JPS63221249A - スルフヒドリルアミノ酸類の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明に導いた研究は、米国政府からの許可によって部
分的に資金を提供された。

本発明は、試料中のスルフヒドリルアミノ酸の濃度を定
量する方法、例えば、温血動物からの体の組織の試料中
の合計のホモシスティンの濃度は定量する方法、および
前記温血動物がコバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、または
それらの両者を有するかどうかを決定する方法に関する
。

スルフヒドリルアミノ酸類は、次に示すような通路の複
雑な組に従って代謝される。

以下余白 理解できるように、メチオニンシンセターゼによりホモ
システィンをメチオニン化してメチオニンを生成するこ
とは、メチルコバラミン（Ｍｅ　−Ｃｂｌ）、また、メ
チル−ＢｔＺとしても知られている、を必要とする。メ
チル基はＮｓ−メチルテトラヒドロフオレート（Ｎ’−
ＭＴＨＦ）によって共与され、後者はテトラヒドロフオ
レート（ＴＨＦ）に転化される。メチルマロニル−Ｃｏ
Ａムターゼを介するメチルマロニル−ＣｏＡのスクシニ
ル−ＣｏＡへの転化は、アデノシル−コバラミン、また
コファクターとして知られたアデノシル−Ｂｌ！、を必
要とする。こうしてコバラミンおよび葉酸はスルフヒド
リルの代謝において極めて重要なコファクターであるが
、葉酸でなくコバラミンはメチルマロニル−Ｃ−ｏＡの
代謝において極めて重要なコファクターである。

温血動物におけるコバラミンおよび葉酸の欠乏の精確な
初期の診断は、これらの欠乏が、それぞれ、コバラミン
または葉酸の処置によって完全に逆転する、生命に危険
を及ぼす血液学的異常に導きうるので、重要である。コ
バラミンの欠乏は、また、無能および生命を脅かす神経
精神病学的異常に導くことがあるので、コバラミンの欠
乏の精確な初期の診断はことに重要である；外因性のコ
バラミンの投与は、常に、これらの異常の進行を停止し
、はとんど常に症候の有意の改良に導き、そして頻繁に
それらの完全な修正に導く。コバラミンの欠乏および葉
酸の欠乏は区別不可能な血液学的異常に導くので、それ
らの区別はしばしば困難である；適切なビタミンの使用
は血液学的異常を大きく改良し、そして、より重要なこ
とには、コバラミンのみ公、コバラミンの欠乏において
のみ見られる、神経精神病学的異常を補正するので、区
別は重要である。コバラミンの欠乏を処置するための葉
酸の使用は極めて危険である。なぜなら、とがあり、あ
るいは沈降することさえあるからである。

先導医学教科書中の章および先導医学雑誌中の論文が教
示するように、コバラミンの欠乏は有意の貧血（すなわ
ち、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの減少）を有す
る個体（赤血球はマクロクリットである、すなわち、平
均細胞体積（ＭＣＶ）が一般に＞　１００ｆｌである）
において、あるいは抹消神経病および／または失調症か
ら成る神経学的異常を有する個体において、疑いが持た
れる。多くのこのような教科書の章または雑誌の論文が
、さらに、述べているように、貧血は典型的には重度で
あり、すなわち、ヘモグロビン≦８ｇ％、ヘマトクリッ
ト〈２５％であり、そして赤血球の大きさは大きくレベ
ル＞　１００ｆｌに増加する。〔参照、Ｂａｂｉｏｒ、
Ｂ、Ｍ、およびＨ，Ｆ、Ｂｕｎｎ、　）Ｉａｒｒｉｓｏ
ｎ’ｓ紅ｎ劇ａμＬ吐１１肛」１基疫匡国虹（Ｒ，Ｇ。

Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ、Ｒ，Ｆ、Ａｄａｍｓ、Ｅ、Ｂｒ
ａｕｎｗａｌｄ、に、Ｊ。

ｌ５ｓｅｌｂａｃｈｅｒ、Ｊ、Ｂ、Ｍａｒｔｉｎおよび
Ｊ、Ｄ、ＷｉｌｓｏｎｌＪｉ）（ＭｃＧｒａｗ−旧１１
　、Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３）
、ｐｐ、１８５３−１８６０；Ｌｅｅ、Ｇ、Ｒ，および
）（、Ｊ、Ｇａｒｄｎｅｒ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆＦ
ａｍｔｌ　　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、３ｒｄ　Ｂ　ｄ　、　
（Ｒ，Ｅ、Ｒａｋｅｌ＆１ｉ）（Ｗ、Ｂ。

５ａｕｎｄｅｒｓ　＆　Ｃｏ、、Ｐｈ１１ａｄｅｌｐｈ
ｉａ＋１９８４）、ｐｐ、１０８２−１０９１゜〕 いくつかの実験室の試験は、コバラミンの欠乏または葉
酸の欠乏を有する患者において異常な結果を与えるとし
て報告された。このような試験は赤血球の葉酸塩の測定
（Ｈｏｆｆｂｒａｎｄ、Ａ、Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、１９：１７（１９６６）　）
およびｒｄＵの抑制試験Ｊ　　（Ｍｅｔｚ、Ｊ、、ｅｔ
　ａｌ、、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、１ｌａｅＩＩ＋、１４：５７
５（１９６８）　）を包含するが、いずれも広く利用さ
ていない。２０年以上にわたって知られているように、
メチルマロン酸はコバラミンの欠乏を有する大抵の患者
の尿中に増大した量で分泌され、そしてこの異常は葉酸
の欠乏を有するほんのわずかの患者によってのみ証明さ
れる。コバラミンの欠乏は、貧血の存在および程度、大
赤血球症の存在および程度、および低下した血清コバラ
ミンレベルの存在に基づいて疑われかつ診断することが
できことが信じられかつ教示されているので、メチルマ
ロン酸はコバラミンの欠乏が疑われている患者において
めったに測定されない、事実、医学の先導教科書および
血液学の先導教科書において、実際には、尿のメチルマ
ロネートのアッセイはめったに必要ではないことが教示
されている。（Ｂｅｃｋ、Ｉ４．Ｓ、。

Ｈｅｍａｔｏｌｏ　　３ｒｄ　Ｂｄ、（Ｗ、Ｊ、Ｗｉｌ
ｌｉａｎ＋ｓ４．Ｂｅｕｔｌｅｒ。

Ａｊ、Ｅｒ５ｌｅｖおよびＭ、Ａ、Ｌｉｃｈｔｎ＋ａｎ
ｌＪＨ）　（ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＢｏｏｋ　Ｃｏ、
、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３）、ｐｐ、４３４−４６
５；Ｂｅｃｋ、Ｗ、Ｓ、。

Ｃｅｃｉｌ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ　Ｖｏｌ、１（Ｊ、Ｂ、Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎおよび
Ｉ、、　Ｉｌ、Ｓｍｆｔｈ、　Ｊｒ、　編＞　（ｋ４．
Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、　＋Ｐｈ１１ａｄｅｌｐ
ｈｉａ、１９８５）、Ｐ＋３．８９３−９００　、　）
　１つの最近の雑誌の論文は尿のメチルマロン酸の測定
を事実支持している（Ｎｏｒｍａｎ、Ｅ、Ｊ、、０．Ｊ
、ＭａｒｔｅｌｏおよびＭ、Ｄ、Ｄｅｎｔｏｎ、ＢＩｏ
ｏｄ５９（６）　：１１２８−１１３Ｈ１９８２）が、
この論文のデータを分析すると、２７人のコバラミンの
欠乏の患者のうち２６人は貧血であり、２７人の患者の
うち２３人はＭＣＶが増大しており、そして血清コバラ
ミンを標準の改良された血清コバラミンアッセイで測定
した１２人の患者のうち１２人は１１００ｐ／−より低
い値を有したことを証明する。こうして、これらの患者
は標準の診断手順に従ってすべてのコバラミンの欠乏で
あおい、そして追加のアッセイは通常不必要であると判
定されている。

血清または血漿中のコバラミンおよび葉酸塩についての
アッセイは、コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏を診断
および区別するための、最も広く利用され、准奨されて
いる試験である。血清コバラミンの正常範囲が約２００
〜９００ｐｇ／−である、コバラミンの欠乏の場合にお
いて、いく人かの先導著者らが述べているように、患者
は血清コバラミンレベルが低いばかりでなく、かつまた
これらの値は１１００ｐ／ｍＺより低いであろう。〔参
照、例えば、Ｂａｂｉｏｒ、５ｕｐｒａＨＬｅｅ　＆　
Ｇａｒｄｎｅｒ＋５ｕｐｒａ；Ｂｅｃｋ＋Ｔｅｘｔｂｏ
ｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋５ｕｐｒａ；およびＢ
ｅｃｋ。

Ｈｅｍａ圏旦■１ｓｕｐｕｒａ　）。

１９７８年において、コバラミン類自体類がヒト血漿中
に存在すること、およびその時使用する血清コバラミン
についてのラジオアイソトープの希釈アッセイが真のコ
バラミンに対して特異的でないので、それらの存在はコ
バラミンの欠乏をマスクしうろことが発見された。この
問題は、コバラミンについてのラジオアイソトープの希
釈アッセイにおいて結合性蛋白質として、純粋なまたは
精製された固有の因子の使用によって補正でき、そして
この修正は非特異的コバラミン結合性蛋白質を使用した
１９７８年に存在したアッセイをほとんど完全に置換し
た。参照、例えば、米国特許第４，１８８゜１８９号（
Ａｌｌｅｎ）　、米国特許第４，３５１，８２２号（Ａ
ｌｉｅｎ）、米国特許第４．４５１，５７１号（Ａｌｉ
ｅｎ）およびＫｏｌｈｏｕｓｅ。

Ｊ、Ｆ、、）１．にｏｎｄｏ、Ｎ、Ｃ，Ａ１１ｅｎ、Ｅ
、ＰｏｄｅｌｌおよびＲ，Ｈ。

Ａ１１ｅｎ、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、２９９ニア８５
−７９２（１９７８）　、これらの血清についての改良
されたアッセイは、世界を通じて数千の研究室において
現在利用されており、そしてコバラミンの欠乏を有する
患者のすべて、あるいはほとんどすべてについて低い値
を与えるように見える。

しかしながら、改良されたアッセイはコバラミンの欠乏
のなんらかの証拠に欠ける患者において、しばしば低い
値を与えるので、かなり批判されてきている。これらの
理由のため、この分野における専門家は、コバラミンの
欠乏を考慮すべきであること、そして前述のように、コ
バラミンの欠乏をもつ患者に典型的である血液学的およ
び神経学的異常を存する患者においてのみ、血清コバラ
ミン値を得るべきであることを教示した。Ｓｃｈｉｌｌ
ｉｎｇおよび彼の共同研究者ら、コバラミンの欠乏およ
び実験室の診断の分野における専門家、は次のように述
べた： われわれは、［改良されたＢＩｚのアッセイキットが血
清ＢＩ！について臨床的に説明されない結果の増大した
比率を生成するであろうことを結論する。

科学的および経済的理由で、ビタミン Ｂｌ！の合理的な確率を示唆する血液学的または神経学
的発見を有する患者においてのみ、血清ビタミンＢ１ｆ
ｆ１を測定することは、賢明であろうと思われる。貧血
または老人医学の人口におけるスクリーニングテストと
して血清ＢＩ２を測定することは、臨床的病気と相関関
係もたせることのできない、低い値を高い比率で生ずる
であろう。

Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ、Ｒ，Ｆ、、Ｖ、Ｆ、Ｆａｉｒｂａ
ｎｋｓ、Ｒ，Ｍｉｌｌｅｒ、Ｋ。

５ｃｈｎ＋ｉｔｔおよびＭ、Ｊ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｃｌ１ｎ
、Ｃｈｅｍ、２９（３）　：５８２゜５８３（１９８３
）、こうして、現在入手可能な広く使用されているコバ
ラミンのアッセイは、真にコバラミンの欠乏ではない患
者において、低い血清コバラミンレベルを頻繁に提供す
ることがある。このような発見は医者の困惑させ、ある
いは亜病まらせ、そして不必要な、経費を要する、それ
以上の試験を生ずることがある。

こうして、この分野において、一般に、教示されている
ように、コバラミンの欠乏の臨床的スペクトルは比較的
狭くかつ良好に限界が定められており、そしてコバラミ
ンの欠乏の可能性は、現在血液学的または神経学的症候
を有する患者、すなわち、通常、適度に重度の大赤血球
症を伴う適度に重度の貧血を有する患者、および抹消の
神経病および／または失調症を有する患者においてのみ
考慮すべきである。一般の人口あるいは適度の貧血、ま
たは適度の大赤血球症、または他の神経精神学的以上を
もつものの日常のスクリーニングは高い数の誤った陽性
の結果に導くであろう。

今回、コバラミンの欠乏の臨床的スペクトルは従来認識
されていたものよりも非常に広いこと、そして多くのコ
バラミンの欠乏の患者は貧血ではなく、あるいは適度に
のみ貧血であること；多くの場合において、それらの赤
血球は大赤血球でないか、あるいは適度にのみ大赤血球
であること；多くの場合において、抹消の神経病および
失調症以外の種々の神経学的異常が存在すること；多（
の倍において、精製した固有の因子を使用する上の改良
されたアッセイを使用してさえ、血清コバラミンレベル
はわずかに減少するだけであり、そして実際には正常で
ありうることが発見された。

したがって、コバラミンの欠乏についての改良されたア
ッセイ、好ましくはコバラミンの欠乏を葉酸塩の欠乏と
区別可能であるアッセイが要求されている。

今回、温血動物における合計のホモシスティンの増大し
たレベルをコバラミンの欠乏および葉酸の欠乏の両者と
相関関係があり；増大したレベルの合計のホモシスティ
ンを有する動物は一方または双方の欠乏を有するようで
あるが、アッセイを２つの間の区別をしないことが発見
された。

スルフヒドリルアミノ酸の代謝の研究において、正常の
ヒト血清は少量のホモシステインーシステインニ量体お
よび蛋白質結合ホモシスティンを含有することが示され
た。ホモシスティンは正常試料において検出されなかっ
たが、腎不全を有する患者において少量で存在する。

従来知られているように、ホモシスティンおよびセリン
をシスメチオニンに転化できない、シスメチオニンシン
セターゼを遺伝的に欠く子供の血清および尿の中に大量
のホモシスチンが存在する。

これらの患者は、また、血清中に存在するメチオニンを
増大した量を有する〔参照、例えば、あＭｕｄｄ、Ｓ、
１１．およびＨルルｅｖｙ、　Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｃ　Ｂａ５ｉｓｏｆ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｄｉｓｅ
ａｓｅ、５ｔｈ　Ｅｄ、　（Ｊ、Ｂ、５ｔａｎｂｕｒｙ
およびＷｙｎｇａａｒｄｅｎ＋口、Ｓ、Ｆｒｅｄｒｉｃ
ｋｓｏｎ＋　Ｊ、Ｌ、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭ、Ｓ
、ＢｒｏｗＪ、ｉ）（ＭｃＧｒａｔｍ−１１ｉ１１　Ｂ
ｏｏｋ　Ｃｏ、＋ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８３）　、　
ｐｐ、５２２−５５９゜大量のホモシスチンは、また、
メチオニンシンセターゼを含む遺伝欠陥を有するある子
供、例えば、ホモシスティンおよびＮＳ−メチルテトラ
ヒドロフオレートを、それぞれ、メチオニンおよびテト
ラヒドロフオレートに転化できないある子供の血清およ
び尿中に存在する。これらの゛患者は、血清中に低いレ
ベルのメチオニンを有する。これらの患者において、遺
伝した欠陥の理由は、１）５．１０−メチレンテトラヒ
ドロフオレートリダクターゼの欠乏（Ｎ’　−メチルテ
トラヒドロフオレート、メチオニンシンセターゼのため
の基質の１つの合成の不能）；２）メチオニンシンセタ
ーゼのための必要なコファクターであるメチル−コバラ
ミンの合成の不能：および３）メチオニンシンセターゼ
自体の欠乏〔参照、例えばＭｕｄｄ、Ｓ、Ｈ，、ｔｌｅ
ｒｉｔａｂｌｅ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆ八へ１ｎｏ
　　Ａｃ１ｄ　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｐａｔｔｅｒ
ｎｓ　　ｏｆ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌハ□ｒｅｓｓｉｎ　
　ｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｊａｔｉｏｎ　（Ｗ、
Ｌ、ＮｙｈａＪＪｉ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４）、ｐｐ、４２９−
４５１３゜他方において、ホモシスチンは、コバラミン
を細胞へ輸送する能力の遺伝欠陥（例えば、トランスコ
バラミンＩＩの欠乏）、またはコバラミンがリポソーム
内に捕捉される、コバラミンの細胞内輪〔参照、例えば
、Ｓｈｉｐｍａｎ＋　Ｒ，Ｔ、　、　Ｒ，Ｒ，Ｗ、Ｔｏ
ｗｎｌｅｙおよびり９Ｍ、Ｄｎａｋｓ、Ｌａｎｃｅｔ　
１（２）：６９３−６９４（１９６９）；Ｆｒａｄｅｒ
。

Ｊ、、Ｂ、Ｒｅｉｍａｎおよびり、Ｔｕｒｋｅｗｉｔｚ
、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、２９９：１３１９（１９７
Ｂ）；Ｍｕｄｄ、Ｓ、Ｈ，、Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　Ｄｉ
ｓｏｒｄｅｒ、ｓｕｐｒａＨＭｕｄｄ、Ｓ、Ｈ，＋Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｃ　Ｂａ５ｉｓ　５ｕｐｒａ：Ｈｏｌｌｏ
ｗｅｌｌ、Ｊ、Ｇ、。

Ｊｒ、　、　Ｗ、　Ｋ、　ｌｌａ　１１．　Ｍ、　Ｅ、
Ｃｏｒｙｅｌｌ、　Ｊ、　ＭｃＰｈｅｒｅｓｏｎ、　Ｊ
ｒ、　、　Ｄ、　Ａ。

１１ａｈｎ、Ｌａｎｃｅｔ　Ｄｅｃ、２７，１９６９．
ｐ、１４２８；ｌｌｉｇｇｅｎｂｏｔｔｏｍ。

Ｍ、Ｃ，、Ｌ、Ｓｗｅｅｔｎ＋ａｎおよびＷ、Ｌ、Ｎｙ
ｈａｎ、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ。

２９９　（７）　：３１７−３２３　（１９７８）　；
Ｄａｖ　ｉｓ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｊ、Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎ
ｇおよびＢ、Ｈルｕｂｔｎ＋へｍ、Ｊ、Ｄｉｓ、ｃｈｉ
ｌｄ、　１３５：５６６（１９８１）　；１１ｏｅｙ、
　ｌｌｊ、ｃ、Ｌｉｎｎｅｌｌ、　Ｖ、Ｇ、０ｂｅｒｈ
ｏｌｚｅｒおよびＢ、Ｍ。

Ｌａｕｒａｎｃｅ、Ｊ、Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ、Ｍｅｄ、
７５：６５６（１９８２）　）　ｅ生命を脅かすコバラ
ミンの欠乏を有する他の幼児において、尿および／また
は血清中のアミノ酸は正常であることが発見され、そし
てホモシスチンは発見されず〔例えば、例えば、Ｇｒａ
ｅｓｂｅｃｋ、Ｒ，Ｂｏｒｄｉｎ。

１　、　Ｋａｎ　ｔｅｒｏおよびＢ、Ｋｕｈｌｂａｅｃ
ｋ、八ｅｔａ　ＭｅｄｉｃａＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｃ
ａ　１６７（４）：２８９（１９６０）；Ｌａｎ＋ｐｋ
ｉｎ、Ｂ、Ｃ。

および八、Ｍ、Ｍａｕｅｒ、Ｂｌｏｏｄ　３０（４）＝
４９５（１９６７）：Ｌａｍｂｅｒｔ。

Ｈ，Ｐ、、Ｔ、Ａ、Ｊ、ＰｒａｎｋｅｒｄおよびＪ、Ｍ
、Ｓｍｅｌｌｉｅ＋Ｑ、Ｊ、Ｍｅｄ。

３０（１１７）　ニアＨ１９６１）　；５ｉｅｖｅｎｄ
、Ｃ，Ｊ、、Ｕｇｅｓｋ、１ａｅｔｅｒ１２５：１７４
（１９６３）　）生命を脅かす葉酸塩の欠乏を有する子
供の尿中にそれは発見されなかた（Ｃｏｒｂｅｅｌ。

Ｌ、、Ｇ、Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇｈｅ、Ｊ、Ｊａｅ
ｋｅｎ、Ｊ、ｖａｎ　Ｔｏｒｎｏｕｔ。

Ｎ、Ｒ，Ｂｅｃｋｌｅｓ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｅｄ、１４３
：２８４−２９０（１９８５）　）。

従来ホモシスティンは中程度またはおだやかなコバラミ
ン葉酸塩の欠乏を有する子供の血清または尿中に報告さ
れていず、生命を脅かす、中程度またはおだやかなコバ
ラミン葉酸塩の欠乏を有する音なの血清または尿中に従
来報告された。

血清葉酸塩レベルは葉酸塩の欠乏をもつ多（のアルコー
ル患者Ｔ、：３いて減少しないこと、および合計のホモ
システィンの測定はこれらの患者の多くにおける葉酸塩
の欠乏の追加の、より精確な指示を提供することが、ま
た、発見された。ホモシスティンは葉酸塩の代謝の遺伝
的欠陥をもつある子供の尿および／または血清において
増大することが従来知られていた〔参照、例えば、Ｍｕ
ｄｄ、Ｓ、’１１．　。

Ｈｅｒｉｔａｂｌａ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ｓｕｐｒａＨ
Ｍｕｄｄ、Ｓ、Ｈ，＋　　ＭｅｔａｂｏｌｉｃＢａｓｉ
ｓ　５ｕｐｒａ　）が、ホモシスティンが葉酸塩の欠乏
をもつ子供または大人の尿または血清中において増大す
ることは、従来、知られていなかった。

さらに、ある動物がコバラミンの欠乏、葉酸の欠乏、両
者を有するか、あるいはいずれももたないかを、合計の
組織のホモシスティンおよびメチルマロン酸のレベルを
正常なレベルと比較する組み合わせのアッセイに基づい
て決定することが可能であることが発見された。葉酸の
欠乏およびコバラミンの欠乏の両者は増大した合計のホ
モシスティンのレベルを生ずるが、コバラミンの欠乏は
、また、メチルマロン酸のレベルを増大し、これに対し
て葉酸の欠乏は増大しないであろう。メチルマロン酸は
コバラミンの代謝またはコバラミンの輸送の遺伝的欠陥
を有する、多くの子供の血清および／または尿において
、および変化する程度のコバラミンの欠乏おもつ子供お
よび大人の尿において増大することが、従来、知られて
いた〔参照、例えば、Ｂｅｃｋ、　Ｈ，Ｓ、　＋血懸豆
圏■＋　５ｕｐｒａ）　＊　しかしながら、従来、ホモ
システィンのアッセイと組み合わせてメチルマロン酸の
アッセイを使用して、コバラミンの欠乏および葉酸の欠
乏を診断および／または区別することは、知られていす
、また示唆されていない。今回、われわれは、この組み
合わせたアッセイは、変化する程度の貧血、大赤血球症
、血清コバラミンのレベルの低下、および変化する種類
の神経精神学的異常をもつ患者におけるコバラミンの欠
乏の診断において、事実、きわめて有用であることを発
見した。

体の組織におけるホモシスティンの増大したレベルは前
記体の組織におけるコバラミンおよび／または葉酸の減
少したレベルと相関関係をもつことが、発見された。し
たがって、ホモシスティンのアッセイを使用して、温血
動物におけるコバラミンおよび／または葉酸の欠乏の存
在または不存在を決定することができる。この目的に対
して適当なアッセイは、体の組織、好ましくは体液、好
ましくは尿または血液におけるホモシスティンのレベル
を決定できるアッセイを包含する。血清および血漿はと
（に好ましい。

尿または血液中のホモシスティンのレベルの決定におけ
る使用に適当な、いくつかの異なる既知のアッセイが存
在するが、従来、コバラミンまたは葉酸の欠乏の検出に
、いずれも使用されてきていない。参照、例えば、５ａ
ｅｔｒｅ、　Ｒ，およびり、Ｌ。

Ｒａｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９
０：６８４−６９２（１９７８）、この文献は、尿中の
減少した合計のシスティン、および血漿の蛋白質以外の
分画中の合計のシスティンおよびホモシスティンを測定
して、イオウの代謝のある種の先天性疾患、例えば、チ
スチン尿症、シスチン蓄積症およびホモシスチン尿症に
ついてスクリーニングし、そしてそれらの処置を監視す
る方法を記載している。この方法は、体液の試料をチオ
ール基に応答するようにセットされた化学的検出器を有
する高性能体クロマトグラフィーにかけ、そして結果を
標準曲線と比較して、もとの試料、中に存在する標的化
合物の量を決定することからなる。この手順において、
標準は標的化合物と同時に混合するのではなく、むしろ
別々に実験する；こうして、標的および標準の回収を同
等にすることを保証することは不可能である。

Ｒｅｆｓｕｎ＋、１１．　、Ｓ、ＩＩｅｌｌａｎｄおよ
びＰ、Ｍ、Ｕｅｌａｎｄ、ＣＩ　ｉｎ。

Ｃｈｅｍ、３１　（４）　：６２４−６２８　（１９８
５）　ｎに記載されている、他の適当な手順は、試料中
に存在するホモシスティンを、放射性標識したＳ−アデ
ノシンおよびＳ−アデノシルホモシステインヒドラーゼ
に暴露することによって、標識されたＳ−アデノシルホ
モシステインに転化し、そして前記標識されたＳ−アデ
ノシルホモシステインを適当な検出系によって定量する
ことからなる。示唆された用途は、悪性の病気の管理に
おけるホモシスティンの代謝の監視、および抗葉酸塩薬
物メトキシレートを使用する処置の間における、遺伝的
病気のホモシスティン尿症の監視、および閉経期後の女
性の血漿中の血清ホモシスティンの監視を包含する。こ
の手順は、ホモシスティンを監視して、コバラミンまた
は葉酸の欠乏の検出または測定に決して使用されてきて
いない。再び、この手順は内部標準を使用せず、こうし
て標的および標準の回収を同等にすることを保証するこ
とは不可能である。

血清または尿中のホモシスティンのレベルを測定する、
非常に、いっそう感受性でありかつ精確な手順は、合計
のスルフヒドリルアミノ酸についての次の新規なアッセ
イである。スルフヒドリルアミノ酸は、−ＳＨ部分を含
有するもの、例えば、弐 〇〇〇Ｃ−Ｃｌ１（ＮＨｚ）　　−Ｃ）Ｉｚ　　−ＣＩ
ｔ　−ＳＨ のホモシスティン（ＨＸｙ３）および式１式％ のシスティンである。スルフヒドリル化合物は、ジサル
ファイド結合を介して化合物して二量体、例えば、式 ％式％ のシスティン、式 ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨｚ）　　−Ｃｔｂ　　Ｃ１１□−Ｓ
　　ＨｚＣ−ＨｔＣ（ＨｚＮ）ＨＣ−Ｃ０ＯＨ のホモシスティン、および式 ％式％ のホモシスティン−システィンを生成する自然の傾向に
よって特徴づけられる。蛋白質の存在下に、ホモシステ
ィンおよびシスティンの両者は蛋白質分子上の遊離のス
ルフヒドリル基と複合体を形成する；組織から誘導され
た試料において、このような蛋白質の複合体は存在する
システィンおよびホモシスティンの大部分を結合するこ
とができる。

合計のスルフヒドリルアミノ酸についてのアッセイは、
これらのアミノ酸がこのような化合物を形成する容易さ
によって複雑化される。還元は放出のためおよび引続く
蛋白質結合スルフヒドリル化合物のアッセイのために要
求されるが、両者のアミノ酸が、初期の還元後、新しい
ジサルファイトを有意な程度に再形成する可能性がある
ように思われる。ジサルファイド結合の再形成は、非常
に変動することがあり、そして非スルフヒドリル含有ア
ミノ酸を内部標準として使用することによってはスルフ
ヒドリルアミノ酸または補償することができない。試料
中の合計のスルフヒドリルアミノ酸のアッセイは、この
ような二量体および複合体を考慮に入れなくてはならな
い。

したがって、本発明は、所定の試料中の合計のシスティ
ンおよび／または合計のホモシスティンを質量分析計を
使用してアッセイする好ましい方法を提供する。用語「
合計のシスティン」および「合計のホモシスティン」は
、遊離の形態および複合化した形態の両者で存在する、
それぞれ、システィンおよびホモシスティンの合計量を
意味する。便宜上、以下の説明は、例として、ホモシス
ティンを使用するが、同一の手順はシスティンに同様に
はたらく。内因性のホモシスティンを含有する所定の試
料を、内因性のホモシスティンの完全なランダム化を補
償するために十分な量の還元剤と一緒にし、そして合計
のホモシスティンを適当な手段によって測定する。好ま
しくは、所定の試料をまず内部参照標準と一緒にし、前
記内部参照標準はホモシスティンと同様に挙動するが、
安定なアイソトープのマーカーで標識された化合物の既
知量からなる。内因性ホモシスティンおよび参照標準の
完全なランダム化を補償するために十分な量の還元剤を
添加し、そして存在するホモシスティンおよび標識参照
標準を質量分析計で測定する。内因性ホモシスティンお
よび参照標準がこの手順を通じて同一の相対比で発生す
ると仮定すると、この比を質量分析計の読みから計算し
、そしてもとの試料中の標準の既知量に適用して、本来
存在する内因性ホモシスティンの合計量を計算すること
ができる。前述のように、同一の手順はシスティンに対
して有効である；また、ホモシスティンおよびシスティ
ン（または他のアミノ酸）の各々がそれ自体の適当な内
部参照標準を有するかぎり、それらについてのアッセイ
を同時に実施することができる。

内部参照標準は、この手順を通じて質量分析計の分析ま
で内因性標的化合物と同一に挙動するが、質量分析計の
分析のもとで区別することができ、かつ別々に測定でき
る、任意の化合物である。適当な内部参照標準は、測定
すべき標的アミノ酸の重水素化またはトリチウム化類似
体、またはこのアッセイの目的に効果的に同一であるた
めに十分に標的アミノ酸に類似する重水素化またはトリ
チウム化化合物、あるいはＣ１３またはＮ”または他の
適当なアイソトープのマーカーを十分な量で含有する標
的アミノ酸の他の類似体である。こうして、標識した参
照化合物は、取扱いの問罪標識標的と区別不可能である
が、質量分析計の定量のために異なるかつ明確なイオン
を提供するであろう。

このアッセイのための好ましい化合物の例は、システィ
ンの重水素化形態、例えば、Ｄ、Ｌ−（３゜３．３’、
３’−”Ｈ，）システィンおよび重水素化ホモシスティ
ン、例えば、Ｄ、Ｌ−（３，３゜３　’　、　３　’　
、　４　、４　、４　’　、　４　’　−”　Ｈａ　）
ホモシスティンである。内部標準として使用するために
適当な化合物は、例えば、メルク・シャープ・アンド・
ドーム（Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ　＆　Ｄｏｈｍｅ）か
ら入手可能である。

定量は、測定した標的化合物対内部標準の比が、最初の
試料中の標的化合物の合計の未知量対添加した内部標準
の合計量の比と同一であるとレーラ仮定に基づく。これ
は、標的および内部標準の両者についての同一回収割合
を仮定する。スルフヒドリル化合物の場合において、回
収は、少なくとも部分的に、スルフヒドリルアミノ酸が
取ることのできる、種々の可能な形態、遊離および複合
化した形態に依存する。したがって、各アッセイについ
て、遊離な状態および各可能な複合化した状態における
標的および内部標準の相対比は、同一であることが非常
に重要である；これは、標的および内部標準の同一の相
対百分率が失われる（および回収される）ことを保証す
る。したがって、標的および内部標準の両者を含有する
初期の試料に還元剤を添加する；十分な還元化合物を添
加してジサルファイド架橋のすべてを破壊し、こうして
スルフヒドリルアミノ酸のすべてを遊離な状態にする。

ジサルファイド架橋の再結合を防止する化合物、例えば
、ヨードアセテート、ヨードアセトアミド、またはヨー
ドプロパンを添加して、スルフヒドリルアミノ酸のすべ
てが遊離な状態にとどまるであろうことを保証すること
ができる。標的および標準のスルフヒドリルアミノ酸が
同一のタイプおよび数のこのような複′合化を形成する
であろうことを仮定して、任意に化合物がジサルファイ
ド架橋を再形成し、こうして遊離の状態、各可能な複合
化状態、質量分析計によって測定される標的および内部
標準の量において、もとの試料中に存在したのと、同一
の標的および内部標準の量についての比存在するように
できる。適当な還元剤はその分子の残部を破壊しないで
ジサルファイド結合を破壊できるもの、例えば、２−メ
ルカプトエタノール、ジチオスレイトールおよびホウ水
素化ナトリウムである。

必要に応じて、還元剤の添加の前または後に、標的アミ
ノ酸および内部標準を部分的に精製することが必要であ
るか、あるいは望ましいことがある。アミノ酸の精製お
よび分離のための既知の手段、例えば、濾過、カラムク
ロマトグラフィー、陰イオンおよび／または陽イオン交
換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体
クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、分
子篩、などを使用できる。適当な分離および精製技術を
選択する方法、およびそれらを実施する手段はこの分野
において知られている。参照、例えば、Ｌａｂａｄａｒ
ｉｏｓ、Ｄ、、　１．Ｍ、ＭｏｏｄｉｅおよびＧ、Ｓ、
５ｈｅｐｈａｒｄ＋Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、３１０：２２３−
２３０１９８４）およびその中の参考文献；、５ｈａｈ
ｒｏｓｈｉ＋　Ｐ、およびＣ，Ｗ、Ｇｅｈｒｋｅ、Ｊ、
Ｃｈｒｏｍ。

３６：３ｌ−４０１９６８）。

必要に応じて、また、標的化合物および内部標準を変性
して、精製および／または分離を促進するために、ある
種の特徴を変更または改良することが必要であるか、あ
るいは望ましいことがある。

この実施は誘導体化としてこの分野においてよく知られ
ている０例えば、標的および参照化合物を、改良された
溶解性、異なる電荷、増大した揮発性などを有する類似
体に転化して、質量分析計の分析前の精製および／また
は分離を促進することが望ましいことがある。参照、例
えば、Ｋｎａｐｐ、　Ｄ、　Ｒ，。

Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｄｅ
ｒｖａｔａｔｉｚ　ｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔ−ｉｏｎｓ（
Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、１９７９）　＊好ましい手順は、標的および参照化
合物をそれらのシリル誘導体に転化して、ガスクロマト
グラフィー／質量分析計の装置の組み合わせによる分離
および同定を促進することを包含する。この目的に対し
てて化合物をシリル化する手段および方法は、この分野
において知られており、参照、例えば、Ｋｎａｐｐ、　
５ｕｐｒａ　；Ｂｉｅｒｍａｎ＋　Ｃ，Ｊ、　＋　Ｃ，
Ｍ、に１ｎｏｓｈｉｔａ、Ｊ、＾。

ＭａｒｌｅｔｔおよびＲ，Ｄ、５ｔｅｅｌｅ、Ｊ、Ｃｈ
ｒｏｗ、３７５：３３０−３３４（１９８６）。好まし
い方法は、標的化合物を内部参照と一緒にし、還元剤を
添加してランダム化を実施し、得られる遊離および複合
化したスルフヒドリルアミノ酸の混合物を部分的に精製
し、生成物をアセトニトリル中に溶解し、そしてＮ−メ
チル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロ
アセトアミド添加してシリル化を達成することを包含す
る。次いで、得られるシリル化スルフヒドリル標的化合
物および参照化合物を濃縮して、ＧＣ／質量分析計に注
入する試料を準備する。

血清についてこの手順を使用すると、合計のホモシステ
ィンのついて１μモル／ｌの感度ヲ達成することが可能
であり、そしてアッセイは合計のホモシスティンについ
て１〜１００μモル／１モルの範囲にわたって直線であ
る。ヒト血清におけるホモシスティンの正常の範囲は約
７〜約２２μモル／１であり、そしてヒトの尿において
約１〜約２０μモル／１である。これらの範囲より上の
ホモシスティンのレベルはコバラミンの欠乏および／ま
たは葉酸塩の欠乏を指示する；このレベルが高いほど、
指示はより強い。

また、メチルマロン酸（ＭＭＡ）のレベルについて、ホ
モシスティンのアッセイと同時に、あるいはそれに引続
いて、第２アツセイを実施することにより、コバラミン
の欠乏と葉酸の欠乏とを区別することが可能であること
が発見された。コバラミンの欠乏および葉酸の欠乏の両
者はホモシスティンのレベルを、上昇させるが、コバラ
ミンの欠乏は通常メチルマロン酸のレベルを上昇させ、
これに対して葉酸の欠乏は通常上昇させないであろう。

ホモシスティンのレベルは遺伝的欠陥のない個体におい
て増大するとき、葉酸塩またはコバラミンの少なくとも
一方は欠乏する。ＭＭＡが、また、増大するとき、コバ
ラミンは通常欠乏する。

したがって、ホモシスティンおよびＭＭＡの両者が増大
するとき、コバラミンは欠乏する（そうでなければ、正
常である）が、葉酸塩が、また、欠乏すうか否かは明ら
かでない（なぜなら、合計のホモシスティンの増大への
葉酸塩の欠乏の寄与はコバラミンの欠乏の作用によって
マスクされうるからである）、逆に、ホモシスティンが
高いが、ＭＭＡが正常であるとき、増大したホモシステ
ィンは葉酸塩の欠乏のためであるように思われる。

なぜなら、コバラミンの欠乏のためのであった場合、Ｍ
ＭＡも通常高いであろうからである。ある場合において
、ＭＭＡレベルは、ホモシスティンのレベルが上昇しは
じめる前にさえ、コバラミンの欠乏のために増大するこ
と、あるいはホモシスティンは、ＭＭＡのレベルが上昇
しはじめる前に、コバラミンの欠乏のために増大するこ
とが、起こりうる。こうして、このアッセイによって供
給される情報は、これらの欠乏の早期の適切な診断に関
連して価値がある。

この組合わされたホモシスティン／ＭＭＡアッセイにお
いて、ホモシスティンのレベルは前述の手段のいずれに
よっても適当にアッセイされる。

本発明の手順は好ましい。ＭＭＡは、例えば、次の文献
に記載される方法によって適当にアッセイされる：　　
Ｎｏｒｍａｎ＋Ｅ、Ｊ、＋０．Ｊ、Ｍａｒｔｅｌｏおよ
びＭ、Ｄ。

Ｄｅｎｔｏ、Ｂｌｏｏｄ　５９（６）：１１２８（１９
８２）またはＭａｒｃｅｌ、Ｐ、Ｄ、。

Ｓ、Ｐ、５ｔａｂｌｅｒ、Ｅ、Ｒ，Ｐｏｄｅｌｌおよび
Ｒ，１，Ａ１１ｅｎ、八ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５０：５８−６６（１９８５）　、
好ましくは、試料は内部参照標準と一緒にする。この内
部参照標準は、安定なアイソトープマーカー、好ましく
はＭＭＡの重水素化類似体で標識されたメチルマロン酸
の既知量からなる。次いで、存在する標識されたＭＭＡ
および標識されないＭＭＡの量を質量分析計で測定し、
そしてもとの試料中のＭＭＡの量をはじめ添加した標識
されたＭＭＡの既知量から計算する。ホモシスティンの
場合と同様に、標識したＭＭＡおよび標識されないＭＭ
Ａを、質量分析計による分析前に、部分的精製および／
または誘導体化にかけることができる。好ましい誘導体
はシリル類似体である；Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）トルフルオロアセトアミドの類似体は
とくに好ましい。

また、１種または２種以上の非スルフヒドリルアミノ酸
、例えば、メチオニンをホモシスティン、ＭＭＡ、また
は両者と同時に測定することが顔使用であるが、ただし
適当な内部標準を含める。非スルフヒドリルアミノ酸の
ための適当な内部標準は、ノルロイシンまたは非スルフ
ヒドリルアミノ酸の適当に標識された類似体である。

いったん葉酸塩の欠乏および／またはコバラミンの欠乏
が決定されると、処置の進行は処置の間または後に周期
的にアッセイを反復することによって監視することがで
きる。場合に応じてコバラミンおよび／または葉酸塩の
経口的または非経口的投与後における、血清および／ま
たは尿中のホモシスティンのレベルの低下は、診断を確
証することができる。

本発明のそれ以上の理解は、以下の非制限的実施例から
得られるであろう、上において使用したように、そして
以下において特記しないかぎり、すべての温度および温
度範囲はセ氏であり、そして周囲温度および室温は約２
０〜２５℃である。用語百分率または（％）は重量％で
あり、そして用語モルはグラムモルである。

実施例■ ２４か月の期間（１９８３年９月〜１９８５年９月）に
わたって、われわれは７．７４７人の患者における血清
コバラミンのレベルを、２つのニューヨーク市の病院（
Ｃｏｌｕｍｂｉａ−Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　ＣｅｎｔｅｒおよびＨａｒｌｅ＋ｍ　Ｈｏ５
ｐｉｔａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）の医師からのこの試験の要
求に答えて測定した。この群のうちで、３０１人の患者
は２００μモル／ｌより低い血清レベルを有し、このレ
ベルは精製した固有の因子を使用する「改良された」ラ
ジオアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）の製造業者が述べ
ている正常の下限である。低いコバラミンレベルをもつ
患者のどれだけ多くがビタミンに真に欠乏しているかを
決定するために、すべての患者を完全に研究することを
試みた。出来るだけ頻繁に、完全な臨床的（神経学的を
包含する）評価、血液および骨髄の塗抹標本、固有因子
に対する抗体についてのシリング（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ
）テストおよび血清テストを得、次いでシアノ−コバラ
ミンによる処置の課程に対する患者の応答を観察した。

コバラミンの欠乏が３０１人の患者のうち１３８人に存
在するか否かに関して確固とした結論に到達することが
できた。１３８人のうち７９人において、臨床的症候群
または血液学的症候群、または両者が存在し、シアノ−
コバラミン処置に対して明瞭に応答した。これらの患者
は欠乏であると考えた。

これらの患者の臨床的表示の分析は、ある数の驚くべき
発見を示し、ここで多くは」バラミンの欠乏のための巨
大赤芽球性貧血の古典的特質を有さなかった。ヘマトク
リットは３４人（４３％）、患者のほぼ半分において正
常（すなわち、貧血は存在しない）であった。中程度に
重度の貧血（ＨＣｔ＜２４％またはヘモグロビン＜　３
　ｇ　／ｄｉ）は７９人の患者のうち１６人（すなわち
１１５）において存在したのみであった。３６人の患者
（４５，６％）において、コバラミンの欠乏の起因させ
うる症候は存在しなかった。白血球の数は８５％におい
て正常であった；血小板の数は７６％において正常であ
った；血清ビリルビンは７４％において正常であった；
そして血清ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は４
０％において正常であた。したがって、これらの実験室
の発見は、巨大赤芽球性貧血をもつ患者において典型的
であると考えられ、欠乏の群においてしばしば、または
通常見失われていた。また、血清コバラミンは欠乏患者
のうち２３人（すなわち２９％）において＞　１１００
ｐ／ｓｒであり、血清コバラミンの低下の程度を、また
、信幀性をもって使用して、ある患者が欠乏であるかど
うかを精確に予測することができるであろうことが示さ
れた。増大したＭＣＶでさえ、コバラミンの欠乏のその
ような特性であると考えられるが、欠乏患者のうち１５
人（１５％）において見られなかった。高いＭＣＶをも
つ患者において、ＭＣＶの増大の程度はしばしばわずか
であったニア９人の患者のうち２８人（すなわち３５％
）は１００〜１１０ｆｌの範囲のＭＣＶを有した。

こうして、わずかに３６人（すなわち４６％）の患者は
顕著に増大したＭＣＶ　（＞１１０ｆｌ）を有した。

確固とした結論に到達できた１３８人の患者の中に、シ
アノ−コバラミンに対していかなる方法においても明瞭
に応答しない５９人の患者が存在した。これらの患者は
欠乏であると考えなかった。

これらの欠乏でない群において、６人（すなわち１０％
）　ハ１１００ｐ／−より低い血清コバラミンを有し、
ＭＣＶまたは血清コバラミンの抑制の程度を患者がコバ
ラミンに欠乏しているがどうかの信顛性ある指示として
使用できないことがさらに示された。

われわれは、実質的の数の欠乏患者がほんのわずかに低
い血清コバラミンレベル、すなわち、１００〜２００ｐ
ｇ／ｒｄの範囲をすることを発見した後、２００〜３０
０ｐｇ／ａｊ　（低い正常）の範囲の血清コバラミンを
もつ患者のすべてを再検討した。このようにして、われ
われは、＞　２００ｐｇ／ａｆの血清コバラミンレベル
を有する、コバラミンが明瞭の欠乏した、いく人かの患
者を発見した。

これらの発見により、われわれは、コバラミンの欠乏を
もつ大きい数の患者は、通常コバラミンの欠乏において
存在することが期待される「典型的な」臨床的および血
液学的特徴を欠き、そして欠乏が事実存在するかどうか
を確立することを促進する、新しい試験が明らかに必要
であるという結論に到達した。

次いで、７９人の欠乏患者および５９人の比欠乏患者か
らの標本中のホモシスティンおよびメチルマロン酸の血
清レベルを測定した。ホモシスティンおよびメチルマロ
ン酸の両者のレベルは、７９人の患者のう、ち６０人（
７６％）において明瞭に増大していた（ホモシスティン
、３０μモル以上およびメチルマロン酸、１５０ｎｇ／
ａ＃以上）。

ホモシスティンレベルは７９人の患者のうち１０人（１
３％）において明瞭に増大しており（メチルマロン酸レ
ベルは明瞭に増大しないで）、そしてメチルマロン酸レ
ベルは７９人の患者のうち４人（５％）において明瞭に
増大していた（ホモシスティンレベルは明瞭に増大しな
いで）、７９人の欠乏患者の残りの５人（６％）におい
て、いずれの試験も明瞭に増大しなかった。

対照的に、５９人の欠乏でない患者において、両者の試
験は１人（２％）患者において明瞭に増大した；ホモシ
スティンのみは６人（１０％）において明瞭に増大した
；そしてメチルマロン酸レベルは９人（１５％）におい
て明瞭に増大した。

残りの４３人（７３％）の患者において、いずれの試験
も明瞭に増大しなかった。一方または双方の試験が明瞭
に増大した、欠乏でない患者の小部分においてさえ、試
験は診断的に有用であることを示した。一方または双方
の試験が明瞭に増大した１６人の患者のうち１１人は、
コバラミンの吸収の隠れた疾患、例えば、悪性の貧血、
重度の萎縮性胃炎および回腸の病気を有し、ある後の時
においてコバラミンの欠乏の潜在的原因を有することが
証明された。このような患者は予防的シアノ−コバラミ
ン処置を受ける必要がある。１６人のうち追加の２人の
患者は、血清ホモシスティンの増大を説明する隠れた葉
酸の欠乏を有した。

これらの試験は、また、葉酸塩の欠乏の診断において有
用であると思われる。貧血をもつ連続的に研究した１２
０人のアルコールの患者において、骨髄を検査した。３
８人の患者において、骨髄の塗抹標本は巨大赤芽球性で
あった。コバラミンの欠乏を有する１人の患者を分析か
ら排除した後、残りの３７人の患者は葉酸の欠乏を有す
る可能性が高度に大きいと考えられた。血清葉酸塩濃度
（葉酸塩の欠乏について最も広く使用されている診断）
は３７人の患者のうち１５人（４１％）において低く、
これに対して血清ホモシスティンは３７人の患者のうち
２７人（７３％）において明瞭に増大していた。こうし
て、血清ホモシスティンは血清葉酸塩濃度よりも葉酸塩
の欠乏の検出について感度のある試験であることがわか
った。赤血球の葉酸塩濃度（ＲＣＦ）を測定した、巨大
赤芽球性骨髄をもつ１５人の患者において、ＲＣＦは１
５人のうち１０人（６７％）において低く、そして血清
ホモシスティンは１３人（８７％）において明瞭に増大
していた。こうして、血清ホモシスティンのアッセイは
、また、赤血球葉酸塩アッセイよりも感度が高かった。

実施例ＴＩ ヒト血清を適当な内部参照標準、例えば、Ｄ。

Ｌ−（３，３，３’　、３’　、４．４．４’　、４’
−”Ｈａ）ホモシスティン〔これは、現在、Ｍｅｒｃｋ
Ｓｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｎｉｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅｓ
（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎｄａ）から入手可能である
〕と−緒にし、そしてよく混合する。

次いで、過剰の還元剤（例えば、２−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトールまたはホウ水素化ナトリウム
）を添加して、すべてのホモシスティンが遊離の形態に
確実に還元されるようにする。必要に応じて、キレート
化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはＢＧＴＡを添加して、そ
うでなければ遊離のスルフヒドリル基に結合しうる、金
属イオンを除去することができる。この反応混合物を菌
株し、必要に応じて約２５〜約１５０℃に約１分〜約６
０分間加熱して、標識されたホモシスティンおよび標識
されないホモシスティンのランダム化を確実にする。

次いで、蛋白質を、例えば、加熱変性、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過により、あるいは蛋白質を沈
殿させる化合物、例えば、スルホサリチル産、ピクリン
産、硫酸アンモニウムなどを添加することによって除去
する。得られる混合物を攪拌し、そして遠心して蛋白質
の沈殿物を除去する。すでに酸性でない場合、上澄みを
酸性化し、そして陽イオン交換カラム、例えば、Ｂｉｏ
ＲａｄＡＧ　　５０ｗ−Ｘ８（２００〜４００メツシユ
）、水素型（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に添加して、負に帯電した
塩類を除去する。次いで、アミノ酸を溶離し、塩基性の
ｐｉ（に調節し、そして陰イオン交換カラム、例えば、
ＢｉｏＲａｄ　ＡＧ　１−Ｘ　８（２００〜４００メソ
シユ）、酢酸塩型に添加して、正にに帯電した塩類を除
去する。次いで、アミノ酸を熔離し、乾燥し、そして小
型の密閉顔使用なバイアル、好ましくはテフロンでライ
ニングした離脱のふたをもつバイアルに移す。次いで、
アセトニトリル中のＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）トリフルオロアセトアミドを添加し、バイ
アルを密閉し、そして約２０〜約１５０℃において約５
分間〜約１夜放置して、シリル化反応を完結させる。好
ましくは、バイアルは室温において１夜放置するか、あ
るいは約８０℃に約１時間加熱する。次いで、過剰の誘
導体化剤を、水（これは攪拌化剤を加水分解する）およ
び揮発性溶媒の添加によって除去できる。この混合物を
遠心して乳濁液を透明にし、そして誘導体剤の大部分を
含有する非水性層を透明なバイアルに移し、そして例え
ば、窒素の下で、はとんど蒸発乾固して体積を減少させ
る。

次いで、得られる調製物をガスクロマトグラフ／質量分
析計上に注入し、この装置は約室温〜約３５０℃の温度
の注入口および約５〜約４５ρｓｉのカラムヘッドを有
する。毛管のカラムを約２０〜約２５０℃において約１
〜約１５分間運転する。その後温度を約７５〜約３５０
℃に約１〜約３０℃／分で上昇させる。ホモシスティン
が溶離する精確な時間および温度は、既知量のホモシス
ティンを最初に展開することによって決定する。その後
、試料を展開し、そして走査のモードで、あるいは好ま
しくは選択したイオンを監視するモードでデータを集め
る。

実施例ＩＩＩ Ｌ−ホモシスティンおよびＬ−システィンはシグマ・ケ
ミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、）（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、そし
てＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリ
フルオロアセトアミドはピアース・ケミカル・カンパニ
ー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（Ｒｏ
ｃｋ４ｏｒｄ、ＩＬ）から入手した。Ｄ、Ｌ−（３，３
，３’、３’、４．４．４’４”Ｈａ）ホモシスティン
（９８，４％）は、メルク・シャープ・アンド・ドーム
・アイソトープス（Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ　ａｎｄ　
Ｄｏｈｍｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ。

Ｃａｎｄａ）から入手した；そしてり、Ｌ−（３，３゜
３　’　、　３　’　−”　Ｈ４）システィン（９８％
）およびＬ−（メチル−”Ｈ３）メチオニン（９８％）
は、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃ
ａｍｂｒｉｄｒｅ　Ｔｓｏｔｏｐｅ　Ｌａｂｏｌａｔｏ
ｒｉｅｓ）（Ｗｏｂａｒｎ、ＭＡ）から購入した。血液
の試料は、通常健康な血液共与者からベレ・ボッフィル
ス・ブラッド・バンク（Ｂｅｌｌｅ　Ｂｏｎｆｉｌｓ　
Ｂｆｏｏｄ　Ｂｎｋ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）において血
液共存時間に得た。連続的血液の共与者は、次の年令群
の各々において５人の男性および５人の女性から試料が
得られるように選択した＝１８〜２６．２７〜３５．３
６〜４５．４６〜５５および５６〜６５（合計５０の試
料）。試料は９ａ、ｍ、およびｉｐ、ｍ、において得、
室温において１〜４時間凝固させ、１５００ｘｇで３０
分間遠心し、そして血清を取り出し、そして−２０℃に
おいて貯蔵した。他の試料は実験しつの人員から得た。

それらを室温において０〜２４時間凝固させた後４℃に
おいて遠心するか、あるいはヘパリンまたはＥＤＴＡを
添加し、室温においてＯ〜２４放置した後、血漿を４℃
において遠心によって集めた。スプレイグーダウリイ（
Ｓｐｒａｇｕｅ−３ａｅｙｌｅｙ）ラット、２５０−３
５０ｇ、を５ＡＳＣＯ、インコーホレーテッド（Ｏｍａ
ｈａ、ＮＢ）から入手し、そして血液をエーテル麻酔の
下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共与者の試料に
ついて前述したように、血清を集めおよび貯蔵した。

５ナノモルのり、Ｌ−（３，３，３’、３’　。

４．４．４’、４’−”　夏４１１）ホモシスティン、
２５ナノモルのり、Ｌ−（３，３，３’　、３’−！Ｈ
４〕システィンおよび１５ナノモルのし一〇メチルー”
Ｈｓ）メチオニンを含有するＨ２０の５０μｌの体積を
１００ｐ１の血清に添加した。混合後、１５８賄のＮａ
ｚ　ＥＤＴＡおよび１００μ／の２−メルカプトエタノ
ールを含有する１１□Ｏの２．５　ｒｎｆをおよびし、
混合し、そして１００℃において１５分間沸騰させた。

室温に冷却した後、２５羅のスルホサリチル酸を含有す
るｌＩ２０の１００Ｊ１！および６Ｎの）ＩＣＩの２５
ｄを添加し、次いで混合し、そして１１０００Ｘで１５
分間遠心した０次いで、上澄みを２００Ｉの陽イオン交
換樹脂ＡＧ　　５０Ｗ−Ｘ８（２００〜４００メツシユ
）、水素型（（旧ｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
＋Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）　（これはＨ２Ｏ中で予備
平衡化しである）を含有する使捨てカラムに適用した。

６−のＨｔＯで洗浄した後、アミノ酸を２−の８ＮのＮ
Ｈ，ＯＨで溶離した。溶離液は、直接、２００　Ｊｌｌ
の陰イオン交換樹脂ＡＧＩ−Ｘ８（１００〜２００メツ
シユ）酢酸塩型（（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｒｉｃｂ＋＋＋ｏｎｄ、ＣＡ）（これはＨ，Ｏ
中で予備平衡化しである）を含有する使捨てカラムに適
用した。９−のＨ，Ｏで洗浄した後、アミノ酸を２艷の
０．　Ｉ　ＮのＭＣＩで溶離し、そしてスピードＶａｃ
カラム濃縮器（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎ５ｔｒｕａ＋−ｅｎ
ｔｓ、Ｉｎｃ、＋Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で乾固
した０次いで、乾燥した試料を２５０ハのＵＺＯ中に溶
解し、３００　ｄのリアクチ（Ｒｅａｃｔｉ）バイアル
（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｓｉｃａＩ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ、ＩＬ）に移し、そして真空濃縮装置で乾固し
た。

１０１１１のアセトニトリルおよびｌ０ｔｄのＮ−メチ
ル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロア
セトアミドを各バイアルに添加し、それらのテフロンで
ライニングした隔膜キャップで密閉し、そしてそれらを
室温（２２℃）で１夜放置するか、あるいはそれらを８
０’Ｃに１時間加熱することによって、アミノ酸のｔ−
ブチルジメチルシリル誘導体を調製した。　　１００Ｉ
１１のヘキサンを添加し、１０秒間渦形成した後、２ｏ
Ｊ１１の１１□０を添加して、未反応の誘導体化剤を加
水分解した。さらに１０秒間渦形成した後、試料を１１
００Ｏｘで５分間遠心し、そして上のヘキサン層をデカ
ンチーシランし、マイクロ遠心管に移し、そして窒素の
流れの適用によってほぼ１ｏｉｌ！に乾燥した。完全な
乾固を回避するように注意した。なぜなら、これは誘導
体の主要な部分を牛なわせるがらである。

はぼ２〆を毛管カラム上に落下する針の注入装置（ｆａ
ｌｌｉｎｇ−ｎｅｅｄｌｅ　１ｎｊｅｃｔｏｒ）で注入
した。

試料の分析はへウレットーパフカード（Ｉｌｅｗｌｅｔ
ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）　（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）
５９９２Ｂガスクロマトグラフ−質量分析計で実施し、
そしてこの装置は９８２５　Ｂ計算器、９８７６プリン
ターおよび分子噴射分離器を装備した。注入口を変更し
て、落下する針の注入器を受入れるようにし、そして補
助の補充キャリヤーガスのラインを噴射分離器に供給し
た。

試料の分割は、デュラボンド（Ｄａｒａｂａｎｄ）　Ｄ
　Ｂ　−１溶融シリ力毛管カラム（３０ｍ　Ｘｏ、２５
ｍ内径、０．２５ｎのフィルム熱さ）ｒＪ＆Ｗ　　サイ
エンティフィック・インコーホレーテッド（Ｒａｎｃｈ
。

Ｃｏｒｄｏｖａ、　ＣＡ）から入手した〕で達成した。

ガスクロマトグラフ−質量分析計は、２５０℃の注入口
の温度および２６ｐｓｉのカラムヘッドの圧力で、標準
の自動同調条件下に操作した。毛管カラムを１８０℃に
平衡化し、そして試料注入後１分に８℃／分で２７６℃
に増加した。データを選択したイオン監視のモードで４
．８〜９．６分に集めた。

次のＣＭ−５７３”イオンを５０ミリ病の滞留時間で各
々について監視した：ホモシステインモノマー、ｍ／ｚ
　４２０．２；Ｄ、（３，３，３’　、３’−２Ｈ４〕
システインモノマー、ｍ　／　ｚ　４２４．２　；シス
ティンモノマー、ｍ／　ｚ　４０６．２；　　（３、３
−２Ｈ２〕システインモノマー、ｍ／ｚ　４０８．２Ｂ
メチオニン、ｍ／Ｚ　３２０．２；およびＬ−（メチル
−２Ｈ１〕メチオニンｍ／ｚ　３２３．２゜合計のホモ
システィンは、はぼ８．９分においてｆＪＭされるｍ／
ｚ　４２０．２ピークの積分した面積（事＃確な時間は
標準を使用して毎日決定した）を同一時間に溶離したｍ
／ｚ　４２４．２ピークの積分した面積で割り、次いで
各試料に添加した（３．３．４’、４’−８Ｈ４〕ホモ
システインモノマーの等しい量である１００μモル／１
を掛けることによって定量した。

合計のシスティンは、同一の方法で、はぼ７．７分に溶
離したｍ／２４０６．２およびｍ／ｚ　４０８．２のピ
ークを利用し、そして試料に添加した（３．３−２Ｈ２
〕システインモノマーの等しい量である、５００μモル
／１をそれらの比に掛けることによって定量する。メチ
オニンは、同一の方法で、はぼ５．４分に溶離したｍ／
　ｚ　３２０．２およびｍ／ｚ　３２３．２のピークを
利用し、そして試料に添加した〔メチル−２Ｈ３〕メチ
オニンの量である、１５０μモル／１をそれらの比に掛
けることによって定量する。

３つの内部標準についての積分した面積、すなわち、そ
れぞれ、約８．９．７．７および５．４分に溶離するｍ
／ｚ　　斗２４．２　、混合物４０８．２およびｍ／ｚ
３２３．２のピークは、天然に産出するアイソトープの
存在量の結果として、それらに寄与される量について、
合計のホモシスティン、内因性合計のシスティンおよび
内因性メチオニンによって補正する。毎日の基準に基づ
いて冨んでないホモシスティン、システィンおよびメチ
オニンを使用して決定した、これらの相関関係は次の通
りであった：ｉ）８．９分におけるｍ／ｚ　４２０．２
ピークの面積のほぼ１．５％は８．９分におけるｍ／ｚ
　４２４．２ピークとして存在し、１ｉ）７．７分にお
けるｍ／ｚ　４０６．２ピークの面積のほぼ２１．４％
は７．７分におけるｍ／Ｚ　　’４０８．２ピークとし
て存在し、そして５．４分におけるｍ／ｚ　３２０．２
ピークの面積のほぼ３．１％は５．４分におけるｍ／ｚ
　３２３．２ピークとして存在した。

システィン−２−メルカプトエタノール、ホモシスティ
ン−２−メルカプトエタノール、システィン、ホモシス
テインーシステインニ量体、およびホモシスティンを検
出しかつ監視する実験において、実施時間を２０分に延
長し、そして最終温度を３３５℃に上昇させた。システ
ィンおよびホモシスティンについてのスペクトルは、２
−メルカプトエタノールを使用する標準の還元を用いな
いで、これらの化合物を直接誘導体化することによって
得た。システィン−２−メルカプトエタノールおよびホ
モシスティン−２−メルカプトエタノールについてのス
ペクトルは、それぞれ、システィンおよびホモシスティ
ンから、これらの化合物を誘導体化前に２−メルカプト
エタノールで還元する実験において得た。後者の技術を
用いてホモシステインージンセターゼニ量体についてス
ペクトルを得たが、ただしホモシスティンおよびシステ
ィンの等しい混合物を２−メルカプトエタノールで還元
し、次いで誘導体化した。アッセイの感度は、例えば、
ホモシスティンモノマ一対〔３゜３．４’、４’−”Ｈ
４〕ホモシスティンモノマーの比を決定することによっ
て測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載されている
直線性から変動する：　Ｚｉｎｎ、Ａ、Ｂ、、Ｄ、Ｇ、
ＨｉｎｅＪ、Ｊ、Ｍａｈｏｎｅｙおよびに、Ｔａｎａｋ
ａ、Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ、１６　：　７４０−７４
５（１９８２）　。

合計ホモシスティン、メチオニンおよび合計システィン
の尿からの清浄化は、合計ホモシスティンについて例示
したように次の唐弐で決定した：合計ホモシスティン／
クレアチニンの清浄化比＝　１００Ｘ　（尿の合計ホモ
システィン（μモル／１）／尿のクレアチニン （μモル／１）／　（血清合計ホモシスティン（μモル
／１）／血清クレアチニン（μモル／１）〕 この手順において利用する部分的試料の精製の長大な性
質は必要であった。なぜなら、アミノ酸および他の有機
化合物の複雑な混合物が血清および尿の中に存在し、そ
して存在する合計ホモシスティンの濃度が比較的低かっ
たからである。既知量の〔メチル−＋　４　ｃ　）メチ
オニンまたは（Ｕ′４３システィンを血清および尿の試
料に添加する実験は、両者のアミノ酸からの放射能のほ
ぼ７０％が最終のヘキサン溶液中に、長大な精製および
誘導体化の手順の終りに回収されたことを示した。同様
な回収の研究は、放射性標識したホモシスティンが商業
的に入手できないので、ホモシスティンについて実施し
なかった。

ホモシスティンのｔ−ブチルジメチルシリル誘導体の構
造およびｍ／ｚ値を、断片化の位置および〔Ｍ）！、（
Ｍ−１５）　”、ＣＭ−５７１”および（Ｍ−１５９）
　”における対応する断片のｍｌｚ値のいくつかと一緒
に下に示す： 以下余白 ＣＨ３ ＣＨ３−Ｃ−ＣＨＩ ＣＨｉ−Ｓｔ−Ｃｔｈ ホモシスティンのモノマー、システィンのモノマー、ホ
モシスティン、システィン、ホモシスティン−２−メル
カプトエタノール、システィン−２−メルカプトエタノ
ール、ホモシステインーシステインニ量体、およびメチ
オニンを、第１図にそれらのｔ−ブチルジメチルシリル
誘導体の質量スペクトルと一緒に示す。特定の誘導体の
分子量は、各存在する一ＣＣＯＨ１−ＮＨ，、−３Ｈお
よび一０ＨＩに結合した各ｔ−ブチルジメチルシリル基
について、アミノ酸またはジサルファイドの分子！　＋
　１１４に等しい。ホモシスティンのモノマー、システ
ィンのモノマー、ホモシスティン−２−メルカプトエタ
ノール、システィン−２−メルカプトエタノールおよび
メチオニンの場合において、主要なピークは（Ｍ−５７
）　”に存在した。ホモシスチン、システィンおよびホ
モシスティンニ量体の場合において、主要なピークはＣ
Ｍ／２）”に存在した。ＣＭ−５７１”ピークはホモシ
スチンでは観察されず、そしてほんの小さい（Ｍ−５７
）　”がシスティンおよびホモシスティン−システィン
二量体について観察された。

第２図は、（Ａ）メチオニン、システィンおよびホモシ
スティンを１：３：１で含有する混合物；（Ｂ）　　１
００Ｉ１１の正常ヒト血清？　　（Ｃ）　　１００ｐｌ
の正常ヒト血清；　　（Ｄ）　　１００．ｕｆの正常ヒ
ト尿から還元後に得られたアミノ酸類のむ一ブチルジメ
チルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す。研究した
アミノ酸は、次の通りであった；メチオニン（ＭＥＴ）
；システィンのモノマー（ＣＹＳ）ｉホモシスティンの
モノマー（ＨＣＹＳ）　　；　　（メチル−”ｕ＊）メ
チオニン（Ｍｅ　ｔ　＊）　　；　　（３、３−”Ｉ］
２〕　システィンモノマー；および（３、３゜４’、４
’−”Ｈ，）ホモシスティンモノマー（ＩＩＣＹＳ　＊
　）。ＭＥＴ＊、ＣＹＳ＊およびＨＣＹＳ　＊は試料Ａ
には添加せず、そしてそれらの表示を有するピークは、
天然に産出するアイソトープの存在■の結果として、そ
れぞれ、ＭＥＴ、ＣＹＳおよびＨＣＹ　Ｓによってそれ
らに寄与される量を表わす。

かっこ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査
したｍ／ｚについての値である。ｒＦ、　　Ｓ、　Ｊに
ついての値は太いダッシュのトレースの全規模について
の相対値である；細いダッシュのトレースは１０×の減
衰である。内因性合計ホモシスティンについて決定した
値は、ＢＳＣおよびＤについて、それぞれ、１８．９．
６．５および３．６μモル／ｌであった。内因性合計シ
スティンについて決定した値は、Ｂ、ＣおよびＤについ
て、それぞれ、３６９．１７３および２３８μモル／１
であった。内因性合計メチオニンについて決定した値は
、Ｂ、ＣおよびＤについて、それぞれ、それぞれ、１６
．８．６０．４および３．２μモル／ｌであった。第２
Ａ図は、毛管カラムがこれらの３種類のアミノ酸を完全
に分離することを立証している。システィン−２−メル
カプトエタノール、ホモシスティン−２−メルカプトエ
タノール、システィン、ホモシスティン−システィンお
よびホモシスチンの溶離プロフィルは示されていないが
、それらは、また、存在し、そして、それぞれ、１１．
８．１２．９．１６．３．１７．４および１８．４分の
溶離時間をもつ単一の対照ピークとして溶離される。

（３，３，３’、３’、４，４．４’、４’−２Ｈ８〕
ホモシスチン、（３、３、３’　、　３　’　−２Ｈ４
〕メチオニンを添加しない、ヒトの血清および尿、およ
びラットの血清の試料を使用する研究は、定量のために
内部標準としてのそれらの使用を妨害する物質が存在し
ないことを立証した。

アッセイの感度は５０μモル／１の（３、３、３’。

３’、４，４．４’、４’−”Ｈａ）ホモシスチン、２
５０Ｉモル／１の（３，３，３’、３’−”Ｈ４）シス
ティンおよび１５０Ｉモル／１の〔メチル−！Ｈ３〕メ
チオニンを使用する標準の条件下に、合計ホモシスティ
ンについて１μモル／１、合計システィンについて５μ
モル／１およびメチオニンについてμモル／１であった
が、感度は各場合において添加する内部標準の量を減少
することによって改良できた。標準条件下実施したアッ
セイは、３種類のアッセイの各々についてのアッセイが
合計ホモシスティンについて１〜１０００μモル／１、
合計システィンについて５〜５０００μモル／１、そし
てメチオニンについて２〜２０００μモル／１の範囲に
わたって直線であることを示した。

１００Ｉの正常ヒト血清を使用して得たクロマトグラム
は第２Ｂ図に示されている。内因性合計システィンは最
大の量で存在し、次いで内因性メチオニンおよび次いで
内因性合計ホモシスティンが存在する０合計システィン
のほぼ７０％はほぼ７．７分におけるシスティンモノマ
ーのピーク中に存在し、残りの３０％は後の時間期間に
溶離されるシスティン−２−メルカプトエタノール（２
０％）、システィン（９％）およびホモシスティン−シ
スティン（１％）のピークとして存在した（データは示
されていない）（上を参照）。合計ホモシスティンのほ
ぼ６０％はホモシスティンモノマーのピーク中に存在し
、このピークはほぼ８．９分で溶離され、残りは後に溶
離されるホモシスティン−２−メルカプトエタノール（
２５％）、ホモシステインーシステインニ量体（１４％
）およびホモシスティン（１％）のピークとして存在し
た（データは示されていない）（上を参照）。

システィンおよびホモシスティンの種々の形態の百分率
は、試料毎にかなり変化したが、２−メルカプトエタノ
ールの沸騰期間が１分から６０に変化したとき、あるい
は２−メルカプトエタノールの量が５μ！から１００ｐ
！に変化したとき、所定の試料について変化しなかった
。内因性システィン対（３、３−”　Ｈｚ　）システィ
ンの比は、システィンを含有する種々のピークのすべて
において本質的に同一であった。内因性ホモシスティン
対（３、３、４’　、　４　’　−”　Ｈａ　）ホモシ
スティンの比は、ホモシスティンを含有する種々のピー
クのすべてにおいて本質的に同一であった。これらの観
察が示すように、システィンおよびホモシスティンの内
因性および内部の標準形態は、１００Ｉの２−メルカプ
トエタノールを使用する初期の１５分の還元によって、
完全に還元剤され、そして蛋白質へ結合した形態を包含
する、それらの種々のジサルファイドの形態から解放さ
れ、そして少量であるが、有意な量の種々のジサルファ
イドは精製および誘導体化の引続く段階において再形成
する。この引続く部分的ジサルファイドの再形成は、内
因性合計システィンおよび内因性合計ホモシスティンの
定量を妨害しない。なぜなら、システィンおよびホモシ
スティンのために利用する内部標準、すなわち、（３，
３，３’、３’−”　Ｈ４）　シスチアおよび（３，３
，３’　、３’　。

４．４．４’　、４’−”　Ｈｅ）＃モシスチ７は、ま
た、完全に還元され、次いで、内因性合計システィンお
よび内因性合計ホモシスティンと同程度に、部分的ジサ
ルファイドの再形成に参加するからである。システィン
モノマー、システィン−２−メルカプトエタノール、シ
スチン、またはホモシステインーシステインニ量体のピ
ークのいずれにおいても、重水素化システィン対内因性
システィンの比を使用して内因性合計システィンを定量
することは可能である。なぜなら、この比の値はいかな
る所定の試料についてのすべて４つのピークにおいも同
一であるからである。また、ホモシスティンモノマー、
ホモシスティン−２−メルカプトエタノール、ホモシス
チン、またはホモシステインーシステインニ量体のピー
クのいずれにおいても、重水素化ホモシスティン対内因
性ホモシスティンの比を使用して内因性合計ホモシステ
ィンを定量することは可能である。なぜなら、この比の
値はいかなる所定の試料についてのすべて４つのピーク
においも同一であるからである。われわれの標準手順に
おいてシスティンモノマーおよびホモシスティンモノマ
ーのピークにおいて得られた比を測定しかつそれを使用
することを選択した。なぜなら、それらは通常最大のピ
ークであり、そしてそれらは他のピークより破約溶離さ
れるかである。

初期の研究において、最初の還元工程後に、システィン
モノマーおよびホモシスティンモノマーにヨードアセト
アミドを結合し、次いで標準の方法で精製および誘導体
化の手順を進行させることが可能であることが示された
（データは示されていない）。この修正法は、ジサルフ
ァイドの再形成を防止するが、詳細に評価しなかった。

２−メルカプトエタノールによる還元をヒト血清を使用
する標準手順から省略するとき、シスチン、ホモシスチ
ン、およびホモシステインーシステインニ量体のピーク
が観測され、これらのピークは、それぞれ、システィン
、ホモシスティンおよび両者のホモシスティンおよびシ
スティンの内因性形態を含有する。システィン−２−メ
ルカプトエタノールおよびホモシスティン−２−メルカ
プトエタノールは、これらの条件下で検出不可能である
（データは表わされていない）。

１００１１！の正常ラット血清および１００ｕｌの正常
ヒト尿を使用して得られたクロマトグラムは、それぞれ
、第２Ｃ図および第２Ｄ図に示されており、そして正常
ヒト血清をもちいて得られたクロマトグラム（第２Ｂ図
）に類似する。

反復して凍結および融解し、そして１月の期間にわたっ
て１６の異なる場合についてアッセイした、プールした
正常ヒト血清の単一の試料を使用して実施した研究は、
合計ホモシスティン、合計システィンおよびメチオニン
のアッセイについて、それぞれ、１９．７％、１７．４
％および５．６％の変動係数についての値を与えた。こ
れらの３種類のアミノ酸についての値の有意の変動また
は傾向は１月の期間にわたって観測されず、また同一の
血清を他の場合において１２か月の期間にわたってアッ
セイしたとき、変化は観測されなかった。

抜出しかつ直ちに４℃において遠心した血液試料を使用
して得られた血清の合計ホモシスティンについての値は
、遠心前室塩において１時間インキュベーションした同
一血液試料の一部を使用して得られた値と同一（１０％
の差）であったが、遠心前にインキュベーションを４時
間および２４時間に延長したとき、それぞれ、はぼ３５
％および７５％だけ増加した。血清の合計システィンに
ついての値は、２４時間のインキュベーション期間にわ
たって不変化であった。血清メチオニンについての値は
、１時間不変化であり、そして４時間および２４時間に
おいて、それぞれ、１０％および２５％だけ増加した。

ＥＤＴＡまたはヘパリン中に集めた血漿は、メチオニン
を除外して、すべての時間期間においてすべての３種類
のアミノ酸について血清の値と同一である値を与えたが
、メチオニンの場合において、両者のタイプの血漿につ
いての値は４時間および２４時間のインキュベーション
期間にわたってすべて増加しなかった。ラット二量体を
使用して実施したインキュベーションの研究は、ヒト血
清を使用して得られた結果に類似する結果を与えた。合
計ホモシスティン、尿の合計システィンおよび合計メチ
オニンについての値は、尿の試料を０時間〜２４時間の
間室温においてインキュベーションしたとき、変化しな
かった。

５０人の正常ヒト被検者および５０匹の正常ラットから
の合計ホモシスティン、合計システィンおよびメチオニ
ンについて得られ、より高い値に向かうひずみについて
補正するために対数変換後に平均±２３．Ｄ、とじて計
算した、実際の平均（μモル／１）および範囲について
の値は、次の通りであった：ヒト血清合計ホモシスティ
ン、１３．０　（７，２−２１，７）　　；ヒト血清合
計メチオニン、２５．５　（１３，７−４３，５）　　
ｉヒト血清合計システィン、２６１　（１７４−３７８
）　；ラント血清合計ホモシスティン、５．６　　（３
，２−９，６）　　：ラット血清合計メチオニン、５６
　（３９−８３）　　、ラット血清合計システィン、１
９０　（１３１−２８３）。同一の５０人の正常ヒト被
検者から得、上に定義したように計算した、実際の平均
（μモル／１またはμモル／１０ミリモルのクレアチニ
ン）および範囲についての値は、次の通りであった：ヒ
ト尿合計ホモシスティン、７．２（１，４−２４，７）
　　；ヒト尿合計ホモシスティン／１０ミリモルのクレ
アチニン、１１．２　（２，０−３６，７）　；ヒト尿
合計メチオニン、５．９　（０，４−３５，１）　　？
ヒト尿合計メチオニン／１０ミリモルのクレアチニン、
６．３　　（１，５−１９，１）　　ｉヒト尿合計シス
ティン、２６０（６８−６５５）　ｉヒト尿合計システ
ィン、／１０ミリモルのクレアチニン、３４４　（１５
Ｂ　−６５５）、尿中の合計システィンおよびメチオニ
ンの正常な範囲は、μモル／ｌとして表わすときより、
μモル／１０ミリモルのクレアチニンとして表わすとき
高い。

合計ホモシスティンおよび合計システィンについての値
は、ラット血清におけるよりヒト血清において有意に（
Ｐ＜＜０．０５）高かった。メチオニンについての値は
、ヒト血清におけるよりラット血清において有意に（Ｐ
＜０．０５）高かった。

ヒト血清の合計ホモシスティン、合計システィン右よび
メチオニンは、尿の値をμモル／ｌまたはμモル／１０
ミリモルのクレアチンとして表すか否かに無関係に、そ
れぞれ、尿の合計ホモシスティン、合計システィンおよ
びメチオニンと相関関係がなかった。血清合計ホモシス
テンおよび血清メチオニンについての値は、女性よりも
男性において、それぞれ、２０％および２２％だけ高か
った（Ｐ＜０．０５）。血清合計システィン、尿合計ホ
モシスティン、尿合計システィンおよび尿メチオニンに
ついての値は男性および女性について有意の異なかった
。血清合計ホモシスティンについての値は、年令、ヘモ
グロビン、平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コ
バラミン、血清葉酸塩、血清メチオニン、血清合計シス
ティンまたは血清メチルマロン酸と有意な相関関係をも
たなかった。最高の補正係数は、血清合計ホモシスティ
ンとヘモグロビンとの間で０．３７　（Ｐ−０，０６）
そして血清合計ホモシスティンと血清葉酸塩との間で−
０，３４（Ｐ−０，０６）であった。血清ホモシスティ
ンと血清コバラミンとの間の相関関係係数は０．１４（
Ｐ−０，４４）であった。血清メチオニンについての値
は、相関関係係数が０．４４　（Ｐ　＜０．０５）であ
るヘモグロビンを除外して、前述のパラメーターのいず
れとも有意に相関関係をもたなかった。血清メチオニン
と血清葉酸塩との間、および血清メチオニンと血清コバ
ラミンとの間の相関関係係数は、それぞれ、−０，０９
（Ｐ　＝０．６４）および０．２０（Ｐ＝０．２９）で
あった、血清合計システィンは、年令および血清メチル
マロン酸を除外して、前述パラメーターと有意な相関関
係をもたなかった。血清合計システィンと年令との間、
および血清合計システィンと血清メチルマロン酸との間
の相関関係係数は、それぞれ、０．３８　（Ｐ　＜０．
０１）および０．３０（Ｐ＜０．０５）であった、μモ
ル／１またはμモル／１０ミリモルのクレアチニンとし
て好ましした尿合計ホモシスティン、尿合計システィン
および尿メチオニンについての値は、年令、ヘモグロビ
ン、平均血球体積、白血球数、血小板数、血清コバラミ
ン、血清葉酸塩、血清メチルマロン酸、血清合計ホモシ
スティン、血清メチオニンまたは血清合計システィンと
有意な相関関係をもたなかった。

クレアチニンの浄化に関する合計ホモシスティン、合計
システィンおよびメチオニンのヒト血清からの平均の尿
浄化は、それぞれ、０．３％、０．６％および０．１％
であると計算された。これらの観測が立証するように、
血清中に存在する合計ホモシスティン、合計システィン
およびメチオニンのほんの小さい分画のみが尿中に分泌
され、そしてこれらのアミノ酸の濃度のレベルおよび相
対的変化は、こうして、種々の病理学的状態における血
清と尿との間で異なりうる。

こうして、正常のヒトおよびラットからの血清および正
常のヒトからの尿の中の合計ホモシスティンおよび合計
システィンを検出しかつ定量することを可能とする技術
を開発しかつ立証した。適当なスルフヒドリル化合物、
例えば、２−メルカプトエタノールを使用する還元は、
血清中の合計ホモシスティンおよび合計システィンを測
定するために必須である。なぜなら、これらのアミノ酸
の５０％〜７０％はジサルファイド結合を介して血清蛋
白質へ共有結合するからである。われわれの研究および
他の研究が示すように、この結合したホモシスティンお
よびシスティンの遊離は、急速に起こるが、われわれの
研究が、また、示すように、還元後の新しいジサルファ
イドの形成は有意な程度に起こる。質量分析計に基づく
検出および定量は、ホモシスティンおよびシスティンそ
れら自体の安定なアイソ−ドブの形態を内部標準として
使用できるので、この場合においてきわめて有益である
。これらの内部標準は内因性合計ホモシスティンおよび
内因性合計システィンと還元工程の間平衡化し、そして
新しいジサルファイドの部分的形成の間平衡状態にとど
まる。また、初期の還元工程を省略することができ、こ
れによって、適当な内部標準をするかぎり、遊離のホモ
システィン、遊離のシスティン、および遊離のホモシス
テインーシステインニ量体を検出しかつ測定することが
顔使用である。本発明の方法を利用して、蛋白質結合し
たホモシスティンおよびシスティンを別々に測定するこ
とが可能であろうが、これを研究しなかった。また、追
加の内部標準を利用して他のアミノ酸を同時に測定する
ことが可能である。われわれは、メチオニンの場合にお
いて、これを実施し、そしてこの方法を他のアミノ酸に
容易に適用できることを発見した。

ヒトおよびラットの血清およびヒトの尿の中の合計ホモ
システィンの正常な範囲を、われわれは規定した。ヒト
の血清および尿についての値は、次の文献に報告されて
いるものに類以する：Ｒｅｆｓｕｓ＋、Ｈ，，Ｓ、Ｈｅ
１ｌａｎｄおよびＰ、Ｍ、　Ｕｅｌａｎｄ＋　ＣＩ　ｉ
ｎ。

Ｃｈｅｍ、３Ｈ４）：６２４−６２８（１９８５）　、
ヒト血清についてのわれわれの値は上の文献の値よりほ
ぼ３０％だけ高いが、これは、一部分、われわれの手順
において内部標準として安定なアイソトープの形態を使
用したためであり、また、一部分、われわれの手順にお
けるように試料を室温で凝固させるとき、合計ホモシス
ティンの値が多少増加という事実のためで６ろう。

また、ヒト血清およびヒト尿中の合計システィンについ
ての正常範囲を、われわれは規定した。

ヒト血清に関するわれわれの値は、Ｍａｌｌｏｙ、Ｍ、
Ｈ，。

Ｄ、に、Ｒａ５ｓｉｎおよびＧ、Ｈ，Ｇａｕｌｌ、Ａｎ
ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、１３３　：４０７−４１５（
１９８１）に報告されている値と良好に一致し、この文
献はジチオスレイトールで還元し、次いで内因性合計シ
スティンを分光高度測定によって決定している。われわ
れの値がほぼ２０％だけ高いという事実は、前述のよう
にわれわれの手順おいて安定なアイソトープの内部標準
を含有させることを反映しているであろう、ヒト尿の合
計システィンはＭａｒｔｅｎｓｓｏｎ、Ｊ、、Ｍｅｔａ
ｂｌｉｓｍ　３１　：　４Ｂ？−４９２（１９８２）に
報告されているものに類以し、この文献は標準のアミノ
酸分析装置を利用している。

ヒトおよびラットの血清およびヒト尿中のメチオニンに
ついてれわれわが決定した正常範囲は、アミノ酸分析装
置を使用したある数の他の研究者らによって決定された
値と、きわめｔよく一致する。

ラット血清中の合計ホモシスティン、合計システィンお
よびメチオニンについＩのわれわれの値は、他の研究者
らの限定されたデータに類以する。

ヒト血清中の合計ホモシスティンを測定する感受性の特
異的方法の利用可能性は、次のものを含む、ある数の臨
床的用途を有するであろう＝　（ｉ）臨床的に確証され
たコバラミンまたは葉酸塩の欠乏を有する患者における
血清合計ホモシスティンについでの増大した値の出現の
決定、（ｉ　ｉ）血清コバラミンおよび血清葉酸塩の診
断的感度および特異性をアッセイするために、血清コバ
ラミンまたは血清葉酸塩が低い、基線の、または低い正
常レベルにある患者の血清中の合計ホモシスティンのレ
ベルの決定、（ｉ　ｉ　ｉ）種々の神経精神学的異常を
もつ患者をおよび初老の人の群におけるコバラミンおよ
び葉酸塩の欠乏の発生をよりよく規定するために、これ
らの群における血清中の合計ホモシスティンの決定、お
よび（ｉｖ）末梢血管および脳血管の病気の増大した発
生と相関関係をもつペテロ接合状態について、よりすぐ
れた診断試験を開発することを試みた、シスタチオンシ
ンセターゼの欠乏のためのへテロ接合体（ｈｅ＄ｅｒｏ
ｚｙ−ｇｏ　ｔｅ）中の合計ホモシスティンの決定。ヒ
ト血清中の合計ホモシスティンのアッセイは、コバラミ
ンの欠乏および葉酸塩の欠乏の両者の比較的感度の高い
測定手段である。動物、例えば、ラットの血清中の合計
ホモシスティンを測定できるということは、亜酸化窒素
、コバラミン類以体、葉酸塩類以体、例えば、メトトレ
キセート、およびコバラミンの欠乏または葉酸塩の欠乏
食物を使用する研究において、また、有用であり、これ
らの物質のすべてはコバラミンおよびＳ酸塩の代謝およ
び利用の種々な面を妨害する。

実施例ＩＶ メチルマロン　の　−ア・・セイ Ｍａｒｃｅｌｌ、Ｐ、Ｄ、、Ｓ、Ｐ、５ｔａｂｌｅｒ＋
Ｅ、Ｒ，ＰｏｄｅｌｌおよびＲ，Ｉｌ、Ａ１１ｅｎ、　
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５０　：　５８−６
６（１９８５）の方法に従う。

メチルマロン酸、コハク酸およびグルタル酸はシグマ・
ケミカル・カンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ、）　（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、
そしてメチルマロン酸はＪ、Ｔ、ベイカー・ケミカル・
カンパニー（Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）
（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）　）から入手し、そ
してジメチルマロン酸はアルドリッヒ・ケミカル・カン
パニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅａｉｉｃａｌ　Ｃｏ、
）（旧１ｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ））から入手し、〔メチル
−”Ｈｚ）メチルマロン酸（〉９９％、慣用の合成によ
る）および（ｉ　、　４−Ｉ″Ｃ２）コハク酸（〉９９
％）はメルク・シャープ・アンド・ドーム・アイソトー
プス（Ｍｅｒｃｋ　　５ｈａｒｐＡｎｄ　　Ｄｏｈｍｅ
　　Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ＋Ｃａｎｄａ
）から入手した。〔メチル−”　ＣＥ　％　ｆｙｖ＝マ
ロン酸（慣用の合成による）および（１，４−１４０、
）コハク酸は二ニー・イングランド・コーポレーション
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｃｏ、（ｈｏｓｔｏｎ、Ｍ
Ａ）〕から購入した。Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジ
メチルシリル）トリフルオロアセトアミドは、ピアース
・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋＋＋
１ｃａｌＣｏ、）　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）から
購入した。すべての溶媒は、バーディツク・アンド・ジ
ャクソン・ラボラトリーズ・インコンポレーテッド（Ｂ
ｕｒｄｔｃｋ　＆Ｊａｃｋｓｏｎ　　しａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、（Ｍｃ＋ｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ））　
　からの高性能液体クロマトグラフィーの等級のもので
あった。血液の試料は、通常健康な血液共存者からベレ
・ボッフィルス・ブラッド・バンク（ＢｅｌｌｅＢｏｎ
ｆｉｌｓ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂｎｋ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）
において血液共存時間に得た。連続的血液の共存者は、
次の年令群の各々において５人の男性および５人の女性
から試料が得られるように選択した：１８〜２６．２７
〜３５．３６〜４５．４６〜５５および５６〜６５（合
計５０の試料）。

試料は９ａ、ｍ、およびｌｐ、ｍ、において得、室温に
おいて１〜４時間凝固させ、１５００ｘｇで３０分間遠
心し、そして血清を取り出し、そして−２０℃において
貯蔵した。さらに、他の試料を遠心前に０〜２４時間凝
結させた。スポット尿の試料を、血液試料を得るたとき
３０分以内に同一の５０人の個体から集め、そして−２
０℃において同様に貯蔵した。スプレイグーダウリイ（
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｓａｗｌｅｙ）　ラット、２５０−３
５０ｇ、を５ＡＳＣＯ，インコーホレーテッド（Ｏｍａ
ｈａ、　ＮＢ）から入手し、そして血液をエーテル麻酔
の下に心臓内穿刺によって得た。ヒト血液共存者の試料
について前述したように、血清を集めそして貯蔵した。

２００ｎｇの〔メチル−”Ｈ３）メチルマロン酸および
２０００ｎｇの（１、４−１３Ｃ，）コハク酸を含有す
る５０Ｉ！／のＨ，０を５００１ｔ！の血清または１０
０１１１の尿に添加し、そして尿の試料にさらに４００
μｌのＨ２Ｏを添加した。次いで、ｐＨを５０ｍの２Ｎ
のＮａＯＨの添加により約１２に上昇させ、次いで５ｄ
のジエチルエーテルを添加し、次いで激しく混合し、１
０００ｇで３分間遠心し、上のエーテル層をデカンチー
シランしそして廃棄した０次いで、ｐＨを５０１ｔｌの
６ＮのＨＣｌの添加により約１に調節し、そして試料を
前述のように５１＃１のジエチルエーテルで２回抽出し
た。エーテル抽出液をプールし、４０℃の水浴中で窒素
の流れの供給によって乾固し、次いで５００　ｄのＨｚ
Ｏ中に溶解した。試料全体をウォーターズ・アソシエー
ツ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｔａｔｅｓ（Ｍｉｌｆｏ
ｒｄ、ＭＡ））高性能液体クロマトグラフィー陰イオン
交換樹脂システム上注入した。このシステムは７２０シ
ステムコントローラー、７３０チータモジユール、２つ
の６０００　Ａポンプ、Ｕ６にインゼクター、およびＺ
−モジュールから也、ラジアル・バク（Ｒａｄｉａｌ　
Ｐａｋ）　Ｓ　Ａ　Ｘカートリッジ（１０１ｍ、　８ｍ
Ｘ１０ａｍ）　オよびワットマン、インコーホレーテッ
ド（Ｗｈａ　ｔｓ＋ａｎ、　Ｉｎｃ、　（Ｃ１ｉｆ　ｔ
ｏｎ、　ＮＪ）　）から入手した薄膜陰イオン交換体を
詰めた予備カラム（４Ｘ２３龍）を装備していた。移動
相は０．０５モルのＫＨ，ＰＯ。

Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ２，０から成り、そして２１１＃１の
分画を２−７分の速度で集めた。分画２〜５は９５％よ
り多いメチルマロン酸およびコハク酸を含有し、これら
は〔メチル扛−４−”　Ｃ）メチルマロン酸および（１
、４−”Ｃ”　）コハク酸を使用して実施した分離実験
に基づいて注入し、これらのコハク酸を使用してクロマ
トグラフィーのシステムを毎日の基準で検査した。これ
らの分画をプールし、５０ｍの６Ｎ　　ＨＣｊ！を添加
してｐＨをほぼ１に調節し、そして前述のように試料を
５１Ｒ１のジエチルエーテルで２回抽出した。これらの
エーテル抽出液をプールし、４０℃の水浴中で窒素の流
れの適用によって乾固し、そして３００，１１７のレア
クチ（Ｒｅａｃｔｉ）バイアル〔ピアース・ケミカル・
カンパニー　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ＋　ＩＬ）　）に１５０４のメ
タノールすすぎ液と一緒に移した。次いで、試料をスピ
ード・バク（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）真空濃縮器〔サバン
ト・インストルメンツ・インコーホレーテッド（Ｓａｖ
ａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｇ＊ｅｎｔｓ＋Ｉｎｃ、（旧ｃｋ
ｓｖｉｌｌｅ。

ＮＹ）　）内で乾固した。

１００ｕｌのアセトニトリルおよび１０Ｉ１１のＮ−メ
チル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロ
アセトアミドを各バイアルに添加し、それらのテフロン
でライニングした隔膜キャップで密閉し、そしてそれら
を室温（２２℃）で１夜放置するか、あるいはそれらを
８０℃に１時間加熱することによって、ジカルボン酸の
ｔ−ブチルジメチルシリルエステル調整した。１００Ｊ
１１のＨ，Ｏを添加して、反応の誘導体化剤を加水分解
し、次いで２５０　ｄのヘキサンを添加し、激しく混合
し、そして１１０００Ｘで５分間遠心した。上のヘキサ
ン層をデカンテーションし、別のレアチ・バイアルに移
し、窒素の流れの適用によってほぼ５Ｉに乾燥した。完
全な乾固を回避するように注意した。なぜなら、これは
誘導体の主要な部分を失わせるからである。はぼ２Ｉを
毛管カラム上に落下する針の注入装置（ｆａｌｌｆｎｇ
−ｎｅｅｄｌｅ　１ｎｊｅｃｔｏｒ）でヘラレット−パ
ラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）（Ｐａｌ
ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）５９９２　Ｂガスクロマトグラフ
−質量分析計に注入し、そしてこの装置は９８２５　Ｂ
計算器、９８７６プリンターおよび分子噴射分離器を装
備していた。注入口を変更して、落下する針の注入器を
受入れるようにし、そして補助の補充キャリヤーガスの
ラインを噴射分離器に供給した。試料の分割は、デュラ
ボンド（口ｕｒａｂｏｎｄ）　Ｄ　Ｂ　−１溶融シリ力
毛管カラム（３０ｍ　Ｘ　０．２５ｗｍ内径、０．２５
．ｎのフィルム熱さ）（Ｊ　＆−サイエンティフィック
・インコーホレーテッド（Ｒａｎｃｈｏ　Ｃｏｒｄｏｖ
ａ、ＣＡ）から入手した〕で達成した。ガスクロマトグ
ラフ−質量分析計は、２５０℃の注入口の温度および２
２ｐｓｉのカラムヘッドの圧力で、標準の自動同調条件
下に操作した。

毛管カラムを１６０℃に平衡化し、そして試料注入後６
．５分に８℃／分で１８８℃に増加した。データを選択
したイオン監視のモードで５．８〜１２．５分に集めた
０次の（Ｍ−５７）　”イオンを５０ミリ病の滞留時間
で各々について監視した：マロン酸、ｍ／　ｚ　２７５
．２　；メチルマロン酸、ｍ／　ｚ　２８９．２　；〔
メチル−！Ｈ１〕メチルマロン酸、ｍ／ｚ２９２．２；
コハク酸、ｍ／ｚ２８９．２；　　（１、４−”Ｃ，）
　コハク酸、ｍ　／　ｚ　２９１．２　ニジメチルマロ
ン酸、ｍ／　ｚ　３０３．２　；エチルマロン酸、ｍン
２３０３．２　；メチルコハク酸、ｍ／ｚ３０３．２ｉ
およびグルタル酸ｍ／ｚ　３０３．２゜メチルマロン酸
は、はぼ６．８分において溶離されるｍ／ｚ　２８９．
２ピークの積分した面積（精確な時間は標準を使用して
毎日決定した）を同一時間に溶離したｍ／ｚ　２９２．
２ピークの積分で割り、次いで各試料に添加した〔メチ
ル−２Ｈ１〕メチルマロン酸の等しい量である２００ｎ
ｇを掛けることによって定量した。コハク酸は、同一の
方法で、はぼ９．３分に溶離したｍ／“２２８９．２お
よびｍ／ｚ　　２９１．２のピークを利用し、そして試
料に添加した［１　、４−”Ｃ３）コハク酸の量である
、２００ｎｇをそれらの比に掛けることによって定量す
る。２つの内部標準についての積分した面積、すなわち
約６．８および９．３分に溶離するｍ／ｚ　２９２．２
およびｍ／ｚ　２１．２のピークは、天然に産出するア
イソトープの存在量の結果として、それらに寄与される
量について、メチルマロン酸およびコハク酸によって補
正する。毎日の基準に基づいて富んでないメチルマロン
酸を使用して決定した、これらの相関関係は次の通りで
あった：ｉ）６．８分におけるｍ　／　ｚ　２８９．２
ピークの面積のほぼ１．９％は６．８分におけるｍ／２
２９２．２ピークとして存在し、そして１ｉ）９．３分
におけるｍ／ｚ　２８９．２ピークの面積のほぼ１０．
８％は９６３分におけるｍ／　ｚ　２９２．２ピークと
して存在した。

アッセイの感度は、例えば、ホモシスティンモノマ一対
（３，３，４’　、４’−”　Ｈ４）ホモシスティンモ
ノマーの比を決定することによって測定し、ここで標準
曲線は次の文献に記載されている直線性から変動する：
　Ｚｉｎｎ、Ａ、Ｂ、、Ｄ、Ｇ、Ｈｉｎｅ、Ｍ、Ｊ。

Ｍａｈｏｎｅｙおよびに、Ｔａｎａｋａ、　Ｐｅｄｉａ
ｔｒ、　Ｒｅｓ、　１６：７４０−７４５　（１９８２
）。

アッセイの感度は、例えば、メチルマロン酸対〔メチル
−２Ｈ１〕メチルマロン酸の比を決定することによって
測定し、ここで標準曲線は次の文献に記載されている直
線性から変動する：　Ｚｔｎｎ、＾。

Ｂ、、Ｄ、Ｇ、Ｈｉｎｅ＋Ｍ、Ｊ、Ｍａｈｏｎｅｙおよ
びに、Ｔａｎａｋａ、Ｐｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、１６：７４０−７４５（１９８２）。

合計ホモシスティン、メチオニンおよび合計システィン
の尿から清浄化は、合計ホモシスティンについて例示し
たように次の等式で決定した：メチルマロン酸／クレア
チニンの清浄化比＝　１００Ｘ　（尿のメチルマロン酸
（ｎｇ／１１１１）／尿のタレアチニン（ｎｇ／ｄ）／
〔血清メチルマロン酸（ｎｇ／ｄ）／血清タレアチニン
（ｎｇ／ｄ）） この手順において利用する部分的試料の精製の長大な性
質は必要であった。なぜなら、アミノ酸および他の有機
化合物の複雑な混合物が血清および尿の中に存在し、そ
して存在するメチルマロン酸の濃度が比較的低かったか
らである。種々の有機溶媒を使用する抽出、次いで小型
の陰イオン−交換または逆相カラムを使用するそれ以上
の精製を用いる手順は、不満足であった。陰イオン−交
換樹脂を使用する高性能液体クロマトグラフィーは、非
常の有益であることが証明された。なぜなら、研究する
ジカルボン酸のｐＫａ値はｐ）１２において遅延するが
、はとんどの他の化合物は遅延しなかったからである。

尿試料の分析は、血清について必要とするのと同程度の
部分的精製を必要対してした。〔メチル−１４０〕メチ
ルマロン酸および（１，４−１４Ｃ）コハク酸の既知量
を血清および尿の試料に添加する実験は、両者のジカル
ボン酸の１０〜２０％が最終のヘキサン溶液中に長大な
部分的精製および誘導体化の手順後の終りにおいて回収
されることを示した。

ｔ−ブチルジメチルクロロシラン／Ｎ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド／イミダゾールの混合物を使用するジカルボ
ン酸のｔ−ブチルジメチルシリル誘導体を生成する初期
の試み（Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、＋５ｔａｔｅ　ＣｏＣｏ１１ｅ
、Ｐ＾）　　（ｄｅ　Ｊｏｎｇ＋Ａ、Ｐ、Ｊ、Ｍ、、Ｊ
、ＥｌｅｍａおよびＢ、Ｊ、Ｔ、ｖａｎ　ｄｅ　Ｂｅｒ
ｇ、Ｂｉｏｍｅｄ。

Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、７：３５９−３６４（１
９８０）に記載されている〕は、誘導体化が著しく変動
しそして誘導体が比較的不安定であるために、′不満足
であった。あるｔ−ブチルジメチルシル誘導体、例えば
、ある種の有機酸のエステルを加水分解するときの予期
されない容易さに関する問題が、過去において生じた。

　Ｊｏｎｇらが記載する反応混合物のｐ旧よほぼ１であ
ること、およびクロロシランを含む反応によって生成す
るＨＣＩをイミダゾールが完全に掃去することできない
ために、これは新しく生成したジカルボン酸のｔ−ブチ
ルジメチルシル誘導体の加水分解を生ずることを、われ
われは発見した。

この問題は他のスキャベンジャ−１例えば、ピリジンの
添加によって部分的にのみ補正されただけである。しか
しながら、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）トリフルオロアセトアミドを使用して調整したｔ−
ブチルジメチルシル誘導体は、高い収率で、再現性のあ
る方法で得られ、そして前述のようにヘキサン中に抽出
した後１週間以上安定であることを、われわれは発見し
た。

したがって、この手順はわれわれの標準法として応用し
た。

メチルマロン酸のｔ−ブチルジメチルシル誘導体の構造
およびｍ／ｚ値を、断片化位置およびＣＭ−５７３”お
よび〔Ｍ−１５〕９に存在する問題の主要な断片の１ｎ
　／　ｚ値と一緒に下に示す：（ｗ＋ヲ旦二二μｍ　　
　　　　　　　　、　　　・−」醪二二３４６　　　　
　　　　　　　　　　。

マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメチルマロン
酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸およびグルタル酸
の分子量は、それらのｔ−ブチルジメチルシル誘導体の
質量スペクトルと一緒に第３図に示されている。特定の
誘導体の分子量は、２つのｔ−ブチルジメチルシル基の
付加のために、ジカルボン酸の分子量＋２２８に等しい
、誘導体全体を表わすピーク、すなわちＣＭ）は、ジカ
ルボン酸のいずれについても観測されなかった。むしろ
、各場合の主要なピークはＣＭ−５７）　”であり、こ
れは１００〜４００のｍ／ｚ範囲におけるすべてのピー
クの合計の３５〜４５％を表わした。ＣＭ−１５）“を
表わす、より小さいピークも各ジカルボン酸誘導体につ
いて観測されたが、量は（Ｍ−５７）　”ピークについ
て存在する量のわずかに３〜６％であった。ｍ／ｚ１４
７の値をもつピークはジカルボン酸誘導体のすべてにつ
いて観測され、そしてｍ／ｚ１８９をもつピークはゲル
タン酸誘導体を除外するすべてについて観測された。こ
れらのピークの両者は、ｔ−ブチルジメチルシル基それ
ら自体の一部の断片化および転位から生ずると思われ、
そして、豊富なｍ／ｚ１４７およびｍ／２１８９ビーク
が、また、〔メチル−２Ｈ１〕メチルマロン酸および（
１、４−”ｃｚ　）コハク酸について観測されので、ジ
カルボン酸それら自体の部分を含まない。

第４図は、（Ａ）１１１ｇの各酸を含有する混合物；（
Ｂ）　５００１１１のプールした正常ヒト血清；　（Ｃ
）５００ｄの正常ラット血清；および（Ｄ）　１００　
ｍの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチ
ルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す、研
究したアミノ酸は、次の通りであった：マロン酸（ＭＡ
）　、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、コハク酸（ＳＡ）、
（ｔ、４−”ｃｔ）コハク酸（Ｓ　Ａ　＊）、〔メチル
−２Ｈ１〕メチルマロン酸（ＭＭＡ本）、ジメチルマロ
ン酸（ＤＭＭＡ）　、エチルマロン酸（ＨＭＡ）　、メ
チルコハク酸（ＭＳＡ）およびグルタル酸（ＧＡ）、か
っこ内の数字は、選択したイオンの監視によって走査し
たｍ　／　ｚについての値である。ｒＦ、Ｓ、Ｊについ
ての値は太いダッシュのトレースの全規模についての相
対値である；細いダッシュのトレースは１０×の減衰で
ある。ＭＭＡについて決定した値は、Ｂ、ＣおよびＤに
ついて、それぞれ、５６．９２および３４００ｎｇ／ｌ
ｙｄであった。ＳＡについて決定した値は、Ｂ、Ｃおよ
びＤについて、それぞれ、１１１０．９２０００および
１９．０００ｎｇ／−であった。

第４Ａ図が立証するように、毛管カラムは同一の分子量
を有する誘導体のすべてについて完全な分離を与える。

すなわち１．メチルマロン酸およびコハク酸は互いに完
全に分離され、そしてジメチルマロン酸、エチルマロン
酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は互いに完全に分
離され為。メチルマロン酸はジメチルマロン酸から完全
に分離されず、コハク酸はメチルコハク酸から完全に分
離されないが、これは問題ではない。なぜなら、第３図
に示すように、これらの分割されないジカルボン酸誘導
体は異なる分子量および質量スペクトルを有し、こうし
て選択したイオンを監視するとき妨害が存在しないから
である。

〔メチル−”Ｈ３）メチルマロン酸および〔１゜４　　
”Ｃ３）コハク酸を添加しない、ヒトの血清お°よび尿
、およびラットの血清の試料を使用する研究は、定量の
ために内部基準としてのそれらの使用を妨害する物質が
存在しないことを立証した。

アッセイの感度は２００ｎｇの〔メチル−”Ｈｓ　）メ
チルマロン酸および２０００ｎｇの（１、４−Ｉ″ＣＺ
　）コハク酸を使用する標準の条件下に、メチルマロン
酸について５　ｎｇ／−およびコハク酸ついて１５０ｎ
ｇ／ＩＲ１であったが、感度は各場合において添加する
内部標準の量を減少することによって改良できた。

標準条件下で実施したアッセイは、水性試料中において
および既知量のそれぞれの酸を添加した血清中において
、メチルマロン酸についてのアッセイが５〜５０００ｎ
ｇにおいて直線であること、およびコハク酸のアッセイ
が１５０〜１５０，０００において直線であることを示
した。

５００μ！の正常ヒト血清を使用して得たクロマトグラ
ムは第４Ｂ図に示されたいる。コハク酸は最大の量で存
在し、そしてマロン酸、メチルマロン酸、エチルマロン
酸、メチルコハク酸およびグルタル酸は、より少量で存
在するが、容易に検出される量である。ジメチルマロン
酸は確実に検出できなかった。５００μｌの正常ラット
血清および１００μｌの正常ヒト尿を使用して得られた
クロマトグラムは、それぞれ、第４Ｃ図および第４Ｄ図
に示されており、そしてプールした正常ヒト血清を用い
て得られたクロマトグラムに類似する（第４Ｂ図）。

反復して凍結および融解し、そして１０か月の期間にわ
たって１７の異なる場合についてアッセイした、プール
した正常ヒト血清の単一の試料を使用して実施した研究
は、メチルマロン酸およびコハク酸のアッセイについて
、それぞれ、２６％および１９％の変動係数についての
値を与えた。

これらの２種類のジカルボン酸についての値の有意の変
動または傾向は１０か月の期間にわたって観測されなか
った。抜出しかつ直ちに４℃において遠心した血清試料
を使用して得られた血清のメチルマロン酸ンについての
値は、遠心部室温において１時間または２４時間インキ
ュベーションした同一血液試料の一部を使用して得られ
た値と同一であった。しかしながら、コハク酸の値はこ
の期間にわたって増加し、室温において１時間インキュ
ベーション後はぼ１０％増加し、そして２４時間インキ
ュベーション後はぼ９０％増加した。

う・、トの血清を使用して実施した研究は同様な結果を
与えた。尿のメチルマロン酸およびコハク酸についての
値は、尿の試料を室温においてＯ〜２４時間インキエベ
ーションした時不変化であった。

５０人の正常ヒト被検者および９５匹の正常ラットから
のメチルマロン酸プおよびコハク酸について得られ、よ
り高い値に向かうひずみについて補正するために対数変
換後に平均±２３．Ｄ。

とじて計算した、実際の平均（μモル／１）および範囲
についての値は、次の通りであったロビト血清メチルマ
ロン酸、４１　（１９−７６）　　ｉヒト血清コハク酸
、１２７０（５８９−２４２０）　　；ラット血清メチ
ルマロン酸、１２８（４２−２９５）　；およびラット
血清コハク酸、１１９００（５４２０−２２８００）。

同一の５０人の正常ヒト被検者から得、上に定義したよ
うに計算した、実際の平均（ｎｇ／−またはｎｇ／■の
クレアチニン）および範囲につレモ値は、次の通りであ
った：ヒト尿メチルマロン酸、１８４０（２７０−７１
９０）　；ヒト尿メチルマロン酸／■尿タレアチニン、
２０１０（８１０−３８３０）　　；ひと尿コハクサン
、２５４００（４６２０−８５６００）；およびヒト尿
コハク酸／■尿クレアチニン、２８２００（８３６０−
７５１００）。尿中のメチルマロン酸およびコハク酸に
ついての正常な範囲は、ｎｇ／ｍｌとして表すときより
、ｎｇ／■のクレアチニンとして表わすとき高い。

メチルマロン酸およびコハク酸についての値は、両者共
、ヒト血清中よりラット血清中において有意に高かった
。ヒト血清メチルマロン酸およびヒト血清メチルマロン
酸／■タレアチニンは、尿メチルマロン酸および尿メチ
ルマロン酸／ｆｆｆクレアチニンと存意に相関関係をも
たない。血清および尿のメチルマロン酸についての値は
、男性および女性について有意Ｉ′：、異ならず、そし
て年令、ヘモグロビン、平均の血球体積、白血球数、血
小板数、血清コバラミン、血清葉酸塩、血清クレアチニ
ン、血清コハク酸または尿コハク酸と有意に相関関係を
もたなかった。最高の相関関係係数は、血清メチルマロ
ン酸と血清コバラミンとの間において−０，２５であっ
た（　Ｐ　＝　０．０８）。血清および尿のコハク酸レ
ベルは、メチルマロン酸について前述のパラメーターの
いずれとも蜂有意に相関関係をもたなかった。

クレアチンの浄化に関するヒト血清からのメチルマロン
酸の平均尿浄化は２８％であり、そしてクレアチンの浄
化に関するヒト血清からのコハク酸の平均尿浄化は１３
％であると、計算された。

この他の観察は、〔メチル−＋　４　ｃ　）メチルマロ
ン酸をラットに心臓内注射により投与した実験において
観察されたように、血清中のメチルマロン酸のほとんど
が未知の通路を経て代謝されるという考えを支持する。

われわれの研究はｄｅ　Ｊｏｎｇらの示唆を支持する。

なぜなら、ある数のジカルボン酸のむ一ブチルジメチル
シル誘導体はきわめて優れたガスクロマトグラフィーお
よび質量分析の性質をもつことをわれわれは示したから
である。最初に、誘導体化の程度の変動および加水分解
の不安定性のための重大な性質の問題にわれわれは直面
したが、これらの問題は、誘導体化試薬として、ｄｅ　
Ｊｏｎｇらが利用したｔ−ブチルジメチルジルクロロシ
ラン／Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド／イミダゾールの混合物の代
わりに、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル
）トリフルオロアセトアミドを使用することによって解
決された。この改良は、また、カルボキシル基またはと
くに加水分解されやすい他の基を含有する生物学的に興
味ある他の化合物のｔ−ブチルジメチルシル誘導体を調
整しかつ定量するために、そして他のアミノ酸の誘導体
化および定量に応用できる。

われわれは、正常のヒトおよびラットからの血清中のメ
チルマロン酸を検出しかつ定量する技術を開発した。わ
れわれは、また、ヒト尿中のメチルマロン酸の正常範囲
を規定し、そしてわれわれの値は、一般に、他のガスク
ロマトグラフィー−質量分析技術を用いてえられた値と
一致する。われわれの方法は、また、血清および尿中の
マロン酸、ジチメチルマロン酸、エチルマロン酸、メチ
ルコハク酸、グルタル酸、および他のジカルボン酸を定
量するために適するが、各ジカルボン酸について適当に
安定なアイソトープ内部標準を利用して最適な定量の精
度を保証すべきである。

ヒト血清中のメチルマロン酸を測定する感度の高い特異
的な方法の利用可能性は、次のものを包含する、ある数
の臨床学的応用を有する：　（ｉ）確証されたコバラミ
ンの欠乏を有する患者における血清メチルマロン酸につ
いての増大した値の発生の決定、（ｉｉ）血清コバラミ
ンのアッセイの診断的感度および特異性を評価するため
に、血清コバラミンの低い、基線のおよび低い正常レベ
ルヲモつ患者の血清のメチルマロン酸のレベルの決定、
および（ｉ　ｉ　ｉ）種々の神経精神学的異常をもつ患
者の血清および老齢の人におけるコバラミンの欠乏の発
生をよりよく定めるために、これらの群におけるメチル
マロン酸のレベルの決定。ヒト血清中のメチルマロン酸
のアッセイはコバラミンの欠乏の比較的感度の高い手段
であり、そして動物、例えば、ラットの血清中のメチル
マロン酸を測定できることは、また、亜酸化窒素、コバ
ラミン類似体またはコバラミンの欠乏食物を使用する研
究において有用であり、これらの物質はコバラミンの代
謝および利用の種々な面を妨害する。

実施例■ １８〜６５才の年令の範囲の５０人の正常血液共存者、
２５人の男性および２５人の女性、からの血清試料を実
施例ＩＩに記載するようにして得た。

患者の試料は、過去１５年にわたって集成された広範囲
の血清収集物から選択した。コバラミン（Ｃｂｌ）欠乏
の診断は、低い血清Ｃｂｌレベル、巨大赤芽球性骨髄の
形態、適当な血液学的または神経学的異常、および非経
口的化合物ゲルを使用する処置に対する応答に基づいた
。悪性の貧血の診断は異常なシリング（Ｓｃｈｉｌｌｉ
ｎｇ）テストに基づいた〔参照、例えば、Ｂｅｃｋ、　
Ｗ、Ｓ、　、　肛肢に旦■（Ｗ、Ｊ　。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｅ、　Ｂｅｕｔｌｅｒ、　Ａ、Ｊ
、Ｅｒ５ｌｅｒおよびＭ、Ａ、Ｌｉｃｈｔｍａｎ遍）（
ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、ＮＥＷ　
Ｙｏｒｋ、１９８３）。

ｐｐ、４４４−４４５）に基づき、このテストは血清中
の外因性固有因子および／または抗固有因子遮断抗体の
存在について補正した。葉酸塩の欠乏の診断は、低い血
清葉酸塩値、正常または増大した血清ｃｂｌ値、巨大赤
芽球性性骨髄の形態、適当な血液学的異常、およびアル
コール中毒症および劣った食物の経歴に基づいた。Ｃｂ
ｌ欠乏の頻繁な処置群における試料を、悪性貧血をもつ
患者から得、前記患者は前述のように前もってＣｂｌ欠
乏と診断されているが、屈従が劣るため６〜９か月の間
隔であるいはＣｂｌ要求の他の研究の一部として非経口
的Ｃｂｌの間欠的処置のみを受けた患者であった。患者
は血清Ｃｂｌレベルについて低い、基線の、あるいは正
常のレベルを有し、血液学的および神経学的異常に欠け
、そして試料を収集するとき、無症候性であった。血清
Ｃｂｌレベルは、レクトバシルス・レイキマンニ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＩｅｉｃｈｉｍａｎｎｉｉ）法
〔参照、例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｄ、Ｍ、　。

Ｃｌ１ｎ、５ｃｉｅｎｃｅ２２：１０１（１６９２））
あるいは固有因子のためにｃｂｔ結合活性の９５％より
多（をもつ、精製した固有因子または胃液を利用するあ
る数の放射線希釈アッセイ　（Ｋｏｌｈｏｕｓｅ、　Ｊ
、Ｆ　、　、　Ｈ，Ｋｏｎｄｏ、　Ｈ，Ｃ。

八１ｌｅｎ、Ｅ、ＰｏｄｅｌｌおよびＲ，Ｈ，Ａ１１ｅ
ｎ、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ。

２９９ニア８５−７９２（１９７８）　）を使用してア
ッセイした。

八−、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、４６：３９０（１９６
６）　）また番よミルり結合放射線希釈アッセイＣＲｏ
ｈｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ。

Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、２８６：　１３３５（１９７２）
　）を使用してアッセイした。患者の試料のすべては、
患者が属するカテゴリーおよび各カテゴリーにおける患
者の数がメチルマロン酸およびコハク酸のアッセイの実
施に酸化する人員が知らないように、ある数字でコード
化した。

ある数の因子を、血清のメチルマロン酸およびコハク酸
との可能な関係について個々に検査した。

明確な因子、例えば、性、人種および診断について、ウ
ィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）　２試料テスト（Ｓ
ｔｅｅｌ、Ｒ，Ｇ、Ｄ、およびＪ、Ｈ，Ｔｏｒｒｉｅ　
Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　
ｏｆ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ
　ＢｏｏｋＣｏ、　、　Ｕｎｃ、　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ＋　１９８３）　）を使用して関係の有意性を決定し
た。神経学的過酷さとの可能な関係を評価するために、
群０、■および２（表１において定義する）を組み合わ
せ、そして組み合わせた群３および４と比較した。連続
的である因子、例えば、年令または平均の血球体積（Ｍ
ＣＶ）は、スピアマン（Ｓｐｅａｓａｎ）相関関係係数
（Ｓｅｅｌ　、　５ｕｐｒａ　）を使用して検査した。

結果を表■に記載する。

種々のカテゴリーにおいて正常の被検者および患者につ
いて血清メチルマロン酸およびコハク酸について得られ
た値は第５図に示されており、ここで血清メチルマロン
酸のレベル（下）および血清コハク酸（上）は臨床的に
確証されたＣｂｌ欠乏、葉酸塩の欠乏をもつ患者、そし
て血液学的または神経学的異常をもたない、ｃｂｔ欠乏
の処置を頻繁にした患者について記載されている。正常
範囲はメチルマロン酸について１９〜７６ｎｇ／ｍｊで
あり、そしてコハク酸について５８０〜２４２０ｎｇ／
ｍ１である。範囲は、より高い値へのひずみについて補
正するため対数変換後、±２３．Ｄ、とじて計算した。

Ｃｂｌ欠乏欠乏台いて、７３人の患者のうち６９人は、
１９〜７６ｎｇ／ｍ１の正常範囲より上であるメチルマ
ロン酸についての値を有した。最高の値は２２，３００
ｎｇ／−であり、そしてメジアン値は１、１１００ｎ　
／　ｃｄであった。　　１６　人０）葉６１塩（Ｄ欠乏
（Ｄ患者のうち５人は、おだやかな血清メチルマロン酸
の増加を有し、最高の値は１４０ｎｇ／ａＪであった。

血液学的および神経学的異常をもたないｃｂｉ欠乏の頻
繁な処置を受けた患者からの１５試料のうち７は、１７
５ｎｇ／ｍ７程度に高い範囲の増大した値を有した。こ
れらの７試料のうち、血清Ｌ　ｌｉｃｔｕｗ−ａｎｎｉ
ｔ　Ｃｂ　ｌ　ｆ７４度は６つにおいて低く　　（８８
〜１６５ｎｇ／ａ＃）そして１つにおいて正常（２７５
ｎｇ／　ｍｊ）であった。すべての７試料は、精製した
固有因子を使用する放射線希釈アッセイに従い低いｃｂ
ｔ値（８５〜１５５ｎｇ／ｍりを与えた。正常のメチル
マロン酸レベルをもつ８試料のうち、血清り、　ｌｉｃ
ｈｍａｎｎｉｉＣｂｌは４つにおいて低かった。

血清コハク酸についての増大した値は、７３人Ｃｂｌ欠
乏患者のうち１９人、１６人の葉酸塩の欠乏患者のうち
１０人、および１５人のＣｂｌ欠乏の頻繁な処置を受け
た患者の１５人において観測された。これらの評価の理
由は未知であるが、血清分離前に血液を放置した時間の
変動に関係づけることができるであろう。なぜなら、血
液を遠心前に室温において２４時間放置すると、コハク
酸についての値は２倍になることがあるからである。血
清メチルマロン酸についての値は、この時間にわたって
変化しない。

Ｃｂｌ欠乏をもつ７３人、の患者に関する臨床的データ
は表■に表わされており、ここでデータは血清メチルマ
ロン酸のレベルに関して減少する順序で配置されている
。血清メチルマロン酸と血清葉酸塩との間に有意な相関
関係が存在した（ｒ＝０．４５、Ｐ　＜　０．００１　
）　、相関関係は、Ｌ、ｃａｓｅｉ血清葉酸塩法（ｒ＝
０．４６、Ｐ　＜　０．０１）ならびに放射線アッセイ
技術（ｒｏ、６６、Ｐ　＜　０．００１　＞によって測
定した試料において存在した。より重度の神経学的異常
をもつ患者（群３および４）は、より穏和な異常を有す
る患者（群ｌおよび２、平均２０８３±２８６６、メジ
アン８７６ｎｇ／ｒａ１）あるいは神経学的関係の証拠
をもたない患者（群０、平均１１５４±１４６８、メジ
アン４０９ｎｇ／ｍｆ）よりも、高い血清メチルマロン
酸レベル（平均上ＳＤ、５０７７±６０７３、メジアン
３６８５ｎｇ／　ｔｄ　）を有した（Ｐ＜０．０１、群
３および４対群０〜２について）。

血清葉酸塩レベルは、神経学的状態に無関係に血清メチ
ルマロン酸を相関関係を有した（神経学的疾患をもたな
い患者においてメチルマロン酸対葉酸塩についてｒ　＝
　０．５８　；　ｎ　＝１７　；　Ｐ　＜　０．０１）
。

血清葉酸塩濃度はより重度の神経学的異常を有する患者
において高い（平均血清葉酸塩、群３および４．２０．
９±１６．９ｎｇ／ｍ！対群０〜２．１０．１±８．７
ｎｇ／ｍ１、ｐ　＜　０．００５）が、より高い血清メ
チルマロン酸レベルと進行した神経学的関係との関連性
は葉酸塩の状態に対して独立であるように思われる。

血清葉酸塩レベルが１５ｎｇ／−より低い患者において
、平気血清メチルマロン酸は、群３および４において、
２０．９±１６．９ｎｇ／＠１対群Ｏ〜２において、１
０．１±８．７ｎｇ／ａｆ、Ｐ　＜　０．００５であっ
た：血清葉酸塩は２つの群において有意に異ならなかっ
た（それぞれ、７．５±３．３ｎｇ／一対６．０±３．
８　ｎｇ／−１ｐ　＜　０．００５）。

血小板数および血清メチルマロン酸の間に負の相関関係
が存在した（ｒ　＝−０，３０；　Ｐ＜０．０５）。

しかしながら、より重度の神経学的異常をもつ患者（群
３および４）を分析から除外した場合（ｒ＝−０，２６
；　Ｐ＞０．０５）あるいは増大した血清メチルマロン
酸をもつ患者を分析から除外した場合（ｒ　＝−０，２
３；　Ｐ＞０．０５）　、コバラミンはもはや有意でな
かった。悪性の貧血を有する患者はマ者（７１４±１０
０７、Ｐ　＜　０．００４）よりも高い血清メチルマロ
ン酸値（平均、２９６８±４３８７）を有した；しかし
ながら、熱帯性スプルーを有する患者における一般に低
い血清葉酸塩値およびより少ない重度の神経学的関係に
ついて補正すると、差はもはや有意ではなかった。舌炎
をもつ患者は舌の徴候または症候をもたない患者よりも
高い血清メチルマロン酸値を有した：しかしながら、舌
炎をもち、７３人の患者の全体の群についてのメジアン
よりも上のメチルマロン酸の血清レベルを有する１８人
の患者のうち１３人は、重度の神経学的関係、増大した
血清葉酸塩値、または両者を有した。

血清メチルマロン酸は血清Ｃｂｌと相関関係をもたなか
った（すべての患者についてｒ　＝　−０，０９；微生
物学的アッセイについてｒ＝０．１２；そして放射線ア
ッセイについてｒ　＝　０．０９、各場合においてＰ　
＞　０．４　）。血清メチルマロン酸は、次のものと有
意な相関関係をもたなかった：ＭＣＶ　（ｒ＝０．０７
、Ｐ　＞　０．０５）　、白血球（ｒ＝−０，０８、Ｐ
〉０．３）およびヘマトクリット（ｒ＝−０，１２、Ｐ
〉０．４）。正常ヘマトクリットを有する１２人の患者
のすべては、増大した血清メチルマロン酸レベルを有し
た（範囲１１６〜４８００ｎｇ／　ｍ！　）。血清メチ
ルマロン酸と年令、性別、人種、症候の期間、体重損失
の程度、あるいは鉄、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
　、ビリルビンまたはアルブミンの血清との間に相関関
係は存在しなかった。

Ｃｂｌ欠乏を処置されない４人の患者（表Ｉ、ｍ７０７
３）は、正常の範囲内の血清メチルマロン酸レベルを有
した。３人は熱帯性スプルーを有した。

４人のうち１人は、固有受容および振動の感覚が傷害さ
れており、神経学的症候をもたなかった。

これらの患者を増大した血清メチルマロン酸濃度をもつ
患者と区別する、臨床的または実験室の特徴は存在しな
かった。

血清コハク酸についての値は、血清メチルマロン酸を包
含する研究したパラメーターのいず−れとも相関関係を
もたず、そして有意差は種々の下位群のいずれの間にも
観察されなかった。

第６図は、診断の時から開始し、非経口的ｃｂｌ処置後
最初の１３日にねって続けられた、古典的悪性貧血をも
つ患者における、血清（−・−）および尿（−−０−−
）のメチルマロン酸の順次のレベルを示す。患者は、汎
血球減少症、芽細胞の骨髄腫の所見、４３ρｇ／ｄの血
清Ｃｂｌ値、血清抗固有因子遮断抗体、および外因性固
有因子について補正した異常シリングテストを有する３
２才の白色人種の男性であり氏０両者の値は処置前顕著
に高く、処置後同様な速度で減少し、そして第１３日に
正常の上限のちょうど上に存在した。これが示唆するよ
うに、血清および尿のメチルマロン酸の測定は、Ｃｂｌ
欠乏Ｉ；ついての診断試験として互いに良好に相関関係
をもつが、より大きい数の追加の患者を研究しなければ
、精確な結論を出すことはできないであろう。

表ＩＩは、増大した血清メチルマロン酸が低い血清Ｃｂ
ｌレベルに先行した、９５才の白色人種の女性に関する
データを含有する。

以下余白 １９８２年９月において、彼女は無症候となったが、血
清Ｃｂ１葉酸塩のアッセイの導＜１０５というＭＣＶを
有し、そしては正常値を与えた。この血清をほぼ１年間
貯蔵し、その間メチルマロン酸のアッセイが開発されつ
つあり、そしてそれを最後に１９８３年８月にアッセイ
したとき、２６９ｎｇ／ｍＪの増大した値が得られた。

１９８３年８月に、１９８２年８月の試料について血清
Ｃｂｌおよび血清葉酸塩を再びアッセイすると、これら
は再び正常であり、そして抗固有因子遮断抗体をアッセ
イし、そして前記抗体は存在することが発見された。１
９８３年８月において、患者をクリニックに再び呼び、
ここで彼女のＭＣＶは本質的に不変化であった。血清メ
チルマロン酸レベルは、なお、３３８ｎｇ／−で高く、
そしてメチルマロン酸は尿中において高かったが、血清
Ｃｂｌレベルは、ここで、顕著に減少していた。Ｃｂｌ
の注射後３週で、血清および尿のメチルマロン酸レベル
は正常範囲内に低下したが、１午後再検査したとき、Ｍ
ＣＶは９４であった。いずれの時も神経精神学的症候は
認められなかった。高い不飽和のＣｂｌ結合容量はこの
患者について説明できるように思われなかった。なぜな
ら、彼女の白血球の数は決して（１９８２年９月〜１９
８３年中頃）評価せず、そして彼女の不飽和ｃｂｌ結合
能力はＣｂｌの処置の直前（１９８３年８月２３日）に
おいて正常（２，１ｎｇ／ａｆ）であったからである。

不都合なことには、Ｃｂｌ結合容量は１９８２年９月の
血清について測定しなかった。

われわれの研究が立証するように、血清中のメチルマロ
ン酸のアッセイはＣｂｌ欠乏の患者において有用な情報
を提供する。臨床的に確証されたＣｂｌ欠乏をもつ患者
の７３人のうち６９人において、および血液学的または
神経学的異常に欠ける、Ｃｂ１欠乏について頻繁に処置
された群からの試料の１５のうち７において、血清メチ
ルマロン酸レベルが増大していたという事実は、その感
度が血清ｃｂｔレベルのそれに類似しうろことを示唆し
ていたが、血清ｃｂｔについて基線のおよび低い正常値
をもつ患者の研究を実施した後、２つのアッセイの比較
をしなくてはならないであろう。血清メチルマロン酸の
中程度の増大が低い血清Ｃｂｌレベルの発現に先行する
患者をわれわれが観察したという事実は、血清メチルマ
ロン酸レベルが血清Ｃｂｌレベルが先行しない、すくな
くともある患者においてＣｂｌ欠乏を正しく検出であろ
うことを示唆する。こうして、血清メチルマロン酸のア
ッセイおよび血清Ｃｂｌのアッセイは互いに相補的であ
り、そして両者のアッセイは、しずれかを単独で用いて
可能であるよりも、いっそう完全な方法で、種々の患者
の固体群におけるＣｂｌ欠乏の真の発生を定めることを
可能とするように思われる。Ｃｂｌ欠乏についての血清
メチルマロン酸の特異性は、欠乏の臨床的証拠をもたな
いか、あるいはＣｂｌのバランスに影響を及ぼす潜在的
条件の臨床的証拠をもたない患者において、しばしば低
い血清ｃｂｔ値のそれよりも大きいことを立証できる。

また、Ｃｂｌおよび葉酸塩の両者の血清が正常値より低
い、巨大赤芽球性貧血をもつ患者の評価において、この
試験は有用であることを証明できる。

血清メチルマロン酸のレベルは、血清Ｃｂｌが共有しな
い１つの利点を有し、Ｃｂｌ欠乏が疑われる患者をＣｂ
ｌで処置し、そして血清メチルマロン酸レベルの効果を
観測できる。このような処置が血清メチルマロン酸レベ
ルを高い範囲から正常範囲から正常範囲に低下する場合
、これは、この報告において詳述した患者の場合におけ
るように、患者がＣｂｌ欠乏であるとう、強い推定上の
証拠である。この利点は血清ＣｂＩレベルは共有しない
。なぜなら、血清Ｃｂｌレベルは、患者がＣｂｌ欠乏で
あるか否かに無関係に、ｃｂｔの非経口的注射後、本質
的に常に高いかあるいは少なくとも正常であるからであ
る。

正常の血清Ｃｂｌレベルを有する１６人の葉酸塩の欠乏
患者のうち５人において、緩和であるが、有意に高い血
清メチルマロン酸が観測された。５人の患者のうち２人
は肝腫および／または異常肝機能の試験を受けており、
そして３人は肝臓の病気の証拠をもたなかった。尿メチ
ルマロン酸の測定を含む研究は、また、葉酸塩の欠乏を
有する数人の患者におけるおだやかな増加を示したが、
これが、おだやかな同時のＣｂｌ欠乏によるか、あるい
は他の未知の原因によるかどうかは、未知である。最近
の研究は、種々の組織中のＣｂｌの量が両者のｃｂｔ依
存性酵素を飽和するためには不十分であることを示した
。葉酸塩の欠乏において、メチオニンに結合したＣｂｌ
の量を増加することによって、メチオニンシンセターゼ
活性のレベルを増大する試みは行なうことが可能であり
、その結果Ｌ−メチルマロニルーＣｏＡムターゼに結合
したＣｂｌＯ量は減少し、そしてこれは順番にメチルマ
ロン酸の患者形成を増大する（表１参照）。

血清メチルマロン酸は、Ｃｂｌ欠乏患者の群において血
清Ｃｂｌのレベルと相関関係をもたなかった。Ｃｂｌレ
ベルと尿メチルマロン酸のレベルとの相関関係は、前に
ある研究において観測されたが、他の研、究おいて観測
されなかった。血清メチルマロン酸と血液学的パラメー
ターのいずれかとの相関関係を発見できなかったことは
、血小板との弱い逆の関係を除外して、尿メチルマロン
酸のレベルを用いる研究と一致する。

神経学的異常を有する小さい数の患者を研究する従来の
研究者らは、メチルマロン酸の尿レベルとの相関関係を
発見せず、あるいは可能な関係を示唆しなかった。われ
われ大きい系列の患者における血清メチルマロン酸レベ
ルと神経学的異常の存在との間の積極的の相関関係は、
興味あることである。なぜなら、Ｃｂｌ欠乏における神
経学的異常の原因となる生物学的機構は、なお、未知で
あるからである。血清葉酸塩レベルと血清メチルマロン
酸レベルとの間の積極的の相関関係は、また、尿メチル
マロン酸レベルの研究において認られてきていなかった
。この相関関係は、比較的高い葉酸塩含有の食事をする
患者が、多分Ｃｂｌ欠乏の診断を遅延させる、より少な
い血液学的異常を有しうるという事実のためであろう。

しかしながら、血清葉酸塩が血液学的パラメーターと積
極的に相関関係をもたなかったという事実は、これを本
当らしくなくする。また、ある未知の代謝または調節の
関係は、Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡムターゼとメチオ
ニンシンセターゼとの間に、それらの両者が活性のため
にＣｂｌを必要とするという事実に加えて、存在するこ
とが可能である。

表■から明らかなように、コバラミンの欠乏の患者の多
くは貧血ではなく、あるいは適度に貧血であり、大赤血
球症でなく、あるいは適度に大赤血球症であり、そして
１１００ｐ／−より著しく減少した血清Ｃｂルベルをも
たなかった。これらの観測は、医学分野における専門家
の現在の信念および教示と一致しく上を参照）、そして
次の実施例の終りにおいて詳述する。

実施例Ｖｌ 確証されたＣｂｌ欠乏をもつ７８人の患者および確証さ
れた葉酸塩の欠乏をもつ１９人の患者からの血清を、実
施例■に記載するように血清ｃｂ１および血清葉酸塩に
ついて、実施例ＩＶに記載するように血清メチルマロン
酸について、および実施例ＩＩＩに記載するようにして
血清メチオニン、血清システィンおよび血清ホモシステ
ィンについて試験した。結果を表ＩＩＩに記載する。

以下余白 表ＩＩＩにおける患者の全部ではないが、あるものは表
■にまた示されている。血清ホモシスティンは、コバラ
ミンの欠乏をもつ患者の７７／７８（９９％）および葉
酸塩の欠乏をもつ患者の１８／１９（９５％）において
増大していた（正常７〜２２μモル／１）。コバラミン
の欠乏の患者において、血清メチルマロン酸は７４／７
８　（９５％）において増大した（正常１９／７６ｐｇ
／ａｔ）。正常血清メチルマロン酸レベルをもつコバラ
ミンの欠乏患者の３人において、血清合計ホモシスティ
ンは増大しく範囲３４〜９３μモル／１）そして１人の
みの患者は正常範囲の血清アセトニトリルおよび血清合
成ホモシスティンの両者を有した。葉酸塩の欠乏の患者
において、５　／１９　（２６％）は血清メチルマロン
酸のおだやかな増加を有した。（範囲９２〜１９５ｎｇ
／＠ｌ）。

血清メチニオンレベルはコバラミンまたは葉酸塩の欠乏
の診断において有用でなかった。なぜなら、わずかに２
／７８（３％）のコバラミンの欠乏患者が低いレベルを
有し、そして葉酸塩の欠乏患者は低いレベルをもたなか
ったからである（正常範囲１４〜４４μモル／１）。さ
らに、血清の合計システィンレベルは診断的に有用でな
かった。なぜなら、わずかに６／７Ｂ（８％）のコバラ
ミンの欠乏患者がおだやかな増加を有し、そしてわずか
にｌ／１９（５％）の葉酸塩の欠乏患者が増大した値を
有したからである（正常範囲１７４〜３７８μモル／１
）。

表ＩＩＩから理解できるように、わずかに３２／７Ｂ　
（４１％）の患者は適度に重度の貧血を有しくＨＣｔ　
＜２５％）　、２８／７８　（３６％）は適度の貧血を
有しく２５〜３４％女性、２５〜３９％男性）、そして
１８／７８　（２３％）はまったく貧血ではなかった。

わずかに４５／７Ｂ　（５８％）はＭＣＶの顕著な増大
を有しく＞１１Ｏｆ＋）、２４／７８　（３１％）はＭ
ＣＶの穏和な増大を存しく１０１〜１１０ｆｌ）、そし
て９／７８（１１％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００ｆ
ｌ）を有した。コバラミンの血清レベルは、わずかに４
８／７８　（６２％）の患者において顕著に減少しく＜
　１１００ｐ／ｍｌ）そして３０／７８　（３８％）の
患者においてほんの適度に（１００〜２００ｐｇ／ｍり
　減少した。こうして、コバラミンの欠乏において見出
されるスペクトルは、従来信しられていたよりも非常に
広く、そして診断を実施するためには、適度に重度の貧
血、顕著に低下した血清コバラミンレベルおよび顕著に
増大したＭＣＶの発見に頼ることはできない。しかしな
がら、これらの患者において血清合計ホモシスティンを
単独で、あるいは血清メチルマロン酸と組み合わせて測
定することによって、コバラミンの欠乏がＨｃｔ、ＭＣ
Ｖおよび血清コバラミンレベルにおいて適度な異常また
は異常の不存在と関連性があるときでさえ、コバラミン
の欠乏の診断を確立することができる。他のアミノ酸、
例えば、血清メチオニンまたは合計システィンの測定は
、血清メチニオンがコバラミンの欠乏の患者において低
いという早期の教示〔参照、例えば、Ｐａｒｒｙ、　Ｔ
。

Ｅ、、　Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔ、１６：　２２１
（１９６９）　）にかかわらず、コバラミンの欠乏にお
いて診断的に有用であることが示されなかった。

以下余白 実施例Ｖｌｌ 神経学的異常は、しばしば、ｃｂｔ欠乏の後の発現であ
り、そして貧血または大赤血球症のまった（存在しない
場合において、めったに起こらないと考えられている。

この考えを試験するために、われわれは、ＣＢＬの欠乏
のために神経学的異常をもつ１４３人の連続した患者を
再検討した。これらの患者のうち４２人（２９％）にお
いて、ヘマトクＵ　−／　ト（３５／４２）またはＭＣ
Ｖ　（２６／４２）　テあり、両者ので試験（１９／４
２）は正常であることを、われわれは発見した。他の血
液学的パラメーターは、測定すると、また、頻繁に正常
であった；ＷＢ　Ｃ（４２／４２）　、血小板（３０／
４２）　、Ｌ　Ｄ　Ｈ（２５／３Ｂ）およびビリルビン
（３０／３１）。これらの４２人の患者において、神経
学的異常は次のものを包含した：末端感覚欠陥（３５）
　、知覚以上（２９）　、失調症（２１）　、記憶喪失
（１２）　、性格の変化（４）、抑型性対不全麻痺（３
）、幻覚（２）、糞便失禁（２）、緩和（２）、視神経
萎縮（１）。

血清Ｃｂｌレベル（正常＝２００〜１１０００ｐ／　−
）は、次のようにかなり変化した：　＜５０ｐｇ／−（
６）　　；５０〜１１００ｐ／ａｆ　（１９）　　；　
　１００〜１５０ｐｇ／ａｊ　（１２）；１５０〜２０
０ｐｇ／ｍ７　（３）　　：および２００〜２５０ｐｇ
　／ｍＺ　（２）。Ｃｂｌ欠乏の診断は、次の１または
２以上を立証することによって、すべての４２人の患者
において確証された：実施例ＩＶの手順によって測定し
て、＞　１５０ｎｇ／　ｍｌの血清メチルマロン酸（Ｍ
ＭＡ）の明瞭な増大、正常＝１８〜７６ｎｇ／　ｍｊ（
３６／３８）　　；実施例ＩＩ（の手順によって測定し
て、＞３０μモル／１の血清ホモシスティン（Ｈｃｙｓ
）の明瞭な増大、正常＝７〜２２μモル／１　　（３７
／３８）；Ｃｂｌ処置後における血清ＭＭＡ　（２８／
２８）および血清Ｈｃｙｓ　（２７／２８）の顕著な減
少、ＭＣＶがＣｂｌ処置前に増大しなかった、はとんど
の患者を含む、Ｃｂｌ処置のＭＣＶの５ｆ１以上の減少
（１３／１６）　　；およびＣｂｌ処置後の神経学的以
上の改良。

上から理解できるように、コバラミンの欠乏による神経
学的異常をもつ１４３人の連続的患者のうちわずかに１
０８人（７６％）のみが貧血を有しくＨｃｔ＜３５人の
女性、＜４０人の男性）を有し、そして３５／１４３（
２４％）はまたったく貧血ではなかった。これらの１４
３人の患者のうつ２６人（１８％）において、ＭＣＶは
正常であり、そして１９／１４３（１３％）において、
ヘマトリットおよびＭＣＶの両者共正常であった。正常
のヘマトクリット、正常のＭＣＶまたは両者を有した４
２人のサブセントにおいて、わずかに５／４２（１２％
）はＭＣＶが顕著に増大しており（＞　１１０ｆｌ）　
、１１／４２　（２６％）は適度に増大したＭ　ＣＶ　
（ｉｏ１〜１１０ｆｌ）を有し、そして２６／４２　（
６２％）は正常のＭＣＶ（８０〜１００ｆｌ）を有した
。コバラミンの試料レベルはわずかに２４／４２　（５
７％）の患者において顕著に減少しており（＜　１１０
０ｐ／ｍＺ）　、そして１４／４２　（３８％）におい
てわずかに中程度に減少していた（１００〜２００ｐｇ
／−）。事実、２／４２（５％）の患者は事実正常の血
清コバラミンレベルを有した。こうして、コバラミンの
欠乏から生ずる神経学的異常をもつこれらの患者におい
て、血液学的異常のスペクトルは従来認識されていたよ
いも非常に広く、そしてコバラミンの診断を実施するた
めには、適度に重度の貧血、顕著に低下した血清コバラ
ミンレベルおよび顕著に増大したＭＣＶの発見に頼るこ
とはできない。しかしながら、これらの患者において血
清合計ホモシスティンを単独で、あるいは血清メチルマ
ロン酸と組み合わせて測定することによって、コバラミ
ンの欠乏がＨｃ　ｔＳＭＣＶおよび血清コバラミンレベ
ルにおいて適度な異常のみをもつ患者においてコバラミ
ンの欠乏の診断を確立することができる。さらに、血清
合計ホモシスティンおよび血清メチルマロン酸の増大し
た値の低下を・監視することによって、コバラミンの欠
乏の診断を確立することができ、そしてコバラミンを使
用する処置の応答を監視することができる。

われわれは、次のように結露する：１）Ｃｂｌ欠乏によ
る神経学的異常は、貧血または増大したＭＣＶの不存在
下のいて普通に起こる；２）血清ＭＭＡおよび血清１１
ｃｙｓの測定、血清ＭＭＡ、血清ＨｃｙｓおよびＭＣＶ
におけるＣｂｌ処置後の変化は、患者をＣｂｌについて
評価するとき有用である；３）説明されない神経学的異
常をもつ患者のすべては、貧血、大赤血球症、または他
の血液学的異常が存在しないときでさえ、ｃｂｔ欠乏に
ついて評価すべきである；そして４）処置後の増大した
血清合計ホモシスティンまたは血清メチルマロン酸の低
下によって確証された、コバラミンの欠乏に温度患者二
次的である神経学的病気をもつ患者における、貧血の不
存在によって理解できるように、コバラミンの欠乏の臨
床的スペクトルは従来推測されているものよりも非常に
広い。

われわれは本発明の好ましい実施態様を例示しかつ説明
してきたが、本発明の変化および変更は可能であり、そ
れゆえ、上の記載した精確な用語に限定されず、本発明
を種々な用途および条件に適合させうる、このような変
化および変更は利用することができる。したがって、こ
のような変化および変更は特許請求の範囲に規定される
同等なものの範囲に完全に入り、それゆえ、特許請求の
範囲に包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ホモシスティンモノマー、システィンモノマ
ー、ホモシスチン、ホモシスティン−２−メルカプトエ
タノール、システィン−２−メルカプトエタノール、ホ
モシスティン−システィン二量体およびメチオニンの分
子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシル誘導体の質量
スペクトルと一緒に示す。 第２図は、（Ａ）アミノ酸類を含有する混合物；（Ｂ）
　　１００ｐＺのプールした正常ヒト血清；　（Ｃ）１
００　Ｉｄの正常ラット血清；および（Ｄ）　　１００
μｌの正常ヒト尿から還元後に得られたアミノ酸類のむ
一ブチルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示
す。 第３図は、マロン酸、メチルマロン酸、コハク酸、ジメ
チルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸および
グルタル酸の分子量を、それらのｔ−ブチルジメチルシ
ル誘導体の質量スペクトルと一緒に示す。 第４図は、（Ａ）Ｉｎの各酸を含有する混合物；（Ｂ）
　　５００ｉＩ！のプールした正常ヒト血清；　（Ｃ）
５００ｄの正常ラット血清；および（Ｄ）　　１００μ
ｌの正常ヒト尿から得られたジカルボン酸類のｔ−ブチ
ルジメチルシリル誘導体類のクロマトグラムを示す。 第５図は、種々のカテゴリーにおいて正常の被検者およ
び患者について血清メチルマロン酸およびコハク酸につ
いて得られた値を示すグラフである。 第６図は、診断の時から開始し、非経口的ｃｂｌ処置後
最初の１３日にわたって続けられた、古典的悪性貧血を
もつ患者における、血清（−・−）および尿（−−０−
一）のメチルマロン酸の順次のレベルを示すグラフであ
る。 以下余白 対的存在量　（％） 相対的存在量　（％） Ｆ、Ｓ、＝２　　Ｆ、Ｓ、：４　　Ｆ、Ｓ、＝＋９　　
Ｆ、Ｓ、＝３６　　Ｆ、Ｓ、＝２“ＥＳ、＝＋３５３　
Ｆ、Ｓ、＝５０Ｏｆ’：Ｓ、＝＋０４４　ＥＳ、＝１０
２６　ＥＳ、＝５３８’手続補正書（方式） 昭和６３年Ｚ月３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、所定の試料中の１種または２種以上の異なるスルフ
   ヒドリルアミノ酸種の存在をアッセイする方法であって
   、工程： （ａ）所定の試料を、アッセイし、適当なマーカーで標
   識すべきスルフヒドリルアミノ酸種の各々の既知量を含
   む内部参照標準と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたスルフヒドリルアミノ酸およ
   び標識されないスルフヒドリルアミノ酸のランダム化を
   保証するために十分な量の還元剤を添加し、 （ｃ）存在する標識されたスルフヒドリルアミノ酸およ
   び標識されないスルフヒドリルアミノ酸の量を各種につ
   いて質量分析計で測定し、 （ｄ）標識されたスルフヒドリルアミノ酸対標識されな
   いスルフヒドリルアミノ酸の比を各種について計算し、
   そして （ｅ）前記所定の試料中の各種について存在する標識さ
   れないスルフヒドリルアミノ酸の量を誘導する、 を含んでなることを特徴とする前記方法。 ２、前記標識されたアミノ酸および標識されないアミノ
   酸を工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に適当な誘導
   体に転化する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記誘導体はシリル誘導体である特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４、前記シリル誘導体は前記アミノ酸をＮ−メチル−Ｎ
   −（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロ−アセト
   アミドに暴露することによって得られる特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ５、前記所定の試料は温血動物から体の組織からなる特
   許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ６、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前にスルフヒド
   リル含有アミノ酸を部分的に精製する追加の工程を含む
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記スルフヒドリル含有アミノ酸はホモシステイン
   である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、前記内部参照標準は既知量の変性ホモシステインか
   らなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前にホモシステ
   インを部分的に精製する追加の工程を含む特許請求の範
   囲第８項記載の方法。 １０、工程（ａ）において適当な非スルフヒドリルアミ
   ノ酸の内部参照標準を準備し、工程（ｃ）において存在
   する標識されたスルフヒドリルアミノ酸および標識され
   ないスルフヒドリルアミノ酸の量を質量分析計で測定し
   、工程（ｄ）において標準対存在する標識されない非ス
   ルフヒドリルアミノ酸の比を計算し、そして工程（ｅ）
   においてそれから前記所定の試料中に存在する標識され
   ない非スルフヒドリルアミノ酸の量を誘導することによ
   って、１種または２種以上の非スルフヒドリルアミノ酸
   を同時にアッセイする追加の工程を含む特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 １１、前記非スルフヒドリルアミノ酸はメチオニンであ
   る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、工程（ａ）におけるスルフヒドリルアミノ酸の内
   部参照標準はノルロイシンである特許請求の範囲第１０
   項記載の方法。 １３、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   て体液をアッセイすることによって、温血動物中コバラ
   ミンまたは葉酸の欠乏を検出する方法。 １４、特許請求の範囲第７項記載の方法に従って増大レ
   ベルの合計のホモシステインの存在について体液をアッ
   セイすることによって、温血動物中コバラミンまたは葉
   酸の欠乏を検出する方法。 １５、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   ての前記アッセイは、体液の試料をクロマトグラフィー
   にかけることからなる特許請求の範囲第１３項記載の方
   法。 １６、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   ての前記アッセイは、体液の試料を高性能液体クロマト
   グラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオール
   基に黄対してするようにセットされた電気化学的検出器
   を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
   中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
   からなる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   ての前記アッセイは、試料中に存在するホモシステイン
   を放射線標識したＳ−アデノシンおよび標識したＳ−ア
   デノシルホモシステインヒドラーゼの暴露することによ
   ってＳ−アデノシルホモシステインに転化し、そして前
   記標識したＳ−アデノシルホモシステインを適当な検出
   手段によって定量することからなる特許請求の範囲第１
   ３項記載の方法。 １８、温血動物のコバラミンおよび／または葉酸の欠乏
   を検出し、そしてそれらの間を区別する方法であって、
   体液を合計のホモシステインおよびメチルマロン酸の合
   計のレベルの存在についてアッセイすることを含んでな
   り、ここで合計のホモシステインの正常のレベルはコバ
   ラミンまたは葉酸の欠乏の不存在を示し、合計のホモシ
   ステインおよびメチルマロン酸は増大したレベルはコバ
   ラミンの欠乏を示し、そして合計のホモシステイン増大
   したレベルとメチルマロン酸の正常レベルとの組み合わ
   せは葉酸の欠乏を示すことを特徴とする前記方法。 １９、温血動物のコバラミンおよび／または葉酸の欠乏
   を検出し、そしてそれらの間を区別する方法であって、
   体液を合計のホモシステインおよびメチルマロン酸の合
   計のレベルの存在についてアッセイすることを含んでな
   り、ここで合計のホモシステインのアッセイは特許請求
   の範囲第７項記載の方法に従い実施し、そして合計のホ
   モシステインの正常のレベルはコバラミンまたは葉酸の
   欠乏の不存在を示し、合計のホモシステインおよびメチ
   ルマロン酸は増大したレベルはコバラミンの欠乏を示し
   、そして合計のホモシステイン増大したレベルとメチル
   マロン酸の正常レベルとの組み合わせは葉酸の欠乏を示
   すことを特徴とする前記方法。 ２０、合計のホモシステインの増大したレベルのアッセ
   イは、体液の試料をクロマトグラフィーにかけることか
   らなる特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   ての前記アッセイは、体液の試料を高性能液体クロマト
   グラフィーにかけ、前記クロマトグラフィーはチオール
   基に黄対してするようにセットされた電気化学的検出器
   を有し、そして結果を標準曲線と比較して、もとの試料
   中に存在する合計のホモシステインの量を決定すること
   からなる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、増大レベルの合計のホモシステインの存在につい
   ての前記アッセイは、試料中に存在するホモシステイン
   を放射線標識したＳ−アデノシンおよびＳ−アデノシル
   ホモシステインヒドラーゼの暴露することによって標識
   したＳ−アデノシルホモシステインに転化し、そして前
   記標識したＳ−アデノシルホモシステインを適当な検出
   手段によって定量することからなる特許請求の範囲第１
   ８項記載の方法。 ２３、メチルマロン酸は、工程： （ａ）組織の試料を、安定なアイソトープのマーカーで
   標識した既知量のメチルマロン酸からなる内部参照標準
   と一緒にし、 （ｂ）存在する標識されたメチルマロン酸および標識さ
   れないメチルマロン酸の量を質量分析計で測定し、 （ｃ）存在する標識されたメチルマロン酸対標識されな
   いメチルマロン酸の比を計算し、そして （ｄ）前記所定の試料中に存在する標識されないメチル
   マロン酸の量を誘導する、 を含んでなる方法によってアッセイする特許請求の範囲
   第１８項記載の方法。 ２４、前記標識されたメチルマロン酸および標識されな
   いメチルマロン酸を工程（ａ）の後および工程（ｂ）の
   前に適当な誘導体に転化する特許請求の範囲第２３項記
   載の方法。 ２５、前記誘導体はシリル誘導体である特許請求の範囲
   第２４項記載の方法。 ２６、前記シリル誘導体は前記メチルマロン酸をＮ−メ
   チル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）トリフルオロ
   −アセトアミドに暴露することによって得られる特許請
   求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、工程（ａ）における前記内部参照標準は既知量の
   変性したメチルメチルマロン酸からなる特許請求の範囲
   第２３または２４項記載の方法。 ２８、工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前にメチルマ
   ロン酸を部分的に精製する追加の工程を含む特許請求の
   範囲第２６項記載の方法。 ２９、コバラミンの欠乏についてヒトを処置する方法で
   あって、特許請求の範囲第１３項記載の方法に従いコバ
   ラミンの欠乏の存在についてアッセイし、そして前記ヒ
   トに合計のホモシステインのレベルを正常に戻すために
   十分な量のコバラミンを投与することを特徴とする前記
   方法。 ３０、コバラミンの欠乏についてヒトを処置する方法で
   あって、特許請求の範囲第１８項記載の方法に従いコバ
   ラミンの欠乏の存在についてアッセイし、そして前記ヒ
   トに合計のホモシステインのレベルを正常に戻すために
   十分な量のコバラミンを投与することを特徴とする前記
   方法。 ３１、葉酸の欠乏についてヒトを処置する方法であって
   、特許請求の範囲第１３項記載の方法に従い葉酸の欠乏
   の存在についてアッセイし、そして前記ヒトに合計のホ
   モシステインのレベルを正常に戻すために十分な量の葉
   酸を投与することを特徴とする前記方法。 ３２、葉酸の欠乏についてヒトを処置する方法であって
   、特許請求の範囲第１８項記載の方法に従い葉酸の欠乏
   の存在についてアッセイし、そして前記ヒトに合計のホ
   モシステインのレベルを正常に戻すために十分な量の葉
   酸を投与することを特徴とする前記方法。