〜400メッ
シュ)、水素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)
に添加して、負に帯電した塩類を除去する。次いで、ア
ミノ酸を溶離し、塩基性のpHに調節し、そして陰イオン
交換カラム、例えば、 BioRad AG1−X8(200〜
400メッシュ)、酢酸塩型に添加して、正に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、乾燥し、
そして小型の密閉可能なバイアル、好ましくはテフロン
でライニングした隔膜のふたをもつバイアルに移す。次
いで、アセトニトリル中のN−メチル−N−(t−ブチ
ルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを添加
し、バイアルを密閉し、そして約20〜約150℃にお
いて約5分間〜約1夜放置して、シリル化反応を完結さ
せる。好ましくは、バイアルは室温において1夜放置す
るか、あるいは約80℃に約1時間加熱する。次いで、
過剰の誘導体化剤を、水(これは攪拌化剤を加水分解す
る)および揮発性溶媒の添加によって除去できる。この
混合物を遠心して乳濁液を透明にし、そして誘導体剤の
大部分を含有する非水性層を透明なバイアルに移し、そ
して例えば、窒素の下で、ほとんと蒸発乾固して体積を
減少させる。
【0043】次いで、得られる調製物をガスクロマトグ
ラフ/質量分析計上に注入し、この装置は約室温〜約3
50℃の温度の注入口および約5〜約45psi のカラム
ヘッドを有する。毛管のカラムを約20〜約250℃に
おいて約1〜約15分間運転する。その後温度を約75
〜約350℃に約1〜約30℃/分で上昇させる。ホモ
システインが溶離する精確な時間および温度は、既知量
のホモシステインを最初に展開することによって決定す
る。その後、試料を展開し、そして走査のモードで、あ
るいは好ましくは選択したイオンを監視するモードでデ
ータを集める。
ラフ/質量分析計上に注入し、この装置は約室温〜約3
50℃の温度の注入口および約5〜約45psi のカラム
ヘッドを有する。毛管のカラムを約20〜約250℃に
おいて約1〜約15分間運転する。その後温度を約75
〜約350℃に約1〜約30℃/分で上昇させる。ホモ
システインが溶離する精確な時間および温度は、既知量
のホモシステインを最初に展開することによって決定す
る。その後、試料を展開し、そして走査のモードで、あ
るいは好ましくは選択したイオンを監視するモードでデ
ータを集める。
【0044】実施例 IIIヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な特異的
手順 L−ホモシステインおよびL−システインはシグマ・ケ
ミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.Louis,
MO) から購入し、そしてN−メチル−N−(t−ブチル
ジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドはピアース
・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Co.) (Rock
ford, IL) から入手した;D,L−〔3,3,3′,
3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスティン
(98.4%)は、メルク・シャープ・アンド・ドーム
・アイソトープス (Merck Sharp andDohme Isotopes (M
ontreal, Canada) から入手した;そしてD,L−
〔3,3,3′,3′−2 H4 〕システィン(98%)
およびL−〔メチル−2 H3 〕メチオニン(98%)
は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ (Ca
mbridge Isotope Laboratories) (Woburn, MA) から購
入した。血液の試料は、通常健康な血液供与者からベレ
・ボノフィルス・ブラッド・バンク(Belle Bonfils Blo
od Bnk, Denver, CO) において血液共与時間に得た。連
続的血液の共与者は、次の年令群の各々において5人の
男性および5人の女性から試料が得られるように選択し
た:18〜26,27〜35,36〜45,46〜55
および56〜65(合計50の試料)。試料は9a.m.お
よび1p.m.において得、室温において1〜4時間凝固さ
せ、1500×gで30分間遠心し、そして血清を取り
出し、そして−20℃において貯蔵した。他の試料は実
験室の人員から得た。それらを室温において0〜24時
間凝固させた後4℃において遠心するか、あるいはヘパ
リンまたはEDTAを添加し、室温において0〜24時
間放置した後、血漿を4℃において遠心によって集め
た。スプレイグ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、
250−350g、をSASCO,インコーポレーテッ
ド(Omaha, NB) から入手し、そして血液をエーテル麻酔
の下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料
について前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。
手順 L−ホモシステインおよびL−システインはシグマ・ケ
ミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.Louis,
MO) から購入し、そしてN−メチル−N−(t−ブチル
ジメチルシリル)トリフルオロアセトアミドはピアース
・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Co.) (Rock
ford, IL) から入手した;D,L−〔3,3,3′,
3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスティン
(98.4%)は、メルク・シャープ・アンド・ドーム
・アイソトープス (Merck Sharp andDohme Isotopes (M
ontreal, Canada) から入手した;そしてD,L−
〔3,3,3′,3′−2 H4 〕システィン(98%)
およびL−〔メチル−2 H3 〕メチオニン(98%)
は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ (Ca
mbridge Isotope Laboratories) (Woburn, MA) から購
入した。血液の試料は、通常健康な血液供与者からベレ
・ボノフィルス・ブラッド・バンク(Belle Bonfils Blo
od Bnk, Denver, CO) において血液共与時間に得た。連
続的血液の共与者は、次の年令群の各々において5人の
男性および5人の女性から試料が得られるように選択し
た:18〜26,27〜35,36〜45,46〜55
および56〜65(合計50の試料)。試料は9a.m.お
よび1p.m.において得、室温において1〜4時間凝固さ
せ、1500×gで30分間遠心し、そして血清を取り
出し、そして−20℃において貯蔵した。他の試料は実
験室の人員から得た。それらを室温において0〜24時
間凝固させた後4℃において遠心するか、あるいはヘパ
リンまたはEDTAを添加し、室温において0〜24時
間放置した後、血漿を4℃において遠心によって集め
た。スプレイグ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、
250−350g、をSASCO,インコーポレーテッ
ド(Omaha, NB) から入手し、そして血液をエーテル麻酔
の下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料
について前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。
【0045】5ナノモルのD,L−〔3,3,3′,
3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスティン、
25ナノモルのD,L−〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕システィンおよび15ナノモルのL−〔メチル
−2 H3 〕メチオニンを含有するH2Oの50μlの体
積を100μlの血清に添加した。混合後、158μg
のNa2 EDTAおよび100μlの2−メルカプトエ
タノールを含有するH2 Oの2.5mlを添加し、混合
し、そして100℃において15分間沸騰させた。室温
に冷却した後、25μgのスルホサリチル酸を含有する
H2 Oの100μlおよび6NのHClの25μlを添
加し、次いで混合し、そして1000×gで15分間遠
心した。次いで、上澄みを200μlの陽イオン交換樹
脂AG 50W−X8(200〜400メッシュ)、水
素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)(これはH
2 O中で予備平衡化してある)を含有する使捨てカラム
に適用した。6mlのH2 Oで洗浄した後、アミノ酸を2
mlの8NのNH4 OHで溶離した。溶離液は、直接、2
00μlの陰イオン交換樹脂AG1−X8(100〜2
00メッシュ)酢酸塩型(BioRad Laboratories, Richm
ond, CA) (これはH2 O中で予備平衡化してある)を含
有する使捨てカラムに適用した。9mlのH2 Oで洗浄し
た後、アミノ酸を2mlの0.1mlのHClで溶離し、そ
してスピードVacカラム濃縮器(Savant Instrument
s, Inc., Hicksville, NY) で乾固した。次いで、乾燥
した試料を250μlのH2 O中に溶解し、300μl
のリアクチ (Reacti) バイアル(Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) に移し、そして真空濃縮装置で乾固し
た。
3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスティン、
25ナノモルのD,L−〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕システィンおよび15ナノモルのL−〔メチル
−2 H3 〕メチオニンを含有するH2Oの50μlの体
積を100μlの血清に添加した。混合後、158μg
のNa2 EDTAおよび100μlの2−メルカプトエ
タノールを含有するH2 Oの2.5mlを添加し、混合
し、そして100℃において15分間沸騰させた。室温
に冷却した後、25μgのスルホサリチル酸を含有する
H2 Oの100μlおよび6NのHClの25μlを添
加し、次いで混合し、そして1000×gで15分間遠
心した。次いで、上澄みを200μlの陽イオン交換樹
脂AG 50W−X8(200〜400メッシュ)、水
素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)(これはH
2 O中で予備平衡化してある)を含有する使捨てカラム
に適用した。6mlのH2 Oで洗浄した後、アミノ酸を2
mlの8NのNH4 OHで溶離した。溶離液は、直接、2
00μlの陰イオン交換樹脂AG1−X8(100〜2
00メッシュ)酢酸塩型(BioRad Laboratories, Richm
ond, CA) (これはH2 O中で予備平衡化してある)を含
有する使捨てカラムに適用した。9mlのH2 Oで洗浄し
た後、アミノ酸を2mlの0.1mlのHClで溶離し、そ
してスピードVacカラム濃縮器(Savant Instrument
s, Inc., Hicksville, NY) で乾固した。次いで、乾燥
した試料を250μlのH2 O中に溶解し、300μl
のリアクチ (Reacti) バイアル(Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) に移し、そして真空濃縮装置で乾固し
た。
【0046】10μlのアセトニトリルおよび10μl
のN−メチル−N−(t−ブチルジメチルシリル)トリ
フルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それらの
テフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そし
てそれらを室温(22℃)で1夜放置するか、あるいは
それらを80℃に1時間加熱することによって、アミノ
酸のt−ブチルジメチルシリル誘導体を調製した。10
0μlのヘキサンを添加し、10秒間渦形成した後、2
0μlのH2 Oを添加して、未反応の誘導体化剤を加水
分解した。さらに10秒間渦形成した後、試料を100
0×gで5分間遠心し、そして上のヘキサン層をデカン
テーションし、マイクロ遠心管に移し、そして窒素の流
れの適用によってほぼ10μlに乾燥した。完全な乾固
を回避するように注意した。なぜなら、これは誘導体の
主要な部分を失わせるからである。ほぼ2μlの毛管カ
ラム上に落下する針の注入装置(falling-needle inject
or) で注入した。
のN−メチル−N−(t−ブチルジメチルシリル)トリ
フルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それらの
テフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そし
てそれらを室温(22℃)で1夜放置するか、あるいは
それらを80℃に1時間加熱することによって、アミノ
酸のt−ブチルジメチルシリル誘導体を調製した。10
0μlのヘキサンを添加し、10秒間渦形成した後、2
0μlのH2 Oを添加して、未反応の誘導体化剤を加水
分解した。さらに10秒間渦形成した後、試料を100
0×gで5分間遠心し、そして上のヘキサン層をデカン
テーションし、マイクロ遠心管に移し、そして窒素の流
れの適用によってほぼ10μlに乾燥した。完全な乾固
を回避するように注意した。なぜなら、これは誘導体の
主要な部分を失わせるからである。ほぼ2μlの毛管カ
ラム上に落下する針の注入装置(falling-needle inject
or) で注入した。
【0047】試料の分析はヘウレット−パッカード(Hew
lett-Packard) (Palo Alto, CA) 5992Bガスクロマ
トグラフィー質量分析計で実施し、そしてこの装置は9
825B計算器、9876Aプリンターおよび分子噴射
分離器を装備した。注入口を変更して、落下する針の注
入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャリヤー
ガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分割は、
デュラボンド (Durabond)DB−1溶融シリカ毛管カラ
ム(30m×0.25mm内径、0.25μmのフィルム
厚さ)〔J&Wサイエンティフィック・インコーポレー
テッド(RanchoCordova, CA) から入手した〕で達成し
た。
lett-Packard) (Palo Alto, CA) 5992Bガスクロマ
トグラフィー質量分析計で実施し、そしてこの装置は9
825B計算器、9876Aプリンターおよび分子噴射
分離器を装備した。注入口を変更して、落下する針の注
入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャリヤー
ガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分割は、
デュラボンド (Durabond)DB−1溶融シリカ毛管カラ
ム(30m×0.25mm内径、0.25μmのフィルム
厚さ)〔J&Wサイエンティフィック・インコーポレー
テッド(RanchoCordova, CA) から入手した〕で達成し
た。
【0048】ガスクロマトグラフー質量分析計は、25
0℃の注入口の温度および26psiのカラムヘッドの圧
力で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを
180℃に平衡化し、そして試料注入後1分に8℃/分
で276℃に増加した。データを選択したイオン監視の
モードで4.8〜9.6分に集めた。次の〔M−57〕
+ イオンを50ミリ秒の滞留時間で各々について監視し
た:ホモシステインモノマー、m/z 420.2;
〔3,3,4,4−2 H4 〕ホモシステインモノマー、
m/z 424.2;システインモノマー、m/z 4
06.2;〔3,3−2 H2 〕システインモノマー、m
/z 408.2;メチオニン、m/z320.2;お
よび〔メチル−2 H3 〕メチオニン、m/z 323.
2。合計のホモシステインは、ほぼ8.9分において溶
離されるm/z 420.2ピークの積分した面積(精
確な時間は標準を使用して毎日決定した)を同一時間に
溶離したm/z 424.2ピークの積分した面積で割
り、次いで各試料に添加した〔3,3,4,4−
2 H4 〕ホモシステインモノマーの等しい量である10
0μモル/1を掛けることによって定量した。合計のシ
ステインは、同一の方法で、ほぼ7.7分に溶離したm
/z 406.2およびm/z 408.2のピークを
利用し、そして試料に添加した〔3,3−2 H2 〕シス
テインモノマーの等しい量である、500μモル/1を
それらの比に掛けることによって定量する。メチオニン
は、同一の方法で、ほぼ5.4分に溶離したm/z 3
20.2およびm/z 323.2のピークを利用し、
そして試料に添加した〔メチル−2 H3 〕メチオニンの
量である、150μモル/1をそれらの比に掛けること
によって定量する。3つの内部標準についての積分した
面積、すなわち、それぞれ、約8.9、7.7および
5.4分に溶離するm/z 424.2、混合物40
8.2およびm/z 323.2のピークは、天然に産
出するアイソトープの存在量の結果として、それらに寄
与される量について、合計のホモシステイン、内因性合
計のシステインおよび内因性メチオニンによって補正す
る。毎日の基準に基づいて富んでないホモシステイン、
システインおよびメチオニンを使用して決定した、これ
らの相関関係は次の通りであった:i)8.9分におけ
るm/z 420.2ピークの面積のほぼ1.5%は
8.9分におけるm/z 424.2ピークとして存在
し、ii)7.7分におけるm/z 406.2ピークの
面積のほぼ21.4%は7.7分におけるm/z 40
8.2ピークとして存在し、そして5.4分におけるm
/z 320.2ピークの面積のほぼ3.1%は5.4
分におけるm/z 323.2ピークとして存在した。
0℃の注入口の温度および26psiのカラムヘッドの圧
力で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを
180℃に平衡化し、そして試料注入後1分に8℃/分
で276℃に増加した。データを選択したイオン監視の
モードで4.8〜9.6分に集めた。次の〔M−57〕
+ イオンを50ミリ秒の滞留時間で各々について監視し
た:ホモシステインモノマー、m/z 420.2;
〔3,3,4,4−2 H4 〕ホモシステインモノマー、
m/z 424.2;システインモノマー、m/z 4
06.2;〔3,3−2 H2 〕システインモノマー、m
/z 408.2;メチオニン、m/z320.2;お
よび〔メチル−2 H3 〕メチオニン、m/z 323.
2。合計のホモシステインは、ほぼ8.9分において溶
離されるm/z 420.2ピークの積分した面積(精
確な時間は標準を使用して毎日決定した)を同一時間に
溶離したm/z 424.2ピークの積分した面積で割
り、次いで各試料に添加した〔3,3,4,4−
2 H4 〕ホモシステインモノマーの等しい量である10
0μモル/1を掛けることによって定量した。合計のシ
ステインは、同一の方法で、ほぼ7.7分に溶離したm
/z 406.2およびm/z 408.2のピークを
利用し、そして試料に添加した〔3,3−2 H2 〕シス
テインモノマーの等しい量である、500μモル/1を
それらの比に掛けることによって定量する。メチオニン
は、同一の方法で、ほぼ5.4分に溶離したm/z 3
20.2およびm/z 323.2のピークを利用し、
そして試料に添加した〔メチル−2 H3 〕メチオニンの
量である、150μモル/1をそれらの比に掛けること
によって定量する。3つの内部標準についての積分した
面積、すなわち、それぞれ、約8.9、7.7および
5.4分に溶離するm/z 424.2、混合物40
8.2およびm/z 323.2のピークは、天然に産
出するアイソトープの存在量の結果として、それらに寄
与される量について、合計のホモシステイン、内因性合
計のシステインおよび内因性メチオニンによって補正す
る。毎日の基準に基づいて富んでないホモシステイン、
システインおよびメチオニンを使用して決定した、これ
らの相関関係は次の通りであった:i)8.9分におけ
るm/z 420.2ピークの面積のほぼ1.5%は
8.9分におけるm/z 424.2ピークとして存在
し、ii)7.7分におけるm/z 406.2ピークの
面積のほぼ21.4%は7.7分におけるm/z 40
8.2ピークとして存在し、そして5.4分におけるm
/z 320.2ピークの面積のほぼ3.1%は5.4
分におけるm/z 323.2ピークとして存在した。
【0049】システイン−2−メルカプトエタノール、
ホモシステイン−2−メルカプトエタノール、システィ
ン、ホモシステイン−システイン二量体、およびホモシ
スティンを検出しかつ監視する実験において、実施時間
を20分に延長し、そして最終温度を335℃に上昇さ
せた。システィンおよびホモシスティンについてのスペ
クトルは、2−メルカプトエタノールを使用する標準の
還元を用いないで、これらの化合物を直接誘導体化する
ことによって得た。システイン−2−メルカプトエタノ
ールおよびホモシステイン−2−メルカプトエタノール
についてのスペクトルは、それぞれ、システィンおよび
ホモシスティンから、これらの化合物を誘導体化前に2
−メルカプトエタノールで還元する実験において得た。
後者の技術を用いてホモシステイン−システイン二量体
についてスペクトルを得たが、ただしホモシスティンお
よびシスティンの等しい混合物を2−メルカプトエタノ
ールで還元し、次いで誘導体化した。アッセイの感度
は、例えば、ホモシステインモノマー対〔3,3,4,
4−2 H4 〕ホモシステインモノマーの比を決定するこ
とによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載さ
れている直線性から変動する:Zinn, A.B., D.G.Hine,
M.J.Mahoney およびK.Tanaka, Pediatr, Res.16 : 740
−745 (1982)。
ホモシステイン−2−メルカプトエタノール、システィ
ン、ホモシステイン−システイン二量体、およびホモシ
スティンを検出しかつ監視する実験において、実施時間
を20分に延長し、そして最終温度を335℃に上昇さ
せた。システィンおよびホモシスティンについてのスペ
クトルは、2−メルカプトエタノールを使用する標準の
還元を用いないで、これらの化合物を直接誘導体化する
ことによって得た。システイン−2−メルカプトエタノ
ールおよびホモシステイン−2−メルカプトエタノール
についてのスペクトルは、それぞれ、システィンおよび
ホモシスティンから、これらの化合物を誘導体化前に2
−メルカプトエタノールで還元する実験において得た。
後者の技術を用いてホモシステイン−システイン二量体
についてスペクトルを得たが、ただしホモシスティンお
よびシスティンの等しい混合物を2−メルカプトエタノ
ールで還元し、次いで誘導体化した。アッセイの感度
は、例えば、ホモシステインモノマー対〔3,3,4,
4−2 H4 〕ホモシステインモノマーの比を決定するこ
とによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載さ
れている直線性から変動する:Zinn, A.B., D.G.Hine,
M.J.Mahoney およびK.Tanaka, Pediatr, Res.16 : 740
−745 (1982)。
【0050】合計ホモシステイン、メチオニンおよび合
計システインの尿からの清浄化は、合計ホモシステイン
について例示したように次の等式で決定した:合計ホモ
システイン/クレアチニンの清浄化比=100×〔尿の
合計ホモシステイン(μモル/1)/尿のクレアチニン
(μモル/1)/血清合計ホモシステイン(μモル/
1)/血清クレアチニン(μモル/1)〕この手順にお
いて利用する部分的試料の精製の長大な性質は必要であ
った。なぜなら、アミノ酸および他の有機化合物の複雑
な混合物が血清および尿の中に存在し、そして存在する
合計ホモシステインの濃度が比較的低かったからであ
る。既知量の〔メチル−14C〕メチオニンまたは〔U14
C〕システィンを血清および尿の試料に添加する実験
は、両者のアミノ酸からの放射能のほぼ70%が最終の
ヘキサン溶液中に、長大な精製および誘導体化の手順の
終りに回収されたことを示した。同様な回収の研究は、
放射性標識したホモシスティンが商業的に入手できない
ので、ホモシスティンについて実施しなかった。
計システインの尿からの清浄化は、合計ホモシステイン
について例示したように次の等式で決定した:合計ホモ
システイン/クレアチニンの清浄化比=100×〔尿の
合計ホモシステイン(μモル/1)/尿のクレアチニン
(μモル/1)/血清合計ホモシステイン(μモル/
1)/血清クレアチニン(μモル/1)〕この手順にお
いて利用する部分的試料の精製の長大な性質は必要であ
った。なぜなら、アミノ酸および他の有機化合物の複雑
な混合物が血清および尿の中に存在し、そして存在する
合計ホモシステインの濃度が比較的低かったからであ
る。既知量の〔メチル−14C〕メチオニンまたは〔U14
C〕システィンを血清および尿の試料に添加する実験
は、両者のアミノ酸からの放射能のほぼ70%が最終の
ヘキサン溶液中に、長大な精製および誘導体化の手順の
終りに回収されたことを示した。同様な回収の研究は、
放射性標識したホモシスティンが商業的に入手できない
ので、ホモシスティンについて実施しなかった。
【0051】ホモシステインのt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の構造およびm/z値を、断片化の位置および
〔M〕+ ,〔M−15〕+ ,〔M−57〕+ および〔M
−159〕+ における対応する断片のm/z値のいくつ
かと一緒に下に示す:
ル誘導体の構造およびm/z値を、断片化の位置および
〔M〕+ ,〔M−15〕+ ,〔M−57〕+ および〔M
−159〕+ における対応する断片のm/z値のいくつ
かと一緒に下に示す:
【0052】
【化2】
【0053】ホモシステインのモノマー、システインの
モノマー、ホモシスティン、システィン、ホモシステイ
ン−2−メルカプトエタノール、システイン−2−メル
カプトエタノール、ホモシステイン−システイン二量
体、およびメチオニンの分子量を、図1にそれらのt−
ブチルジメチルシリル誘導体の質量スペクトルと一緒に
示す。特定の誘導体の分子量は、各存在する−CCO
H,−NH2 ,−SHおよび−OH基に結合した各t−
ブチルジメチルシリル基について、アミノ酸またはジサ
ルファイドの分子量+114に等しい。ホモシステイン
のモノマー、システインのモノマー、ホモシステイン−
2−メルカプトエタノール、システイン−2−メルカプ
トエタノールおよびメチオニンの場合において、主要な
ピークは〔M−57〕+ に存在した。ホモシスチン、シ
スチィンおよびホモシステイン−システイン二量体の場
合において、主要なピークは〔M/2〕+ に存在した。
〔M−57〕+ ピークはホモシスチンでは観察されず、
そしてほんの小さい〔M−57〕+ がシスティンおよび
ホモシステイン−システイン二量体について観察され
た。
モノマー、ホモシスティン、システィン、ホモシステイ
ン−2−メルカプトエタノール、システイン−2−メル
カプトエタノール、ホモシステイン−システイン二量
体、およびメチオニンの分子量を、図1にそれらのt−
ブチルジメチルシリル誘導体の質量スペクトルと一緒に
示す。特定の誘導体の分子量は、各存在する−CCO
H,−NH2 ,−SHおよび−OH基に結合した各t−
ブチルジメチルシリル基について、アミノ酸またはジサ
ルファイドの分子量+114に等しい。ホモシステイン
のモノマー、システインのモノマー、ホモシステイン−
2−メルカプトエタノール、システイン−2−メルカプ
トエタノールおよびメチオニンの場合において、主要な
ピークは〔M−57〕+ に存在した。ホモシスチン、シ
スチィンおよびホモシステイン−システイン二量体の場
合において、主要なピークは〔M/2〕+ に存在した。
〔M−57〕+ ピークはホモシスチンでは観察されず、
そしてほんの小さい〔M−57〕+ がシスティンおよび
ホモシステイン−システイン二量体について観察され
た。
【0054】図2は、(A)メチオニン、システインお
よびホモシステインを1:3:1で含有する混合物;
(B)100μlの正常ヒト血清;(C)100μlの
正常ヒト血清;(D)100μlの正常ヒト尿から還元
後に得られたアミノ酸類のt−ブチルジメチルシリル誘
導体類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ酸は、
次の通りであった:メチオニン(MET);システイン
のモノマー(CYS);ホモシステインのモノマー(H
CYS);〔メチル−2 H3 〕メチオニン(Met
*);〔3,3−2 H2 〕システインモノマー;および
〔3,3,4,4−2H4 〕ホモシステインモノマー
(HCYS*)。MET*,CYS*およびHCYS*
は試料Aには添加せず、そしてそれらの表示を有するピ
ークは、天然に産出するアイソトープの存在量の結果と
して、それぞれ、MET,CYSおよびHCYSによっ
てそれらに寄与される量を表わす。かっこ内の数字は、
選択したイオンの監視によって走査したm/zについて
の値である。「F.S.」についての値は太いダッシュ
のトレースの全規模についての相対値である;細いダッ
シュのトレースは10×の減衰である。内因性合計ホモ
システインについて決定した値は、B,CおよびDにつ
いて、それぞれ、18.9、6.5および3.6μモル
/1であった。内因性合計システインについて決定した
値は、B,CおよびDについて、それぞれ、369、1
73および238μモル/1であった。内因性合計メチ
オニンについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ16.8、60.4および3.2μモル/
1であった。図2Aは、毛管カラムがこれらの3種類の
アミノ酸を完全に分離することを立証している。システ
イン−2−メルカプトエタノール、ホモシステイン−2
−メルカプトエタノール、システィン、ホモシステイン
−システインおよびホモシスチンの溶離プロフィルは示
されていないが、それらは、また、存在し、そして、そ
れぞれ、11.8、12.9、16.3、17.4およ
び18.4分の溶離時間をもつ単一の対照ピークとして
溶離される。
よびホモシステインを1:3:1で含有する混合物;
(B)100μlの正常ヒト血清;(C)100μlの
正常ヒト血清;(D)100μlの正常ヒト尿から還元
後に得られたアミノ酸類のt−ブチルジメチルシリル誘
導体類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ酸は、
次の通りであった:メチオニン(MET);システイン
のモノマー(CYS);ホモシステインのモノマー(H
CYS);〔メチル−2 H3 〕メチオニン(Met
*);〔3,3−2 H2 〕システインモノマー;および
〔3,3,4,4−2H4 〕ホモシステインモノマー
(HCYS*)。MET*,CYS*およびHCYS*
は試料Aには添加せず、そしてそれらの表示を有するピ
ークは、天然に産出するアイソトープの存在量の結果と
して、それぞれ、MET,CYSおよびHCYSによっ
てそれらに寄与される量を表わす。かっこ内の数字は、
選択したイオンの監視によって走査したm/zについて
の値である。「F.S.」についての値は太いダッシュ
のトレースの全規模についての相対値である;細いダッ
シュのトレースは10×の減衰である。内因性合計ホモ
システインについて決定した値は、B,CおよびDにつ
いて、それぞれ、18.9、6.5および3.6μモル
/1であった。内因性合計システインについて決定した
値は、B,CおよびDについて、それぞれ、369、1
73および238μモル/1であった。内因性合計メチ
オニンについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ16.8、60.4および3.2μモル/
1であった。図2Aは、毛管カラムがこれらの3種類の
アミノ酸を完全に分離することを立証している。システ
イン−2−メルカプトエタノール、ホモシステイン−2
−メルカプトエタノール、システィン、ホモシステイン
−システインおよびホモシスチンの溶離プロフィルは示
されていないが、それらは、また、存在し、そして、そ
れぞれ、11.8、12.9、16.3、17.4およ
び18.4分の溶離時間をもつ単一の対照ピークとして
溶離される。
【0055】〔3,3,3′,3′,4,4,4′,
4′−2 H8 〕ホモシスチン、〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕シスチンおよび〔メチル−2 H3 〕メチオニン
を添加しない、ヒトの血清および尿、およびラットの血
清の試料を使用する研究は、定量のために内部標準とし
てのそれらの使用を妨害する物質が存在しないことを立
証した。アッセイの感度は50μモル/1の〔3,3,
3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスチ
ン、250μモル/1の〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕システィンおよび150μモル/1の〔メチル
−2 H3 〕メチオニンを使用する標準の条件下に、合計
ホモシステインについて1μモル/1、合計システイン
について5μモル/1およびメチオニンについて2μモ
ル/1であったが、感度は各場合において添加する内部
標準の量を減少することによって改良できた。標準条件
下実施したアッセイは、3種類のアッセイの各々につい
てのアッセイが合計ホモシステインについて1〜100
0μモル/1、合計システインについて5〜5000μ
モル/1、そしてメチオニンについて2〜2000μモ
ル/1の範囲にわたって直線であることを示した。
4′−2 H8 〕ホモシスチン、〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕シスチンおよび〔メチル−2 H3 〕メチオニン
を添加しない、ヒトの血清および尿、およびラットの血
清の試料を使用する研究は、定量のために内部標準とし
てのそれらの使用を妨害する物質が存在しないことを立
証した。アッセイの感度は50μモル/1の〔3,3,
3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシスチ
ン、250μモル/1の〔3,3,3′,3′−
2 H4 〕システィンおよび150μモル/1の〔メチル
−2 H3 〕メチオニンを使用する標準の条件下に、合計
ホモシステインについて1μモル/1、合計システイン
について5μモル/1およびメチオニンについて2μモ
ル/1であったが、感度は各場合において添加する内部
標準の量を減少することによって改良できた。標準条件
下実施したアッセイは、3種類のアッセイの各々につい
てのアッセイが合計ホモシステインについて1〜100
0μモル/1、合計システインについて5〜5000μ
モル/1、そしてメチオニンについて2〜2000μモ
ル/1の範囲にわたって直線であることを示した。
【0056】100μlの正常ヒト血清を使用して得た
クロマトグラムは図2Bに示されている。内因性合計シ
ステインは最大の量で存在し、次いで内因性メチオニン
および次いで内因性合計ホモシステインが存在する。合
計システインのほぼ70%はほぼ7.7分におけるシス
テインモノマーのピーク中に存在し、残りの30%は後
の時間期間に溶離されるシステイン−2−メルカプトエ
タノール(20%)、システィン(9%)およびホモシ
ステイン−システイン二量体(1%)のピークとして存
在した(データは示されていない)(上を参照)。合計
ホモシステインのほぼ60%はホモシステインモノマー
のピーク中に存在し、このピークはほぼ8.9分で溶離
され、残りは後に溶離されるホモシステイン−2−メル
カプトエタノール(25%)、ホモシステイン−システ
イン二量体(14%)およびホモシスティン(1%)の
ピークとして存在した(データは示されていない)(上
を参照)。
クロマトグラムは図2Bに示されている。内因性合計シ
ステインは最大の量で存在し、次いで内因性メチオニン
および次いで内因性合計ホモシステインが存在する。合
計システインのほぼ70%はほぼ7.7分におけるシス
テインモノマーのピーク中に存在し、残りの30%は後
の時間期間に溶離されるシステイン−2−メルカプトエ
タノール(20%)、システィン(9%)およびホモシ
ステイン−システイン二量体(1%)のピークとして存
在した(データは示されていない)(上を参照)。合計
ホモシステインのほぼ60%はホモシステインモノマー
のピーク中に存在し、このピークはほぼ8.9分で溶離
され、残りは後に溶離されるホモシステイン−2−メル
カプトエタノール(25%)、ホモシステイン−システ
イン二量体(14%)およびホモシスティン(1%)の
ピークとして存在した(データは示されていない)(上
を参照)。
【0057】システインおよびホモシステインの種々の
形態の百分率は、試料毎にかなり変化したが、2−メル
カプトエタノールの沸騰期間が1分から60分に変化し
たとき、あるいは2−メルカプトエタノールの量が5μ
lから100μlに変化したとき、所定の試料について
変化しなかった。内因性システイン対〔3,3−
2 H2 〕システインの比は、システインを含有する種々
のピークのすべてにおいて本質的に同一であった。内因
性ホモシステイン対〔3,3,4,4−2 H4 〕ホモシ
ステインの比は、ホモシステインを含有する種々のピー
クのすべてにおいて本質的に同一であった。これらの観
察が示すように、システインおよびホモシステインの内
因性および内部の標準形態は、100μlの2−メルカ
プトエタノールを使用する初期の15分の還元によっ
て、完全に還元され、そして蛋白質へ結合した形態を包
含する、それらの種々のジサルファイドの形態から解放
され、そして少量であるが、有意な量の種々のジサルフ
ァイドは精製および誘導体化の引続く段階において再形
成する。この引続く部分的ジサルファイドの再形成は、
内因性合計システインおよび内因性合計ホモシステイン
の定量を妨害しない。なぜなら、システインおよびホモ
システインのために利用する内部標準、すなわち、
〔3,3,3′,3′−2 H4 〕シスチンおよび〔3,
3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシ
スチンは、また、完全に還元され、次いで、内因性合計
システインおよび内因性合計ホモシステインと同程度
に、部分的ジサルファイドの再形成に参加するからであ
る。システインモノマー、システイン−2−メルカプト
エタノール、シスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化シス
テイン対内因性システインの比を使用して内因性合計シ
ステインを定量することは可能である。なぜなら、この
比の値はいかなる所定の試料についてのすべて4つのピ
ークにおいても同一であるからである。また、ホモシス
テインモノマー、ホモシステイン−2−メルカプトエタ
ノール、ホモシスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化ホモ
システイン対内因性ホモシステインの比を使用して内因
性合計ホモシステインを定量することは可能である。な
ぜなら、この比の値はいかなる所定の試料についてのす
べて4つのピークにおいても同一であるからである。わ
れわれの標準手順においてシステインモノマーおよびホ
モシステインモノマーのピークにおいて得られた比を測
定しかつそれを使用することを選択した。なぜなら、そ
れらは通常最大のピークであり、そしてそれらは他のピ
ークより早く溶離されるからである。
形態の百分率は、試料毎にかなり変化したが、2−メル
カプトエタノールの沸騰期間が1分から60分に変化し
たとき、あるいは2−メルカプトエタノールの量が5μ
lから100μlに変化したとき、所定の試料について
変化しなかった。内因性システイン対〔3,3−
2 H2 〕システインの比は、システインを含有する種々
のピークのすべてにおいて本質的に同一であった。内因
性ホモシステイン対〔3,3,4,4−2 H4 〕ホモシ
ステインの比は、ホモシステインを含有する種々のピー
クのすべてにおいて本質的に同一であった。これらの観
察が示すように、システインおよびホモシステインの内
因性および内部の標準形態は、100μlの2−メルカ
プトエタノールを使用する初期の15分の還元によっ
て、完全に還元され、そして蛋白質へ結合した形態を包
含する、それらの種々のジサルファイドの形態から解放
され、そして少量であるが、有意な量の種々のジサルフ
ァイドは精製および誘導体化の引続く段階において再形
成する。この引続く部分的ジサルファイドの再形成は、
内因性合計システインおよび内因性合計ホモシステイン
の定量を妨害しない。なぜなら、システインおよびホモ
システインのために利用する内部標準、すなわち、
〔3,3,3′,3′−2 H4 〕シスチンおよび〔3,
3,3′,3′,4,4,4′,4′−2 H8 〕ホモシ
スチンは、また、完全に還元され、次いで、内因性合計
システインおよび内因性合計ホモシステインと同程度
に、部分的ジサルファイドの再形成に参加するからであ
る。システインモノマー、システイン−2−メルカプト
エタノール、シスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化シス
テイン対内因性システインの比を使用して内因性合計シ
ステインを定量することは可能である。なぜなら、この
比の値はいかなる所定の試料についてのすべて4つのピ
ークにおいても同一であるからである。また、ホモシス
テインモノマー、ホモシステイン−2−メルカプトエタ
ノール、ホモシスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化ホモ
システイン対内因性ホモシステインの比を使用して内因
性合計ホモシステインを定量することは可能である。な
ぜなら、この比の値はいかなる所定の試料についてのす
べて4つのピークにおいても同一であるからである。わ
れわれの標準手順においてシステインモノマーおよびホ
モシステインモノマーのピークにおいて得られた比を測
定しかつそれを使用することを選択した。なぜなら、そ
れらは通常最大のピークであり、そしてそれらは他のピ
ークより早く溶離されるからである。
【0058】初期の研究において、最初の還元工程後
に、システインモノマーおよびホモシステインモノマー
にヨードアセトアミドを結合し、次いで標準の方法で精
製および誘導体化の手順を進行させることが可能である
ことが示された(データは示されていない)。この修正
法は、ジサルファイドの再形成を防止するが、詳細に評
価しなかった。
に、システインモノマーおよびホモシステインモノマー
にヨードアセトアミドを結合し、次いで標準の方法で精
製および誘導体化の手順を進行させることが可能である
ことが示された(データは示されていない)。この修正
法は、ジサルファイドの再形成を防止するが、詳細に評
価しなかった。
【0059】2−メルカプトエタノールによる還元をヒ
ト血清を使用する標準手順から省略するとき、シスチ
ン、ホモシスチン、およびホモシステイン−システイン
二量体のピークが観測され、これらのピークは、それぞ
れ、システイン、ホモシステインおよび両者のホモシス
テインおよびシステインの内因性形態を含有する。シス
テイン−2−メルカプトエタノールおよびホモシステイ
ン−2−メルカプトエタノールは、これらの条件下で検
出不可能である(データは表わされていない)。
ト血清を使用する標準手順から省略するとき、シスチ
ン、ホモシスチン、およびホモシステイン−システイン
二量体のピークが観測され、これらのピークは、それぞ
れ、システイン、ホモシステインおよび両者のホモシス
テインおよびシステインの内因性形態を含有する。シス
テイン−2−メルカプトエタノールおよびホモシステイ
ン−2−メルカプトエタノールは、これらの条件下で検
出不可能である(データは表わされていない)。
【0060】100μlの正常ラット血清および100
μlの正常ヒト尿を使用して得られたクロマトグラム
は、それぞれ、図2Cおよび図2Dに示されており、そ
して正常ヒト血清を用いて得られたクロマトグラム(図
2B)に類似する。反復して凍結および融解し、そして
1月の期間にわたって16の異なる場合についてアッセ
イした、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用し
て実施した研究は、合計ホモシステイン、合計システイ
ンおよびメチオニンのアッセイについて、それぞれ、1
9.7%,17.4%および5.6%の変動係数につい
ての値を与えた。これらの3種類のアミノ酸についての
値の有意の変動または傾向は1月の期間にわたって観測
されず、また同一の血清を他の場合において12か月の
期間にわたってアッセイしたとき、変化は観測されなか
った。
μlの正常ヒト尿を使用して得られたクロマトグラム
は、それぞれ、図2Cおよび図2Dに示されており、そ
して正常ヒト血清を用いて得られたクロマトグラム(図
2B)に類似する。反復して凍結および融解し、そして
1月の期間にわたって16の異なる場合についてアッセ
イした、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用し
て実施した研究は、合計ホモシステイン、合計システイ
ンおよびメチオニンのアッセイについて、それぞれ、1
9.7%,17.4%および5.6%の変動係数につい
ての値を与えた。これらの3種類のアミノ酸についての
値の有意の変動または傾向は1月の期間にわたって観測
されず、また同一の血清を他の場合において12か月の
期間にわたってアッセイしたとき、変化は観測されなか
った。
【0061】抜出しかつ直ちに4℃において遠心した血
液試料を使用して得られた血清の合計ホモシステインに
ついての値は、遠心前室温において1時間インキュベー
ションした同一血液試料の一部を使用して得られた値と
同一(10%の差)であったが、遠心前にインキュベー
ションを4時間および24時間に延長したとき、それぞ
れ、ほぼ35%および75%だけ増加した。血清の合計
システインについての値は、24時間のインキュベーシ
ョン期間にわたって不変化であった。血清メチオニンに
ついての値は、1時間不変化であり、そして4時間およ
び24時間において、それぞれ、10%および25%だ
け増加した。EDTAまたはヘパリン中に集めた血漿
は、メチオニンを除外して、すべての時間期間において
すべての3種類のアミノ酸について血清の値と同一であ
る値を与えたが、メチオニンの場合において、両者のタ
イプの血漿についての値は4時間および24時間のイン
キュベーション期間にわたってすべて増加しなかった。
ラット二量体を使用して実施したインキュベーションの
研究は、ヒト血清を使用して得られた結果に類似する結
果を与えた。合計ホモシステイン、尿の合計システイン
および合計メチオニンについての値は、尿の試料を0時
間〜24時間の間室温においてインキュベーションした
とき、変化しなかった。
液試料を使用して得られた血清の合計ホモシステインに
ついての値は、遠心前室温において1時間インキュベー
ションした同一血液試料の一部を使用して得られた値と
同一(10%の差)であったが、遠心前にインキュベー
ションを4時間および24時間に延長したとき、それぞ
れ、ほぼ35%および75%だけ増加した。血清の合計
システインについての値は、24時間のインキュベーシ
ョン期間にわたって不変化であった。血清メチオニンに
ついての値は、1時間不変化であり、そして4時間およ
び24時間において、それぞれ、10%および25%だ
け増加した。EDTAまたはヘパリン中に集めた血漿
は、メチオニンを除外して、すべての時間期間において
すべての3種類のアミノ酸について血清の値と同一であ
る値を与えたが、メチオニンの場合において、両者のタ
イプの血漿についての値は4時間および24時間のイン
キュベーション期間にわたってすべて増加しなかった。
ラット二量体を使用して実施したインキュベーションの
研究は、ヒト血清を使用して得られた結果に類似する結
果を与えた。合計ホモシステイン、尿の合計システイン
および合計メチオニンについての値は、尿の試料を0時
間〜24時間の間室温においてインキュベーションした
とき、変化しなかった。
【0062】50人の正常ヒト被検者および50匹の正
常ラットからの合計ホモシステイン、合計システインお
よびメチオニンについて得られ、より高い値に向かうひ
ずみについて補正するために対数変換後に平均±2 S.
D. として計算した。実際の平均(μモル/1)および
範囲についての値は、次の通りであった:ヒト血清合計
ホモシステイン、13.0(7.2−21.7);ヒト
血清合計メチオニン、25.5(13.7−43.
5);ヒト血清合計システイン、261(174−37
8);ラット血清合計ホモシステイン、5.6(3.2
−9.6);ラット血清合計メチオニン、56(39−
83);ラット血清合計システイン、190(131−
283)。同一の50人の正常ヒト被検者から得、上に
定義したように計算した、実際の平均(μモル/1また
はμモル/10ミリモルのクレアチニン)および範囲に
ついての値は、次の通りであった:ヒト尿合計ホモシス
テイン、7.2(1.4−24.7);ヒト尿合計ホモ
システイン/10ミリモルのクレアチニン、11.2
(2.0−36.7);ヒト尿合計メチオニン、5.9
(04−35.1);ヒト尿合計メチオニン/10ミリ
モルのクレアチニン、6.3(1.5−19.1);ヒ
ト尿合計システイン、260(68−729);ヒト尿
合計システイン/10ミリモルのクレアチニン、344
(158−655)。尿中の合計システインおよびメチ
オニンの正常な範囲は、μモル/1として表わすときよ
り、μモル/10μミリモルのクレアチニンとして表わ
すとき高い。
常ラットからの合計ホモシステイン、合計システインお
よびメチオニンについて得られ、より高い値に向かうひ
ずみについて補正するために対数変換後に平均±2 S.
D. として計算した。実際の平均(μモル/1)および
範囲についての値は、次の通りであった:ヒト血清合計
ホモシステイン、13.0(7.2−21.7);ヒト
血清合計メチオニン、25.5(13.7−43.
5);ヒト血清合計システイン、261(174−37
8);ラット血清合計ホモシステイン、5.6(3.2
−9.6);ラット血清合計メチオニン、56(39−
83);ラット血清合計システイン、190(131−
283)。同一の50人の正常ヒト被検者から得、上に
定義したように計算した、実際の平均(μモル/1また
はμモル/10ミリモルのクレアチニン)および範囲に
ついての値は、次の通りであった:ヒト尿合計ホモシス
テイン、7.2(1.4−24.7);ヒト尿合計ホモ
システイン/10ミリモルのクレアチニン、11.2
(2.0−36.7);ヒト尿合計メチオニン、5.9
(04−35.1);ヒト尿合計メチオニン/10ミリ
モルのクレアチニン、6.3(1.5−19.1);ヒ
ト尿合計システイン、260(68−729);ヒト尿
合計システイン/10ミリモルのクレアチニン、344
(158−655)。尿中の合計システインおよびメチ
オニンの正常な範囲は、μモル/1として表わすときよ
り、μモル/10μミリモルのクレアチニンとして表わ
すとき高い。
【0063】合計ホモシステインおよび合計システイン
についての値は、ラット血清におけるよりヒト血清にお
いて有意に(P<0.05)高かった。メチオニンにつ
いての値は、ヒト血清におけるよりラット血清において
有意に(P<0.05)高かった。ヒト血清の合計ホモ
システイン、合計システインおよびメチオニンは、尿の
値をμモル/1またはμモル/10ミリモルのクレアチ
ニンとして表すか否かに無関係に、それぞれ、尿の合計
ホモシステイン、合計システインおよびメチオニンと相
関関係がなかった。血清合計ホモシステインおよび血清
メチオニンについての値は、女性よりも男性において、
それぞれ、20%および22%だけ高かった(P<0.
05)。血清合計システイン、尿合計ホモシステイン、
尿合計システインおよび尿メチオニンについての値は男
性および女性について有意に異ならなかった。血清合計
ホモシステインについての値は、年令、ヘモグロビン、
平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラミン、
血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計システインまた
は血清メチルマロン酸と有意な相関関係をもたなかっ
た。最高の補正係数は、血清合計ホモシステインとヘモ
グロビンとの間で0.37(P=0.06)そして血清
合計ホモシステインと血清葉酸塩との間で−0.34
(P=0.06)であった。血清ホモシステインと血清
コバラミンとの間の相関関係係数は0.14(P=0.
44)であった。血清メチオニンについての値は、相関
関係係数が0.44(P<0.05)であるヘモグロビ
ンを除外して、前述のパラメーターのいずれとも有意に
相関関係をもたなかった。血清メチオニンと血清葉酸塩
との間、および血清メチオニンと血清コバラミンとの間
の相関関係係数は、それぞれ、−0.09(P=0.6
4)および0.20(P=0.29)であった。血清合
計システインは、年令および血清メチルマロン酸を除外
して、前述パラメーターと有意な相関関係をもたなかっ
た。血清合計システインと年令との間、および血清合計
システインと血清メチルマロン酸との間の相関関係係数
は、それぞれ、0.38(P<0.01)および0.3
0(P<0.05)であった。μモル/1またはμモル
/10ミリモルのクレアチニンとして表した尿合計ホモ
システイン、尿合計システインおよび尿メチオニンにつ
いての値は、年令、ヘモグロビン、平均血球体積、白血
球数、血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清メ
チルマロン酸、血清合計ホモシステイン、血清メチオニ
ンまたは血清合計システインと有意な相関関係をもたな
かった。
についての値は、ラット血清におけるよりヒト血清にお
いて有意に(P<0.05)高かった。メチオニンにつ
いての値は、ヒト血清におけるよりラット血清において
有意に(P<0.05)高かった。ヒト血清の合計ホモ
システイン、合計システインおよびメチオニンは、尿の
値をμモル/1またはμモル/10ミリモルのクレアチ
ニンとして表すか否かに無関係に、それぞれ、尿の合計
ホモシステイン、合計システインおよびメチオニンと相
関関係がなかった。血清合計ホモシステインおよび血清
メチオニンについての値は、女性よりも男性において、
それぞれ、20%および22%だけ高かった(P<0.
05)。血清合計システイン、尿合計ホモシステイン、
尿合計システインおよび尿メチオニンについての値は男
性および女性について有意に異ならなかった。血清合計
ホモシステインについての値は、年令、ヘモグロビン、
平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラミン、
血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計システインまた
は血清メチルマロン酸と有意な相関関係をもたなかっ
た。最高の補正係数は、血清合計ホモシステインとヘモ
グロビンとの間で0.37(P=0.06)そして血清
合計ホモシステインと血清葉酸塩との間で−0.34
(P=0.06)であった。血清ホモシステインと血清
コバラミンとの間の相関関係係数は0.14(P=0.
44)であった。血清メチオニンについての値は、相関
関係係数が0.44(P<0.05)であるヘモグロビ
ンを除外して、前述のパラメーターのいずれとも有意に
相関関係をもたなかった。血清メチオニンと血清葉酸塩
との間、および血清メチオニンと血清コバラミンとの間
の相関関係係数は、それぞれ、−0.09(P=0.6
4)および0.20(P=0.29)であった。血清合
計システインは、年令および血清メチルマロン酸を除外
して、前述パラメーターと有意な相関関係をもたなかっ
た。血清合計システインと年令との間、および血清合計
システインと血清メチルマロン酸との間の相関関係係数
は、それぞれ、0.38(P<0.01)および0.3
0(P<0.05)であった。μモル/1またはμモル
/10ミリモルのクレアチニンとして表した尿合計ホモ
システイン、尿合計システインおよび尿メチオニンにつ
いての値は、年令、ヘモグロビン、平均血球体積、白血
球数、血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清メ
チルマロン酸、血清合計ホモシステイン、血清メチオニ
ンまたは血清合計システインと有意な相関関係をもたな
かった。
【0064】クレアチニンの浄化に関する合計ホモシス
テイン、合計システインおよびメチオニンのヒト血清か
らの平均の尿浄化は、それぞれ、0.3%,0.6%お
よび0.1%であると計算された。これらの観測が立証
するように、血清中に存在する合計ホモシステイン、合
計システインおよびメチオニンのほんの小さい分画のみ
が尿中に分泌され、そしてこれらのアミノ酸の濃度のレ
ベルおよび相対的変化は、こうして、種々の病理学的状
態における血清と尿との間で異なりうる。
テイン、合計システインおよびメチオニンのヒト血清か
らの平均の尿浄化は、それぞれ、0.3%,0.6%お
よび0.1%であると計算された。これらの観測が立証
するように、血清中に存在する合計ホモシステイン、合
計システインおよびメチオニンのほんの小さい分画のみ
が尿中に分泌され、そしてこれらのアミノ酸の濃度のレ
ベルおよび相対的変化は、こうして、種々の病理学的状
態における血清と尿との間で異なりうる。
【0065】こうして、正常のヒトおよびラットからの
血清および正常のヒトからの尿の中の合計ホモシステイ
ンおよび合計システインを検出しかつ定量することを可
能とする技術を開発しかつ立証した。適当なスルフヒド
リル化合物、例えば、2−メルカプトエタノールを使用
する還元は、血清中の合計ホモシステインおよび合計シ
ステインを測定するために必須である。なぜなら、これ
らのアミノ酸の50%〜70%はジサルファイド結合を
介して血清蛋白質へ共有結合するからである。われわれ
の研究および他の研究が示すように、この結合したホモ
システインおよびシステインの遊離は、急速に起こる
が、われわれの研究が、また、示すように、還元後の新
しいジサルファイドの形成は有意な程度に起こる。質量
分析計に基づく検出および定量は、ホモシステインおよ
びシステインそれら自体の安定なアイソトープの形態を
内部標準として使用できるので、この場合においてきわ
めて有益である。これらの内部標準は内因性合計ホモシ
ステインおよび内因性合計システインと還元工程の間平
衡化し、そして新しいジサルファイドの部分的形成の間
平衡状態にとどまる。また、初期の還元工程を省略する
ことができ、これによって、適当な内部標準を利用する
かぎり、遊離のホモシスチン、遊離のシスチン、および
遊離のホモシステイン−システイン二量体を検出しかつ
測定することが可能である。本発明の方法を利用して、
蛋白質結合したホモシステインおよびシステインを別々
に測定することが可能であろうが、これを研究しなかっ
た。また、追加の内部標準を利用して他のアミノ酸を同
時に測定することが可能である。われわれは、メチオニ
ンの場合において、これを実施し、そしてこの方法を他
のアミノ酸に容易に適用できることを発見した。
血清および正常のヒトからの尿の中の合計ホモシステイ
ンおよび合計システインを検出しかつ定量することを可
能とする技術を開発しかつ立証した。適当なスルフヒド
リル化合物、例えば、2−メルカプトエタノールを使用
する還元は、血清中の合計ホモシステインおよび合計シ
ステインを測定するために必須である。なぜなら、これ
らのアミノ酸の50%〜70%はジサルファイド結合を
介して血清蛋白質へ共有結合するからである。われわれ
の研究および他の研究が示すように、この結合したホモ
システインおよびシステインの遊離は、急速に起こる
が、われわれの研究が、また、示すように、還元後の新
しいジサルファイドの形成は有意な程度に起こる。質量
分析計に基づく検出および定量は、ホモシステインおよ
びシステインそれら自体の安定なアイソトープの形態を
内部標準として使用できるので、この場合においてきわ
めて有益である。これらの内部標準は内因性合計ホモシ
ステインおよび内因性合計システインと還元工程の間平
衡化し、そして新しいジサルファイドの部分的形成の間
平衡状態にとどまる。また、初期の還元工程を省略する
ことができ、これによって、適当な内部標準を利用する
かぎり、遊離のホモシスチン、遊離のシスチン、および
遊離のホモシステイン−システイン二量体を検出しかつ
測定することが可能である。本発明の方法を利用して、
蛋白質結合したホモシステインおよびシステインを別々
に測定することが可能であろうが、これを研究しなかっ
た。また、追加の内部標準を利用して他のアミノ酸を同
時に測定することが可能である。われわれは、メチオニ
ンの場合において、これを実施し、そしてこの方法を他
のアミノ酸に容易に適用できることを発見した。
【0066】ヒトおよびラットの血清およびヒトの尿の
中の合計ホモシステインの正常な範囲を、われわれは規
定した。ヒトの血清および尿についての値は、次の文献
に報告されているものに類似する:Refsum, H., S.Hell
and およびP.M.Ueland, Clin.Chem. 31 (4): 624−628
(1985)。ヒト血清についてのわれわれの値は上の文献の
値よりほぼ30%だけ高いが、これは、一部分、われわ
れの手順において内部標準として安定なアイソトープの
形態を使用したためであり、また、一部分、われわれの
手順におけるように試料を室温で凝固させるとき、合計
ホモシステインの値が多少増加という事実のためであろ
う。
中の合計ホモシステインの正常な範囲を、われわれは規
定した。ヒトの血清および尿についての値は、次の文献
に報告されているものに類似する:Refsum, H., S.Hell
and およびP.M.Ueland, Clin.Chem. 31 (4): 624−628
(1985)。ヒト血清についてのわれわれの値は上の文献の
値よりほぼ30%だけ高いが、これは、一部分、われわ
れの手順において内部標準として安定なアイソトープの
形態を使用したためであり、また、一部分、われわれの
手順におけるように試料を室温で凝固させるとき、合計
ホモシステインの値が多少増加という事実のためであろ
う。
【0067】また、ヒト血清およびヒト尿中の合計シス
テインについての正常範囲を、われわれは規定した。ヒ
ト血清に関するわれわれの値は、Malloy, M.H., D.K.Ra
ssinおよびG.H.Gaull, Anal.Biochem. 113 : 407−415
(1981)に報告されている値と良好に一致し、この文献は
ジチオスレイトールで還元し、次いで内因性合計システ
インを分光光度測定によって決定している。われわれの
値がほぼ20%だけ高いという事実は、前述のようにわ
れわれの手順において安定なアイソトープの内部標準を
含有させることを反映しているであろう。ヒト尿の合計
システインはMartensson, J., Metablism 31 : 487−49
2 (1982)に報告されているものに類似し、この文献は標
準のアミノ酸分析装置を利用している。
テインについての正常範囲を、われわれは規定した。ヒ
ト血清に関するわれわれの値は、Malloy, M.H., D.K.Ra
ssinおよびG.H.Gaull, Anal.Biochem. 113 : 407−415
(1981)に報告されている値と良好に一致し、この文献は
ジチオスレイトールで還元し、次いで内因性合計システ
インを分光光度測定によって決定している。われわれの
値がほぼ20%だけ高いという事実は、前述のようにわ
れわれの手順において安定なアイソトープの内部標準を
含有させることを反映しているであろう。ヒト尿の合計
システインはMartensson, J., Metablism 31 : 487−49
2 (1982)に報告されているものに類似し、この文献は標
準のアミノ酸分析装置を利用している。
【0068】ヒトおよびラットの血清およびヒト尿中の
メチオニンについてわれわれが決定した正常範囲は、ア
ミノ酸分析装置を使用したある数の他の研究者らによっ
て決定された値と、きわめてよく一致する。ラット血清
中の合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオ
ニンについてのわれわれの値は、他の研究者らの限定さ
れたデータに類似する。
メチオニンについてわれわれが決定した正常範囲は、ア
ミノ酸分析装置を使用したある数の他の研究者らによっ
て決定された値と、きわめてよく一致する。ラット血清
中の合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオ
ニンについてのわれわれの値は、他の研究者らの限定さ
れたデータに類似する。
【0069】ヒト血清中の合計ホモシステインを測定す
る感受性の特異的方法の利用可能性は、次のものを含
む、ある数の臨床的用途を有するであろう:(i)臨床
的に確証されたコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する
患者における血清合計ホモシステインについての増大し
た値の出現の決定、(ii)血清コバラミンおよび血清葉
酸塩の診断的感度および特異性をアッセイするために、
血清コバラミンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、また
は低い正常レベルにある患者の血清中の合計ホモシステ
インのレベルの決定、(iii)種々の神経精神学的異常を
もつ患者をおよび初老の人の群におけるコバラミンおよ
び葉酸塩の欠乏の発生をよりよく規定するために、これ
らの群における血清中の合計ホモシステインの決定、お
よび(iv)末梢血管および脳血管の病気の増大した発生
と相関関係をもつヘテロ接合状態について、よりすぐれ
た診断試験を開発することを試みた、シスタチオンシン
セターゼの欠乏のためのヘテロ接合体 (heterozygote)
中の合計ホモシステインの決定。ヒト血清中の合計ホモ
システインのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
塩の欠乏の両者の比較的感度の高い測定手段である。動
物、例えば、ラットの血清中の合計ホモシステインを測
定できるということは、亜酸化窒素、コバラミン類似
体、葉酸塩類似体、例えば、メトトレキセート、および
コバラミンの欠乏または葉酸塩の欠乏食物を使用する研
究において、また、有用であり、これらの物質のすべて
はコバラミンおよび葉酸塩の代謝および利用の種々な面
を妨害する。
る感受性の特異的方法の利用可能性は、次のものを含
む、ある数の臨床的用途を有するであろう:(i)臨床
的に確証されたコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する
患者における血清合計ホモシステインについての増大し
た値の出現の決定、(ii)血清コバラミンおよび血清葉
酸塩の診断的感度および特異性をアッセイするために、
血清コバラミンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、また
は低い正常レベルにある患者の血清中の合計ホモシステ
インのレベルの決定、(iii)種々の神経精神学的異常を
もつ患者をおよび初老の人の群におけるコバラミンおよ
び葉酸塩の欠乏の発生をよりよく規定するために、これ
らの群における血清中の合計ホモシステインの決定、お
よび(iv)末梢血管および脳血管の病気の増大した発生
と相関関係をもつヘテロ接合状態について、よりすぐれ
た診断試験を開発することを試みた、シスタチオンシン
セターゼの欠乏のためのヘテロ接合体 (heterozygote)
中の合計ホモシステインの決定。ヒト血清中の合計ホモ
システインのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
塩の欠乏の両者の比較的感度の高い測定手段である。動
物、例えば、ラットの血清中の合計ホモシステインを測
定できるということは、亜酸化窒素、コバラミン類似
体、葉酸塩類似体、例えば、メトトレキセート、および
コバラミンの欠乏または葉酸塩の欠乏食物を使用する研
究において、また、有用であり、これらの物質のすべて
はコバラミンおよび葉酸塩の代謝および利用の種々な面
を妨害する。
【0070】実施例IVメチルマロン酸の代表的アッセイ Marcell, P.D., S.P.Stabler, E.R.PodellおよびR.H.Al
len, Anal.Biochem. 150:58−66 (1985) の方法に従
う。メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.
Louis, MO)から購入し、そしてメチルマロン酸はJ.
T.ベイカー・ケミカル・カンパニー〔Baker Chemical
Co.(Philipsburg, NJ) 〕から入手し、そしてジメチル
マロン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー〔Aldr
ich Chemical Co.(Milwaukee, WI) 〕から入手し、〔メ
チル−2 H3 〕メチルマロン酸(>99%、慣用の合成
における)および〔1,4−13C2 〕コハク酸(>99
%)はメルク・シャープ・アンド・ドーム・アイソトー
プ (Merck Sharp and Dohme Isotopes) (Montreal, Ca
nada) から入手した。〔メチル−14C〕メチルマロン酸
(慣用の合成による)および〔1,4−14C2 〕コハク
酸はニュー・イングランド・コーポレーション〔New En
gland Co. (Boston, MA)〕から購入した。N−メチル−
N−(t−ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセト
アミドは、ピアース・ケミカル・カンパニー (Pierce C
hemical Co.) (Rockford, IL) から購入した。すべての
溶媒は、バーディック・アンド・ジャクソン・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド〔Burdick & Jackson La
boratories,Inc. (Muskegon, MI) 〕からの高性能液体
クロマトグラフィーの等級のものであった。血液の試料
は、通常健康な血液共与者からベレ・ボノフィルス・ブ
ラッド・バンク (Belle Bonfils Blood Bank, Denver,
CO) において血液共与時間に得た。連続的血液の共与者
は、次の年令群の各々において5人の男性および5人の
女性から試料が得られるように選択した:18〜26,
27〜35,36〜45,46〜55および56〜65
(合計50の試料)。試料は9a.m.および1p.m.の間に
おいて得、室温において1〜4時間凝固させ、1500
gで30分間遠心し、そして血清を取り出し、そして−
20℃において貯蔵した。さらに、他の試料を遠心前に
0〜24時間凝結させた。スポット尿の試料を、血液試
料を得たとき30分以内に同一の50人の個体から集
め、そして−20℃において同様に貯蔵した。スプレイ
グ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、250−35
0g、をSASCO,インコーポレーテッド(Omaha, N
E) から入手し、そして血液をエーテル麻酔の下に心臓
内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料について前
述したように、血清を集めそして貯蔵した。
len, Anal.Biochem. 150:58−66 (1985) の方法に従
う。メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグ
マ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.
Louis, MO)から購入し、そしてメチルマロン酸はJ.
T.ベイカー・ケミカル・カンパニー〔Baker Chemical
Co.(Philipsburg, NJ) 〕から入手し、そしてジメチル
マロン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー〔Aldr
ich Chemical Co.(Milwaukee, WI) 〕から入手し、〔メ
チル−2 H3 〕メチルマロン酸(>99%、慣用の合成
における)および〔1,4−13C2 〕コハク酸(>99
%)はメルク・シャープ・アンド・ドーム・アイソトー
プ (Merck Sharp and Dohme Isotopes) (Montreal, Ca
nada) から入手した。〔メチル−14C〕メチルマロン酸
(慣用の合成による)および〔1,4−14C2 〕コハク
酸はニュー・イングランド・コーポレーション〔New En
gland Co. (Boston, MA)〕から購入した。N−メチル−
N−(t−ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセト
アミドは、ピアース・ケミカル・カンパニー (Pierce C
hemical Co.) (Rockford, IL) から購入した。すべての
溶媒は、バーディック・アンド・ジャクソン・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド〔Burdick & Jackson La
boratories,Inc. (Muskegon, MI) 〕からの高性能液体
クロマトグラフィーの等級のものであった。血液の試料
は、通常健康な血液共与者からベレ・ボノフィルス・ブ
ラッド・バンク (Belle Bonfils Blood Bank, Denver,
CO) において血液共与時間に得た。連続的血液の共与者
は、次の年令群の各々において5人の男性および5人の
女性から試料が得られるように選択した:18〜26,
27〜35,36〜45,46〜55および56〜65
(合計50の試料)。試料は9a.m.および1p.m.の間に
おいて得、室温において1〜4時間凝固させ、1500
gで30分間遠心し、そして血清を取り出し、そして−
20℃において貯蔵した。さらに、他の試料を遠心前に
0〜24時間凝結させた。スポット尿の試料を、血液試
料を得たとき30分以内に同一の50人の個体から集
め、そして−20℃において同様に貯蔵した。スプレイ
グ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、250−35
0g、をSASCO,インコーポレーテッド(Omaha, N
E) から入手し、そして血液をエーテル麻酔の下に心臓
内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料について前
述したように、血清を集めそして貯蔵した。
【0071】200ngの〔メチル−2 H3 〕メチルマロ
ン酸および2000ngの〔1,4−13C2 〕コハク酸を
含有する50μlのH2 Oを500μlの血清または1
00μlの尿に添加し、そして尿の試料にさらに400
μlのH2 Oを添加した。次いで、pHを50μlの2N
のNaOHの添加により約12に上昇させ、次いで5ml
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、1
000gで3分間遠心し、上のエーテル層をデカンテー
ションしそして廃棄した。次いで、pHを50μlの6N
のHClの添加により約1に調節し、そして試料を前述
のように5mlのジエチルエーテルで2回抽出した。エー
テル抽出液をプールし、40℃の水浴中で窒素の流れの
供給によって乾固し、次いで500μlのH2 O中に溶
解した。試料全体をウォーターズ・アソシエーツ〔Wate
rs Associates (Milford, MA) 〕高性能液体クロマトグ
ラフィー陰イオン交換樹脂システム上注入した。このシ
ステムは720システムコントローラー、730データ
モジュール、2つの6000Aポンプ、U6Kインゼク
ター、およびZ−モジュールからなり、ラジアル・パク
(Radial Pak) SAXカートリッジ(10μm,8mm×
10cm)およびワットマン,インコーポレーテッド〔Wh
atman, Inc. (Clifton, NJ) 〕から入手した薄膜陰イオ
ン交換体を詰めた予備カラム(4×23mm)を装備して
いた。移動相は0.05モルのKH2 PO4 −H3 PO
4 ,pH2.0から成り、そして2mlの分画を2ml/分の
速度で集めた。分画3〜5は95%より多いメチルマロ
ン酸およびコハク酸を含有し、これらは〔メチル−
14C〕メチルマロン酸および〔1,4−14C2 〕コハク
酸を使用して実施した分離実験に基づいて注入し、これ
らのコハク酸を使用してクロマトグラフィーのシステム
を毎日の基準で検査した。これらの分画をプールし、5
0μlの6N HClを添加してpHをほぼ1に調節し、
そして前述のように試料を5mlのジエチルエーテルで2
回抽出した。これらのエーテル抽出液をプールし、40
℃の水浴中で窒素の流れの適用によって乾固し、そして
300μlのレアクチ (Reacti) バイアル〔ピアース・
ケミカル・カンパニー〔Pierce Chemical Co. (Rockfor
d, IL)〕に150μlのメタノールすすぎ液と一緒に移
した。次いで、試料をスピード・バク(Speed Vac) 真空
濃縮器〔サバント・インストルメンツ・インコーポレー
テッド〔Savant Instruments, Inc. (Hicksville, NY)
〕内で乾固した。
ン酸および2000ngの〔1,4−13C2 〕コハク酸を
含有する50μlのH2 Oを500μlの血清または1
00μlの尿に添加し、そして尿の試料にさらに400
μlのH2 Oを添加した。次いで、pHを50μlの2N
のNaOHの添加により約12に上昇させ、次いで5ml
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、1
000gで3分間遠心し、上のエーテル層をデカンテー
ションしそして廃棄した。次いで、pHを50μlの6N
のHClの添加により約1に調節し、そして試料を前述
のように5mlのジエチルエーテルで2回抽出した。エー
テル抽出液をプールし、40℃の水浴中で窒素の流れの
供給によって乾固し、次いで500μlのH2 O中に溶
解した。試料全体をウォーターズ・アソシエーツ〔Wate
rs Associates (Milford, MA) 〕高性能液体クロマトグ
ラフィー陰イオン交換樹脂システム上注入した。このシ
ステムは720システムコントローラー、730データ
モジュール、2つの6000Aポンプ、U6Kインゼク
ター、およびZ−モジュールからなり、ラジアル・パク
(Radial Pak) SAXカートリッジ(10μm,8mm×
10cm)およびワットマン,インコーポレーテッド〔Wh
atman, Inc. (Clifton, NJ) 〕から入手した薄膜陰イオ
ン交換体を詰めた予備カラム(4×23mm)を装備して
いた。移動相は0.05モルのKH2 PO4 −H3 PO
4 ,pH2.0から成り、そして2mlの分画を2ml/分の
速度で集めた。分画3〜5は95%より多いメチルマロ
ン酸およびコハク酸を含有し、これらは〔メチル−
14C〕メチルマロン酸および〔1,4−14C2 〕コハク
酸を使用して実施した分離実験に基づいて注入し、これ
らのコハク酸を使用してクロマトグラフィーのシステム
を毎日の基準で検査した。これらの分画をプールし、5
0μlの6N HClを添加してpHをほぼ1に調節し、
そして前述のように試料を5mlのジエチルエーテルで2
回抽出した。これらのエーテル抽出液をプールし、40
℃の水浴中で窒素の流れの適用によって乾固し、そして
300μlのレアクチ (Reacti) バイアル〔ピアース・
ケミカル・カンパニー〔Pierce Chemical Co. (Rockfor
d, IL)〕に150μlのメタノールすすぎ液と一緒に移
した。次いで、試料をスピード・バク(Speed Vac) 真空
濃縮器〔サバント・インストルメンツ・インコーポレー
テッド〔Savant Instruments, Inc. (Hicksville, NY)
〕内で乾固した。
【0072】100μlのアセトニトリルおよび10μ
lのN−メチル−N−(t−ブチルジメチルシリル)ト
リフルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それら
のテフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そ
してそれらを室温(22℃)で1夜放置するか、あるい
はそれらを80℃に1時間加熱することによって、ジカ
ルボン酸のt−ブチルジメチルシリルエステル調整し
た。100μlのH2 Oを添加して、反応の誘導体化剤
を加水分解し、次いで250μlのヘキサンを添加し、
激しく混合し、そして1000gで5分間遠心した。上
のヘキサン層をデカンテーションし、別のレアクチ・バ
イアルに移し、窒素の流れの適用によってほぼ5μlに
乾燥した。完全な乾固を回避するように注意した。なぜ
なら、これは誘導体の主要な部分を失わせるからであ
る。ほぼ2μlを毛管カラム上に落下する針の注入装置
(falling-needle injector) でヘウレット−パッカード
(Hewlett-Packard) (Palo Alto, CA) 5992Bガスク
ロマトグラフー質量分析計に注入し、そしてこの装置は
9825B計算器、9876Aプリンターおよび分子噴
射分離器を装備していた。注入口を変更して、落下する
針の注入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャ
リヤーガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分
割は、デュラボンド (Durabond)DB−5溶融シリカ毛
管カラム(30m×0.25mm内径、0.25μmのフ
ィルム厚さ)〔J&Wサイエンティフィック・インコー
ポレーテッド(Rancho Cordova, CA) から入手した〕で
達成した。ガスクロマトグラフー質量分析計は、250
℃の注入口の温度および22psi のカラムヘッドの圧力
で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを1
60℃に平衡化し、そして試料注入後6.5分に8℃/
分で188℃に増加した。データを選択したイオン監視
のモードで5.8〜12.5分に集めた。次の〔M−5
7〕+ イオンを50ミリ秒の滞留時間で各々について監
視した:マロン酸、m/z 275.2;メチルマロン
酸、m/z 289.2;〔メチル−2 H3 〕メチルマ
ロン酸、m/z 292.2;コハク酸、m/z 28
9.2;〔1,4−13C2 〕コハク酸、m/z 29
1.2;ジメチルマロン酸、m/z 303.2;エチ
ルマロン酸、m/z 303.2;メチルコハク酸、m
/z 303.2;およびグルタル酸、m/z 30
3.2。メチルマロン酸は、ほぼ6.8分において溶離
されるm/z 289.2ピークの積分した面積(精確
な時間は標準を使用して毎日決定した)を同一時間に溶
離したm/z 292.2ピークの積分で割り、次いで
各試料に添加した〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸の
等しい量である、200ngを掛けることによって定量し
た。コハク酸は、同一の方法で、ほぼ9.3分に溶離し
たm/z 289.2およびm/z 291.2のピー
クを利用し、そして試料に添加した〔1,4−13C3 〕
コハク酸の量である、200ngをそれらの比に掛けるこ
とによって定量する。2つの内部標準についての積分し
た面積、すなわち約6.8および9.3分に溶離するm
/z 292.2およびm/z 291.2のピーク
は、天然に産出するアイソトープの存在量の結果とし
て、それらに寄与される量について、メチルマロン酸お
よびコハク酸によって補正する。毎日の基準に基づいて
富んでないメチルマロン酸を使用して決定した、これら
の補正は次の通りであった:i)6.8分におけるm/
z289.2ピークの面積のほぼ1.9%は6.8分に
おけるm/z 292.2ピークとして存在し、そして
ii)9.3分におけるm/z 289.2ピークの面積
のほぼ10.8%は9.3分におけるm/z 291.
2ピークとして存在した。
lのN−メチル−N−(t−ブチルジメチルシリル)ト
リフルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それら
のテフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そ
してそれらを室温(22℃)で1夜放置するか、あるい
はそれらを80℃に1時間加熱することによって、ジカ
ルボン酸のt−ブチルジメチルシリルエステル調整し
た。100μlのH2 Oを添加して、反応の誘導体化剤
を加水分解し、次いで250μlのヘキサンを添加し、
激しく混合し、そして1000gで5分間遠心した。上
のヘキサン層をデカンテーションし、別のレアクチ・バ
イアルに移し、窒素の流れの適用によってほぼ5μlに
乾燥した。完全な乾固を回避するように注意した。なぜ
なら、これは誘導体の主要な部分を失わせるからであ
る。ほぼ2μlを毛管カラム上に落下する針の注入装置
(falling-needle injector) でヘウレット−パッカード
(Hewlett-Packard) (Palo Alto, CA) 5992Bガスク
ロマトグラフー質量分析計に注入し、そしてこの装置は
9825B計算器、9876Aプリンターおよび分子噴
射分離器を装備していた。注入口を変更して、落下する
針の注入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャ
リヤーガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分
割は、デュラボンド (Durabond)DB−5溶融シリカ毛
管カラム(30m×0.25mm内径、0.25μmのフ
ィルム厚さ)〔J&Wサイエンティフィック・インコー
ポレーテッド(Rancho Cordova, CA) から入手した〕で
達成した。ガスクロマトグラフー質量分析計は、250
℃の注入口の温度および22psi のカラムヘッドの圧力
で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを1
60℃に平衡化し、そして試料注入後6.5分に8℃/
分で188℃に増加した。データを選択したイオン監視
のモードで5.8〜12.5分に集めた。次の〔M−5
7〕+ イオンを50ミリ秒の滞留時間で各々について監
視した:マロン酸、m/z 275.2;メチルマロン
酸、m/z 289.2;〔メチル−2 H3 〕メチルマ
ロン酸、m/z 292.2;コハク酸、m/z 28
9.2;〔1,4−13C2 〕コハク酸、m/z 29
1.2;ジメチルマロン酸、m/z 303.2;エチ
ルマロン酸、m/z 303.2;メチルコハク酸、m
/z 303.2;およびグルタル酸、m/z 30
3.2。メチルマロン酸は、ほぼ6.8分において溶離
されるm/z 289.2ピークの積分した面積(精確
な時間は標準を使用して毎日決定した)を同一時間に溶
離したm/z 292.2ピークの積分で割り、次いで
各試料に添加した〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸の
等しい量である、200ngを掛けることによって定量し
た。コハク酸は、同一の方法で、ほぼ9.3分に溶離し
たm/z 289.2およびm/z 291.2のピー
クを利用し、そして試料に添加した〔1,4−13C3 〕
コハク酸の量である、200ngをそれらの比に掛けるこ
とによって定量する。2つの内部標準についての積分し
た面積、すなわち約6.8および9.3分に溶離するm
/z 292.2およびm/z 291.2のピーク
は、天然に産出するアイソトープの存在量の結果とし
て、それらに寄与される量について、メチルマロン酸お
よびコハク酸によって補正する。毎日の基準に基づいて
富んでないメチルマロン酸を使用して決定した、これら
の補正は次の通りであった:i)6.8分におけるm/
z289.2ピークの面積のほぼ1.9%は6.8分に
おけるm/z 292.2ピークとして存在し、そして
ii)9.3分におけるm/z 289.2ピークの面積
のほぼ10.8%は9.3分におけるm/z 291.
2ピークとして存在した。
【0073】アッセイの感度は、例えば、メチルマロン
酸対〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸の比を決定する
ことによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載
されている直線性から変動する:Zinn, A.B., D.G.Hin
e, M.J.Mahoney および K.Tanaka, Pediatr.Res. 16 :
740−745 (1982)。クレアチニンの浄化に関する、血清
からのメチルマロン酸およびコハク酸の尿浄化は、メチ
ルマロン酸について例示したように次の等式で決定し
た:メチルマロン酸/クレアチニンの清浄化比=100
×〔尿のメチルマロン酸(ng/ml)/尿のクレアチニン
(ng/ml)/〔血清メチルマロン酸(ng/ml)/血清ク
レアチニン(ng/ml)〕この手順において利用する部分
的試料の精製の長大な性質は必要であった。なぜなら、
アミノ酸および他の有機化合物の複雑な混合物が血清お
よび尿の中に存在し、そして存在するメチルマロン酸の
濃度が比較的低かったからである。種々の有機溶媒を使
用する抽出、次いで小型の陰イオン−交換または逆相カ
ラムを使用するそれ以上の精製を用いる手順は、不満足
であった。陰イオン−交換樹脂を使用する高性能液体ク
ロマトグラフィーは、非常に有益であることが証明され
た。なぜなら、研究するジカルボン酸の pKa値はpH2に
おいて遅延するが、ほとんどの他の化合物は遅延しなか
ったからである。尿試料の分析は、血清について必要と
するのと同程度の部分的精製を必要としていた。〔メチ
ル−14C〕メチルマロン酸および〔1,4−14C〕コハ
ク酸の既知量を血清および尿の試料に添加する実験は、
両者のジカルボン酸の10〜20%が最終のヘキサン溶
液中に長大な部分的精製および誘導体化の手順後の終り
において回収されることを示した。
酸対〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸の比を決定する
ことによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載
されている直線性から変動する:Zinn, A.B., D.G.Hin
e, M.J.Mahoney および K.Tanaka, Pediatr.Res. 16 :
740−745 (1982)。クレアチニンの浄化に関する、血清
からのメチルマロン酸およびコハク酸の尿浄化は、メチ
ルマロン酸について例示したように次の等式で決定し
た:メチルマロン酸/クレアチニンの清浄化比=100
×〔尿のメチルマロン酸(ng/ml)/尿のクレアチニン
(ng/ml)/〔血清メチルマロン酸(ng/ml)/血清ク
レアチニン(ng/ml)〕この手順において利用する部分
的試料の精製の長大な性質は必要であった。なぜなら、
アミノ酸および他の有機化合物の複雑な混合物が血清お
よび尿の中に存在し、そして存在するメチルマロン酸の
濃度が比較的低かったからである。種々の有機溶媒を使
用する抽出、次いで小型の陰イオン−交換または逆相カ
ラムを使用するそれ以上の精製を用いる手順は、不満足
であった。陰イオン−交換樹脂を使用する高性能液体ク
ロマトグラフィーは、非常に有益であることが証明され
た。なぜなら、研究するジカルボン酸の pKa値はpH2に
おいて遅延するが、ほとんどの他の化合物は遅延しなか
ったからである。尿試料の分析は、血清について必要と
するのと同程度の部分的精製を必要としていた。〔メチ
ル−14C〕メチルマロン酸および〔1,4−14C〕コハ
ク酸の既知量を血清および尿の試料に添加する実験は、
両者のジカルボン酸の10〜20%が最終のヘキサン溶
液中に長大な部分的精製および誘導体化の手順後の終り
において回収されることを示した。
【0074】t−ブチルジメチルクロロシラン/N,N
−ジメチルホルムアミド/イミダゾールの混合物を使用
するジカルボン酸のt−ブチルジメチルシリル誘導体を
生成する初期の試み(Applied Science Laboratories,
Inc., State College, PA)〔de Jong, A.P.J.M., J.Ele
maおよびB.J.T.van de Berg, Biomed.Mass Spectrom.7
: 359−364 (1980)に記載されている〕は、誘導体化が
著しく変動しそして誘導体が比較的不安定であるため
に、不満足であった。あるt−ブチルジメチルシリル誘
導体、例えば、ある種の有機酸のエステルが加水分解す
るときの予期されない容易さに関する問題が、過去にお
いて生じた。Jongらが記載する反応混合物のpHはほぼ1
であること、およびクロロシランを含む反応によって生
成するHClをイミダゾールが完全に掃去することがで
きないために、これは新しく生成したジカルボン酸のt
−ブチルジメチルシリル誘導体の加水分解を生ずること
を、われわれは発見した。この問題は他のスキャベンジ
ャー、例えば、ピリジンの添加によって部分的にのみ補
正されただけである。しかしながら、N−メチル−N−
(t−ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミ
ドを使用して調整したt−ブチルジメチルシリル誘導体
は、高い収率で、再現性のある方法で得られ、そして前
述のようにヘキサン中に抽出した後1週間以上安定であ
ることを、われわれは発見した。したがって、この手順
はわれわれの標準法として応用した。
−ジメチルホルムアミド/イミダゾールの混合物を使用
するジカルボン酸のt−ブチルジメチルシリル誘導体を
生成する初期の試み(Applied Science Laboratories,
Inc., State College, PA)〔de Jong, A.P.J.M., J.Ele
maおよびB.J.T.van de Berg, Biomed.Mass Spectrom.7
: 359−364 (1980)に記載されている〕は、誘導体化が
著しく変動しそして誘導体が比較的不安定であるため
に、不満足であった。あるt−ブチルジメチルシリル誘
導体、例えば、ある種の有機酸のエステルが加水分解す
るときの予期されない容易さに関する問題が、過去にお
いて生じた。Jongらが記載する反応混合物のpHはほぼ1
であること、およびクロロシランを含む反応によって生
成するHClをイミダゾールが完全に掃去することがで
きないために、これは新しく生成したジカルボン酸のt
−ブチルジメチルシリル誘導体の加水分解を生ずること
を、われわれは発見した。この問題は他のスキャベンジ
ャー、例えば、ピリジンの添加によって部分的にのみ補
正されただけである。しかしながら、N−メチル−N−
(t−ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミ
ドを使用して調整したt−ブチルジメチルシリル誘導体
は、高い収率で、再現性のある方法で得られ、そして前
述のようにヘキサン中に抽出した後1週間以上安定であ
ることを、われわれは発見した。したがって、この手順
はわれわれの標準法として応用した。
【0075】メチルマロン酸のt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の構造およびm/z値を、断片化位置および
〔M−57〕+ および〔M−15〕+ に存在する問題の
主要な断片のm/z値と一緒に下に示す:
ル誘導体の構造およびm/z値を、断片化位置および
〔M−57〕+ および〔M−15〕+ に存在する問題の
主要な断片のm/z値と一緒に下に示す:
【0076】
【化3】
【0077】マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジ
メチルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およ
びグルタル酸の分子量は、それらのt−ブチルジメチル
シリル誘導体の質量スペクトルと一緒に図3に示されて
いる。特定の誘導体の分子量は、2つのt−ブチルジメ
チルシリル基の付加のために、ジカルボン酸の分子量+
228に等しい。誘導体全体を表わすピーク、すなわち
〔M〕+ は、ジカルボン酸のいずれについても観測され
なかった。むしろ、各場合の主要なピークは〔M−5
7〕+ であり、これは100〜400のm/z範囲にお
けるすべてのピークの合計の35〜45%を表わした。
〔M−15〕+ を表わす、より小さいピークも各ジカル
ボン酸誘導体について観測されたが、量は〔M−57〕
+ ピークについて存在する量のわずかに3〜6%であっ
た。m/z 147値をもつピークはジカルボン酸誘導
体のすべてについて観測され、そしてm/z 189を
もつピークはグルタル酸誘導体を除外するすべてについ
て観測された。これらのピークの両者は、t−ブチルジ
メチルシリル基それら自体の一部の断片化および転位か
ら生ずると思われ、そして、豊富なm/z 147およ
びm/z 189ピークが、また、〔メチル−2 H3 〕
メチルマロン酸および〔1,4−13C2 〕コハク酸につ
いて観測されるので、ジカルボン酸それら自体の部分を
含まない。
メチルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およ
びグルタル酸の分子量は、それらのt−ブチルジメチル
シリル誘導体の質量スペクトルと一緒に図3に示されて
いる。特定の誘導体の分子量は、2つのt−ブチルジメ
チルシリル基の付加のために、ジカルボン酸の分子量+
228に等しい。誘導体全体を表わすピーク、すなわち
〔M〕+ は、ジカルボン酸のいずれについても観測され
なかった。むしろ、各場合の主要なピークは〔M−5
7〕+ であり、これは100〜400のm/z範囲にお
けるすべてのピークの合計の35〜45%を表わした。
〔M−15〕+ を表わす、より小さいピークも各ジカル
ボン酸誘導体について観測されたが、量は〔M−57〕
+ ピークについて存在する量のわずかに3〜6%であっ
た。m/z 147値をもつピークはジカルボン酸誘導
体のすべてについて観測され、そしてm/z 189を
もつピークはグルタル酸誘導体を除外するすべてについ
て観測された。これらのピークの両者は、t−ブチルジ
メチルシリル基それら自体の一部の断片化および転位か
ら生ずると思われ、そして、豊富なm/z 147およ
びm/z 189ピークが、また、〔メチル−2 H3 〕
メチルマロン酸および〔1,4−13C2 〕コハク酸につ
いて観測されるので、ジカルボン酸それら自体の部分を
含まない。
【0078】図4は、(A)1μgの各酸を含有する混
合物;(B)500μlのプールした正常ヒト血清;
(C)500μlの正常ラット血清;および(D)10
0μlの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のt−
ブチルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示
す。研究したアミノ酸は、次の通りであった:マロン酸
(MA)、メチルマロン酸(MMA)、コハク酸(S
A)、〔1,4−13C2 〕コハク酸(SA*)、〔メチ
ル−2 H3 〕メチルマロン酸(MMA*)、ジメチルマ
ロン酸(DMMA)、エチルマロン酸(EMA)、メチ
ルコハク酸(MSA)およびグルタル酸(GA)。かっ
こ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査した
m/zについての値である。「F.S.」についての値
は太いダッシュのトレースの全規模についての相対値で
ある;細いダッシュのトレースは10×の減衰である。
MMAについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ、56、92および3400ng/mlであっ
た。SAについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ、1110、9200および19,000
ng/mlであった。
合物;(B)500μlのプールした正常ヒト血清;
(C)500μlの正常ラット血清;および(D)10
0μlの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のt−
ブチルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示
す。研究したアミノ酸は、次の通りであった:マロン酸
(MA)、メチルマロン酸(MMA)、コハク酸(S
A)、〔1,4−13C2 〕コハク酸(SA*)、〔メチ
ル−2 H3 〕メチルマロン酸(MMA*)、ジメチルマ
ロン酸(DMMA)、エチルマロン酸(EMA)、メチ
ルコハク酸(MSA)およびグルタル酸(GA)。かっ
こ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査した
m/zについての値である。「F.S.」についての値
は太いダッシュのトレースの全規模についての相対値で
ある;細いダッシュのトレースは10×の減衰である。
MMAについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ、56、92および3400ng/mlであっ
た。SAについて決定した値は、B,CおよびDについ
て、それぞれ、1110、9200および19,000
ng/mlであった。
【0079】図4Aが立証するように、毛管カラムは同
一の分子量を有する誘導体のすべてについて完全な分離
を与える。すなわち、メチルマロン酸およびコハク酸は
互いに完全に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチ
ルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに
完全に分離される。メチルマロン酸はジメチルマロン酸
から完全に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から
完全に分離されないが、これは問題ではない。なぜな
ら、図3に示すように、これらの分割されないジカルボ
ン酸誘導体は異なる分子量および質量スペクトルを有
し、こうして選択したイオンを監視するとき妨害が存在
しないからである。
一の分子量を有する誘導体のすべてについて完全な分離
を与える。すなわち、メチルマロン酸およびコハク酸は
互いに完全に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチ
ルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに
完全に分離される。メチルマロン酸はジメチルマロン酸
から完全に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から
完全に分離されないが、これは問題ではない。なぜな
ら、図3に示すように、これらの分割されないジカルボ
ン酸誘導体は異なる分子量および質量スペクトルを有
し、こうして選択したイオンを監視するとき妨害が存在
しないからである。
【0080】〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸および
〔1,4−13C3 〕コハク酸を添加しない、ヒトの血清
および尿、およびラットの血清の試料を使用する研究
は、定量のために内部基準としてのそれらの使用を妨害
する物質が存在しないことを立証した。アッセイの感度
は200ngの〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸および
2000ngの〔1,4−13C2 〕コハク酸を使用する標
準の条件下に、メチルマロン酸について5ng/mlおよび
コハク酸について150ng/mlであったが、感度は各場
合において添加する内部標準の量を減少することによっ
て改良できた。標準条件下で実施したアッセイは、水性
試料中においておよび既知量のそれぞれの酸を添加した
血清中において、メチルマロン酸についてのアッセイが
5〜5000ngにおいて直線であること、およびコハク
酸のアッセイが150〜150,000において直線で
あることを示した。
〔1,4−13C3 〕コハク酸を添加しない、ヒトの血清
および尿、およびラットの血清の試料を使用する研究
は、定量のために内部基準としてのそれらの使用を妨害
する物質が存在しないことを立証した。アッセイの感度
は200ngの〔メチル−2 H3 〕メチルマロン酸および
2000ngの〔1,4−13C2 〕コハク酸を使用する標
準の条件下に、メチルマロン酸について5ng/mlおよび
コハク酸について150ng/mlであったが、感度は各場
合において添加する内部標準の量を減少することによっ
て改良できた。標準条件下で実施したアッセイは、水性
試料中においておよび既知量のそれぞれの酸を添加した
血清中において、メチルマロン酸についてのアッセイが
5〜5000ngにおいて直線であること、およびコハク
酸のアッセイが150〜150,000において直線で
あることを示した。
【0081】500μlの正常ヒト血清を使用して得た
クロマトグラムは図4Bに示されている。コハク酸は最
大の量で存在し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エ
チルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、よ
り少量で存在するが、容易に検出される量である。ジメ
チルマロン酸は確実に検出できなかった。500μlの
正常ラット血清および100μlの正常ヒト尿を使用し
て得られたクロマトグラムは、それぞれ、図4Cおよび
図4Dに示されており、そしてプールした正常ヒト血清
を用いて得られたクロマトグラムに類似する(図4
B)。
クロマトグラムは図4Bに示されている。コハク酸は最
大の量で存在し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エ
チルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、よ
り少量で存在するが、容易に検出される量である。ジメ
チルマロン酸は確実に検出できなかった。500μlの
正常ラット血清および100μlの正常ヒト尿を使用し
て得られたクロマトグラムは、それぞれ、図4Cおよび
図4Dに示されており、そしてプールした正常ヒト血清
を用いて得られたクロマトグラムに類似する(図4
B)。
【0082】反復して凍結および融解し、そして10か
月の期間にわたって17の異なる場合についてアッセイ
した、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用して
実施した研究は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッ
セイについて、それぞれ、26%および19%の変動係
数についての値を与えた。これらの2種類のジカルボン
酸についての値の有意の変動または傾向は10か月の期
間にわたって観測されなかった。抜出しかつ直ちに4℃
において遠心した血清試料を使用して得られた血清のメ
チルマロン酸についての値は、遠心前室温において1時
間または24時間インキュベーションした同一血液試料
の一部を使用して得られた値と同一であった。しかしな
がら、コハク酸の値はこの期間にわたって増加し、室温
において1時間インキュベーション後ほぼ10%増加
し、そして24時間インキュベーション後ほぼ90%増
加した。ラットの血清を使用して実施した研究は同様な
結果を与えた。尿のメチルマロン酸およびコハク酸につ
いての値は、尿の試料を室温において0〜24時間イン
キュベーションした時不変化であった。
月の期間にわたって17の異なる場合についてアッセイ
した、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用して
実施した研究は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッ
セイについて、それぞれ、26%および19%の変動係
数についての値を与えた。これらの2種類のジカルボン
酸についての値の有意の変動または傾向は10か月の期
間にわたって観測されなかった。抜出しかつ直ちに4℃
において遠心した血清試料を使用して得られた血清のメ
チルマロン酸についての値は、遠心前室温において1時
間または24時間インキュベーションした同一血液試料
の一部を使用して得られた値と同一であった。しかしな
がら、コハク酸の値はこの期間にわたって増加し、室温
において1時間インキュベーション後ほぼ10%増加
し、そして24時間インキュベーション後ほぼ90%増
加した。ラットの血清を使用して実施した研究は同様な
結果を与えた。尿のメチルマロン酸およびコハク酸につ
いての値は、尿の試料を室温において0〜24時間イン
キュベーションした時不変化であった。
【0083】50人の正常ヒト被検者および95匹の正
常ラットからのメチルマロン酸およびコハク酸について
得られ、より高い値に向かうひずみにつて補正するため
に対数変換後に平均±2 S.D. として計算した、実際の
平均(μモル/1)および範囲についての値は、次の通
りであった:ヒト血清メチルマロン酸、41(19−7
6);ヒト血清コハク酸、1270(589−242
0);ラット血清メチルマロン酸、128(42−29
5);およびラット血清コハク酸、11900(542
0−22800)。同一の50人の正常ヒト被検者から
得、上に定義したように計算した、実際の平均(ng/ml
またはng/mgのクレアチニン)および範囲についての値
は、次の通りであった:ヒト尿メチルマロン酸、184
0(270−7190);ヒト尿メチルマロン酸/mg尿
クレアチニン、2010(810−3830);ヒト尿
コハク酸、25400(4620−85600);およ
びヒト尿コハク酸/mg尿クレアチニン、28200(8
360−75100)。尿中のメチルマロン酸およびコ
ハク酸についての正常な範囲は、ng/mlとして表すとき
より、ng/mgのクレアチニンとして表わすとき高い。
常ラットからのメチルマロン酸およびコハク酸について
得られ、より高い値に向かうひずみにつて補正するため
に対数変換後に平均±2 S.D. として計算した、実際の
平均(μモル/1)および範囲についての値は、次の通
りであった:ヒト血清メチルマロン酸、41(19−7
6);ヒト血清コハク酸、1270(589−242
0);ラット血清メチルマロン酸、128(42−29
5);およびラット血清コハク酸、11900(542
0−22800)。同一の50人の正常ヒト被検者から
得、上に定義したように計算した、実際の平均(ng/ml
またはng/mgのクレアチニン)および範囲についての値
は、次の通りであった:ヒト尿メチルマロン酸、184
0(270−7190);ヒト尿メチルマロン酸/mg尿
クレアチニン、2010(810−3830);ヒト尿
コハク酸、25400(4620−85600);およ
びヒト尿コハク酸/mg尿クレアチニン、28200(8
360−75100)。尿中のメチルマロン酸およびコ
ハク酸についての正常な範囲は、ng/mlとして表すとき
より、ng/mgのクレアチニンとして表わすとき高い。
【0084】メチルマロン酸およびコハク酸についての
値は、両者共、ヒト血清中よりラット血清中において有
意に高かった。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清
メチルマロン酸/mgクレアチニンは、尿メチルマロン酸
および尿メチルマロン酸/mgクレアチニンと有意に相関
関係をもたない。血清および尿のメチルマロン酸につい
ての値は、男性および女性について有意に異ならず、そ
して年令、ヘモグロビン、平均の血球体積、白血球数、
血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清クレアチ
ニン、血清コハク酸または尿コハク酸と有意に相関関係
をもたなかった。最高の相関関係係数は、血清メチルマ
ロン酸と血清コバラミンとの間において−0.25であ
った(P=0.08)。血清および尿のコハク酸レベル
は、メチルマロン酸について前述のパラメーターのいず
れとも有意に相関関係をもたなかった。
値は、両者共、ヒト血清中よりラット血清中において有
意に高かった。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清
メチルマロン酸/mgクレアチニンは、尿メチルマロン酸
および尿メチルマロン酸/mgクレアチニンと有意に相関
関係をもたない。血清および尿のメチルマロン酸につい
ての値は、男性および女性について有意に異ならず、そ
して年令、ヘモグロビン、平均の血球体積、白血球数、
血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清クレアチ
ニン、血清コハク酸または尿コハク酸と有意に相関関係
をもたなかった。最高の相関関係係数は、血清メチルマ
ロン酸と血清コバラミンとの間において−0.25であ
った(P=0.08)。血清および尿のコハク酸レベル
は、メチルマロン酸について前述のパラメーターのいず
れとも有意に相関関係をもたなかった。
【0085】クレアチニンの浄化に関するヒト血清から
のメチルマロン酸の平均尿浄化は28%であり、そして
クレアチニンの浄化に関するヒト血清からのコハク酸の
平均尿浄化は13%であると、計算された。この他の観
察は、〔メチル−14C〕メチルマロン酸をラットに心臓
内注射により投与した実験において観察されたように、
血清中のメチルマロン酸のほとんどが未知の通路を経て
代謝されるという考えを支持する。
のメチルマロン酸の平均尿浄化は28%であり、そして
クレアチニンの浄化に関するヒト血清からのコハク酸の
平均尿浄化は13%であると、計算された。この他の観
察は、〔メチル−14C〕メチルマロン酸をラットに心臓
内注射により投与した実験において観察されたように、
血清中のメチルマロン酸のほとんどが未知の通路を経て
代謝されるという考えを支持する。
【0086】われわれの研究は de Jongらの示唆を支持
する。なぜなら、ある数のジカルボン酸のt−ブチルジ
メチルシリル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラ
フィーおよび質量分析の性質をもつことをわれわれは示
したからである。最初に、誘導体化の程度の変動および
加水分解の不安定性のための重大な性質の問題にわれわ
れは直面したが、これらの問題は、誘導体化試薬とし
て、 de Jongらが利用したt−ブチルジメチルクロロシ
ラン/N,N−ジメチルホルムアミド/イミダゾールの
混合物の代わりに、N−メチル−N−(t−ブチルジメ
チルシリル)トリフルオロアセトアミドを使用すること
によって解決された。この改良は、また、カルボキシル
基またはとくに加水分解されやすい他の基を含有する生
物学的に興味ある他の化合物のt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体を調整しかつ定量するために、そして他のアミ
ノ酸の誘導体化および定量に応用できる。
する。なぜなら、ある数のジカルボン酸のt−ブチルジ
メチルシリル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラ
フィーおよび質量分析の性質をもつことをわれわれは示
したからである。最初に、誘導体化の程度の変動および
加水分解の不安定性のための重大な性質の問題にわれわ
れは直面したが、これらの問題は、誘導体化試薬とし
て、 de Jongらが利用したt−ブチルジメチルクロロシ
ラン/N,N−ジメチルホルムアミド/イミダゾールの
混合物の代わりに、N−メチル−N−(t−ブチルジメ
チルシリル)トリフルオロアセトアミドを使用すること
によって解決された。この改良は、また、カルボキシル
基またはとくに加水分解されやすい他の基を含有する生
物学的に興味ある他の化合物のt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体を調整しかつ定量するために、そして他のアミ
ノ酸の誘導体化および定量に応用できる。
【0087】われわれは、正常のヒトおよびラットから
の血清中のメチルマロン酸を検出しかつ定量する技術を
開発した。われわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン
酸の正常範囲を規定し、そしてわれわれの値は、一般
に、他のガスクロマトグラフィー−質量分析技術を用い
て得られた値と一致する。われわれの方法は、また、血
清および尿中のマロン酸、ジメチルマロン酸、エチルマ
ロン酸、メチルコハク酸、グルタル酸、および他のジカ
ルボン酸を定量するために適するが、各ジカルボン酸に
ついて適当に安定なアイソトープ内部標準を利用して最
適な定量の精度を保証すべきである。
の血清中のメチルマロン酸を検出しかつ定量する技術を
開発した。われわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン
酸の正常範囲を規定し、そしてわれわれの値は、一般
に、他のガスクロマトグラフィー−質量分析技術を用い
て得られた値と一致する。われわれの方法は、また、血
清および尿中のマロン酸、ジメチルマロン酸、エチルマ
ロン酸、メチルコハク酸、グルタル酸、および他のジカ
ルボン酸を定量するために適するが、各ジカルボン酸に
ついて適当に安定なアイソトープ内部標準を利用して最
適な定量の精度を保証すべきである。
【0088】ヒト血清中のメチルマロン酸を測定する感
度の高い特異的な方法の利用可能性は、次のものを包含
する、ある数の臨床学的応用を有する:(i)確証され
たコバラミンの欠乏を有する患者における血清メチルマ
ロン酸についての増大した値の発生の決定、(ii)血清
コバラミンのアッセイの診断的感度および特異性を評価
するために、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い
正常レベルをもつ患者の血清のメチルマロン酸のレベル
の決定、および(iii)種々の神経精神学的異常をもつ患
者の血清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発
生をよりよく定めるために、これらの群におけるメチル
マロン酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸
のアッセイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段
であり、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチル
マロン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバ
ラミン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研
究において有用であり、これらの物質はコバラミンの代
謝および利用の種々な面を妨害する。
度の高い特異的な方法の利用可能性は、次のものを包含
する、ある数の臨床学的応用を有する:(i)確証され
たコバラミンの欠乏を有する患者における血清メチルマ
ロン酸についての増大した値の発生の決定、(ii)血清
コバラミンのアッセイの診断的感度および特異性を評価
するために、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い
正常レベルをもつ患者の血清のメチルマロン酸のレベル
の決定、および(iii)種々の神経精神学的異常をもつ患
者の血清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発
生をよりよく定めるために、これらの群におけるメチル
マロン酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸
のアッセイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段
であり、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチル
マロン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバ
ラミン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研
究において有用であり、これらの物質はコバラミンの代
謝および利用の種々な面を妨害する。
【0089】実施例Vコバラミンの欠乏をもつ患者の血清中のメチルマロン酸
のアッセイ 18〜65才の年令の範囲の50人の正常血液共与者、
25人の男性および25人の女性、からの血清試料を実
施例IIに記載するようにして得た。患者の試料は、過去
15年にわたって集成された広範囲の血清収集物から選
択した。コバラミン(Cbl)欠乏の診断は、低い血清
Cblレベル、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な血液学
的または神経学的異常、および非経口的化合物ゲルを使
用する処置に対する応答に基づいた。悪性の貧血の診断
は異常なシリング(Schilling) テストに基づいた〔参
照、例えば、Beck, W.S., Hematology (W.J.Williams,
E.Beutler, A.J.Ersler およびM.A.Lichtman編) (McGra
w-Hill Book Co., New York,1983), pp.444−445 〕に
基づき、このテストは血清中の外因性固有因子および/
または抗固有因子遮断抗体の存在について補正した。葉
酸塩の欠乏の診断は、低い血清葉酸塩値、正常または増
大した血清Cbl値、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な
血液学的異常、およびアルコール中毒症および劣った食
物の経歴に基づいた。Cbl欠乏の頻繁な処置群におけ
る試料を、悪性貧血をもつ患者から得、前記患者は前述
のように前もってCbl欠乏と診断されているが、屈従
が劣るため6〜9か月の間隔であるいはCbl要求の他
の研究の一部として非経口的Cblの間欠的処置のみを
受けた患者であった。患者は血清Cblレベルについて
低い、基線の、あるいは正常のレベルを有し、血液学的
および神経学的異常に欠け、そして試料を収集すると
き、無症候性であった。血清Cblレベルは、レクトバ
シルス・レイキマンニ (Lactobacillus leichimannii)
法〔参照、例えば、Matthews, D.M., Clin.Science 22
: 101 (1962)〕あるいは固有因子のためにCbl結合
活性の95%より多くをもつ、精製した固有因子または
胃液を利用するある数の放射線希釈アッセイ〔Kolhous
e, J.F., H.Kondo, H.C.Allen, E.Podellおよび R.H.Al
len, N.Eng.J.Med. 299 : 785−792 (1978)〕を使用し
てアッセイした。血清葉酸塩は、レクトバシルス・カセ
イ (Lactobacillus casei) 法〔Goulian, M. およびW.
S.Geck, Am.J.Clin.Path. 46:390 (1966)〕またはミル
ク結合放射線希釈アッセイ〔Rohenberg, S.P. et al.,
N.Eng.J.Med. 286:1335 (1972) 〕を使用してアッセイ
した。患者の試料のすべては、患者が属するカテゴリー
および各カテゴリーにおける患者の数がメチルマロン酸
およびコハク酸のアッセイの実施に参加する人員が知ら
ないように、ある数字でコード化した。
のアッセイ 18〜65才の年令の範囲の50人の正常血液共与者、
25人の男性および25人の女性、からの血清試料を実
施例IIに記載するようにして得た。患者の試料は、過去
15年にわたって集成された広範囲の血清収集物から選
択した。コバラミン(Cbl)欠乏の診断は、低い血清
Cblレベル、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な血液学
的または神経学的異常、および非経口的化合物ゲルを使
用する処置に対する応答に基づいた。悪性の貧血の診断
は異常なシリング(Schilling) テストに基づいた〔参
照、例えば、Beck, W.S., Hematology (W.J.Williams,
E.Beutler, A.J.Ersler およびM.A.Lichtman編) (McGra
w-Hill Book Co., New York,1983), pp.444−445 〕に
基づき、このテストは血清中の外因性固有因子および/
または抗固有因子遮断抗体の存在について補正した。葉
酸塩の欠乏の診断は、低い血清葉酸塩値、正常または増
大した血清Cbl値、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な
血液学的異常、およびアルコール中毒症および劣った食
物の経歴に基づいた。Cbl欠乏の頻繁な処置群におけ
る試料を、悪性貧血をもつ患者から得、前記患者は前述
のように前もってCbl欠乏と診断されているが、屈従
が劣るため6〜9か月の間隔であるいはCbl要求の他
の研究の一部として非経口的Cblの間欠的処置のみを
受けた患者であった。患者は血清Cblレベルについて
低い、基線の、あるいは正常のレベルを有し、血液学的
および神経学的異常に欠け、そして試料を収集すると
き、無症候性であった。血清Cblレベルは、レクトバ
シルス・レイキマンニ (Lactobacillus leichimannii)
法〔参照、例えば、Matthews, D.M., Clin.Science 22
: 101 (1962)〕あるいは固有因子のためにCbl結合
活性の95%より多くをもつ、精製した固有因子または
胃液を利用するある数の放射線希釈アッセイ〔Kolhous
e, J.F., H.Kondo, H.C.Allen, E.Podellおよび R.H.Al
len, N.Eng.J.Med. 299 : 785−792 (1978)〕を使用し
てアッセイした。血清葉酸塩は、レクトバシルス・カセ
イ (Lactobacillus casei) 法〔Goulian, M. およびW.
S.Geck, Am.J.Clin.Path. 46:390 (1966)〕またはミル
ク結合放射線希釈アッセイ〔Rohenberg, S.P. et al.,
N.Eng.J.Med. 286:1335 (1972) 〕を使用してアッセイ
した。患者の試料のすべては、患者が属するカテゴリー
および各カテゴリーにおける患者の数がメチルマロン酸
およびコハク酸のアッセイの実施に参加する人員が知ら
ないように、ある数字でコード化した。
【0090】ある数の因子を、血清のメチルマロン酸お
よびコハク酸との可能な関係について個々に検査した。
明確な因子、例えば、性、人種および診断について、ウ
ィルコキソン (Wilcoxon) 2試料テスト〔Steel, R.G.
D. およびJ.H.Torrie, Principles and Procedures of
Statistics (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York,1
960)〕を使用して関係の有意性を決定した。神経学的過
酷さとの可能な関係を評価するために、群0,1および
2(表1おいて定義する)を組み合わせ、そして組み合
わせた群3および4と比較した。連続的である因子、例
えば、年令または平均の血球体積(MCV)は、スピア
マン(Speaman) 相関関係係数〔Steel, supra〕を使用し
て検査した。結果を表1〜表4に記載する。
よびコハク酸との可能な関係について個々に検査した。
明確な因子、例えば、性、人種および診断について、ウ
ィルコキソン (Wilcoxon) 2試料テスト〔Steel, R.G.
D. およびJ.H.Torrie, Principles and Procedures of
Statistics (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York,1
960)〕を使用して関係の有意性を決定した。神経学的過
酷さとの可能な関係を評価するために、群0,1および
2(表1おいて定義する)を組み合わせ、そして組み合
わせた群3および4と比較した。連続的である因子、例
えば、年令または平均の血球体積(MCV)は、スピア
マン(Speaman) 相関関係係数〔Steel, supra〕を使用し
て検査した。結果を表1〜表4に記載する。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】
【表3】
【0094】
【表4】
【0095】種々のカテゴリーにおいて正常の被検者お
よび患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸に
ついて得られた値は図5に示されており、ここで血清メ
チルマロン酸のレベル(下)および血清コハク酸(上)
は臨床的に確証されたCbl欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ
患者、そして血液学的または神経学的異常をもたない、
Cbl欠乏の処置を頻繁にした患者について記載されて
いる。正常範囲はメチルマロン酸について19〜76ng
/mlであり、そしてコハク酸について580〜2420
ng/mlである。範囲は、より高い値へのひずみについて
補正するため対数変換後、±2 S.D. として計算した。
Cbl欠乏分において、73人の患者のうち69人は、
19〜76ng/mlの正常範囲より上であるメチルマロン
酸についての値を有した。最高の値は22,300ng/
mlであり、そしてメジアン値は1,100ng/mlであっ
た。16人の葉酸塩の欠乏の患者のうち5人は、おだや
かな血清メチルマロン酸の増加を有し、最高の値は14
0ng/mlであった。血液学的および神経学的異常をもた
ないCbl欠乏の頻繁な処置を受けた患者からの15試
料のうち7は、175ng/ml程度に高い範囲の増大した
値を有した。これらの7試料のうち、血清L.lichmannii
Cbl濃度は6つにおいて低く(88〜165pg/m
l)そして1つにおいて正常(275pg/ml)であっ
た。すべての7試料は、精製した固有因子を使用する放
射線希釈アッセイに従い低いCbl値(85〜155pg
/ml)を与えた。正常のメチルマロン酸レベルをもつ8
試料のうち、血清L.lichmannii Cblは4つにおいて
低かった。
よび患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸に
ついて得られた値は図5に示されており、ここで血清メ
チルマロン酸のレベル(下)および血清コハク酸(上)
は臨床的に確証されたCbl欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ
患者、そして血液学的または神経学的異常をもたない、
Cbl欠乏の処置を頻繁にした患者について記載されて
いる。正常範囲はメチルマロン酸について19〜76ng
/mlであり、そしてコハク酸について580〜2420
ng/mlである。範囲は、より高い値へのひずみについて
補正するため対数変換後、±2 S.D. として計算した。
Cbl欠乏分において、73人の患者のうち69人は、
19〜76ng/mlの正常範囲より上であるメチルマロン
酸についての値を有した。最高の値は22,300ng/
mlであり、そしてメジアン値は1,100ng/mlであっ
た。16人の葉酸塩の欠乏の患者のうち5人は、おだや
かな血清メチルマロン酸の増加を有し、最高の値は14
0ng/mlであった。血液学的および神経学的異常をもた
ないCbl欠乏の頻繁な処置を受けた患者からの15試
料のうち7は、175ng/ml程度に高い範囲の増大した
値を有した。これらの7試料のうち、血清L.lichmannii
Cbl濃度は6つにおいて低く(88〜165pg/m
l)そして1つにおいて正常(275pg/ml)であっ
た。すべての7試料は、精製した固有因子を使用する放
射線希釈アッセイに従い低いCbl値(85〜155pg
/ml)を与えた。正常のメチルマロン酸レベルをもつ8
試料のうち、血清L.lichmannii Cblは4つにおいて
低かった。
【0096】血清コハク酸についての増大した値は、7
3人Cbl欠乏患者のうち19人、16人の葉酸塩の欠
乏患者のうち10人、および15人のCbl欠乏の頻繁
な処置を受けた患者の15人において観測された。これ
らの評価の理由は未知であるが、血清分離前に血液を放
置した時間の変動に関係づけることができるであろう。
なぜなら、血液を遠心前に室温において24時間放置す
ると、コハク酸についての値は2倍になることがあるか
らである。血清メチルマロン酸についての値は、この時
間にわたって変化しない。
3人Cbl欠乏患者のうち19人、16人の葉酸塩の欠
乏患者のうち10人、および15人のCbl欠乏の頻繁
な処置を受けた患者の15人において観測された。これ
らの評価の理由は未知であるが、血清分離前に血液を放
置した時間の変動に関係づけることができるであろう。
なぜなら、血液を遠心前に室温において24時間放置す
ると、コハク酸についての値は2倍になることがあるか
らである。血清メチルマロン酸についての値は、この時
間にわたって変化しない。
【0097】Cbl欠乏をもつ73人の患者に関する臨
床的データは表1〜表4に表わされており、ここでデー
タは血清メチルマロン酸のレベルに関して減少する順序
で配置されている。血清メチルマロン酸と血清葉酸塩と
の間に有意な相関関係が存在した(r=0.45、P<
0.001)。相関関係は、L.casei 血清葉酸塩法(r
=0.46,P<0.01)ならびに放射線アッセイ技
術(r=0.66、P<0.001)によって測定した
試料において存在した。より重度の神経学的異常をもつ
患者(群3および4)は、より穏和な異常を有する患者
(群1および2、平均2083±2866、メジアン8
79ng/ml)あるいは神経学的関係の証拠をもたない患
者(群0、平均1154±1468、メジアン409ng
/ml)よりも、高い血清メチルマロン酸レベル(平均±
SD,5077±6073、メジアン3685ng/ml)
を有した(P<0.01、群3および4対群0〜2につ
いて)。
床的データは表1〜表4に表わされており、ここでデー
タは血清メチルマロン酸のレベルに関して減少する順序
で配置されている。血清メチルマロン酸と血清葉酸塩と
の間に有意な相関関係が存在した(r=0.45、P<
0.001)。相関関係は、L.casei 血清葉酸塩法(r
=0.46,P<0.01)ならびに放射線アッセイ技
術(r=0.66、P<0.001)によって測定した
試料において存在した。より重度の神経学的異常をもつ
患者(群3および4)は、より穏和な異常を有する患者
(群1および2、平均2083±2866、メジアン8
79ng/ml)あるいは神経学的関係の証拠をもたない患
者(群0、平均1154±1468、メジアン409ng
/ml)よりも、高い血清メチルマロン酸レベル(平均±
SD,5077±6073、メジアン3685ng/ml)
を有した(P<0.01、群3および4対群0〜2につ
いて)。
【0098】血清葉酸塩レベルは、神経学的状態に無関
係に血清メチルマロン酸と相関関係を有した(神経学的
疾患をもたない患者においてメチルマロン酸対葉酸塩に
ついてr=0.58;n=27;P<0.01)。血清
葉酸塩濃度はより重度の神経学的異常を有する患者にお
いて高い(平均血清葉酸塩、群3および4、20.9±
16.9ng/ml対群0〜2、10.1±8.7ng/ml、
P<0.005)が、より高い血清メチルマロン酸レベ
ルと進行した神経学的関係との関連性は葉酸塩の状態に
対して独立であるように思われる。血清葉酸塩レベルが
15ng/mlより低い患者において、平均血清メチルマロ
ン酸は、群3および4において、3189±2317ng
/ml対群0〜2において、1030±1795ng/ml、
P<0.005であった;血清葉酸塩は2つの群におい
て有意に異ならなかった(それぞれ、7.5±3.3ng
/ml対6.0±3.8ng/ml、P<0.25)。
係に血清メチルマロン酸と相関関係を有した(神経学的
疾患をもたない患者においてメチルマロン酸対葉酸塩に
ついてr=0.58;n=27;P<0.01)。血清
葉酸塩濃度はより重度の神経学的異常を有する患者にお
いて高い(平均血清葉酸塩、群3および4、20.9±
16.9ng/ml対群0〜2、10.1±8.7ng/ml、
P<0.005)が、より高い血清メチルマロン酸レベ
ルと進行した神経学的関係との関連性は葉酸塩の状態に
対して独立であるように思われる。血清葉酸塩レベルが
15ng/mlより低い患者において、平均血清メチルマロ
ン酸は、群3および4において、3189±2317ng
/ml対群0〜2において、1030±1795ng/ml、
P<0.005であった;血清葉酸塩は2つの群におい
て有意に異ならなかった(それぞれ、7.5±3.3ng
/ml対6.0±3.8ng/ml、P<0.25)。
【0099】血小板数および血清メチルマロン酸の間に
負の相関関係が存在した(r=−0.30;P<0.0
5)。しかしながら、より重度の神経学的異常をもつ患
者(群3および4)を分析から除外した場合(r=−
0.26;P>0.05)あるいは増大した血清メチル
マロン酸をもつ患者を分析から除外した場合(r=−
0.23;P>0.05)、コバラミンはもはや有意で
なかった。悪性の貧血を有する患者はマン−ウィトニイ
(Mann-Whitney) 試験〔Steel, supra〕を用いると、熱
帯性スプルーを有する患者(714±1007、P<
0.004)よりも高い血清メチルマロン酸値(平均、
2968±4387)を有した;しかしながら、熱帯性
スプルーを有する患者における一般に低い血清葉酸塩値
およびより少ない重度の神経学的関係について補正する
と、差はもはや有意ではなかった。舌炎をもつ患者は舌
の徴候または症候をもたない患者よりも高い血清メチル
マロン酸値を有した;しかしながら、舌炎をもち、73
人の患者の全体の群についてのメジアンよりも上のメチ
ルマロン酸の血清レベルを有する18人の患者のうち1
3人は、重度の神経学的関係、増大した血清葉酸塩値、
または両者を有した。
負の相関関係が存在した(r=−0.30;P<0.0
5)。しかしながら、より重度の神経学的異常をもつ患
者(群3および4)を分析から除外した場合(r=−
0.26;P>0.05)あるいは増大した血清メチル
マロン酸をもつ患者を分析から除外した場合(r=−
0.23;P>0.05)、コバラミンはもはや有意で
なかった。悪性の貧血を有する患者はマン−ウィトニイ
(Mann-Whitney) 試験〔Steel, supra〕を用いると、熱
帯性スプルーを有する患者(714±1007、P<
0.004)よりも高い血清メチルマロン酸値(平均、
2968±4387)を有した;しかしながら、熱帯性
スプルーを有する患者における一般に低い血清葉酸塩値
およびより少ない重度の神経学的関係について補正する
と、差はもはや有意ではなかった。舌炎をもつ患者は舌
の徴候または症候をもたない患者よりも高い血清メチル
マロン酸値を有した;しかしながら、舌炎をもち、73
人の患者の全体の群についてのメジアンよりも上のメチ
ルマロン酸の血清レベルを有する18人の患者のうち1
3人は、重度の神経学的関係、増大した血清葉酸塩値、
または両者を有した。
【0100】血清メチルマロン酸は血清Cblと相関関
係をもたなかった(すべての患者についてr=−0.0
9;微生物学的アッセイについてr=0.12;そして
放射線アッセイについてr=−0.09、各場合におい
てP>0.4)。血清メチルマロン酸は、次のものと有
意な相関関係をもたなかった:MCV(r=0.07、
P>0.05)、白血球(r=−0.08、P>0.
3)およびヘマトクリット(r=−0.12、P>0.
4)。正常ヘマトクリットを有する12人の患者のすべ
ては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有した(範
囲116〜4800ng/ml)。血清メチルマロン酸と年
令、性別、人種、症候の期間、体重損失の程度、あるい
は鉄、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、ビリルビンま
たはアルブミンの血清との間に相関関係は存在しなかっ
た。
係をもたなかった(すべての患者についてr=−0.0
9;微生物学的アッセイについてr=0.12;そして
放射線アッセイについてr=−0.09、各場合におい
てP>0.4)。血清メチルマロン酸は、次のものと有
意な相関関係をもたなかった:MCV(r=0.07、
P>0.05)、白血球(r=−0.08、P>0.
3)およびヘマトクリット(r=−0.12、P>0.
4)。正常ヘマトクリットを有する12人の患者のすべ
ては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有した(範
囲116〜4800ng/ml)。血清メチルマロン酸と年
令、性別、人種、症候の期間、体重損失の程度、あるい
は鉄、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、ビリルビンま
たはアルブミンの血清との間に相関関係は存在しなかっ
た。
【0101】Cbl欠乏を処置されない4人の患者(表
3および表4、 No.70〜73)は、正常の範囲内の血
清メチルマロン酸レベルを有した。3人は熱帯性スプル
ーを有した。4人のうち1人は、固有受容および振動の
感覚が傷害されており、神経学的症候をもたなかった。
これらの患者を増大した血清メチルマロン酸濃度をもつ
患者と区別する、臨床的または実験室の特徴は存在しな
かった。
3および表4、 No.70〜73)は、正常の範囲内の血
清メチルマロン酸レベルを有した。3人は熱帯性スプル
ーを有した。4人のうち1人は、固有受容および振動の
感覚が傷害されており、神経学的症候をもたなかった。
これらの患者を増大した血清メチルマロン酸濃度をもつ
患者と区別する、臨床的または実験室の特徴は存在しな
かった。
【0102】血清コハク酸についての値は、血清メチル
マロン酸を包含する研究したパラメーターのいずれとも
相関関係をもたず、そして有意差は種々の下位群のいず
れの間にも観察されなかった。図6は、診断の時から開
始し、非経口的Cbl処置後最初の13日にわたって続
けられた。古典的悪性貧血をもつ患者における、血清
(−・−)および尿(−−o−−)のメチルマロン酸の
順次のレベルを示す。患者は汎血球減少症、芽細胞の骨
髄腫の所見、43pg/mlの血清Cbl値、血清抗固有因
子遮断抗体、および外因性固有因子について補正した異
常シリングテストを有する32才の白色人種の男性であ
った。両者の値は処置前顕著に高く、処置後同様な速度
で減少し、そして第13日に正常の上限のちょうど上に
存在した。これが示唆するように、血清および尿のメチ
ルマロン酸の測定は、Cbl欠乏についての診断試験と
して互いに良好に相関関係をもつが、より大きい数の追
加の患者を研究しなければ、精確な結論を出すことはで
きないであろう。
マロン酸を包含する研究したパラメーターのいずれとも
相関関係をもたず、そして有意差は種々の下位群のいず
れの間にも観察されなかった。図6は、診断の時から開
始し、非経口的Cbl処置後最初の13日にわたって続
けられた。古典的悪性貧血をもつ患者における、血清
(−・−)および尿(−−o−−)のメチルマロン酸の
順次のレベルを示す。患者は汎血球減少症、芽細胞の骨
髄腫の所見、43pg/mlの血清Cbl値、血清抗固有因
子遮断抗体、および外因性固有因子について補正した異
常シリングテストを有する32才の白色人種の男性であ
った。両者の値は処置前顕著に高く、処置後同様な速度
で減少し、そして第13日に正常の上限のちょうど上に
存在した。これが示唆するように、血清および尿のメチ
ルマロン酸の測定は、Cbl欠乏についての診断試験と
して互いに良好に相関関係をもつが、より大きい数の追
加の患者を研究しなければ、精確な結論を出すことはで
きないであろう。
【0103】表5は、増大した血清メチルマロン酸が低
い血清Cblレベルに先行した、95才の白色人種の女
性に関するデータを含む。
い血清Cblレベルに先行した、95才の白色人種の女
性に関するデータを含む。
【0104】
【表5】
【0105】1982年9月において、彼女は無症候と
なったが、血清Cbl葉酸塩のアッセイの導く105と
いうMCVを有し、それは正常値を与えた。この血清を
ほぼ1年間貯蔵し、その間メチルマロン酸のアッセイが
開発されつつあり、そしてそれを最後に1983年8月
にアッセイしたとき、269ng/mlの増大した値が得ら
れた。1983年8月に、1982年8月の試料につい
て血清Cblおよび血清葉酸塩を再びアッセイすると、
これらは再び正常であり、そして抗固有因子遮断抗体を
アッセイし、そして前記抗体は存在することが発見され
た。1983年8月において、患者をクリニックに再び
呼び、ここで彼女のMCVは本質的に不変化であった。
血清メチルマロン酸レベルは、なお、338ng/mlで高
く、そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、
血清Cblレベルは、ここで、顕著に減少していた。C
blの注射後3週で、血清および尿のメチルマロン酸レ
ベルは正常範囲内に低下したが、1年後再検査したと
き、MCVは94であった。いずれの時も神経精神学的
症候は認められなかった。高い不飽和のCbl結合容量
はこの患者について証明できるように思われなかった。
なぜなら、彼女の白血球の数は決して(1982年9月
〜1983年中頃)高くならず、そして彼女の不飽和C
bl結合能力はCbl処置の直前(1983年8月23
日)において正常(2.1ng/ml)であったからであ
る。不都合なことには、Cbl結合容量は1982年9
月の血清について測定しなかった。
なったが、血清Cbl葉酸塩のアッセイの導く105と
いうMCVを有し、それは正常値を与えた。この血清を
ほぼ1年間貯蔵し、その間メチルマロン酸のアッセイが
開発されつつあり、そしてそれを最後に1983年8月
にアッセイしたとき、269ng/mlの増大した値が得ら
れた。1983年8月に、1982年8月の試料につい
て血清Cblおよび血清葉酸塩を再びアッセイすると、
これらは再び正常であり、そして抗固有因子遮断抗体を
アッセイし、そして前記抗体は存在することが発見され
た。1983年8月において、患者をクリニックに再び
呼び、ここで彼女のMCVは本質的に不変化であった。
血清メチルマロン酸レベルは、なお、338ng/mlで高
く、そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、
血清Cblレベルは、ここで、顕著に減少していた。C
blの注射後3週で、血清および尿のメチルマロン酸レ
ベルは正常範囲内に低下したが、1年後再検査したと
き、MCVは94であった。いずれの時も神経精神学的
症候は認められなかった。高い不飽和のCbl結合容量
はこの患者について証明できるように思われなかった。
なぜなら、彼女の白血球の数は決して(1982年9月
〜1983年中頃)高くならず、そして彼女の不飽和C
bl結合能力はCbl処置の直前(1983年8月23
日)において正常(2.1ng/ml)であったからであ
る。不都合なことには、Cbl結合容量は1982年9
月の血清について測定しなかった。
【0106】われわれの研究が立証するように、血清中
のメチルマロン酸のアッセイはCbl欠乏の患者におい
て有用な情報を提供する。臨床的に確証されたCbl欠
乏をもつ患者の73人のうち69人において、および血
液学的または神経学的異常に欠ける、Cbl欠乏につい
て頻繁に処置された群からの試料の15のうち7におい
て、血清メチルマロン酸レベルが増大していたという事
実は、その感度が血清Cblレベルのそれに類似しうる
ことを示唆していたが、血清Cblについて基線のおよ
び低い正常値をもつ患者の研究を実施した後、2つのア
ッセイの比較をしなくてはならないであろう。血清メチ
ルマロン酸の中程度の増大が低い血清Cblレベルの発
現に先行する患者をわれわれが観察したという事実は、
血清メチルマロン酸レベルが血清Cblレベルが先行し
ない、少なくともある患者においてCbl欠乏を正しく
検出できるであろうことを示唆する。こうして、血清メ
チルマロン酸のアッセイおよび血清Cblのアッセイは
互いに相補的であり、そして両者のアッセイは、いずれ
かを単独で用いて可能であるよりも、いっそう完全な方
法で、種々の患者の個体群におけるCbl欠乏の真の発
生を定めることを可能とするように思われる。Cbl欠
乏についての血清メチルマロン酸の特異性は、欠乏の臨
床的証拠をもたないか、あるいはCblのバランスに影
響を及ぼす潜在的条件の臨床的証拠をもたない患者にお
いて、しばしば低い血清Cbl値のそれよりも大きいこ
とを立証できる。また、Cblおよび葉酸塩の両者の血
清が正常値より低い、巨大赤芽球性貧血をもつ患者の評
価において、この試験は有用であることを証明できる。
のメチルマロン酸のアッセイはCbl欠乏の患者におい
て有用な情報を提供する。臨床的に確証されたCbl欠
乏をもつ患者の73人のうち69人において、および血
液学的または神経学的異常に欠ける、Cbl欠乏につい
て頻繁に処置された群からの試料の15のうち7におい
て、血清メチルマロン酸レベルが増大していたという事
実は、その感度が血清Cblレベルのそれに類似しうる
ことを示唆していたが、血清Cblについて基線のおよ
び低い正常値をもつ患者の研究を実施した後、2つのア
ッセイの比較をしなくてはならないであろう。血清メチ
ルマロン酸の中程度の増大が低い血清Cblレベルの発
現に先行する患者をわれわれが観察したという事実は、
血清メチルマロン酸レベルが血清Cblレベルが先行し
ない、少なくともある患者においてCbl欠乏を正しく
検出できるであろうことを示唆する。こうして、血清メ
チルマロン酸のアッセイおよび血清Cblのアッセイは
互いに相補的であり、そして両者のアッセイは、いずれ
かを単独で用いて可能であるよりも、いっそう完全な方
法で、種々の患者の個体群におけるCbl欠乏の真の発
生を定めることを可能とするように思われる。Cbl欠
乏についての血清メチルマロン酸の特異性は、欠乏の臨
床的証拠をもたないか、あるいはCblのバランスに影
響を及ぼす潜在的条件の臨床的証拠をもたない患者にお
いて、しばしば低い血清Cbl値のそれよりも大きいこ
とを立証できる。また、Cblおよび葉酸塩の両者の血
清が正常値より低い、巨大赤芽球性貧血をもつ患者の評
価において、この試験は有用であることを証明できる。
【0107】血清メチルマロン酸のレベルは、血清Cb
lが共有しない1つの利点を有し、Cbl欠乏が疑われ
る患者をCblで処置し、そして血清メチルマロン酸レ
ベルの効果を観測できる。このような処置が血清メチル
マロン酸レベルを高い範囲から正常範囲から正常範囲に
低下する場合、これは、この報告において詳述した患者
の場合におけるように、患者がCbl欠乏であるとい
う、強い推定上の証拠である。この利点は血清Cblレ
ベルは共有しない。なぜなら、血清Cblレベルは、患
者がCbl欠乏であるか否かに無関係に、Cblの非経
口的注射後、本質的に常に高いかあるいは少なくとも正
常であるからである。
lが共有しない1つの利点を有し、Cbl欠乏が疑われ
る患者をCblで処置し、そして血清メチルマロン酸レ
ベルの効果を観測できる。このような処置が血清メチル
マロン酸レベルを高い範囲から正常範囲から正常範囲に
低下する場合、これは、この報告において詳述した患者
の場合におけるように、患者がCbl欠乏であるとい
う、強い推定上の証拠である。この利点は血清Cblレ
ベルは共有しない。なぜなら、血清Cblレベルは、患
者がCbl欠乏であるか否かに無関係に、Cblの非経
口的注射後、本質的に常に高いかあるいは少なくとも正
常であるからである。
【0108】正常の血清Cblレベルを有する16人の
葉酸塩の欠乏患者のうち5人において、緩和であるが、
有意に高い血清メチルマロン酸が観測された。5人の患
者のうち2人は肝腫および/または異常肝機能の試験を
受けており、そして3人は肝臓の病気の証拠をもたなか
った。尿メチルマロン酸の測定を含む研究は、また、葉
酸塩の欠乏を有する数人の患者におけるおだやかな増加
を示したが、これが、おだやかな同時にCblの欠乏に
よるか、あるいは他の未知の原因によるかどうかは、未
知である。最近の研究は、種々の組織中のCblの量が
両者のCbl依存性酵素を飽和するためには不十分であ
ることを示した。葉酸塩の欠乏において、メチオニンに
結合したCblの量を増加することによって、メチオニ
ンシンセターゼ活性のレベルを増大する試みは行なうこ
とが可能であり、その結果L−メチルマロニル−CoA
ムターゼに結合したCblの量は減少し、そしてこれは
順番にメチルマロン酸の患者形成を増大する(表1〜表
4参照)。
葉酸塩の欠乏患者のうち5人において、緩和であるが、
有意に高い血清メチルマロン酸が観測された。5人の患
者のうち2人は肝腫および/または異常肝機能の試験を
受けており、そして3人は肝臓の病気の証拠をもたなか
った。尿メチルマロン酸の測定を含む研究は、また、葉
酸塩の欠乏を有する数人の患者におけるおだやかな増加
を示したが、これが、おだやかな同時にCblの欠乏に
よるか、あるいは他の未知の原因によるかどうかは、未
知である。最近の研究は、種々の組織中のCblの量が
両者のCbl依存性酵素を飽和するためには不十分であ
ることを示した。葉酸塩の欠乏において、メチオニンに
結合したCblの量を増加することによって、メチオニ
ンシンセターゼ活性のレベルを増大する試みは行なうこ
とが可能であり、その結果L−メチルマロニル−CoA
ムターゼに結合したCblの量は減少し、そしてこれは
順番にメチルマロン酸の患者形成を増大する(表1〜表
4参照)。
【0109】血清メチルマロン酸は、Cbl欠乏患者の
群において血清Cblのレベルと相関関係をもたなかっ
た。Cblレベルと尿メチルマロン酸のレベルとの相関
関係は、前にある研究において観測されたが、他の研究
において観測されなかった。血清メチルマロン酸と血液
学的パラメーターのいずれかとの相関関係を発見できな
かったことは、血小板との弱い逆の関係を除外して、尿
メチルマロン酸のレベルを用いる研究と一致する。
群において血清Cblのレベルと相関関係をもたなかっ
た。Cblレベルと尿メチルマロン酸のレベルとの相関
関係は、前にある研究において観測されたが、他の研究
において観測されなかった。血清メチルマロン酸と血液
学的パラメーターのいずれかとの相関関係を発見できな
かったことは、血小板との弱い逆の関係を除外して、尿
メチルマロン酸のレベルを用いる研究と一致する。
【0110】神経学的異常を有する少数の患者を研究す
る従来の研究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相
関関係を発見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかっ
た。われわれ大きい系列の患者における血清メチルマロ
ン酸レベルと神経学的異常の存在との間の積極的の相関
関係は、興味あることである。なぜなら、Cbl欠乏に
おける神経学的異常の原因となる生物学的機構は、な
お、未知であるからであ。血清葉酸塩レベルと血清メチ
ルマロン酸レベルとの間の積極的の相関関係は、また、
尿メチルマロン酸レベルの研究において認められてきて
いなかった。この相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の
食事をする患者が、多分Cbl欠乏の診断を遅延させ
る、より少ない血液学的異常を有しうるという事実のた
めであろう。しかしながら、血清葉酸塩が血液学的パラ
メーターと積極的に相関関係をもたなかったという事実
は、これを本当らしくなくする。また、ある未知の代謝
または調節の関係は、L−メチルマロニル−CoAムタ
ーゼとメチオニンシンセターゼとの間に、それらの両者
が活性のためにCblを必要とするという事実に加え
て、存在することが可能である。
る従来の研究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相
関関係を発見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかっ
た。われわれ大きい系列の患者における血清メチルマロ
ン酸レベルと神経学的異常の存在との間の積極的の相関
関係は、興味あることである。なぜなら、Cbl欠乏に
おける神経学的異常の原因となる生物学的機構は、な
お、未知であるからであ。血清葉酸塩レベルと血清メチ
ルマロン酸レベルとの間の積極的の相関関係は、また、
尿メチルマロン酸レベルの研究において認められてきて
いなかった。この相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の
食事をする患者が、多分Cbl欠乏の診断を遅延させ
る、より少ない血液学的異常を有しうるという事実のた
めであろう。しかしながら、血清葉酸塩が血液学的パラ
メーターと積極的に相関関係をもたなかったという事実
は、これを本当らしくなくする。また、ある未知の代謝
または調節の関係は、L−メチルマロニル−CoAムタ
ーゼとメチオニンシンセターゼとの間に、それらの両者
が活性のためにCblを必要とするという事実に加え
て、存在することが可能である。
【0111】表1〜表4から明らかなように、コバラミ
ンの欠乏の患者の多くは貧血ではなく、あるいは適度に
貧血であり、大赤血球症でなく、あるいは適度に大赤血
球症であり、そして100pg/mlより著しく減少した血
清Cblレベルをもたなかった。これらの観測は、医学
分野における専門家の現在の信念および教示と一致し
(上を参照)、そして次の実施例の終りにおいて詳述す
る。
ンの欠乏の患者の多くは貧血ではなく、あるいは適度に
貧血であり、大赤血球症でなく、あるいは適度に大赤血
球症であり、そして100pg/mlより著しく減少した血
清Cblレベルをもたなかった。これらの観測は、医学
分野における専門家の現在の信念および教示と一致し
(上を参照)、そして次の実施例の終りにおいて詳述す
る。
【0112】実施例VIコバラミンの欠乏および葉酸塩の欠乏の診断および区別
における合計ホモシステイン単独のアッセイおよび組み
合わせたホモシステイン−メチルマロン酸のアッセイの
使用 確証されたCbl欠乏をもつ78人の患者および確証さ
れた葉酸塩の欠乏をもつ19人の患者からの血清を、実
施例Vに記載するように血清Cblおよび血清葉酸塩に
ついて、実施例IVに記載するように血清メチルマロン酸
について、および実施例 IIIに記載するようにして血清
メチオニン、血清システインおよび血清ホモシステイン
について試験した。結果を表6〜表10に記載する。
における合計ホモシステイン単独のアッセイおよび組み
合わせたホモシステイン−メチルマロン酸のアッセイの
使用 確証されたCbl欠乏をもつ78人の患者および確証さ
れた葉酸塩の欠乏をもつ19人の患者からの血清を、実
施例Vに記載するように血清Cblおよび血清葉酸塩に
ついて、実施例IVに記載するように血清メチルマロン酸
について、および実施例 IIIに記載するようにして血清
メチオニン、血清システインおよび血清ホモシステイン
について試験した。結果を表6〜表10に記載する。
【0113】
【表6】
【0114】
【表7】
【0115】
【表8】
【0116】
【表9】
【0117】
【表10】
【0118】表6〜表10における患者の全部ではない
が、あるものは表1〜表2にも示されている。血清ホモ
システインは、コバラミンの欠乏をもつ患者の77/7
8(99%)および葉酸塩の欠乏をもつ患者の18/1
9(95%)において増大していた(正常7〜22μモ
ル/1)。コバラミンの欠乏の患者において、血清メチ
ルマロン酸は74/78(95%)において増大した
(正常19/76pg/ml)。正常血清メチルマロン酸レ
ベルをもつコバラミンの欠乏患者の3人において、血清
合計ホモシステインは増大し(範囲34〜93μモル/
1)そして1人のみの患者は正常範囲の血清アセトニト
リルおよび血清合成ホモシステインの両者を有した。葉
酸塩の欠乏の患者において、5/19(26%)は血清
メチルマロン酸のおだやかな増加を示した(範囲92〜
195ng/ml)。血清メチオニンレベルはコバラミンま
たは葉酸塩の欠乏の診断において有用でなかった。なぜ
なら、わずかに2/78(3%)のコバラミンの欠乏患
者が低いレベルを有し、そして葉酸塩の欠乏患者は低い
レベルをもたなかったからである(正常範囲14〜44
μモル/1)。さらに、血清の合計システインレベルは
診断的に有用でなかった。なぜなら、わずかに6/78
(8%)のコバラミンの欠乏患者がおだやかな増加を有
し、そしてわずかに1/19(5%)の葉酸塩の欠乏患
者が増大した値を有したからである(正常範囲174〜
378μモル/1)。
が、あるものは表1〜表2にも示されている。血清ホモ
システインは、コバラミンの欠乏をもつ患者の77/7
8(99%)および葉酸塩の欠乏をもつ患者の18/1
9(95%)において増大していた(正常7〜22μモ
ル/1)。コバラミンの欠乏の患者において、血清メチ
ルマロン酸は74/78(95%)において増大した
(正常19/76pg/ml)。正常血清メチルマロン酸レ
ベルをもつコバラミンの欠乏患者の3人において、血清
合計ホモシステインは増大し(範囲34〜93μモル/
1)そして1人のみの患者は正常範囲の血清アセトニト
リルおよび血清合成ホモシステインの両者を有した。葉
酸塩の欠乏の患者において、5/19(26%)は血清
メチルマロン酸のおだやかな増加を示した(範囲92〜
195ng/ml)。血清メチオニンレベルはコバラミンま
たは葉酸塩の欠乏の診断において有用でなかった。なぜ
なら、わずかに2/78(3%)のコバラミンの欠乏患
者が低いレベルを有し、そして葉酸塩の欠乏患者は低い
レベルをもたなかったからである(正常範囲14〜44
μモル/1)。さらに、血清の合計システインレベルは
診断的に有用でなかった。なぜなら、わずかに6/78
(8%)のコバラミンの欠乏患者がおだやかな増加を有
し、そしてわずかに1/19(5%)の葉酸塩の欠乏患
者が増大した値を有したからである(正常範囲174〜
378μモル/1)。
【0119】表6〜表10から理解できるように、わず
かに32/78(41%)の患者は適度に重度の貧血を
有し(Hct<25%)、28/78(36%)は適度
の貧血を有し(25〜34%女性、25〜39%男
性)、そして18/78(23%)はまったく貧血では
なかった。わずかに45/78(58%)はMCVの顕
著な増大を有し(>110fl) 、24/78(31%)
はMCVの穏和な増大を有し(101〜110fl) 、そ
して9/78(11%)は正常のMCV(80〜100
fl) を有した。コバラミンの血清レベルは、わずかに4
8/78(62%)の患者において顕著に減少し(<1
00pg/ml)そして30/78(38%)の患者におい
てほんの適度に(100〜200pg/ml)減少した。こ
うして、コバラミンの欠乏において見出されるスペクト
ルは、従来信じられていたよりも非常に広く、そして診
断を実施するためには、適度に重度の貧血、顕著に低下
した血清コバラミンレベルおよび顕著に増大したMCV
の発見に頼ることはできない。しかしながら、これらの
患者において血清合計ホモシステインを単独で、あるい
は血清メチルマロン酸と組み合わせて測定することによ
って、コバラミンの欠乏がHct,MCVおよび血清コ
バラミンレベルにおいて適度な異常または異常の不存在
と関連性があるときでさえ、コバラミンの欠乏の診断を
確立することができる。他のアミノ酸、例えば、血清メ
チオニンまたは合計システインの測定は、血清メチオニ
ンがコバラミンの欠乏の患者において低いという早期の
教示〔参照、例えば、Parry, T.E., Brit.J.Haemat. 1
6::221 (1969)〕にかかわらず、コバラミンの欠乏にお
いて診断的に有用であることが示されなかった。
かに32/78(41%)の患者は適度に重度の貧血を
有し(Hct<25%)、28/78(36%)は適度
の貧血を有し(25〜34%女性、25〜39%男
性)、そして18/78(23%)はまったく貧血では
なかった。わずかに45/78(58%)はMCVの顕
著な増大を有し(>110fl) 、24/78(31%)
はMCVの穏和な増大を有し(101〜110fl) 、そ
して9/78(11%)は正常のMCV(80〜100
fl) を有した。コバラミンの血清レベルは、わずかに4
8/78(62%)の患者において顕著に減少し(<1
00pg/ml)そして30/78(38%)の患者におい
てほんの適度に(100〜200pg/ml)減少した。こ
うして、コバラミンの欠乏において見出されるスペクト
ルは、従来信じられていたよりも非常に広く、そして診
断を実施するためには、適度に重度の貧血、顕著に低下
した血清コバラミンレベルおよび顕著に増大したMCV
の発見に頼ることはできない。しかしながら、これらの
患者において血清合計ホモシステインを単独で、あるい
は血清メチルマロン酸と組み合わせて測定することによ
って、コバラミンの欠乏がHct,MCVおよび血清コ
バラミンレベルにおいて適度な異常または異常の不存在
と関連性があるときでさえ、コバラミンの欠乏の診断を
確立することができる。他のアミノ酸、例えば、血清メ
チオニンまたは合計システインの測定は、血清メチオニ
ンがコバラミンの欠乏の患者において低いという早期の
教示〔参照、例えば、Parry, T.E., Brit.J.Haemat. 1
6::221 (1969)〕にかかわらず、コバラミンの欠乏にお
いて診断的に有用であることが示されなかった。
【0120】実施例 VIIホモシステインのアッセイまたは組合せたホモシステイ
ン−メチルマロン酸のアッセイを用いる、神経学的異常
および穏和の血液学的異常をもつかもたない患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断の確証 神経学的異常は、しばしば、Cbl欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまったく存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。
この考えを試験するために、われわれは、CBLの欠乏
のために神経学的異常をもつ143人の連続した患者を
再検討した。これらの患者のうち42人(29%)にお
いて、ヘマトクリット(35/42)またはMCV(2
6/42)であり、両者での試験(19/42)は正常
であることを、われわれは発見した。他の血液学的パラ
メーターは、測定すると、また、頻繁に正常であった:
WBC(42/42)、血小板(40/42)、LDH
(25/38)およびビリルビン(30/31)。これ
らの42人の患者において、神経学的異常は次のものを
包含した:末端感覚欠陥(35)、知覚異常(29)、
失調症(21)、記憶喪失(12)、性格の変化
(4)、痙攣性対不全麻痺(3)、幻覚(2)、糞便失
禁(2)、緩和(2)、視神経萎縮(1)および自殺
(1)。血清Cblレベル(正常=200〜1000pg
/mlは、次のようにかなり変化した:<50pg/ml
(6);50〜100pg/ml(19);100〜150
pg/ml(12);150〜200pg/ml(3);および
200〜250pg/ml(2)。Cbl欠乏の診断は、次
の1または2以上を立証することによって、すべての4
2人の患者において確証された:実施例IVの手順によっ
て測定して、>150ng/mlの血清メチルマロン酸(M
MA)の明瞭な増大、正常=18〜76ng/ml(36/
38);実施例 IIIの手順によって測定して、>30μ
モル/1の血清ホモシステイン(Hcys)の明瞭な増
大、正常=7〜22μモル/1(37/38);Cbl
処置後における血清MMA(28/28)および血清H
cys(27/28)の顕著な減少;MCVがCbl処
置前に増大しなかった、ほとんどの患者を含む、Cbl
処置(29/35)後のMCVの5fl以上の減少(13
/16);およびCbl処置(39/39)後の神経学
的異常の改良。
ン−メチルマロン酸のアッセイを用いる、神経学的異常
および穏和の血液学的異常をもつかもたない患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断の確証 神経学的異常は、しばしば、Cbl欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまったく存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。
この考えを試験するために、われわれは、CBLの欠乏
のために神経学的異常をもつ143人の連続した患者を
再検討した。これらの患者のうち42人(29%)にお
いて、ヘマトクリット(35/42)またはMCV(2
6/42)であり、両者での試験(19/42)は正常
であることを、われわれは発見した。他の血液学的パラ
メーターは、測定すると、また、頻繁に正常であった:
WBC(42/42)、血小板(40/42)、LDH
(25/38)およびビリルビン(30/31)。これ
らの42人の患者において、神経学的異常は次のものを
包含した:末端感覚欠陥(35)、知覚異常(29)、
失調症(21)、記憶喪失(12)、性格の変化
(4)、痙攣性対不全麻痺(3)、幻覚(2)、糞便失
禁(2)、緩和(2)、視神経萎縮(1)および自殺
(1)。血清Cblレベル(正常=200〜1000pg
/mlは、次のようにかなり変化した:<50pg/ml
(6);50〜100pg/ml(19);100〜150
pg/ml(12);150〜200pg/ml(3);および
200〜250pg/ml(2)。Cbl欠乏の診断は、次
の1または2以上を立証することによって、すべての4
2人の患者において確証された:実施例IVの手順によっ
て測定して、>150ng/mlの血清メチルマロン酸(M
MA)の明瞭な増大、正常=18〜76ng/ml(36/
38);実施例 IIIの手順によって測定して、>30μ
モル/1の血清ホモシステイン(Hcys)の明瞭な増
大、正常=7〜22μモル/1(37/38);Cbl
処置後における血清MMA(28/28)および血清H
cys(27/28)の顕著な減少;MCVがCbl処
置前に増大しなかった、ほとんどの患者を含む、Cbl
処置(29/35)後のMCVの5fl以上の減少(13
/16);およびCbl処置(39/39)後の神経学
的異常の改良。
【0121】上から理解できるように、コバラミンの欠
乏による神経学的異常をもつ143人の連続的患者のう
ちわずかに108人(76%)のみが貧血を有し(Hc
t<35人の女性、<40人の男性)を有し、そして3
5/143(24%)はまったく貧血ではなかった。こ
れらの143人の患者のうち26人(18%)におい
て、MCVは正常であり、そして19/143(13
%)において、ヘマトクリットおよびMCVの両者共正
常であった。正常のヘマトクリット、正常のMCVまた
は両者を有した42人のサブセットにおいて、わずかに
5/42(12%)はMCVが顕著に増大しており(>
110fl)、11/42(26%)は適度に増大したM
CV(101〜110fl)を有し、そして26/42
(62%)は正常のMCV(80〜100fl)を有し
た。コバラミンの試料レベルはわずかに24/42(5
7%)の患者において顕著に減少しており(<100pg
/ml)、そして16/42(38%)においてわずかに
中程度に減少していた(100〜200pg/ml)。事
実、2/42(5%)の患者は事実正常の血清コバラミ
ンレベルを有した。こうして、コバラミンの欠乏から生
ずる神経学的異常がもつこれらの患者において、血液学
的異常のスペクトルは従来認識されていたよりも非常に
広く、そしてコバラミンの診断を実施するためには、適
度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラミンレベル
および顕著に増大したMCVの発見に頼ることはできな
い。しかしながら、これらの患者において血清合計ホモ
システインを単独で、あるいは血清メチルマロン酸と組
み合わせて測定することによって、コバラミンの欠乏が
Hct,MCVおよび血清コバラミンレベルにおいて適
度な異常のみをもつ患者においてコバラミンの欠乏の診
断を確立することができる。さらに、血清合計ホモシス
テインおよび血清メチルマロン酸の増大した値の低下を
監視することによって、コバラミンの欠乏の診断を確立
することができ、そしてコバラミンを使用する処置の応
答を監視することができる。
乏による神経学的異常をもつ143人の連続的患者のう
ちわずかに108人(76%)のみが貧血を有し(Hc
t<35人の女性、<40人の男性)を有し、そして3
5/143(24%)はまったく貧血ではなかった。こ
れらの143人の患者のうち26人(18%)におい
て、MCVは正常であり、そして19/143(13
%)において、ヘマトクリットおよびMCVの両者共正
常であった。正常のヘマトクリット、正常のMCVまた
は両者を有した42人のサブセットにおいて、わずかに
5/42(12%)はMCVが顕著に増大しており(>
110fl)、11/42(26%)は適度に増大したM
CV(101〜110fl)を有し、そして26/42
(62%)は正常のMCV(80〜100fl)を有し
た。コバラミンの試料レベルはわずかに24/42(5
7%)の患者において顕著に減少しており(<100pg
/ml)、そして16/42(38%)においてわずかに
中程度に減少していた(100〜200pg/ml)。事
実、2/42(5%)の患者は事実正常の血清コバラミ
ンレベルを有した。こうして、コバラミンの欠乏から生
ずる神経学的異常がもつこれらの患者において、血液学
的異常のスペクトルは従来認識されていたよりも非常に
広く、そしてコバラミンの診断を実施するためには、適
度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラミンレベル
および顕著に増大したMCVの発見に頼ることはできな
い。しかしながら、これらの患者において血清合計ホモ
システインを単独で、あるいは血清メチルマロン酸と組
み合わせて測定することによって、コバラミンの欠乏が
Hct,MCVおよび血清コバラミンレベルにおいて適
度な異常のみをもつ患者においてコバラミンの欠乏の診
断を確立することができる。さらに、血清合計ホモシス
テインおよび血清メチルマロン酸の増大した値の低下を
監視することによって、コバラミンの欠乏の診断を確立
することができ、そしてコバラミンを使用する処置の応
答を監視することができる。
【0122】われわれは、次のように結論する:1)C
bl欠乏による神経学的異常は、貧血または増大したM
CVの不存在下において普通に起こる;2)血清MMA
および血清Hcysの測定、血清MMA、血清Hcys
およびMCVにおけるCbl処置後の変化は、患者をC
blについて評価するとき有用である;3)説明されな
い神経学的異常をもつ患者のすべては、貧血、大赤血球
症、または他の血液学的異常が存在しないときでさえ、
Cbl欠乏について評価すべきである;そして4)処置
後の増大した血清合計ホモシステインまたは血清メチル
マロン酸の低下によって確証された、コバラミンの欠乏
に二次的である神経学的病気をもつ患者における、貧血
の不存在によって理解できるように、コバラミンの欠乏
の臨床的スペクトルは従来推測されているものよりも非
常に広い。
bl欠乏による神経学的異常は、貧血または増大したM
CVの不存在下において普通に起こる;2)血清MMA
および血清Hcysの測定、血清MMA、血清Hcys
およびMCVにおけるCbl処置後の変化は、患者をC
blについて評価するとき有用である;3)説明されな
い神経学的異常をもつ患者のすべては、貧血、大赤血球
症、または他の血液学的異常が存在しないときでさえ、
Cbl欠乏について評価すべきである;そして4)処置
後の増大した血清合計ホモシステインまたは血清メチル
マロン酸の低下によって確証された、コバラミンの欠乏
に二次的である神経学的病気をもつ患者における、貧血
の不存在によって理解できるように、コバラミンの欠乏
の臨床的スペクトルは従来推測されているものよりも非
常に広い。
【0123】われわれは本発明の好ましい実施態様を例
示しかつ説明してきたが、本発明の変化および変更は可
能であり、それゆえ、上の記載した精確な用語に限定さ
れず、本発明を種々の用途および条件に適合させうる、
このような変化および変更は利用することができる。し
たがって、このような変化および変更は特許請求の範囲
に規定される同等なものの範囲に完全に入り、それゆ
え、特許請求の範囲に包含される。
示しかつ説明してきたが、本発明の変化および変更は可
能であり、それゆえ、上の記載した精確な用語に限定さ
れず、本発明を種々の用途および条件に適合させうる、
このような変化および変更は利用することができる。し
たがって、このような変化および変更は特許請求の範囲
に規定される同等なものの範囲に完全に入り、それゆ
え、特許請求の範囲に包含される。
【図1】ホモシステインモノマー、システインモノマ
ー、ホモシスチン、シスチン、ホモシステイン−2−メ
ルカプトエタノール、システイン−2−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体およびメチ
オニンの分子量を、それらのt−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
ー、ホモシスチン、シスチン、ホモシステイン−2−メ
ルカプトエタノール、システイン−2−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体およびメチ
オニンの分子量を、それらのt−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
【図2】(A)アミノ酸類を含有する混合物;(B)1
00μlのプールした正常ヒト血清;(C)100μl
の正常ラット血清;および(D)100μlの正常ヒト
尿から還元後に得られたアミノ酸類のt−ブチルジメチ
ルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
00μlのプールした正常ヒト血清;(C)100μl
の正常ラット血清;および(D)100μlの正常ヒト
尿から還元後に得られたアミノ酸類のt−ブチルジメチ
ルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
【図3】マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメチ
ルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグ
ルタル酸の分子量を、それらのt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
ルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグ
ルタル酸の分子量を、それらのt−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
【図4】(A)1μgの各酸を含有する混合物;(B)
500μlのプールした正常ヒト血清;(C)500μ
lの正常ラット血清;および(D)100μlの正常ヒ
ト尿から得られたジカルボン酸類のt−ブチルジメチル
シリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
500μlのプールした正常ヒト血清;(C)500μ
lの正常ラット血清;および(D)100μlの正常ヒ
ト尿から得られたジカルボン酸類のt−ブチルジメチル
シリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
【図5】種々のカテゴリーにおいて正常の被検者および
患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につい
て得られた値を示すグラフ。
患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につい
て得られた値を示すグラフ。
【図6】診断の時から開始し、非経口的Cbl処置後最
初の13日にわたって続けられた、古典的悪性貧血をも
つ患者における、血清(−・−)および尿(−−o−
−)のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフ。
初の13日にわたって続けられた、古典的悪性貧血をも
つ患者における、血清(−・−)および尿(−−o−
−)のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エイチ.アレン アメリカ合衆国,コロラド 80110,イ ングルウッド,サウス デクスター 4001 (72)発明者 サリー ピー.ステイブラー アメリカ合衆国,コロラド 80206,デ ンバー,ハリソン ストリート 1035 (72)発明者 ジョン リンデンバウム アメリカ合衆国,ニューヨーク 10023, ニューヨーク ウェスト エイティーフ ィフス ストリート 72
Claims (16)
- 【請求項1】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在について体液を測定することによって、温血動物中コ
バラミンまたは葉酸の欠乏を検出する方法。 - 【請求項2】 温血動物の体組織中の1種または2種以
上の異なるホモシステイン種の存在を測定する方法であ
って、工程: (a)温血動物の体組織を、測定すべきホモシステイン
種の各々の既知量を含む適当なマーカーで標識された内
部参照標準と一緒にし、 (b)存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの均質化を保証するために十分な
量の還元剤を添加し、 (c)存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの量を各種について質量分析計で
測定し、 (d)標識されたホモシステイン対標識されないホモシ
ステインの比を各種について計算し、そして (e)前記温血動物の体組織中の各種について存在する
標識されないホモシステインの量を誘導する、 を含む方法に従って増大レベルの合計のホモシステイン
の存在について体液を測定することによって、温血動物
中コバラミンまたは葉酸の欠乏を検出する請求項1記載
の方法。 - 【請求項3】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料をクロマトグラフ
ィーにかけることからなる請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料を高性能液体クロ
マトグラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオ
ール基に応答するようにセットされた電気化学的検出器
を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
からなる請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、試料中に存在するホモシステ
インを放射線標識したS−アデノシンおよび標識したS
−アデノシルホモシステインヒドラーゼに暴露すること
によってS−アデノシルホモシステインに転化し、そし
て前記標識したS−アデノシルホモシステインを適当な
検出手段によって定量することからなる請求項1記載の
方法。 - 【請求項6】 温血動物のコバラミンおよび/または葉
酸の欠乏を検出し、そしてそれらの間を区別する方法で
あって、体液を増大レベルの合計のホモシステインおよ
びメチルマロン酸の存在について測定することを含んで
なり、ここで合計のホモシステインの正常のレベルはコ
バラミンまたは葉酸の欠乏の不存在を示し、増大レベル
の合計のホモシステインおよびメチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を示し、そして合計のホモシステイン増大し
たレベルとメチルマロン酸の正常レベルとの組み合わせ
は葉酸の欠乏を示すことを特徴とする前記方法。 - 【請求項7】 温血動物のコバラミンおよび/または葉
酸の欠乏を検出し、そしてそれらの間を区別する方法で
あって、体液を増大レベルの合計のホモシステインおよ
びメチルマロン酸の存在について測定することを含んで
なり、ここで合計のホモシステインの測定は温血動物の
体組織中の1種または2種以上の異なるホモシステイン
種の存在を測定する方法であって、工程: (a)温血動物の体組織を、測定すべきホモシステイン
種の各々の既知量を含む適当なマーカーで標識された内
部参照標準と一緒にし、 (b)存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの均質化を保証するために十分な
量の還元剤を添加し、 (c)存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの量を各種について質量分析計で
測定し、 (d)標識されたホモシステイン対標識されないホモシ
ステインの比を各種について計算し、そして (e)前記温血動物の体組織中の各種について存在する
標識されないホモシステインの量を誘導する、 を含む方法に従い実施し、そして合計のホモシステイン
の正常のレベルはコバラミンまたは葉酸の欠乏の不存在
を示し、合計のホモシステインおよびメチルマロン酸の
増大したレベルはコバラミンの欠乏を示し、そして合計
のホモシステインの増大したレベルとメチルマロン酸の
正常レベルとの組み合わせは葉酸の欠乏を示すことを特
徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 増大レベルの合計のホモシステインの測
定は、体液の試料をクロマトグラフィーにかけることか
らなる請求項6記載の方法。 - 【請求項9】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料を高性能液体クロ
マトグラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオ
ール基に応答するようにセットされた電気化学的検出器
を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
からなる請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 増大レベルの合計のホモシステインの
存在についての前記測定は、試料中に存在するホモシス
テインを放射線標識したアデノシンおよびS−アデノシ
ルホモシステインヒドラーゼに暴露することによって標
識したS−アデノシルホモシステインに転化し、そして
前記標識したS−アデノシルホモシステインを適当な検
出手段によって定量することからなる請求項6記載の方
法。 - 【請求項11】 メチルマロン酸は、工程: (a)組織の試料を、安定なアイソトープのマーカーで
標識した既知量のメチルマロン酸からなる内部参照標準
と一緒にし、 (b)存在する標識されたメチルマロン酸および標識さ
れないメチルマロン酸の量を質量分析計で測定し、 (c)存在する標識されたメチルマロン酸対標識されな
いメチルマロン酸の比を計算し、そして (d)前記所定の試料中に存在する標識されないメチル
マロン酸の量を誘導する、 を含んでなる方法によって測定する請求項6記載の方
法。 - 【請求項12】 前記標識されたメチルマロン酸および
標識されないメチルマロン酸を工程(a)の後および工
程(b)の前に適当な誘導体に転化する請求項11記載
の方法。 - 【請求項13】 前記誘導体はシリル誘導体である請求
項12記載の方法。 - 【請求項14】 前記シリル誘導体は前記メチルマロン
酸をN−メチル−N−(t−ブチルジメチルシリル)ト
リフルオロ−アセトアミドに暴露することによって得ら
れる請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 工程(a)における前記内部参照標準
は既知量の変性したメチルマロン酸からなる請求項11
または12記載の方法。 - 【請求項16】 工程(a)の後および工程(b)の前
にメチルマロン酸を部分的に精製する追加の工程を含む
請求項14記載の方法。
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---|---|---|---|
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