JP2574339B2 - スルフヒドリルアミノ酸類の定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明に導いた研究は、米国政府からの許可によって
部分的に資金を提供された。

本発明は、試料中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を
定量する方法、例えば、温血動物からの体の組織の試料
中の合計のホモシステインの濃度を定量する方法、およ
び前記温血動物がコバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、また
はそれらの両者を有するかどうかを決定する方法に関す
る。

スルフヒドリルアミノ酸類は、次の示すような通路の
複雑な組に従って代謝される。

理解できるように、メチオニンシンセターゼによりホ
モシステインをメチオニン化してメチオニンを生成する
ことは、メチルコバラミン（Me−Cb1）、また、メチル
−B₁₂としても知られている、を必要とする。メチル基
はN⁵−メチルテトラヒドロフォレート（N⁵−MTHF）によ
って共与され、後者はテトラヒドロフォレート（THF）
に転化される。メチルマロニル−CoAムターゼを介する
メチルマロニル−CoAのスクシニルCoAへの転化は、アデ
ノシル−コバラミン、またコファクターとして知られた
アデノシル−B₁₂、を必要とする。こうしてコバラミン
および葉酸はスルヒドリルの代謝において極めて重要な
コファクターであるが、葉酸でなくコバラミンはメチル
マロニル−CoAの代謝において極めて重要なコファクタ
ーである。

温血動物におけるコバラミンおよび葉酸の欠乏の精確
な初期の診断は、これらの欠乏が、それぞれ、コバラミ
ンまたは葉酸の処置によって完全に逆転する、生命に危
険を及ぼす血液学的異常に導きうるので、重要である。
コバラミンの欠乏は、また、無能および生命を脅かす神
経精神病学的異常に導くことがあるので、コバラミンの
欠乏の精確な初期の診断はことに重要である；外因性の
コバラミンの投与は、常に、これらの異常の進行を停止
し、ほとんど常に症候の有意の改良に導き、そして頻繁
にそれらの完全な修正に導く。コバラミンの欠乏及び葉
酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常に導くので、それ
らの区別はしばしば困難である；適切なビタミンの使用
は血液学的異常を大きく改良し、そして、より重要なこ
とには、コバラミンのみが、コバラミンの欠乏において
のみ見られる、神経精神病学的異常を補正するので、区
別は重要である。コバラミンの欠乏を処置するための葉
酸の使用は極めて危険である。なぜなら、血液学的異常
のあるもの、あるいはすべては改良されるが、血液学的
異常は改良されず、進行することがあり、あるいは沈降
することさえあるからである。

先導医学教科書中の章および先導医学雑誌中の論文が
教示するように、コバラミンの欠乏は有無の貧血（すな
わち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの減少）を有
する個体（赤血球はマクロクリットである。すなわち、
平均細胞体積（MCV）が一般に＞100f1である）におい
て、あるいは抹消神経病および／または失調症から成る
神経学的異常を有する個体において、疑いが持たれる。
多くのこのような教科書の章または雑誌の論文が、さら
に、述べているように、貧血は典型的には重度であり、
すなわち、ヘモグロビン≦8g％、ヘマトクリット＜25％
であり、そして赤血球の大きさはレベル＞110まで大き
く増加する。〔参照、Babior,B.M.およびH.F.Bunn,Harr
ison's Principles of Internal Medicine（R.G.Peters
dorf,R.F.Adams,E.Braunwald,K.J.Isselbacher,J.B.Mar
tinおよびJ.D.Wilson編）（McGraw−Hill Book Co.,New
York,1983）,pp.1853−1860;Lee,G.R.およびH.J.Gardn
er,Textbook of Family Practice,3rd E d.（R.E.Rakel
編）（W.B.Saunders ＆ Co.,Philadelphia,1984）,pp.1
082−1091。〕 いくつかの実験室の試験は、コバラミンの欠乏または
葉酸の欠乏を有する患者において異常な結果を与えると
して報告された。このような試験は赤血球の葉酸塩の測
定〔Hoffbrand,A.V.,et al.,J.Clin.Path.19:17（198
6）〕および「dUの抑制試験」〔Metz,J.,et al.,Brit.
J.Haem.14:575（1968）〕を包含するが、いずれも広く
利用されていない。20年以上にわたって知られているよ
うに、メチルマロン酸はコバラミンの欠乏を有する大抵
の患者の尿中に増大した量で分泌され、そしてこの異常
は葉酸の欠乏を有するほんのわずかの患者によってのみ
証明される。コバラミンの欠乏は、貧血の存在および程
度、大赤血球症の存在および程度、および低下した血清
コバラミンレベルの存在に基づいて疑われかつ診断する
ことができることが信じられかつ教示されているので、
メチルマロン酸はコバラミンの欠乏が疑われている患者
においてめったに測定されない。事実、医学の先導教科
書および血液学の先導教科書において、実際には、尿の
メチルマロネートのアッセイはめったに必要ではないこ
とが教示されている。

〔Beck,W.s.,Hemetology,3rd Ed.（W.J.Williams,E.Beu
tler,A.J.ErslevおよびM.A.Lichtman編）（McGraw−Hil
l Book Co.,New York,1983）,pp.434−465;Beck,W.S.,C
ecil Textbook of Medicine,Vol.1（J.B.Wyngaardenお
よびL.H.Smith,Jr.編）（W.B.Saunders Co.,Philadelph
ia,1985）,pp.893−900。〕１つの最近の雑誌の論文は
尿のメチルマロン酸の測定を事実支持している〔Norma
n,E.J.,O.J.MarteloおよびM.D.Denton,Blood59（６）:1
128−1131（1982）が、この論文のデータを分析する
と、27人のコバラミンの欠乏の患者のうち26人は貧血で
あり、27人の患者のうち23人はMCVが増大しており、そ
して血清コバラミンを標準の改良された血清コバラミン
アッセイで測定した12人の患者のうち12人は100pg/mlよ
り低い値を有したことを証明する。こうして、これらの
患者は標準の診断手順に従って皆コバラミンの欠乏であ
り、そして追加のアッセイは通常不必要であると判定さ
れている。

血清または血漿中のコバラミンおよび葉酸塩について
のアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診
断および区別するための、最も広く利用され、推奨され
ている試験である。血清コバラミンの正常範囲が約200
〜900pg/mlである、コバラミンの欠乏の場合において、
いく人かの先導著者が述べているように、患者は血清コ
バラミンレベルが低いばかりでなく、かつまたこれらの
値は100pg/mlより低いであろう。〔参照、例えば、Babi
or,supra;Lee ＆ Gardner,supra;Beck,Textbook of Med
icine,supra:およびBeck,Hematology,supura〕。

1978年において、コバラミン類自体類がヒト血漿中に
存在すること、およびその時使用する血清コバラミンに
ついてのラジオアイソトープの希釈アッセイが真のコバ
ラミンに対して特異的でないので、それらの存在はコバ
ラミンの欠乏をマスクしうることが発見された。この問
題は、コバラミンについてのラジオアイソトープの希釈
アッセイにおいて結合性蛋白質として、純粋なまたは精
製された固有の因子の使用によって補正でき、そしてこ
の修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質を使用した19
78年に存在したアッセイをほとんど完全に置換した。参
照、例えば、米国特許第4,188,189号（Allen）、米国特
許第4,351,822号（Allen）米国特許第4,451,571号（All
en）およびKolhouse,J.F.,H.Kondo,N.C.Allen,E.Podell
およびR.H.Allen,N.Eng.J.Med.299;785−792（1978）。
これらの血清についての改良されたアッセイは、世界を
通じて数千の研究室において現在利用されており、そし
てコバラミンの欠乏を有る患者のすべて、あるいはほと
んどすべてについて低い値を与えるように見える。

しかしながら、改良されたアッセイはコバラミンの欠
乏のなんらかの証拠に欠ける患者において、しばしば低
い値を与えるので、かなり批判されてきている。これら
の理由のため、この分野における専門家は、コバラミン
の欠乏を考慮すべきであること、そして前述のように、
コバラミンの欠乏をもつ患者に典型的である血液学的お
よび神経学的異常を有する患者においてのみ、血清コバ
ラミン値を得るべきであることを教示した。Schilingお
よび彼の共同研究者ら、コバラミンの欠乏および実験室
の診断の分野における専門家、は次のように述べた： われわれは、「改良されたB₁₂のアッセイキットが血
清B₁₂について臨床的に説明されない結果の増大した比
率を生成するであろうことを結論する。

科学的および経済的理由で、ビタミンB₁₂の合理的な
確率を示唆する血液学的または神経学的発見を有する患
者においてのみ、血清ビタミンB₁₂を測定することは、
賢明であろうと思われる。貧血または老人医学の入口に
おけるスクリーニングテストとして血清B₁₂を測定する
ことは、臨床的病気と相関関係もたせることのできな
い、低い値を高い比率で生ずるであろう。

Schilling,R.F.,V.F.Fairbanks,R.Miller,K. SchmittおよびM.J.Smith,Clin.Chem.29（３）:582,58
3（1983）。こうして、現在入手可能な広く使用されて
いるコバラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏で
はない患者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁
に提供することがある。このような発見は医者を困惑さ
せ、あるいは誤らせ、そして不必要な、経費を要する、
それ以上の試験を生ずることがある。

こうして、この分野において、一般に、教示されてい
るように、コバラミンの欠乏の臨床的スペクトルは比較
的狭くかつ良好に限界が定められており、そしてコバラ
ミンの欠乏の可能性は、現在血液学的または神経学的症
候を有する患者、すなわち、通常、適度に重度の大赤血
球症を伴う適度に重度の貧血を有する患者、および抹消
の神経病および／または失調症を有する患者においての
み考慮すべきである。一般の入口あるいは適度の貧血、
または適度の大赤血球症、または他の神経精神学的異常
をもつものの日常のスクリーニングは高い数の誤った陽
性の結果に導くであろう。

今回、コバラミンの欠乏の臨床的スペクトルは従来認
識されていたものよりも非常に広いこと、そして多くの
コバラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あるいは適度
にのみ貧血であること；多くの場合において、それらの
赤血球は大赤血球でないか、あるいは適度にのみ大赤血
球であること；多くの場合において、抹消の神経病およ
び失調症以外の種々の神経学的異常が存在すること；多
くの場合において、精製した固有の因子を使用する上の
改良されたアッセイを使用してさえ、血清コバラミンレ
ベルはわずかに減少するだけであり、そして実際には正
常でありうることが発見された。したがって、コバラミ
ンの欠乏についての改良されたアッセイ、好ましくはコ
バラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と区別可能であるアッセ
イが要求されている。

今回、温血動物における合計のホモシステインの増大
したレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の欠乏の両者
と相関関係があり；増大したレベルの合計のホモシステ
インを有する動物は一方または双方の欠乏を有するよう
であるが、アッセイは２つの間の区別をしないことが発
見された。

スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研究において、正常
のヒト血清は少量のホモシステイン−システイン二量体
および蛋白質結合ホモシステインを含有することが示さ
れた。ホモシステインは正常試料において検出されなか
ったが、腎不全を有する患者において少量で存在する。

従来知られているように、ホモシステインおよびセリ
ンをシスタチオニンに転化できない、シスタチオニンシ
ンセターゼを遺伝的に欠く子供の血清および尿の中に大
量のホモシスチン（ホモシスティン）が存在する。これ
らの患者は、また、血清中に存在するメチオニンを増大
した量を有する〔参照、例えば、Mudd,S.H.およびH.L.L
evy,The Metabolic Basis of Inherited Disease.5th E
d.（J.B.StanburyおよびWyngaarden,D.S.Fredrickson,
J.L.GoldsteinおよびM.S.Brown編）（McGraw−Hill Boo
k Co.,New York,1983）,pp.522−559。大量のホモシス
チンは、また、メチオニンシンセターゼを含む遺伝欠陥
を有する子供、例えば、ホモシステインおよびN⁵−メチ
ルテトラヒドロフォレートを、それぞれ、メチオニンお
よびテトラヒドロフォレートに転化できないある子供の
血清および尿中に存在する。これらの患者は、血清中に
低いレベルのメチオニンを有する。これらの患者におい
て、遺伝した欠陥の理由は、１）5,10−メチレンテトラ
ヒドロフォレートリダクターゼの欠乏（N⁵−メチルテト
ラヒドロフォレート、メチオニンシンセターぜのための
基質の１つの合成の不能）;2）メチオニンシンセターゼ
のための必要なコファクターであるメチル−コバラミン
の合成の不能；および３）メチオニンシンセターゼ自体
における欠陥である〔参照、例えばMudd.S.H.,Heritabl
e Disorders of Amino Acid Metabolism;Patterns of C
linical Exprression and Genetic Variation,（W.L.Ny
han編）（John Wiley ＆ Sons.New York,1974）,pp.429
−451〕。他方において、ホモシスチンは、コバラミン
を細胞へ輸送する能力の遺伝欠陥（例えば、トランスコ
バラミンIIの欠乏）、またはコバラミンがリボソーム内
に捕捉されるようなコバラミンの細胞内輸送の遺伝欠陥
による、メチオニンシンセターゼ能を含む遺伝欠陥を有
する他の子供の尿または血清中にはこれまで検出されて
いない。大量のホモシステインまたはホモシスチンは、
生命を脅かすコバラミン欠乏を有する数人の子供の血清
および尿中に見出されている〔参照、例えば、Shipman,
R.T.,R.R.W.TownleyおよびD.M.Dnaks,Lancet 1（２）:6
93−694（1969）;Frader.J.,B.ReimanおよびD.Turkewit
z,N.Eng.J.Med.299:1319（1978）;Mudd,S.H.,Heritable
Disorder,supra;Mudd.S.H.,Metabolic Basis,supra;Ho
llowell,J.G.,Jr.,W.K.Hall.M.E.Coryell.J.Mcphereso
n,Jr.,D.A.Hahn.Lancet Dec.27,1969,p.1428;Higgenbot
tom,M.C.,L,SweetmanおよびW.L.Nyhan,N.Eng.J.Med.299
（７）:317−323（1978）;Davis,J.R.,J.Goldenringお
よびB.H.Lubin,Am.J.Dis.Child.135:566（1981）;Hoey,
H.J.C.Linnell,V.G.OberholzerおよびB.M.Laurance.J.R
oyal Soc.Med.75:656（1982）〕。生命を脅かすコバラ
ミンの欠乏を有する他の幼児において、尿および／また
は血清中のアミノ酸は正常であることが発見され、そし
てホモシスチンは発見されず〔参照、例えば、Graesbec
k,R.Bordin,I.KanteroおよびB.Kuhlbaeck,Acta Medica
Scandinaviaca 167（４）:289（1960）;Lampkin,B.C.お
よびA.M.Mauer,Blood 30（４）:495（1967）;Lambert,
H.P.,T.A.J.PrankerdおよびJ.M.Smellie,Q,J.Med.30（1
77）:71（1961）;Sievend,C.J.,Ugesk.Laeter 125:174
（1963）〕生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子供の尿
中にそれは発見されなかった〔Corbeel,L.,G.Van den B
erghe,J.Jaeken.J.van Tornout,N.R.Eeckles,Eur.J.Pe
d.143:284−290（1985）〕。従来ホモシスティンは中程
度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有する子
供の血清または尿中に報告されていず、生命を脅かす、
中程度またはおだやかなコバラミン葉酸塩の欠乏を有す
る大人の血清または尿中にも従来報告されていない。

血清葉酸塩レベルは葉酸塩の欠乏をもつ多くのアルコ
ール患者において減少しないこと、および合計のホモシ
ステインの測定はこれらの患者の多くにおける葉酸塩の
欠乏の追加の、より精確な指示を提供することが、ま
た、発見された。ホモシステインは葉酸塩の代謝の遺伝
的欠陥をもつある子供の尿および／または血清において
増大することが従来知られていた〔参照、例えば、Mud
d,S.H.,Heritable Disorder,supra;Mudd,S.H.,Metaboli
c Basis,supra〕が、ホモシステインが葉酸塩の欠乏を
もつ子供または大人の尿または血清中において増大する
ことは、従来、知られていなかった。

さらに、ある動物がコバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、
両者を有するか、あるいはいずれももたないかを、合計
の組織のホモシステインおよびメチルマロン酸のレベル
と比較する組み合わせのアッセイに基づいて決定するこ
とが可能であることが発見された。葉酸の欠乏およびコ
バラミンの欠乏の両者は増大した合計のホモシステイン
のレベルを生ずるが、コバラミンの欠乏は、また、メチ
ルマロン酸のレべルを増大し、これに対して葉酸の欠乏
は増大しないであろう。メチルマロン酸はコバラミンの
代謝またはコバラミンの輸送の遺伝的欠陥を有する、多
くの子供の血清および／または尿において、および変化
する程度のコバラミンの欠乏をもつ子供および大人の尿
において増大することが、従来、知られていた〔参照、
例えば、Beck,W.S.,Hematology,supra〕。しかしなが
ら、従来、ホモシステインのアッセイと組み合わせてメ
チルメロン酸のアッセイを使用して、コバラミンの欠乏
および葉酸の欠乏を診断および／または区別すること
は、知られていず、また示唆されていない。今回、われ
われは、この組み合わせたアッセイは、変化する程度の
貧血、大赤血球症、血清コバラミンのレベルの低下、お
よび変化する種類の神経精神学的異常をもつ患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断において、事実、きわめて有
用であることを発見した。

体の組織におけるホモシステインの増大したレベルは
前記体の組織におけるコバラミンおよび／または葉酸の
減少したレベルと相関関係をもつことが、発見された。
したがって、ホモシステインのアッセイを使用して、温
血動物におけるコバラミンおよび／または葉酸の欠乏の
存在または不存在を決定することができる。この目的に
対して適当なアッセイは、体の組織、好ましくは体液、
好ましくは尿または血液におけるホモシステインのレベ
ルを決定できるアッセイを包含する。血清および血漿は
とくに好ましい。

尿または血液中のホモシステインのレベルの決定にお
ける使用に適当な、いくつかの異なる既知のアッセイが
存在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出
に、いずれも使用されてきていない。参照、例えば、Sa
etre,R.およびD.L.Rabenstein,Anal.Biochem.90:684−6
92（1978）、この文献は、尿中の減少した合計のシステ
イン、およびホモシステインを測定して、イオウの代謝
のある種の先天的疾患、例えば、シスチン（システィ
ン）尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチン尿症につ
いてスクリーニングし、そしてそれらの処置を監視する
方法を記載している。この方法は、体液の試料をチオー
ル基に応答するようにセットされた化学的検出器を有す
る高性能体クロマトグラフィーにかけ、そして結果を標
準曲線と比較して、もとの試料中に存在する標的化合物
の量を決定することからなる。この手順において、標準
は標的化合物と同時に混合するのではなく、むしろ別々
に実験する；こうして、標的および標準の回復を同等に
することを保証することは不可能である。

Refsum.H.,S.HellandおよびP.M.Ueland,Clin.Chem.31
（４）:624−628（1985）に記載されている、他の適当
な手順は、試料中に存在するホモシステイン、放射性標
識したＳ−アデノシンおよびＳ−アデノシルホモシステ
インヒドラーゼに暴露することによって、標識されたＳ
−アデノシルホモシステインに転化し、そして前記標識
されたＳ−アデノシルホモシステインを適当な検出系に
よって定量することからなる。示唆された用途は、悪性
の病気を管理におけるホモシステインの代謝の監視、お
よび抗葉酸塩薬物メトキシレートを使用する処置の間に
おける、遺伝的病気のホモシスチン尿症の監視、および
閉経期後の女性の血漿中の血清ホモシステインの監視を
包含する。この手順は、ホモシステインを監視て、コバ
ラミンまたは葉酸の欠乏の検出または測定に決して使用
されてきていない。再び、この手順は内部標準を使用せ
ず、こうして、標的および標準の回収を同等にすること
を保証することは不可能である。

血清または尿中のホモシステインのレベルを測定す
る。非常に、いっそう感受性でありかつ精確な手順は、
合計のスルフヒドリルアミノ酸についての次の新規なア
ッセイである。スルフヒドリルアミノ酸は、−SH部分を
含有するもの、例えば、式 HOOC−CH（NH₂）−CH₂−CH₂−SH のホモシステイン（Hcys）および式 HOOC−CH（NH₂）−CH₂−SH のシステイン（Cys）である。スルフヒドリル化合物
は、ジサルファイド結合を介して化合して二量体、例え
ば、式 HOOC−CH（NH₂）−CH₂−Ｓ−Ｓ−H₂C−（H₂N）HC−C0
0H のシスティン、式 HOOC−CH（NH₂）−CH₂−CH₂−Ｓ−Ｓ−H₂C−H₂C−（H
₂N）HC−COOH のホモシスティン、および式 HOOC−CH（NH₂）−CH₂−CH₂−Ｓ−Ｓ−H₂C−（H₂N）H
C−COOH のホモシステイン−システインを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
インおよびシステインの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフドリル基と複合体を形成する；組織から誘導された
試料において、このような蛋白質の複合体は存在するシ
ステインおよびホモシステインの大部分を結合すること
ができる。合計のスルフヒドリルアミノ酸についてのア
ッセイは、これらのアミノ酸がこのような化合物を形成
する容易さによって複雑化される。還元は放出のためお
よび引続く蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセイ
のために要求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還元
後、新しいジサルファイドを有意な程度に再形成する可
能性があるように思われる。ジサルファイド結合の再形
成は、非常に変動することがあり、そして非にスルフヒ
ドリル含有アミノ酸を内部標準として使用することによ
っては評価または補償されることができない。試料中の
合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、このよう
な二量体および複合体を考慮に入れなくてはならない。

したがって、本発明は、所定の試料中の合計のシステ
インおよび／または合計のホモシステインを質量分析計
を使用してアッセイする好ましい方法を提供する。用語
「合計のシステイン」および「合計のホモシステイン」
は、遊離の形態および複合化した形態の両者で存在す
る。それぞれ、システインおよびホモシステインの合計
量を意味する。便宜上、以下の説明は例として、ホモシ
ステインを使用するが、同一の手順はシステインに同様
にはたらく。内因性のホモシステインを含有する所定の
試料を、内因性のホモシステインの完全なランダム化を
補償するために十分な量の還元剤と一緒にし、そして合
計のホモシステインを適当な手段によって測定する。好
ましくは、所定の試料をまず内部参照標準と一緒にし、
前記内部参照標準はホモシステインと同様に挙動する
が、安定なアイソトープのマーカーで標識された化合物
の既知量からなる。内因性ホモシステインおよび参照標
準の完全な均質化を補償するために十分な量の還元剤を
添加し、そして存在するホモシステインおよび標識参照
標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシステインお
よび参照標準がこの手順を通じて同一の相対比で発生す
ると仮定すると、この比を質量分析計の読みから計算
し、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用して、本
来存在する内因性ホモシステインの合計量を計算するこ
とができる。前述のように、同一の手順はシステインに
対して有効である；また、ホモシステインおよびシステ
イン（または他のアミノ酸）の各々がそれ自体の適当な
内部参照標準を有するかぎり、それらについてのアッセ
イを同時に実施することができる。

内部参照標準は、この手順を通じて質量分析計の分析
まで内因性標的化合物と同一に挙動するが、質量分析計
の分析のもとで区別することができ、かつ別々に測定で
きる。任意の化合物である。適当な内部参照標準は、測
定すべき標的アミノ酸の重水酸化またはトリチウム化類
体、またはこのアッセイの目的に効果的に同一であるた
めに十分に標的アミノ酸に類似する重水素化またはトリ
チウム化化合物、あるいはC¹³またはN¹⁵または他の適当
なアイソトープのマーカーを十分な量で含有する標的ア
ミノ酸の他の類似体である。こうして、標識した参照化
合物は、取扱いの間非標識標的と区別不可能であるが、
質量分析計の定量のために異なるかつ明確なイオンを提
供するであろう。このアッセイのための好ましい化合物
の例は、システィンの重水素化形態、例えば、D,L−
〔3,3,3′,3′−²H₄〕システィンおよび重水素化ホモシ
スティン、例えば、D,L−〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−
²H₈〕ホモシスティンである。内部標準として使用する
ために適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・ア
ンド・ドーム（Merck Sharp ＆ Dohme）から入手可能で
ある。

定量は、測定した標的化合物対内部標準の比が、最初
の試料中の標的化合物の合計の未知量対添加した内部標
準の合計量の比と同一であるという仮定に基づく、これ
は、標的および内部標準の両者についての同一回収割合
を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合において、回
収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリルアミノ酸が
取ることのできる、種々の可能な形態、遊離および複合
化した形態に依存する。したがって、各アッセイについ
て、遊離な状態および各可能な複合化した状態における
標的および内部標準の相対比は、同一であることが非常
に重要である；これは、標的および内部標準の同一の相
対百分率が失われる（および回収される）ことを保証す
る。そのため、本発明では均質化を行う。具体的には、
標的および内部標準の両者を含有する初期の試料に還元
剤を添加する；十分な還元化合物を添加してジサルファ
イド架橋のすべてを破壊し、こうしてスルフヒドリルア
ミノ酸のすべてを遊離な状態にする。ジサルファイド架
橋の再結合を防止する化合物、例えば、ヨードアセテー
ト、ヨードアセトアミド、またはヨードプロパンを添加
して、スルフヒドリルアミノ酸のすべてが遊離な状態に
とどまるであろうことを保証することができる。標的お
よび標準のスルフヒドリルアミノ酸が同一のタイプおよ
び数のこのような複合化を形成するであろうことを仮定
して、任意に化合物がジサルファイド架橋を再形成し、
こうして遊離の状態、各可能な複合化状態、質量分析計
によって測定される標的および内部標準の量において、
もとの試料中に存在したのと、同一の比で標的および内
部標準スルフヒドリルアミノ酸の量が存在することがで
きる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊しないでジ
サルファイド結合を破壊できるもの、例えば、２−メル
カプトエタノール、ジチオスレイトールおよびホウ水素
化ナトリウムである。

必要に応じて、還元剤の添加の前または後に、標的ア
ミノ酸および内部標準を部分的に精製することが必要で
あるか、あるいは望ましいことがある。アミノ酸の精製
および分離のための既知の手段、例えば、濾過、カラム
クロマトグラフィー、陰イオンおよび／または陽イオン
交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、
分子篩、などを使用できる。適当な分離および精製技術
を選択する方法、およびそれらを実施する手段は、この
分野において知られている。参照、例えば、Labadario
s,D.,I.M.MoodieおよびG.S.Shephard,J.Chrom.310:223
−231（1984）およびその中の参考文献;Shahroshi,F.お
よびC.W.Gehrke,J.Chrom.36:31−41（1968）。

必要に応じて、また、標的化合物および内部標準を変
性して、精製および／または分離を促進するために、あ
る種の特徴を変更または改良することが必要であるか、
あるいは望ましいことがある。この実施は誘導体化とし
てこの分野においてよく知られている。例えば、標的お
よび参照化合物を、改良された溶解性、異なる電荷、増
大した揮発性などを有する類似体に転化して、質量分析
計の分析前の精製および／または分離を促進することが
望ましいことがある。参照、例えば、Knapp,D.R.,Handb
ook of Analytical Dervatatization Reactions（John
Wiley ＆ Sons,New York,1979）。好ましい手順は、標
的および参照化合物をそれらのシリル誘導体に転化し
て、ガスクロマトグラフィー／質量分析計の装置の組み
合わせによる分離および同定を促進することを包含す
る。この目的に対して化合物をシリル化する手段および
方法は、この分野において知られており、参照、例え
ば、Knapp,supra;Bierman,C.J.,C.M.Kinoshita,J.A.Mar
lettおよびR.D.Steele,J.Chrom.375:330−334（198
6）。好ましい方法は、標的化合物を内部参照と一緒に
し、還元剤を添加してランダム化を実施し、得られる遊
離および複合化したスルフヒドリルアミノ酸の混合物を
部分的に精製し、生成物をアセトニトリル中に溶解し、
そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）
トリフルオロアセトアミド添加してシリル化を達成する
ことを包含する。次いで、得られるシリル化スルフヒド
リル標的化合物および参照化合物を濃縮して、GC/質量
分析計に注入する試料を準備する。

血清についてこの手順を使用すると、合計のホモシス
テインについて１μモル/1の感度を達成することが可能
であり、そしてアッセイは合計のホモシステインについ
て１〜1000μモル/1モルの範囲にわたって直線である。
ヒト血清におけるホモシステインの正常の範囲は約７〜
約22μモル/1であり、そしてヒトの尿において約１〜約
20μモル/1である。これらの範囲より上のホモシステイ
ンのレベルはコバラミンの欠乏および／または葉酸塩の
欠乏を指示する；このレベルが高いほど、指示はより強
い。

また、メチルマロン酸（MMA）のレベルについて、ホ
モシステインのアッセイと同時に、あるいはそれに引続
いて、第２アッセイを実施することにより、コバラミン
の欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが可能であること
が発見された。コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏の両
者はホモシステインのレベルを上昇させるが、コバラミ
ンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベルを上昇させ、こ
れに対して葉酸の欠乏は通常上昇させないであろう。ホ
モシステインのレベルは遺伝的欠陥のない個体において
増大するとき、葉酸塩またはコバラミンの少なくとも一
方は欠乏する。MMAが、また、増大するとき、コバラミ
ンは通常欠乏する。したがって、ホモシステインおよび
MMAの両者が増大するとき、コバラミンは欠乏する（そ
うでなければ、正常である）が、葉酸塩が、また、欠乏
するか否かは明らかでない（なぜなら、合計のホモシス
テインの増大への葉酸塩の欠乏の寄与はコバラミンの欠
乏の作用によってマスクされうるからである）。逆に、
ホモシステインが高いが、MMAが正常であるとき、増大
したホモシステインは葉酸塩の欠乏のためであるように
思われる。なぜなら、コバラミンの欠乏のためのであっ
た場合、MMAも通常高いであろうからである。ある場合
において、MMAレベルは、ホモシステインのレベルが上
昇しはじめる前にさえ、コバラミンの欠乏のために増大
すること、あるいはホモシステインは、MMAのレベルが
上昇しはじめる前に、コバラミンの欠乏のために増大す
ることが、起こりうる。こうして、このアッセイによっ
て供給される情報は、これらの欠乏の早期の適切な診断
に関連して価値がある。

この組合わされたホモシステイン/MMAアッセイにおい
て、ホモシステインのレベルは前述の手段のいずれによ
っても適当にアッセイされる。本発明の手順は好まし
い。MMAは、例えば、次の文献に記載される方法によっ
て適当にアッセイされる:Norman,E.J.,O.J.Marteloおよ
びM.D.Dento,Blood 59（６）:1128（1982）またはMarce
l,P.D.,S.P.Stabler,E.R.PodellおよびR.H.Allen,Anal.
Biochem.150:58−66（1985）。好ましくは、試料は内部
参照標準と一緒にする。この内部参照標準は、安定なア
イソトープマーカー、好ましくはMMAの重水素化類似体
で標識されたメチルマロン酸の既知量からなる。次い
で、存在する標識されたMMAおよび認識されないMMAの量
を質量分析計で測定し、そしてもとの試料中のMMAの量
をはじめ添加した標識されたMMAの既知量から計算す
る。ホモシステインの場合と同様に、標識したMMAおよ
び標識されないMMAを、質量分析計による分析前に、部
分的精製および／または誘導体化にかけることができ
る。好ましい誘導体はシリル類似体である;N−メチル−
Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセト
アミドの類似体はとくに好ましい。

また、１種または２種以上の非スルフヒドリルアミノ
酸、例えば、メチオニンをホモシステイン、MMA、また
は両者と同時に測定することが可能であるが、ただし適
当な内部標準を含める。非スルフヒドリルアミノ酸のた
めの適当な内部標準は、ノルロイシンまたは非スルフヒ
ドリルアミノ酸の適当に標識された類似体である。

いったん葉酸塩の欠乏および／またはコバラミンの欠
乏が決定されると、処置の進行は処置の間または後に周
期的にアッセイを反復することによって監視することが
できる。場合に応じてコバラミンおよび／または葉酸塩
の経口的または非経口的投与後における、血清および／
または尿中のホモシステインのレベルの低下は、診断を
確証することができる。

本発明のそれ以上の理解は、以下の非制限的実施例か
ら得られるであろう。上において使用したように、そし
て以下において特記しないかぎり、すべての温度および
温度範囲はセ氏であり、そして周囲温度および室温は約
20〜25℃である。用語百分率または（％）は質量％であ
り、そして用語モルはグラムモルである。

実施例Ｉ 種々の臨床的指数とコバラミンの欠乏との間の相関関係 24か月の期間（1983年９月〜1985年９月）にわたっ
て、われわれは、7,747人の患者における血清コバラミ
ンのレベルを、２つのニューヨーク市の病院（Columbia
−Presbyterian Medical CenterおよびHarlem Hospital
Center）の医師からのこの試験の要求に答えて測定し
た。この群のうちで、301人の患者は200μモル/1より低
い血清レベルを有し、このレベルは精製した固有の因子
を使用する「改良された」ラジオアッセイキット（BioR
ad Laboratories,Richmond,CA）の製造業者が述べてい
る正常の下限である。低いコバラミンレベルをもつ患者
のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏しているかを決定
するために、すべての患者を完全に研究することを試み
た。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的（神経学的を包含
する）評価、血液および骨髄の塗抹標本、固有因子に対
する抗体についてのシリング（Schiling）テストおよび
血清テストを得、次いでシアノーコバラミンによる処置
の過程に対する患者の応対を観察した。

コバラミンの欠乏が301人の患者のうち138人に存在す
るか否かに関して確固とした結論に到達することができ
た。138人のうち79人において、臨床的症候群または血
液学的症候群、または両者が存在し、シアノ−コバラミ
ン処置に対して明瞭に応答した。これらの患者は欠乏で
あると考えた。これらの患者の臨床的表示の分析は、あ
る数の驚くべき発見を示し、ここで多くはコバラミンの
欠乏のための巨大赤芽球性貧血の古典的特質を有さなか
った。ヘマトクリットは34人（43％）、患者のほぼ半分
において正常（すなわち、貧血は存在しない）であっ
た。中程度に重度の貧血（Hct＜24％またはヘモグロビ
ン＜8g＜dl）は79人の患者のうち16人（すなわち1/5）
において存在したのみであった。36人の患者（45.6％）
において、コバラミンの欠乏の起因させうる症候は存在
しなかった。白血球の数は85％において正常であった；
血小板の数は76％において正常であった；血清ビリルビ
ンは74％において正常であった；そして血清ラクテート
デヒドロゲナーゼ（LDH）は40％において正常であた。
したがって、これらの実験室の発見は、巨大赤芽球性貧
血をもつ患者において典型的であると考えられ、欠乏の
群においてしばしば、または通常見失われていた。ま
た、血清コバラミンは欠乏患者のうち23人（すなわち29
％）において＞100pg/mlであり、血清コバラミンの低下
の程度を、また、信頼性をもって使用して、ある患者が
欠乏であるかどうかを精確に予測することができるであ
ろうことが示された。増大したMCVでさえ、コバラミン
の欠乏のそのような特性であると考えられるが、欠乏患
者のうち15人（19％）において見られなかった。高いMC
Vをもつ患者において、MCVの増大の程度はしばしばわず
かであった;79人の患者のうち28人（すなわち35％）は1
00〜110flの範囲のMCVを有した。こうして、わずかに36
人（すなわち46％）の患者は顕著に増大したMCV（＞110
fl）を有した。

確固とした結論に到達できた138人の患者の中に、シ
アノ−コバラミンに対していかなる方法においても明瞭
に応答しない59人の患者が存在した。これらの患者は欠
乏であると考えなかった。これらの欠乏でない群におい
て、６人（すなわち10％）は100pg/mlより低い血清コバ
ラミンを有し、MCVまたは血清コバラミンの抑制の程度
を患者がコバラミンに欠乏しているかどうかの信頼性あ
る指示として使用できないことがさらに示された。

われわれは、実質的の数の欠乏患者がほんのわずかに
低い血清コバラミンレベル、すなわち、100〜200pg/ml
の範囲をすることを発見した後、200〜300pg/ml（低い
正常）の範囲の血清コバラミンをもつ患者のすべてを再
検討した。このようにして、われわれは、＞200pg/mlの
血清コバラミンレベルを有する、コバラミンが明瞭の欠
乏した、いく人かの患者を発見した。

これらの発見により、われわれは、コバラミンの欠乏
をもつ多数の患者は、通常コバラミンの欠乏において存
在することが期待される「典型的な」臨床的および血液
学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在するかどうかを
確立することを促進する、新しい試験が明らかに必要で
あるという結論に到達した。

次いで、79人の欠乏患者および59人の比欠乏患者から
の標本中のホモシステインおよびメチルマロン酸の血清
レベルを測定した。ホモシステインおよびメチルマロン
酸の両者のレベルは、79人の患者のうち60人（76％）に
おいて明瞭に増大していた（ホモシステイン、30μモル
以上およびメチルマロン酸、150ng/ml以上）。ホモシス
テインレベルは79人の患者のうち10人（13％）において
明瞭に増大しており（メチルマロン酸レベルは明瞭に増
大しないで）、そしてメチルマロン酸レベルは79人の患
者のうち４人（５％）において明瞭に増大していた（ホ
モシステインレベルは明瞭に増大しないで）。79人の欠
乏患者の残りの５人（６％）において、いずれの試験も
明瞭に増大しなかった。

対照的に、59人の欠乏でない患者において、両者の試
験は１人（２％）患者において明瞭に増大した；ホモシ
ステインのみは６人（10％）において明瞭に増大した；
そしてメチルマロン酸レベルは９人（15％）において明
瞭に増大した。残りの43人（73％）の患者において、い
ずれの試験も明瞭に増大しなかった。一方または双方の
試験が明瞭に増大した、欠乏でない患者の小部分におい
てさえ、試験は診断的に有用であることを示した。一方
または双方の試験が明瞭に増大した16人の患者のうち11
人は、コバラミンの吸収の隠れた疾患、例えば、悪性の
貧血、重度の萎縮性胃炎および回腸の病気を有し、ある
後の時においてコバラミンの欠乏の潜在的原因を有する
ことが証明された。このような患者は予防的シアノ−コ
バラミン処置を受ける必要がある。16人のうち追加の２
人の患者は、血清ホモシステインの増大を説明する隠れ
た葉酸の欠乏を有した。

これらの試験は、また、葉酸塩の欠乏の診断において
有用であると思われる。貧血をもつ連続的に研究した。
120人のアルコールの患者において、骨髄を検査した。3
8人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨大赤芽球性で
あった。コバラミンの欠乏を有する１人の患者を分析か
ら排除した後、残りの37人の患者は葉酸の欠乏を有する
可能性が高度に大きいと考えられた。血清葉酸酸濃度
（葉酸塩の欠乏について最も広く使用されている診断）
は37人の患者のうち15人（41％）において低く、これに
対して血清ホモシステインは37人の患者のうち27人（73
％）において明瞭に増大していた。こうして、血清ホモ
システインは血清葉酸塩濃度よりも葉酸塩の欠乏の検出
について感度のある試験であることがわかった。赤血球
の葉酸塩濃度（RCF）を測定した。巨大赤芽球性骨髄を
もつ15人の患者において、RCFは15人のうち10人（67
％）において低く、そして血清ホモシステインは13人
（87％）において明瞭に増大していた。こうして、血清
ホモシステインのアッセイは、また、赤血球葉酸塩アッ
セイよりも感度が高かった。

実施例II ヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な好まし
い手順 ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、D,L−〔3,
3,3′,3′,4,4,4′,4′−²H₈〕ホモシスティン〔これ
は、現在、Merck Sharp and Dohme Isotopes（Montrea
l,Canda）から入手可能である〕と一緒にし、そしてよ
く混合する。

次いで、過剰の還元剤（例えば、２−メルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトールまたはホウ水酸化ナトリウ
ム）を添加して、すべてのホモシステインが遊離の形態
に確実に還元されるようにする。必要に応じて、キレー
ト化剤、例えば、EDTAまたはEGTAを添加して、そうでな
ければ遊離のスルフヒドリル基に結合しうる。金属イオ
ンを除去することができる。この反応混合物を菌株し、
必要に応じて約25〜約150℃に約１分〜約60分間加熱し
て、標識されたホモシステインおよび標識されないホモ
システインのランダム化を確実にする。

次いで、蛋白質を、例えば、加熱変性、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過により、あるいは蛋白質を
沈殿させる化合物、例えば、スルホサリチル産、ピクリ
ル産、硫酸アンモニウムなどを添加することによって除
去する。得られる混合物を攪拌し、そして遠心して蛋白
質の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場合、上澄み
を酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例えば、BioR
ad AG 50W−X8（200〜400メッシュ）、水素型（BioRad
Laboratories,Richmond,CA）に添加して、負に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、塩基性の
pHに調節し、そして陰イオン交換カラム、例えば、BioR
ad AG1−X8（200〜400メッシュ）、酢酸塩型に添加し
て、正に帯電した塩類を除去する。次いで、アミノ酸を
溶離し、乾燥し、そして小型の密閉顔使用なべイアル、
好ましくはテフロンでライニングした離膜のふたをもつ
バイアルに移す。次いで、アセトニトリル中のＮ−メチ
ル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロア
セトアミドを添加し、バイアルを密閉し、そして約20〜
約150℃において約５分間〜約１夜放置して、シリル化
反応を完結させる。好ましくは、バイアルは室温におい
て１夜放置するか、あるいは約80℃に約１時間加熱す
る。次いで、過剰の誘導体化剤を、水（これは攪拌化剤
を加水分解する）および揮発性溶媒の添加によって除去
できる。この混合物を遠心して乳濁液を透明にし、そし
て誘導体剤の大部分を含有する非水性層を透明なバイア
ルに移し、そして例えば、窒素の下で、ほとんど蒸発乾
固して体積を減少させる。

次いで、得られる調製物をガスクロマトグラフ／質量
分析計上に注入し、この装置は約室温〜約350℃の温度
の注入口および約５〜約45psiのカラムヘッドを有す
る。毛管のカラムを約20〜約250℃において約１〜約15
分間運転する。その後温度を約75〜約350℃に約１〜約3
0℃／分で上昇させる。ホモシステインが溶離する精確
な時間および温度は、既知量のホモシステインを最初に
展開することによって決定する。その後、試料を展開
し、そして走査のモードで、あるいは好ましくは選択し
たイオンを監視するモードでデータを集める。

実施例III ヒト血清中のホモシステインを測定する代表的な特異的
手順 Ｌ−ホモシステインおよびＬ−システインはシグマ・
ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）（St.Lou
is.MO）から購入し、そしてＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブ
チルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミドはピア
ース・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Co.）
（Rockford,IL）から入手した;D,L−〔3,3,3′,3′,4,
4,4′,4′−²H₈〕ホモシスティン（98.4％）は、メルク
・シャープ・アンド・ドーム・アイソトープス（Merck
Sharp and Dohme Isotopes （Montreal.Canada）から入
手した；そしてD,L−〔3,3,3′,3′−²H₄〕システィン
（98％）およびＬ−〔メチル−²H₃〕メチオニン（98
％）は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ
（Cambridge Isotope Laboratories）（Woburn,MA）か
ら購入シタ血液の試料は、通常健康な血液供与者からベ
レ・ボノフィルス・ブラッド・バンク（Belle Bonfils
Blood Bnk,Denver,CO）において血液共与時間に得た。
連続的血液の共与者は、次の年令群の各々において５人
の男性および５人の女性から試料が得られるように選択
した:18〜26,27〜35,36〜45,46〜55および56〜65（合計
50の試料）。試料は9a.m.および1p.m.において得、室温
において１〜４時間凝固させ、1500×ｇで30分間遠心
し、そして血清を取り山し、そして−20℃において貯蔵
した。他の試料は実験室の人員から得た。それらを室温
において０〜24時間凝固させた約４℃において遠心する
か、あるいはヘパリンまたはEDTAを添加し、室温におい
て０〜24時間放置した後、血漿を４℃において遠心によ
って集めた。スプレイグーダウリイ（Sprague−Dawle
y）ラット、250−350g、をSASCO、インコポレーテッド
（Omaha,NB）から入手し、そして血液をエーテル麻酔の
下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料に
ついて前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。

５ナノモルのD,L−〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−
²H₈〕ホモシスティン、25ナイモルのD,L−〔3,3,3′,
3′−²H₄〕システィンおよび15ナノモルのＬ−（メチル
−²H₃〕メチオニンを含有するH²Oの50μｌの体積を100
μｌの血清に添加した。混合後、158μｇのNa₂EDAおよ
び100μｌの２−メルカプトエタノールを含有するH₂Oの
2.5mlを添加し、混合し、そして100℃において15分間沸
騰させた。室温に冷却した後、25μｇのスルホサリチル
酸を含有するH₂Oの100μｌおよび6NのHClの25μｌを添
加し、次いで混合し、そして1000×ｇで15分間遠心し
た。次いで、上澄みを200μｌの陽イオン交換樹脂AG 50
W−X8（200〜400メッシュ）、水素型（BioRad Laborato
ries,Richmond,CA）（これはH₂O中で予備平衡化してあ
る）を含有する使捨てカラムに適用した。6mlのH₂Oで洗
浄した後、アミノ酸を2mlの8NのNH₄で溶離した。溶離液
は、直後、200μｌの陰イオン交換樹脂AGI−X8（100〜2
00メッシュ）酢酸塩型（BioRad Laboratories,Richmon
d,CA）（これはH₂O中で予備平衡化してある）を含有す
る使捨てカラムに適用した。9mlのH₂Oで洗浄した後、ア
ミノ酸を2mlの0.1mlのHClで溶離し、そしてスピードVac
カラム濃縮器（Savant Instruments,Inc.,Hicksville,N
Y）で乾固した。次いで、乾燥した試料を250μｌのH₂O
中に溶解し、300μｌのリアクチ（Reacti）バイアル（P
ierce Chemical Co.,Rockford,IL）に移し、そして真空
濃縮装置で乾固した。

10μｌのアセトニトリルおよび10μｌのＮ−メチル−
Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセト
アミドを各バイアルに添加し、それらのテフロンでラン
ニングした隔膜キャップで密閉し、そしてそれらを室温
（22℃）で１夜放置するか、あるいはそれらを80℃に１
時間加熱することによって、アミノ酸のｔ−ブチルジメ
チルシリル誘導体を調製した。100μｌのヘキサンを添
加し、10秒間過形成した後、20μｌのH₂Oを添加して、
未反応の誘導体化剤を加水分解した。さらに10秒間過形
成した後、試料を1000×ｇで５分間遠心し、そして上の
ヘキサン層をデカンテーションし、マイクロ遠心管に移
し、そして窒素の流れの適用によってほぼ10μｌに乾燥
した。完全な乾固を回避するように注意した。なぜな
ら、これは誘導体の主要な部分を失わせるからである。
ほぼ２μｌの毛管カラム上に落下する針の注入装置（fa
lling−needle injector）で注入した。

試料の分析はヘウレット−パッカード（Hewlett−Pac
kard）（Palo Alto,CA）5992Bガスクロマトグラフィー
質量分析計で実施し、そしてこの装置は9825B計算器、9
876Aプリンターおよび分子噴射分離器を装備した。注入
口を変更して、落下する針の注入器を受入れるように
し、そして補助の補充キャリヤーガスのラインを噴射分
離器に供給した。試料の分割は、デュラボンド（Durabo
nd）DB−１溶融シリカ毛管カラム（30m×0.25mm内径、
0.25μｍのフィルム厚さ）〔Ｊ＆Ｗサイエンティフィッ
ク・インコーポレーテッド（Rancho Cordova,CA）から
入手した〕で達成した。

ガスクロマトグラフー質量分析計は、250℃の注入口
の温度および26psiのカラムヘッドの圧力で、標準の自
動同調条件下に操作した。毛管カラムを180℃に平衡化
し、そして試料注入後１分に８℃／分で276℃に増加し
た。データを選択したイオン監視のモードで4.8〜9.6分
に集めた。次の〔Ｍ−57〕⁺イオンを50ミリ秒の滞留時
間で各々について監視した：ホモシステインモノマー、
m/z 420.2;〔3,3,4,4−²H₄〕ホモシステインモノマー、
m/z 424.2;システインモノマー、m/z 406.2;〔3,3−
²H₂〕システインモノマー、m/z 408.2;メチオニン、m/z
320.2;および（メチル−²H₃〕メチオニン、m/z 323.
2。合計のホモシステインは、ほぼ8.9分において溶離さ
れるm/z 420.2ピークの積分した面積（精確な時間は標
準を使用して毎日決定した）を同一時間に溶離したm/z
424.2ピークの積分した面積で割り、次いで各試料に添
加した〔3,3,4,4−²H₄〕ホモシステインモノマーの等し
い量である100μモル/lを掛けることによって定量し
た。合計のシステインは、同一の方法で、ほぼ7.7分に
溶離したm/z 406.2およびm/z 408.2のピークを利用し、
そして試料に添加した〔3,3−²H₂〕システインモノマー
の等しい量である。500μモル/1をそれらの比に掛ける
ことによって定量する。メチオニンは、同一の方法で、
ほぼ5.4分に溶離したm/z 320.2およびm/z 323.2のピー
クを利用し、そして試料に添加した〔メチル−²H₃〕メ
チオニンの量である。150μモル/1をそれらの比に掛け
ることによって定量する。３つの内部標準についての積
分した面積、すなわち、それぞれ、約8.9、7.7および5.
4分に溶離するm/z 424.2、混合物408.2およびm/z 323.2
のピークは、天然に産出するアイソトープの存在量の結
果として、それらに寄与される量について、合計のホモ
システィン、内因性合計のシステインおよび内因性メチ
オニンによって補正する。毎日の基準に基づいて富んで
いないホモシステイン、システインおよびメチオニンを
使用して決定した、これらの相関関係は次の通りであっ
た:i）8.9分におけるm/z 420.2ピークの面積のほぼ1.5
％は8.9分におけるm/z 424.2ピークとして存在し、ii）
7.7分におけるm/z 406.2ピークの面積のほぼ21.4％は7.
7分におけるm/z 408.2ピークとして存在し、そして5.4
分におけるm/z 320.2ピークの面積のほぼ3.1％は5.4分
におけるm/z 323.2ピークとして存在した。

システイン−２−メルカプトエタノール、ホモシステ
イン−２−メルカプトエタノール、システィン、ホモシ
ステイン−システイン二量体、およびホモシスティンを
検出しかつ監視する実験において、実施時間を20分に延
長し、そして最終温度を335℃に上昇させた。システィ
ンおよびホモシスティンについてのスペクトルは、２−
メルカプトエタノールを使用する標準の還元を用いない
で、これらの化合物を直接誘導体化することによって得
た。システイン−２−メルカプトエタノールおよびホモ
システイン−２−メルカプトエタノールについてのスペ
クトルは、それぞれ、システィンおよびホモシスティン
から、これらの化合物を誘導体化前に２−メルカプトエ
タノールで還元する実験において得た。後者の技術を用
いてホモシステイン−システイン二量体についてスペク
トルを得たが、ただしホモシスティンおよびシスティン
の等しい混合物を２−メルカプトエタノールで還元し、
次いで誘導体化した。アッセイの感度は、ホモシステイ
ンモノマー対〔3,3,4,4−²H₄〕ホモシステインモノマー
の比を決定することによって測定し、ここで標準曲線は
次の文献に記載されている直線性から変動する:Zinn,A.
B.,D.G.Hine,M.J.MahoneyおよびK.Tanaka,Pediatr,Res.
16:740−745（1982）。

合計ホモシステイン、メチオニンおよび合計システイ
ンの尿からの洗浄化は、合計ホモシステインについて例
示したように次の等式で決定した： 合計ホモシステイン／クレアチニンの洗浄化比＝100
×〔尿の合計ホモシステイン（μモル/1）／尿のクレア
チニン（μモル/1）／血清合計ホモシステイン（μモル
/l）／血清クレアチニン（μモル/1）〕 この手順において利用する部分的試料の精製の長大な
性質は必要であった。なぜなら、アミノ酸および他の有
機化合物の複雑な混合物が血清および尿の中に存在し、
そして存在する合計ホモシステインの濃度が比較的低か
ったからである。既知量の〔メチル−¹⁴C〕メチオニン
または〔U¹⁴Ｃ〕システィンの血清および尿の試料に添
加する実験は、両者のアミノ酸からの放射能のほぼ70％
が最終のヘキサン溶液中に、長大な精製および誘導体化
の手順の終りに回収されたことを示した。同様な回収の
研究は、放射性標識したホモシステインが商業的入手で
きないので、ホモシステインについ実施しなかった。

ホモシステインのｔ−ブチルジメチルシリル誘導体の
構造およびm/z値を、断片化の位置および〔Ｍ〕⁺、〔Ｍ
−15〕⁺、〔Ｍ−57〕⁺および〔Ｍ−159〕⁺における対応
する断片のm/z値のいくつかと一緒に下に示す： ホモシステインのモノマー、システインのモノマー、
ホモシスティン、システィン、ホモシステイン−２−メ
ルカプトエタノール、システイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体、およびメ
チオニンの分子量を、第１図にそれらのｔ−ブチルジメ
チルシリル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す。特定
の誘導体の分子量は、各存在する−CCOH,−NH₂，−SHお
よび−OH基に結合した各ｔ−ブチルジメチルシリル基に
ついて、アミノ酸またはジサルファイドの分子量＋114
に等しい。ホモシステインのモノマー、システインのモ
ノマー、ホモシステイン−２−メルカプトエタノール、
システイン−２−メルカプトエタノールおよびメチオニ
ンの場合において、主要なピークは〔Ｍ−57〕⁺に存在
した。ホモシスチン、システィンおよびホモシステイン
−システイン二量体の場合において、主要なピークは
〔M/2〕⁺に存在した。〔Ｍ−57〕⁺ピークはホモシスチ
ンでは観察されず、そしてほんの小さい〔Ｍ−57〕⁺が
システィンおよびホモシステイン−システイン二量体に
ついて観察された。 第２図は、（Ａ）メチオニン、シ
ステインおよびホモシステインを1:3:1で含有する混合
物；（Ｂ）100μｌの正常ヒト血清；（Ｃ）100μｌの正
常ヒト血清；（Ｄ）100μｌの正常ヒト尿から還元後に
得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体
類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ酸は、次の
通りであった：メチオニン（MET）；システインのモノ
マー（CYS）；ホモシステインのモノマー（HCYS）；
〔メチル−²H₃〕メチオニン〔Met＊）；〔3,3−²H₂〕シ
ステインモノマー；および〔3,3,4,4−²H₄〕ホモシステ
インモノマー（HCYS＊）。MET＊,CYS＊およびHCY＊は試
料Ａには添加せず、そしてそれらの表示を有するピーク
は、天然に産出するアイソトープの存在量の結果とし
て、それぞれ、MET,CYSおよびHCYSによってそれらに寄
与される量を表わす。かっこ内の数字は、選択したイオ
ンの監視によって走査したm/zについての値である。
「F.S.」についての値は太いダッシュのトレースの全規
模についての相対値である；細いダッシュのトレースは
10×の減衰である。内因性合計ホモシステインについて
決定した値は、B,CおよびＤについて、それぞれ、18.
9、6.5および3.6μモル/lであった。内因性合計システ
インについて決定した値は、B,CおよびＤについて、そ
れぞれ、369、173および238μモル/1であった。内因性
合計メチオニンについて決定した値は、B,CおよびＤに
ついて、それぞれ16.8,60.4および3.2μモル/lであっ
た。第2A図は、毛管カラムがこれらの３種類のアミノ酸
を完全に分離することを立証している。システイン−２
−メルカプトエタノール、ホモシステイン−２−メルカ
プトエタノール、システィン、ホモシステイン−システ
インおよびホモシスチンの溶離プロフィルは示すされて
いないが、それらは、また、存在し、そして、それぞ
れ、11.8、12.9、16.3、17.4および18.4分の溶離時間を
もつ単一の対照ピークとして溶離される。

〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−²H₈〕ホモシスチン、
〔3,3,3′,3′，−²H₄システィンおよび〔メチル−
²H₃〕メチオニンを添加しない、ヒト血清および尿、お
よびラットの血清の試料を使用する研究は、定量のため
に内部標準としてのそれらの試料を妨害する物質が存在
しないことを立証した。アッセイの感度は50μモル/lの
〔3,3,3′,3′,4,4,4′,4′−²H₈〕ホモシスチン、250
μモル/lの〔3,3,3′,3′，−²H₄システィンおよび150
μモル/lの〔メチル²H₃〕メチオニンを使用する標準の
条件下に、合計ホモシステインについて１μモル/l、合
計システインについて５μモル/lおよびメチオニンにつ
いて２μモル/lあったが、感度は各場合において添加す
る内部標準の量を減少することによって改良できた。標
準条件下実施したアッセイは、３種類のアッセイの各々
についのアッセイが合計ホモシステインについて１〜10
00μモル/l、合計システインについて５〜5000μモル/
l、そしてメチオニンについて２〜2000ミモル/lの範囲
にわたって直線であることを示した。

100μｌの正常ヒト血清を使用して得たクロマトグラ
ムは第2B図に示されている。内因性合計システインは最
大の量で存在し、次いで内因性メチオニンおよび次いで
内因性合計ホモシステインが存在する。合計システイン
のほぼ70％はほぼ7.7分におけるシステインモノマーの
ピーク中に存在し、残りの30％は後の時間期間に溶離さ
れるシステイン−２−メルカプトエタノール（20％）、
システイン（９％）よびホモシステイン−システイン二
量体（１％）のピークとして存在した（データは示され
ていない）（上を参照）。合計ホモシステインのほぼ60
％はホモシステインモノマーのピーク中に存在し、この
ピークはほぼ8.9分で溶離され、残りは後に溶離される
ホモシステイン−２−メルカプトエタノール（25％）ホ
モシステイン−システイン二量体（14％）およびホモシ
ステイン（１％）のピークとして存在した（データは示
されていない）（上を参照）。

システインおよびホモシステインの種々の形態の百分
率は、試料毎にかなり変化したが、２−メルカプトエタ
ノールの沸騰期間が１分から60分に変化したとき、ある
いは２−メルカプトエタノールの量が５μｌから100μ
ｌに変化したとき、所定の試料について変化しなかっ
た。内因性システイン対〔3,3−²H₂〕システインの比
は、システインを含有する種々のピークのすべてにおい
て本質的に同一であった。内因性ホモシステイン対〔3,
3,4,4−²H₄〕ホモシステインの比は、ホモシステインを
含有する種々のピークのすべてにおいて本質的に同一で
あった。これらの観察が示すように、システインおよび
ホモシステインの内因性および内部の標準形態は、100
μｌの２−メルカプトエタノールを使用する初期の15分
の還元によって、完全に還元され、そして蛋白質へ結合
した形態を包含する、それらの種々のジサルファイドの
形態から解放され、そして少量であるが、有意な量の種
々のジサルファイドは精製および誘導体化の引き続く段
階において再形成する。この引続く部分ジサルファイド
の再形成は、内因性合計システインおよび内因性合計ホ
モシステインの定量を妨害しない。なぜなら、システイ
ンおよびホモシステインのために利用する内部標準、す
なわち〔3,3,3′,3′−²H₄〕シスチンおよび〔3,3,3′,
3′4,4,4′,4′−²H₈〕ホモシスチンは、また、完全に
還元され、次いで、内因性合計システインおよび内因性
合計ホモシステインと同程度に、部分的ジサルファイド
の再形成に参加するからである。システインモノマー、
システイン−２−メルカプトエタノール、シスチン、ま
たはホモシステイン−システイン二量体のピークのいず
れにおいても、重水素化システイン対内因性システイン
の比を使用して内因性合計システインを定量することは
可能である。なぜなら、この比の値はいかなる所定の試
料についてのすべて４つのピークにおいても同一である
からである。また、ホモシステインモノマー、ホモシス
テイン−２−メルカプトエタノール、ホモシスチン、ま
たはホモシステイン−システイン二量体のピークのいず
れにおいても、重水素化ホモシステイン対内因性ホモシ
ステインの比を使用して内因性合計ホモシステインを定
量することは可能である。なぜなら、この比の値はいか
なる所定の試料についてのすべて４つのピークにおいて
も同一であるからである。われわれの標準手順において
システインモノマーおよびホモシステインモノマーのピ
ークにおいて得られた比を測定し、かつそれを使用する
ことを選択した。なぜなら、それらは通常最大のピーク
であり、そしてそれらは他のピークより早く溶離される
からである。

初期の研究において、最初の還元工程後に、システイ
ンモノマーおよびホモシステインモノマーにヨードアセ
トアミドを結合し、次いで標準の方法で精製および誘導
体化の手順を進行させることが可能であることが示され
た（データは示されていない）。この修正法は、ジサル
ファイドの再形成を防止するが、詳細に評価しなかっ
た。

２−メルカプトエタノールによる還元をヒト血清を使
用する標準手順から省略するとき、シスチン、ホモシス
チン、およびホモシステイン−システイン二量体のピー
クが観測され、これらのピークは、それぞれ、システイ
ン、ホモシステインおよび両者のホモシステインおよび
システインの内因性形態を含有する。システイン−２−
メルカプトエタノールおよびホモシステイン−２−メル
カプトエタノールは、これらの条件下で検出不可能であ
る（データは表わされていない）。

100μｌの正常ラット血清および100μｌの正常ヒト尿
を使用して得られたクロマトグラムは、それぞれ、第2C
図および第2D図に示されており、そして正常ヒト血清を
もちいて得られたクロマトグラム（第2B図）に類似す
る。

反復して凍結および融解し、そして１月の期間にわた
って16の異なる場合についてアッセイした、プールした
正常ヒト血清の単一の試料を使用して実施した研究は、
合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオニン
のアッセイについて、それぞれ、19.7％、17.4％および
5.6％の変動係数についての値を与えた。これらの３種
類のアミノ酸についての値の有意の変動または傾向は１
月の期間にわたって観測されず、また同一の血清を他の
場合において12か月の期間にわたってアッセイしたと
き、変化は観測されなかった。

抜出しかつ直ちに４℃において遠心した血液試料を使
用して得られた血清の合計ホモシステインについての値
は、遠心前室温において１時間インキュベーションした
同一血液試料の一部を使用して得られた値と同一（10％
の差）であったが、遠心前にインキュベーションを４時
間および24時間に延長したとき、それぞれ、ほぼ35％お
よび75％だけ増加した。血清の合計システインについて
の値は、24時間のインキュベーション期間にわたって不
変化であった。血清メチオニンについての値は、１時間
不変化であり、そして４時間および24時間において、そ
れぞれ、10％および25％だけ増加した。EDTAまたはヘパ
リン中に集めた血漿は、メチオニンを除外して、すべて
の時間期間においてすべての３種類のアミノ酸について
血清の値と同一である値を与えたが、メチオニンの場合
において、両者のタイプの血漿についての値は４時間お
よび24時間のインキュベーション期間にわたって、すべ
て増加しなかった。ラット二量体を使用して実施したイ
ンキュベーションの研究は、ヒト血清を使用して得られ
た結果に類似する結果を与えた。合計ホモシステイン、
尿の合計システインおよび合計メチオニンについての値
は、尿の試料を０時間〜24時間の間室温においてインキ
ュベーションしたとき、変化しなかった。

50人の正常ヒト被検者および50匹の正常ラットからの
合計ホモシステイン、合計システインおよびメチオニン
について得られ、より高い値に向かうひずみについて補
正するために対数変換後に平均±2 S.D.として計算し
た。実際の平均（μモル/l）および範囲についての値
は、次の通りであった。ヒト血清合計ホモシステイン、
13.0（7.2−21.7）；ヒト血清合計メチオニン、23.5
（13.7−43.5）；ヒト血清郷家システイン、261（174−
378）；ラット血清合計ホモシステイン、5.6（3.2−9.
6）；ラット血清合計メチオニン、56（39−83）；ラッ
ト血清合計システイン、190（131−283）。同一の50人
の正常ヒト被検者から得、上に定義したように計算し
た。実際の平均（μモル/lまたはμモル/10ミリモルの
クレアチニン）および範囲についての値は、次の通りで
あった：ヒト尿合計ホモシステイン、7.2（1.4−24.
7）；ヒト尿合計ホモシステイン/10ミリモルのクレアチ
ニン、11.2（2.0−36.7）；ヒト尿合計メチオニン、5.9
（0.4−35.1）；ヒト尿合計メチオニン/10ミリモルのク
レアチニン、6.3（1.5−19.1）；ヒト尿合計システイ
ン、260（68−729）；ヒト尿合計システイン、/10ミリ
モルのクレアチニン、344（158−655）。尿中の合計シ
ステインおよびメチオニンの正常な範囲は、μモル/lと
して表わすときより、μモル/10ミリモルのクレアチニ
ンとして表わすとき高い。

合計ホモシステインおよび合計システインについての
値は、ラット血清におけるよりヒト血清において有意に
（Ｐ＜0.05）高かった。メチオニンについての値は、ヒ
ト血清におけるよりラット血清において有意に（Ｐ＜0.
05）高かった。

ヒト血清の合計ホモシステイン、合計システインおよ
びメチオニンは、尿の値をμモル/lまたはμモル/10ミ
リモルのクレアチンとして表すか否かに無関係に、それ
ぞれ、尿の合計ホモシステイン、合計システインおよび
メチオニンと相関関係がなかった。血清合計ホモシステ
インおよび血清メチオニンについての値は、女性よりも
男性において、それぞれ、20％および22％だけ高かった
（Ｐ＜0.05）。血清合計システイン、尿合計ホモシステ
イン、尿合計システインおよび尿メチオニンについての
値は男性および女性について有意に異ならなかった。血
清合計ホモシステインについての値は、年令、ヘモグロ
ビン、平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラ
ミン、血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計システイ
ンまたは血清メチルマロン酸と有意な相関関係をもたな
かった。最高の補正係数は、血清合計ホモシステインと
ヘモグロビンとの間で0.37（Ｐ＝0.06）そして血清合計
ホモシステインと血清葉酸塩との間で０−0.34（Ｐ＝0.
06）であった。血清ホモシステインと血清コバラミンと
の間の相関関係係数は0.14（Ｐ＝0.44）であった。血清
メチオニンについての値は、相関関係係数が0.44（Ｐ＜
0.05）であるヘモグロビンを除外して、前述のパラメー
ターのいずれとも有意に相関関係をもたなかった。血清
メチオニンと血清葉酸塩との間、および血清メチオニン
と血清コバラミンとの間の相関関係係数は、それぞれ、
−0.09（Ｐ＝0.64）および0.20（Ｐ＝0.29）であった。
血清合計システインは、年令および血清メチルマロン酸
を除外して、前述パラメーターと有意な相関関係をもた
なかった。血清合計システインと年令との間、および血
清合計システインと血清メチルマロン酸との間の相関関
係係数は、それぞれ、0.38（Ｐ＜0.01）および0.30（Ｐ
＜0.05）であった。μモル/lまたはμモル/l0ミリモル
のクレアチニンとして表した尿合計ホモシステイン、尿
合計システインおよび尿メチオニンについての値は、年
令、ヘモグロビン、平均血球体積、白血球数、血小板
数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清メチルマロン
酸、血清合計ホモシステイン、血清メチオニンまたは血
清合計システインと有意な相関関係をもたなかった。

クリアチニンの浄化に関する合計ホモシステイン、合
計システインおよびメチオニンのヒト血清からの平均の
尿浄化は、それぞれ、0.3％、0.6％および0.1％である
と計算された。これらの観測が立証するように、血清中
に存在する合計ホモシステイン、合計システインおよび
メチオニンのほんの小さい分画のみが尿中に分泌され、
そして、これらのアミノ酸の濃度のレベルおよび相対的
変化は、こうして、種々の病理学的状態における血清と
尿との間で異なりうる。

こうして、正常のヒトおよびラットからの血清および
正常のヒトからの尿の中の合計ホモシステインおよび合
計システインを検出しかつ定量することを可能とする技
術を開発しかつ立証した。適当なスルフヒドリル化合
物、例えば、２−メルカプトエタノールを使用する還元
は、血清中の合計ホモシステインおよび合計システイン
を測定するために必須である。なぜなら、これらのアミ
ノ酸の50％〜70％はジサルファイド結合を介して血清蛋
白質へ共有結合するからである。われわれの研究および
他の研究が示されるように、この結合したホモシステイ
ンおよびシステインの遊離は、急速に起こるが、われわ
れの研究が、また、示すように、還元後の新しいサルフ
ァイドの形成は有意な程度に起こる。質量分析計に基づ
く検出および定量は、ホモシステインおよびシステイン
それら自体の安定なアイソトープの形態を内部標準とし
て使用できるので、この場合においてきわめて有益であ
る。これらの内部標準は内因性合計ホモシステインおよ
び内因性システインと還元工程の間平衡化し、そして新
しいジサルファイドの部分的形成の間平衡状態にとどま
る。また、初期の還元工程を省略することができ、これ
によって、適当な内部標準を利用するかぎり、遊離のホ
モシステイン、遊離のシスチン、および遊離のホモシス
テイン−システイン二量体を検出しかつ測定することが
可能である。本発明の方法を利用して、蛋白質結合した
ホモシステインおよびシステインを別々に測定すること
が可能であろうが、これを研究しなかった。また、追加
の内部標準を利用して他のアミノ酸を同時に測定するこ
とが可能である。われわれは、メチオニンの場合におい
て、これを実施し、そしてこの方法を他のアミノ酸に容
易に適用できることを発見した。

ヒトおよびラットの血清およびヒトの尿の中の合計ホ
モシステインの正常な範囲を、われわれは規定した。ヒ
トの血清および尿についての値は、次の文献に報告され
ているものに類似する： Refsum,H.,S.HellandおよびP.M.Ueland,Clin.Chem.31
（４）:624−628（1985）。ヒト血清についてのわれわ
れの値は上の文献の値よりほぼ30％だけ高いが、これ
は、一部分、われわれの手順において内部標準として安
定なアイソトープの形態を使用したためであり、また、
一部分、われわれの手順におけるように試料を室温で凝
固させるとき、合計ホモシステインの値が多少増加する
という事実のためであろう。

また、ヒト血清およびヒト尿中の合計システインにつ
いての正常範囲を、われわれは規定した。ヒト血清に関
するわれわれの値は、Malloy,M.H.,D.K.RassinおよびG.
H.Gaull,Anal.Biochem.113:407−415（1981）に報告さ
れている値と良好に一致し、この文献はジチオスレイト
ールで還元し、次いで内因性合計システインを分光高度
測定によって決定している。われわれの値がほぼ20％だ
け高いという事実は、前述のようにわれわれの手順にお
いて安定なアイソトープの内部標準を含有させることを
反映しているであろう。ヒト尿の合計システインはMart
ensson,J.,Metabism 31:487−492（1982）に報告されて
いるものに類似し、この文献は標準のアミノ酸分析装置
を利用している。

ヒトおよびラットの血清およびヒト尿中のメチオニン
についてわれわれが決定した正常範囲は、アミノ酸分析
装置を使用したある数の他の研究者らによって決定され
た値と、きわめてよく一致する。

ラット血清中の合計ホモシステイン、合計システイン
およびメチオニンについてのわれわれの値は、他の研究
者らの限定されたデータに類似する。

ヒト血清中の合計ホモシステインを測定する感受性の
特異的方法の利用可能性は、次のものを含む、ある数の
臨床的用途を有するであろう：（ｉ）臨床的に確証され
たコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する患者における
血清合計ホモシステインについての増大した他の出現の
決定、（ii）血清コバラミンおよび血清葉酸塩の診断的
感度および特異性をアッセイするために、血清コバラミ
ンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、または低い正常レ
ベルにある患者の血清中の合計ホモシステインのレベル
の決定、（iii）種々の神経精神学的異常をもつ患者を
および初老の人の群におけるコバラミンおよび葉酸塩の
欠乏の発生をよりよく規定するために、これらの群にお
ける血清中の合計ホモシステインの決定、および（iv）
抹消血管および脳血管の病気の増大した発生と相関関係
をもつヘテロ接合状態について、よりすぐれた診断試験
を開発することを試みた、シスタチオンシンセターゼの
欠乏のためのヘテロ接合体（heterozygote）中の合計ホ
モシステインの決定。ヒト血清中の合計ホモシステイン
のアッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸塩の欠乏の
両者の比較的感度の高い測定手段である。動物、例え
ば、ラットの血清中の合計ホモシステインを測定できる
ということは、亜酸化窒素、コバラミン類以体、葉酸塩
類以体、例えば、メトトレキセート、およびコバラミン
の欠乏または葉酸塩の欠乏食物を使用する研究におい
て、また、有用であり、これらの物質のすべてはコバラ
ミンおよび葉酸塩の代謝および利用の種々な面を妨害す
る。

実施例IV メチルマロン酸の代表的アッセイ Marcell,P.D.,S.P.Stabler,E.R.PodellおよびR.H.All
en,Anal.Biochem.150:58−66（1985）の方法に従う。

メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグマ
・ケミカル・カンパニー（Sigmn Chemical Co.）（St.L
ouis,MO）から購入し、そしてメチルマロン酸はJ.T.べ
イカー・ケミカル・カンパニー〔Baker Chemical Co.）
（Philipsburg,NJ）〕から入手し、そしてジメチルマロ
ン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー〔Aldrich
Chemical Co.）（Milwaukee,WI〕から入手し、〔メチル
−²H₃〕メチルマロン酸（＞99％、慣用の合成による）
および〔1,4−¹³C₂〕コハク酸（＞99％）はメルク・シ
ャープ、アンド・ドーム・アイソトープス（Merck Shar
p and Dohme Isotopes（Montreal,Canda）から入手し
た。（メチル−¹⁴C）メチルマロン酸（慣用の合成によ
る）および〔1,4−¹⁴C₂〕コハク酸はニュー・イングラ
ンド・コーポレーション〔New England Co.（boston,M
A）〕から購入した。Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジ
メチルシリル）トリフルオロアセトアミドは、ピアース
・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Co.）（Roc
kford,IL）から購入した。すべての溶媒は、バーディッ
ク・アンド・ジャクソン・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド〔Burdick ＆ Jackson Laboratories,Inc.
（Muskegon,MI）〕からの高性能液体クロマトグラフィ
ーの等級のものであった。血液の試料は、通常健康な血
液共与者からベレ・ボノフィルス・ブラッド・バンク
（Belle Bonfils Blood Bank,Denver,CO）において血液
共与時間に得た。連続的血液の共与者は、次の年令群の
各々において５人の男性および５人の女性から試料が得
られるように選択した:18〜26、27〜35、36〜45、46〜5
5および56〜65（合計50の試料）。試料は9a,m.および1
p.m.の間において得、室温において１〜４時間凝固さ
せ、1500gで30分間遠心し、そして血清を取り出し、そ
して−20℃において貯蔵した。さらに、他の試料を遠心
前に０〜24時間凝固させた。スポット尿の試料を、血液
試料を得たとき30分以内に同一の50人の個体から集め、
そして−20℃において同様に貯蔵した。スプレイグーダ
ウリイ（Sprague−Dawley）ラット、250−350g、をSASC
O,インコーポレーテッド（Omaha,NE）から入手し、そし
て血液をエーテル麻酔の下に心臓内穿刺によって得た。
ヒト血液共与者の試料について前述したように、血清を
集めそして貯蔵した。

200ngの〔メチル−²H₃〕メチルマロン酸および2000ng
の〔1,4−¹³C₂〕コハク酸を含有する50μｌのH₂Oを500
μｌの血清または100μｌの尿に添加し、そして尿の試
料にさらに400μｌのH₂Oを添加した。次いで、pHを50μ
ｌの2NのNaOHの添加により約12に上昇させ、次いで5ml
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、10
00gで３分間遠心し、上のエーテル層をデカンテーショ
ンしそして廃棄した。次いで、pHを50μｌの6NのHClの
添加により約１に調節し、そして試料を前述のように5m
lのジエチルエーテルで２回抽出した。エーテル抽出液
をプールし、40℃の水浴中で窒素の流れの供給によって
乾固し、次いで500μｌのH₂OのH₂O中に溶解した。試料
全体をウォーターズ・アソシエーツ〔Waters Associate
s（Milford,MA）〕高性能液体をクロマトグラフィー陰
イオン交換樹脂システム上注入した。このシステムは72
0システムコントローラー、730データモジュール、２つ
の6000Aポンプ、U6Kインゼクター、およびＺ−モジュー
ルからなり、ラジアル・パク（Radial Pak）SAXカート
リッジ（10μｌ、8mm×10cm）およびワットマン、イン
コーポレーテッド〔Whatman,Inc.Clifton,NJ）〕から入
手した薄膜陰イオン交換体を詰めた予備カラム（４×23
mm）を装備していた。移動相は0.05モルのKH₂PO₄−H₃PO
₄、pH2.0から成り、そして2mlの分画を2ml/分の速度で
集めた。分画３〜５は95％より多くメチルマロン酸およ
びコハク酸を含有し、これらは〔メチル−¹⁴C〕メチル
マロン酸および〔1,4−¹⁴C₂〕コハク酸を使用して実施
した分離実験に基づいて注入し、これらのコハク酸を使
用してクロマトグラフィーのシステムを毎日の基準で検
査した。これらの分画をプールし、50μｌの6N HClを添
加してpHをほぼ１に調節し、そして前述のように試料を
5mlのジエチルエーテルで２回抽出した。これらのエー
テル抽出液をプールし、40℃の水浴中で窒素の流れに適
用によって乾固し、そして300μｌのレアクチ（React
i）バイアル〔ピアース・ケミカル・カンパニー（Pierc
e Chemical Co.）（Rockford,IL）〕に150μｌのメタノ
ールすすぎ液と一緒に移した。次いで、試料をスピード
・バク（Speed Vac）真空濃縮器〔サバント・インスト
ルメンツ・インコポレーテッド（Savant Instruments,I
nc.（Hicksville,NY）〕内で乾固した。

100μｌのアセトニトリルおよび10μｌのＮ−メチル
−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセ
トアミドを各バイアルに添加し、それらのテフロンでラ
イニングした隔膜キャップで密封し、そしてそれらを室
温（22℃）で１夜放置するか、あるいはそれらを80℃に
１時間加熱することによって、ジカルボン酸のｔ−ブチ
ルジメチルシリルエステル調整した。100μｌのH₂Oを添
加して、反応の誘導体化剤を加水分解し、次いで250μ
ｌのヘキサンを添加し、激しく混合し、そして1000gで
５分間遠心した。上のヘキサン層をデカンテーション
し、別のレアチ・バイアルに移し、窒素の流れの適用に
よってほぼ５μｌに乾燥した。完全な乾固を回避するよ
うに注意した。なぜなら、これは誘導体の主要な部分を
失わせるからである。ほぼ２μｌを毛管カラム上に落下
する針の注入装置（falling−needle injector）でヘウ
レット−パッカード（Hewlett−Packard）（Palo Alto,
CA）5992Bガスクロマトグラフー質量分析計に注入し、
そしてこの装置は9825B計算器、9876Aプリンターおよび
分子噴射分離器を装備していた。注入口を変更して、落
下する針の注入器を受入れるようにし、そして補助の補
充キャリヤーガスのラインを噴射分離器に供給した。試
料の分割は、デュラポンド（Durabond）DB−５培養シリ
カ毛管カラム（30m×0.25μｌのフィルム厚さ）〔J ＆
Wサイエンティフィック・インコーポレーテッド（Ranch
o Cordova,CA）から入手した〕で達成した。ガスクロマ
トグラフィー質量分析計は、250℃の注入口の濃度およ
び22psiのカラムヘッドの圧力で、標準の自動同調条件
下に操作した。毛管カラムを160℃に平衡化し、そして
試料注入後6.5分に８℃／分で188℃に増加した。データ
を選択したイオン監視のモードで5.8〜12.5分に集め
た。次の〔Ｍ−57〕⁺イオンを50ミリ秒の滞留時間で各
々について監視した：マロン酸、m/z 275.2;メチルマロ
ン酸、m/z 289.2;〔メチル−²H₃〕メチルマロン酸、m/z
292.2;コハク酸、m/z 289.2;〔1.4−¹³C₂〕コハク酸、
m/z 291.2;ジメチルマロン酸、m/z 303.2;エチルマロン
酸、m/z 303.2;メチルコハク酸、m/z 303.2;およびグル
タル酸m/z 303.2。メチルマロン酸は、ほぼ6.8分におい
て溶離されるm/z 289.2ピークの積分した面積（精確な
時間は標準を使用して毎日決定した）を同一時間に溶離
したm/z 292.2ピークの積分で割り、次いで各試料に添
加した〔メチル−²H₃〕メチルマロン酸の等しい量であ
る、200ngを掛けることによって定量した。コハク酸
は、同一の方法で、ほぼ9.3分に溶離したm/z 289.2およ
びm/z 291.2のピークを利用し、そして試料に添加した
〔1,4−¹³C₃〕コハク酸の量である、200ngをそれらの比
に掛けることによって定量する。２つの内部標準につい
ての積分した面積、すなわち約6.8および9.3分に溶離す
るm/z 292.2およびm/z 291.2のピークは、天然に産出す
るアイソトープの存在量の結果として、それらに寄与さ
れる量について、メチルマロン酸およびコハク酸によっ
て補正する。毎日の基準に基づいて富んでないメチルマ
ロン酸を使用して決定した、これらの補正は次の通りで
あった:i）6.8分におけるm/z 289.2ピークの面積のほぼ
1.9％は6.8分におけるm/z 292.2ピークとして存在シ、
そしてii）9.3分におけるm/z 289.2ピークの面積のほぼ
10.8％は9.3分におけるm/z 291.2ピークとして存在し
た。

アッセイの感度は、例えば、メチルマロン酸対〔メチ
ル−²H₃〕メチルマロン酸の比を決定することによって
測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載されている直
線性から変動する:Zinn,A.B.,D.G.Hine,M.J.Mahoneyお
よびK.Tanaka,Padiatr.Res.16:740−745（1982）。

クレアチンの浄化に関する、血清からのメチルマロン
酸およびコハク酸の尿浄化は、メチルマロン酸について
例示したように次の等式で決定した： メチルマロン酸／クレアチニンの清浄化比＝100×
〔尿のメチルマロン酸（ng/ ml）／尿のクレアチニン
（ng/ml）／〔血清メチルマロン酸（ng/ml）／血清 ク
レアチニン（ng/ml）〕 この手順において利用する部分的試料の精製の長大な
性質は必要であった。なぜなら、アミノ酸および他の有
機化合物の複雑な混合物が血清および尿の中に存在し、
そして存在するメチルマロン酸の濃度が比較的低かった
からである。種々の有機溶媒を使用する抽出、次いで小
型の陰イオン−交換または逆相カラムを使用するそれ以
上の精製を用いる手順は、不満足であった。陰イオン−
交換樹脂を使用する高性能液体クロマトグラフィーは、
非常の有益であることが証明された。なぜなら、研究す
るジカルボン酸のpKa値はpH2において遅延するが、ほと
んどの他の化合物は遅延しなかったからである。尿試料
の分析は、血清について必要とするのと同程度の部分的
精製を必要としていた。〔メチル−¹⁴C〕メチルマロン
酸および〔1,4−¹⁴C〕コハク酸の既知量を血清および尿
の試料に添加する実験は、両者のジカルボン酸の10〜20
％が最終のヘキサン溶液中に長大な部分的精製および誘
導体化の手順後の終りにおいて回収されることを示し
た。

ｔ−ブチルジメチルクロロシラン/N,N−ジメチルホル
ムアミド／イミダゾールの混合物を使用するジカルボン
酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を生成する初期の
試み（Applied Science Laboratories,Inc.,State Coll
ege,PA）〔de Jong,A.P.J.M.,J.ElemaおよびB.J.T.van
de Berg,Biomed.Mass Spectrom.7:359−364（1980）に
記載されている〕は、誘導体化が著しく変動しそして誘
導体が比較的不安定であるために、不満足であった。あ
るｔ−ブチルジメチルシリル誘導体、例えば、ある種の
有機酸のエステルを加水分解するときの予期されない容
易さに関する問題が、過去において生じた。Jongらが記
載する反応混合物のpHはほぼ１であること、およびクロ
ロシランを含む反応によって生成するHClをイミダゾー
ルが完全に掃去することができないために、これは新し
く生成したジカルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘
導体の加水分解を生ずることを、われわれは発見した。
この問題は他のスキャベンジャー、例えば、ピリジンの
添加によって部分的にのみ補正されただけである。しか
しながら、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）トリフルオロアセトアミドを使用して調整したｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体は、高い収率で、再現性の
ある方法で得られ、そして前述のようにヘキサン中に抽
出した後１時間以上安定であることを、われわれは発見
した。したがって、この手順はわれわれの標準法として
応用した。

メチルマロン酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体の
構造およびm/z値を、断片化位置および（Ｍ−57〕⁺およ
び〔Ｍ−15〕⁺に存在する問題の主要な断片のm/z値と一
緒に下に示す： マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメチルマロ
ン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル
酸の分子量は、それらのｔ−ブチルジメチルシリル誘導
体の質量スペクトルと一緒に第３図に示されている。特
定の誘導体の分子量は、２つのｔ−ブチルジメチルシリ
ル基の付加のために、ジカルボン酸の分子量＋228に等
しい。誘導体全体を表わすピーク、すなわち〔Ｍ〕
⁺は、ジカルボン酸のいずれについても観測されなかっ
た。むしろ、各場合の主要なピークは〔Ｍ−57〕⁺であ
り、これは100〜400m/z範囲におけるすべてのピークの
合計の35〜45％を表わした。〔Ｍ−15〕⁺を表わす、よ
り小さいピークも各ジカルボン酸誘導体について観測さ
れたが、量は〔Ｍ−57〕⁺ピークについて存在する量の
わずかに３〜６％であった。m/z 147の値をもつピーク
はジカルボン酸誘導体のすべてについて観測され、そし
てm/z 189をもつピークはグルタル酸誘導体を除外する
すべてについて観測された。これらのピークの両者は、
ｔ−ブチルジメチルシリル基それら自体の一部の断片化
および転位から生ずると思われ、そして、豊富なm/z 14
7およびm/z 189ピークが、また、〔メチル−¹H₃〕メチ
ルマロン酸および〔1,4−¹³C₂〕コハク酸について観測
されるので、ジカルボン酸それら自体の部分を含まな
い。

第４図は、（Ａ）１μｇの各酸を含有する混合物；
（Ｂ）500μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）500μ
ｌの正常ラット血清；および（Ｄ）100μｌの正常ヒト
尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチルジメチルシ
リル誘導体類のクロマトグラムを示す。研究したアミノ
酸は、次の通りであった：マロン酸〔MA〕、メチルマロ
ン酸〔MMA〕、コハク酸〔SA〕、〔1,4−¹³C₂〕コハク酸
（SA＊）、〔メチル−²H₃〕メチルマロン酸（MMA＊）、
ジメチルマロン酸（DMMA）、エチルマロン酸（EMA）、
メチルコハク酸（MSA）およびグルタル酸（GA）。かっ
こ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査した
m/zについての値である。「F.S.」についての値は太い
ダッシュのトレースの全規模についての相対値である；
細いダッシュのトレースは10×減衰である。MMAについ
て決定した値は、Ｂ、ＣおよびＤについて、それぞれ、
56、92および3400ng/mlであった。SAについて決定した
値は、Ｂ、ＣおよびＤについて、それぞれ、1110、9200
および19,000ng/mlであった。

第4A図が立証するように、毛管カラムは同一の分子量
を有する誘導体のすべてについて完全な分離を与える。
すなわち、メチルマロン酸およびコハク酸は互いに完全
に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチルマロン
酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに完全に分
離される。メチルマロン酸はジメチルマロン酸から完全
に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から完全に分
離されないが、これは問題ではない。なぜなら、第３図
に示すように、これらの分割されないジカルボン酸誘導
体は異なる分子量および質量スペクトルを有し、こうし
て選択したイオンを監視するとき妨害が存在しないから
である。

〔メチル−²H₃〕メチルマロン酸および〔1,4−¹³C₃〕
コハク酸を添加しない、ヒトの血清および尿、およびラ
ットの血清の試料を使用する研究は、定量のために内部
基準としてのそれらの使用を妨害する物質が存在しない
ことを立証した。アッセイの感度は200ngの〔メチル−²
H₃〕メチルマロン酸および2000ngの〔1,4−¹³C₃〕コハ
ク酸を使用する標準の条件下に、メチルマロン酸につい
て5ng/mlおよびコハク酸について150ng/mlであったが、
感度は各場合において添加する内部標準の量を減少する
ことによって改良できた。標準条件下で実施したアッセ
イは、水性試料中においておよび既知量のそれぞれの酸
を添加した血清中において、メチルマロン酸についての
アッセイが５〜5000ngにおいて直線であること、および
コハク酸のアッセイが150〜150,000において直線である
ことを示した。

500μｌの正常ヒト血清を使用して得たクロマトグラ
ムは第4B図に示されている。コハク酸は最大の量で存在
し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エチルマロン
酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、より少量で存
在するが、容易に検出される量である。ジメチルマロン
酸は確実に検出できなかった。500μｌの正常ラット血
清および100μｌの正常ヒト尿を使用して得られたクロ
マトグラムは、それぞれ、第4C図および第4D図に示され
ており、そしてプールした正常ヒト血清を用いて得られ
たクロマトグラムに類似する（第4B図）。

反復して凍結および融解し、そして10か月の期間にわ
たって17の異なる場合についてアッセイした、プールし
た正常ヒト血清の単一の試料を使用して実施した研究
は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッセイについ
て、それぞれ、26％および19％の変動係数についての値
を与えた。これらの２種類のジカルボン酸についての値
の有意の変動または傾向は10か月の期間にわたって観測
されなかった。抜出しかつ直ちに４℃において遠心した
血清試料を使用して得られた血清のメチルマロン酸につ
いての値は、遠心前室温において１時間または24時間イ
ンキュベーションした同一血液試料の一部を使用して得
られた値と同一であった。しかしながら、コハク酸の値
はこの期間にわたって増加し、室温において１時間イン
キュベーション後ほぼ10％増加し、そして24時間インキ
ュベーション後ほぼ90％増加した。ラットの血清を使用
して実施した研究は同様な結果を与えた。尿のメチルマ
ロン酸およびコハク酸についての値は、尿の試料を室温
において０〜24時間インキュベーションした時不変化で
あった。

50人の正常ヒト被検者および95匹の正常ラットからの
メチルマロン酸およびコハク酸について得られ、より高
い値に向かうひずみについて補正するために対数変換後
に平均±2 S.D.として計算した、実際の平均（μモル/
1）および範囲についての値は、次の通りであった：ヒ
ト血清メチルマロン酸、41（19−76）；ヒト血清コハク
酸、1270（589−2420）；ラット血清メチルマロン酸、1
28（42−295）；およびラット血清コハク酸、11900（54
20−22800）。同一の50人の正常ヒト被検者から得、上
に定義したように計算した、実際の平均（ng/mlまたはn
g/mgのクレアチニン）および範囲についての値は、次の
通りであった：ヒト尿メチルマロン酸、1840（270−719
0）；ヒト尿メチルマロン酸/mg尿クレアチニン、2010
（810−3830）；ヒト尿コハクサン、25400（4620−8560
0）；およびヒト尿コハク酸/mg尿クレアチニン、28200
（8360−75100）。尿中のメチルマロン酸およびコハク
酸についての正常な範囲は、ng/mlとして表すときよ
り、ng/mgのクレアチニンとして表わすとき高い。

メチルマロン酸およびコハク酸についての値は、両者
共、ヒト血清中よりラット血清中において有意に高かっ
た。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清メチルマロ
ン酸/mgクレアチニンは、尿メチルマロン酸および尿メ
チルマロン酸/mgクレアチニンと有意に相関関係をもた
ない。血清および尿のメチルマロン酸についての値は、
男性および女性について有意に異ならず、そして年令、
ヘモグロビン、平均の血球体積、血小板数、血清コバラ
ミン、血清葉酸塩、血清クレアチニン、血清コハク酸ま
たは尿コハク酸と有意に相関関係をもたなかった。最高
の相関関係係数は、血清メチルマロン酸と血清コバラミ
ンとの間において−0.25であった（Ｐ＝0.08）。血清お
よび尿のコハク酸レベルは、メチルマロン酸について前
述のパラメーターのいずれとも有意に相関関係をもたな
かった。

クレアチニンの浄化に関するヒト血清からのメチルマ
ロン酸の平均尿浄化は28％であり、そしてクレアチンの
浄化に関するヒト血清からのコハク酸の平均尿浄化は13
％であると、計算された。この他の観察は、〔メチル−
¹⁴C〕メチルマロン酸をラットに心臓内注射により投与
した実験において観察されたように、血清中のメチルマ
ロン酸のほとんどが未知の通路を経て代謝されるという
考えを支持する。

われわれの研究はde Jongらの示唆を支持する。なぜ
なら、ある数のジカルボン酸のｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラフィーおよ
び質量分析の性質をもつことをわれわれは示したからで
ある。最初に、誘導体化の程度の変動および加水分解の
不安定性のための重大な性質の問題にわれわれは直面し
たが、これらの問題は、誘導体化試薬として、de Jong
らが利用したｔ−ブチルジメチルクロロシラン/N,N−ジ
メチルホルムアミド／イミダゾールの混合物の代わり
に、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ト
リフルオロアセトアミドを使用することによって解決さ
れた。この改良は、また、カルボキシル基またはとくに
加水分解されやすい他の基を含有する生物学的に興味あ
る他の化合物のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を調整
しかつ定量するために、そして他のアミノ酸の誘導体化
および定量に応用できる。

われわれは、正常のヒトおよびラットからの血清中の
メチルマロン酸を検出しかつ定量する技術を開発した。
われわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン酸の正常範
囲を規定し、そしてわれわれの値は、一般に、他のガス
クロマトグラフィー質量分析技術を用いてえられた値と
一致する。われわれの方法は、また、血清および尿中の
マロン酸、ジチメチルマロン酸、エチルマロン酸、メチ
ルコハク酸、グルタル酸、および他のジカルボン酸を定
量するために適するが、各ジカルボンについて適当に安
定なアイソトープ内部標準を利用して最適な定量の精度
を保証すべきである。

ヒト血清中のメチルマロン酸を測定する感度の高い特
異的な方法の利用可能性は、次のものを包含する、ある
数の臨床学的応用を有する：（ｉ）確証されたコバラミ
ンの欠乏を有する患者における血清メチルマロン酸につ
いての増大した値の発生の決定、（ii）血清コバラミン
のアッセイの診断的感度および特異性を評価するため
に、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い正常レベ
ルをもつ患者の血清のメチルマロン酸のレベルの決定、
および（iii）種々の神経精神学的異常をもつ患者の血
清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発生をよ
りよく定めるために、これらの群におけるメチルマロン
酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸のアッ
セイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段であ
り、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチルマロ
ン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバラミ
ン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研究に
おいて有用であり、これらの物質はコバラミンの代謝お
よび利用の種々な面を妨害する。

実施例Ｖ コバラミンの欠乏をもつ患者の血清中のメチルマロン酸
のアッセイ 18〜65才の年令の範囲の50人の正常血液共与者、25人
の男性および25人の女性、からの血清試料を実施例IIに
記載するようにして得た。患者の試料は、過去15年にわ
たって集成された広範囲の血清収集物から選択した。コ
バラミン（Cb1）欠乏の診断は、低い血清Cb1レベル、巨
大赤芽球性骨髄の形態、適当な血液学的または神経学的
異常、および非経口的化合物ゲルを使用する処置に対す
る応答に基づいた。悪性の貧血の診断は異常なシリング
（Schilling）テストに基づいた〔参照、例えば、Beck,
W.S.,Hematology（W.J.Williams,E.Beutler,A.J.Ersler
およびM.A.Lichtman遍）（McGraw−Hill Book Co.,NEW
York,1983）,pp.444−445〕に基づき、このテストは血
清中の外因性固有因子および／または抗固有因子遮断抗
体の存在について補正した。葉酸塩の欠乏の診断は、低
い血清葉酸塩値、正常または増大した血清Cb1値、巨大
赤芽球性性骨髄の形態、適当な血液学的異常、およびア
ルコール中毒症および劣った植物の経歴に基づいた。Cb
1欠乏の頻繁な処置群における試料を、悪性貧血をもつ
患者から得、前記患者は前述のように前もってCb1欠乏
と診断されているが、屈従が劣るため６〜９か月の間隔
であるいはCb1要求の他の研究の一部として非経口的Cb1
の間欠的処置のみを受けた患者であった。患者は血清Cb
1レベルについて低い、基線の、あるいは正常のレベル
を有し、血液学的および神経学的異常に欠け、そして試
料を収集するとき、無症候性であった。血清Cb1レベル
は、レクトバシルス・レイキマンニ（Lactobacillus le
ichimannii）法〔参照、例えば、Matthews,D.M.,Clin.S
cience22:101（1692）〕あるいは固有因子のためにCb1
結合活性の95％より多くをもつ、精製した固有因子また
は胃液を利用するある数の放射線希釈アッセイ〔Kolhou
se,J.F.,H.Kondo,H.C.Allen,E.PodellおよびR.H.Allen,
N.Eng.J.Med.299:785−792（1978）〕を使用してアッセ
イした。血清葉酸塩は、レクトバシルス・カセイ（Lact
obacillus casei）法〔Goulian,M.およびW.S.Geck,Am.
J.Clin.Path.46:390（1966）〕またはミルク結合放射線
希釈アッセイ〔Rohenberg,S.P.et al.,N.Eng.J.Med.28
6:1335（1972）〕を使用してアッセイした。患者の試料
のすべては、患者が属するカテゴリーおよび各カテゴリ
ーにおける患者の数がメチルマロン酸およびコハク酸の
アッセイの実施に参加する人員が知らないように、ある
数字でコード化した。

ある数の因子を、血清のメチルマロン酸およびコハク
酸との可能な関係について個々に検査した。明確な因
子、例えば、性、人種および診断について、ウィルコキ
ソン（Wilcoxon）２試料テスト〔Steel,R.G.D.およびJ.
H.Torrue,Principles and Procedures of Statistics
（McGraw−Hill Book Co.,Unc.,New York,1960）〕を使
用して関係の有意性を決定した。神経学的過酷さとの可
能な関係を評価するために、群０、１および２（表１に
おいて定義する）を組み合わせ、そして組み合わせた群
３および４と比較した。連続的である因子、例えば、年
令または平均の血球体積（MCV）HA、スピアマン（Speam
an）相関関係係数〔Steel,supra〕を使用して検査し
た。結果を表Ｉに記載する。

種々のカテゴリーにおいて正常の被検者および患者に
ついて血清メチルマロン酸およびコハク酸について得ら
れた値は第５図に示されており、ここで血清メチルマロ
ン酸のレベル（下）および血清コハク酸（上）は臨床的
に確証されたCb1欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ患者、そし
て血液学的または神経学的異常をもたない、Cb1欠乏の
処理を頻繁にした患者について記載されている。正常範
囲はメチルマロン酸について19〜76ng/mlであり、そし
てコハク酸について580〜2420にng/mlである。範囲は、
より高い値へのひずみについて補正するため対数変換
後、±2S.D.として計算した。Cb1欠乏分において、73人
の患者のうち69人は、19〜76ng/mlの正常範囲より上で
あるメチルマロン酸についての値を有した。最高の値は
22,300ng/mlであり、そしてメジアン値は1,100ng/mlで
あった。16人の葉酸塩の欠乏の患者のうち５人は、おだ
やかな血清メチルマロン酸の増加を有し、最高の値は14
0ng/mlであった。血液学的および神経学的異常をもたな
いCb1欠乏の頻繁は処置を受けた患者からの15試料のう
ち７は、175ng/ml程度に高い範囲の増大した値を有し
た。これらの７試料のうち、血清L.lichmanniiCb1濃度
は６つにおいて低く（88〜165pg/ml）そして１つにおい
て正常（275pg/ml）であった。すべての７試料は、精製
した固有因子を使用する放射線希釈アッセイに従い低い
Cb1値（85〜155pg/ml）を与えた。正常のメチルマロン
酸レベルをもつ８試料のうち、血清L.lichmanniiCb1は
４つにおいて低かった。

血清コハク酸についての増大した値は、73人Cb1欠乏
患者のうち19人、16人の葉酸塩の欠乏患者のうち10人、
および15人のCb1欠乏の頻繁な処置を受けた患者の15人
において観測された。これらの評価の理由は未知である
が、血清分離前に血液を放置した時間の変動に関係づけ
ることができるであろう。なぜなら、血液を遠心前に室
温において24時間放置すると、コハク酸についての値は
２倍になることがあるからである。血清メチルマロン酸
についての値は、この時間にわたって変化しない。

Cb1欠乏をもつ73人の患者に関する臨床的データは表
Ｉに表わされており、ここでデータは血清メチルマロン
酸のレベルに関して減少する順序で配置されている。血
清メチルマロン酸と血清葉酸塩との間に有意な相関関係
が存在した（ｒ＝0.45、Ｐ＜0.001）。相関関係は、L.c
asei血清葉酸塩法（ｒ＝0.46、Ｐ＜0.01）ならびに放射
線アッセイ技術（ｒ＝0.66、Ｐ＜0.001）によって測定
した試料において存在した。より重度の神経学的異常を
もつ患者（群３および４）は、より穏和な異常を有する
患者（群１および２、平均2083±2866、メジアン879ng/
ml）あるいは神経学的関係の証拠をもたない患者（群
０、平均1154±1468、メジアン409ng/ml）よりも、高い
血清メチルマロン酸レベル（平均±SD、5077±6073、メ
ジアン3685ng/ml）を有した（Ｐ＜0.01、群３および４
対群０〜２について）。

血清葉酸塩レベルは、神経学的状態に無関係に血清メ
チルマロン酸を相関関係を有した（神経学的疾患をもた
ない患者においてメチルマロン酸対葉酸塩についてｒ＝
0.58;n＝27;P＜0.01）。血清葉酸塩濃度はより重度の神
経学的異常を有する患者において高い（平均血清葉酸
塩、群３および４、20.9±16.9ng/ml対群０〜２、10.1
±8.7ng/ml、Ｐ＜0.005）が、より高い血清メチルマロ
ン酸レベルと進行した神経学的関係との関連性は葉酸塩
の状態に対して独立であるように思われる。血清葉酸塩
レベルが15ng/mlより低い患者において、平均血清メチ
ルマロン酸は、群３および４において、3189±2317ng/m
l対群０〜２において、1030±1795ng/ml、Ｐ＜0.005で
あった；血清葉酸塩は２つの群において有意に異ならな
かった（それぞれ、7.5±3.3ng/ml対6.0±3.8ng/ml、Ｐ
＜0.25）。

血小板数および血清メチルマロン酸の間に負の相関関
係が存在した（ｒ＝−0.30;P＜0.05）。しかしながら、
より重度の神経学的異常をもつ患者（群３および４）を
分析から除外した場合（ｒ＝−0.26;P＞0.05）あるいは
増大した血清メチルマロン酸をもつ患者を分析から除外
した場合（ｒ＝−0.23;P＞0.05）、コバラミンはもはや
有意でなかった。悪性の貧血を有する患者はマン−ウィ
トニイ（Mann−Whitney）試験〔Steel,supra〕をもちい
ると、熱帯性スプルーを有する患者（714±1007、Ｐ＜
0.004）よりも高い血清メチルマロン酸値（平均、2968
±4387）を有した；しかしながら、熱帯性スプルーを有
する患者における一般に低い血清葉酸塩値およびより少
ない重度の神経学的関係について補正すると、差はもは
や有意ではなかった。舌炎をもつ患者は舌の微候または
症候をもたない患者よりも高い血清メチルマロン酸値を
有した；しかしながら、舌炎をもち、73人の患者の全体
の群についてのメジアンよりも上のメチルマロン酸の血
清レベルを有する18人の患者のうち13人は、重度の神経
学的関係、増大した血清葉酸塩値、または両者を有し
た。

血清メチルマロン酸は血清Cb1と相関関係をもたなか
った（すべての患者についてｒ＝−0.09;微生物学的ア
ッセイについてｒ＝0.12;そして放射線アッセイについ
てｒ＝−0.09、各場合においてＰ＞0.4）。血清メチル
マロン酸は、次のものと有意な相関関係をもたなかっ
た。:MCV（ｒ＝0.07、Ｐ＞0.05）、白血球（ｒ＝−0.0
8、Ｐ＞0.3）およびヘマトクリット（ｒ＝−0.12、Ｐ＞
0.4）。正常ヘマトクリットを有する12人の患者のすべ
ては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有した（範
囲116〜4800ng/ml）。血清メチルマロン酸と年令、性
別、人種、症候の期間、体重損失の程度、あるいは鉄、
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、ビリルビンまたはアル
ブミンの血清との間に相関関係は存在しなかった。

Cb1欠乏を処置されない４人の患者（表Ｉ、No.70〜7
3）は、正常の範囲内の血清メチルマロン酸レベルを有
した。３人は熱帯性スプルーを有した。４人のうち１人
は、固有受容および振動の感覚が傷害されており、神経
学的症候をもたなかった。これらの患者を増大した血清
メチルマロン酸濃度をもつ患者と区別する、臨床的また
は実験室の特徴は存在しなかった。

血清コハク酸についての値は、血清メチルマロン酸を
包含する研究したパラメーターのいずれとも相関関係を
もたず、そして有意差は種々の下位群のいずれの間にも
観察されなかった。

第６図は、診断の時から開始し、非経口的Cb1処置後
最初の13日にわって続けられた、古典的悪性貧血をもつ
患者における、血清（−・−）および尿（−−−−）
のメチルマロン酸の順次のレベルを示す。患者は、汎血
球減少症、芽細胞の骨髄腫の所見、43pg/mlの血清Cb1
値、血清抗固有因子遮断抗体、および外因性固有因子に
ついて補正した異常シリングテストを有する32才の白色
人種の男性であった。両者の値は処置前顕著に高く、処
置後同様な速度で減少し、そして第13日に正常の上限の
ちょうど上に存在した。これが示唆するように、血清お
よび尿のメチルマロン酸の測定は、Cb1欠乏についての
診断試験として互いに良好に相関関係をもつが、より大
きい数の追加の患者を研究しなければ、精確な結論を出
すことはできないであろう。

表IIは、増大した血清メチルマロン酸が低い血清Cb1
レベルに先行した、95才の白色人種の女性に関するデー
タを含有する。

1982年９月において、彼女は無症候となったが、血清Cb
1葉酸塩のアッセイの導く105というMCVを有し、それは
正常値を与えた。この血清をほぼ１年間貯蔵し、その間
メチルマロン酸のアッセイが開発されつつあり、そして
それを最後に1983年８月にアッセイしたとき、269ng/ml
の増大した値が得られた。1983年８月に、1982年８月の
試料について血清Cb1および血清葉酸塩を再びアッセイ
すると、これらは再び正常であり、そして抗固有因子遮
断抗体をアッセイし、そして前記抗体は存在することが
発見された。1983年８月において、患者をクリニックに
再び呼び、ここで彼女のMCVは本質的に不変化であっ
た。血清メチルマロン酸レベルは、なお、338ng/mlで高
く、そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、
血清Cb1レベルは、ここで、顕著に減少していた。Cb1の
注射後３週で、血清および尿のメチルマロン酸レベルは
正常範囲内に低下したが、１年後再検査したとき、MCV
は94であった。いずれの時も神経精神学的症候は認めら
れなかった。高い不飽和のCb1結合容量はこの患者につ
いて説明できるように思われなかった。なぜなら、彼女
の白血球の数は決して（1982年９月〜1983年中頃）高く
ならず、そして彼女の不飽和Cb1結合能力はCb1の処理の
直前（1983年８月23日）において正常（2.1ng/ml）であ
ったからである。不都合なことには、Cb1結合容量は198
2年９月の血清について測定しなかった。

われわれの研究が立証するように、血清中のメチルマ
ロン酸のアッセイはCb1欠乏の患者において有用な情報
を提供する。臨床的に確証されたCb1欠乏をもつ患者の7
3人のうち69人において、および血液学的または神経学
的異常に欠ける、Cb1欠乏について頻繁に処置された群
からの試料の15のうち７において、血清メチルマロン酸
レベルが増大していたという事実は、その感度が血清Cb
1レベルのそれに類似しうることを示唆していたが、血
清Cb1について基線のおよび低い正常値をもつ患者の研
究を実施した後、２つのアッセイの比較をしなくてはな
らないであろう。血清メチルマロン酸の中程度の増大が
低い血清Cb1レベルの発現に先行する患者をわれわれが
観察したという事実は、血清メチルマロン酸レベルが血
清Cb1レベルが先行しない、すくなくともある患者にお
いてCb1欠乏を正しく検出できるであろうことを示唆す
る。こうして、血清メチルマロン酸のアッセイおよび血
清Cb1のアッセイは互いに相補的であり、そして両者の
アッセイは、いずれかを単独で用いて可能であるより
も、いっそう完全な方法で、種々の患者の固体群におけ
るCb1欠乏の真の発生を定めることを可能とするように
思われる。Cb1欠乏についての血清メチルマロン酸の特
異性は、欠乏の臨床的証拠をもたないか、あるいはCb1
のバランスに影響を及ぼす潜在的条件の臨床的証拠をも
たない患者において、しばしば低い血清Cb1値のそれよ
りも大きいことを立証できる。また、Cb1および葉酸塩
の両者の血清が正常値より低い、巨大赤芽球性貧血をも
つ患者の評価において、この試験は有用であることを証
明できる。

血清メチルマロン酸のレベルは、血清Cb1が共有しな
い１つの利点を有し、Cb1欠乏が疑われる患者をCb1で処
置し、そして血清メチルマロン酸レベルの効果を観測で
きる。このような処置が血清メチルマロン酸レベルを高
い範囲から正常範囲から正常範囲に低下する場合、これ
は、この報告において詳述した患者の場合におけるよう
に、患者がCb1欠乏であるとう、強い推定上の証拠であ
る。この利点は血清Cb1レベルは共有しない。なぜな
ら、血清Cb1レベルは、患者がCb1欠乏であるか否かに無
関係に、Cb1の非経口的注射後、本質的に常に高いかあ
るいは少なくとも正常であるからである。

正常の血清Cb1レベルを有する16人の葉酸塩の欠乏患
者のうち５人において、緩和であるが、有意に高い血清
メチルマロン酸が観測された。５人の患者のうち２人は
肝腫および／または異常肝機能の試験を受けており、そ
して３人は肝臓の病気の証拠をもたなかった。尿メチル
マロン酸の測定を含む研究は、また、葉酸塩の欠乏を有
する数人の患者におけるおだやかな増加を示したが、こ
れが、おだやかな同時のCb1欠乏によるか、あるいは他
の未知の原因によるかどうかは、未知である。最近の研
究は、種々の組織中のCb1の量が両者のCb1依存性酵素を
飽和するためには不十分であるとを示した。葉酸塩の欠
乏において、メチオニンに結合したCb1の量を増加する
ことによって、メチオニンシンセターゼ活性のレベルを
増大する試みは行なうことが可能であり、その結果Ｌ−
メチルマロニル−CoAムターゼに結合したCb1の量は減少
し、そしてこれは順番にメチルマロン酸の患者形成を増
大する（表Ｉ参照）。

血清メチルマロン酸は、Cb1欠乏患者の群において血
清Cb1のレベルと相関関係をもたなかった。Cb1レベルと
尿メチルマロン酸のレベルとの相関関係は、前にある研
究において観測されたが、他の研究において観測されな
かった。血清メチルマロン酸と血液学的パラメーターの
いずれかとの相関関係を発見できなかったことは、血小
板との弱い逆の関係を除外して、尿メチルマロン酸のレ
ベルを用いる研究と一致する。

神経学的異常を有する少数の患者を研究する従来の研
究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相関関係を発
見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかった。われわ
れ大きい系列の患者における血清メチルマロン酸レベル
と神経学的異常の存在との間の積極的の相関関係は、興
味あることである。なぜなら、Cb1欠乏における神経学
的異常の原因となる生物学的機構は、なお、未知である
からである。血清葉酸塩レベルと血清メチルマロン酸レ
ベルとの間の積極的の相関関係は、また、尿メチルマロ
ン酸レベルの研究において認られてきていなかった。こ
の相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の食事をする患者
が、多分Cb1欠乏の診断を遅延させる、より少ない血液
学的異常を有しうるという事実のためであろう。しかし
ながら、血清葉酸塩が血液学的パラメーターと積極的に
相関関係をもたなかったという事実は、これを本当らし
くなくする。また、ある未知の代謝または調節の関係
は、Ｌ−メチルマロニル−CoAムターゼとメチオニンシ
ンセターゼとの間に、それらの両者が活性のためにCb1
を必要とするという事実に加えて、存在することが可能
である。

表Ｉから明らかなように、コバラミンの欠乏の患者の
多くは貧血ではなく、あるいは適度に貧血であり、大赤
血球症でなく、あるいは適度に大赤血球症であり、そし
て100pg/mlより著しく減少した血清Cb1レベルをもたな
かった。これらの観測は、医学分野における専門家の現
在の信念および教示と一致し（上を参照）、そして次の
実施例の終りにおいて詳述する。

実施例VI コバラミンの欠乏および葉酸塩の欠乏の診断および区別
における合計ホモシステイン単独のアッセイおよび組み
合わせたホモシステイン−メチルマロン酸のアッセイの
使用 確証されたCb1欠乏をもつ78人の患者および確証され
た葉酸塩の欠乏をもつ19人の患者からの血清を、実施例
Ｖに記載するように血清Cb1および血清葉酸塩につい
て、実施例IVに記載するように血清メチルマロン酸につ
いて、および実施例IIIに記載するようにして血清メチ
オニン、血清システインおよび血清ホモシステインにつ
いて試験した。結果を表IIIに記載する。

表IIIにおける患者の全部ではないが、あるものは表
Ｉにまた示されている。血清ホモシステインは、コバラ
ミンの欠乏をもつ患者の77/78（99％）および葉酸塩の
欠乏をもつ患者の18/19（95％）において増大していた
（正常７〜22μモル/1）。コバラミンの欠乏の患者にお
いて、血清メチルマロン酸は74/78（95％）において増
大した（正常19/76pg/ml）。正常血清メチルマロン酸レ
ベルをもつコバラミンの欠乏患者の３人において、血清
合計ホモシステインは増大し（範囲34〜93μモル/1）そ
して１人のみの患者は正常範囲の血清アセトニトリルお
よび血清合成ホモシステインの両者を有した。葉酸塩の
欠乏の患者において、5/19（26％）は血清メチルマロン
酸のおだやかな増加を有した。（範囲92〜195ng/ml）。
血清メチニオンレベルはコバラミンまたは葉酸塩の欠乏
の診断において有用でなかった。なぜなら、わずかに2/
78（３％）のコバラミンの欠乏患者が低いレベルを有
し、そして葉酸塩の欠乏患者は低いレベルをもたなかっ
たからである（正常範囲14〜44μモル/1）。さらに、血
清の合計システインレベルは診断的に有用でなかった。
なぜなら、わずかに6/78（８％）のコバラミンの欠乏患
者がおだやかな増加を有し、そしてわずかに1/19（５
％）の葉酸塩の欠乏患者が増大した値を有したからであ
る（正常範囲174〜378μモル/1）。

表IIIから理解できるように、わずかに32/78（41％）
の患者は適度に重度の貧血を有し（Hct＜25％）、28/78
（36％）は適度の貧血を有し（25〜34％女性、25〜39％
男性）、そして18/78（23％）はまったく貧血ではなか
った。わずかに45/78（58％）はMCVの顕著な増大を有し
（＞110fl）、24/78（31％）はMCVの穏和な増大を有し
（101〜110fl）、そして9/78（11％）は正常のMCV（80
〜100fl）を有した。コバラミンの血清レベルは、わず
かに48/78（62％）の患者において顕著に減少し（＜100
pg/ml）そして30/78（38％）の患者においてほんの適度
に（100〜200pg/ml）減少した。こうして、コバラミン
の欠乏において見出されるスペクトルは、従来信じられ
ていたよりも非常に広く、そして診断を実施するために
は、適度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラミン
レベルおよび顕著に増大したMCVの発見に頼ることはで
きない。しかしながら、これらの患者において血清合計
ホモシステインを単独で、あるいは血清メチルマロン酸
と組み合わせて測定することによって、コバラミンの欠
乏がHct、MCVおよび血清コバラミンレベルにおいて適度
な異常または異常の不存在と関連性があるときでさえ、
コバラミンの欠乏の診断を確立することができる。他の
アミノ酸、例えば、血清メチオニンまたは合計システイ
ンの測定は、血清メチニオンがコバラミンの欠乏の患者
において低いという早期の教示（参照、例えば、Parry,
T.E.,Brit.J.Haemat.16::221（1969）〕にかかわらず、
コバラミンの欠乏において診断的に有用であることが示
されなかった。

実施例VII ホモシステインのアッセイまたは組合せたホモシステイ
ン−メチルマロン酸のアッセイを用いる、神経学的異常
および穏和の血液学的異常をもつかもたない患者におけ
るコバラミンの欠乏の診断の確証 神経学的異常は、しばしば、Cb1欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまったく存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。
この考えを試験するために、われわれは、CBLの欠乏の
ために神経学的異常をもつ143人の連続した患者を再検
討した。これらの患者のうち42人（29％）において、ヘ
マトクリット（35/42）またはMCV（26/42）であり、両
者での試験（19/42）は正常であることを、われわれは
発見した。他の血液学的パラメーターは、測定すると、
また、頻繁に正常であった:WBC（42/42）、血小板（40/
42）、LDH（25/38）およびビリルビン（30/31）。これ
らの42人の患者において、神経学的異常は次のものを包
含した：末端感覚欠陥（35）、知覚異常（29）、失調症
（21）、記憶喪失（12）、性格の変化（４）、痙攣性対
不全麻痺（３）、幻覚（２）、糞便失禁（２）、緩和
（２）、視神経萎縮（１）および自殺（１）。血清Cb1
レベル（正常＝200〜1000pg/mlは、次のようにかなり変
化した：＜50pg/ml（６）;50〜100pg/ml（19）;100〜15
0pg/ml（12）;150〜200pg/ml（３）；および200〜250pg
/ml（２）。Cb1欠乏の診断は、次の１または２以上を立
証することによって、すべての42人の患者において確証
された：実施例IVの手順によって測定して、＞150ng/ml
の血清メチルマロン酸（MMA）の明瞭な増大、正常＝18
〜76ng/ml（36/38）；実施例IIIの手順によって測定し
て、＞30μモル/1の血清ホモシステイン（Hcys）の明瞭
な増大、正常＝７〜22μモル/1（37/38）;Cb1処理後に
おける血清MMA（28/28）および血清Hcys（27/28）の顕
著な減少;MCVがCb1処置前に増大しなかった、ほとんど
の患者を含む、Cb1処理（29/35）後のMCVの5fl以上の減
少（13/16）；およびCb1処置（39/39）後の神経学的異
常の改良。

上から理解できるように、コバラミンの欠乏による神
経学的異常をもつ143人の連続的患者のうちわずかに108
人（76％）のみが貧血を有し（Hct＜35人の女性、＜40
人の男性）を有し、そして35/143（24％）はまったく貧
血ではなかった。これらの143人の患者のうち26人（18
％）において、MCVは正常であり、そして19/143（13
％）において、ヘマトクリットおよびMCVの両者共正常
であった。正常のヘマトクリット、正常のMCVまたは両
者を有した42人のサブセットにおいて、わずかに5/42
（12％）はMCVが顕著に増大しており（＞110fl）、11/4
2（26％）は適度に増大したMCV（101〜110fl）を有し、
そして26/42（62％）は正常のMCV（80〜100fl）を有し
た。コバラミンの試料レベルはわずかに24/42（57％）
の患者において顕著に減少しており（＜100pg/ml）、そ
して16/42（38％）においてわずかに中程度に減少して
いた（100〜200pg/ml）。事実、2/42（５％）の患者は
事実正常の血清コバラミンレベルを有した。こうして、
コバラミンの欠乏から生ずる神経学的異常をもつこれら
の患者において、血液学的異常のスペクトルは従来認識
されていたよりも非常に広く、そしてコバラミンの診断
を実施するためには、適度に重度の貧血、顕著に低下し
た血清コバラミンレベルおよび顕著に増大したMCVの発
見に頼ることはできない。しかしながら、これらの患者
において血清合計ホモシステインを単独で、あるいは血
清メチルマロン酸と組み合わせて測定することによっ
て、コバラミンの欠乏がHct、MCVおよび血清コバラミン
レベルにおいて適度な異常のみをもつ患者においてコバ
ラミンの欠乏の診断を確立することができる。さらに、
血清合計ホモシステインおよび血清メチルマロン酸の増
大した値の低下を監視することによって、コバラミンの
欠乏の診断を確立することができ、そしてコバラミンを
使用する処置の応答を監視することができる。

われわれは、次のように結論する:1）Cb1欠乏による
神経学的異常は、貧血または増大したMCVの不存在下に
おいて普通に起こる;2）血清MMAおよび血清Hcysの測
定、血清MMA、血清HcysおよびMCVにおけるCb1処置後の
変化は、患者をCb1について評価するとき有用である;
3）説明されない神経学的異常をもつ患者のすべては、
貧血、大赤血球症、または他の血液学的異常が存在しな
いときでさえ、Cb1欠乏について評価すべきである；そ
して４）処置後の増大した血清合計ホモシステインまた
は血清メチルマロン酸の低下によって確証された、コバ
ラミンの欠乏に二次的である神経学的病気をもつ患者に
おける、貧血の不存在によって理解できるように、コバ
ラミンの欠乏の臨床的スペクトルは従来推測されている
ものよりも非常に広い。

われわれは本発明の好ましい実施態様を例示しかつ説
明してきたが、本発明の変化および変更は可能であり、
それゆえ、上の記載した精確な用語に限定されず、本発
明を種々な用途および条件に適合させうる、このような
変化および変更は利用することができる。したがって、
このような変化および変更は特許請求の範囲に規定され
る同等なものの範囲に完全に入り、それゆえ、特許請求
の範囲に包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ホモシステインモノマー、システインモノマ
ー、ホモシスチン、シスチン、ホモシステイン−２−メ
ルカプトエタノール、システイン−２−メルカプトエタ
ノール、ホモシステイン−システイン二量体およびメチ
オニンの分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す。 第２図は、（Ａ）アミノ酸類を含有する混合物；（Ｂ）
100μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）100μｌの正
常ラット血清；および（Ｄ）100μｌの正常ヒト尿から
還元後に得られたアミノ酸類のｔ−ブチルジメチルシリ
ル誘導体類のクロマトグラムを示す。 第３図は、マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメ
チルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸および
グルタル酸の分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシ
リル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す。 第４図は、（Ａ）１μｇの各酸を含有する混合物；
（Ｂ）500μｌのプールした正常ヒト血清；（Ｃ）500μ
ｌの正常ラット血清；および（Ｄ）100μｌの正常ヒト
尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチルジメチルシ
リル誘導体類のクロマトグラムを示す。 第５図は、種々のカテゴリーにおいて正常の被検者およ
び患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につ
いて得られた値を示すグラフである。 第６図は、診断の時から開始し、非経口的Cb1処置後最
初の13日にわたって続けられた、古典的悪性貧血をもつ
患者における、血清（−・−）および尿（−−−−）
のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エイチ．アレン アメリカ合衆国，コロラド 80110，イ ングルウッド，サウス デクスター 4001 (72)発明者 サリー ピー．ステイブラー アメリカ合衆国，コロラド 80206，デ ンバー，ハリソン ストリート 1035 (72)発明者 ジョン リンデンバウム アメリカ合衆国，ニューヨーク 10023, ニューヨーク ウェスト エイティーフ ィフスストリート 72

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】所定の試料中の１種または２種以上の異な
   るスルフヒドリルアミノ酸種の存在を測定する方法であ
   って、工程： （ａ）所定の試料を、測定すべきスルフヒドリルアミノ
   酸種の各々の既知量を含む適当なマーカーで標識された
   内部参照標準と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたスルフヒドリルアミノ酸およ
   び標識されないスルフヒドリルアミノ酸の均質化を保証
   するために十分な量の還元剤を添加し、 （ｃ）存在する標識されたスルフヒドリルアミノ酸およ
   び標識されないスルフヒドリルアミノ酸の量を各種につ
   いて質量分析計で測定し、 （ｄ）標識されたスルフヒドリルアミノ酸対標識されな
   いスルフヒドリルアミノ酸の比を各種について計算し、
   そして （ｅ）前記所定の試料中の各種について存在する標識さ
   れないスルフヒドリルアミノ酸の量を誘導する、 を含んでなることを特徴とする前記方法。
2. 【請求項２】前記標識されたアミノ酸および標識されな
   いアミノ酸を工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に適
   当な誘導体に転化する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】前記誘導体はシリル誘導体である特許請求
   の範囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】前記シリル誘導体は前記アミノ酸をＮ−メ
   チル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロ
   −アセトアミドに暴露することによって得られる特許請
   求の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】前記所定の試料は温血動物から体組織から
   なる特許請求の範囲第１または２項記載の方法。
6. 【請求項６】工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前にス
   ルフヒドリル含有アミノ酸を部分的に精製する追加の工
   程を含む特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. 【請求項７】前記スルフヒドリル含有アミノ酸はホモシ
   ステインである特許請求の範囲第５項記載の方法。
8. 【請求項８】前記内部参照標準は既知量の変性ホモシス
   テインからなる特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. 【請求項９】工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前にホ
   モシステインを部分的に精製する追加の工程を含む特許
   請求の範囲第８項記載の方法。