JP2579434B2 - コバラミンおよび葉酸の欠乏を検出および区別する方法 - Google Patents
コバラミンおよび葉酸の欠乏を検出および区別する方法Info
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Description
【０００１】本発明に導いた研究は、米国政府からの許
可によって部分的に資金を提供された。本発明は、試料
中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を定量する方法、例
えば、温血動物からの体の組織の試料中の合計のホモシ
ステインの濃度を定量する方法、および前記温血動物が
コバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、またはそれらの両者を
有するかどうかを決定する方法に関する。
可によって部分的に資金を提供された。本発明は、試料
中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を定量する方法、例
えば、温血動物からの体の組織の試料中の合計のホモシ
ステインの濃度を定量する方法、および前記温血動物が
コバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、またはそれらの両者を
有するかどうかを決定する方法に関する。
【０００２】スルフヒドリルアミノ酸類は、次に示すよ
うな通路の複雑な組に従って代謝される。
うな通路の複雑な組に従って代謝される。
【０００３】
【化１】
【０００４】理解できるように、メチオニンシンセター
ゼによりホモシステインをメチル化してメチオニンを生
成することは、メチルコバラミン（Ｍｅ−Ｃｂｌ）、ま
た、メチル−Ｂ12としても知られている、を必要とす
る。メチル基はＮ5 −メチルテトラヒドロフォレート
（Ｎ5 −ＭＴＨＦ）によって共与され、後者はテトラヒ
ドロフォレート（ＴＨＦ）に転化される。メチルマロニ
ル−ＣｏＡムターゼを介するメチルマロニル−ＣｏＡの
スクシニル−ＣｏＡへの転化は、アデノシル−コバラミ
ン、またコファクターとして知られたアデノシル−
Ｂ12、を必要とする。こうしてコバラミンおよび葉酸は
スルフヒドリルの代謝において極めて重要なコファクタ
ーであるが、葉酸でなくコバラミンはメチルマロニル−
ＣｏＡの代謝において極めて重要なコファクターであ
る。
ゼによりホモシステインをメチル化してメチオニンを生
成することは、メチルコバラミン（Ｍｅ−Ｃｂｌ）、ま
た、メチル−Ｂ12としても知られている、を必要とす
る。メチル基はＮ5 −メチルテトラヒドロフォレート
（Ｎ5 −ＭＴＨＦ）によって共与され、後者はテトラヒ
ドロフォレート（ＴＨＦ）に転化される。メチルマロニ
ル−ＣｏＡムターゼを介するメチルマロニル−ＣｏＡの
スクシニル−ＣｏＡへの転化は、アデノシル−コバラミ
ン、またコファクターとして知られたアデノシル−
Ｂ12、を必要とする。こうしてコバラミンおよび葉酸は
スルフヒドリルの代謝において極めて重要なコファクタ
ーであるが、葉酸でなくコバラミンはメチルマロニル−
ＣｏＡの代謝において極めて重要なコファクターであ
る。
【０００５】温血動物におけるコバラミンおよび葉酸の
欠乏の精確な初期の診断は、これらの欠乏が、それぞ
れ、コバラミンまたは葉酸の処置によって完全に逆転す
る、生命に危険を及ぼす血液学的異常に導きうるので、
重要である。コバラミンの欠乏は、また、無能および生
命を脅かす神経精神病学的異常に導くことがあるので、
コバラミンの欠乏の精確な初期の診断はことに重要であ
る；外因性のコバラミンの投与は、常に、これらの異常
の進行を停止し、ほとんど常に症候の有意の改良に導
き、そして頻繁にそれらの完全な修正に導く。コバラミ
ンの欠乏および葉酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常
に導くので、それらの区別はしばしば困難である；適切
なビタミンの使用は血液学的異常を大きく改良し、そし
て、より重要なことには、コバラミンのみが、コバラミ
ンの欠乏においてのみ見られる、神経精神病学的異常を
補正するので、区別は重要である。コバラミンの欠乏を
処置するための葉酸の使用は極めて危険である。なぜな
ら、血液学的異常があるもの、あるいはすべては改良さ
れるが、血液学的異常は改良されず、進行することがあ
り、あるいは沈降することさえあるからである。
欠乏の精確な初期の診断は、これらの欠乏が、それぞ
れ、コバラミンまたは葉酸の処置によって完全に逆転す
る、生命に危険を及ぼす血液学的異常に導きうるので、
重要である。コバラミンの欠乏は、また、無能および生
命を脅かす神経精神病学的異常に導くことがあるので、
コバラミンの欠乏の精確な初期の診断はことに重要であ
る；外因性のコバラミンの投与は、常に、これらの異常
の進行を停止し、ほとんど常に症候の有意の改良に導
き、そして頻繁にそれらの完全な修正に導く。コバラミ
ンの欠乏および葉酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常
に導くので、それらの区別はしばしば困難である；適切
なビタミンの使用は血液学的異常を大きく改良し、そし
て、より重要なことには、コバラミンのみが、コバラミ
ンの欠乏においてのみ見られる、神経精神病学的異常を
補正するので、区別は重要である。コバラミンの欠乏を
処置するための葉酸の使用は極めて危険である。なぜな
ら、血液学的異常があるもの、あるいはすべては改良さ
れるが、血液学的異常は改良されず、進行することがあ
り、あるいは沈降することさえあるからである。
【０００６】先導医学教科書中の章および先導医学雑誌
中の論文が教示するように、コバラミンの欠乏は有意の
貧血（すなわち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの
減少）を有する個体（赤血球はマクロクリットである、
すなわち、平均細胞体積（ＭＣＶ）が一般に＞１００fl
である）において、あるいは末梢神経病および／または
失調症から成る神経学的異常を有する個体において、疑
いが持たれる。多くのこのような教科書の章または雑誌
の論文が、さらに、述べているように、貧血は典型的に
は重度であり、すなわち、ヘモグロビン≦８ｇ％、ヘマ
トクリット＜2５％であり、そして赤血球の大きさはレ
ベル＞１１０まで大きく増加する。〔参照、Babior, B.
M.およびH.F.Bunn, Harrison's Principles of Interna
l Medicine (R.G.Petersdorf, R.F.Adams, E.Braunwal
d, K.J.Isselbacher, J.B.MartinおよびJ.D.Wilson編)
(McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.1853−
1860；Lee, G.R. および H.J.Gardner, Textbook of Fa
mily Practice, 3rd E d.(R.E.Rakel編) (W.B.Saunders
& Co., Philadelphia, 1984), pp.1082−1091〕。
中の論文が教示するように、コバラミンの欠乏は有意の
貧血（すなわち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの
減少）を有する個体（赤血球はマクロクリットである、
すなわち、平均細胞体積（ＭＣＶ）が一般に＞１００fl
である）において、あるいは末梢神経病および／または
失調症から成る神経学的異常を有する個体において、疑
いが持たれる。多くのこのような教科書の章または雑誌
の論文が、さらに、述べているように、貧血は典型的に
は重度であり、すなわち、ヘモグロビン≦８ｇ％、ヘマ
トクリット＜2５％であり、そして赤血球の大きさはレ
ベル＞１１０まで大きく増加する。〔参照、Babior, B.
M.およびH.F.Bunn, Harrison's Principles of Interna
l Medicine (R.G.Petersdorf, R.F.Adams, E.Braunwal
d, K.J.Isselbacher, J.B.MartinおよびJ.D.Wilson編)
(McGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.1853−
1860；Lee, G.R. および H.J.Gardner, Textbook of Fa
mily Practice, 3rd E d.(R.E.Rakel編) (W.B.Saunders
& Co., Philadelphia, 1984), pp.1082−1091〕。
【０００７】いくつかの実験室の試験は、コバラミンの
欠乏または葉酸の欠乏を有する患者において異常な結果
を与えるとして報告された。このような試験は赤血球の
葉酸塩の測定〔Hoffbrand, A.V., et al., J.Clin.Pat
h. 19：17 (1986）〕および「ｄＵの抑制試験」〔Metz,
J., et al., Brit.J.Haem. 14 : 575 (1968)〕を含有
するが、いずれも広く利用されていない。２０年以上に
わたって知られているように、メチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を有する大抵の患者の尿中に増大した量で分
泌され、そしてこの異常は葉酸の欠乏を有するほんのわ
ずかの患者によってのみ証明される。コバラミンの欠乏
は、貧血の存在および程度、大赤血球症の存在および程
度、および低下した血清コバラミンレベルの存在に基づ
いて疑われかつ診断することができることが信じられか
つ教示されているので、メチルマロン酸はコバラミンの
欠乏が疑われている患者においてめったに測定されな
い。事実、医学の先導教科書および血液学の先導教科書
において、実際には、尿のメチルマロネートのアッセイ
はめったに必要ではないことが教示されている。〔Bec
k, W.S., Hematology, 3rd Ed. (W.J.Williams, E.Beut
ler, A.J.ErslevおよびM.A.Lichtman編) (McGraw-Hill
Book Co., New York, 1983), pp.434−465 ; Beck, W.
S., Cecil Textbook of Medicine, Vol.1 (J.B.Wyngaar
den およびL.H.Smith, Jr.編) (W.B.Saunders Co., Phi
ladelphia, 1985), pp.893−900 。〕１つの最近の雑誌
の論文は尿のメチルマロン酸の測定を事実支持している
〔Norman, E.J., O.J.Martelo およびM.D.Denton, Bloo
d 59 (6)：1128−1131 (1982) 〕が、この論文のデータ
を分析すると、２７人のコバラミンの欠乏の患者のうち
２６人は貧血であり、２７人の患者のうち２３人はＭＣ
Ｖが増大しており、そして血清コバラミンを標準の改良
された血清コバラミンアッセイで測定した１２人の患者
のうち１２人は１００pg／mlより低い値を有したことを
証明する。こうして、これらの患者は標準の診断手順に
従って皆コバラミンの欠乏であり、そして追加のアッセ
イは通常不必要であると判定されている。
欠乏または葉酸の欠乏を有する患者において異常な結果
を与えるとして報告された。このような試験は赤血球の
葉酸塩の測定〔Hoffbrand, A.V., et al., J.Clin.Pat
h. 19：17 (1986）〕および「ｄＵの抑制試験」〔Metz,
J., et al., Brit.J.Haem. 14 : 575 (1968)〕を含有
するが、いずれも広く利用されていない。２０年以上に
わたって知られているように、メチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を有する大抵の患者の尿中に増大した量で分
泌され、そしてこの異常は葉酸の欠乏を有するほんのわ
ずかの患者によってのみ証明される。コバラミンの欠乏
は、貧血の存在および程度、大赤血球症の存在および程
度、および低下した血清コバラミンレベルの存在に基づ
いて疑われかつ診断することができることが信じられか
つ教示されているので、メチルマロン酸はコバラミンの
欠乏が疑われている患者においてめったに測定されな
い。事実、医学の先導教科書および血液学の先導教科書
において、実際には、尿のメチルマロネートのアッセイ
はめったに必要ではないことが教示されている。〔Bec
k, W.S., Hematology, 3rd Ed. (W.J.Williams, E.Beut
ler, A.J.ErslevおよびM.A.Lichtman編) (McGraw-Hill
Book Co., New York, 1983), pp.434−465 ; Beck, W.
S., Cecil Textbook of Medicine, Vol.1 (J.B.Wyngaar
den およびL.H.Smith, Jr.編) (W.B.Saunders Co., Phi
ladelphia, 1985), pp.893−900 。〕１つの最近の雑誌
の論文は尿のメチルマロン酸の測定を事実支持している
〔Norman, E.J., O.J.Martelo およびM.D.Denton, Bloo
d 59 (6)：1128−1131 (1982) 〕が、この論文のデータ
を分析すると、２７人のコバラミンの欠乏の患者のうち
２６人は貧血であり、２７人の患者のうち２３人はＭＣ
Ｖが増大しており、そして血清コバラミンを標準の改良
された血清コバラミンアッセイで測定した１２人の患者
のうち１２人は１００pg／mlより低い値を有したことを
証明する。こうして、これらの患者は標準の診断手順に
従って皆コバラミンの欠乏であり、そして追加のアッセ
イは通常不必要であると判定されている。
【０００８】血清または血漿中のコバラミンおよび葉酸
塩についてのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
の欠乏を診断および区別するための、最も広く利用さ
れ、推奨されている試験である。血清コバラミンの正常
範囲が約２００〜９００pg／mlである、コバラミンの欠
乏の場合において、いく人かの先導著者らが述べている
ように、患者は血清コバラミンレベルが低いばかりでな
く、かつまたこれらの値は１００pg／mlより低いであろ
う。〔参照、例えば、 Babior, supra；Lee & Gardner,
supra；Beck, Textbook of Medicine, supra ; および
Beck, Hematology,supra〕。
塩についてのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
の欠乏を診断および区別するための、最も広く利用さ
れ、推奨されている試験である。血清コバラミンの正常
範囲が約２００〜９００pg／mlである、コバラミンの欠
乏の場合において、いく人かの先導著者らが述べている
ように、患者は血清コバラミンレベルが低いばかりでな
く、かつまたこれらの値は１００pg／mlより低いであろ
う。〔参照、例えば、 Babior, supra；Lee & Gardner,
supra；Beck, Textbook of Medicine, supra ; および
Beck, Hematology,supra〕。
【０００９】１９７８年において、コバラミン類自体が
ヒト血漿中に存在すること、およびその時使用する血清
コバラミンについてのラジオアイソトープの希釈アッセ
イが真のコバラミンに対して特異的でないので、それら
の存在はコバラミンの欠乏をマスクしうることが発見さ
れた。この問題は、コバラミンについてのラジオアイソ
トープの希釈アッセイにおいて結合性蛋白質として、純
粋なまたは精製された固有の因子の使用によって補正で
き、そしてこの修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質
を使用した１９７８年に存在したアッセイをほとんど完
全に置換した。参照、例えば、米国特許第４，１８８，
１８９号（Allen)、米国特許第４，３５１，８２２号
（Allen)、米国特許第４，４５１，５７１号（Allen)お
よびKolhouse, J.F., H.Kondo, N.C.Allen, E.Podellお
よび R.H.Allen, N.Eng.J.Med. 299: 785−792 (197
8)。これらの血清についての改良されたアッセイは、世
界を通じて数千の研究室において現在利用されており、
そしてコバラミンの欠乏を有する患者のすべて、あるい
はほとんどすべてについて低い値を与えるように見え
る。
ヒト血漿中に存在すること、およびその時使用する血清
コバラミンについてのラジオアイソトープの希釈アッセ
イが真のコバラミンに対して特異的でないので、それら
の存在はコバラミンの欠乏をマスクしうることが発見さ
れた。この問題は、コバラミンについてのラジオアイソ
トープの希釈アッセイにおいて結合性蛋白質として、純
粋なまたは精製された固有の因子の使用によって補正で
き、そしてこの修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質
を使用した１９７８年に存在したアッセイをほとんど完
全に置換した。参照、例えば、米国特許第４，１８８，
１８９号（Allen)、米国特許第４，３５１，８２２号
（Allen)、米国特許第４，４５１，５７１号（Allen)お
よびKolhouse, J.F., H.Kondo, N.C.Allen, E.Podellお
よび R.H.Allen, N.Eng.J.Med. 299: 785−792 (197
8)。これらの血清についての改良されたアッセイは、世
界を通じて数千の研究室において現在利用されており、
そしてコバラミンの欠乏を有する患者のすべて、あるい
はほとんどすべてについて低い値を与えるように見え
る。
【００１０】しかしながら、改良されたアッセイはコバ
ラミンの欠乏のなんらかの証拠に欠ける患者において、
しばしば低い値を与えるので、かなり批判されてきてい
る。これらの理由のため、この分野における専門家は、
コバラミンの欠乏を考慮すべきであること、そして前述
のように、コバラミンの欠乏をもつ患者に典型的である
血液学的および神経学的異常を有する患者においての
み、血清コバラミン値を得るべきであることを教示し
た。 Schillingおよび彼の共同研究者ら、コバラミンの
欠乏および実験室の診断の分野における専門家、は次の
ように述べた。
ラミンの欠乏のなんらかの証拠に欠ける患者において、
しばしば低い値を与えるので、かなり批判されてきてい
る。これらの理由のため、この分野における専門家は、
コバラミンの欠乏を考慮すべきであること、そして前述
のように、コバラミンの欠乏をもつ患者に典型的である
血液学的および神経学的異常を有する患者においての
み、血清コバラミン値を得るべきであることを教示し
た。 Schillingおよび彼の共同研究者ら、コバラミンの
欠乏および実験室の診断の分野における専門家、は次の
ように述べた。
【００１１】「われわれは、改良されたＢ12のアッセイ
キットが血清Ｂ12について臨床的に説明されない結果の
増大した比率を生成するであろうことを結論する。科学
的および経済的理由で、ビタミンＢ12の合理的な確率を
示唆する血液学的または神経学的発見を有する患者にお
いてのみ、血清ビタミンＢ12を測定することは、賢明で
あろうと思われる。貧血または老人医学の人口における
スクリーニングテストとして血清Ｂ12を測定すること
は、臨床的病気と相関関係をもたせることのできない、
低い値を高い比率で生ずるであろう。」：Schilling,
R.F., V.F.Fairbanks, R.Miller, K.Schmitt およびM.
J.Smith, Clin.Chem. 29 (3)：582, 583 (1983) 。
キットが血清Ｂ12について臨床的に説明されない結果の
増大した比率を生成するであろうことを結論する。科学
的および経済的理由で、ビタミンＢ12の合理的な確率を
示唆する血液学的または神経学的発見を有する患者にお
いてのみ、血清ビタミンＢ12を測定することは、賢明で
あろうと思われる。貧血または老人医学の人口における
スクリーニングテストとして血清Ｂ12を測定すること
は、臨床的病気と相関関係をもたせることのできない、
低い値を高い比率で生ずるであろう。」：Schilling,
R.F., V.F.Fairbanks, R.Miller, K.Schmitt およびM.
J.Smith, Clin.Chem. 29 (3)：582, 583 (1983) 。
【００１２】こうして、現在入手可能な広く利用されて
いるコバラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏で
はない患者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁
に提供することがある。このような発見は医者を困惑さ
せ、あるいは誤らせ、そして不必要な、経費を要する、
それ以上の試験を生ずることがある。こうして、この分
野において、一般に、教示されているように、コバラミ
ンの欠乏の臨床的スペクトルは比較的狭くかつ良好に限
界が定められており、そしてコバラミンの欠乏の可能性
は、現在血液学的または神経学的症候を有する患者、す
なわち、通常、適度に重度の大赤血球症を伴う適度に重
度の貧血を有する患者、および末梢の神経病および／ま
たは失調症を有する患者においてのみ考慮すべきであ
る。一般の人口あるいは適度の貧血、または適度の大赤
血球症、または他の神経精神学的異常をもつものの日常
のスクリーニングは高い数の誤った陽性の結果に導くで
あろう。
いるコバラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏で
はない患者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁
に提供することがある。このような発見は医者を困惑さ
せ、あるいは誤らせ、そして不必要な、経費を要する、
それ以上の試験を生ずることがある。こうして、この分
野において、一般に、教示されているように、コバラミ
ンの欠乏の臨床的スペクトルは比較的狭くかつ良好に限
界が定められており、そしてコバラミンの欠乏の可能性
は、現在血液学的または神経学的症候を有する患者、す
なわち、通常、適度に重度の大赤血球症を伴う適度に重
度の貧血を有する患者、および末梢の神経病および／ま
たは失調症を有する患者においてのみ考慮すべきであ
る。一般の人口あるいは適度の貧血、または適度の大赤
血球症、または他の神経精神学的異常をもつものの日常
のスクリーニングは高い数の誤った陽性の結果に導くで
あろう。
【００１３】今回、コバラミンの欠乏の臨床的スペクト
ルは従来認識されていたものよりも非常に広いこと、そ
して多くのコバラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あ
るいは適度にのみ貧血であること；多くの場合におい
て、それらの赤血球は大赤血球でないか、あるいは適度
にのみ大赤血球であること；多くの場合において、末梢
の神経病および失調症以外の種々の神経学的異常が存在
すること；多くの場合において、精製した固有の因子を
使用する上の改良されたアッセイを使用してさえ、血清
コバラミンレベルはわずかに減少するだけであり、そし
て実際には正常でありうることが発見された。したがっ
て、コバラミンの欠乏についての改良されたアッセイ、
好ましくはコバラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と区別可能
であるアッセイが要求されている。
ルは従来認識されていたものよりも非常に広いこと、そ
して多くのコバラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あ
るいは適度にのみ貧血であること；多くの場合におい
て、それらの赤血球は大赤血球でないか、あるいは適度
にのみ大赤血球であること；多くの場合において、末梢
の神経病および失調症以外の種々の神経学的異常が存在
すること；多くの場合において、精製した固有の因子を
使用する上の改良されたアッセイを使用してさえ、血清
コバラミンレベルはわずかに減少するだけであり、そし
て実際には正常でありうることが発見された。したがっ
て、コバラミンの欠乏についての改良されたアッセイ、
好ましくはコバラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と区別可能
であるアッセイが要求されている。
【００１４】今回、温血動物における合計のホモシステ
インの増大したレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の
欠乏の両者と相関関係があり；増大したレベルの合計の
ホモシステインを有する動物は一方または双方の欠乏を
有するようであるが、アッセイは２つの間の区別しない
ことが発見された。スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研
究において、正常のヒト血清は少量のホモシステイン−
システイン二量体および蛋白質結合ホモシステインを含
有することが示された。ホモシステインは正常試料にお
いて検出されなかったが、腎不全を有する患者において
少量で存在する。
インの増大したレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の
欠乏の両者と相関関係があり；増大したレベルの合計の
ホモシステインを有する動物は一方または双方の欠乏を
有するようであるが、アッセイは２つの間の区別しない
ことが発見された。スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研
究において、正常のヒト血清は少量のホモシステイン−
システイン二量体および蛋白質結合ホモシステインを含
有することが示された。ホモシステインは正常試料にお
いて検出されなかったが、腎不全を有する患者において
少量で存在する。
【００１５】従来知られているように、ホモシステイン
およびセリンをシスタチオニンに転化できない、シスタ
チオニンシンセターゼを遺伝的に欠く子供の血清および
尿の中に大量のホモシスチン（ホモシスティン）が存在
する。これらの患者は、また、血清中に存在するメチオ
ニンを増大した量を有する〔参照、例えば、Mudd, S.H.
およびH.L.Levy, The Metabolic Basis of Inherited D
isease, 5th Ed. (J.B.Stanbury およびWyngaarden, D.
S.Fredrickson, J.L.Goldsteinおよび M.S.Brown編) (M
cGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.522−559
。大量のホモシスチンは、また、メチオニンシンセタ
ーゼを含む遺伝欠陥を有するある子供、例えば、ホモシ
ステインおよびＮ5 −メチルテトラヒドロフォレート
を、それぞれ、メチオニンおよびテトラヒドロフォレー
トに転化できないある子供の血清および尿中に存在す
る。これらの患者は、血清中に低いレベルのメチオニン
を有する。これらの患者において、遺伝した欠陥の理由
は、１）５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートリ
ダクターゼの欠乏（Ｎ5 −メチルテトラヒドロフォレー
ト、メチオニンシンセターゼのための基質の１つの合成
の不能）；２）メチオニンシンセターゼのための必要な
コファクターであるメチル−コバラミンの合成の不能；
および３）メチオニンシンセターゼ自体における欠陥で
ある〔参照、例えばMudd, S.H., Heritable Disorders
of Amino Acid Metabolism：Patterns of Clinical Exp
ression and Genetic Variation, (W.L.Nyhan 編） (Jo
hn Wiley & Sons, New York, 1974), pp.429−451 〕。
他方において、ホモシスチンは、コバラミンを細胞へ輸
送する能力の遺伝欠陥（例えば、トランスコバラミンII
の欠乏）、またはコバラミンがリボソーム内に捕捉され
るようなコバラミンの細胞内輸送の遺伝欠陥による、メ
チオニンシンセターゼ能を含む遺伝欠陥を有する他の子
供の尿または血清中にはこれまで検出されていない。大
量のホモシステインまたはホモシスチンは、生命を脅か
すコバラミン欠乏を有する数人の子供の血清および尿中
に見出されている〔参照、例えば、Shipman, R.T., R.
R.W.TownleyおよびD.M.Dnaks, Lancet 1 (2): 693−694
(1969)；Frader, J., B.ReimanおよびD.Turkewitz, N.
Eng.J.Med. 299 : 1319 (1978); Mudd, S.H., Heritab
le Disorder, supra ; Mudd, S.H., Metabolic Basis,
supra；Hollowell, J.G., Jr., W.K.Hall, M.E.Coryel
l, J.McPhereson, Jr., D.A.Hahn, Lancet Dec. 27, 19
69, p.1428；Higgenbottom, M.C., L.SweetmanおよびW.
L.Nyhan, N.Eng.J.Med. 299 (7): 317−323 (1978)；Da
vis, J.R., J.Goldenring およびB.H.Lubin, Am.J.Dis.
Child. 135：566 (1981)；Hoey, H.J.C.Linnell, V.G.O
berholzer およびB.M.Laurance, J.Royal Soc.Med. 75
: 656 (1982)〕。生命を脅かすコバラミンの欠乏を有
する他の幼児において、尿および／または血清中のアミ
ノ酸は正常であることが発見され、そしてホモシスチン
は発見されず〔参照、例えば、Graesbeck, R.Bordin,
I.KanteroおよびB.Kuhlbaeck, Acta Medica Scandinavi
aca 167 (4)：289 (1960)；Lampkin, B.C. およびA.M.M
auer, Blood 30 (4): 495 (1967); Lambert, H.P., T.
A.J.PrankerdおよびJ.M.Smellie, Q.J.Med. 30 (117)：
71 (1961); Sievend, C.J., Ugesk.Laeter 125：174 (1
963)〕生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子供の尿中に
それは発見されなかった〔 Corbeel, L., G.Van den Be
rghe, J.Jaeken, J.van Tornout, N.R.Eeckles, Eur.J.
Ped. 143 : 284−290 (1985)〕。従来ホモシスティンは
中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有す
る子供の血清または尿中に報告されていず、生命を脅か
す、中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を
有する大人の血清または尿中にも従来報告されていな
い。
およびセリンをシスタチオニンに転化できない、シスタ
チオニンシンセターゼを遺伝的に欠く子供の血清および
尿の中に大量のホモシスチン（ホモシスティン）が存在
する。これらの患者は、また、血清中に存在するメチオ
ニンを増大した量を有する〔参照、例えば、Mudd, S.H.
およびH.L.Levy, The Metabolic Basis of Inherited D
isease, 5th Ed. (J.B.Stanbury およびWyngaarden, D.
S.Fredrickson, J.L.Goldsteinおよび M.S.Brown編) (M
cGraw-Hill Book Co., New York, 1983), pp.522−559
。大量のホモシスチンは、また、メチオニンシンセタ
ーゼを含む遺伝欠陥を有するある子供、例えば、ホモシ
ステインおよびＮ5 −メチルテトラヒドロフォレート
を、それぞれ、メチオニンおよびテトラヒドロフォレー
トに転化できないある子供の血清および尿中に存在す
る。これらの患者は、血清中に低いレベルのメチオニン
を有する。これらの患者において、遺伝した欠陥の理由
は、１）５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートリ
ダクターゼの欠乏（Ｎ5 −メチルテトラヒドロフォレー
ト、メチオニンシンセターゼのための基質の１つの合成
の不能）；２）メチオニンシンセターゼのための必要な
コファクターであるメチル−コバラミンの合成の不能；
および３）メチオニンシンセターゼ自体における欠陥で
ある〔参照、例えばMudd, S.H., Heritable Disorders
of Amino Acid Metabolism：Patterns of Clinical Exp
ression and Genetic Variation, (W.L.Nyhan 編） (Jo
hn Wiley & Sons, New York, 1974), pp.429−451 〕。
他方において、ホモシスチンは、コバラミンを細胞へ輸
送する能力の遺伝欠陥（例えば、トランスコバラミンII
の欠乏）、またはコバラミンがリボソーム内に捕捉され
るようなコバラミンの細胞内輸送の遺伝欠陥による、メ
チオニンシンセターゼ能を含む遺伝欠陥を有する他の子
供の尿または血清中にはこれまで検出されていない。大
量のホモシステインまたはホモシスチンは、生命を脅か
すコバラミン欠乏を有する数人の子供の血清および尿中
に見出されている〔参照、例えば、Shipman, R.T., R.
R.W.TownleyおよびD.M.Dnaks, Lancet 1 (2): 693−694
(1969)；Frader, J., B.ReimanおよびD.Turkewitz, N.
Eng.J.Med. 299 : 1319 (1978); Mudd, S.H., Heritab
le Disorder, supra ; Mudd, S.H., Metabolic Basis,
supra；Hollowell, J.G., Jr., W.K.Hall, M.E.Coryel
l, J.McPhereson, Jr., D.A.Hahn, Lancet Dec. 27, 19
69, p.1428；Higgenbottom, M.C., L.SweetmanおよびW.
L.Nyhan, N.Eng.J.Med. 299 (7): 317−323 (1978)；Da
vis, J.R., J.Goldenring およびB.H.Lubin, Am.J.Dis.
Child. 135：566 (1981)；Hoey, H.J.C.Linnell, V.G.O
berholzer およびB.M.Laurance, J.Royal Soc.Med. 75
: 656 (1982)〕。生命を脅かすコバラミンの欠乏を有
する他の幼児において、尿および／または血清中のアミ
ノ酸は正常であることが発見され、そしてホモシスチン
は発見されず〔参照、例えば、Graesbeck, R.Bordin,
I.KanteroおよびB.Kuhlbaeck, Acta Medica Scandinavi
aca 167 (4)：289 (1960)；Lampkin, B.C. およびA.M.M
auer, Blood 30 (4): 495 (1967); Lambert, H.P., T.
A.J.PrankerdおよびJ.M.Smellie, Q.J.Med. 30 (117)：
71 (1961); Sievend, C.J., Ugesk.Laeter 125：174 (1
963)〕生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子供の尿中に
それは発見されなかった〔 Corbeel, L., G.Van den Be
rghe, J.Jaeken, J.van Tornout, N.R.Eeckles, Eur.J.
Ped. 143 : 284−290 (1985)〕。従来ホモシスティンは
中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有す
る子供の血清または尿中に報告されていず、生命を脅か
す、中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を
有する大人の血清または尿中にも従来報告されていな
い。
【００１６】血清葉酸塩レベルは葉酸塩の欠乏をもつ多
くのアルコール患者において減少しないこと、および合
計のホモシステインの測定はこれらの患者の多くにおけ
る葉酸塩の欠乏の追加の、より精確な指示を提供するこ
とが、また、発見された。ホモシステインは葉酸塩の代
謝の遺伝的欠陥をもつある子供の尿および／または血清
において増大することが従来知られていた〔参照、例え
ば、Mudd, S.H., Heritable Disorder, supra ; Mudd,
S.H., Metabolic Basis, supra〕が、ホモシステインが
葉酸塩の欠乏をもつ子供または大人の尿または血清中に
おいて増大することは、従来、知られていなかった。
くのアルコール患者において減少しないこと、および合
計のホモシステインの測定はこれらの患者の多くにおけ
る葉酸塩の欠乏の追加の、より精確な指示を提供するこ
とが、また、発見された。ホモシステインは葉酸塩の代
謝の遺伝的欠陥をもつある子供の尿および／または血清
において増大することが従来知られていた〔参照、例え
ば、Mudd, S.H., Heritable Disorder, supra ; Mudd,
S.H., Metabolic Basis, supra〕が、ホモシステインが
葉酸塩の欠乏をもつ子供または大人の尿または血清中に
おいて増大することは、従来、知られていなかった。
【００１７】さらに、ある動物がコバラミンの欠乏、葉
酸の欠乏、両者を有するか、あるいはいずれももたない
かを、合計の組織のホモシステインおよびメチルマロン
酸のレベルを正常なレベルと比較する組み合わせのアッ
セイに基づいて決定することが可能であることが発見さ
れた。葉酸の欠乏およびコバラミンの欠乏の両者は増大
した合計のホモシステインのレベルを生ずるが、コバラ
ミンの欠乏は、また、メチルマロン酸のレベルを増大
し、これに対して葉酸の欠乏は増大しないであろう。メ
チルマロン酸はコバラミンの代謝またはコバラミンの輸
送の遺伝的欠陥を有する、多くの子供の血清および／ま
たは尿において、および変化する程度のコバラミンの欠
乏をもつ子供および大人の尿において増大することが、
従来、知られていた〔参照、例えば、Beck, W.S., Hema
tology, supra 〕。しかしながら、従来、ホモシステイ
ンのアッセイと組み合わせてメチルマロン酸のアッセイ
を使用して、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診断
および／または区別することは、知られていず、また示
唆されていない。今回、われわれは、この組み合わせた
アッセイは、変化する程度の貧血、大赤血球症、血清コ
バラミンのレベルの低下、および変化する種類の神経精
神学的異常をもつ患者におけるコバラミンの欠乏の診断
において、事実、きわめて有用であることを発見した。
酸の欠乏、両者を有するか、あるいはいずれももたない
かを、合計の組織のホモシステインおよびメチルマロン
酸のレベルを正常なレベルと比較する組み合わせのアッ
セイに基づいて決定することが可能であることが発見さ
れた。葉酸の欠乏およびコバラミンの欠乏の両者は増大
した合計のホモシステインのレベルを生ずるが、コバラ
ミンの欠乏は、また、メチルマロン酸のレベルを増大
し、これに対して葉酸の欠乏は増大しないであろう。メ
チルマロン酸はコバラミンの代謝またはコバラミンの輸
送の遺伝的欠陥を有する、多くの子供の血清および／ま
たは尿において、および変化する程度のコバラミンの欠
乏をもつ子供および大人の尿において増大することが、
従来、知られていた〔参照、例えば、Beck, W.S., Hema
tology, supra 〕。しかしながら、従来、ホモシステイ
ンのアッセイと組み合わせてメチルマロン酸のアッセイ
を使用して、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診断
および／または区別することは、知られていず、また示
唆されていない。今回、われわれは、この組み合わせた
アッセイは、変化する程度の貧血、大赤血球症、血清コ
バラミンのレベルの低下、および変化する種類の神経精
神学的異常をもつ患者におけるコバラミンの欠乏の診断
において、事実、きわめて有用であることを発見した。
【００１８】体の組織におけるホモシステインの増大し
たレベルは前記体の組織におけるコバラミンおよび／ま
たは葉酸の減少したレベルと相関関係をもつことが、発
見された。したがって、ホモシステインのアッセイを使
用して、温血動物におけるコバラミンおよび／または葉
酸の欠乏の存在または不存在を決定することができる。
この目的に対して適当なアッセイは、体の組織、好まし
くは体液、好ましくは尿または血液におけるホモシステ
インのレベルを決定できるアッセイを包含する。血清お
よび血漿はとくに好ましい。
たレベルは前記体の組織におけるコバラミンおよび／ま
たは葉酸の減少したレベルと相関関係をもつことが、発
見された。したがって、ホモシステインのアッセイを使
用して、温血動物におけるコバラミンおよび／または葉
酸の欠乏の存在または不存在を決定することができる。
この目的に対して適当なアッセイは、体の組織、好まし
くは体液、好ましくは尿または血液におけるホモシステ
インのレベルを決定できるアッセイを包含する。血清お
よび血漿はとくに好ましい。
【００１９】尿または血液中のホモシステインのレベル
の決定における使用に適当な、いくつかの異なる既知の
アッセイが存在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の
欠乏の検出に、いずれも使用されてきていない。参照、
例えば、Saetre, R.およびD.L.Rabenstein, Anal.Bioch
em. 90 : 684−692 (1978)、この文献は、尿中の減少し
た合計のシステイン、および血漿の蛋白質以外の分画中
の合計のシステインおよびホモシステインを測定して、
イオウの代謝のある種の先天的疾患、例えば、シスチン
（システィン）尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチ
ン尿症についてスクリーニングし、そしてそれらの処置
を監視する方法を記載している。この方法は、体液の試
料をチオール基に応答するようにセットされた化学的検
出器を有する高性能体クロマトグラフィーにかけ、そし
て結果を標準曲線と比較して、もとの試料中に存在する
標的化合物の量を決定することからなる。この手順にお
いて、標準は標的化合物と同時に混合するのではなく、
むしろ別々に実験する；こうして、標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
の決定における使用に適当な、いくつかの異なる既知の
アッセイが存在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の
欠乏の検出に、いずれも使用されてきていない。参照、
例えば、Saetre, R.およびD.L.Rabenstein, Anal.Bioch
em. 90 : 684−692 (1978)、この文献は、尿中の減少し
た合計のシステイン、および血漿の蛋白質以外の分画中
の合計のシステインおよびホモシステインを測定して、
イオウの代謝のある種の先天的疾患、例えば、シスチン
（システィン）尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチ
ン尿症についてスクリーニングし、そしてそれらの処置
を監視する方法を記載している。この方法は、体液の試
料をチオール基に応答するようにセットされた化学的検
出器を有する高性能体クロマトグラフィーにかけ、そし
て結果を標準曲線と比較して、もとの試料中に存在する
標的化合物の量を決定することからなる。この手順にお
いて、標準は標的化合物と同時に混合するのではなく、
むしろ別々に実験する；こうして、標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
【００２０】Refsum.H., S.HellandおよびP.M.Ueland,
Clin.Chem. 31 (4): 624−628 (1985)に記載されてい
る、他の適当な手順は、試料中に存在するホモシステイ
ンを、放射性標識したＳ−アデノシンおよびＳ−アデノ
シルホモシステインヒドラーゼに暴露することによっ
て、標識されたＳ−アデノシルホモシステインに転化
し、そして前記標識されたＳ−アデノシルホモシステイ
ンを適当な検出系によって定量することからなる。示唆
された用途は、悪性の病気の管理におけるホモシステイ
ンの代謝の監視、および抗葉酸塩薬物メトキシレートを
使用する処置の間における、遺伝的病気のホモシスチン
尿症の監視、および閉経期後の女性の血漿中の血清ホモ
システインの監視を包含する。この手順は、ホモシステ
インを監視して、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出ま
たは測定に決して使用されてきていない。再び、この手
順は内部標準を使用せず、こうして標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
Clin.Chem. 31 (4): 624−628 (1985)に記載されてい
る、他の適当な手順は、試料中に存在するホモシステイ
ンを、放射性標識したＳ−アデノシンおよびＳ−アデノ
シルホモシステインヒドラーゼに暴露することによっ
て、標識されたＳ−アデノシルホモシステインに転化
し、そして前記標識されたＳ−アデノシルホモシステイ
ンを適当な検出系によって定量することからなる。示唆
された用途は、悪性の病気の管理におけるホモシステイ
ンの代謝の監視、および抗葉酸塩薬物メトキシレートを
使用する処置の間における、遺伝的病気のホモシスチン
尿症の監視、および閉経期後の女性の血漿中の血清ホモ
システインの監視を包含する。この手順は、ホモシステ
インを監視して、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出ま
たは測定に決して使用されてきていない。再び、この手
順は内部標準を使用せず、こうして標的および標準の回
収を同等にすることを保証することは不可能である。
【００２１】血清または尿中のホモシステインのレベル
を測定する、非常に、いっそう感受性でありかつ精確な
手順は、合計のスルフヒドリルアミノ酸についての次の
新規なアッセイである。スルフヒドリルアミノ酸は、−
ＳＨ部分を含有するもの、例えば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −SH のホモシステイン（Ｈｃｙｓ）および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −SH のシステイン（Ｃｙｓ）である。スルフヒドリル化合物
は、ジサルファイド結合を介して化合して二量体、例え
ば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −(H2N)HC −COOH のシスティン、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −H2C −(H
2N)HC −COOH のホモシスティン、および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −(H2N)HC
−COOH のホモシステイン−システインを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
インおよびシステインの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフヒドリル基と複合体を形成する；組織から誘導され
た試料において、このような蛋白質の複合体は存在する
システインおよびホモシステインの大部分を結合するこ
とができる。合計のスルフヒドリルアミノ酸についての
アッセイは、これらのアミノ酸がこのような化合物を形
成する容易さによって複雑化される。還元は放出のため
および引続く蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセ
イのために要求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還
元後、新しいジサルファイドを有意な程度に再形成する
可能性があるように思われる。ジサルファイド結合の再
形成は、非常に変動することがあり、そして非スルフヒ
ドリル含有アミノ酸を内部標準として使用することによ
っては評価または補償されることができない。試料中の
合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、このよう
な二量体および複合体を考慮に入れなくてはならない。
を測定する、非常に、いっそう感受性でありかつ精確な
手順は、合計のスルフヒドリルアミノ酸についての次の
新規なアッセイである。スルフヒドリルアミノ酸は、−
ＳＨ部分を含有するもの、例えば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −SH のホモシステイン（Ｈｃｙｓ）および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −SH のシステイン（Ｃｙｓ）である。スルフヒドリル化合物
は、ジサルファイド結合を介して化合して二量体、例え
ば、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −(H2N)HC −COOH のシスティン、式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −H2C −(H
2N)HC −COOH のホモシスティン、および式 HOOC−CH(NH2) −CH2 −CH2 −Ｓ−Ｓ−H2C −(H2N)HC
−COOH のホモシステイン−システインを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
インおよびシステインの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフヒドリル基と複合体を形成する；組織から誘導され
た試料において、このような蛋白質の複合体は存在する
システインおよびホモシステインの大部分を結合するこ
とができる。合計のスルフヒドリルアミノ酸についての
アッセイは、これらのアミノ酸がこのような化合物を形
成する容易さによって複雑化される。還元は放出のため
および引続く蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセ
イのために要求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還
元後、新しいジサルファイドを有意な程度に再形成する
可能性があるように思われる。ジサルファイド結合の再
形成は、非常に変動することがあり、そして非スルフヒ
ドリル含有アミノ酸を内部標準として使用することによ
っては評価または補償されることができない。試料中の
合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、このよう
な二量体および複合体を考慮に入れなくてはならない。
【００２２】したがって、本発明は、所定の試料中の合
計のシステインおよび／または合計のホモシステインを
質量分析計を使用してアッセイする好ましい方法を提供
する。用語「合計のシステイン」および「合計のホモシ
ステイン」は、遊離の形態および複合化した形態の両者
で存在する、それぞれ、システインおよびホモシステイ
ンの合計量を意味する。便宜上、以下の説明は、例とし
て、ホモシステインを使用するが、同一の手順はシステ
インに同様にはたらく。内因性のホモシステインを含有
する所定の試料を、内因性のホモシステインの完全なラ
ンダム化を補償するために十分な量の還元剤と一緒に
し、そして合計のホモシステインを適当な手段によって
測定する。好ましくは、所定の試料をまず内部参照標準
と一緒にし、前記内部参照標準はホモシステインと同様
に挙動するが、安定なアイソトープのマーカーで標識さ
れた化合物の既知量からなる。内因性ホモシステインお
よび参照標準の完全な均質化を補償するために十分な量
の還元剤を添加し、そして存在するホモシステインおよ
び標識参照標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシ
ステインおよび参照標準がこの手順を通じて同一の相対
比で発生すると仮定すると、この比を質量分析計の読み
から計算し、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用
して、本来存在する内因性ホモシステインの合計量を計
算することができる。前述のように、同一の手順はシス
テインに対して有効である；また、ホモシステインおよ
びシステイン（または他のアミノ酸）の各々がそれ自体
の適当な内部参照標準を有するかぎり、それらについて
のアッセイを同時に実施することができる。
計のシステインおよび／または合計のホモシステインを
質量分析計を使用してアッセイする好ましい方法を提供
する。用語「合計のシステイン」および「合計のホモシ
ステイン」は、遊離の形態および複合化した形態の両者
で存在する、それぞれ、システインおよびホモシステイ
ンの合計量を意味する。便宜上、以下の説明は、例とし
て、ホモシステインを使用するが、同一の手順はシステ
インに同様にはたらく。内因性のホモシステインを含有
する所定の試料を、内因性のホモシステインの完全なラ
ンダム化を補償するために十分な量の還元剤と一緒に
し、そして合計のホモシステインを適当な手段によって
測定する。好ましくは、所定の試料をまず内部参照標準
と一緒にし、前記内部参照標準はホモシステインと同様
に挙動するが、安定なアイソトープのマーカーで標識さ
れた化合物の既知量からなる。内因性ホモシステインお
よび参照標準の完全な均質化を補償するために十分な量
の還元剤を添加し、そして存在するホモシステインおよ
び標識参照標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシ
ステインおよび参照標準がこの手順を通じて同一の相対
比で発生すると仮定すると、この比を質量分析計の読み
から計算し、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用
して、本来存在する内因性ホモシステインの合計量を計
算することができる。前述のように、同一の手順はシス
テインに対して有効である；また、ホモシステインおよ
びシステイン（または他のアミノ酸）の各々がそれ自体
の適当な内部参照標準を有するかぎり、それらについて
のアッセイを同時に実施することができる。
【００２３】内部参照標準は、この手順を通じて質量分
析計の分析まで内因性標的化合物と同一に挙動するが、
質量分析計の分析のもとで区別することができ、かつ別
々に測定できる、任意の化合物である。適当な内部参照
標準は、測定すべき標的アミノ酸の重水素化またはトリ
チウム化類似体、またはこのアッセイの目的に効果的に
同一であるために十分に標的アミノ酸に類似する重水素
化またはトリチウム化化合物、あるいはＣ13またはＮ15
または他の適当なアイソトープのマーカーを十分な量で
含有する標的アミノ酸の他の類似体である。こうして、
標識した参照化合物は、取扱いの間非標識標的と区別不
可能であるが、質量分析計の定量のために異なるかつ明
確なイオンを提供するであろう。このアッセイのための
好ましい化合物の例は、システィンの重水素化形態、例
えば、Ｄ，Ｌ−〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕システ
ィンおよび重水素化ホモシスティン、例えば、Ｄ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕
ホモシスティンである。内部標準として使用するために
適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・アンド・
ドーム (Merck Sharp & Dohme)から入手可能である。
析計の分析まで内因性標的化合物と同一に挙動するが、
質量分析計の分析のもとで区別することができ、かつ別
々に測定できる、任意の化合物である。適当な内部参照
標準は、測定すべき標的アミノ酸の重水素化またはトリ
チウム化類似体、またはこのアッセイの目的に効果的に
同一であるために十分に標的アミノ酸に類似する重水素
化またはトリチウム化化合物、あるいはＣ13またはＮ15
または他の適当なアイソトープのマーカーを十分な量で
含有する標的アミノ酸の他の類似体である。こうして、
標識した参照化合物は、取扱いの間非標識標的と区別不
可能であるが、質量分析計の定量のために異なるかつ明
確なイオンを提供するであろう。このアッセイのための
好ましい化合物の例は、システィンの重水素化形態、例
えば、Ｄ，Ｌ−〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕システ
ィンおよび重水素化ホモシスティン、例えば、Ｄ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕
ホモシスティンである。内部標準として使用するために
適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・アンド・
ドーム (Merck Sharp & Dohme)から入手可能である。
【００２４】定量は、測定した標的化合物対内部標準の
比が、最初の試料中の標的化合物の合計の未知量対添加
した内部標準の合計量の比と同じであるという仮定に基
づく。これは、標的および内部標準の両者についての同
一回収割合を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合に
おいて、回収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリル
アミノ酸が取ることのできる、種々の可能な形態、遊離
および複合化した形態に依存する。したがって、各アッ
セイについて、遊離な状態および各可能な複合化した状
態における標的および内部標準の相対比は、同一である
ことが非常に重要である；これは、標的および内部標準
の同一の相対百分率が失われる（および回収される）こ
とを保証する。そのため、本発明では均質化を行う。具
体的には、標的および内部標準の両者を含有する初期の
試料に還元剤を添加する；十分な還元化合物を添加して
ジサルファイド架橋のすべてを破壊し、こうしてスルフ
ヒドリルアミノ酸のすべてを遊離な状態にする。ジサル
ファイド架橋の再結合を防止する化合物、例えば、ヨー
ドアセテート、ヨードアセトアミド、またはヨードプロ
パンを添加して、スルフヒドリルアミノ酸のすべてが遊
離な状態にとどまるであろうことを保証することができ
る。標的および標準のスルフヒドリルアミノ酸が同一の
タイプおよび数のこのような複合化を形成するであろう
ことを仮定して、任意に化合物がジサルファイド架橋を
再形成し、こうして遊離の状態、各可能な複合化状態、
質量分析計によって測定される標的および内部標準の量
において、もとの試料中に存在したのと、同一の比で標
的および内部標準スルフヒドリルアミノ酸の量が存在す
ることができる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊
しないでジサルファイド結合を破壊できるもの、例え
ば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールお
よびホウ水素化ナトリウムである。
比が、最初の試料中の標的化合物の合計の未知量対添加
した内部標準の合計量の比と同じであるという仮定に基
づく。これは、標的および内部標準の両者についての同
一回収割合を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合に
おいて、回収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリル
アミノ酸が取ることのできる、種々の可能な形態、遊離
および複合化した形態に依存する。したがって、各アッ
セイについて、遊離な状態および各可能な複合化した状
態における標的および内部標準の相対比は、同一である
ことが非常に重要である；これは、標的および内部標準
の同一の相対百分率が失われる（および回収される）こ
とを保証する。そのため、本発明では均質化を行う。具
体的には、標的および内部標準の両者を含有する初期の
試料に還元剤を添加する；十分な還元化合物を添加して
ジサルファイド架橋のすべてを破壊し、こうしてスルフ
ヒドリルアミノ酸のすべてを遊離な状態にする。ジサル
ファイド架橋の再結合を防止する化合物、例えば、ヨー
ドアセテート、ヨードアセトアミド、またはヨードプロ
パンを添加して、スルフヒドリルアミノ酸のすべてが遊
離な状態にとどまるであろうことを保証することができ
る。標的および標準のスルフヒドリルアミノ酸が同一の
タイプおよび数のこのような複合化を形成するであろう
ことを仮定して、任意に化合物がジサルファイド架橋を
再形成し、こうして遊離の状態、各可能な複合化状態、
質量分析計によって測定される標的および内部標準の量
において、もとの試料中に存在したのと、同一の比で標
的および内部標準スルフヒドリルアミノ酸の量が存在す
ることができる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊
しないでジサルファイド結合を破壊できるもの、例え
ば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールお
よびホウ水素化ナトリウムである。
【００２５】必要に応じて、還元剤の添加の前または後
に、標的アミノ酸および内部標準を部分的に精製するこ
とが必要であるか、あるいは望ましいことがある。アミ
ノ酸の精製および分離のための既知の手段、例えば、濾
過、カラムクロマトグラフィー、陰イオンおよび／また
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグ
ラフィー、分子篩、などを使用できる。適当な分離およ
び精製技術を選択する方法、およびそれらを実施する手
段はこの分野において知られている。参照、例えば、La
badarios, D.,I.M.MoodieおよびG.S.Shephard, J.Chro
m. 310 : 223−231 (1984)およびその中の参考文献；Sh
ahroshi, F. およびC.W.Gehrke, J.Chrom. 36 : 31−41
(1968)。
に、標的アミノ酸および内部標準を部分的に精製するこ
とが必要であるか、あるいは望ましいことがある。アミ
ノ酸の精製および分離のための既知の手段、例えば、濾
過、カラムクロマトグラフィー、陰イオンおよび／また
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグ
ラフィー、分子篩、などを使用できる。適当な分離およ
び精製技術を選択する方法、およびそれらを実施する手
段はこの分野において知られている。参照、例えば、La
badarios, D.,I.M.MoodieおよびG.S.Shephard, J.Chro
m. 310 : 223−231 (1984)およびその中の参考文献；Sh
ahroshi, F. およびC.W.Gehrke, J.Chrom. 36 : 31−41
(1968)。
【００２６】必要に応じて、また、標的化合物および内
部標準を変性して、精製および／または分離を促進する
ために、ある種の特徴を変更または改良することが必要
であるか、あるいは望ましいことがある。この実施は誘
導体化としてこの分野においてよく知られている。例え
ば、標的および参照化合物を、改良された溶解性、異な
る電荷、増大した揮発性などを有する類似体に転化し
て、質量分析計の分析前の精製および／または分離を促
進することが望ましいことがある。参照、例えば、 Kna
pp, D.R., Handbook of Analytical Dervatatization R
eactions (John Wiley & Sons, New York, 1979)。好ま
しい手順は、標的および参照化合物をそれらのシリル誘
導体に転化して、ガスクロマトグラフィー／質量分析計
の装置の組み合わせによる分離および同定を促進するこ
とを包含する。この目的に対して化合物をシリル化する
手段および方法は、この分野において知られており、参
照、例えば、Knapp, supra；Bierman, C.J., C.M.Kinos
hita, J.A.Marlett およびR.D.Steele, J.Chrom. 375 :
330−334 (1986)。好ましい方法は、標的化合物を内部
参照と一緒にし、還元剤を添加してランダム化を実施
し、得られる遊離および複合化したスルフヒドリルアミ
ノ酸の混合物を部分的に精製し、生成物をアセトニトリ
ル中に溶解し、そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジ
メチルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加してシ
リル化を達成することを包含する。次いで、得られるシ
リル化スルフヒドリル標的化合物および参照化合物を濃
縮して、Ｇ
部標準を変性して、精製および／または分離を促進する
ために、ある種の特徴を変更または改良することが必要
であるか、あるいは望ましいことがある。この実施は誘
導体化としてこの分野においてよく知られている。例え
ば、標的および参照化合物を、改良された溶解性、異な
る電荷、増大した揮発性などを有する類似体に転化し
て、質量分析計の分析前の精製および／または分離を促
進することが望ましいことがある。参照、例えば、 Kna
pp, D.R., Handbook of Analytical Dervatatization R
eactions (John Wiley & Sons, New York, 1979)。好ま
しい手順は、標的および参照化合物をそれらのシリル誘
導体に転化して、ガスクロマトグラフィー／質量分析計
の装置の組み合わせによる分離および同定を促進するこ
とを包含する。この目的に対して化合物をシリル化する
手段および方法は、この分野において知られており、参
照、例えば、Knapp, supra；Bierman, C.J., C.M.Kinos
hita, J.A.Marlett およびR.D.Steele, J.Chrom. 375 :
330−334 (1986)。好ましい方法は、標的化合物を内部
参照と一緒にし、還元剤を添加してランダム化を実施
し、得られる遊離および複合化したスルフヒドリルアミ
ノ酸の混合物を部分的に精製し、生成物をアセトニトリ
ル中に溶解し、そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジ
メチルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加してシ
リル化を達成することを包含する。次いで、得られるシ
リル化スルフヒドリル標的化合物および参照化合物を濃
縮して、Ｇ
【００２７】Ｃ／質量分析計に注入する試料を準備す
る。血清についてのこの手順を使用すると、合計のホモ
システインについて１μモル／１の感度を達成すること
が可能であり、そしてアッセイは合計のホモシステイン
について１〜１０００μモル／１モルの範囲にわたって
直線である。ヒト血清におけるホモシステインの正常の
範囲は約７〜約２２μモル／１であり、そしてヒトの尿
において約１〜約２０μモル／１である。これらの範囲
より上のホモシステインのレベルはコバラミンの欠乏お
よび／または葉酸塩の欠乏を指示する；このレベルが高
いほど、指示はより強い。
る。血清についてのこの手順を使用すると、合計のホモ
システインについて１μモル／１の感度を達成すること
が可能であり、そしてアッセイは合計のホモシステイン
について１〜１０００μモル／１モルの範囲にわたって
直線である。ヒト血清におけるホモシステインの正常の
範囲は約７〜約２２μモル／１であり、そしてヒトの尿
において約１〜約２０μモル／１である。これらの範囲
より上のホモシステインのレベルはコバラミンの欠乏お
よび／または葉酸塩の欠乏を指示する；このレベルが高
いほど、指示はより強い。
【００２８】また、メチルマロン酸（ＭＭＡ）のレベル
について、ホモシステインのアッセイと同時に、あるい
はそれに引続いて、第２アッセイを実施することによ
り、コバラミンの欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが
可能であることが発見された。コバラミンの欠乏および
葉酸の欠乏の両者はホモシステインのレベルを上昇させ
るが、コバラミンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベル
を上昇させ、これに対して葉酸の欠乏は通常上昇させな
いであろう。ホモシステインのレベルは遺伝的欠陥のな
い個体において増大するとき、葉酸塩またはコバラミン
の少なくとも一方は欠乏する。ＭＭＡが、また、増大す
るとき、コバラミンは通常欠乏する。したがって、ホモ
システインおよびＭＭＡの両者が増大するとき、コバラ
ミンは欠乏する（そうでなければ、正常である）が、葉
酸塩が、また、欠乏するか否かは明らかでない（なぜな
ら、合計のホモシステインの増大への葉酸塩の欠乏の寄
与はコバラミンの欠乏の作用によってマスクされうるか
らである）。逆に、ホモシステインが高いが、ＭＭＡが
正常であるとき、増大したホモシステインは葉酸塩の欠
乏のためであるように思われる。なぜなら、コバラミン
の欠乏のためであった場合、ＭＭＡも通常高いであろう
からである。ある場合において、ＭＭＡレベルは、ホモ
システインのレベルが上昇しはじめる前にさえ、コバラ
ミンの欠乏のために増大すること、あるいはホモシステ
インは、ＭＭＡのレベルが上昇しはじめる前に、コバラ
ミンの欠乏のために増大することが、起こりうる。こう
して、このアッセイによって供給される情報は、これら
の欠乏の早期の適切な診断に関連して価値がある。
について、ホモシステインのアッセイと同時に、あるい
はそれに引続いて、第２アッセイを実施することによ
り、コバラミンの欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが
可能であることが発見された。コバラミンの欠乏および
葉酸の欠乏の両者はホモシステインのレベルを上昇させ
るが、コバラミンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベル
を上昇させ、これに対して葉酸の欠乏は通常上昇させな
いであろう。ホモシステインのレベルは遺伝的欠陥のな
い個体において増大するとき、葉酸塩またはコバラミン
の少なくとも一方は欠乏する。ＭＭＡが、また、増大す
るとき、コバラミンは通常欠乏する。したがって、ホモ
システインおよびＭＭＡの両者が増大するとき、コバラ
ミンは欠乏する（そうでなければ、正常である）が、葉
酸塩が、また、欠乏するか否かは明らかでない（なぜな
ら、合計のホモシステインの増大への葉酸塩の欠乏の寄
与はコバラミンの欠乏の作用によってマスクされうるか
らである）。逆に、ホモシステインが高いが、ＭＭＡが
正常であるとき、増大したホモシステインは葉酸塩の欠
乏のためであるように思われる。なぜなら、コバラミン
の欠乏のためであった場合、ＭＭＡも通常高いであろう
からである。ある場合において、ＭＭＡレベルは、ホモ
システインのレベルが上昇しはじめる前にさえ、コバラ
ミンの欠乏のために増大すること、あるいはホモシステ
インは、ＭＭＡのレベルが上昇しはじめる前に、コバラ
ミンの欠乏のために増大することが、起こりうる。こう
して、このアッセイによって供給される情報は、これら
の欠乏の早期の適切な診断に関連して価値がある。
【００２９】この組合わされたホモシステイン／ＭＭＡ
アッセイにおいて、ホモシステインのレベルは前述の手
段のいずれによっても適当にアッセイされる。本発明の
手順は好ましい。ＭＭＡは、例えば、次の文献に記載さ
れる方法によって適当にアッセイされる：Norman, E.
J., O.J.Martelo および M.D.Dento, Blood 59 (6)：11
28 (1982) またはMarcel, P.D., S.P.Stabler, E.R.Pod
ell およびR.H.Allen, Anal.Biochem. 150：58−66 (19
85) 。好ましくは、試料は内部参照標準と一緒にする。
この内部参照標準は、安定なアイソトープマーカー、好
ましくはＭＭＡの重水素化類似体で標識されたメチルマ
ロン酸の既知量からなる。次いで、存在する標識された
ＭＭＡおよび標識されないＭＭＡの量を質量分析計で測
定し、そしてもとの試料中のＭＭＡの量をはじめ添加し
た標識されたＭＭＡの既知量から計算する。ホモシステ
インの場合と同様に、標識したＭＭＡおよび標識されな
いＭＭＡを、質量分析計による分析前に、部分的精製お
よび／または誘導体化にかけることができる。好ましい
誘導体はシリル類似体である；Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−
ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドの類
似体はとくに好ましい。
アッセイにおいて、ホモシステインのレベルは前述の手
段のいずれによっても適当にアッセイされる。本発明の
手順は好ましい。ＭＭＡは、例えば、次の文献に記載さ
れる方法によって適当にアッセイされる：Norman, E.
J., O.J.Martelo および M.D.Dento, Blood 59 (6)：11
28 (1982) またはMarcel, P.D., S.P.Stabler, E.R.Pod
ell およびR.H.Allen, Anal.Biochem. 150：58−66 (19
85) 。好ましくは、試料は内部参照標準と一緒にする。
この内部参照標準は、安定なアイソトープマーカー、好
ましくはＭＭＡの重水素化類似体で標識されたメチルマ
ロン酸の既知量からなる。次いで、存在する標識された
ＭＭＡおよび標識されないＭＭＡの量を質量分析計で測
定し、そしてもとの試料中のＭＭＡの量をはじめ添加し
た標識されたＭＭＡの既知量から計算する。ホモシステ
インの場合と同様に、標識したＭＭＡおよび標識されな
いＭＭＡを、質量分析計による分析前に、部分的精製お
よび／または誘導体化にかけることができる。好ましい
誘導体はシリル類似体である；Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−
ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドの類
似体はとくに好ましい。
【００３０】また、１種または２種以上の非スルフヒド
リルアミノ酸、例えば、メチオニンをホモシステイン、
ＭＭＡ、または両者と同時に測定することが可能である
が、ただし適当な内部標準を含める。非スルフヒドリル
アミノ酸のための適当な内部標準は、ノルロイシンまた
は非スルフヒドリルアミノ酸の適当に標識された類似体
である。
リルアミノ酸、例えば、メチオニンをホモシステイン、
ＭＭＡ、または両者と同時に測定することが可能である
が、ただし適当な内部標準を含める。非スルフヒドリル
アミノ酸のための適当な内部標準は、ノルロイシンまた
は非スルフヒドリルアミノ酸の適当に標識された類似体
である。
【００３１】いったん葉酸塩の欠乏および／またはコバ
ラミンの欠乏が決定されると、処置の進行は処置の間ま
たは後に周期的にアッセイを反復することによって監視
することができる。場合に応じてコバラミンおよび／ま
たは葉酸塩の経口的または非経口的投与後における、血
清および／または尿中のホモシステインのレベルの低下
は、診断を確証することができる。
ラミンの欠乏が決定されると、処置の進行は処置の間ま
たは後に周期的にアッセイを反復することによって監視
することができる。場合に応じてコバラミンおよび／ま
たは葉酸塩の経口的または非経口的投与後における、血
清および／または尿中のホモシステインのレベルの低下
は、診断を確証することができる。
【００３２】本発明のそれ以上の理解は、以下の非制限
的実施例から得られるであろう。上において使用したよ
うに、そして以下において特記しないかぎり、すべての
温度および温度範囲はセ氏であり、そして周囲温度およ
び室温は約２０〜２５℃である。用語百分率または
（％）は重量％であり、そして用語モルはグラムモルで
ある。
的実施例から得られるであろう。上において使用したよ
うに、そして以下において特記しないかぎり、すべての
温度および温度範囲はセ氏であり、そして周囲温度およ
び室温は約２０〜２５℃である。用語百分率または
（％）は重量％であり、そして用語モルはグラムモルで
ある。
【００３３】実施例Ｉ種々の臨床的指数とコバラミンの欠乏との間の相関関係 ２４か月の期間（１９８３年９月〜１９８５年９月）に
わたって、われわれは７，７４７人の患者における血清
コバラミンのレベルを、２つのニューヨーク市の病院
（Columbia-Presbyterian Medical CenterおよびHarlem
Hospitial Center)の医師からのこの試験の要求に答え
て測定した。この群のうちで、３０１人の患者は２００
μモル／１より低い血清レベルを有し、このレベルは精
製した固有の因子を使用する「改良された」ラジオアッ
セイキット(BioRad Laboratories,Richmond, CA) の製
造業者が述べている正常の下限である。低いコバラミン
レベルをもつ患者のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏
しているかを決定するために、すべての患者を完全に研
究することを試みた。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的
（神経学的を包含する）評価、血液および骨髄の塗抹標
本、固有因子に対する抗体についてのシリング(Schilli
ng) テストおよび血清テストを得、次いでシアノ−コバ
ラミンによる処置の課程に対する患者の応答を観察し
た。
わたって、われわれは７，７４７人の患者における血清
コバラミンのレベルを、２つのニューヨーク市の病院
（Columbia-Presbyterian Medical CenterおよびHarlem
Hospitial Center)の医師からのこの試験の要求に答え
て測定した。この群のうちで、３０１人の患者は２００
μモル／１より低い血清レベルを有し、このレベルは精
製した固有の因子を使用する「改良された」ラジオアッ
セイキット(BioRad Laboratories,Richmond, CA) の製
造業者が述べている正常の下限である。低いコバラミン
レベルをもつ患者のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏
しているかを決定するために、すべての患者を完全に研
究することを試みた。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的
（神経学的を包含する）評価、血液および骨髄の塗抹標
本、固有因子に対する抗体についてのシリング(Schilli
ng) テストおよび血清テストを得、次いでシアノ−コバ
ラミンによる処置の課程に対する患者の応答を観察し
た。
【００３４】コバラミンの欠乏が３０１人の患者のうち
１３８人に存在するか否かに関して確固とした結論に到
達することができた。１３８人のうち７９人において、
臨床的症候群または血液学的症候群、または両者が存在
し、シアノ−コバラミン処置に対して明瞭に応答した。
これらの患者は欠乏であると考えた。これらの患者の臨
床的表示の分析は、ある数の驚くべき発見を示し、ここ
で多くはコバラミンの欠乏のための巨大赤芽球性貧血の
古典的特質を有さなかった。ヘマトクリットは３４人
（４３％）、患者のほぼ半分において正常（すなわち、
貧血は存在しない）であった。中程度に重度の貧血（Ｈ
ｃｔ＜２４％またはヘモグロビン＜８ｇ／dl）は７９人
の患者のうち１６人（すなわち１／５）において存在し
たのみであった。３６人の患者（４５．６％）におい
て、コバラミンの欠乏の起因させうる症候は存在しなか
った。白血球の数は８５％において正常であった；血小
板の数は７６％において正常であった；血清ビリルビン
は７４％において正常であった；そして血清ラクテート
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は４０％において正常であ
った。したがって、これらの実験室の発見は、巨大赤芽
球性貧血をもつ患者において典型的であると考えられ、
欠乏の群においてしばしば、または通常見失われてい
た。また、血清コバラミンは欠乏患者のうち２３人（す
なわち２９％）において＞１００pg／mlであり、血清コ
バラミンの低下の程度を、また、信頼性をもって使用し
て、ある患者が欠乏であるかどうかを精確に予測するこ
とができるであろうことが示された。増大したＭＣＶで
さえ、コバラミンの欠乏のそのような特性であると考え
られるが、欠乏患者のうち１５人（１９％）において見
られなかった。高いＭＣＶをもつ患者において、ＭＣＶ
の増大の程度はしばしばわずかであった：７９人の患者
のうち２８人（すなわち３５％）は１００〜１１０flの
範囲のＭＣＶを有した。こうして、わずかに３６人（す
なわち４６％）の患者は顕著に増大したＭＣＶ（＞１１
０fl）を有した。
１３８人に存在するか否かに関して確固とした結論に到
達することができた。１３８人のうち７９人において、
臨床的症候群または血液学的症候群、または両者が存在
し、シアノ−コバラミン処置に対して明瞭に応答した。
これらの患者は欠乏であると考えた。これらの患者の臨
床的表示の分析は、ある数の驚くべき発見を示し、ここ
で多くはコバラミンの欠乏のための巨大赤芽球性貧血の
古典的特質を有さなかった。ヘマトクリットは３４人
（４３％）、患者のほぼ半分において正常（すなわち、
貧血は存在しない）であった。中程度に重度の貧血（Ｈ
ｃｔ＜２４％またはヘモグロビン＜８ｇ／dl）は７９人
の患者のうち１６人（すなわち１／５）において存在し
たのみであった。３６人の患者（４５．６％）におい
て、コバラミンの欠乏の起因させうる症候は存在しなか
った。白血球の数は８５％において正常であった；血小
板の数は７６％において正常であった；血清ビリルビン
は７４％において正常であった；そして血清ラクテート
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は４０％において正常であ
った。したがって、これらの実験室の発見は、巨大赤芽
球性貧血をもつ患者において典型的であると考えられ、
欠乏の群においてしばしば、または通常見失われてい
た。また、血清コバラミンは欠乏患者のうち２３人（す
なわち２９％）において＞１００pg／mlであり、血清コ
バラミンの低下の程度を、また、信頼性をもって使用し
て、ある患者が欠乏であるかどうかを精確に予測するこ
とができるであろうことが示された。増大したＭＣＶで
さえ、コバラミンの欠乏のそのような特性であると考え
られるが、欠乏患者のうち１５人（１９％）において見
られなかった。高いＭＣＶをもつ患者において、ＭＣＶ
の増大の程度はしばしばわずかであった：７９人の患者
のうち２８人（すなわち３５％）は１００〜１１０flの
範囲のＭＣＶを有した。こうして、わずかに３６人（す
なわち４６％）の患者は顕著に増大したＭＣＶ（＞１１
０fl）を有した。
【００３５】確固とした結論に到達できた１３８人の患
者の中に、シアノ−コバラミンに対していかなる方法に
おいても明瞭に応答しない５９人の患者が存在した。こ
れらの患者は欠乏であると考えなかった。これらの欠乏
でない群において、６人（すなわち１０％）は１００pg
／mlより低い血清コバラミンを有し、ＭＣＶまたは血清
コバラミンの抑制の程度を患者がコバラミンに欠乏して
いるかどうかの信頼性ある指示として使用できないこと
がさらに示された。
者の中に、シアノ−コバラミンに対していかなる方法に
おいても明瞭に応答しない５９人の患者が存在した。こ
れらの患者は欠乏であると考えなかった。これらの欠乏
でない群において、６人（すなわち１０％）は１００pg
／mlより低い血清コバラミンを有し、ＭＣＶまたは血清
コバラミンの抑制の程度を患者がコバラミンに欠乏して
いるかどうかの信頼性ある指示として使用できないこと
がさらに示された。
【００３６】われわれは、実質的の数の欠乏患者がほん
のわずかに低い血清コバラミンレベル、すなわち、１０
０〜２００pg／mlの範囲とすることを発見した後、２０
０〜３００pg／ml（低い正常）の範囲の血清コバラミン
をもつ患者のすべてを再検討した。このようにして、わ
れわれは、＞２００pg／mlの血清コバラミンレベルを有
する、コバラミンが明瞭に欠乏した、いく人かの患者を
発見した。
のわずかに低い血清コバラミンレベル、すなわち、１０
０〜２００pg／mlの範囲とすることを発見した後、２０
０〜３００pg／ml（低い正常）の範囲の血清コバラミン
をもつ患者のすべてを再検討した。このようにして、わ
れわれは、＞２００pg／mlの血清コバラミンレベルを有
する、コバラミンが明瞭に欠乏した、いく人かの患者を
発見した。
【００３７】これらの発見により、われわれは、コバラ
ミンの欠乏をもつ多数の患者は、通常コバラミンの欠乏
において存在することが期待される「典型的な」臨床的
および血液学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在する
かどうかを確立することを促進する、新しい試験が明ら
かに必要であるという結論に到達した。次いで、７９人
の欠乏患者および５９人の非欠乏患者からの標本中のホ
モシステインおよびメチルマロン酸の血清レベルを測定
した。ホモシステインおよびメチルマロン酸の両者のレ
ベルは、７９人の患者のうち６０人（７６％）において
明瞭に増大していた（ホモシステイン、３０μモル以上
およびメチルマロン酸、１５０ng／ml以上）。ホモシス
テインレベルは７９人の患者のうち１０人（１３％）に
おいて明瞭に増大しており（メチルマロン酸レベルは明
瞭に増大しないで）、そしてメチルマロン酸レベルは７
９人の患者のうち４人（５％）において明瞭に増大して
いた（ホモシステインレベルは明瞭に増大しないで）。
７９人の欠乏患者の残りの５人（６％）において、いず
れの試験も明瞭に増大しなかった。
ミンの欠乏をもつ多数の患者は、通常コバラミンの欠乏
において存在することが期待される「典型的な」臨床的
および血液学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在する
かどうかを確立することを促進する、新しい試験が明ら
かに必要であるという結論に到達した。次いで、７９人
の欠乏患者および５９人の非欠乏患者からの標本中のホ
モシステインおよびメチルマロン酸の血清レベルを測定
した。ホモシステインおよびメチルマロン酸の両者のレ
ベルは、７９人の患者のうち６０人（７６％）において
明瞭に増大していた（ホモシステイン、３０μモル以上
およびメチルマロン酸、１５０ng／ml以上）。ホモシス
テインレベルは７９人の患者のうち１０人（１３％）に
おいて明瞭に増大しており（メチルマロン酸レベルは明
瞭に増大しないで）、そしてメチルマロン酸レベルは７
９人の患者のうち４人（５％）において明瞭に増大して
いた（ホモシステインレベルは明瞭に増大しないで）。
７９人の欠乏患者の残りの５人（６％）において、いず
れの試験も明瞭に増大しなかった。
【００３８】対照的に、５９人の欠乏でない患者におい
て、両者の試験は１人（２％）患者において明瞭に増大
した；ホモシステインのみは６人（１０％）において明
瞭に増大した；そしてメチルマロン酸レベルは９人（１
５％）において明瞭に増大した。残りの４３人（７３
％）の患者において、いずれの試験も明瞭に増大しなか
った。一方または双方の試験が明瞭に増大した、欠乏で
ない患者の小部分においてさえ、試験は診断的に有用で
あることを示した。一方または双方の試験が明瞭に増大
した１６人の患者のうち１１人は、コバラミンの吸収の
隠れた疾患、例えば、悪性の貧血、重度の萎縮性胃炎お
よび回腸の病気を有し、ある後の時においてコバラミン
の欠乏の潜在的原因を有することが証明された。このよ
うな患者は予防的シアノ−コバラミン処置を受ける必要
がある。１６人のうち追加の２人の患者は、血清ホモシ
ステインの増大を説明する隠れた葉酸の欠乏を有した。
て、両者の試験は１人（２％）患者において明瞭に増大
した；ホモシステインのみは６人（１０％）において明
瞭に増大した；そしてメチルマロン酸レベルは９人（１
５％）において明瞭に増大した。残りの４３人（７３
％）の患者において、いずれの試験も明瞭に増大しなか
った。一方または双方の試験が明瞭に増大した、欠乏で
ない患者の小部分においてさえ、試験は診断的に有用で
あることを示した。一方または双方の試験が明瞭に増大
した１６人の患者のうち１１人は、コバラミンの吸収の
隠れた疾患、例えば、悪性の貧血、重度の萎縮性胃炎お
よび回腸の病気を有し、ある後の時においてコバラミン
の欠乏の潜在的原因を有することが証明された。このよ
うな患者は予防的シアノ−コバラミン処置を受ける必要
がある。１６人のうち追加の２人の患者は、血清ホモシ
ステインの増大を説明する隠れた葉酸の欠乏を有した。
【００３９】これらの試験は、また、葉酸塩の欠乏の診
断において有用であると思われる。貧血をもつ連続的に
研究した１２０人のアルコールの患者において、骨髄を
検査した。３８人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨
大赤芽球性であった。コバラミンの欠乏を有する１人の
患者を分析から排除した後、残りの３７人の患者は葉酸
の欠乏を有する可能性が高度に大きいと考えられた。血
清葉酸塩濃度（葉酸塩の欠乏について最も広く使用され
ている診断）は３７人の患者のうち１５人（４１％）に
おいて低く、これに対して血清ホモシステインは３７人
の患者のうち２７人（７３％）において明瞭に増大して
いた。こうして、血清ホモシステインは血清葉酸塩濃度
よりも葉酸塩の欠乏の検出について感度のある試験であ
ることがわかった。赤血球の葉酸塩濃度（ＲＣＦ）を測
定した、巨大赤芽球性骨髄をもつ１５人の患者におい
て、ＲＣＦは１５人のうち１０人（６７％）において低
く、そして血清ホモシステインは１３人（８７％）にお
いて明瞭に増大していた。こうして、血清ホモシステイ
ンのアッセイは、また、赤血球葉酸塩アッセイよりも感
度が高かった。
断において有用であると思われる。貧血をもつ連続的に
研究した１２０人のアルコールの患者において、骨髄を
検査した。３８人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨
大赤芽球性であった。コバラミンの欠乏を有する１人の
患者を分析から排除した後、残りの３７人の患者は葉酸
の欠乏を有する可能性が高度に大きいと考えられた。血
清葉酸塩濃度（葉酸塩の欠乏について最も広く使用され
ている診断）は３７人の患者のうち１５人（４１％）に
おいて低く、これに対して血清ホモシステインは３７人
の患者のうち２７人（７３％）において明瞭に増大して
いた。こうして、血清ホモシステインは血清葉酸塩濃度
よりも葉酸塩の欠乏の検出について感度のある試験であ
ることがわかった。赤血球の葉酸塩濃度（ＲＣＦ）を測
定した、巨大赤芽球性骨髄をもつ１５人の患者におい
て、ＲＣＦは１５人のうち１０人（６７％）において低
く、そして血清ホモシステインは１３人（８７％）にお
いて明瞭に増大していた。こうして、血清ホモシステイ
ンのアッセイは、また、赤血球葉酸塩アッセイよりも感
度が高かった。
【００４０】実施例IIヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な好まし
い手順 ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、Ｄ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕
ホモシスティン〔これは、現在、Merck Sharp andDohme
Isotopes (Montreal, Canada) から入手可能である〕
と一緒にし、そしてよく混合する。
い手順 ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、Ｄ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕
ホモシスティン〔これは、現在、Merck Sharp andDohme
Isotopes (Montreal, Canada) から入手可能である〕
と一緒にし、そしてよく混合する。
【００４１】次いで、過剰の還元剤（例えば、２−メル
カプトエタノール、ジチオスレイトールまたはホウ水素
化ナトリウム）を添加して、すべてのホモシステインが
遊離の形態に確実に還元されるようにする。必要に応じ
て、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを
添加して、そうでなければ遊離のスルフヒドリル基に結
合しうる、金属イオンを除去することができる。この反
応混合物を菌株し、必要に応じて約２５〜約１５０℃に
約１分〜約６０分間加熱して、標識されたホモシステイ
ンおよび標識されないホモシステインのランダム化を確
実にする。
カプトエタノール、ジチオスレイトールまたはホウ水素
化ナトリウム）を添加して、すべてのホモシステインが
遊離の形態に確実に還元されるようにする。必要に応じ
て、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを
添加して、そうでなければ遊離のスルフヒドリル基に結
合しうる、金属イオンを除去することができる。この反
応混合物を菌株し、必要に応じて約２５〜約１５０℃に
約１分〜約６０分間加熱して、標識されたホモシステイ
ンおよび標識されないホモシステインのランダム化を確
実にする。
【００４２】次いで、蛋白質を、例えば、加熱変性、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により、あるい
は蛋白質を沈殿させる化合物、例えば、スルホサリチル
酸、ピクリン酸、硫酸アンモニウムなどを添加すること
によって除去する。得られる混合物を攪拌し、そして遠
心して蛋白質の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場
合、上澄みを酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例
えば、 BioRad ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（２００〜４００メッ
シュ）、水素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)
に添加して、負に帯電した塩類を除去する。次いで、ア
ミノ酸を溶離し、塩基性のpHに調節し、そして陰イオン
交換カラム、例えば、 BioRad ＡＧ１−Ｘ８（２００〜
４００メッシュ）、酢酸塩型に添加して、正に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、乾燥し、
そして小型の密閉可能なバイアル、好ましくはテフロン
でライニングした隔膜のふたをもつバイアルに移す。次
いで、アセトニトリル中のＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチ
ルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加
し、バイアルを密閉し、そして約２０〜約１５０℃にお
いて約５分間〜約１夜放置して、シリル化反応を完結さ
せる。好ましくは、バイアルは室温において１夜放置す
るか、あるいは約８０℃に約１時間加熱する。次いで、
過剰の誘導体化剤を、水（これは攪拌化剤を加水分解す
る）および揮発性溶媒の添加によって除去できる。この
混合物を遠心して乳濁液を透明にし、そして誘導体剤の
大部分を含有する非水性層を透明なバイアルに移し、そ
して例えば、窒素の下で、ほとんと蒸発乾固して体積を
減少させる。
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により、あるい
は蛋白質を沈殿させる化合物、例えば、スルホサリチル
酸、ピクリン酸、硫酸アンモニウムなどを添加すること
によって除去する。得られる混合物を攪拌し、そして遠
心して蛋白質の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場
合、上澄みを酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例
えば、 BioRad ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（２００〜４００メッ
シュ）、水素型(BioRad Laboratories, Richmond, CA)
に添加して、負に帯電した塩類を除去する。次いで、ア
ミノ酸を溶離し、塩基性のpHに調節し、そして陰イオン
交換カラム、例えば、 BioRad ＡＧ１−Ｘ８（２００〜
４００メッシュ）、酢酸塩型に添加して、正に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、乾燥し、
そして小型の密閉可能なバイアル、好ましくはテフロン
でライニングした隔膜のふたをもつバイアルに移す。次
いで、アセトニトリル中のＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチ
ルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加
し、バイアルを密閉し、そして約２０〜約１５０℃にお
いて約５分間〜約１夜放置して、シリル化反応を完結さ
せる。好ましくは、バイアルは室温において１夜放置す
るか、あるいは約８０℃に約１時間加熱する。次いで、
過剰の誘導体化剤を、水（これは攪拌化剤を加水分解す
る）および揮発性溶媒の添加によって除去できる。この
混合物を遠心して乳濁液を透明にし、そして誘導体剤の
大部分を含有する非水性層を透明なバイアルに移し、そ
して例えば、窒素の下で、ほとんと蒸発乾固して体積を
減少させる。
【００４３】次いで、得られる調製物をガスクロマトグ
ラフ／質量分析計上に注入し、この装置は約室温〜約３
５０℃の温度の注入口および約５〜約４５psi のカラム
ヘッドを有する。毛管のカラムを約２０〜約２５０℃に
おいて約１〜約１５分間運転する。その後温度を約７５
〜約３５０℃に約１〜約３０℃／分で上昇させる。ホモ
システインが溶離する精確な時間および温度は、既知量
のホモシステインを最初に展開することによって決定す
る。その後、試料を展開し、そして走査のモードで、あ
るいは好ましくは選択したイオンを監視するモードでデ
ータを集める。
ラフ／質量分析計上に注入し、この装置は約室温〜約３
５０℃の温度の注入口および約５〜約４５psi のカラム
ヘッドを有する。毛管のカラムを約２０〜約２５０℃に
おいて約１〜約１５分間運転する。その後温度を約７５
〜約３５０℃に約１〜約３０℃／分で上昇させる。ホモ
システインが溶離する精確な時間および温度は、既知量
のホモシステインを最初に展開することによって決定す
る。その後、試料を展開し、そして走査のモードで、あ
るいは好ましくは選択したイオンを監視するモードでデ
ータを集める。
【００４４】実施例 IIIヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な特異的
手順 Ｌ−ホモシステインおよびＬ−システインはシグマ・ケ
ミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.Louis,
MO) から購入し、そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドはピアース
・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Co.) (Rock
ford, IL) から入手した；Ｄ，Ｌ−〔３，３，３′，
３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスティン
（９８．４％）は、メルク・シャープ・アンド・ドーム
・アイソトープス (Merck Sharp andDohme Isotopes (M
ontreal, Canada) から入手した；そしてＤ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕システィン（９８％）
およびＬ−〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン（９８％）
は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ (Ca
mbridge Isotope Laboratories) (Woburn, MA) から購
入した。血液の試料は、通常健康な血液供与者からベレ
・ボノフィルス・ブラッド・バンク(Belle Bonfils Blo
od Bnk, Denver, CO) において血液共与時間に得た。連
続的血液の共与者は、次の年令群の各々において５人の
男性および５人の女性から試料が得られるように選択し
た：１８〜２６，２７〜３５，３６〜４５，４６〜５５
および５６〜６５（合計５０の試料）。試料は９a.m.お
よび１p.m.において得、室温において１〜４時間凝固さ
せ、１５００×ｇで３０分間遠心し、そして血清を取り
出し、そして−２０℃において貯蔵した。他の試料は実
験室の人員から得た。それらを室温において０〜２４時
間凝固させた後４℃において遠心するか、あるいはヘパ
リンまたはＥＤＴＡを添加し、室温において０〜２４時
間放置した後、血漿を４℃において遠心によって集め
た。スプレイグ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、
２５０−３５０ｇ、をＳＡＳＣＯ，インコーポレーテッ
ド(Omaha, NB) から入手し、そして血液をエーテル麻酔
の下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料
について前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。
手順 Ｌ−ホモシステインおよびＬ−システインはシグマ・ケ
ミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.) (St.Louis,
MO) から購入し、そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドはピアース
・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Co.) (Rock
ford, IL) から入手した；Ｄ，Ｌ−〔３，３，３′，
３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスティン
（９８．４％）は、メルク・シャープ・アンド・ドーム
・アイソトープス (Merck Sharp andDohme Isotopes (M
ontreal, Canada) から入手した；そしてＤ，Ｌ−
〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕システィン（９８％）
およびＬ−〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン（９８％）
は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ (Ca
mbridge Isotope Laboratories) (Woburn, MA) から購
入した。血液の試料は、通常健康な血液供与者からベレ
・ボノフィルス・ブラッド・バンク(Belle Bonfils Blo
od Bnk, Denver, CO) において血液共与時間に得た。連
続的血液の共与者は、次の年令群の各々において５人の
男性および５人の女性から試料が得られるように選択し
た：１８〜２６，２７〜３５，３６〜４５，４６〜５５
および５６〜６５（合計５０の試料）。試料は９a.m.お
よび１p.m.において得、室温において１〜４時間凝固さ
せ、１５００×ｇで３０分間遠心し、そして血清を取り
出し、そして−２０℃において貯蔵した。他の試料は実
験室の人員から得た。それらを室温において０〜２４時
間凝固させた後４℃において遠心するか、あるいはヘパ
リンまたはＥＤＴＡを添加し、室温において０〜２４時
間放置した後、血漿を４℃において遠心によって集め
た。スプレイグ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、
２５０−３５０ｇ、をＳＡＳＣＯ，インコーポレーテッ
ド(Omaha, NB) から入手し、そして血液をエーテル麻酔
の下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料
について前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。
【００４５】５ナノモルのＤ，Ｌ−〔３，３，３′，
３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスティン、
２５ナノモルのＤ，Ｌ−〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕システィンおよび１５ナノモルのＬ−〔メチル
−2 Ｈ3 〕メチオニンを含有するＨ2Ｏの５０μｌの体
積を１００μｌの血清に添加した。混合後、１５８μｇ
のＮａ2 ＥＤＴＡおよび１００μｌの２−メルカプトエ
タノールを含有するＨ2 Ｏの２．５mlを添加し、混合
し、そして１００℃において１５分間沸騰させた。室温
に冷却した後、２５μｇのスルホサリチル酸を含有する
Ｈ2 Ｏの１００μｌおよび６ＮのＨＣｌの２５μｌを添
加し、次いで混合し、そして１０００×ｇで１５分間遠
心した。次いで、上澄みを２００μｌの陽イオン交換樹
脂ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８（２００〜４００メッシュ）、水
素型（BioRad Laboratories, Richmond, CA)(これはＨ
2 Ｏ中で予備平衡化してある）を含有する使捨てカラム
に適用した。６mlのＨ2 Ｏで洗浄した後、アミノ酸を２
mlの８ＮのＮＨ4 ＯＨで溶離した。溶離液は、直接、２
００μｌの陰イオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８（１００〜２
００メッシュ）酢酸塩型（BioRad Laboratories, Richm
ond, CA) (これはＨ2 Ｏ中で予備平衡化してある）を含
有する使捨てカラムに適用した。９mlのＨ2 Ｏで洗浄し
た後、アミノ酸を２mlの０．１mlのＨＣｌで溶離し、そ
してスピードＶａｃカラム濃縮器（Savant Instrument
s, Inc., Hicksville, NY) で乾固した。次いで、乾燥
した試料を２５０μｌのＨ2 Ｏ中に溶解し、３００μｌ
のリアクチ (Reacti) バイアル(Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) に移し、そして真空濃縮装置で乾固し
た。
３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスティン、
２５ナノモルのＤ，Ｌ−〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕システィンおよび１５ナノモルのＬ−〔メチル
−2 Ｈ3 〕メチオニンを含有するＨ2Ｏの５０μｌの体
積を１００μｌの血清に添加した。混合後、１５８μｇ
のＮａ2 ＥＤＴＡおよび１００μｌの２−メルカプトエ
タノールを含有するＨ2 Ｏの２．５mlを添加し、混合
し、そして１００℃において１５分間沸騰させた。室温
に冷却した後、２５μｇのスルホサリチル酸を含有する
Ｈ2 Ｏの１００μｌおよび６ＮのＨＣｌの２５μｌを添
加し、次いで混合し、そして１０００×ｇで１５分間遠
心した。次いで、上澄みを２００μｌの陽イオン交換樹
脂ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８（２００〜４００メッシュ）、水
素型（BioRad Laboratories, Richmond, CA)(これはＨ
2 Ｏ中で予備平衡化してある）を含有する使捨てカラム
に適用した。６mlのＨ2 Ｏで洗浄した後、アミノ酸を２
mlの８ＮのＮＨ4 ＯＨで溶離した。溶離液は、直接、２
００μｌの陰イオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８（１００〜２
００メッシュ）酢酸塩型（BioRad Laboratories, Richm
ond, CA) (これはＨ2 Ｏ中で予備平衡化してある）を含
有する使捨てカラムに適用した。９mlのＨ2 Ｏで洗浄し
た後、アミノ酸を２mlの０．１mlのＨＣｌで溶離し、そ
してスピードＶａｃカラム濃縮器（Savant Instrument
s, Inc., Hicksville, NY) で乾固した。次いで、乾燥
した試料を２５０μｌのＨ2 Ｏ中に溶解し、３００μｌ
のリアクチ (Reacti) バイアル(Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) に移し、そして真空濃縮装置で乾固し
た。
【００４６】１０μｌのアセトニトリルおよび１０μｌ
のＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリ
フルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それらの
テフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そし
てそれらを室温（２２℃）で１夜放置するか、あるいは
それらを８０℃に１時間加熱することによって、アミノ
酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を調製した。１０
０μｌのヘキサンを添加し、１０秒間渦形成した後、２
０μｌのＨ2 Ｏを添加して、未反応の誘導体化剤を加水
分解した。さらに１０秒間渦形成した後、試料を１００
０×ｇで５分間遠心し、そして上のヘキサン層をデカン
テーションし、マイクロ遠心管に移し、そして窒素の流
れの適用によってほぼ１０μｌに乾燥した。完全な乾固
を回避するように注意した。なぜなら、これは誘導体の
主要な部分を失わせるからである。ほぼ２μｌの毛管カ
ラム上に落下する針の注入装置(falling-needle inject
or) で注入した。
のＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリ
フルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それらの
テフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そし
てそれらを室温（２２℃）で１夜放置するか、あるいは
それらを８０℃に１時間加熱することによって、アミノ
酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を調製した。１０
０μｌのヘキサンを添加し、１０秒間渦形成した後、２
０μｌのＨ2 Ｏを添加して、未反応の誘導体化剤を加水
分解した。さらに１０秒間渦形成した後、試料を１００
０×ｇで５分間遠心し、そして上のヘキサン層をデカン
テーションし、マイクロ遠心管に移し、そして窒素の流
れの適用によってほぼ１０μｌに乾燥した。完全な乾固
を回避するように注意した。なぜなら、これは誘導体の
主要な部分を失わせるからである。ほぼ２μｌの毛管カ
ラム上に落下する針の注入装置(falling-needle inject
or) で注入した。
【００４７】試料の分析はヘウレット−パッカード(Hew
lett-Packard) (Palo Alto, CA) ５９９２Ｂガスクロマ
トグラフィー質量分析計で実施し、そしてこの装置は９
８２５Ｂ計算器、９８７６Ａプリンターおよび分子噴射
分離器を装備した。注入口を変更して、落下する針の注
入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャリヤー
ガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分割は、
デュラボンド (Durabond）ＤＢ−１溶融シリカ毛管カラ
ム（３０ｍ×０．２５mm内径、０．２５μｍのフィルム
厚さ）〔Ｊ＆Ｗサイエンティフィック・インコーポレー
テッド（RanchoCordova, CA) から入手した〕で達成し
た。
lett-Packard) (Palo Alto, CA) ５９９２Ｂガスクロマ
トグラフィー質量分析計で実施し、そしてこの装置は９
８２５Ｂ計算器、９８７６Ａプリンターおよび分子噴射
分離器を装備した。注入口を変更して、落下する針の注
入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャリヤー
ガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分割は、
デュラボンド (Durabond）ＤＢ−１溶融シリカ毛管カラ
ム（３０ｍ×０．２５mm内径、０．２５μｍのフィルム
厚さ）〔Ｊ＆Ｗサイエンティフィック・インコーポレー
テッド（RanchoCordova, CA) から入手した〕で達成し
た。
【００４８】ガスクロマトグラフー質量分析計は、２５
０℃の注入口の温度および２６psiのカラムヘッドの圧
力で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを
１８０℃に平衡化し、そして試料注入後１分に８℃／分
で２７６℃に増加した。データを選択したイオン監視の
モードで４．８〜９．６分に集めた。次の〔Ｍ−５７〕
+ イオンを５０ミリ秒の滞留時間で各々について監視し
た：ホモシステインモノマー、ｍ／ｚ ４２０．２；
〔３，３，４，４−2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマー、
ｍ／ｚ ４２４．２；システインモノマー、ｍ／ｚ ４
０６．２；〔３，３−2 Ｈ2 〕システインモノマー、ｍ
／ｚ ４０８．２；メチオニン、ｍ／ｚ３２０．２；お
よび〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン、ｍ／ｚ ３２３．
２。合計のホモシステインは、ほぼ８．９分において溶
離されるｍ／ｚ ４２０．２ピークの積分した面積（精
確な時間は標準を使用して毎日決定した）を同一時間に
溶離したｍ／ｚ ４２４．２ピークの積分した面積で割
り、次いで各試料に添加した〔３，３，４，４−
2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマーの等しい量である１０
０μモル／１を掛けることによって定量した。合計のシ
ステインは、同一の方法で、ほぼ７．７分に溶離したｍ
／ｚ ４０６．２およびｍ／ｚ ４０８．２のピークを
利用し、そして試料に添加した〔３，３−2 Ｈ2 〕シス
テインモノマーの等しい量である、５００μモル／１を
それらの比に掛けることによって定量する。メチオニン
は、同一の方法で、ほぼ５．４分に溶離したｍ／ｚ ３
２０．２およびｍ／ｚ ３２３．２のピークを利用し、
そして試料に添加した〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニンの
量である、１５０μモル／１をそれらの比に掛けること
によって定量する。３つの内部標準についての積分した
面積、すなわち、それぞれ、約８．９、７．７および
５．４分に溶離するｍ／ｚ ４２４．２、混合物４０
８．２およびｍ／ｚ ３２３．２のピークは、天然に産
出するアイソトープの存在量の結果として、それらに寄
与される量について、合計のホモシステイン、内因性合
計のシステインおよび内因性メチオニンによって補正す
る。毎日の基準に基づいて富んでないホモシステイン、
システインおよびメチオニンを使用して決定した、これ
らの相関関係は次の通りであった：ｉ）８．９分におけ
るｍ／ｚ ４２０．２ピークの面積のほぼ１．５％は
８．９分におけるｍ／ｚ ４２４．２ピークとして存在
し、ii）７．７分におけるｍ／ｚ ４０６．２ピークの
面積のほぼ２１．４％は７．７分におけるｍ／ｚ ４０
８．２ピークとして存在し、そして５．４分におけるｍ
／ｚ ３２０．２ピークの面積のほぼ３．１％は５．４
分におけるｍ／ｚ ３２３．２ピークとして存在した。
０℃の注入口の温度および２６psiのカラムヘッドの圧
力で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを
１８０℃に平衡化し、そして試料注入後１分に８℃／分
で２７６℃に増加した。データを選択したイオン監視の
モードで４．８〜９．６分に集めた。次の〔Ｍ−５７〕
+ イオンを５０ミリ秒の滞留時間で各々について監視し
た：ホモシステインモノマー、ｍ／ｚ ４２０．２；
〔３，３，４，４−2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマー、
ｍ／ｚ ４２４．２；システインモノマー、ｍ／ｚ ４
０６．２；〔３，３−2 Ｈ2 〕システインモノマー、ｍ
／ｚ ４０８．２；メチオニン、ｍ／ｚ３２０．２；お
よび〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン、ｍ／ｚ ３２３．
２。合計のホモシステインは、ほぼ８．９分において溶
離されるｍ／ｚ ４２０．２ピークの積分した面積（精
確な時間は標準を使用して毎日決定した）を同一時間に
溶離したｍ／ｚ ４２４．２ピークの積分した面積で割
り、次いで各試料に添加した〔３，３，４，４−
2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマーの等しい量である１０
０μモル／１を掛けることによって定量した。合計のシ
ステインは、同一の方法で、ほぼ７．７分に溶離したｍ
／ｚ ４０６．２およびｍ／ｚ ４０８．２のピークを
利用し、そして試料に添加した〔３，３−2 Ｈ2 〕シス
テインモノマーの等しい量である、５００μモル／１を
それらの比に掛けることによって定量する。メチオニン
は、同一の方法で、ほぼ５．４分に溶離したｍ／ｚ ３
２０．２およびｍ／ｚ ３２３．２のピークを利用し、
そして試料に添加した〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニンの
量である、１５０μモル／１をそれらの比に掛けること
によって定量する。３つの内部標準についての積分した
面積、すなわち、それぞれ、約８．９、７．７および
５．４分に溶離するｍ／ｚ ４２４．２、混合物４０
８．２およびｍ／ｚ ３２３．２のピークは、天然に産
出するアイソトープの存在量の結果として、それらに寄
与される量について、合計のホモシステイン、内因性合
計のシステインおよび内因性メチオニンによって補正す
る。毎日の基準に基づいて富んでないホモシステイン、
システインおよびメチオニンを使用して決定した、これ
らの相関関係は次の通りであった：ｉ）８．９分におけ
るｍ／ｚ ４２０．２ピークの面積のほぼ１．５％は
８．９分におけるｍ／ｚ ４２４．２ピークとして存在
し、ii）７．７分におけるｍ／ｚ ４０６．２ピークの
面積のほぼ２１．４％は７．７分におけるｍ／ｚ ４０
８．２ピークとして存在し、そして５．４分におけるｍ
／ｚ ３２０．２ピークの面積のほぼ３．１％は５．４
分におけるｍ／ｚ ３２３．２ピークとして存在した。
【００４９】システイン−２−メルカプトエタノール、
ホモシステイン−２−メルカプトエタノール、システィ
ン、ホモシステイン−システイン二量体、およびホモシ
スティンを検出しかつ監視する実験において、実施時間
を２０分に延長し、そして最終温度を３３５℃に上昇さ
せた。システィンおよびホモシスティンについてのスペ
クトルは、２−メルカプトエタノールを使用する標準の
還元を用いないで、これらの化合物を直接誘導体化する
ことによって得た。システイン−２−メルカプトエタノ
ールおよびホモシステイン−２−メルカプトエタノール
についてのスペクトルは、それぞれ、システィンおよび
ホモシスティンから、これらの化合物を誘導体化前に２
−メルカプトエタノールで還元する実験において得た。
後者の技術を用いてホモシステイン−システイン二量体
についてスペクトルを得たが、ただしホモシスティンお
よびシスティンの等しい混合物を２−メルカプトエタノ
ールで還元し、次いで誘導体化した。アッセイの感度
は、例えば、ホモシステインモノマー対〔３，３，４，
４−2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマーの比を決定するこ
とによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載さ
れている直線性から変動する：Zinn, A.B., D.G.Hine,
M.J.Mahoney およびK.Tanaka, Pediatr, Res.16 : 740
−745 (1982)。
ホモシステイン−２−メルカプトエタノール、システィ
ン、ホモシステイン−システイン二量体、およびホモシ
スティンを検出しかつ監視する実験において、実施時間
を２０分に延長し、そして最終温度を３３５℃に上昇さ
せた。システィンおよびホモシスティンについてのスペ
クトルは、２−メルカプトエタノールを使用する標準の
還元を用いないで、これらの化合物を直接誘導体化する
ことによって得た。システイン−２−メルカプトエタノ
ールおよびホモシステイン−２−メルカプトエタノール
についてのスペクトルは、それぞれ、システィンおよび
ホモシスティンから、これらの化合物を誘導体化前に２
−メルカプトエタノールで還元する実験において得た。
後者の技術を用いてホモシステイン−システイン二量体
についてスペクトルを得たが、ただしホモシスティンお
よびシスティンの等しい混合物を２−メルカプトエタノ
ールで還元し、次いで誘導体化した。アッセイの感度
は、例えば、ホモシステインモノマー対〔３，３，４，
４−2 Ｈ4 〕ホモシステインモノマーの比を決定するこ
とによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載さ
れている直線性から変動する：Zinn, A.B., D.G.Hine,
M.J.Mahoney およびK.Tanaka, Pediatr, Res.16 : 740
−745 (1982)。
【００５０】合計ホモシステイン、メチオニンおよび合
計システインの尿からの清浄化は、合計ホモシステイン
について例示したように次の等式で決定した：合計ホモ
システイン／クレアチニンの清浄化比＝１００×〔尿の
合計ホモシステイン（μモル／１）／尿のクレアチニン
（μモル／１）／血清合計ホモシステイン（μモル／
１）／血清クレアチニン（μモル／１）〕この手順にお
いて利用する部分的試料の精製の長大な性質は必要であ
った。なぜなら、アミノ酸および他の有機化合物の複雑
な混合物が血清および尿の中に存在し、そして存在する
合計ホモシステインの濃度が比較的低かったからであ
る。既知量の〔メチル−14Ｃ〕メチオニンまたは〔Ｕ14
Ｃ〕システィンを血清および尿の試料に添加する実験
は、両者のアミノ酸からの放射能のほぼ７０％が最終の
ヘキサン溶液中に、長大な精製および誘導体化の手順の
終りに回収されたことを示した。同様な回収の研究は、
放射性標識したホモシスティンが商業的に入手できない
ので、ホモシスティンについて実施しなかった。
計システインの尿からの清浄化は、合計ホモシステイン
について例示したように次の等式で決定した：合計ホモ
システイン／クレアチニンの清浄化比＝１００×〔尿の
合計ホモシステイン（μモル／１）／尿のクレアチニン
（μモル／１）／血清合計ホモシステイン（μモル／
１）／血清クレアチニン（μモル／１）〕この手順にお
いて利用する部分的試料の精製の長大な性質は必要であ
った。なぜなら、アミノ酸および他の有機化合物の複雑
な混合物が血清および尿の中に存在し、そして存在する
合計ホモシステインの濃度が比較的低かったからであ
る。既知量の〔メチル−14Ｃ〕メチオニンまたは〔Ｕ14
Ｃ〕システィンを血清および尿の試料に添加する実験
は、両者のアミノ酸からの放射能のほぼ７０％が最終の
ヘキサン溶液中に、長大な精製および誘導体化の手順の
終りに回収されたことを示した。同様な回収の研究は、
放射性標識したホモシスティンが商業的に入手できない
ので、ホモシスティンについて実施しなかった。
【００５１】ホモシステインのｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の構造およびｍ／ｚ値を、断片化の位置および
〔Ｍ〕+ ，〔Ｍ−１５〕+ ，〔Ｍ−５７〕+ および〔Ｍ
−１５９〕+ における対応する断片のｍ／ｚ値のいくつ
かと一緒に下に示す：
ル誘導体の構造およびｍ／ｚ値を、断片化の位置および
〔Ｍ〕+ ，〔Ｍ−１５〕+ ，〔Ｍ−５７〕+ および〔Ｍ
−１５９〕+ における対応する断片のｍ／ｚ値のいくつ
かと一緒に下に示す：
【００５２】
【化２】
【００５３】ホモシステインのモノマー、システインの
モノマー、ホモシスティン、システィン、ホモシステイ
ン−２−メルカプトエタノール、システイン−２−メル
カプトエタノール、ホモシステイン−システイン二量
体、およびメチオニンの分子量を、図１にそれらのｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体の質量スペクトルと一緒に
示す。特定の誘導体の分子量は、各存在する−ＣＣＯ
Ｈ，−ＮＨ2 ，−ＳＨおよび−ＯＨ基に結合した各ｔ−
ブチルジメチルシリル基について、アミノ酸またはジサ
ルファイドの分子量＋１１４に等しい。ホモシステイン
のモノマー、システインのモノマー、ホモシステイン−
２−メルカプトエタノール、システイン−２−メルカプ
トエタノールおよびメチオニンの場合において、主要な
ピークは〔Ｍ−５７〕+ に存在した。ホモシスチン、シ
スチィンおよびホモシステイン−システイン二量体の場
合において、主要なピークは〔Ｍ／２〕+ に存在した。
〔Ｍ−５７〕+ ピークはホモシスチンでは観察されず、
そしてほんの小さい〔Ｍ−５７〕+ がシスティンおよび
ホモシステイン−システイン二量体について観察され
た。
モノマー、ホモシスティン、システィン、ホモシステイ
ン−２−メルカプトエタノール、システイン−２−メル
カプトエタノール、ホモシステイン−システイン二量
体、およびメチオニンの分子量を、図１にそれらのｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体の質量スペクトルと一緒に
示す。特定の誘導体の分子量は、各存在する−ＣＣＯ
Ｈ，−ＮＨ2 ，−ＳＨおよび−ＯＨ基に結合した各ｔ−
ブチルジメチルシリル基について、アミノ酸またはジサ
ルファイドの分子量＋１１４に等しい。ホモシステイン
のモノマー、システインのモノマー、ホモシステイン−
２−メルカプトエタノール、システイン−２−メルカプ
トエタノールおよびメチオニンの場合において、主要な
ピークは〔Ｍ−５７〕+ に存在した。ホモシスチン、シ
スチィンおよびホモシステイン−システイン二量体の場
合において、主要なピークは〔Ｍ／２〕+ に存在した。
〔Ｍ−５７〕+ ピークはホモシスチンでは観察されず、
そしてほんの小さい〔Ｍ−５７〕+ がシスティンおよび
ホモシステイン−システイン二量体について観察され
た。
【００５４】図２は、（Ａ）メチオニン、システインお
よびホモシステインを１：３：１で含有する混合物；
（Ｂ）１００μｌの正常ヒト血清；（Ｃ）１００μｌの
正常ヒト血清；（Ｄ）１００μｌの正常ヒト尿から還元
後に得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチルシリル誘
導体類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ酸は、
次の通りであった：メチオニン（ＭＥＴ）；システイン
のモノマー（ＣＹＳ）；ホモシステインのモノマー（Ｈ
ＣＹＳ）；〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン（Ｍｅｔ
＊）；〔３，３−2 Ｈ2 〕システインモノマー；および
〔３，３，４，４−2Ｈ4 〕ホモシステインモノマー
（ＨＣＹＳ＊）。ＭＥＴ＊，ＣＹＳ＊およびＨＣＹＳ＊
は試料Ａには添加せず、そしてそれらの表示を有するピ
ークは、天然に産出するアイソトープの存在量の結果と
して、それぞれ、ＭＥＴ，ＣＹＳおよびＨＣＹＳによっ
てそれらに寄与される量を表わす。かっこ内の数字は、
選択したイオンの監視によって走査したｍ／ｚについて
の値である。「Ｆ．Ｓ．」についての値は太いダッシュ
のトレースの全規模についての相対値である；細いダッ
シュのトレースは１０×の減衰である。内因性合計ホモ
システインについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤにつ
いて、それぞれ、１８．９、６．５および３．６μモル
／１であった。内因性合計システインについて決定した
値は、Ｂ，ＣおよびＤについて、それぞれ、３６９、１
７３および２３８μモル／１であった。内因性合計メチ
オニンについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ１６．８、６０．４および３．２μモル／
１であった。図２Ａは、毛管カラムがこれらの３種類の
アミノ酸を完全に分離することを立証している。システ
イン−２−メルカプトエタノール、ホモシステイン−２
−メルカプトエタノール、システィン、ホモシステイン
−システインおよびホモシスチンの溶離プロフィルは示
されていないが、それらは、また、存在し、そして、そ
れぞれ、１１．８、１２．９、１６．３、１７．４およ
び１８．４分の溶離時間をもつ単一の対照ピークとして
溶離される。
よびホモシステインを１：３：１で含有する混合物；
（Ｂ）１００μｌの正常ヒト血清；（Ｃ）１００μｌの
正常ヒト血清；（Ｄ）１００μｌの正常ヒト尿から還元
後に得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチルシリル誘
導体類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ酸は、
次の通りであった：メチオニン（ＭＥＴ）；システイン
のモノマー（ＣＹＳ）；ホモシステインのモノマー（Ｈ
ＣＹＳ）；〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン（Ｍｅｔ
＊）；〔３，３−2 Ｈ2 〕システインモノマー；および
〔３，３，４，４−2Ｈ4 〕ホモシステインモノマー
（ＨＣＹＳ＊）。ＭＥＴ＊，ＣＹＳ＊およびＨＣＹＳ＊
は試料Ａには添加せず、そしてそれらの表示を有するピ
ークは、天然に産出するアイソトープの存在量の結果と
して、それぞれ、ＭＥＴ，ＣＹＳおよびＨＣＹＳによっ
てそれらに寄与される量を表わす。かっこ内の数字は、
選択したイオンの監視によって走査したｍ／ｚについて
の値である。「Ｆ．Ｓ．」についての値は太いダッシュ
のトレースの全規模についての相対値である；細いダッ
シュのトレースは１０×の減衰である。内因性合計ホモ
システインについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤにつ
いて、それぞれ、１８．９、６．５および３．６μモル
／１であった。内因性合計システインについて決定した
値は、Ｂ，ＣおよびＤについて、それぞれ、３６９、１
７３および２３８μモル／１であった。内因性合計メチ
オニンについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ１６．８、６０．４および３．２μモル／
１であった。図２Ａは、毛管カラムがこれらの３種類の
アミノ酸を完全に分離することを立証している。システ
イン−２−メルカプトエタノール、ホモシステイン−２
−メルカプトエタノール、システィン、ホモシステイン
−システインおよびホモシスチンの溶離プロフィルは示
されていないが、それらは、また、存在し、そして、そ
れぞれ、１１．８、１２．９、１６．３、１７．４およ
び１８．４分の溶離時間をもつ単一の対照ピークとして
溶離される。
【００５５】〔３，３，３′，３′，４，４，４′，
４′−2 Ｈ8 〕ホモシスチン、〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕シスチンおよび〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン
を添加しない、ヒトの血清および尿、およびラットの血
清の試料を使用する研究は、定量のために内部標準とし
てのそれらの使用を妨害する物質が存在しないことを立
証した。アッセイの感度は５０μモル／１の〔３，３，
３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスチ
ン、２５０μモル／１の〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕システィンおよび１５０μモル／１の〔メチル
−2 Ｈ3 〕メチオニンを使用する標準の条件下に、合計
ホモシステインについて１μモル／１、合計システイン
について５μモル／１およびメチオニンについて２μモ
ル／１であったが、感度は各場合において添加する内部
標準の量を減少することによって改良できた。標準条件
下実施したアッセイは、３種類のアッセイの各々につい
てのアッセイが合計ホモシステインについて１〜１００
０μモル／１、合計システインについて５〜５０００μ
モル／１、そしてメチオニンについて２〜２０００μモ
ル／１の範囲にわたって直線であることを示した。
４′−2 Ｈ8 〕ホモシスチン、〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕シスチンおよび〔メチル−2 Ｈ3 〕メチオニン
を添加しない、ヒトの血清および尿、およびラットの血
清の試料を使用する研究は、定量のために内部標準とし
てのそれらの使用を妨害する物質が存在しないことを立
証した。アッセイの感度は５０μモル／１の〔３，３，
３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシスチ
ン、２５０μモル／１の〔３，３，３′，３′−
2 Ｈ4 〕システィンおよび１５０μモル／１の〔メチル
−2 Ｈ3 〕メチオニンを使用する標準の条件下に、合計
ホモシステインについて１μモル／１、合計システイン
について５μモル／１およびメチオニンについて２μモ
ル／１であったが、感度は各場合において添加する内部
標準の量を減少することによって改良できた。標準条件
下実施したアッセイは、３種類のアッセイの各々につい
てのアッセイが合計ホモシステインについて１〜１００
０μモル／１、合計システインについて５〜５０００μ
モル／１、そしてメチオニンについて２〜２０００μモ
ル／１の範囲にわたって直線であることを示した。
【００５６】１００μｌの正常ヒト血清を使用して得た
クロマトグラムは図２Ｂに示されている。内因性合計シ
ステインは最大の量で存在し、次いで内因性メチオニン
および次いで内因性合計ホモシステインが存在する。合
計システインのほぼ７０％はほぼ７．７分におけるシス
テインモノマーのピーク中に存在し、残りの３０％は後
の時間期間に溶離されるシステイン−２−メルカプトエ
タノール（２０％）、システィン（９％）およびホモシ
ステイン−システイン二量体（１％）のピークとして存
在した（データは示されていない）（上を参照）。合計
ホモシステインのほぼ６０％はホモシステインモノマー
のピーク中に存在し、このピークはほぼ８．９分で溶離
され、残りは後に溶離されるホモシステイン−２−メル
カプトエタノール（２５％）、ホモシステイン−システ
イン二量体（１４％）およびホモシスティン（１％）の
ピークとして存在した（データは示されていない）（上
を参照）。
クロマトグラムは図２Ｂに示されている。内因性合計シ
ステインは最大の量で存在し、次いで内因性メチオニン
および次いで内因性合計ホモシステインが存在する。合
計システインのほぼ７０％はほぼ７．７分におけるシス
テインモノマーのピーク中に存在し、残りの３０％は後
の時間期間に溶離されるシステイン−２−メルカプトエ
タノール（２０％）、システィン（９％）およびホモシ
ステイン−システイン二量体（１％）のピークとして存
在した（データは示されていない）（上を参照）。合計
ホモシステインのほぼ６０％はホモシステインモノマー
のピーク中に存在し、このピークはほぼ８．９分で溶離
され、残りは後に溶離されるホモシステイン−２−メル
カプトエタノール（２５％）、ホモシステイン−システ
イン二量体（１４％）およびホモシスティン（１％）の
ピークとして存在した（データは示されていない）（上
を参照）。
【００５７】システインおよびホモシステインの種々の
形態の百分率は、試料毎にかなり変化したが、２−メル
カプトエタノールの沸騰期間が１分から６０分に変化し
たとき、あるいは２−メルカプトエタノールの量が５μ
ｌから１００μｌに変化したとき、所定の試料について
変化しなかった。内因性システイン対〔３，３−
2 Ｈ2 〕システインの比は、システインを含有する種々
のピークのすべてにおいて本質的に同一であった。内因
性ホモシステイン対〔３，３，４，４−2 Ｈ4 〕ホモシ
ステインの比は、ホモシステインを含有する種々のピー
クのすべてにおいて本質的に同一であった。これらの観
察が示すように、システインおよびホモシステインの内
因性および内部の標準形態は、１００μｌの２−メルカ
プトエタノールを使用する初期の１５分の還元によっ
て、完全に還元され、そして蛋白質へ結合した形態を包
含する、それらの種々のジサルファイドの形態から解放
され、そして少量であるが、有意な量の種々のジサルフ
ァイドは精製および誘導体化の引続く段階において再形
成する。この引続く部分的ジサルファイドの再形成は、
内因性合計システインおよび内因性合計ホモシステイン
の定量を妨害しない。なぜなら、システインおよびホモ
システインのために利用する内部標準、すなわち、
〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕シスチンおよび〔３，
３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシ
スチンは、また、完全に還元され、次いで、内因性合計
システインおよび内因性合計ホモシステインと同程度
に、部分的ジサルファイドの再形成に参加するからであ
る。システインモノマー、システイン−２−メルカプト
エタノール、シスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化シス
テイン対内因性システインの比を使用して内因性合計シ
ステインを定量することは可能である。なぜなら、この
比の値はいかなる所定の試料についてのすべて４つのピ
ークにおいても同一であるからである。また、ホモシス
テインモノマー、ホモシステイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化ホモ
システイン対内因性ホモシステインの比を使用して内因
性合計ホモシステインを定量することは可能である。な
ぜなら、この比の値はいかなる所定の試料についてのす
べて４つのピークにおいても同一であるからである。わ
れわれの標準手順においてシステインモノマーおよびホ
モシステインモノマーのピークにおいて得られた比を測
定しかつそれを使用することを選択した。なぜなら、そ
れらは通常最大のピークであり、そしてそれらは他のピ
ークより早く溶離されるからである。
形態の百分率は、試料毎にかなり変化したが、２−メル
カプトエタノールの沸騰期間が１分から６０分に変化し
たとき、あるいは２−メルカプトエタノールの量が５μ
ｌから１００μｌに変化したとき、所定の試料について
変化しなかった。内因性システイン対〔３，３−
2 Ｈ2 〕システインの比は、システインを含有する種々
のピークのすべてにおいて本質的に同一であった。内因
性ホモシステイン対〔３，３，４，４−2 Ｈ4 〕ホモシ
ステインの比は、ホモシステインを含有する種々のピー
クのすべてにおいて本質的に同一であった。これらの観
察が示すように、システインおよびホモシステインの内
因性および内部の標準形態は、１００μｌの２−メルカ
プトエタノールを使用する初期の１５分の還元によっ
て、完全に還元され、そして蛋白質へ結合した形態を包
含する、それらの種々のジサルファイドの形態から解放
され、そして少量であるが、有意な量の種々のジサルフ
ァイドは精製および誘導体化の引続く段階において再形
成する。この引続く部分的ジサルファイドの再形成は、
内因性合計システインおよび内因性合計ホモシステイン
の定量を妨害しない。なぜなら、システインおよびホモ
システインのために利用する内部標準、すなわち、
〔３，３，３′，３′−2 Ｈ4 〕シスチンおよび〔３，
３，３′，３′，４，４，４′，４′−2 Ｈ8 〕ホモシ
スチンは、また、完全に還元され、次いで、内因性合計
システインおよび内因性合計ホモシステインと同程度
に、部分的ジサルファイドの再形成に参加するからであ
る。システインモノマー、システイン−２−メルカプト
エタノール、シスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化シス
テイン対内因性システインの比を使用して内因性合計シ
ステインを定量することは可能である。なぜなら、この
比の値はいかなる所定の試料についてのすべて４つのピ
ークにおいても同一であるからである。また、ホモシス
テインモノマー、ホモシステイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシスチン、またはホモシステイン−システ
イン二量体のピークのいずれにおいても、重水素化ホモ
システイン対内因性ホモシステインの比を使用して内因
性合計ホモシステインを定量することは可能である。な
ぜなら、この比の値はいかなる所定の試料についてのす
べて４つのピークにおいても同一であるからである。わ
れわれの標準手順においてシステインモノマーおよびホ
モシステインモノマーのピークにおいて得られた比を測
定しかつそれを使用することを選択した。なぜなら、そ
れらは通常最大のピークであり、そしてそれらは他のピ
ークより早く溶離されるからである。
【００５８】初期の研究において、最初の還元工程後
に、システインモノマーおよびホモシステインモノマー
にヨードアセトアミドを結合し、次いで標準の方法で精
製および誘導体化の手順を進行させることが可能である
ことが示された（データは示されていない）。この修正
法は、ジサルファイドの再形成を防止するが、詳細に評
価しなかった。
に、システインモノマーおよびホモシステインモノマー
にヨードアセトアミドを結合し、次いで標準の方法で精
製および誘導体化の手順を進行させることが可能である
ことが示された（データは示されていない）。この修正
法は、ジサルファイドの再形成を防止するが、詳細に評
価しなかった。
【００５９】２−メルカプトエタノールによる還元をヒ
ト血清を使用する標準手順から省略するとき、シスチ
ン、ホモシスチン、およびホモシステイン−システイン
二量体のピークが観測され、これらのピークは、それぞ
れ、システイン、ホモシステインおよび両者のホモシス
テインおよびシステインの内因性形態を含有する。シス
テイン−２−メルカプトエタノールおよびホモシステイ
ン−２−メルカプトエタノールは、これらの条件下で検
出不可能である（データは表わされていない）。
ト血清を使用する標準手順から省略するとき、シスチ
ン、ホモシスチン、およびホモシステイン−システイン
二量体のピークが観測され、これらのピークは、それぞ
れ、システイン、ホモシステインおよび両者のホモシス
テインおよびシステインの内因性形態を含有する。シス
テイン−２−メルカプトエタノールおよびホモシステイ
ン−２−メルカプトエタノールは、これらの条件下で検
出不可能である（データは表わされていない）。
【００６０】１００μｌの正常ラット血清および１００
μｌの正常ヒト尿を使用して得られたクロマトグラム
は、それぞれ、図２Ｃおよび図２Ｄに示されており、そ
して正常ヒト血清を用いて得られたクロマトグラム（図
２Ｂ）に類似する。反復して凍結および融解し、そして
１月の期間にわたって１６の異なる場合についてアッセ
イした、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用し
て実施した研究は、合計ホモシステイン、合計システイ
ンおよびメチオニンのアッセイについて、それぞれ、１
９．７％，１７．４％および５．６％の変動係数につい
ての値を与えた。これらの３種類のアミノ酸についての
値の有意の変動または傾向は１月の期間にわたって観測
されず、また同一の血清を他の場合において１２か月の
期間にわたってアッセイしたとき、変化は観測されなか
った。
μｌの正常ヒト尿を使用して得られたクロマトグラム
は、それぞれ、図２Ｃおよび図２Ｄに示されており、そ
して正常ヒト血清を用いて得られたクロマトグラム（図
２Ｂ）に類似する。反復して凍結および融解し、そして
１月の期間にわたって１６の異なる場合についてアッセ
イした、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用し
て実施した研究は、合計ホモシステイン、合計システイ
ンおよびメチオニンのアッセイについて、それぞれ、１
９．７％，１７．４％および５．６％の変動係数につい
ての値を与えた。これらの３種類のアミノ酸についての
値の有意の変動または傾向は１月の期間にわたって観測
されず、また同一の血清を他の場合において１２か月の
期間にわたってアッセイしたとき、変化は観測されなか
った。
【００６１】抜出しかつ直ちに４℃において遠心した血
液試料を使用して得られた血清の合計ホモシステインに
ついての値は、遠心前室温において１時間インキュベー
ションした同一血液試料の一部を使用して得られた値と
同一（１０％の差）であったが、遠心前にインキュベー
ションを４時間および２４時間に延長したとき、それぞ
れ、ほぼ３５％および７５％だけ増加した。血清の合計
システインについての値は、２４時間のインキュベーシ
ョン期間にわたって不変化であった。血清メチオニンに
ついての値は、１時間不変化であり、そして４時間およ
び２４時間において、それぞれ、１０％および２５％だ
け増加した。ＥＤＴＡまたはヘパリン中に集めた血漿
は、メチオニンを除外して、すべての時間期間において
すべての３種類のアミノ酸について血清の値と同一であ
る値を与えたが、メチオニンの場合において、両者のタ
イプの血漿についての値は４時間および２４時間のイン
キュベーション期間にわたってすべて増加しなかった。
ラット二量体を使用して実施したインキュベーションの
研究は、ヒト血清を使用して得られた結果に類似する結
果を与えた。合計ホモシステイン、尿の合計システイン
および合計メチオニンについての値は、尿の試料を０時
間〜２４時間の間室温においてインキュベーションした
とき、変化しなかった。
液試料を使用して得られた血清の合計ホモシステインに
ついての値は、遠心前室温において１時間インキュベー
ションした同一血液試料の一部を使用して得られた値と
同一（１０％の差）であったが、遠心前にインキュベー
ションを４時間および２４時間に延長したとき、それぞ
れ、ほぼ３５％および７５％だけ増加した。血清の合計
システインについての値は、２４時間のインキュベーシ
ョン期間にわたって不変化であった。血清メチオニンに
ついての値は、１時間不変化であり、そして４時間およ
び２４時間において、それぞれ、１０％および２５％だ
け増加した。ＥＤＴＡまたはヘパリン中に集めた血漿
は、メチオニンを除外して、すべての時間期間において
すべての３種類のアミノ酸について血清の値と同一であ
る値を与えたが、メチオニンの場合において、両者のタ
イプの血漿についての値は４時間および２４時間のイン
キュベーション期間にわたってすべて増加しなかった。
ラット二量体を使用して実施したインキュベーションの
研究は、ヒト血清を使用して得られた結果に類似する結
果を与えた。合計ホモシステイン、尿の合計システイン
および合計メチオニンについての値は、尿の試料を０時
間〜２４時間の間室温においてインキュベーションした
とき、変化しなかった。
【００６２】５０人の正常ヒト被検者および５０匹の正
常ラットからの合計ホモシステイン、合計システインお
よびメチオニンについて得られ、より高い値に向かうひ
ずみについて補正するために対数変換後に平均±２ S.
D. として計算した。実際の平均（μモル／１）および
範囲についての値は、次の通りであった：ヒト血清合計
ホモシステイン、１３．０（７．２−２１．７）；ヒト
血清合計メチオニン、２５．５（１３．７−４３．
５）；ヒト血清合計システイン、２６１（１７４−３７
８）；ラット血清合計ホモシステイン、５．６（３．２
−９．６）；ラット血清合計メチオニン、５６（３９−
８３）；ラット血清合計システイン、１９０（１３１−
２８３）。同一の５０人の正常ヒト被検者から得、上に
定義したように計算した、実際の平均（μモル／１また
はμモル／１０ミリモルのクレアチニン）および範囲に
ついての値は、次の通りであった：ヒト尿合計ホモシス
テイン、７．２（１．４−２４．７）；ヒト尿合計ホモ
システイン／１０ミリモルのクレアチニン、１１．２
（２．０−３６．７）；ヒト尿合計メチオニン、５．９
（０４−３５．１）；ヒト尿合計メチオニン／１０ミリ
モルのクレアチニン、６．３（１．５−１９．１）；ヒ
ト尿合計システイン、２６０（６８−７２９）；ヒト尿
合計システイン／１０ミリモルのクレアチニン、３４４
（１５８−６５５）。尿中の合計システインおよびメチ
オニンの正常な範囲は、μモル／１として表わすときよ
り、μモル／１０μミリモルのクレアチニンとして表わ
すとき高い。
常ラットからの合計ホモシステイン、合計システインお
よびメチオニンについて得られ、より高い値に向かうひ
ずみについて補正するために対数変換後に平均±２ S.
D. として計算した。実際の平均（μモル／１）および
範囲についての値は、次の通りであった：ヒト血清合計
ホモシステイン、１３．０（７．２−２１．７）；ヒト
血清合計メチオニン、２５．５（１３．７−４３．
５）；ヒト血清合計システイン、２６１（１７４−３７
８）；ラット血清合計ホモシステイン、５．６（３．２
−９．６）；ラット血清合計メチオニン、５６（３９−
８３）；ラット血清合計システイン、１９０（１３１−
２８３）。同一の５０人の正常ヒト被検者から得、上に
定義したように計算した、実際の平均（μモル／１また
はμモル／１０ミリモルのクレアチニン）および範囲に
ついての値は、次の通りであった：ヒト尿合計ホモシス
テイン、７．２（１．４−２４．７）；ヒト尿合計ホモ
システイン／１０ミリモルのクレアチニン、１１．２
（２．０−３６．７）；ヒト尿合計メチオニン、５．９
（０４−３５．１）；ヒト尿合計メチオニン／１０ミリ
モルのクレアチニン、６．３（１．５−１９．１）；ヒ
ト尿合計システイン、２６０（６８−７２９）；ヒト尿
合計システイン／１０ミリモルのクレアチニン、３４４
（１５８−６５５）。尿中の合計システインおよびメチ
オニンの正常な範囲は、μモル／１として表わすときよ
り、μモル／１０μミリモルのクレアチニンとして表わ
すとき高い。
【００６３】合計ホモシステインおよび合計システイン
についての値は、ラット血清におけるよりヒト血清にお
いて有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。メチオニンにつ
いての値は、ヒト血清におけるよりラット血清において
有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。ヒト血清の合計ホモ
システイン、合計システインおよびメチオニンは、尿の
値をμモル／１またはμモル／１０ミリモルのクレアチ
ニンとして表すか否かに無関係に、それぞれ、尿の合計
ホモシステイン、合計システインおよびメチオニンと相
関関係がなかった。血清合計ホモシステインおよび血清
メチオニンについての値は、女性よりも男性において、
それぞれ、２０％および２２％だけ高かった（Ｐ＜０．
０５）。血清合計システイン、尿合計ホモシステイン、
尿合計システインおよび尿メチオニンについての値は男
性および女性について有意に異ならなかった。血清合計
ホモシステインについての値は、年令、ヘモグロビン、
平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラミン、
血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計システインまた
は血清メチルマロン酸と有意な相関関係をもたなかっ
た。最高の補正係数は、血清合計ホモシステインとヘモ
グロビンとの間で０．３７（Ｐ＝０．０６）そして血清
合計ホモシステインと血清葉酸塩との間で−０．３４
（Ｐ＝０．０６）であった。血清ホモシステインと血清
コバラミンとの間の相関関係係数は０．１４（Ｐ＝０．
４４）であった。血清メチオニンについての値は、相関
関係係数が０．４４（Ｐ＜０．０５）であるヘモグロビ
ンを除外して、前述のパラメーターのいずれとも有意に
相関関係をもたなかった。血清メチオニンと血清葉酸塩
との間、および血清メチオニンと血清コバラミンとの間
の相関関係係数は、それぞれ、−０．０９（Ｐ＝０．６
４）および０．２０（Ｐ＝０．２９）であった。血清合
計システインは、年令および血清メチルマロン酸を除外
して、前述パラメーターと有意な相関関係をもたなかっ
た。血清合計システインと年令との間、および血清合計
システインと血清メチルマロン酸との間の相関関係係数
は、それぞれ、０．３８（Ｐ＜０．０１）および０．３
０（Ｐ＜０．０５）であった。μモル／１またはμモル
／１０ミリモルのクレアチニンとして表した尿合計ホモ
システイン、尿合計システインおよび尿メチオニンにつ
いての値は、年令、ヘモグロビン、平均血球体積、白血
球数、血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清メ
チルマロン酸、血清合計ホモシステイン、血清メチオニ
ンまたは血清合計システインと有意な相関関係をもたな
かった。
についての値は、ラット血清におけるよりヒト血清にお
いて有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。メチオニンにつ
いての値は、ヒト血清におけるよりラット血清において
有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。ヒト血清の合計ホモ
システイン、合計システインおよびメチオニンは、尿の
値をμモル／１またはμモル／１０ミリモルのクレアチ
ニンとして表すか否かに無関係に、それぞれ、尿の合計
ホモシステイン、合計システインおよびメチオニンと相
関関係がなかった。血清合計ホモシステインおよび血清
メチオニンについての値は、女性よりも男性において、
それぞれ、２０％および２２％だけ高かった（Ｐ＜０．
０５）。血清合計システイン、尿合計ホモシステイン、
尿合計システインおよび尿メチオニンについての値は男
性および女性について有意に異ならなかった。血清合計
ホモシステインについての値は、年令、ヘモグロビン、
平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラミン、
血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計システインまた
は血清メチルマロン酸と有意な相関関係をもたなかっ
た。最高の補正係数は、血清合計ホモシステインとヘモ
グロビンとの間で０．３７（Ｐ＝０．０６）そして血清
合計ホモシステインと血清葉酸塩との間で−０．３４
（Ｐ＝０．０６）であった。血清ホモシステインと血清
コバラミンとの間の相関関係係数は０．１４（Ｐ＝０．
４４）であった。血清メチオニンについての値は、相関
関係係数が０．４４（Ｐ＜０．０５）であるヘモグロビ
ンを除外して、前述のパラメーターのいずれとも有意に
相関関係をもたなかった。血清メチオニンと血清葉酸塩
との間、および血清メチオニンと血清コバラミンとの間
の相関関係係数は、それぞれ、−０．０９（Ｐ＝０．６
４）および０．２０（Ｐ＝０．２９）であった。血清合
計システインは、年令および血清メチルマロン酸を除外
して、前述パラメーターと有意な相関関係をもたなかっ
た。血清合計システインと年令との間、および血清合計
システインと血清メチルマロン酸との間の相関関係係数
は、それぞれ、０．３８（Ｐ＜０．０１）および０．３
０（Ｐ＜０．０５）であった。μモル／１またはμモル
／１０ミリモルのクレアチニンとして表した尿合計ホモ
システイン、尿合計システインおよび尿メチオニンにつ
いての値は、年令、ヘモグロビン、平均血球体積、白血
球数、血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清メ
チルマロン酸、血清合計ホモシステイン、血清メチオニ
ンまたは血清合計システインと有意な相関関係をもたな
かった。
【００６４】クレアチニンの浄化に関する合計ホモシス
テイン、合計システインおよびメチオニンのヒト血清か
らの平均の尿浄化は、それぞれ、０．３％，０．６％お
よび０．１％であると計算された。これらの観測が立証
するように、血清中に存在する合計ホモシステイン、合
計システインおよびメチオニンのほんの小さい分画のみ
が尿中に分泌され、そしてこれらのアミノ酸の濃度のレ
ベルおよび相対的変化は、こうして、種々の病理学的状
態における血清と尿との間で異なりうる。
テイン、合計システインおよびメチオニンのヒト血清か
らの平均の尿浄化は、それぞれ、０．３％，０．６％お
よび０．１％であると計算された。これらの観測が立証
するように、血清中に存在する合計ホモシステイン、合
計システインおよびメチオニンのほんの小さい分画のみ
が尿中に分泌され、そしてこれらのアミノ酸の濃度のレ
ベルおよび相対的変化は、こうして、種々の病理学的状
態における血清と尿との間で異なりうる。
【００６５】こうして、正常のヒトおよびラットからの
血清および正常のヒトからの尿の中の合計ホモシステイ
ンおよび合計システインを検出しかつ定量することを可
能とする技術を開発しかつ立証した。適当なスルフヒド
リル化合物、例えば、２−メルカプトエタノールを使用
する還元は、血清中の合計ホモシステインおよび合計シ
ステインを測定するために必須である。なぜなら、これ
らのアミノ酸の５０％〜７０％はジサルファイド結合を
介して血清蛋白質へ共有結合するからである。われわれ
の研究および他の研究が示すように、この結合したホモ
システインおよびシステインの遊離は、急速に起こる
が、われわれの研究が、また、示すように、還元後の新
しいジサルファイドの形成は有意な程度に起こる。質量
分析計に基づく検出および定量は、ホモシステインおよ
びシステインそれら自体の安定なアイソトープの形態を
内部標準として使用できるので、この場合においてきわ
めて有益である。これらの内部標準は内因性合計ホモシ
ステインおよび内因性合計システインと還元工程の間平
衡化し、そして新しいジサルファイドの部分的形成の間
平衡状態にとどまる。また、初期の還元工程を省略する
ことができ、これによって、適当な内部標準を利用する
かぎり、遊離のホモシスチン、遊離のシスチン、および
遊離のホモシステイン−システイン二量体を検出しかつ
測定することが可能である。本発明の方法を利用して、
蛋白質結合したホモシステインおよびシステインを別々
に測定することが可能であろうが、これを研究しなかっ
た。また、追加の内部標準を利用して他のアミノ酸を同
時に測定することが可能である。われわれは、メチオニ
ンの場合において、これを実施し、そしてこの方法を他
のアミノ酸に容易に適用できることを発見した。
血清および正常のヒトからの尿の中の合計ホモシステイ
ンおよび合計システインを検出しかつ定量することを可
能とする技術を開発しかつ立証した。適当なスルフヒド
リル化合物、例えば、２−メルカプトエタノールを使用
する還元は、血清中の合計ホモシステインおよび合計シ
ステインを測定するために必須である。なぜなら、これ
らのアミノ酸の５０％〜７０％はジサルファイド結合を
介して血清蛋白質へ共有結合するからである。われわれ
の研究および他の研究が示すように、この結合したホモ
システインおよびシステインの遊離は、急速に起こる
が、われわれの研究が、また、示すように、還元後の新
しいジサルファイドの形成は有意な程度に起こる。質量
分析計に基づく検出および定量は、ホモシステインおよ
びシステインそれら自体の安定なアイソトープの形態を
内部標準として使用できるので、この場合においてきわ
めて有益である。これらの内部標準は内因性合計ホモシ
ステインおよび内因性合計システインと還元工程の間平
衡化し、そして新しいジサルファイドの部分的形成の間
平衡状態にとどまる。また、初期の還元工程を省略する
ことができ、これによって、適当な内部標準を利用する
かぎり、遊離のホモシスチン、遊離のシスチン、および
遊離のホモシステイン−システイン二量体を検出しかつ
測定することが可能である。本発明の方法を利用して、
蛋白質結合したホモシステインおよびシステインを別々
に測定することが可能であろうが、これを研究しなかっ
た。また、追加の内部標準を利用して他のアミノ酸を同
時に測定することが可能である。われわれは、メチオニ
ンの場合において、これを実施し、そしてこの方法を他
のアミノ酸に容易に適用できることを発見した。
【００６６】ヒトおよびラットの血清およびヒトの尿の
中の合計ホモシステインの正常な範囲を、われわれは規
定した。ヒトの血清および尿についての値は、次の文献
に報告されているものに類似する：Refsum, H., S.Hell
and およびP.M.Ueland, Clin.Chem. 31 (4): 624−628
(1985)。ヒト血清についてのわれわれの値は上の文献の
値よりほぼ３０％だけ高いが、これは、一部分、われわ
れの手順において内部標準として安定なアイソトープの
形態を使用したためであり、また、一部分、われわれの
手順におけるように試料を室温で凝固させるとき、合計
ホモシステインの値が多少増加という事実のためであろ
う。
中の合計ホモシステインの正常な範囲を、われわれは規
定した。ヒトの血清および尿についての値は、次の文献
に報告されているものに類似する：Refsum, H., S.Hell
and およびP.M.Ueland, Clin.Chem. 31 (4): 624−628
(1985)。ヒト血清についてのわれわれの値は上の文献の
値よりほぼ３０％だけ高いが、これは、一部分、われわ
れの手順において内部標準として安定なアイソトープの
形態を使用したためであり、また、一部分、われわれの
手順におけるように試料を室温で凝固させるとき、合計
ホモシステインの値が多少増加という事実のためであろ
う。
【００６７】また、ヒト血清およびヒト尿中の合計シス
テインについての正常範囲を、われわれは規定した。ヒ
ト血清に関するわれわれの値は、Malloy, M.H., D.K.Ra
ssinおよびG.H.Gaull, Anal.Biochem. 113 : 407−415
(1981)に報告されている値と良好に一致し、この文献は
ジチオスレイトールで還元し、次いで内因性合計システ
インを分光光度測定によって決定している。われわれの
値がほぼ２０％だけ高いという事実は、前述のようにわ
れわれの手順において安定なアイソトープの内部標準を
含有させることを反映しているであろう。ヒト尿の合計
システインはMartensson, J., Metablism 31 : 487−49
2 (1982)に報告されているものに類似し、この文献は標
準のアミノ酸分析装置を利用している。
テインについての正常範囲を、われわれは規定した。ヒ
ト血清に関するわれわれの値は、Malloy, M.H., D.K.Ra
ssinおよびG.H.Gaull, Anal.Biochem. 113 : 407−415
(1981)に報告されている値と良好に一致し、この文献は
ジチオスレイトールで還元し、次いで内因性合計システ
インを分光光度測定によって決定している。われわれの
値がほぼ２０％だけ高いという事実は、前述のようにわ
れわれの手順において安定なアイソトープの内部標準を
含有させることを反映しているであろう。ヒト尿の合計
システインはMartensson, J., Metablism 31 : 487−49
2 (1982)に報告されているものに類似し、この文献は標
準のアミノ酸分析装置を利用している。
【００６８】ヒトおよびラットの血清およびヒト尿中の
メチオニンについてわれわれが決定した正常範囲は、ア
ミノ酸分析装置を使用したある数の他の研究者らによっ
て決定された値と、きわめてよく一致する。ラット血清
中の合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオ
ニンについてのわれわれの値は、他の研究者らの限定さ
れたデータに類似する。
メチオニンについてわれわれが決定した正常範囲は、ア
ミノ酸分析装置を使用したある数の他の研究者らによっ
て決定された値と、きわめてよく一致する。ラット血清
中の合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオ
ニンについてのわれわれの値は、他の研究者らの限定さ
れたデータに類似する。
【００６９】ヒト血清中の合計ホモシステインを測定す
る感受性の特異的方法の利用可能性は、次のものを含
む、ある数の臨床的用途を有するであろう：（ｉ）臨床
的に確証されたコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する
患者における血清合計ホモシステインについての増大し
た値の出現の決定、（ii）血清コバラミンおよび血清葉
酸塩の診断的感度および特異性をアッセイするために、
血清コバラミンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、また
は低い正常レベルにある患者の血清中の合計ホモシステ
インのレベルの決定、（iii)種々の神経精神学的異常を
もつ患者をおよび初老の人の群におけるコバラミンおよ
び葉酸塩の欠乏の発生をよりよく規定するために、これ
らの群における血清中の合計ホモシステインの決定、お
よび（iv)末梢血管および脳血管の病気の増大した発生
と相関関係をもつヘテロ接合状態について、よりすぐれ
た診断試験を開発することを試みた、シスタチオンシン
セターゼの欠乏のためのヘテロ接合体 (heterozygote)
中の合計ホモシステインの決定。ヒト血清中の合計ホモ
システインのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
塩の欠乏の両者の比較的感度の高い測定手段である。動
物、例えば、ラットの血清中の合計ホモシステインを測
定できるということは、亜酸化窒素、コバラミン類似
体、葉酸塩類似体、例えば、メトトレキセート、および
コバラミンの欠乏または葉酸塩の欠乏食物を使用する研
究において、また、有用であり、これらの物質のすべて
はコバラミンおよび葉酸塩の代謝および利用の種々な面
を妨害する。
る感受性の特異的方法の利用可能性は、次のものを含
む、ある数の臨床的用途を有するであろう：（ｉ）臨床
的に確証されたコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する
患者における血清合計ホモシステインについての増大し
た値の出現の決定、（ii）血清コバラミンおよび血清葉
酸塩の診断的感度および特異性をアッセイするために、
血清コバラミンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、また
は低い正常レベルにある患者の血清中の合計ホモシステ
インのレベルの決定、（iii)種々の神経精神学的異常を
もつ患者をおよび初老の人の群におけるコバラミンおよ
び葉酸塩の欠乏の発生をよりよく規定するために、これ
らの群における血清中の合計ホモシステインの決定、お
よび（iv)末梢血管および脳血管の病気の増大した発生
と相関関係をもつヘテロ接合状態について、よりすぐれ
た診断試験を開発することを試みた、シスタチオンシン
セターゼの欠乏のためのヘテロ接合体 (heterozygote)
中の合計ホモシステインの決定。ヒト血清中の合計ホモ
システインのアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸
塩の欠乏の両者の比較的感度の高い測定手段である。動
物、例えば、ラットの血清中の合計ホモシステインを測
定できるということは、亜酸化窒素、コバラミン類似
体、葉酸塩類似体、例えば、メトトレキセート、および
コバラミンの欠乏または葉酸塩の欠乏食物を使用する研
究において、また、有用であり、これらの物質のすべて
はコバラミンおよび葉酸塩の代謝および利用の種々な面
を妨害する。
【００７０】実施例IVメチルマロン酸の代表的アッセイ Marcell, P.D., S.P.Stabler, E.R.PodellおよびR.H.Al
len, Anal.Biochem. 150：58−66 (1985) の方法に従
う。メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグ
マ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.) (St.
Louis, MO)から購入し、そしてメチルマロン酸はＪ．
Ｔ．ベイカー・ケミカル・カンパニー〔Baker Chemical
Co.(Philipsburg, NJ) 〕から入手し、そしてジメチル
マロン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー〔Aldr
ich Chemical Co.(Milwaukee, WI) 〕から入手し、〔メ
チル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸（＞９９％、慣用の合成
における）および〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸（＞９９
％）はメルク・シャープ・アンド・ドーム・アイソトー
プ (Merck Sharp and Dohme Isotopes） (Montreal, Ca
nada) から入手した。〔メチル−14Ｃ〕メチルマロン酸
（慣用の合成による）および〔１，４−14Ｃ2 〕コハク
酸はニュー・イングランド・コーポレーション〔New En
gland Co. (Boston, MA)〕から購入した。Ｎ−メチル−
Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセト
アミドは、ピアース・ケミカル・カンパニー (Pierce C
hemical Co.) (Rockford, IL) から購入した。すべての
溶媒は、バーディック・アンド・ジャクソン・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド〔Burdick & Jackson La
boratories,Inc. (Muskegon, MI) 〕からの高性能液体
クロマトグラフィーの等級のものであった。血液の試料
は、通常健康な血液共与者からベレ・ボノフィルス・ブ
ラッド・バンク (Belle Bonfils Blood Bank, Denver,
CO) において血液共与時間に得た。連続的血液の共与者
は、次の年令群の各々において５人の男性および５人の
女性から試料が得られるように選択した：１８〜２６，
２７〜３５，３６〜４５，４６〜５５および５６〜６５
（合計５０の試料）。試料は９a.m.および１p.m.の間に
おいて得、室温において１〜４時間凝固させ、１５００
ｇで３０分間遠心し、そして血清を取り出し、そして−
２０℃において貯蔵した。さらに、他の試料を遠心前に
０〜２４時間凝結させた。スポット尿の試料を、血液試
料を得たとき３０分以内に同一の５０人の個体から集
め、そして−２０℃において同様に貯蔵した。スプレイ
グ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、２５０−３５
０ｇ、をＳＡＳＣＯ，インコーポレーテッド(Omaha, N
E) から入手し、そして血液をエーテル麻酔の下に心臓
内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料について前
述したように、血清を集めそして貯蔵した。
len, Anal.Biochem. 150：58−66 (1985) の方法に従
う。メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグ
マ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.) (St.
Louis, MO)から購入し、そしてメチルマロン酸はＪ．
Ｔ．ベイカー・ケミカル・カンパニー〔Baker Chemical
Co.(Philipsburg, NJ) 〕から入手し、そしてジメチル
マロン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー〔Aldr
ich Chemical Co.(Milwaukee, WI) 〕から入手し、〔メ
チル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸（＞９９％、慣用の合成
における）および〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸（＞９９
％）はメルク・シャープ・アンド・ドーム・アイソトー
プ (Merck Sharp and Dohme Isotopes） (Montreal, Ca
nada) から入手した。〔メチル−14Ｃ〕メチルマロン酸
（慣用の合成による）および〔１，４−14Ｃ2 〕コハク
酸はニュー・イングランド・コーポレーション〔New En
gland Co. (Boston, MA)〕から購入した。Ｎ−メチル−
Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセト
アミドは、ピアース・ケミカル・カンパニー (Pierce C
hemical Co.) (Rockford, IL) から購入した。すべての
溶媒は、バーディック・アンド・ジャクソン・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド〔Burdick & Jackson La
boratories,Inc. (Muskegon, MI) 〕からの高性能液体
クロマトグラフィーの等級のものであった。血液の試料
は、通常健康な血液共与者からベレ・ボノフィルス・ブ
ラッド・バンク (Belle Bonfils Blood Bank, Denver,
CO) において血液共与時間に得た。連続的血液の共与者
は、次の年令群の各々において５人の男性および５人の
女性から試料が得られるように選択した：１８〜２６，
２７〜３５，３６〜４５，４６〜５５および５６〜６５
（合計５０の試料）。試料は９a.m.および１p.m.の間に
おいて得、室温において１〜４時間凝固させ、１５００
ｇで３０分間遠心し、そして血清を取り出し、そして−
２０℃において貯蔵した。さらに、他の試料を遠心前に
０〜２４時間凝結させた。スポット尿の試料を、血液試
料を得たとき３０分以内に同一の５０人の個体から集
め、そして−２０℃において同様に貯蔵した。スプレイ
グ−ダウリイ (Sprague-Dawley) ラット、２５０−３５
０ｇ、をＳＡＳＣＯ，インコーポレーテッド(Omaha, N
E) から入手し、そして血液をエーテル麻酔の下に心臓
内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料について前
述したように、血清を集めそして貯蔵した。
【００７１】２００ngの〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロ
ン酸および２０００ngの〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸を
含有する５０μｌのＨ2 Ｏを５００μｌの血清または１
００μｌの尿に添加し、そして尿の試料にさらに４００
μｌのＨ2 Ｏを添加した。次いで、pHを５０μｌの２Ｎ
のＮａＯＨの添加により約１２に上昇させ、次いで５ml
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、１
０００ｇで３分間遠心し、上のエーテル層をデカンテー
ションしそして廃棄した。次いで、pHを５０μｌの６Ｎ
のＨＣｌの添加により約１に調節し、そして試料を前述
のように５mlのジエチルエーテルで２回抽出した。エー
テル抽出液をプールし、４０℃の水浴中で窒素の流れの
供給によって乾固し、次いで５００μｌのＨ2 Ｏ中に溶
解した。試料全体をウォーターズ・アソシエーツ〔Wate
rs Associates (Milford, MA) 〕高性能液体クロマトグ
ラフィー陰イオン交換樹脂システム上注入した。このシ
ステムは７２０システムコントローラー、７３０データ
モジュール、２つの６０００Ａポンプ、Ｕ６Ｋインゼク
ター、およびＺ−モジュールからなり、ラジアル・パク
(Radial Pak) ＳＡＸカートリッジ（１０μｍ，８mm×
１０cm）およびワットマン，インコーポレーテッド〔Wh
atman, Inc. (Clifton, NJ) 〕から入手した薄膜陰イオ
ン交換体を詰めた予備カラム（４×２３mm）を装備して
いた。移動相は０．０５モルのＫＨ2 ＰＯ4 −Ｈ3 ＰＯ
4 ，pH２．０から成り、そして２mlの分画を２ml／分の
速度で集めた。分画３〜５は９５％より多いメチルマロ
ン酸およびコハク酸を含有し、これらは〔メチル−
14Ｃ〕メチルマロン酸および〔１，４−14Ｃ2 〕コハク
酸を使用して実施した分離実験に基づいて注入し、これ
らのコハク酸を使用してクロマトグラフィーのシステム
を毎日の基準で検査した。これらの分画をプールし、５
０μｌの６Ｎ ＨＣｌを添加してpHをほぼ１に調節し、
そして前述のように試料を５mlのジエチルエーテルで２
回抽出した。これらのエーテル抽出液をプールし、４０
℃の水浴中で窒素の流れの適用によって乾固し、そして
３００μｌのレアクチ (Reacti) バイアル〔ピアース・
ケミカル・カンパニー〔Pierce Chemical Co. (Rockfor
d, IL)〕に１５０μｌのメタノールすすぎ液と一緒に移
した。次いで、試料をスピード・バク(Speed Vac) 真空
濃縮器〔サバント・インストルメンツ・インコーポレー
テッド〔Savant Instruments, Inc. (Hicksville, NY)
〕内で乾固した。
ン酸および２０００ngの〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸を
含有する５０μｌのＨ2 Ｏを５００μｌの血清または１
００μｌの尿に添加し、そして尿の試料にさらに４００
μｌのＨ2 Ｏを添加した。次いで、pHを５０μｌの２Ｎ
のＮａＯＨの添加により約１２に上昇させ、次いで５ml
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、１
０００ｇで３分間遠心し、上のエーテル層をデカンテー
ションしそして廃棄した。次いで、pHを５０μｌの６Ｎ
のＨＣｌの添加により約１に調節し、そして試料を前述
のように５mlのジエチルエーテルで２回抽出した。エー
テル抽出液をプールし、４０℃の水浴中で窒素の流れの
供給によって乾固し、次いで５００μｌのＨ2 Ｏ中に溶
解した。試料全体をウォーターズ・アソシエーツ〔Wate
rs Associates (Milford, MA) 〕高性能液体クロマトグ
ラフィー陰イオン交換樹脂システム上注入した。このシ
ステムは７２０システムコントローラー、７３０データ
モジュール、２つの６０００Ａポンプ、Ｕ６Ｋインゼク
ター、およびＺ−モジュールからなり、ラジアル・パク
(Radial Pak) ＳＡＸカートリッジ（１０μｍ，８mm×
１０cm）およびワットマン，インコーポレーテッド〔Wh
atman, Inc. (Clifton, NJ) 〕から入手した薄膜陰イオ
ン交換体を詰めた予備カラム（４×２３mm）を装備して
いた。移動相は０．０５モルのＫＨ2 ＰＯ4 −Ｈ3 ＰＯ
4 ，pH２．０から成り、そして２mlの分画を２ml／分の
速度で集めた。分画３〜５は９５％より多いメチルマロ
ン酸およびコハク酸を含有し、これらは〔メチル−
14Ｃ〕メチルマロン酸および〔１，４−14Ｃ2 〕コハク
酸を使用して実施した分離実験に基づいて注入し、これ
らのコハク酸を使用してクロマトグラフィーのシステム
を毎日の基準で検査した。これらの分画をプールし、５
０μｌの６Ｎ ＨＣｌを添加してpHをほぼ１に調節し、
そして前述のように試料を５mlのジエチルエーテルで２
回抽出した。これらのエーテル抽出液をプールし、４０
℃の水浴中で窒素の流れの適用によって乾固し、そして
３００μｌのレアクチ (Reacti) バイアル〔ピアース・
ケミカル・カンパニー〔Pierce Chemical Co. (Rockfor
d, IL)〕に１５０μｌのメタノールすすぎ液と一緒に移
した。次いで、試料をスピード・バク(Speed Vac) 真空
濃縮器〔サバント・インストルメンツ・インコーポレー
テッド〔Savant Instruments, Inc. (Hicksville, NY)
〕内で乾固した。
【００７２】１００μｌのアセトニトリルおよび１０μ
ｌのＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ト
リフルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それら
のテフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そ
してそれらを室温（２２℃）で１夜放置するか、あるい
はそれらを８０℃に１時間加熱することによって、ジカ
ルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリルエステル調整し
た。１００μｌのＨ2 Ｏを添加して、反応の誘導体化剤
を加水分解し、次いで２５０μｌのヘキサンを添加し、
激しく混合し、そして１０００ｇで５分間遠心した。上
のヘキサン層をデカンテーションし、別のレアクチ・バ
イアルに移し、窒素の流れの適用によってほぼ５μｌに
乾燥した。完全な乾固を回避するように注意した。なぜ
なら、これは誘導体の主要な部分を失わせるからであ
る。ほぼ２μｌを毛管カラム上に落下する針の注入装置
(falling-needle injector) でヘウレット−パッカード
(Hewlett-Packard) (Palo Alto, CA) ５９９２Ｂガスク
ロマトグラフー質量分析計に注入し、そしてこの装置は
９８２５Ｂ計算器、９８７６Ａプリンターおよび分子噴
射分離器を装備していた。注入口を変更して、落下する
針の注入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャ
リヤーガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分
割は、デュラボンド (Durabond）ＤＢ−５溶融シリカ毛
管カラム（３０ｍ×０．２５mm内径、０．２５μｍのフ
ィルム厚さ）〔Ｊ＆Ｗサイエンティフィック・インコー
ポレーテッド（Rancho Cordova, CA) から入手した〕で
達成した。ガスクロマトグラフー質量分析計は、２５０
℃の注入口の温度および２２psi のカラムヘッドの圧力
で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを１
６０℃に平衡化し、そして試料注入後６．５分に８℃／
分で１８８℃に増加した。データを選択したイオン監視
のモードで５．８〜１２．５分に集めた。次の〔Ｍ−５
７〕+ イオンを５０ミリ秒の滞留時間で各々について監
視した：マロン酸、ｍ／ｚ ２７５．２；メチルマロン
酸、ｍ／ｚ ２８９．２；〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマ
ロン酸、ｍ／ｚ ２９２．２；コハク酸、ｍ／ｚ ２８
９．２；〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸、ｍ／ｚ ２９
１．２；ジメチルマロン酸、ｍ／ｚ ３０３．２；エチ
ルマロン酸、ｍ／ｚ ３０３．２；メチルコハク酸、ｍ
／ｚ ３０３．２；およびグルタル酸、ｍ／ｚ ３０
３．２。メチルマロン酸は、ほぼ６．８分において溶離
されるｍ／ｚ ２８９．２ピークの積分した面積（精確
な時間は標準を使用して毎日決定した）を同一時間に溶
離したｍ／ｚ ２９２．２ピークの積分で割り、次いで
各試料に添加した〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸の
等しい量である、２００ngを掛けることによって定量し
た。コハク酸は、同一の方法で、ほぼ９．３分に溶離し
たｍ／ｚ ２８９．２およびｍ／ｚ ２９１．２のピー
クを利用し、そして試料に添加した〔１，４−13Ｃ3 〕
コハク酸の量である、２００ngをそれらの比に掛けるこ
とによって定量する。２つの内部標準についての積分し
た面積、すなわち約６．８および９．３分に溶離するｍ
／ｚ ２９２．２およびｍ／ｚ ２９１．２のピーク
は、天然に産出するアイソトープの存在量の結果とし
て、それらに寄与される量について、メチルマロン酸お
よびコハク酸によって補正する。毎日の基準に基づいて
富んでないメチルマロン酸を使用して決定した、これら
の補正は次の通りであった：ｉ）６．８分におけるｍ／
ｚ２８９．２ピークの面積のほぼ１．９％は６．８分に
おけるｍ／ｚ ２９２．２ピークとして存在し、そして
ii）９．３分におけるｍ／ｚ ２８９．２ピークの面積
のほぼ１０．８％は９．３分におけるｍ／ｚ ２９１．
２ピークとして存在した。
ｌのＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ト
リフルオロアセトアミドを各バイアルに添加し、それら
のテフロンでライニングした隔膜キャップで密閉し、そ
してそれらを室温（２２℃）で１夜放置するか、あるい
はそれらを８０℃に１時間加熱することによって、ジカ
ルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリルエステル調整し
た。１００μｌのＨ2 Ｏを添加して、反応の誘導体化剤
を加水分解し、次いで２５０μｌのヘキサンを添加し、
激しく混合し、そして１０００ｇで５分間遠心した。上
のヘキサン層をデカンテーションし、別のレアクチ・バ
イアルに移し、窒素の流れの適用によってほぼ５μｌに
乾燥した。完全な乾固を回避するように注意した。なぜ
なら、これは誘導体の主要な部分を失わせるからであ
る。ほぼ２μｌを毛管カラム上に落下する針の注入装置
(falling-needle injector) でヘウレット−パッカード
(Hewlett-Packard) (Palo Alto, CA) ５９９２Ｂガスク
ロマトグラフー質量分析計に注入し、そしてこの装置は
９８２５Ｂ計算器、９８７６Ａプリンターおよび分子噴
射分離器を装備していた。注入口を変更して、落下する
針の注入器を受入れるようにし、そして補助の補充キャ
リヤーガスのラインを噴射分離器に供給した。試料の分
割は、デュラボンド (Durabond）ＤＢ−５溶融シリカ毛
管カラム（３０ｍ×０．２５mm内径、０．２５μｍのフ
ィルム厚さ）〔Ｊ＆Ｗサイエンティフィック・インコー
ポレーテッド（Rancho Cordova, CA) から入手した〕で
達成した。ガスクロマトグラフー質量分析計は、２５０
℃の注入口の温度および２２psi のカラムヘッドの圧力
で、標準の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを１
６０℃に平衡化し、そして試料注入後６．５分に８℃／
分で１８８℃に増加した。データを選択したイオン監視
のモードで５．８〜１２．５分に集めた。次の〔Ｍ−５
７〕+ イオンを５０ミリ秒の滞留時間で各々について監
視した：マロン酸、ｍ／ｚ ２７５．２；メチルマロン
酸、ｍ／ｚ ２８９．２；〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマ
ロン酸、ｍ／ｚ ２９２．２；コハク酸、ｍ／ｚ ２８
９．２；〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸、ｍ／ｚ ２９
１．２；ジメチルマロン酸、ｍ／ｚ ３０３．２；エチ
ルマロン酸、ｍ／ｚ ３０３．２；メチルコハク酸、ｍ
／ｚ ３０３．２；およびグルタル酸、ｍ／ｚ ３０
３．２。メチルマロン酸は、ほぼ６．８分において溶離
されるｍ／ｚ ２８９．２ピークの積分した面積（精確
な時間は標準を使用して毎日決定した）を同一時間に溶
離したｍ／ｚ ２９２．２ピークの積分で割り、次いで
各試料に添加した〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸の
等しい量である、２００ngを掛けることによって定量し
た。コハク酸は、同一の方法で、ほぼ９．３分に溶離し
たｍ／ｚ ２８９．２およびｍ／ｚ ２９１．２のピー
クを利用し、そして試料に添加した〔１，４−13Ｃ3 〕
コハク酸の量である、２００ngをそれらの比に掛けるこ
とによって定量する。２つの内部標準についての積分し
た面積、すなわち約６．８および９．３分に溶離するｍ
／ｚ ２９２．２およびｍ／ｚ ２９１．２のピーク
は、天然に産出するアイソトープの存在量の結果とし
て、それらに寄与される量について、メチルマロン酸お
よびコハク酸によって補正する。毎日の基準に基づいて
富んでないメチルマロン酸を使用して決定した、これら
の補正は次の通りであった：ｉ）６．８分におけるｍ／
ｚ２８９．２ピークの面積のほぼ１．９％は６．８分に
おけるｍ／ｚ ２９２．２ピークとして存在し、そして
ii）９．３分におけるｍ／ｚ ２８９．２ピークの面積
のほぼ１０．８％は９．３分におけるｍ／ｚ ２９１．
２ピークとして存在した。
【００７３】アッセイの感度は、例えば、メチルマロン
酸対〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸の比を決定する
ことによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載
されている直線性から変動する：Zinn, A.B., D.G.Hin
e, M.J.Mahoney および K.Tanaka, Pediatr.Res. 16 :
740−745 (1982)。クレアチニンの浄化に関する、血清
からのメチルマロン酸およびコハク酸の尿浄化は、メチ
ルマロン酸について例示したように次の等式で決定し
た：メチルマロン酸／クレアチニンの清浄化比＝１００
×〔尿のメチルマロン酸（ng／ml）／尿のクレアチニン
（ng／ml）／〔血清メチルマロン酸（ng／ml）／血清ク
レアチニン（ng／ml）〕この手順において利用する部分
的試料の精製の長大な性質は必要であった。なぜなら、
アミノ酸および他の有機化合物の複雑な混合物が血清お
よび尿の中に存在し、そして存在するメチルマロン酸の
濃度が比較的低かったからである。種々の有機溶媒を使
用する抽出、次いで小型の陰イオン−交換または逆相カ
ラムを使用するそれ以上の精製を用いる手順は、不満足
であった。陰イオン−交換樹脂を使用する高性能液体ク
ロマトグラフィーは、非常に有益であることが証明され
た。なぜなら、研究するジカルボン酸の pKa値はpH２に
おいて遅延するが、ほとんどの他の化合物は遅延しなか
ったからである。尿試料の分析は、血清について必要と
するのと同程度の部分的精製を必要としていた。〔メチ
ル−14Ｃ〕メチルマロン酸および〔１，４−14Ｃ〕コハ
ク酸の既知量を血清および尿の試料に添加する実験は、
両者のジカルボン酸の１０〜２０％が最終のヘキサン溶
液中に長大な部分的精製および誘導体化の手順後の終り
において回収されることを示した。
酸対〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸の比を決定する
ことによって測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載
されている直線性から変動する：Zinn, A.B., D.G.Hin
e, M.J.Mahoney および K.Tanaka, Pediatr.Res. 16 :
740−745 (1982)。クレアチニンの浄化に関する、血清
からのメチルマロン酸およびコハク酸の尿浄化は、メチ
ルマロン酸について例示したように次の等式で決定し
た：メチルマロン酸／クレアチニンの清浄化比＝１００
×〔尿のメチルマロン酸（ng／ml）／尿のクレアチニン
（ng／ml）／〔血清メチルマロン酸（ng／ml）／血清ク
レアチニン（ng／ml）〕この手順において利用する部分
的試料の精製の長大な性質は必要であった。なぜなら、
アミノ酸および他の有機化合物の複雑な混合物が血清お
よび尿の中に存在し、そして存在するメチルマロン酸の
濃度が比較的低かったからである。種々の有機溶媒を使
用する抽出、次いで小型の陰イオン−交換または逆相カ
ラムを使用するそれ以上の精製を用いる手順は、不満足
であった。陰イオン−交換樹脂を使用する高性能液体ク
ロマトグラフィーは、非常に有益であることが証明され
た。なぜなら、研究するジカルボン酸の pKa値はpH２に
おいて遅延するが、ほとんどの他の化合物は遅延しなか
ったからである。尿試料の分析は、血清について必要と
するのと同程度の部分的精製を必要としていた。〔メチ
ル−14Ｃ〕メチルマロン酸および〔１，４−14Ｃ〕コハ
ク酸の既知量を血清および尿の試料に添加する実験は、
両者のジカルボン酸の１０〜２０％が最終のヘキサン溶
液中に長大な部分的精製および誘導体化の手順後の終り
において回収されることを示した。
【００７４】ｔ−ブチルジメチルクロロシラン／Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド／イミダゾールの混合物を使用
するジカルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を
生成する初期の試み（Applied Science Laboratories,
Inc., State College, PA)〔de Jong, A.P.J.M., J.Ele
maおよびB.J.T.van de Berg, Biomed.Mass Spectrom.7
: 359−364 (1980)に記載されている〕は、誘導体化が
著しく変動しそして誘導体が比較的不安定であるため
に、不満足であった。あるｔ−ブチルジメチルシリル誘
導体、例えば、ある種の有機酸のエステルが加水分解す
るときの予期されない容易さに関する問題が、過去にお
いて生じた。Jongらが記載する反応混合物のpHはほぼ１
であること、およびクロロシランを含む反応によって生
成するＨＣｌをイミダゾールが完全に掃去することがで
きないために、これは新しく生成したジカルボン酸のｔ
−ブチルジメチルシリル誘導体の加水分解を生ずること
を、われわれは発見した。この問題は他のスキャベンジ
ャー、例えば、ピリジンの添加によって部分的にのみ補
正されただけである。しかしながら、Ｎ−メチル−Ｎ−
（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミ
ドを使用して調整したｔ−ブチルジメチルシリル誘導体
は、高い収率で、再現性のある方法で得られ、そして前
述のようにヘキサン中に抽出した後１週間以上安定であ
ることを、われわれは発見した。したがって、この手順
はわれわれの標準法として応用した。
−ジメチルホルムアミド／イミダゾールの混合物を使用
するジカルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を
生成する初期の試み（Applied Science Laboratories,
Inc., State College, PA)〔de Jong, A.P.J.M., J.Ele
maおよびB.J.T.van de Berg, Biomed.Mass Spectrom.7
: 359−364 (1980)に記載されている〕は、誘導体化が
著しく変動しそして誘導体が比較的不安定であるため
に、不満足であった。あるｔ−ブチルジメチルシリル誘
導体、例えば、ある種の有機酸のエステルが加水分解す
るときの予期されない容易さに関する問題が、過去にお
いて生じた。Jongらが記載する反応混合物のpHはほぼ１
であること、およびクロロシランを含む反応によって生
成するＨＣｌをイミダゾールが完全に掃去することがで
きないために、これは新しく生成したジカルボン酸のｔ
−ブチルジメチルシリル誘導体の加水分解を生ずること
を、われわれは発見した。この問題は他のスキャベンジ
ャー、例えば、ピリジンの添加によって部分的にのみ補
正されただけである。しかしながら、Ｎ−メチル−Ｎ−
（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミ
ドを使用して調整したｔ−ブチルジメチルシリル誘導体
は、高い収率で、再現性のある方法で得られ、そして前
述のようにヘキサン中に抽出した後１週間以上安定であ
ることを、われわれは発見した。したがって、この手順
はわれわれの標準法として応用した。
【００７５】メチルマロン酸のｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の構造およびｍ／ｚ値を、断片化位置および
〔Ｍ−５７〕+ および〔Ｍ−１５〕+ に存在する問題の
主要な断片のｍ／ｚ値と一緒に下に示す：
ル誘導体の構造およびｍ／ｚ値を、断片化位置および
〔Ｍ−５７〕+ および〔Ｍ−１５〕+ に存在する問題の
主要な断片のｍ／ｚ値と一緒に下に示す：
【００７６】
【化３】
【００７７】マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジ
メチルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およ
びグルタル酸の分子量は、それらのｔ−ブチルジメチル
シリル誘導体の質量スペクトルと一緒に図３に示されて
いる。特定の誘導体の分子量は、２つのｔ−ブチルジメ
チルシリル基の付加のために、ジカルボン酸の分子量＋
２２８に等しい。誘導体全体を表わすピーク、すなわち
〔Ｍ〕+ は、ジカルボン酸のいずれについても観測され
なかった。むしろ、各場合の主要なピークは〔Ｍ−５
７〕+ であり、これは１００〜４００のｍ／ｚ範囲にお
けるすべてのピークの合計の３５〜４５％を表わした。
〔Ｍ−１５〕+ を表わす、より小さいピークも各ジカル
ボン酸誘導体について観測されたが、量は〔Ｍ−５７〕
+ ピークについて存在する量のわずかに３〜６％であっ
た。ｍ／ｚ １４７値をもつピークはジカルボン酸誘導
体のすべてについて観測され、そしてｍ／ｚ １８９を
もつピークはグルタル酸誘導体を除外するすべてについ
て観測された。これらのピークの両者は、ｔ−ブチルジ
メチルシリル基それら自体の一部の断片化および転位か
ら生ずると思われ、そして、豊富なｍ／ｚ １４７およ
びｍ／ｚ １８９ピークが、また、〔メチル−2 Ｈ3 〕
メチルマロン酸および〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸につ
いて観測されるので、ジカルボン酸それら自体の部分を
含まない。
メチルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およ
びグルタル酸の分子量は、それらのｔ−ブチルジメチル
シリル誘導体の質量スペクトルと一緒に図３に示されて
いる。特定の誘導体の分子量は、２つのｔ−ブチルジメ
チルシリル基の付加のために、ジカルボン酸の分子量＋
２２８に等しい。誘導体全体を表わすピーク、すなわち
〔Ｍ〕+ は、ジカルボン酸のいずれについても観測され
なかった。むしろ、各場合の主要なピークは〔Ｍ−５
７〕+ であり、これは１００〜４００のｍ／ｚ範囲にお
けるすべてのピークの合計の３５〜４５％を表わした。
〔Ｍ−１５〕+ を表わす、より小さいピークも各ジカル
ボン酸誘導体について観測されたが、量は〔Ｍ−５７〕
+ ピークについて存在する量のわずかに３〜６％であっ
た。ｍ／ｚ １４７値をもつピークはジカルボン酸誘導
体のすべてについて観測され、そしてｍ／ｚ １８９を
もつピークはグルタル酸誘導体を除外するすべてについ
て観測された。これらのピークの両者は、ｔ−ブチルジ
メチルシリル基それら自体の一部の断片化および転位か
ら生ずると思われ、そして、豊富なｍ／ｚ １４７およ
びｍ／ｚ １８９ピークが、また、〔メチル−2 Ｈ3 〕
メチルマロン酸および〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸につ
いて観測されるので、ジカルボン酸それら自体の部分を
含まない。
【００７８】図４は、（Ａ）１μｇの各酸を含有する混
合物；（Ｂ）５００μｌのプールした正常ヒト血清；
（Ｃ）５００μｌの正常ラット血清；および（Ｄ）１０
０μｌの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示
す。研究したアミノ酸は、次の通りであった：マロン酸
（ＭＡ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、コハク酸（Ｓ
Ａ）、〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸（ＳＡ＊）、〔メチ
ル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸（ＭＭＡ＊）、ジメチルマ
ロン酸（ＤＭＭＡ）、エチルマロン酸（ＥＭＡ）、メチ
ルコハク酸（ＭＳＡ）およびグルタル酸（ＧＡ）。かっ
こ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査した
ｍ／ｚについての値である。「Ｆ．Ｓ．」についての値
は太いダッシュのトレースの全規模についての相対値で
ある；細いダッシュのトレースは１０×の減衰である。
ＭＭＡについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ、５６、９２および３４００ng／mlであっ
た。ＳＡについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ、１１１０、９２００および１９，０００
ng／mlであった。
合物；（Ｂ）５００μｌのプールした正常ヒト血清；
（Ｃ）５００μｌの正常ラット血清；および（Ｄ）１０
０μｌの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示
す。研究したアミノ酸は、次の通りであった：マロン酸
（ＭＡ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、コハク酸（Ｓ
Ａ）、〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸（ＳＡ＊）、〔メチ
ル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸（ＭＭＡ＊）、ジメチルマ
ロン酸（ＤＭＭＡ）、エチルマロン酸（ＥＭＡ）、メチ
ルコハク酸（ＭＳＡ）およびグルタル酸（ＧＡ）。かっ
こ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査した
ｍ／ｚについての値である。「Ｆ．Ｓ．」についての値
は太いダッシュのトレースの全規模についての相対値で
ある；細いダッシュのトレースは１０×の減衰である。
ＭＭＡについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ、５６、９２および３４００ng／mlであっ
た。ＳＡについて決定した値は、Ｂ，ＣおよびＤについ
て、それぞれ、１１１０、９２００および１９，０００
ng／mlであった。
【００７９】図４Ａが立証するように、毛管カラムは同
一の分子量を有する誘導体のすべてについて完全な分離
を与える。すなわち、メチルマロン酸およびコハク酸は
互いに完全に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチ
ルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに
完全に分離される。メチルマロン酸はジメチルマロン酸
から完全に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から
完全に分離されないが、これは問題ではない。なぜな
ら、図３に示すように、これらの分割されないジカルボ
ン酸誘導体は異なる分子量および質量スペクトルを有
し、こうして選択したイオンを監視するとき妨害が存在
しないからである。
一の分子量を有する誘導体のすべてについて完全な分離
を与える。すなわち、メチルマロン酸およびコハク酸は
互いに完全に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチ
ルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに
完全に分離される。メチルマロン酸はジメチルマロン酸
から完全に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から
完全に分離されないが、これは問題ではない。なぜな
ら、図３に示すように、これらの分割されないジカルボ
ン酸誘導体は異なる分子量および質量スペクトルを有
し、こうして選択したイオンを監視するとき妨害が存在
しないからである。
【００８０】〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸および
〔１，４−13Ｃ3 〕コハク酸を添加しない、ヒトの血清
および尿、およびラットの血清の試料を使用する研究
は、定量のために内部基準としてのそれらの使用を妨害
する物質が存在しないことを立証した。アッセイの感度
は２００ngの〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸および
２０００ngの〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸を使用する標
準の条件下に、メチルマロン酸について５ng／mlおよび
コハク酸について１５０ng／mlであったが、感度は各場
合において添加する内部標準の量を減少することによっ
て改良できた。標準条件下で実施したアッセイは、水性
試料中においておよび既知量のそれぞれの酸を添加した
血清中において、メチルマロン酸についてのアッセイが
５〜５０００ngにおいて直線であること、およびコハク
酸のアッセイが１５０〜１５０，０００において直線で
あることを示した。
〔１，４−13Ｃ3 〕コハク酸を添加しない、ヒトの血清
および尿、およびラットの血清の試料を使用する研究
は、定量のために内部基準としてのそれらの使用を妨害
する物質が存在しないことを立証した。アッセイの感度
は２００ngの〔メチル−2 Ｈ3 〕メチルマロン酸および
２０００ngの〔１，４−13Ｃ2 〕コハク酸を使用する標
準の条件下に、メチルマロン酸について５ng／mlおよび
コハク酸について１５０ng／mlであったが、感度は各場
合において添加する内部標準の量を減少することによっ
て改良できた。標準条件下で実施したアッセイは、水性
試料中においておよび既知量のそれぞれの酸を添加した
血清中において、メチルマロン酸についてのアッセイが
５〜５０００ngにおいて直線であること、およびコハク
酸のアッセイが１５０〜１５０，０００において直線で
あることを示した。
【００８１】５００μｌの正常ヒト血清を使用して得た
クロマトグラムは図４Ｂに示されている。コハク酸は最
大の量で存在し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エ
チルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、よ
り少量で存在するが、容易に検出される量である。ジメ
チルマロン酸は確実に検出できなかった。５００μｌの
正常ラット血清および１００μｌの正常ヒト尿を使用し
て得られたクロマトグラムは、それぞれ、図４Ｃおよび
図４Ｄに示されており、そしてプールした正常ヒト血清
を用いて得られたクロマトグラムに類似する（図４
Ｂ）。
クロマトグラムは図４Ｂに示されている。コハク酸は最
大の量で存在し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エ
チルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、よ
り少量で存在するが、容易に検出される量である。ジメ
チルマロン酸は確実に検出できなかった。５００μｌの
正常ラット血清および１００μｌの正常ヒト尿を使用し
て得られたクロマトグラムは、それぞれ、図４Ｃおよび
図４Ｄに示されており、そしてプールした正常ヒト血清
を用いて得られたクロマトグラムに類似する（図４
Ｂ）。
【００８２】反復して凍結および融解し、そして１０か
月の期間にわたって１７の異なる場合についてアッセイ
した、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用して
実施した研究は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッ
セイについて、それぞれ、２６％および１９％の変動係
数についての値を与えた。これらの２種類のジカルボン
酸についての値の有意の変動または傾向は１０か月の期
間にわたって観測されなかった。抜出しかつ直ちに４℃
において遠心した血清試料を使用して得られた血清のメ
チルマロン酸についての値は、遠心前室温において１時
間または２４時間インキュベーションした同一血液試料
の一部を使用して得られた値と同一であった。しかしな
がら、コハク酸の値はこの期間にわたって増加し、室温
において１時間インキュベーション後ほぼ１０％増加
し、そして２４時間インキュベーション後ほぼ９０％増
加した。ラットの血清を使用して実施した研究は同様な
結果を与えた。尿のメチルマロン酸およびコハク酸につ
いての値は、尿の試料を室温において０〜２４時間イン
キュベーションした時不変化であった。
月の期間にわたって１７の異なる場合についてアッセイ
した、プールした正常ヒト血清の単一の試料を使用して
実施した研究は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッ
セイについて、それぞれ、２６％および１９％の変動係
数についての値を与えた。これらの２種類のジカルボン
酸についての値の有意の変動または傾向は１０か月の期
間にわたって観測されなかった。抜出しかつ直ちに４℃
において遠心した血清試料を使用して得られた血清のメ
チルマロン酸についての値は、遠心前室温において１時
間または２４時間インキュベーションした同一血液試料
の一部を使用して得られた値と同一であった。しかしな
がら、コハク酸の値はこの期間にわたって増加し、室温
において１時間インキュベーション後ほぼ１０％増加
し、そして２４時間インキュベーション後ほぼ９０％増
加した。ラットの血清を使用して実施した研究は同様な
結果を与えた。尿のメチルマロン酸およびコハク酸につ
いての値は、尿の試料を室温において０〜２４時間イン
キュベーションした時不変化であった。
【００８３】５０人の正常ヒト被検者および９５匹の正
常ラットからのメチルマロン酸およびコハク酸について
得られ、より高い値に向かうひずみにつて補正するため
に対数変換後に平均±２ S.D. として計算した、実際の
平均（μモル／１）および範囲についての値は、次の通
りであった：ヒト血清メチルマロン酸、４１（１９−７
６）；ヒト血清コハク酸、１２７０（５８９−２４２
０）；ラット血清メチルマロン酸、１２８（４２−２９
５）；およびラット血清コハク酸、１１９００（５４２
０−２２８００）。同一の５０人の正常ヒト被検者から
得、上に定義したように計算した、実際の平均（ng／ml
またはng／mgのクレアチニン）および範囲についての値
は、次の通りであった：ヒト尿メチルマロン酸、１８４
０（２７０−７１９０）；ヒト尿メチルマロン酸／mg尿
クレアチニン、２０１０（８１０−３８３０）；ヒト尿
コハク酸、２５４００（４６２０−８５６００）；およ
びヒト尿コハク酸／mg尿クレアチニン、２８２００（８
３６０−７５１００）。尿中のメチルマロン酸およびコ
ハク酸についての正常な範囲は、ng／mlとして表すとき
より、ng／mgのクレアチニンとして表わすとき高い。
常ラットからのメチルマロン酸およびコハク酸について
得られ、より高い値に向かうひずみにつて補正するため
に対数変換後に平均±２ S.D. として計算した、実際の
平均（μモル／１）および範囲についての値は、次の通
りであった：ヒト血清メチルマロン酸、４１（１９−７
６）；ヒト血清コハク酸、１２７０（５８９−２４２
０）；ラット血清メチルマロン酸、１２８（４２−２９
５）；およびラット血清コハク酸、１１９００（５４２
０−２２８００）。同一の５０人の正常ヒト被検者から
得、上に定義したように計算した、実際の平均（ng／ml
またはng／mgのクレアチニン）および範囲についての値
は、次の通りであった：ヒト尿メチルマロン酸、１８４
０（２７０−７１９０）；ヒト尿メチルマロン酸／mg尿
クレアチニン、２０１０（８１０−３８３０）；ヒト尿
コハク酸、２５４００（４６２０−８５６００）；およ
びヒト尿コハク酸／mg尿クレアチニン、２８２００（８
３６０−７５１００）。尿中のメチルマロン酸およびコ
ハク酸についての正常な範囲は、ng／mlとして表すとき
より、ng／mgのクレアチニンとして表わすとき高い。
【００８４】メチルマロン酸およびコハク酸についての
値は、両者共、ヒト血清中よりラット血清中において有
意に高かった。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清
メチルマロン酸／mgクレアチニンは、尿メチルマロン酸
および尿メチルマロン酸／mgクレアチニンと有意に相関
関係をもたない。血清および尿のメチルマロン酸につい
ての値は、男性および女性について有意に異ならず、そ
して年令、ヘモグロビン、平均の血球体積、白血球数、
血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清クレアチ
ニン、血清コハク酸または尿コハク酸と有意に相関関係
をもたなかった。最高の相関関係係数は、血清メチルマ
ロン酸と血清コバラミンとの間において−０．２５であ
った（Ｐ＝０．０８）。血清および尿のコハク酸レベル
は、メチルマロン酸について前述のパラメーターのいず
れとも有意に相関関係をもたなかった。
値は、両者共、ヒト血清中よりラット血清中において有
意に高かった。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清
メチルマロン酸／mgクレアチニンは、尿メチルマロン酸
および尿メチルマロン酸／mgクレアチニンと有意に相関
関係をもたない。血清および尿のメチルマロン酸につい
ての値は、男性および女性について有意に異ならず、そ
して年令、ヘモグロビン、平均の血球体積、白血球数、
血小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清クレアチ
ニン、血清コハク酸または尿コハク酸と有意に相関関係
をもたなかった。最高の相関関係係数は、血清メチルマ
ロン酸と血清コバラミンとの間において−０．２５であ
った（Ｐ＝０．０８）。血清および尿のコハク酸レベル
は、メチルマロン酸について前述のパラメーターのいず
れとも有意に相関関係をもたなかった。
【００８５】クレアチニンの浄化に関するヒト血清から
のメチルマロン酸の平均尿浄化は２８％であり、そして
クレアチニンの浄化に関するヒト血清からのコハク酸の
平均尿浄化は１３％であると、計算された。この他の観
察は、〔メチル−14Ｃ〕メチルマロン酸をラットに心臓
内注射により投与した実験において観察されたように、
血清中のメチルマロン酸のほとんどが未知の通路を経て
代謝されるという考えを支持する。
のメチルマロン酸の平均尿浄化は２８％であり、そして
クレアチニンの浄化に関するヒト血清からのコハク酸の
平均尿浄化は１３％であると、計算された。この他の観
察は、〔メチル−14Ｃ〕メチルマロン酸をラットに心臓
内注射により投与した実験において観察されたように、
血清中のメチルマロン酸のほとんどが未知の通路を経て
代謝されるという考えを支持する。
【００８６】われわれの研究は de Jongらの示唆を支持
する。なぜなら、ある数のジカルボン酸のｔ−ブチルジ
メチルシリル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラ
フィーおよび質量分析の性質をもつことをわれわれは示
したからである。最初に、誘導体化の程度の変動および
加水分解の不安定性のための重大な性質の問題にわれわ
れは直面したが、これらの問題は、誘導体化試薬とし
て、 de Jongらが利用したｔ−ブチルジメチルクロロシ
ラン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／イミダゾールの
混合物の代わりに、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）トリフルオロアセトアミドを使用すること
によって解決された。この改良は、また、カルボキシル
基またはとくに加水分解されやすい他の基を含有する生
物学的に興味ある他の化合物のｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体を調整しかつ定量するために、そして他のアミ
ノ酸の誘導体化および定量に応用できる。
する。なぜなら、ある数のジカルボン酸のｔ−ブチルジ
メチルシリル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラ
フィーおよび質量分析の性質をもつことをわれわれは示
したからである。最初に、誘導体化の程度の変動および
加水分解の不安定性のための重大な性質の問題にわれわ
れは直面したが、これらの問題は、誘導体化試薬とし
て、 de Jongらが利用したｔ−ブチルジメチルクロロシ
ラン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／イミダゾールの
混合物の代わりに、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）トリフルオロアセトアミドを使用すること
によって解決された。この改良は、また、カルボキシル
基またはとくに加水分解されやすい他の基を含有する生
物学的に興味ある他の化合物のｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体を調整しかつ定量するために、そして他のアミ
ノ酸の誘導体化および定量に応用できる。
【００８７】われわれは、正常のヒトおよびラットから
の血清中のメチルマロン酸を検出しかつ定量する技術を
開発した。われわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン
酸の正常範囲を規定し、そしてわれわれの値は、一般
に、他のガスクロマトグラフィー−質量分析技術を用い
て得られた値と一致する。われわれの方法は、また、血
清および尿中のマロン酸、ジメチルマロン酸、エチルマ
ロン酸、メチルコハク酸、グルタル酸、および他のジカ
ルボン酸を定量するために適するが、各ジカルボン酸に
ついて適当に安定なアイソトープ内部標準を利用して最
適な定量の精度を保証すべきである。
の血清中のメチルマロン酸を検出しかつ定量する技術を
開発した。われわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン
酸の正常範囲を規定し、そしてわれわれの値は、一般
に、他のガスクロマトグラフィー−質量分析技術を用い
て得られた値と一致する。われわれの方法は、また、血
清および尿中のマロン酸、ジメチルマロン酸、エチルマ
ロン酸、メチルコハク酸、グルタル酸、および他のジカ
ルボン酸を定量するために適するが、各ジカルボン酸に
ついて適当に安定なアイソトープ内部標準を利用して最
適な定量の精度を保証すべきである。
【００８８】ヒト血清中のメチルマロン酸を測定する感
度の高い特異的な方法の利用可能性は、次のものを包含
する、ある数の臨床学的応用を有する：（ｉ）確証され
たコバラミンの欠乏を有する患者における血清メチルマ
ロン酸についての増大した値の発生の決定、（ii）血清
コバラミンのアッセイの診断的感度および特異性を評価
するために、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い
正常レベルをもつ患者の血清のメチルマロン酸のレベル
の決定、および（iii)種々の神経精神学的異常をもつ患
者の血清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発
生をよりよく定めるために、これらの群におけるメチル
マロン酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸
のアッセイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段
であり、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチル
マロン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバ
ラミン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研
究において有用であり、これらの物質はコバラミンの代
謝および利用の種々な面を妨害する。
度の高い特異的な方法の利用可能性は、次のものを包含
する、ある数の臨床学的応用を有する：（ｉ）確証され
たコバラミンの欠乏を有する患者における血清メチルマ
ロン酸についての増大した値の発生の決定、（ii）血清
コバラミンのアッセイの診断的感度および特異性を評価
するために、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い
正常レベルをもつ患者の血清のメチルマロン酸のレベル
の決定、および（iii)種々の神経精神学的異常をもつ患
者の血清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発
生をよりよく定めるために、これらの群におけるメチル
マロン酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸
のアッセイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段
であり、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチル
マロン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバ
ラミン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研
究において有用であり、これらの物質はコバラミンの代
謝および利用の種々な面を妨害する。
【００８９】実施例Ｖコバラミンの欠乏をもつ患者の血清中のメチルマロン酸
のアッセイ １８〜６５才の年令の範囲の５０人の正常血液共与者、
２５人の男性および２５人の女性、からの血清試料を実
施例IIに記載するようにして得た。患者の試料は、過去
１５年にわたって集成された広範囲の血清収集物から選
択した。コバラミン（Ｃｂｌ）欠乏の診断は、低い血清
Ｃｂｌレベル、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な血液学
的または神経学的異常、および非経口的化合物ゲルを使
用する処置に対する応答に基づいた。悪性の貧血の診断
は異常なシリング(Schilling) テストに基づいた〔参
照、例えば、Beck, W.S., Hematology (W.J.Williams,
E.Beutler, A.J.Ersler およびM.A.Lichtman編) (McGra
w-Hill Book Co., New York,1983), pp.444−445 〕に
基づき、このテストは血清中の外因性固有因子および／
または抗固有因子遮断抗体の存在について補正した。葉
酸塩の欠乏の診断は、低い血清葉酸塩値、正常または増
大した血清Ｃｂｌ値、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な
血液学的異常、およびアルコール中毒症および劣った食
物の経歴に基づいた。Ｃｂｌ欠乏の頻繁な処置群におけ
る試料を、悪性貧血をもつ患者から得、前記患者は前述
のように前もってＣｂｌ欠乏と診断されているが、屈従
が劣るため６〜９か月の間隔であるいはＣｂｌ要求の他
の研究の一部として非経口的Ｃｂｌの間欠的処置のみを
受けた患者であった。患者は血清Ｃｂｌレベルについて
低い、基線の、あるいは正常のレベルを有し、血液学的
および神経学的異常に欠け、そして試料を収集すると
き、無症候性であった。血清Ｃｂｌレベルは、レクトバ
シルス・レイキマンニ (Lactobacillus leichimannii）
法〔参照、例えば、Matthews, D.M., Clin.Science 22
: 101 (1962)〕あるいは固有因子のためにＣｂｌ結合
活性の９５％より多くをもつ、精製した固有因子または
胃液を利用するある数の放射線希釈アッセイ〔Kolhous
e, J.F., H.Kondo, H.C.Allen, E.Podellおよび R.H.Al
len, N.Eng.J.Med. 299 : 785−792 (1978)〕を使用し
てアッセイした。血清葉酸塩は、レクトバシルス・カセ
イ (Lactobacillus casei) 法〔Goulian, M. およびW.
S.Geck, Am.J.Clin.Path. 46：390 (1966)〕またはミル
ク結合放射線希釈アッセイ〔Rohenberg, S.P. et al.,
N.Eng.J.Med. 286：1335 (1972) 〕を使用してアッセイ
した。患者の試料のすべては、患者が属するカテゴリー
および各カテゴリーにおける患者の数がメチルマロン酸
およびコハク酸のアッセイの実施に参加する人員が知ら
ないように、ある数字でコード化した。
のアッセイ １８〜６５才の年令の範囲の５０人の正常血液共与者、
２５人の男性および２５人の女性、からの血清試料を実
施例IIに記載するようにして得た。患者の試料は、過去
１５年にわたって集成された広範囲の血清収集物から選
択した。コバラミン（Ｃｂｌ）欠乏の診断は、低い血清
Ｃｂｌレベル、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な血液学
的または神経学的異常、および非経口的化合物ゲルを使
用する処置に対する応答に基づいた。悪性の貧血の診断
は異常なシリング(Schilling) テストに基づいた〔参
照、例えば、Beck, W.S., Hematology (W.J.Williams,
E.Beutler, A.J.Ersler およびM.A.Lichtman編) (McGra
w-Hill Book Co., New York,1983), pp.444−445 〕に
基づき、このテストは血清中の外因性固有因子および／
または抗固有因子遮断抗体の存在について補正した。葉
酸塩の欠乏の診断は、低い血清葉酸塩値、正常または増
大した血清Ｃｂｌ値、巨大赤芽球性骨髄の形態、適当な
血液学的異常、およびアルコール中毒症および劣った食
物の経歴に基づいた。Ｃｂｌ欠乏の頻繁な処置群におけ
る試料を、悪性貧血をもつ患者から得、前記患者は前述
のように前もってＣｂｌ欠乏と診断されているが、屈従
が劣るため６〜９か月の間隔であるいはＣｂｌ要求の他
の研究の一部として非経口的Ｃｂｌの間欠的処置のみを
受けた患者であった。患者は血清Ｃｂｌレベルについて
低い、基線の、あるいは正常のレベルを有し、血液学的
および神経学的異常に欠け、そして試料を収集すると
き、無症候性であった。血清Ｃｂｌレベルは、レクトバ
シルス・レイキマンニ (Lactobacillus leichimannii）
法〔参照、例えば、Matthews, D.M., Clin.Science 22
: 101 (1962)〕あるいは固有因子のためにＣｂｌ結合
活性の９５％より多くをもつ、精製した固有因子または
胃液を利用するある数の放射線希釈アッセイ〔Kolhous
e, J.F., H.Kondo, H.C.Allen, E.Podellおよび R.H.Al
len, N.Eng.J.Med. 299 : 785−792 (1978)〕を使用し
てアッセイした。血清葉酸塩は、レクトバシルス・カセ
イ (Lactobacillus casei) 法〔Goulian, M. およびW.
S.Geck, Am.J.Clin.Path. 46：390 (1966)〕またはミル
ク結合放射線希釈アッセイ〔Rohenberg, S.P. et al.,
N.Eng.J.Med. 286：1335 (1972) 〕を使用してアッセイ
した。患者の試料のすべては、患者が属するカテゴリー
および各カテゴリーにおける患者の数がメチルマロン酸
およびコハク酸のアッセイの実施に参加する人員が知ら
ないように、ある数字でコード化した。
【００９０】ある数の因子を、血清のメチルマロン酸お
よびコハク酸との可能な関係について個々に検査した。
明確な因子、例えば、性、人種および診断について、ウ
ィルコキソン (Wilcoxon) ２試料テスト〔Steel, R.G.
D. およびJ.H.Torrie, Principles and Procedures of
Statistics (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York,1
960)〕を使用して関係の有意性を決定した。神経学的過
酷さとの可能な関係を評価するために、群０，１および
２（表１おいて定義する）を組み合わせ、そして組み合
わせた群３および４と比較した。連続的である因子、例
えば、年令または平均の血球体積（ＭＣＶ）は、スピア
マン(Speaman) 相関関係係数〔Steel, supra〕を使用し
て検査した。結果を表１〜表４に記載する。
よびコハク酸との可能な関係について個々に検査した。
明確な因子、例えば、性、人種および診断について、ウ
ィルコキソン (Wilcoxon) ２試料テスト〔Steel, R.G.
D. およびJ.H.Torrie, Principles and Procedures of
Statistics (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York,1
960)〕を使用して関係の有意性を決定した。神経学的過
酷さとの可能な関係を評価するために、群０，１および
２（表１おいて定義する）を組み合わせ、そして組み合
わせた群３および４と比較した。連続的である因子、例
えば、年令または平均の血球体積（ＭＣＶ）は、スピア
マン(Speaman) 相関関係係数〔Steel, supra〕を使用し
て検査した。結果を表１〜表４に記載する。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
【００９３】
【表３】
【００９４】
【表４】
【００９５】種々のカテゴリーにおいて正常の被検者お
よび患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸に
ついて得られた値は図５に示されており、ここで血清メ
チルマロン酸のレベル（下）および血清コハク酸（上）
は臨床的に確証されたＣｂｌ欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ
患者、そして血液学的または神経学的異常をもたない、
Ｃｂｌ欠乏の処置を頻繁にした患者について記載されて
いる。正常範囲はメチルマロン酸について１９〜７６ng
／mlであり、そしてコハク酸について５８０〜２４２０
ng／mlである。範囲は、より高い値へのひずみについて
補正するため対数変換後、±２ S.D. として計算した。
Ｃｂｌ欠乏分において、７３人の患者のうち６９人は、
１９〜７６ng／mlの正常範囲より上であるメチルマロン
酸についての値を有した。最高の値は２２，３００ng／
mlであり、そしてメジアン値は１，１００ng／mlであっ
た。１６人の葉酸塩の欠乏の患者のうち５人は、おだや
かな血清メチルマロン酸の増加を有し、最高の値は１４
０ng／mlであった。血液学的および神経学的異常をもた
ないＣｂｌ欠乏の頻繁な処置を受けた患者からの１５試
料のうち７は、１７５ng／ml程度に高い範囲の増大した
値を有した。これらの７試料のうち、血清L.lichmannii
Ｃｂｌ濃度は６つにおいて低く（８８〜１６５pg／m
l）そして１つにおいて正常（２７５pg／ml）であっ
た。すべての７試料は、精製した固有因子を使用する放
射線希釈アッセイに従い低いＣｂｌ値（８５〜１５５pg
／ml）を与えた。正常のメチルマロン酸レベルをもつ８
試料のうち、血清L.lichmannii Ｃｂｌは４つにおいて
低かった。
よび患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸に
ついて得られた値は図５に示されており、ここで血清メ
チルマロン酸のレベル（下）および血清コハク酸（上）
は臨床的に確証されたＣｂｌ欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ
患者、そして血液学的または神経学的異常をもたない、
Ｃｂｌ欠乏の処置を頻繁にした患者について記載されて
いる。正常範囲はメチルマロン酸について１９〜７６ng
／mlであり、そしてコハク酸について５８０〜２４２０
ng／mlである。範囲は、より高い値へのひずみについて
補正するため対数変換後、±２ S.D. として計算した。
Ｃｂｌ欠乏分において、７３人の患者のうち６９人は、
１９〜７６ng／mlの正常範囲より上であるメチルマロン
酸についての値を有した。最高の値は２２，３００ng／
mlであり、そしてメジアン値は１，１００ng／mlであっ
た。１６人の葉酸塩の欠乏の患者のうち５人は、おだや
かな血清メチルマロン酸の増加を有し、最高の値は１４
０ng／mlであった。血液学的および神経学的異常をもた
ないＣｂｌ欠乏の頻繁な処置を受けた患者からの１５試
料のうち７は、１７５ng／ml程度に高い範囲の増大した
値を有した。これらの７試料のうち、血清L.lichmannii
Ｃｂｌ濃度は６つにおいて低く（８８〜１６５pg／m
l）そして１つにおいて正常（２７５pg／ml）であっ
た。すべての７試料は、精製した固有因子を使用する放
射線希釈アッセイに従い低いＣｂｌ値（８５〜１５５pg
／ml）を与えた。正常のメチルマロン酸レベルをもつ８
試料のうち、血清L.lichmannii Ｃｂｌは４つにおいて
低かった。
【００９６】血清コハク酸についての増大した値は、７
３人Ｃｂｌ欠乏患者のうち１９人、１６人の葉酸塩の欠
乏患者のうち１０人、および１５人のＣｂｌ欠乏の頻繁
な処置を受けた患者の１５人において観測された。これ
らの評価の理由は未知であるが、血清分離前に血液を放
置した時間の変動に関係づけることができるであろう。
なぜなら、血液を遠心前に室温において２４時間放置す
ると、コハク酸についての値は２倍になることがあるか
らである。血清メチルマロン酸についての値は、この時
間にわたって変化しない。
３人Ｃｂｌ欠乏患者のうち１９人、１６人の葉酸塩の欠
乏患者のうち１０人、および１５人のＣｂｌ欠乏の頻繁
な処置を受けた患者の１５人において観測された。これ
らの評価の理由は未知であるが、血清分離前に血液を放
置した時間の変動に関係づけることができるであろう。
なぜなら、血液を遠心前に室温において２４時間放置す
ると、コハク酸についての値は２倍になることがあるか
らである。血清メチルマロン酸についての値は、この時
間にわたって変化しない。
【００９７】Ｃｂｌ欠乏をもつ７３人の患者に関する臨
床的データは表１〜表４に表わされており、ここでデー
タは血清メチルマロン酸のレベルに関して減少する順序
で配置されている。血清メチルマロン酸と血清葉酸塩と
の間に有意な相関関係が存在した（ｒ＝０．４５、Ｐ＜
０．００１）。相関関係は、L.casei 血清葉酸塩法（ｒ
＝０．４６，Ｐ＜０．０１）ならびに放射線アッセイ技
術（ｒ＝０．６６、Ｐ＜０．００１）によって測定した
試料において存在した。より重度の神経学的異常をもつ
患者（群３および４）は、より穏和な異常を有する患者
（群１および２、平均２０８３±２８６６、メジアン８
７９ng／ml）あるいは神経学的関係の証拠をもたない患
者（群０、平均１１５４±１４６８、メジアン４０９ng
／ml）よりも、高い血清メチルマロン酸レベル（平均±
ＳＤ，５０７７±６０７３、メジアン３６８５ng／ml）
を有した（Ｐ＜０．０１、群３および４対群０〜２につ
いて）。
床的データは表１〜表４に表わされており、ここでデー
タは血清メチルマロン酸のレベルに関して減少する順序
で配置されている。血清メチルマロン酸と血清葉酸塩と
の間に有意な相関関係が存在した（ｒ＝０．４５、Ｐ＜
０．００１）。相関関係は、L.casei 血清葉酸塩法（ｒ
＝０．４６，Ｐ＜０．０１）ならびに放射線アッセイ技
術（ｒ＝０．６６、Ｐ＜０．００１）によって測定した
試料において存在した。より重度の神経学的異常をもつ
患者（群３および４）は、より穏和な異常を有する患者
（群１および２、平均２０８３±２８６６、メジアン８
７９ng／ml）あるいは神経学的関係の証拠をもたない患
者（群０、平均１１５４±１４６８、メジアン４０９ng
／ml）よりも、高い血清メチルマロン酸レベル（平均±
ＳＤ，５０７７±６０７３、メジアン３６８５ng／ml）
を有した（Ｐ＜０．０１、群３および４対群０〜２につ
いて）。
【００９８】血清葉酸塩レベルは、神経学的状態に無関
係に血清メチルマロン酸と相関関係を有した（神経学的
疾患をもたない患者においてメチルマロン酸対葉酸塩に
ついてｒ＝０．５８；ｎ＝２７；Ｐ＜０．０１）。血清
葉酸塩濃度はより重度の神経学的異常を有する患者にお
いて高い（平均血清葉酸塩、群３および４、２０．９±
１６．９ng／ml対群０〜２、１０．１±８．７ng／ml、
Ｐ＜０．００５）が、より高い血清メチルマロン酸レベ
ルと進行した神経学的関係との関連性は葉酸塩の状態に
対して独立であるように思われる。血清葉酸塩レベルが
１５ng／mlより低い患者において、平均血清メチルマロ
ン酸は、群３および４において、３１８９±２３１７ng
／ml対群０〜２において、１０３０±１７９５ng／ml、
Ｐ＜０．００５であった；血清葉酸塩は２つの群におい
て有意に異ならなかった（それぞれ、７．５±３．３ng
／ml対６．０±３．８ng／ml、Ｐ＜０．２５）。
係に血清メチルマロン酸と相関関係を有した（神経学的
疾患をもたない患者においてメチルマロン酸対葉酸塩に
ついてｒ＝０．５８；ｎ＝２７；Ｐ＜０．０１）。血清
葉酸塩濃度はより重度の神経学的異常を有する患者にお
いて高い（平均血清葉酸塩、群３および４、２０．９±
１６．９ng／ml対群０〜２、１０．１±８．７ng／ml、
Ｐ＜０．００５）が、より高い血清メチルマロン酸レベ
ルと進行した神経学的関係との関連性は葉酸塩の状態に
対して独立であるように思われる。血清葉酸塩レベルが
１５ng／mlより低い患者において、平均血清メチルマロ
ン酸は、群３および４において、３１８９±２３１７ng
／ml対群０〜２において、１０３０±１７９５ng／ml、
Ｐ＜０．００５であった；血清葉酸塩は２つの群におい
て有意に異ならなかった（それぞれ、７．５±３．３ng
／ml対６．０±３．８ng／ml、Ｐ＜０．２５）。
【００９９】血小板数および血清メチルマロン酸の間に
負の相関関係が存在した（ｒ＝−０．３０；Ｐ＜０．０
５）。しかしながら、より重度の神経学的異常をもつ患
者（群３および４）を分析から除外した場合（ｒ＝−
０．２６；Ｐ＞０．０５）あるいは増大した血清メチル
マロン酸をもつ患者を分析から除外した場合（ｒ＝−
０．２３；Ｐ＞０．０５）、コバラミンはもはや有意で
なかった。悪性の貧血を有する患者はマン−ウィトニイ
(Mann-Whitney) 試験〔Steel, supra〕を用いると、熱
帯性スプルーを有する患者（７１４±１００７、Ｐ＜
０．００４）よりも高い血清メチルマロン酸値（平均、
２９６８±４３８７）を有した；しかしながら、熱帯性
スプルーを有する患者における一般に低い血清葉酸塩値
およびより少ない重度の神経学的関係について補正する
と、差はもはや有意ではなかった。舌炎をもつ患者は舌
の徴候または症候をもたない患者よりも高い血清メチル
マロン酸値を有した；しかしながら、舌炎をもち、７３
人の患者の全体の群についてのメジアンよりも上のメチ
ルマロン酸の血清レベルを有する１８人の患者のうち１
３人は、重度の神経学的関係、増大した血清葉酸塩値、
または両者を有した。
負の相関関係が存在した（ｒ＝−０．３０；Ｐ＜０．０
５）。しかしながら、より重度の神経学的異常をもつ患
者（群３および４）を分析から除外した場合（ｒ＝−
０．２６；Ｐ＞０．０５）あるいは増大した血清メチル
マロン酸をもつ患者を分析から除外した場合（ｒ＝−
０．２３；Ｐ＞０．０５）、コバラミンはもはや有意で
なかった。悪性の貧血を有する患者はマン−ウィトニイ
(Mann-Whitney) 試験〔Steel, supra〕を用いると、熱
帯性スプルーを有する患者（７１４±１００７、Ｐ＜
０．００４）よりも高い血清メチルマロン酸値（平均、
２９６８±４３８７）を有した；しかしながら、熱帯性
スプルーを有する患者における一般に低い血清葉酸塩値
およびより少ない重度の神経学的関係について補正する
と、差はもはや有意ではなかった。舌炎をもつ患者は舌
の徴候または症候をもたない患者よりも高い血清メチル
マロン酸値を有した；しかしながら、舌炎をもち、７３
人の患者の全体の群についてのメジアンよりも上のメチ
ルマロン酸の血清レベルを有する１８人の患者のうち１
３人は、重度の神経学的関係、増大した血清葉酸塩値、
または両者を有した。
【０１００】血清メチルマロン酸は血清Ｃｂｌと相関関
係をもたなかった（すべての患者についてｒ＝−０．０
９；微生物学的アッセイについてｒ＝０．１２；そして
放射線アッセイについてｒ＝−０．０９、各場合におい
てＰ＞０．４）。血清メチルマロン酸は、次のものと有
意な相関関係をもたなかった：ＭＣＶ（ｒ＝０．０７、
Ｐ＞０．０５）、白血球（ｒ＝−０．０８、Ｐ＞０．
３）およびヘマトクリット（ｒ＝−０．１２、Ｐ＞０．
４）。正常ヘマトクリットを有する１２人の患者のすべ
ては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有した（範
囲１１６〜４８００ng／ml）。血清メチルマロン酸と年
令、性別、人種、症候の期間、体重損失の程度、あるい
は鉄、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ビリルビンま
たはアルブミンの血清との間に相関関係は存在しなかっ
た。
係をもたなかった（すべての患者についてｒ＝−０．０
９；微生物学的アッセイについてｒ＝０．１２；そして
放射線アッセイについてｒ＝−０．０９、各場合におい
てＰ＞０．４）。血清メチルマロン酸は、次のものと有
意な相関関係をもたなかった：ＭＣＶ（ｒ＝０．０７、
Ｐ＞０．０５）、白血球（ｒ＝−０．０８、Ｐ＞０．
３）およびヘマトクリット（ｒ＝−０．１２、Ｐ＞０．
４）。正常ヘマトクリットを有する１２人の患者のすべ
ては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有した（範
囲１１６〜４８００ng／ml）。血清メチルマロン酸と年
令、性別、人種、症候の期間、体重損失の程度、あるい
は鉄、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ビリルビンま
たはアルブミンの血清との間に相関関係は存在しなかっ
た。
【０１０１】Ｃｂｌ欠乏を処置されない４人の患者（表
３および表４、 No.７０〜７３）は、正常の範囲内の血
清メチルマロン酸レベルを有した。３人は熱帯性スプル
ーを有した。４人のうち１人は、固有受容および振動の
感覚が傷害されており、神経学的症候をもたなかった。
これらの患者を増大した血清メチルマロン酸濃度をもつ
患者と区別する、臨床的または実験室の特徴は存在しな
かった。
３および表４、 No.７０〜７３）は、正常の範囲内の血
清メチルマロン酸レベルを有した。３人は熱帯性スプル
ーを有した。４人のうち１人は、固有受容および振動の
感覚が傷害されており、神経学的症候をもたなかった。
これらの患者を増大した血清メチルマロン酸濃度をもつ
患者と区別する、臨床的または実験室の特徴は存在しな
かった。
【０１０２】血清コハク酸についての値は、血清メチル
マロン酸を包含する研究したパラメーターのいずれとも
相関関係をもたず、そして有意差は種々の下位群のいず
れの間にも観察されなかった。図６は、診断の時から開
始し、非経口的Ｃｂｌ処置後最初の１３日にわたって続
けられた。古典的悪性貧血をもつ患者における、血清
（−・−）および尿（−−ｏ−−）のメチルマロン酸の
順次のレベルを示す。患者は汎血球減少症、芽細胞の骨
髄腫の所見、４３pg／mlの血清Ｃｂｌ値、血清抗固有因
子遮断抗体、および外因性固有因子について補正した異
常シリングテストを有する３２才の白色人種の男性であ
った。両者の値は処置前顕著に高く、処置後同様な速度
で減少し、そして第１３日に正常の上限のちょうど上に
存在した。これが示唆するように、血清および尿のメチ
ルマロン酸の測定は、Ｃｂｌ欠乏についての診断試験と
して互いに良好に相関関係をもつが、より大きい数の追
加の患者を研究しなければ、精確な結論を出すことはで
きないであろう。
マロン酸を包含する研究したパラメーターのいずれとも
相関関係をもたず、そして有意差は種々の下位群のいず
れの間にも観察されなかった。図６は、診断の時から開
始し、非経口的Ｃｂｌ処置後最初の１３日にわたって続
けられた。古典的悪性貧血をもつ患者における、血清
（−・−）および尿（−−ｏ−−）のメチルマロン酸の
順次のレベルを示す。患者は汎血球減少症、芽細胞の骨
髄腫の所見、４３pg／mlの血清Ｃｂｌ値、血清抗固有因
子遮断抗体、および外因性固有因子について補正した異
常シリングテストを有する３２才の白色人種の男性であ
った。両者の値は処置前顕著に高く、処置後同様な速度
で減少し、そして第１３日に正常の上限のちょうど上に
存在した。これが示唆するように、血清および尿のメチ
ルマロン酸の測定は、Ｃｂｌ欠乏についての診断試験と
して互いに良好に相関関係をもつが、より大きい数の追
加の患者を研究しなければ、精確な結論を出すことはで
きないであろう。
【０１０３】表５は、増大した血清メチルマロン酸が低
い血清Ｃｂｌレベルに先行した、９５才の白色人種の女
性に関するデータを含む。
い血清Ｃｂｌレベルに先行した、９５才の白色人種の女
性に関するデータを含む。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】１９８２年９月において、彼女は無症候と
なったが、血清Ｃｂｌ葉酸塩のアッセイの導く１０５と
いうＭＣＶを有し、それは正常値を与えた。この血清を
ほぼ１年間貯蔵し、その間メチルマロン酸のアッセイが
開発されつつあり、そしてそれを最後に１９８３年８月
にアッセイしたとき、２６９ng／mlの増大した値が得ら
れた。１９８３年８月に、１９８２年８月の試料につい
て血清Ｃｂｌおよび血清葉酸塩を再びアッセイすると、
これらは再び正常であり、そして抗固有因子遮断抗体を
アッセイし、そして前記抗体は存在することが発見され
た。１９８３年８月において、患者をクリニックに再び
呼び、ここで彼女のＭＣＶは本質的に不変化であった。
血清メチルマロン酸レベルは、なお、３３８ng／mlで高
く、そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、
血清Ｃｂｌレベルは、ここで、顕著に減少していた。Ｃ
ｂｌの注射後３週で、血清および尿のメチルマロン酸レ
ベルは正常範囲内に低下したが、１年後再検査したと
き、ＭＣＶは９４であった。いずれの時も神経精神学的
症候は認められなかった。高い不飽和のＣｂｌ結合容量
はこの患者について証明できるように思われなかった。
なぜなら、彼女の白血球の数は決して（１９８２年９月
〜１９８３年中頃）高くならず、そして彼女の不飽和Ｃ
ｂｌ結合能力はＣｂｌ処置の直前（１９８３年８月２３
日）において正常（２．１ng／ml）であったからであ
る。不都合なことには、Ｃｂｌ結合容量は１９８２年９
月の血清について測定しなかった。
なったが、血清Ｃｂｌ葉酸塩のアッセイの導く１０５と
いうＭＣＶを有し、それは正常値を与えた。この血清を
ほぼ１年間貯蔵し、その間メチルマロン酸のアッセイが
開発されつつあり、そしてそれを最後に１９８３年８月
にアッセイしたとき、２６９ng／mlの増大した値が得ら
れた。１９８３年８月に、１９８２年８月の試料につい
て血清Ｃｂｌおよび血清葉酸塩を再びアッセイすると、
これらは再び正常であり、そして抗固有因子遮断抗体を
アッセイし、そして前記抗体は存在することが発見され
た。１９８３年８月において、患者をクリニックに再び
呼び、ここで彼女のＭＣＶは本質的に不変化であった。
血清メチルマロン酸レベルは、なお、３３８ng／mlで高
く、そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、
血清Ｃｂｌレベルは、ここで、顕著に減少していた。Ｃ
ｂｌの注射後３週で、血清および尿のメチルマロン酸レ
ベルは正常範囲内に低下したが、１年後再検査したと
き、ＭＣＶは９４であった。いずれの時も神経精神学的
症候は認められなかった。高い不飽和のＣｂｌ結合容量
はこの患者について証明できるように思われなかった。
なぜなら、彼女の白血球の数は決して（１９８２年９月
〜１９８３年中頃）高くならず、そして彼女の不飽和Ｃ
ｂｌ結合能力はＣｂｌ処置の直前（１９８３年８月２３
日）において正常（２．１ng／ml）であったからであ
る。不都合なことには、Ｃｂｌ結合容量は１９８２年９
月の血清について測定しなかった。
【０１０６】われわれの研究が立証するように、血清中
のメチルマロン酸のアッセイはＣｂｌ欠乏の患者におい
て有用な情報を提供する。臨床的に確証されたＣｂｌ欠
乏をもつ患者の７３人のうち６９人において、および血
液学的または神経学的異常に欠ける、Ｃｂｌ欠乏につい
て頻繁に処置された群からの試料の１５のうち７におい
て、血清メチルマロン酸レベルが増大していたという事
実は、その感度が血清Ｃｂｌレベルのそれに類似しうる
ことを示唆していたが、血清Ｃｂｌについて基線のおよ
び低い正常値をもつ患者の研究を実施した後、２つのア
ッセイの比較をしなくてはならないであろう。血清メチ
ルマロン酸の中程度の増大が低い血清Ｃｂｌレベルの発
現に先行する患者をわれわれが観察したという事実は、
血清メチルマロン酸レベルが血清Ｃｂｌレベルが先行し
ない、少なくともある患者においてＣｂｌ欠乏を正しく
検出できるであろうことを示唆する。こうして、血清メ
チルマロン酸のアッセイおよび血清Ｃｂｌのアッセイは
互いに相補的であり、そして両者のアッセイは、いずれ
かを単独で用いて可能であるよりも、いっそう完全な方
法で、種々の患者の個体群におけるＣｂｌ欠乏の真の発
生を定めることを可能とするように思われる。Ｃｂｌ欠
乏についての血清メチルマロン酸の特異性は、欠乏の臨
床的証拠をもたないか、あるいはＣｂｌのバランスに影
響を及ぼす潜在的条件の臨床的証拠をもたない患者にお
いて、しばしば低い血清Ｃｂｌ値のそれよりも大きいこ
とを立証できる。また、Ｃｂｌおよび葉酸塩の両者の血
清が正常値より低い、巨大赤芽球性貧血をもつ患者の評
価において、この試験は有用であることを証明できる。
のメチルマロン酸のアッセイはＣｂｌ欠乏の患者におい
て有用な情報を提供する。臨床的に確証されたＣｂｌ欠
乏をもつ患者の７３人のうち６９人において、および血
液学的または神経学的異常に欠ける、Ｃｂｌ欠乏につい
て頻繁に処置された群からの試料の１５のうち７におい
て、血清メチルマロン酸レベルが増大していたという事
実は、その感度が血清Ｃｂｌレベルのそれに類似しうる
ことを示唆していたが、血清Ｃｂｌについて基線のおよ
び低い正常値をもつ患者の研究を実施した後、２つのア
ッセイの比較をしなくてはならないであろう。血清メチ
ルマロン酸の中程度の増大が低い血清Ｃｂｌレベルの発
現に先行する患者をわれわれが観察したという事実は、
血清メチルマロン酸レベルが血清Ｃｂｌレベルが先行し
ない、少なくともある患者においてＣｂｌ欠乏を正しく
検出できるであろうことを示唆する。こうして、血清メ
チルマロン酸のアッセイおよび血清Ｃｂｌのアッセイは
互いに相補的であり、そして両者のアッセイは、いずれ
かを単独で用いて可能であるよりも、いっそう完全な方
法で、種々の患者の個体群におけるＣｂｌ欠乏の真の発
生を定めることを可能とするように思われる。Ｃｂｌ欠
乏についての血清メチルマロン酸の特異性は、欠乏の臨
床的証拠をもたないか、あるいはＣｂｌのバランスに影
響を及ぼす潜在的条件の臨床的証拠をもたない患者にお
いて、しばしば低い血清Ｃｂｌ値のそれよりも大きいこ
とを立証できる。また、Ｃｂｌおよび葉酸塩の両者の血
清が正常値より低い、巨大赤芽球性貧血をもつ患者の評
価において、この試験は有用であることを証明できる。
【０１０７】血清メチルマロン酸のレベルは、血清Ｃｂ
ｌが共有しない１つの利点を有し、Ｃｂｌ欠乏が疑われ
る患者をＣｂｌで処置し、そして血清メチルマロン酸レ
ベルの効果を観測できる。このような処置が血清メチル
マロン酸レベルを高い範囲から正常範囲から正常範囲に
低下する場合、これは、この報告において詳述した患者
の場合におけるように、患者がＣｂｌ欠乏であるとい
う、強い推定上の証拠である。この利点は血清Ｃｂｌレ
ベルは共有しない。なぜなら、血清Ｃｂｌレベルは、患
者がＣｂｌ欠乏であるか否かに無関係に、Ｃｂｌの非経
口的注射後、本質的に常に高いかあるいは少なくとも正
常であるからである。
ｌが共有しない１つの利点を有し、Ｃｂｌ欠乏が疑われ
る患者をＣｂｌで処置し、そして血清メチルマロン酸レ
ベルの効果を観測できる。このような処置が血清メチル
マロン酸レベルを高い範囲から正常範囲から正常範囲に
低下する場合、これは、この報告において詳述した患者
の場合におけるように、患者がＣｂｌ欠乏であるとい
う、強い推定上の証拠である。この利点は血清Ｃｂｌレ
ベルは共有しない。なぜなら、血清Ｃｂｌレベルは、患
者がＣｂｌ欠乏であるか否かに無関係に、Ｃｂｌの非経
口的注射後、本質的に常に高いかあるいは少なくとも正
常であるからである。
【０１０８】正常の血清Ｃｂｌレベルを有する１６人の
葉酸塩の欠乏患者のうち５人において、緩和であるが、
有意に高い血清メチルマロン酸が観測された。５人の患
者のうち２人は肝腫および／または異常肝機能の試験を
受けており、そして３人は肝臓の病気の証拠をもたなか
った。尿メチルマロン酸の測定を含む研究は、また、葉
酸塩の欠乏を有する数人の患者におけるおだやかな増加
を示したが、これが、おだやかな同時にＣｂｌの欠乏に
よるか、あるいは他の未知の原因によるかどうかは、未
知である。最近の研究は、種々の組織中のＣｂｌの量が
両者のＣｂｌ依存性酵素を飽和するためには不十分であ
ることを示した。葉酸塩の欠乏において、メチオニンに
結合したＣｂｌの量を増加することによって、メチオニ
ンシンセターゼ活性のレベルを増大する試みは行なうこ
とが可能であり、その結果Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡ
ムターゼに結合したＣｂｌの量は減少し、そしてこれは
順番にメチルマロン酸の患者形成を増大する（表１〜表
４参照）。
葉酸塩の欠乏患者のうち５人において、緩和であるが、
有意に高い血清メチルマロン酸が観測された。５人の患
者のうち２人は肝腫および／または異常肝機能の試験を
受けており、そして３人は肝臓の病気の証拠をもたなか
った。尿メチルマロン酸の測定を含む研究は、また、葉
酸塩の欠乏を有する数人の患者におけるおだやかな増加
を示したが、これが、おだやかな同時にＣｂｌの欠乏に
よるか、あるいは他の未知の原因によるかどうかは、未
知である。最近の研究は、種々の組織中のＣｂｌの量が
両者のＣｂｌ依存性酵素を飽和するためには不十分であ
ることを示した。葉酸塩の欠乏において、メチオニンに
結合したＣｂｌの量を増加することによって、メチオニ
ンシンセターゼ活性のレベルを増大する試みは行なうこ
とが可能であり、その結果Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡ
ムターゼに結合したＣｂｌの量は減少し、そしてこれは
順番にメチルマロン酸の患者形成を増大する（表１〜表
４参照）。
【０１０９】血清メチルマロン酸は、Ｃｂｌ欠乏患者の
群において血清Ｃｂｌのレベルと相関関係をもたなかっ
た。Ｃｂｌレベルと尿メチルマロン酸のレベルとの相関
関係は、前にある研究において観測されたが、他の研究
において観測されなかった。血清メチルマロン酸と血液
学的パラメーターのいずれかとの相関関係を発見できな
かったことは、血小板との弱い逆の関係を除外して、尿
メチルマロン酸のレベルを用いる研究と一致する。
群において血清Ｃｂｌのレベルと相関関係をもたなかっ
た。Ｃｂｌレベルと尿メチルマロン酸のレベルとの相関
関係は、前にある研究において観測されたが、他の研究
において観測されなかった。血清メチルマロン酸と血液
学的パラメーターのいずれかとの相関関係を発見できな
かったことは、血小板との弱い逆の関係を除外して、尿
メチルマロン酸のレベルを用いる研究と一致する。
【０１１０】神経学的異常を有する少数の患者を研究す
る従来の研究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相
関関係を発見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかっ
た。われわれ大きい系列の患者における血清メチルマロ
ン酸レベルと神経学的異常の存在との間の積極的の相関
関係は、興味あることである。なぜなら、Ｃｂｌ欠乏に
おける神経学的異常の原因となる生物学的機構は、な
お、未知であるからであ。血清葉酸塩レベルと血清メチ
ルマロン酸レベルとの間の積極的の相関関係は、また、
尿メチルマロン酸レベルの研究において認められてきて
いなかった。この相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の
食事をする患者が、多分Ｃｂｌ欠乏の診断を遅延させ
る、より少ない血液学的異常を有しうるという事実のた
めであろう。しかしながら、血清葉酸塩が血液学的パラ
メーターと積極的に相関関係をもたなかったという事実
は、これを本当らしくなくする。また、ある未知の代謝
または調節の関係は、Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡムタ
ーゼとメチオニンシンセターゼとの間に、それらの両者
が活性のためにＣｂｌを必要とするという事実に加え
て、存在することが可能である。
る従来の研究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相
関関係を発見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかっ
た。われわれ大きい系列の患者における血清メチルマロ
ン酸レベルと神経学的異常の存在との間の積極的の相関
関係は、興味あることである。なぜなら、Ｃｂｌ欠乏に
おける神経学的異常の原因となる生物学的機構は、な
お、未知であるからであ。血清葉酸塩レベルと血清メチ
ルマロン酸レベルとの間の積極的の相関関係は、また、
尿メチルマロン酸レベルの研究において認められてきて
いなかった。この相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の
食事をする患者が、多分Ｃｂｌ欠乏の診断を遅延させ
る、より少ない血液学的異常を有しうるという事実のた
めであろう。しかしながら、血清葉酸塩が血液学的パラ
メーターと積極的に相関関係をもたなかったという事実
は、これを本当らしくなくする。また、ある未知の代謝
または調節の関係は、Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡムタ
ーゼとメチオニンシンセターゼとの間に、それらの両者
が活性のためにＣｂｌを必要とするという事実に加え
て、存在することが可能である。
【０１１１】表１〜表４から明らかなように、コバラミ
ンの欠乏の患者の多くは貧血ではなく、あるいは適度に
貧血であり、大赤血球症でなく、あるいは適度に大赤血
球症であり、そして１００pg／mlより著しく減少した血
清Ｃｂｌレベルをもたなかった。これらの観測は、医学
分野における専門家の現在の信念および教示と一致し
（上を参照）、そして次の実施例の終りにおいて詳述す
る。
ンの欠乏の患者の多くは貧血ではなく、あるいは適度に
貧血であり、大赤血球症でなく、あるいは適度に大赤血
球症であり、そして１００pg／mlより著しく減少した血
清Ｃｂｌレベルをもたなかった。これらの観測は、医学
分野における専門家の現在の信念および教示と一致し
（上を参照）、そして次の実施例の終りにおいて詳述す
る。
【０１１２】実施例VIコバラミンの欠乏および葉酸塩の欠乏の診断および区別
における合計ホモシステイン単独のアッセイおよび組み
合わせたホモシステイン−メチルマロン酸のアッセイの
使用 確証されたＣｂｌ欠乏をもつ７８人の患者および確証さ
れた葉酸塩の欠乏をもつ１９人の患者からの血清を、実
施例Ｖに記載するように血清Ｃｂｌおよび血清葉酸塩に
ついて、実施例IVに記載するように血清メチルマロン酸
について、および実施例 IIIに記載するようにして血清
メチオニン、血清システインおよび血清ホモシステイン
について試験した。結果を表６〜表１０に記載する。
における合計ホモシステイン単独のアッセイおよび組み
合わせたホモシステイン−メチルマロン酸のアッセイの
使用 確証されたＣｂｌ欠乏をもつ７８人の患者および確証さ
れた葉酸塩の欠乏をもつ１９人の患者からの血清を、実
施例Ｖに記載するように血清Ｃｂｌおよび血清葉酸塩に
ついて、実施例IVに記載するように血清メチルマロン酸
について、および実施例 IIIに記載するようにして血清
メチオニン、血清システインおよび血清ホモシステイン
について試験した。結果を表６〜表１０に記載する。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
【表８】
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
【表１０】
【０１１８】表６〜表１０における患者の全部ではない
が、あるものは表１〜表２にも示されている。血清ホモ
システインは、コバラミンの欠乏をもつ患者の７７／７
８（９９％）および葉酸塩の欠乏をもつ患者の１８／１
９（９５％）において増大していた（正常７〜２２μモ
ル／１）。コバラミンの欠乏の患者において、血清メチ
ルマロン酸は７４／７８（９５％）において増大した
（正常１９／７６pg／ml）。正常血清メチルマロン酸レ
ベルをもつコバラミンの欠乏患者の３人において、血清
合計ホモシステインは増大し（範囲３４〜９３μモル／
１）そして１人のみの患者は正常範囲の血清アセトニト
リルおよび血清合成ホモシステインの両者を有した。葉
酸塩の欠乏の患者において、５／１９（２６％）は血清
メチルマロン酸のおだやかな増加を示した（範囲９２〜
１９５ng／ml）。血清メチオニンレベルはコバラミンま
たは葉酸塩の欠乏の診断において有用でなかった。なぜ
なら、わずかに２／７８（３％）のコバラミンの欠乏患
者が低いレベルを有し、そして葉酸塩の欠乏患者は低い
レベルをもたなかったからである（正常範囲１４〜４４
μモル／１）。さらに、血清の合計システインレベルは
診断的に有用でなかった。なぜなら、わずかに６／７８
（８％）のコバラミンの欠乏患者がおだやかな増加を有
し、そしてわずかに１／１９（５％）の葉酸塩の欠乏患
者が増大した値を有したからである（正常範囲１７４〜
３７８μモル／１）。
が、あるものは表１〜表２にも示されている。血清ホモ
システインは、コバラミンの欠乏をもつ患者の７７／７
８（９９％）および葉酸塩の欠乏をもつ患者の１８／１
９（９５％）において増大していた（正常７〜２２μモ
ル／１）。コバラミンの欠乏の患者において、血清メチ
ルマロン酸は７４／７８（９５％）において増大した
（正常１９／７６pg／ml）。正常血清メチルマロン酸レ
ベルをもつコバラミンの欠乏患者の３人において、血清
合計ホモシステインは増大し（範囲３４〜９３μモル／
１）そして１人のみの患者は正常範囲の血清アセトニト
リルおよび血清合成ホモシステインの両者を有した。葉
酸塩の欠乏の患者において、５／１９（２６％）は血清
メチルマロン酸のおだやかな増加を示した（範囲９２〜
１９５ng／ml）。血清メチオニンレベルはコバラミンま
たは葉酸塩の欠乏の診断において有用でなかった。なぜ
なら、わずかに２／７８（３％）のコバラミンの欠乏患
者が低いレベルを有し、そして葉酸塩の欠乏患者は低い
レベルをもたなかったからである（正常範囲１４〜４４
μモル／１）。さらに、血清の合計システインレベルは
診断的に有用でなかった。なぜなら、わずかに６／７８
（８％）のコバラミンの欠乏患者がおだやかな増加を有
し、そしてわずかに１／１９（５％）の葉酸塩の欠乏患
者が増大した値を有したからである（正常範囲１７４〜
３７８μモル／１）。
【０１１９】表６〜表１０から理解できるように、わず
かに３２／７８（４１％）の患者は適度に重度の貧血を
有し（Ｈｃｔ＜２５％）、２８／７８（３６％）は適度
の貧血を有し（２５〜３４％女性、２５〜３９％男
性）、そして１８／７８（２３％）はまったく貧血では
なかった。わずかに４５／７８（５８％）はＭＣＶの顕
著な増大を有し（＞１１０fl) 、２４／７８（３１％）
はＭＣＶの穏和な増大を有し（１０１〜１１０fl) 、そ
して９／７８（１１％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００
fl) を有した。コバラミンの血清レベルは、わずかに４
８／７８（６２％）の患者において顕著に減少し（＜１
００pg／ml）そして３０／７８（３８％）の患者におい
てほんの適度に（１００〜２００pg／ml）減少した。こ
うして、コバラミンの欠乏において見出されるスペクト
ルは、従来信じられていたよりも非常に広く、そして診
断を実施するためには、適度に重度の貧血、顕著に低下
した血清コバラミンレベルおよび顕著に増大したＭＣＶ
の発見に頼ることはできない。しかしながら、これらの
患者において血清合計ホモシステインを単独で、あるい
は血清メチルマロン酸と組み合わせて測定することによ
って、コバラミンの欠乏がＨｃｔ，ＭＣＶおよび血清コ
バラミンレベルにおいて適度な異常または異常の不存在
と関連性があるときでさえ、コバラミンの欠乏の診断を
確立することができる。他のアミノ酸、例えば、血清メ
チオニンまたは合計システインの測定は、血清メチオニ
ンがコバラミンの欠乏の患者において低いという早期の
教示〔参照、例えば、Parry, T.E., Brit.J.Haemat. 1
6::221 (1969)〕にかかわらず、コバラミンの欠乏にお
いて診断的に有用であることが示されなかった。
かに３２／７８（４１％）の患者は適度に重度の貧血を
有し（Ｈｃｔ＜２５％）、２８／７８（３６％）は適度
の貧血を有し（２５〜３４％女性、２５〜３９％男
性）、そして１８／７８（２３％）はまったく貧血では
なかった。わずかに４５／７８（５８％）はＭＣＶの顕
著な増大を有し（＞１１０fl) 、２４／７８（３１％）
はＭＣＶの穏和な増大を有し（１０１〜１１０fl) 、そ
して９／７８（１１％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００
fl) を有した。コバラミンの血清レベルは、わずかに４
８／７８（６２％）の患者において顕著に減少し（＜１
００pg／ml）そして３０／７８（３８％）の患者におい
てほんの適度に（１００〜２００pg／ml）減少した。こ
うして、コバラミンの欠乏において見出されるスペクト
ルは、従来信じられていたよりも非常に広く、そして診
断を実施するためには、適度に重度の貧血、顕著に低下
した血清コバラミンレベルおよび顕著に増大したＭＣＶ
の発見に頼ることはできない。しかしながら、これらの
患者において血清合計ホモシステインを単独で、あるい
は血清メチルマロン酸と組み合わせて測定することによ
って、コバラミンの欠乏がＨｃｔ，ＭＣＶおよび血清コ
バラミンレベルにおいて適度な異常または異常の不存在
と関連性があるときでさえ、コバラミンの欠乏の診断を
確立することができる。他のアミノ酸、例えば、血清メ
チオニンまたは合計システインの測定は、血清メチオニ
ンがコバラミンの欠乏の患者において低いという早期の
教示〔参照、例えば、Parry, T.E., Brit.J.Haemat. 1
6::221 (1969)〕にかかわらず、コバラミンの欠乏にお
いて診断的に有用であることが示されなかった。
【０１２０】実施例 VIIホモシステインのアッセイまたは組合せたホモシステイ
ン−メチルマロン酸のアッセイを用いる、神経学的異常
および穏和の血液学的異常をもつかもたない患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断の確証 神経学的異常は、しばしば、Ｃｂｌ欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまったく存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。
この考えを試験するために、われわれは、ＣＢＬの欠乏
のために神経学的異常をもつ１４３人の連続した患者を
再検討した。これらの患者のうち４２人（２９％）にお
いて、ヘマトクリット（３５／４２）またはＭＣＶ（２
６／４２）であり、両者での試験（１９／４２）は正常
であることを、われわれは発見した。他の血液学的パラ
メーターは、測定すると、また、頻繁に正常であった：
ＷＢＣ（４２／４２）、血小板（４０／４２）、ＬＤＨ
（２５／３８）およびビリルビン（３０／３１）。これ
らの４２人の患者において、神経学的異常は次のものを
包含した：末端感覚欠陥（３５）、知覚異常（２９）、
失調症（２１）、記憶喪失（１２）、性格の変化
（４）、痙攣性対不全麻痺（３）、幻覚（２）、糞便失
禁（２）、緩和（２）、視神経萎縮（１）および自殺
（１）。血清Ｃｂｌレベル（正常＝２００〜１０００pg
／mlは、次のようにかなり変化した：＜５０pg／ml
（６）；５０〜１００pg／ml（１９）；１００〜１５０
pg／ml（１２）；１５０〜２００pg／ml（３）；および
２００〜２５０pg／ml（２）。Ｃｂｌ欠乏の診断は、次
の１または２以上を立証することによって、すべての４
２人の患者において確証された：実施例IVの手順によっ
て測定して、＞１５０ng／mlの血清メチルマロン酸（Ｍ
ＭＡ）の明瞭な増大、正常＝１８〜７６ng／ml（３６／
３８）；実施例 IIIの手順によって測定して、＞３０μ
モル／１の血清ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）の明瞭な増
大、正常＝７〜２２μモル／１（３７／３８）；Ｃｂｌ
処置後における血清ＭＭＡ（２８／２８）および血清Ｈ
ｃｙｓ（２７／２８）の顕著な減少；ＭＣＶがＣｂｌ処
置前に増大しなかった、ほとんどの患者を含む、Ｃｂｌ
処置（２９／３５）後のＭＣＶの５fl以上の減少（１３
／１６）；およびＣｂｌ処置（３９／３９）後の神経学
的異常の改良。
ン−メチルマロン酸のアッセイを用いる、神経学的異常
および穏和の血液学的異常をもつかもたない患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断の確証 神経学的異常は、しばしば、Ｃｂｌ欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまったく存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。
この考えを試験するために、われわれは、ＣＢＬの欠乏
のために神経学的異常をもつ１４３人の連続した患者を
再検討した。これらの患者のうち４２人（２９％）にお
いて、ヘマトクリット（３５／４２）またはＭＣＶ（２
６／４２）であり、両者での試験（１９／４２）は正常
であることを、われわれは発見した。他の血液学的パラ
メーターは、測定すると、また、頻繁に正常であった：
ＷＢＣ（４２／４２）、血小板（４０／４２）、ＬＤＨ
（２５／３８）およびビリルビン（３０／３１）。これ
らの４２人の患者において、神経学的異常は次のものを
包含した：末端感覚欠陥（３５）、知覚異常（２９）、
失調症（２１）、記憶喪失（１２）、性格の変化
（４）、痙攣性対不全麻痺（３）、幻覚（２）、糞便失
禁（２）、緩和（２）、視神経萎縮（１）および自殺
（１）。血清Ｃｂｌレベル（正常＝２００〜１０００pg
／mlは、次のようにかなり変化した：＜５０pg／ml
（６）；５０〜１００pg／ml（１９）；１００〜１５０
pg／ml（１２）；１５０〜２００pg／ml（３）；および
２００〜２５０pg／ml（２）。Ｃｂｌ欠乏の診断は、次
の１または２以上を立証することによって、すべての４
２人の患者において確証された：実施例IVの手順によっ
て測定して、＞１５０ng／mlの血清メチルマロン酸（Ｍ
ＭＡ）の明瞭な増大、正常＝１８〜７６ng／ml（３６／
３８）；実施例 IIIの手順によって測定して、＞３０μ
モル／１の血清ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）の明瞭な増
大、正常＝７〜２２μモル／１（３７／３８）；Ｃｂｌ
処置後における血清ＭＭＡ（２８／２８）および血清Ｈ
ｃｙｓ（２７／２８）の顕著な減少；ＭＣＶがＣｂｌ処
置前に増大しなかった、ほとんどの患者を含む、Ｃｂｌ
処置（２９／３５）後のＭＣＶの５fl以上の減少（１３
／１６）；およびＣｂｌ処置（３９／３９）後の神経学
的異常の改良。
【０１２１】上から理解できるように、コバラミンの欠
乏による神経学的異常をもつ１４３人の連続的患者のう
ちわずかに１０８人（７６％）のみが貧血を有し（Ｈｃ
ｔ＜３５人の女性、＜４０人の男性）を有し、そして３
５／１４３（２４％）はまったく貧血ではなかった。こ
れらの１４３人の患者のうち２６人（１８％）におい
て、ＭＣＶは正常であり、そして１９／１４３（１３
％）において、ヘマトクリットおよびＭＣＶの両者共正
常であった。正常のヘマトクリット、正常のＭＣＶまた
は両者を有した４２人のサブセットにおいて、わずかに
５／４２（１２％）はＭＣＶが顕著に増大しており（＞
１１０fl）、１１／４２（２６％）は適度に増大したＭ
ＣＶ（１０１〜１１０fl）を有し、そして２６／４２
（６２％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００fl）を有し
た。コバラミンの試料レベルはわずかに２４／４２（５
７％）の患者において顕著に減少しており（＜１００pg
／ml）、そして１６／４２（３８％）においてわずかに
中程度に減少していた（１００〜２００pg／ml）。事
実、２／４２（５％）の患者は事実正常の血清コバラミ
ンレベルを有した。こうして、コバラミンの欠乏から生
ずる神経学的異常がもつこれらの患者において、血液学
的異常のスペクトルは従来認識されていたよりも非常に
広く、そしてコバラミンの診断を実施するためには、適
度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラミンレベル
および顕著に増大したＭＣＶの発見に頼ることはできな
い。しかしながら、これらの患者において血清合計ホモ
システインを単独で、あるいは血清メチルマロン酸と組
み合わせて測定することによって、コバラミンの欠乏が
Ｈｃｔ，ＭＣＶおよび血清コバラミンレベルにおいて適
度な異常のみをもつ患者においてコバラミンの欠乏の診
断を確立することができる。さらに、血清合計ホモシス
テインおよび血清メチルマロン酸の増大した値の低下を
監視することによって、コバラミンの欠乏の診断を確立
することができ、そしてコバラミンを使用する処置の応
答を監視することができる。
乏による神経学的異常をもつ１４３人の連続的患者のう
ちわずかに１０８人（７６％）のみが貧血を有し（Ｈｃ
ｔ＜３５人の女性、＜４０人の男性）を有し、そして３
５／１４３（２４％）はまったく貧血ではなかった。こ
れらの１４３人の患者のうち２６人（１８％）におい
て、ＭＣＶは正常であり、そして１９／１４３（１３
％）において、ヘマトクリットおよびＭＣＶの両者共正
常であった。正常のヘマトクリット、正常のＭＣＶまた
は両者を有した４２人のサブセットにおいて、わずかに
５／４２（１２％）はＭＣＶが顕著に増大しており（＞
１１０fl）、１１／４２（２６％）は適度に増大したＭ
ＣＶ（１０１〜１１０fl）を有し、そして２６／４２
（６２％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００fl）を有し
た。コバラミンの試料レベルはわずかに２４／４２（５
７％）の患者において顕著に減少しており（＜１００pg
／ml）、そして１６／４２（３８％）においてわずかに
中程度に減少していた（１００〜２００pg／ml）。事
実、２／４２（５％）の患者は事実正常の血清コバラミ
ンレベルを有した。こうして、コバラミンの欠乏から生
ずる神経学的異常がもつこれらの患者において、血液学
的異常のスペクトルは従来認識されていたよりも非常に
広く、そしてコバラミンの診断を実施するためには、適
度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラミンレベル
および顕著に増大したＭＣＶの発見に頼ることはできな
い。しかしながら、これらの患者において血清合計ホモ
システインを単独で、あるいは血清メチルマロン酸と組
み合わせて測定することによって、コバラミンの欠乏が
Ｈｃｔ，ＭＣＶおよび血清コバラミンレベルにおいて適
度な異常のみをもつ患者においてコバラミンの欠乏の診
断を確立することができる。さらに、血清合計ホモシス
テインおよび血清メチルマロン酸の増大した値の低下を
監視することによって、コバラミンの欠乏の診断を確立
することができ、そしてコバラミンを使用する処置の応
答を監視することができる。
【０１２２】われわれは、次のように結論する：１）Ｃ
ｂｌ欠乏による神経学的異常は、貧血または増大したＭ
ＣＶの不存在下において普通に起こる；２）血清ＭＭＡ
および血清Ｈｃｙｓの測定、血清ＭＭＡ、血清Ｈｃｙｓ
およびＭＣＶにおけるＣｂｌ処置後の変化は、患者をＣ
ｂｌについて評価するとき有用である；３）説明されな
い神経学的異常をもつ患者のすべては、貧血、大赤血球
症、または他の血液学的異常が存在しないときでさえ、
Ｃｂｌ欠乏について評価すべきである；そして４）処置
後の増大した血清合計ホモシステインまたは血清メチル
マロン酸の低下によって確証された、コバラミンの欠乏
に二次的である神経学的病気をもつ患者における、貧血
の不存在によって理解できるように、コバラミンの欠乏
の臨床的スペクトルは従来推測されているものよりも非
常に広い。
ｂｌ欠乏による神経学的異常は、貧血または増大したＭ
ＣＶの不存在下において普通に起こる；２）血清ＭＭＡ
および血清Ｈｃｙｓの測定、血清ＭＭＡ、血清Ｈｃｙｓ
およびＭＣＶにおけるＣｂｌ処置後の変化は、患者をＣ
ｂｌについて評価するとき有用である；３）説明されな
い神経学的異常をもつ患者のすべては、貧血、大赤血球
症、または他の血液学的異常が存在しないときでさえ、
Ｃｂｌ欠乏について評価すべきである；そして４）処置
後の増大した血清合計ホモシステインまたは血清メチル
マロン酸の低下によって確証された、コバラミンの欠乏
に二次的である神経学的病気をもつ患者における、貧血
の不存在によって理解できるように、コバラミンの欠乏
の臨床的スペクトルは従来推測されているものよりも非
常に広い。
【０１２３】われわれは本発明の好ましい実施態様を例
示しかつ説明してきたが、本発明の変化および変更は可
能であり、それゆえ、上の記載した精確な用語に限定さ
れず、本発明を種々の用途および条件に適合させうる、
このような変化および変更は利用することができる。し
たがって、このような変化および変更は特許請求の範囲
に規定される同等なものの範囲に完全に入り、それゆ
え、特許請求の範囲に包含される。
示しかつ説明してきたが、本発明の変化および変更は可
能であり、それゆえ、上の記載した精確な用語に限定さ
れず、本発明を種々の用途および条件に適合させうる、
このような変化および変更は利用することができる。し
たがって、このような変化および変更は特許請求の範囲
に規定される同等なものの範囲に完全に入り、それゆ
え、特許請求の範囲に包含される。
【図１】ホモシステインモノマー、システインモノマ
ー、ホモシスチン、シスチン、ホモシステイン−２−メ
ルカプトエタノール、システイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体およびメチ
オニンの分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
ー、ホモシスチン、シスチン、ホモシステイン−２−メ
ルカプトエタノール、システイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体およびメチ
オニンの分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
【図２】（Ａ）アミノ酸類を含有する混合物；（Ｂ）１
００μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）１００μｌ
の正常ラット血清；および（Ｄ）１００μｌの正常ヒト
尿から還元後に得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチ
ルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
００μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）１００μｌ
の正常ラット血清；および（Ｄ）１００μｌの正常ヒト
尿から還元後に得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチ
ルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
【図３】マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメチ
ルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグ
ルタル酸の分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
ルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグ
ルタル酸の分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す図。
【図４】（Ａ）１μｇの各酸を含有する混合物；（Ｂ）
５００μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）５００μ
ｌの正常ラット血清；および（Ｄ）１００μｌの正常ヒ
ト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチルジメチル
シリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
５００μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）５００μ
ｌの正常ラット血清；および（Ｄ）１００μｌの正常ヒ
ト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチルジメチル
シリル誘導体類のクロマトグラムを示す図。
【図５】種々のカテゴリーにおいて正常の被検者および
患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につい
て得られた値を示すグラフ。
患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につい
て得られた値を示すグラフ。
【図６】診断の時から開始し、非経口的Ｃｂｌ処置後最
初の１３日にわたって続けられた、古典的悪性貧血をも
つ患者における、血清（−・−）および尿（−−ｏ−
−）のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフ。
初の１３日にわたって続けられた、古典的悪性貧血をも
つ患者における、血清（−・−）および尿（−−ｏ−
−）のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エイチ．アレン アメリカ合衆国，コロラド 80110，イ ングルウッド，サウス デクスター 4001 (72)発明者 サリー ピー．ステイブラー アメリカ合衆国，コロラド 80206，デ ンバー，ハリソン ストリート 1035 (72)発明者 ジョン リンデンバウム アメリカ合衆国，ニューヨーク 10023, ニューヨーク ウェスト エイティーフ ィフス ストリート 72
Claims (16)
- 【請求項１】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在について体液を測定することによって、温血動物中コ
バラミンまたは葉酸の欠乏を検出する方法。 - 【請求項２】 温血動物の体組織中の１種または２種以
上の異なるホモシステイン種の存在を測定する方法であ
って、工程： （ａ）温血動物の体組織を、測定すべきホモシステイン
種の各々の既知量を含む適当なマーカーで標識された内
部参照標準と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの均質化を保証するために十分な
量の還元剤を添加し、 （ｃ）存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの量を各種について質量分析計で
測定し、 （ｄ）標識されたホモシステイン対標識されないホモシ
ステインの比を各種について計算し、そして （ｅ）前記温血動物の体組織中の各種について存在する
標識されないホモシステインの量を誘導する、 を含む方法に従って増大レベルの合計のホモシステイン
の存在について体液を測定することによって、温血動物
中コバラミンまたは葉酸の欠乏を検出する請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料をクロマトグラフ
ィーにかけることからなる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料を高性能液体クロ
マトグラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオ
ール基に応答するようにセットされた電気化学的検出器
を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
からなる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、試料中に存在するホモシステ
インを放射線標識したＳ−アデノシンおよび標識したＳ
−アデノシルホモシステインヒドラーゼに暴露すること
によってＳ−アデノシルホモシステインに転化し、そし
て前記標識したＳ−アデノシルホモシステインを適当な
検出手段によって定量することからなる請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】 温血動物のコバラミンおよび／または葉
酸の欠乏を検出し、そしてそれらの間を区別する方法で
あって、体液を増大レベルの合計のホモシステインおよ
びメチルマロン酸の存在について測定することを含んで
なり、ここで合計のホモシステインの正常のレベルはコ
バラミンまたは葉酸の欠乏の不存在を示し、増大レベル
の合計のホモシステインおよびメチルマロン酸はコバラ
ミンの欠乏を示し、そして合計のホモシステイン増大し
たレベルとメチルマロン酸の正常レベルとの組み合わせ
は葉酸の欠乏を示すことを特徴とする前記方法。 - 【請求項７】 温血動物のコバラミンおよび／または葉
酸の欠乏を検出し、そしてそれらの間を区別する方法で
あって、体液を増大レベルの合計のホモシステインおよ
びメチルマロン酸の存在について測定することを含んで
なり、ここで合計のホモシステインの測定は温血動物の
体組織中の１種または２種以上の異なるホモシステイン
種の存在を測定する方法であって、工程： （ａ）温血動物の体組織を、測定すべきホモシステイン
種の各々の既知量を含む適当なマーカーで標識された内
部参照標準と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの均質化を保証するために十分な
量の還元剤を添加し、 （ｃ）存在する標識されたホモシステインおよび標識さ
れないホモシステインの量を各種について質量分析計で
測定し、 （ｄ）標識されたホモシステイン対標識されないホモシ
ステインの比を各種について計算し、そして （ｅ）前記温血動物の体組織中の各種について存在する
標識されないホモシステインの量を誘導する、 を含む方法に従い実施し、そして合計のホモシステイン
の正常のレベルはコバラミンまたは葉酸の欠乏の不存在
を示し、合計のホモシステインおよびメチルマロン酸の
増大したレベルはコバラミンの欠乏を示し、そして合計
のホモシステインの増大したレベルとメチルマロン酸の
正常レベルとの組み合わせは葉酸の欠乏を示すことを特
徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 増大レベルの合計のホモシステインの測
定は、体液の試料をクロマトグラフィーにかけることか
らなる請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 増大レベルの合計のホモシステインの存
在についての前記測定は、体液の試料を高性能液体クロ
マトグラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオ
ール基に応答するようにセットされた電気化学的検出器
を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
からなる請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 増大レベルの合計のホモシステインの
存在についての前記測定は、試料中に存在するホモシス
テインを放射線標識したアデノシンおよびＳ−アデノシ
ルホモシステインヒドラーゼに暴露することによって標
識したＳ−アデノシルホモシステインに転化し、そして
前記標識したＳ−アデノシルホモシステインを適当な検
出手段によって定量することからなる請求項６記載の方
法。 - 【請求項１１】 メチルマロン酸は、工程： （ａ）組織の試料を、安定なアイソトープのマーカーで
標識した既知量のメチルマロン酸からなる内部参照標準
と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたメチルマロン酸および標識さ
れないメチルマロン酸の量を質量分析計で測定し、 （ｃ）存在する標識されたメチルマロン酸対標識されな
いメチルマロン酸の比を計算し、そして （ｄ）前記所定の試料中に存在する標識されないメチル
マロン酸の量を誘導する、 を含んでなる方法によって測定する請求項６記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記標識されたメチルマロン酸および
標識されないメチルマロン酸を工程（ａ）の後および工
程（ｂ）の前に適当な誘導体に転化する請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１３】 前記誘導体はシリル誘導体である請求
項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 前記シリル誘導体は前記メチルマロン
酸をＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ト
リフルオロ−アセトアミドに暴露することによって得ら
れる請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 工程（ａ）における前記内部参照標準
は既知量の変性したメチルマロン酸からなる請求項１１
または１２記載の方法。 - 【請求項１６】 工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前
にメチルマロン酸を部分的に精製する追加の工程を含む
請求項１４記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US06/933,553 US4940658A (en) | 1986-11-20 | 1986-11-20 | Assay for sulfhydryl amino acids and methods for detecting and distinguishing cobalamin and folic acid deficency |
| US933553 | 1986-11-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP6088530A Expired - Fee Related JP2579434B2 (ja) | 1986-11-20 | 1994-04-26 | コバラミンおよび葉酸の欠乏を検出および区別する方法 |
| JP7171988A Expired - Fee Related JP2577878B2 (ja) | 1986-11-20 | 1995-07-07 | スルフヒドリルアミノ酸類の定量方法 |
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|---|---|---|---|
| JP62292190A Expired - Lifetime JP2574339B2 (ja) | 1986-11-20 | 1987-11-20 | スルフヒドリルアミノ酸類の定量方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| US4940658A (en) * | 1986-11-20 | 1990-07-10 | University Patents, Inc. | Assay for sulfhydryl amino acids and methods for detecting and distinguishing cobalamin and folic acid deficency |
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| US5457055A (en) * | 1986-11-20 | 1995-10-10 | The University Of Colorado Foundation | Diagnostic method for cobalamin deficiency |
| US5438017A (en) * | 1989-05-01 | 1995-08-01 | The University Of Colorado Foundation, Inc. | Assays for sulfhydryl amino acids and methylmalonic acid and their application to diagnosis of cobalamin deficiency |
| DK138090D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Novo Nordisk As | Diagnostisk analysemetode |
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| US20030203873A1 (en) * | 1992-12-29 | 2003-10-30 | Allen Robert H | Method for treatment of neuropsychiatric disorders |
| US5478729A (en) * | 1994-04-28 | 1995-12-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay for homocysteine |
| US5559038A (en) * | 1994-05-04 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of Colorado | Gas chromatography/mass spectrometry determination of oxidized sulfhydryl amino acids |
| US5800979A (en) * | 1994-12-01 | 1998-09-01 | Kolhouse; J. Fred | Gas chromatography/mass spectrometric determination of folic acid coenzymes |
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| ATE262799T1 (de) | 1996-01-31 | 2004-04-15 | Univ South Alabama | Lebensmittel und vitamin herstellungen mit natürlichem isomeren von reduzierten folaten |
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| DE69826253D1 (de) | 1997-03-20 | 2004-10-21 | Coventry Group Ltd | Nährungsergänzungsmittel für kardiovasküläre gesundheit |
| DE19713088C1 (de) * | 1997-03-27 | 1998-11-26 | Reiner Dr Probst | Verfahren und Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Folatbestimmung |
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| US6140102A (en) * | 1997-07-24 | 2000-10-31 | Anticancer, Inc. | High specificity homocysteinases and genes therefor |
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| AU4835599A (en) | 1998-06-29 | 2000-01-17 | Edwin F. Ullman | Assay for homocysteine |
| US6284219B1 (en) | 1998-06-30 | 2001-09-04 | Phenome Sciences Inc. | In vivo determination of metabolic function for use in therapy management |
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| DE60037311T2 (de) | 1999-02-01 | 2008-10-23 | Anticancer Inc., San Diego | Homogene enzymatische bestimmungsmethode für vitamin b6 |
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