JP3459069B2 - Ａβアミロイドの形成を決定するためのインビトロシステム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 連邦的に後援された研究および開発下で行われた発明に
対する権利に関する記述 本研究の一部は本発明の進展中、国立衛生研究所（NI
H）により与えられた承認番号RO1 NS3048−03およびRO1
AG11899−01下で、米国政府基金を利用して実施した。
政府は本発明において所定の権利を有し得る。

発明の分野 本発明は、Ａβアミロイドを検出するための種々のア
ッセイ、インビトロでＡβアミロイドの形成を防止する
あるいは反転（reverse）させる能力について候補とな
る薬剤のスクリーニング、ならびに本発明において使用
されるキットに関する。

関連技術 脳内におけるＡβの凝集は、アルツハイマー病（AD）
の特徴である痴呆、および早発生ADによって特徴付けら
れる状態であるダウン症候群に寄与すると考えられてい
る。4.3kDaペプチドであるＡβは、脳アミロイド沈着物
の主要成分であり、アルツハイマー病（AD）の病理学的
な顕微な特徴である（Mastersら,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 82:4245〜4249（1985）;Glenner ＆ Wong,Biochem.B
iophys.Rev.Commun.120:885〜890（1984））。Ａβは非
常により大きなアミロイドタンパク質前駆体（APP）に
由来し（Kangら,Nature 325:733〜736（1987）;Tanzi
ら,Science 235:880〜884（1987）;Robakisら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 84:4190〜4194（1987）;Goldgaberら,S
cience 235:877〜880（1987））、その生理学的機能は
不明なままである。アルツハイマー病の原因はわかりに
くいままである；しかし、Ａβドメインに近接したある
いはドメイン内のAPPの変異の発見（Goateら,Nature 34
9:704〜706（1991）;Levyら,Science 248:1124〜1126
（1990）;Murrellら,Science 254:97〜99（1991）;Hend
ricksら,Nature Genet.1:218〜221（1992））は、家族
制ADと関連しており（E.Levyら,Science 248:1124（199
0）;Aβ Goateら,Nature 349:704（1991）;M.Chartier
−Harlinら,Nature 353:844（1991）;J.Murrell,M.Farl
ow,B.Ghetti,M.D.Benson,Science 254:97（1991）;L.He
ndricksら,Nature Genet.1:218（1992）;M.Mullanら,Na
ture Genet.1:345（1992））、これらはＡβおよびAPP
の代謝が本疾患の病態生理に本質的に関与するようであ
ることを示している。

可溶性Ａβは細胞培養物中に分泌され、そして脳脊髄
液（CSF）中に40残基のペプチド（Ａβ_1-40）として見
出される（Shojiら,Science 258:126〜129（1992）;Seu
bertら,Nature 359:325〜327（1992）;Haassら,Nature
359:322〜325（1992））が、散発性のADの場合にはこの
ペプチドは上昇したレベルでは見出されていない（M.Sh
ojiら,Science 258:126（1992）;P.Seubertら,Nature 3
59:325（1992））。可溶性Ａβの凝集を誘導し得る生理
学的因子はＡβアミロイド形成の原因を決定するにおい
て重要である。合成Ａβ_1-40は、中性リン酸緩衝液中で
は16mg/mlの濃度までは可溶性であり（Tomski ＆ Murph
y,Arch.Biochem.Biophys.294:630〜638（1992））、こ
のことは可溶性Ａβの過剰生産ではＡβ沈殿を十分に説
明し得ないことを示している。それゆえ、散発性の場
合、Ａβアミロイド形成を促進する生化学的機構がADの
病因と関わっているようである。さらに、ADの場合、脳
脊髄液中の可溶性Ａβは増加されず（Shojiら,Science
258:126〜129（1992））、このことは他の病因性機構が
関与するようであることを示している。

近年、Ａβペプチドの研究は、Ａβ、またはその前駆
体タンパク質APPを発現あるいは過剰発現する細胞株の
作製に至り、あるいはそのよりアミロイド性な（amyloi
dgenic）Ａβ_1-42形態の量を増加させた。N.Suzukiら,S
cience 264:1336〜1340（1994）;X−D Caiら,Science 2
59:514〜516（1993）;F.S.Eschら,Science 248:1122〜1
124（1990）を参照のこと。さらに、Ａβペプチドに対
するモノクローナル抗体が作製されている（例えば、米
国特許第5,231,000号、1993年７月27日発行を参照）。
これらのモノクローナル抗体は、Ａβアミロイドの存在
の検出に使用するための試薬として有用である。

発明の要旨 本発明に記載のプロセスは、亜鉛のような重金属カチ
オンによりＡβアミロイドを急速に誘導してアミロイド
を形成することに関与する。本発明の好適な実施態様に
おいて、亜鉛とのインキュベーション後も濾過性なまま
であるＡβ_1-40溶液の割合をアッセイし、そして候補と
なる薬理学的薬剤のこの濾液に対する効果を測定し、生
理学的溶液中でのＡβの溶解性を維持させ、それゆえＡ
βアミロイド形成を防止する能力を決定する。

Ａβアミロイドのインビトロでの誘導法が以前に記載
されている（J.T.Jarrettら,Biochem.32:4693〜4697（1
993））。しかし、この方法は、定量的であるよりむし
ろ定性的である結果を伴い、高濃度のペプチドおよびイ
ンキュベーション期間（日）の延長を必要とするような
多くの不利な点を有する。対照的に、本発明の主ないく
つかの利点は、本技術は信頼性があり、迅速であり（分
で行い得る）、容易に定量化し得、そして低μＭ濃度の
ペプチドで達成されることである。

それゆえ、本発明はアルツハイマー病の特徴および関
連した病理学的状態であるインビボでのアミロイド沈着
の形成を、防止または反転するのに有効であるような候
補となる薬剤を迅速にスクリーニングするためのインビ
トロ方法に関する。次いで、本発明のインビトロ方法の
１つによって選択される見込みのある（Promising）候
補となる薬剤が、アルツハイマー病に苦しむ患者、ある
いはアルツハイマー病が発症する危険がある患者におい
てインビボでのその有効性について試験され得る。

本発明の１つの局面は、生物的液体中でのＡβアミロ
イド形成を検出するための迅速な分析方法に関し、以下
の工程を包含する： （ａ） コントロールのヒト被験体由来の生の（neat）
生物的液体を含む第１のセットの反応混合物、および水
性緩衝液または生理学的溶液中で作製した該反応混合物
の系列希釈物を調製する工程； （ｂ） アミロイド症の疑いがあるヒト患者由来の生の
生物的液体を含む第２のセットの反応混合物、および水
性緩衝液または生理学的溶液中で作製された該反応混合
物の系列希釈物を調製する工程； （ｃ） 各系列希釈サンプルに、少なくともＡβのアミ
ノ酸６〜28を含有する等量のＡβペプチドを添加する工
程； （ｄ） 第１および第２のセットの各反応混合物と、少
なくともＡβのアミノ酸６〜28を含むＡβペプチドに結
合し得る300nM以上の重金属カチオンとを接触させる工
程； （ｅ） 第１および第２のセットの各反応混合物を遠心
分離し、第１および第２のセットのペレットをそれぞれ
提供する工程；および （ｆ） 第１および第２のセットのペレット中のアミロ
イドの量を比較し、それにより、アミロイド症の疑いが
あるヒト患者由来の生物的液体中での過剰なＡβアミロ
イドの形成を検出する工程。

本発明の第２の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するか否かを決定するための方法に関し、以下
の工程を包含する： （ａ） Ａβペプチド中のアミノ酸番号６〜28の領域を
少なくとも含有するＡβペプチドの水性緩衝液を予め濾
過して、第１の濾液を提供する工程； （ｂ） 工程（ａ）で得られた第１の濾液中のＡβペプ
チドの量を測定する工程； （ｃ） 工程（ａ）で得られた第１の濾液と、少なくと
もＡβのアミノ酸６〜28を含有するペプチドに結合し得
る重金属カチオンとを接触させ、反応混合物を得る工
程； （ｄ） 工程（ｃ）で得られた反応混合物と候補となる
抗アミロイド（anti−amyloidotic）剤とを接触させる
工程； （ｅ） 工程（ｄ）で得られた反応混合物を濾過して、
第２の濾液を提供する工程； および （ｆ） 第２の濾液中のＡβペプチドの量を第１の濾液
中のＡβペプチドの量と比較し、それにより候補の化合
物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する
工程。

本発明の第３の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するかどうか決定する方法に関し、以下の工程
を含む： （ａ） 第１および第２の反応混合物を集める工程、こ
こで各反応混合物は、Ａβペプチドの少なくともアミノ
酸番号６〜28の領域、および水性緩衝液または生理学的
溶液を含有する等量の予め濾過したＡβペプチド溶液を
含有する工程； （ｂ） 第１および第２の各反応混合物と、等量の候補
となる抗アミロイド剤とを接触させる工程； （ｃ） 第１の反応混合物と、少なくともＡβのアミノ
酸６〜28を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオ
ンとを接触させる工程； （ｄ） 第２の反応混合物と、EDTAとを接触させる工
程；および （ｅ） 第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの
量を、第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量
とを比較し、それにより候補となる化合物がＡβアミロ
イドの形成を阻害するか否かを決定する工程。

本発明の第４の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するか否かを決定する方法に関し、以下の工程
を包含する： （ａ） 第１および第２の反応混合物を集める工程、こ
こで、各反応混合物は、Ａβペプチド中の少なくともア
ミノ酸番号６〜28のアミノ酸の領域、および水性緩衝液
または生理学的溶液を含有する等量の予め濾過したＡβ
ペプチド溶液を含有する工程； （ｂ） 第１および第２の各反応混合物と、等量の候補
となる抗アミロイド剤とを接触させる工程； （ｃ） 第１の反応混合物のみを、少なくともＡβのア
ミノ酸６〜28を含有するペプチドに結合し得る重金属カ
チオンと接触させる工程；および （ｄ） 第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの
量を、第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量
と比較し、それにより化合物がＡβアミロイドの形成を
阻害するか否か決定する工程。

本発明の第５の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するか否か決定する方法に関し、以下の工程を
包含する： （ａ） Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜28の領域を少
なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現す
る細胞株を含む第１および第２の細胞培養物を確立する
工程； （ｂ） 等濃度の亜鉛を、各細胞培養物に接触させる工
程； （ｃ） 該第１の細胞培養物と候補となる薬剤とを接触
させ、そして該第２の細胞培養物と重金属キレート剤と
を接触させる工程；および （ｄ） 各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導
されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補の抗ア
ミロイド剤の有効性を決定する工程。

本発明の第６の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するか否かを決定する方法に関し、以下の工程
を含む： （ａ） Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜28の領域を少
なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現す
る細胞株を含む第１および第２の細胞培養物を確立する
工程； （ｂ） 第１の細胞培養物と亜鉛とを接触させ、第１の
反応混合物を提供する工程； （ｃ） 第１の反応混合物および第２の細胞培養物と、
候補の薬剤とを接触させる工程；および （ｄ） 各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導
されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補となる
抗アミロイド剤の有効性を決定する工程。

本発明の第７の局面は、化合物がＡβアミロイドの形
成を阻害するか否かを決定するためのキットに関し、本
キットは、区分されて、その中に１以上のコンテナ手段
を密閉して収容するキャリア手段を含有し、ここで、 （ａ） 第１のコンテナ手段は、Ａβペプチドのアミノ
酸番号６〜28の領域を少なくとも含有するペプチドを含
有し；および （ｂ） 第２のコンテナ手段は、重金属カチオンを含有
する。

図の簡単な説明 図1a、1b、1c、1d、および1e.Aβに結合する⁶⁵Zn²⁺の
分析。示した値は平均±標準偏差,n≧３である。（1a）
スキャッチャードプロット。Ａβのアリコートを種々の
濃度の未標識Zn²⁺（全体で0.01〜50μＭ）の存在下で⁶⁵
Zn²⁺とともにインキュベートした（60分）。固定化した
ペプチド（1.0nmol）に対する⁶⁵Zn²⁺の結合率は示した
ように２つの結合カーブを記した。高親和性結合カーブ
は低親和性成分を差し引くことにより校正し、低親和性
カーブは差し引いた高親和性成分を有した。（1b）金属
に対するZn²⁺結合部位の特異性を示す棒グラフ.Aβを⁶⁵
Zn²⁺（157nM,138,000cpm）および競合する未標識の金属
イオン（全体で50μＭ）とともにインキュベートした
（60分）。（1c）ネガティブコントロールタンパク質
（アプロチニン、インスリンａ鎖、逆ペプチド40〜１）
およびポジティブコントロールタンパク質（ウシ血清ア
ルブミン（BSA））およびＡβフラグメント（Ａβ配列
内のそれらの残基数によって同定された（gln11は、残
基11がグルタミンであるＡβ_1-28をいう））に対する、
⁶⁵Zn²⁺（74nM,104,000cpm）の結合を示す棒グラフ。加
えられた⁶⁵Zn²⁺/分の全体のカウントの結合パーセント
を、膜に接着するペプチドの量（nmol）に対して校正す
る。（1d）（1a）についてのような、Ａβ_1-28をＡβ
_1-40で置き換えたスキャッチャードプロット。本実験で
は157nM⁶⁵Zn（138,000cpm）を、固定したペプチド（1.6
nmol）をプローブするために用いる。（1e）⁶⁵Zn²⁺のＡ
β_1-40への結合のpH依存性を示すグラフ。

図2a、2b、および2c。G50ゲル濾過クロマトグラフィ
ーを用いたＡβ重合に対するZn²⁺および他の金属の効
果。示した結果はｎ≧３の実験を示し、ここでは55μｇ
のＡβをカラムにアプライし、そして15mlずつ溶出して
254nmの吸光度によりモニターした。（2a）50μM EDT
A、0.4μM Zn²⁺;25μM Zn²⁺;および25μM Cu²⁺の存在下
でのＡβのクロマトグラムを示すグラフ。分子質量スタ
ンダードの溶出点およびＡβピーク溶出の相対的な割当
てを示す（assignment）。質量スタンダードは、ブルー
デキストラン（２×10⁶kDa,V₀＝空隙容量）、BSA（66kD
a）、カルボニックアンヒドラーゼ（29kDa）、チトクロ
ームｃ（12.4kDa）、およびアプロチニン（6.5kDa）で
あった。Ａβの分子量は4.3kDaである。（2b）種々の金
属イオン（25μＭ）、種々の濃度のZn²⁺またはCu²⁺（Tr
isキレート化の見込みは、上限推定値（upper limit es
timate）で示される）、およびEDTA存在下でのモノマ
ー、ダイマー、またはポリマーとして溶出された可溶性
Ａβの相対量（曲線下の面積から推定した）を示す棒グ
ラフ。銅の存在下で実施された実験についてのデータ
は、214nmで読み取り、そして比較のために校正した。
（2c）亜鉛（25μＭ）、銅（25μＭ）、またはキレート
剤の存在下でのＡβ種の回収に対するBSAを用いたクロ
マトグラフィーカラムのプレブロックの効果を示す棒グ
ラフ。

図3aおよび3b。カオリン（アルミニウムケイ酸塩）へ
のＡβの結合：亜鉛（25μＭ）、銅（25μＭ）、および
EDTA（50μＭ）の効果。（3a）10mgのG50セファデック
スとのインキュベーション後の上清中に残存するＡβの
濃度（214nmの吸光度による）を示す棒グラフ。（3b）1
0mgのカオリンとのインキュベーション後の上清中に残
存するＡβの濃度（214nmの吸光度による）を示す棒グ
ラフ（初発の吸光度のパーセントで示す）。

図4aおよび4b.トリプシン消化に対するＡβの耐性に
対するZn²⁺の効果。（4a）増加する濃度の亜鉛（レーン
ラベル、μＭ）とのインキュベーション後のＡβ（13.9
μｇ）のトリプシン消化のブロット（クマシーブルーに
より染色した）。3.6kDa（Ａβ_６〜40）、および2.1kDa
（Ａβ_17〜40）の消化産物、ならびに未消化のＡβ_1-40
（4.3kDa）を左側に示す。低分子量マーカー（STD）の
移動度を右側に示す（キロダルトン）。（4b）Ａβのト
リプシン消化産物への⁶⁵Zn²⁺の結合を示す棒グラフ。ａ
におけるブロットを⁶⁵Zn²⁺とともにインキュベートし、
目に見えるバンドを切り取り、そして各バンドに対する
結合カウントを測定した。これらのデータはｎ＝３の反
復実験の代表である。

図５。ラットＡβ_1-40への⁶⁵Zn結合のスキャッチャー
ド分析。溶解したペプチド（1.2nMol）を0.20μPVDFメ
ンブレン（Pierce）上にドットブロットし、そして実施
例１（図１）に記載したように競合分析を実施した。ラ
ットＡβ_1-40およびヒトＡβ_1-40、固層Fmoc化学によっ
て合成した。逆相HPLCによる精製およびアミノ酸配列決
定によって合成を確認した。回帰線は3.8μＭのK_Aを示
している。結合の化学量論は1:1である。スキャッチャ
ード曲線のデータポイントは、僅かに２相性曲線を示唆
しているが、２相の反復法（biphasic iteration）は、
２および９μＭの会合定数を生じ、これは生理学的に離
れた結合部位の説明を正当化しない。

図6a、6b、6c、および6d。ヒトＡβ_1-40、¹²⁵I−ヒト
Ａβ_1-40、およびラットＡβ_1-40の＞0.2μ粒子への凝
集に対する亜鉛の効果。ヒトおよびラットＡβ_1-40のペ
プチドストック水溶液（16μＭ）を、予め濾過し（Spin
−X,Costar,0.2μセルロースアセテート,700g）、100mM
NaCl、20mM Tris−HCl、pH7.4（緩衝液１）±EDTA（50
μＭ）または塩化金属塩に入れ、インキュベートし（30
分、37℃）、次いで再度濾過した（700g、４分）。濾液
中のＡβ_1-40の画分を、濾過していないサンプルのOD
₂₁₄に対する濾液のOD₂₁₄の比（ヒトおよびラットＡβ
_1-40の濃度に対して滴定したOD₂₁₄の応答は、直線性
（これらの実験で用いられた緩衝液中では20μＭまで）
であることが決定された）によって算定した。全てのデ
ータのポイントは、示さない限り３連である。（6a）±
Zn²⁺（25μＭ）またはEDTA（50μＭ）とともにインキュ
ベートし、次いで0.2μで濾過し、ペプチド濃度に対し
て滴定したＡβ_1-40の比率を示すグラフ。（6b）0.2μ
で濾過したＡβ_1-40（1.6μＭ）のZn²⁺濃度に対して滴
定した比を示すグラフ。¹²⁵IヒトＡβ_1-40（¹²⁵IヒトＡ
β_1-40は、Mantyhら,J.Neurochem 61:1171（1993）にお
ける方法に従って調製された（15,000CPM,John Maggio
博士,Harvard Medical Schoolから懇意に贈与され
た））を上記のように、トレーサーとして未標識Ａβ
_1-40（1.6μＭ）に添加し、インキュベートし、そして
濾過した。濾液中のおよび削り取ったフィルター上に保
持されたCPMはγカウンターにより測定された。（6c）
種々の金属イオン（３μＭ）とのインキュベーション後
に、0.2μで濾過したＡβ_1-40（1.6μＭ）の比を示す棒
グラフ。金属種の原子番号を示す。（6d）0.2μ濾過に
よって測定したヒトＡβ_1-40凝集のキネティックスに及
ぼすZn²⁺（25μＭ）またはEDTA（50μＭ）の効果を示す
グラフ。データポイントは２連である。

図7a、7b、7c、および7d。亜鉛で誘導されるＡβ凝集
物のサイズの推定。（7aおよび7b）Ａβ_1-40の比率を示
す棒グラフ（100mM NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.4（緩衝
液１）中の1.6μＭのＡβ_1-40を、±Zn²⁺（25μＭ）ま
たはEDTA（50μＭ）とインキュベートし、次いで示した
孔サイズのフィルターで濾過した（Duraporeフィルター
（Ultrafree−MC,Millipore）を本研究では用い、それ
ゆえ本研究で0.22μフィルターを用いて得られた値の間
には、0.2μ Costerフィルターを用いて図６で得られた
値に比べて僅かな矛盾がある））。（7c）図7aおよび7b
において生成された亜鉛で誘導されるヒトＡβ_1-40の凝
集物の集合のトレーサーとして用いた⁶⁵ZnCl₂（130,000
CPM,75nM）を示す棒グラフ。濾液中のＡβ_1-40および⁶⁵
Znの量を決定することによって、フィルターによって阻
まれた（retarded）量を決定し得、そしてZn:Aβ集合体
の化学量論を見積もる。（7d）棒グラフ。この手順の
後、Zn:Aβ集合体を保持するフィルターを、緩衝液１
（100mM NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.4）＋EDTAで洗浄し
た（50μＭ×300μl,700g,4分）。濾液画分中に再可溶
化された亜鉛で沈澱したＡβ_1-40の量をOD₂₁₄によって
決定し、そして元来各フィルターによって保持された量
のパーセントとして表した。濾液中に放出された⁶⁵Zn
は、γカウントによって測定した。

図8aおよび8b。亜鉛で誘導される着色性のアミロイド
形成。（8a）コンゴーレッドで染色した亜鉛で誘導され
るヒトＡβ_1-40沈澱物。粒子の直径は40μである。Ａβ
_1-40（緩衝液１（100mM NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.4）
中の200μｌ×25μＭ）を、25μM Zn²⁺の存在下でイン
キュベートした（30分、37℃）。次いで、この混合物を
遠心分離（16,000g×15分）、このペレットを緩衝液１
（100mM NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.4）＋EDTA（50μ
Ｍ）で洗浄し、再度ペレット化し、そしてコンゴーレッ
ド（50％エタノール中の１％、５分）に再懸濁した。未
結合の色素を除去し、このペレットを緩衝液１（100mM
NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.4）で洗浄し、そして顕微鏡
用にマウントした。（8b）この凝集物を、緑色複屈折を
示す偏光下で可視化した。この実験をZn²⁺の代わりにED
TA（50μＭ）で繰り返したが、目に見える物質は生じな
かった。

図９。ヒトＡβ_1-40、¹²⁵I−ヒトＡβ_1-40、およびラ
ットＡβ_1-40の＞0.2μ粒子への凝集に対する亜鉛およ
び銅の効果を示すグラフ。ヒトおよびラットＡβ_1-40の
ペプチドストック水溶液（16μＭ）を予め濾過し（Spin
−X,Costar,0.2μセルロースアセテート,700g）、100mM
NaCl、20mM Tris−HCl、pH7.4（緩衝液１）±EDTA（50
μＭ）または塩化金属塩に入れ、インキュベートし（30
分、37℃）、次いで再度濾過した（700g、４分）。濾液
中のＡβ_1-40の画分を、濾過していないサンプルのOD
₂₁₄に対する濾液のOD₂₁₄の比（ヒトおよびラットＡβ
_1-40の濃度に対して滴定したOD₂₁₄の応答を直線性（こ
れらの実験で用いられた緩衝液中では20μＭまで）であ
ることが決定された）によって算定した。全てのデータ
ポイントは、示さない限り３連である（図９）。このグ
ラフは、±Zn²⁺（25μＭ）またはCu²⁺またはEDTA（50μ
Ｍ）とともにインキュベートし、次いで0.2μで濾過
し、ペプチド濃度に対して滴定したＡβ_1-40の比を示
す。

図10。ヒトＡβペプチドのアミノ酸配列。ヒトＡβペプ
チドのアミノ酸配列を示し、そしてアミノ酸の位置に番
号を付けた。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、
および請求の範囲から明白である。

好適な実施態様の詳細な説明 アルツハイマー病の脳内アミロイドの主要成分である
Ａβ_1-40は、CSF内に存在し、高濃度（≦3.7mM）でも比
較的可溶性なままである。従って、Ａβアミロイド形成
を誘導する生理学的因子は、この疾患の病因に対する貴
重な手掛りを提供する。ヒトＡβは亜鉛に特定的におよ
び飽和して結合することが見出されている。300nM以上
の濃度の亜鉛は、ヒトＡβ_1-40を急速に不安定にし、こ
れは着色性のアミロイド形成を含む。一方、ラットＡβ
_1-40は、亜鉛に強く結合することはないのでこの効果を
免れる。このことはおそらく、これらの動物が脳内Ａβ
アミロイドを形成することに関する不足を説明する。全
体的に、これらのデータは、アルツハイマー病の神経病
発生における脳の亜鉛代謝の潜在的に重要な役割を示唆
している。

さらに、ADおよびDS患者には亜鉛恒常性の異常性が発
生することが観察されている。Ａβは亜鉛に特異的およ
び飽和して結合することが示されており、通常のCSF亜
鉛レベルと適合性の高親和性結合（K_A＝107nM）および
低親和性結合（K_A＝5.2μＭ）を明示している。ADにお
ける異常性が報告されている脳の亜鉛恒常性（D.Wenstr
up,W.D.Ehmann,W.R.Markesbery,Brain Res.533:125（19
90）;J.Constantinidis,Encephale 16:231（1990）;F.
M.Corrigan,G.P.Reynolds,N.I.Ward,Biometals 6:149
（1993）;C.O.Hersheyら,Neurology 33:1350（1983））
は、亜鉛濃度の上昇がペプチドの接着性およびタンパク
質分解的消化に対する耐性を増加させるため、Ａβの代
謝的運命にとって重要であり得る。さらに、経口的な亜
鉛の補充は、近年、年齢を合わせたコントロールではな
くAD被験体において、認識力に対して急性の有害な効果
を有することが示され、このことは環境性または栄養性
亜鉛の曝露が、ADの病態生理学に対する寄与因子であり
得ることを示した。

発明の発見はＡβが、pH依存性の様式で亜鉛に強くお
よび特異的に結合することを示した。脳環境内では、こ
れらの金属イオンは、結合および溶解性に対してこの効
果を発揮するに十分な濃度で存在する。Ａβ溶解性にお
ける減少は、0.3μＭ程度の低い亜鉛濃度の存在下で生
じる。Ａβ上の亜鉛結合部位の占有は、α−セクレター
ゼ部位でのトリプシン消化に対するペプチドの耐性を増
大させる。α−セクレターゼは、未だに未同定のプロテ
アーゼであり、Ａβの前駆体分子であるアミロイドタン
パク質前駆体（APP）を、Ａβドメイン内で切断し、Ａ
βを蓄積し得なくすることが観察されている。それゆ
え、Ａβの亜鉛結合部位の占有は、このペプチドの生物
学的半減期を増加させ、そして沈着のための利用性を増
大させる。

それゆえ、Ａβ上の亜鉛の結合部位への亜鉛の結合を
阻止する、あるいはＡβが過剰の亜鉛（すなわち、300n
M以上の亜鉛）に接触した後のアミロイド形成を防止す
る薬理学的薬剤は、Ａβ沈着を阻止および／または反転
させることにより、アルツハイマー病、ダウン症候群、
およびGALS/PDCの処置に有用であり得る。現在、これら
の疾患における治療的可能性を有する候補となる抗アミ
ロイド剤の迅速なスクリーニング手段は存在しない。本
発明は、そのような候補となる薬理学的薬剤をスクリー
ニングする手段および方法を提供する。

亜鉛誘導性Ａβアミロイド形成に対する候補となる抗
アミロイド薬理学的薬剤の効果は、本発明のフィルトレ
ーションアッセイによって迅速にスクリーニングされ得
る。亜鉛誘導性Ａβ_1-40凝集反応は、Ａβ_1-40を伴うか
伴わないで（±）、候補となる薬剤の存在下で実施さ
れ、そしてフィルトレーション滴定が、薬剤、亜鉛、お
よびペプチドの濃度を変化させながら実施される（この
濃度は、³H−Ａβの使用によって生理学的レベルにされ
る）。本アッセイはまた、観察された任意の抗アミロイ
ド効果を、実際の生理学的状況により近いインビトロ近
似にさせるため、ヒトCSF存在下でも実施され得る。

ヒトおよびラットＡβ_1-40のペプチドストック水溶液
（16μＭ）を、予め濾過し（Spin−X,Costar,0.2μセル
ロースアセテート,700g）、100mM NaCl、20mM Tris−HC
l、pH7.4＋塩化亜鉛（0.3〜25μＭ、これらの濃度限界
の間で間隔をおいてサンプリングした）、±候補となる
抗アミロイド剤に入れ、インキュベートし（30分、37
℃）、次いで再度濾過した（700g、４分）。濾液中のＡ
β_1-40の画分を、濾過していないサンプルのOD₂₁₄に対
する濾液のOD₂₁₄の比によって算定した。ヒトＡβ_1-40
の濃度（これらの実験で用いられた緩衝液中では20μＭ
まで）に対して滴定したOD₂₁₄の応答は、直線性である
ことが決定された。候補となる抗アミロイド剤の効果
が、亜鉛の代わりにEDTA（50μＭ）の存在下でインキュ
ベーションが行われる場合に濾過されるペプチドの比率
に対して比較され得る。

候補となる抗アミロイド剤は、広い範囲であるが、以
下のように分類され得る： Ａβとの相互作用に対する亜鉛の利用性を修飾する薬
剤：この薬剤は、デスフェリオキサミン（desferrioxam
ine）のようなキレート薬剤を含むが、遊離の亜鉛を結
合するアミノ酸ヒスチジンおよびシステインもまた含
み、血液脳関門（BBB）を通過する血漿由来の亜鉛を運
ぶことに関与していると考えられる。これらの薬剤は、
全てのクラスの亜鉛特異的キレート薬剤、およびEDTA
（エディック酸（Edetic acid）,N,N'−1,2−エタンジ
イルビス［Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン］または
（エチレンジニトロ）四酢酸,Merck Index第10版，登録
番号3490）およびEDTAの全ての塩、および／またはフィ
チン酸（ミオイノシトールヘキサキス（hexakis）（二
水素リン酸）,Merck Index第10版，登録番号7269）およ
びフィチン塩酸のような亜鉛をキレート化し得る非特異
的キレート剤の組合わせを包含する。

溶媒：ジメチルスルホキシドを、全身性アミロイド症
のいくつかの形態についての処置として提案した；エタ
ノール；グリシン（溶媒特性を有するアミノ酸）。

銅：高濃度において、銅はＡβ_1-40のガラスへの接着
を阻止し、そして可溶性Ａβダイマーを安定化する。亜
鉛で誘導されるＡβの凝集に対する銅の効果は競合的で
あり得る。

炭酸リチウム：臭化リチウムが、Ａβ合成ペプチドを
溶液中で維持するために使用されている（Halverson
ら、1990）。この観察は、リチウム塩それ自体が、Ａβ
凝集を阻害し得るという考察をもたらす。炭酸リチウム
は、双極性感情障害の処置に用いられている神経弛緩薬
物であり、ここでは、全身性の治療レベルは1mMに保持
される。炭酸リチウムが1mMでＡβ凝集に対して阻害効
果を有する場合、炭酸リチウムはADおよび関連した病理
学的状態のための治療剤として、妥当な候補である。

その他（Miscellaneous）：有効な抗アミロイド剤に
は前例がないため、亜鉛で誘導されるＡβ凝集を阻害す
る能力について、脳区画に接近し得る化合物を偶然的に
試験することは理にかなっている。これらの化合物は、
色素化合物、ヘパリン、硫酸ヘパラン、および抗酸化剤
（例えば、アスコルベート、トロロックス（trolox）、
およびトコフェロール）を含有する。

定義 Ａβペプチドはまた、Ａβ、βタンパク質、β−A4お
よびA4として当該分野で公知である。

アミロイドは、当該分野で通常知られているように、
そして本明細書中で意図されるように凝集タンパク質の
形態である。

同様に、Ａβアミロイドは凝集したＡβペプチドであ
る。これは、ADおよびDSを患う患者の脳内に見出され、
そして脳傷害およびGALS/PDC後に蓄積し得る。

染色アミロイドとは、緩衝水溶液中に不溶であること
に加え、コンゴーレッドで染色され得、そして偏光中で
陽性の複屈折性を有するアミロイドをいう。

抗アミロイド試薬とは、アミロイドの形成を阻害する
化合物をいう。

亜鉛で誘導されるＡβ凝集物は、染色アミロイドのよ
うに、緩衝水溶液に不溶であって、そしてコンゴーレッ
ドで染まる。しかし、染色アミロイドとは異なり、偏光
中で陽性の複屈折性を明確に示さない。

Ａβアミロイド症は、当該分野で通常知られ、そして
本明細書中で意図されるように、脳のような神経組織内
でＡβアミロイドの形成により特徴づけられる、ヒトお
よび他の動物における発症状態をいう。

本明細書中で用いられるとき、予め濾過する、および
予め濾過されたは、溶液（例えば、Ａβペプチド水溶
液）を、任意の方法（例えば、遠心分離、重力による滴
透過（drip−through）、または（気体の圧力のよう
な）任意形態の圧力の適用）により、多孔性膜を通じて
通過させることを意味する。

本明細書中で使用される生理学的溶液は、CSF、血
液、血漿などのような体液または生物学的液体が示すの
に近い、生理学的pH（約7.4）で化合物を含有する溶液
を意味する。

重金属キレート剤は、例えば、重金属をキレート化す
る（すなわち、重金属が、例えば化合物または分子であ
る他の試薬と、反応および／または結合し得なくする）
化合物または分子である任意の試薬をいう。このような
重金属キレート剤の例には、EDTAまたはデスフェリオキ
サミンがある。

本発明において、重金属塩は、任意の形態（可溶性ま
たは不溶性）における、任意の重金属または任意の遷移
金属の塩である。

本明細書において、指示がなければ、亜鉛は、亜鉛の
塩、すなわち任意の形態（可溶性または不溶性）におけ
るZn²⁺を示す。

生物学的液体は、ヒトまたは動物により産生されるヒ
トまたは動物から得られる流体を意味する。生物学的液
体の例には、脳脊髄液（CSF）、血液、血清、および血
漿が含まれるが、これらに限定されない。本発明におい
て、生物学的液体は、任意の手段（例えば、限外濾過ま
たはクロマトグラフィー）による精製から派生するよう
な流体の全体または任意のフラクションを含む。

生物学的液体の原液サンプルは、生物学的液体が、例
えば希釈によって改変されていないことを意味する。

コントロールのヒト被験体とは、アミロイド症を患っ
ていない健康なヒトをいう。

Ａβアミロイドの検出のための迅速な分析方法では、
アミロイド症を患っていると疑われるヒト患者の、SC
F、血清または血漿のような生物学的液体を、系列希釈
して滴定する。同様に、コントロールサンプル（アミロ
イド症を患っていない健康なヒト由来の生物学的液体）
を、系列希釈により滴定する。希釈は、原液（希釈して
いない）サンプルから1:10,000以上までの範囲であり得
る。アミロイド症を患うヒト由来のサンプルはより低い
力価を有することと推定される。なぜならこれらの患者
は、有意にアミロイドを形成しやすくする病状を患って
いるからである。次いで、緩衝水溶液または生理学的溶
液中の等量のＡβペプチドを、各サンプルに添加する。
次いで、このサンプルを、少なくともＡβペプチドのア
ミノ酸６〜28を含むペプチドに結合し得る、大きな（30
0nM以上の）、好ましくは25μＭの重金属カチオンと接
触させる。本発明中の好ましい重金属は亜鉛である。さ
らに、Ａβペプチドは、重金属カチオンの存在下でＡβ
アミロイドを形成する。次いで、このＡβアミロイド
を、遠心分離によりそれらをペレット化することにより
回収し得る。最後に、このペレットをコンゴーレッドの
ようなアミロイド染色色素を用いて染色し、そしてこの
ペレットを顕微鏡下で観察し、そして（所望であれば）
グリッドを用いて定量する。（健康なヒトと比較して）
アミロイド症の患者の生物学的液体はすでに、アミロイ
ドを形成する傾向がより大きく、そして彼／彼女の生物
学的液体（例えばCSF）はすでに、アミロイドを含有し
ており、従って、患っている患者から得られるペレット
中の染色Ａβアミロイドの量は、健康なコントロールの
サンプルよりも多いことが予想される。

あるいは、サンプルを系列希釈により滴定した後、少
なくともＡβのアミノ酸６〜28を含む等量の滴定された
Ａβペプチドを各サンプルに添加する。このサンプルは
先のように遠心分離され得、そして各ペレットにおける
１分間あたりのカウントを測定した。しかし、好ましく
は、サンプルを濾過し、そしてフィルターのCPMをシン
チレーションカウンターにより測定する。

化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するかを決定す
る本発明の方法では、亜鉛誘導または重金属誘導に曝し
た後の反応中に残存する可溶性または沈澱Ａβペプチド
の量を測定し、そして反応混合物に添加された可溶性ペ
プチドの初期量と比較し、これによって候補となる試薬
がアミロイド形成を阻害し得ることを明らかにする。逆
に、亜鉛または重金属で誘導される反応において形成さ
れたＡβアミロイドの量を測定し、そして少なくともＡ
βのアミノ酸６〜28を含有するペプチドに結合し得る重
金属カチオンのキレーター（例えば、EDTAまたはデスフ
ェリオキサミン）を含むコントロール反応混合物と比較
し、候補となる試薬がアミロイドの形成を阻害し得るか
を決定する。

さらに、上記のように、ペプチドまたはアミロイドの
量を測定および比較するために、この反応混合物を濾過
し得る。逆に、この反応混合物を遠心分離し、例えばコ
ンゴーレッドでペレットを染色し、そして顕微鏡下で観
察して、アミロイドの形成を検出し得る。さらに、形成
されたアミロイドの量を、グリッドを用いて定量し得
る。

本発明において、Ａβペプチドは、少なくともＡβの
アミノ酸６〜28を含有するポリペプチドに結合し得る最
も好ましい重金属カチオンである亜鉛に対する結合部位
を含む、少なくともＡβペプチドの６〜28位に対応する
アミノ酸を含む限り、Ａβペプチドの任意の配列を含み
得る。本発明の好ましい実施態様は、ペプチドＡ
β_1-39、Ａβ_1-40、Ａβ_1-41、Ａβ_1-42、およびＡβ
_1-43を使用する。最も好ましい本発明の実施態様はＡβ
_1-40を使用する。しかし、少なくともＡβのアミノ酸６
〜28を含有する任意のＡβペプチドが本発明に従って用
いられ得る。アミノ酸６〜28を含有するＡβペプチドの
配列は、C.Hilbichら、J.Mol.Biol.228:460〜473（199
2）に示されている。

本発明の方法において、Ａβペプチドは、光学分光光
度法を用いて検出される。これは、ペプチドの濃度とOD
₂₁₄測定との間に直接の相関関係が存在するので可能で
ある。OD測定について好ましい波長は約214であるが、
この測定は、本発明の目的のために約190〜約440の波長
で行われ得る。しかし、好適な波長は約208〜約280であ
る。

さらに、Ａβパイロットを放射能標識し、そして濾液
および／またはペレットの１分あたりの化合物（CPM）
を測定することにより、このペプチドを検出し得る。本
発明において、好ましい放射能標識Ａβペプチドは³H−
Ａβである。本発明において使用され得る他の放射能標
識は、¹⁴Cおよび³⁵Sである。

逆に、非特異的タンパク質染色、例えば、クーマシー
ブルー（Bushら,J.Biol.Chem.269（16）:12152〜12158
（1994））、またはＡβアミロイドに特異的な抗体（例
えば、米国特許第5,231,000号、1993年７月27日発行、
を参照のこと）を用いて、反応中に形成されるＡβアミ
ロイドの形成を検出し得る。それ故、本発明の方法に従
って反応中のＡβアミロイド形成のレベルを測定するこ
とによって、候補となる試薬がＡβアミロイドの形成を
阻害するために効果的であるかを決定し得る。Ａβアミ
ロイドのレベルを、遠心分離後の可溶性もしくは沈澱画
分中、またはELISA（Suzukiの参照文献）による、もし
くはウエスタンブロットによる濾過後の濾中のＡβ量を
測定することにより定量し得る。

本発明の実施に用いられ得る少なくともＡβのアミノ
酸６〜28を含有するポリペプチドに結合し得る他の重金
属カチオンは、好ましくは、亜鉛、銅、または水銀の塩
化金属塩を含む。しかし、本発明の最も好ましい実施態
様は、塩化亜鉛を使用することである。

種々の反応混合物のpHは好ましくは中性付近である
（約7.4）。従って、このpHは、約6.8〜約８の範囲であ
り得、より好ましくは約７〜約7.8、そして最も好まし
くは約7.4であり得る。

本発明の方法に使用され得る緩衝液は、Tris−Clおよ
びTris−base、MOPS、HEPES、炭酸水素塩、Krebs、なら
びにTyrode'sを含むが、これらに限定されない。緩衝液
の濃度は、約10mM〜約500mMの間であり得る。しかし、
これらの緩衝液が亜鉛をキレート化することを考慮する
と、これらの緩衝液の濃度は、結果を危うくすることな
く可能な限り低く保つべきである。

本発明中で使用されるフィルターは、Ａβペプチドを
通過可能にする、例えば約0.2ミクロン〜約60ミクロン
の孔サイズを有し；好ましくは約0.2ミクロン〜約８ミ
クロン；そして最も好ましくは約0.2ミクロン〜約0.65
ミクロンである。本発明の好適な実施態様において、0.
2ミクロンフィルターが使用される。Ａβペプチドモノ
マーは、4.3kDaの分子量を有する。それ故、4.3kDaを越
える、例えば、4.4kDaの粒子を保持し得るフィルター
が、本発明を実施するために使用され得る。Ａβペプチ
ドおよびフラグメントは、ダイマーおよびポリマーを形
成し得る。本発明で用いられるＡβペプチドのサイズに
基づいて、当業者は、Ａβペプチドの通過を可能にし、
そして亜鉛で誘導されるＡβ凝集物のような重金属カチ
オンにより誘導される、大部分またはすべてのアミロイ
ドおよびＡβ凝集物の通過を妨げるような、適切な孔サ
イズを備えたフィルターを選択し得る。

さらに、任意のアミロイド−染色色素が本発明の方法
で用いられ、溶液中で亜鉛で誘導されるＡβ凝集物のよ
うな重金属カチオンにより誘導されるアミロイドおよび
Ａβ凝集物の沈着の測定を容易にし得る。このような色
素には、コンゴーレッド、ビフラビン（biflavin）Ｓお
よびビフラビンＴが挙げられるが、これに限定されな
い。このような色素の濃度は、約0.1％（w/v）〜約50％
（w/v）の範囲であり得る。事実、色素濃度の上限は、
溶液中の色素の溶解限度に制限される。

本発明は、Ａβペプチドをかなり低い濃度で、例え
ば、約0.1nM〜約3.7mM（すなわち溶解限界）で使用し得
る。本発明の好適な実施態様は、約0.8μＭの濃度（光
学密度により検出される最低のペプチド濃度）のＡβペ
プチドを用いる。以前に報告されている最低濃度（J.T.
Jarrettら、Biochem.32:4693−4697（1993））は、Ａβ
_1-40について20μＭおよびＡβ_1-42について２μＭであ
る。従って、本発明の利点は、かなり低い濃度のペプチ
ドを、本発明のアッセイの高感度に起因して使用し得る
ことである。

同様に、少なくともＡβのアミノ酸６〜28を含むポリ
ペプチドに結合し得るかなり低い濃度（例えば、約200n
Mから、重金属カチオンの溶解限界まで）の重金属カチ
オンが用いられ得る。最も好適な重金属カチオンである
亜鉛を、約300nMもの低濃度で本発明において使用し得
る。報告された使用最低濃度（P.W.Mantyhら、J.Neuroc
hem.61:1171（1993）は1mMであり、すなわち本発明で使
用され得る濃度よりも３桁大きい。当業者は、ルーチン
の実験だけで重金属カチオンの濃度を容易に最適化し得
る。

本発明は、約１℃〜約99℃の温度範囲で実施し得る。
好ましい温度範囲は、約４℃〜約40℃である。本発明の
実施に最も好ましい温度は約37℃、すなわちヒトの体温
である。

Ａβペプチドの凝集は、ほぼ瞬時の速さで起こる。そ
れ故、本発明の方法により、重金属とＡβペプチドとの
接触に際し結果が実質的に即座に得られ得る。しかし、
所望であれば、この反応は、より長く進行させ得る。本
発明の好ましい実施態様において、この反応は約30分間
行われる。

本発明はまた、実際の生理学的条件を厳密に模倣する
ために生物学的液体（例えば、CSF）の存在下で行われ
得る。この生物学的液体は、反応混合物に直接添加され
得、または数倍に希釈され得る。希釈は、約1:10,000〜
約1:1倍の範囲であり得る。本発明中における好ましい
生物学的液体、すなわちCSFは、直接用いられ、または
約1:1,000〜約1:5倍に希釈され得る。

本発明のアッセイは理想的にはキットの調製に適して
いる。このようなキットは、区分されて、その中に１つ
以上のコンテナ手段（バイアル、チューブなど）を密閉
して収容するキャリア手段を含み得、各々のコンテナ手
段は、本発明の方法で用いられるべきアッセイの別の分
離要素の１つを含む。例えば、本発明の方法に用いられ
る変化する量および／または所定濃度の試薬（例えば、
標準溶液、または任意の形態（溶液または乾燥）の重金
属カチオンの変化する量のキレート剤）を含むキャリア
手段に加えてさらに、Ａβペプチドまたは凍結乾燥Ａβ
ペプチドの標準溶液を含むコンテナ手段、および、標準
溶液、または任意の形態（すなわち、溶液または乾燥、
可溶性または不溶性）の、少なくともＡβペプチドのア
ミノ酸６〜28を含有するペプチドに結合し得る重金属カ
チオンの変化する量を含有するコンテナ手段が提供され
得る。Ａβペプチドの標準溶液は、好ましくは、約10μ
Ｍ以上の濃度を有し、より好ましくは約10μＭ〜25μＭ
であり、あるいはこのペプチドが凍結乾燥形態で提供さ
れる場合、緩衝水溶液または生理学的溶液を添加するこ
とにより上記濃度に溶解し得る量で提供される。重金属
カチオンの標準溶液は、好ましくは300nM以上の濃度で
あり、より好ましくは約25μＭの濃度である。分析物の
標準溶液を用いて、化合物がＡβアミロイド形成を阻害
するかを決定する本発明の方法に従って、比較のために
コントロールおよび試験反応混合物を調製し得る。

APPエクトドメイン（ectodomain）内の１つのZn²⁺結
合部位がすでに記載されている（Bushら、J.Biol.Chem.
268:16109−16112（1993））。APP上のさらなる亜鉛結
合部位の可能性を調査した。Ａβ_1-40構造は３つのヒス
チジンおよびいくつかの負荷電の残基を有し、Zn²⁺結合
を支持する構造的特色がある。これらの研究は、Ａβ
が、飽和および特異的様式で亜鉛を結合することを示
す。さらに、Zn²⁺の生理学的濃度が、タンパク質分解異
化に対するペプチドの抵抗性を増加し、そしてアルミノ
ケイ酸塩によるＡβ沈澱を促進することが示される。こ
れらの知見に基づいて、過剰の亜鉛濃度が、ADおよび関
連する発病状態において、Ａβ沈着を促進することが発
見された。

さらに、溶液中の合成ヒトＡβ_1-40の安定性に対する
亜鉛の生理学的濃度の影響を、比較のためにラット／マ
ウス種のペプチド（「ラットＡβ」）を用いて研究し
た。可溶性Ａβ_1-40はラット神経組織により産生される
が（C.HaassおよびD.J.Selkoe、私信）、Ａβアミロイ
ド沈着は、老齢ラットの脳の特徴ではない（D.W.Vaugha
nおよびA.Peters、J.Neuropathol.Exp.Neurol.40:472
（1981））。βアミロイド産生（β−amyloidogenesi
s）は、ヒトＡβ配列を有する他の老齢哺乳動物におい
て起こり、この配列はラットおよびマウス以外の報告さ
れたすべての動物種において強く保存されている（E.M.
Johnstone,M.O.Chaney,F.H.Norris,R.Pascual,S.P.Litt
le,Mol.Brain Res.10:299（1991））。ラット／マウス
Ａβ置換（５位、10位および13位のそれぞれ、Arg→Gl
y、Tyr→PheおよびHis→Arg［B.D.Shiversら、EMBO J.
7:1365（1988）］）は、アミロイド形成に対するその相
対免疫を、ペプチドに与える十分なペプチドの物理化学
的性質に特異的変化を引き起こすようである。ヒトＡβ
_1-40に結合する亜鉛は、ヒスチジンで仲介される；従っ
て、ラットＡβは、改変された亜鉛結合性質を示すと予
想され得る。

ラットＡβ_1-40に対する亜鉛の結合親和性を、実施例
１（図１）で記載されるような⁶⁵Zn競合アッセイ系で研
究し、ヒトＡβ_1-40に結合する亜鉛のK_Aを測定した。ヒ
トＡβ_1-40とは対照的に、ラットＡβ_1-40に結合する亜
鉛のスキャッチャード分析は、1:1の化学量論の１つの
結合会合（binding association）（K_A＝3.8μＭ）だけ
を示す（図５）。

濾過クロマトグラフィーにおけるヒトＡβ_1-40の回収
率が、一部、増加したＡβの粘着のために、亜鉛の存在
下で劇的に減少することが観察された。ヒトＡβ_1-40の
凝集がまた、亜鉛の存在下で高められるかを決定するた
めに、Zn²⁺（25μＭ）またはEDTAと共に、このペプチド
を、種々の濃度で30分間インキュベートし、次いで0.2
μフィルターを通して溶液を濾過した。亜鉛は、利用可
能なペプチドの80％までを、＞0.2μの粒子に凝集させ
た（図6A）（実際に濾過することなくフィルター装置中
でＡβ_1-40溶液をインキュベーションしたので、プラス
チックまたは膜表面へのペプチドの非特異性損失は示さ
れなかった）。ヒトＡβペプチド濃度と、25μＭのZn²⁺
中の濾過可能なペプチドの割合との間に、浅い負の対数
−直線（log−linear）関係が存在するようであるが、
試験される最低濃度（0.8μＭ）でさえ、70％を越える
ヒトＡβ_1-40溶液が凝集した。対照的に、ラットＡβ
_1-40に対するZn²⁺の効果は目立たず、0.8μＭのペプチ
ド溶液の凝集は同じ条件下で検出されず、そして４μＭ
溶液でわずか25％の凝集が検出された。その一方、EDTA
の存在下で、ヒトおよびラットＡβ_1-40溶液では、0.8
μＭで観察される検出可能な凝集がないので区別でき
ず、そしてより高いペプチド濃度で約15％の凝集があっ
た。

次いで、＞0.2μＡβ粒子の形成を、増加する亜鉛濃
度に対して滴定し（図6B）、そしてヒトＡβ_1-40（1.6
μＭ）について浅い応答曲線が、亜鉛濃度が300nM（高
親和性結合の飽和に相当する）に達するまで観察され
た。低親和性結合に相当する300nM以上の亜鉛濃度で
は、ヒトＡβ_1-40が劇的に凝集する。対照的に、ラット
Ａβ_1-40は10μＭまでの亜鉛の存在下で安定であり、そ
して25μＭの亜鉛でのみ凝集が観察された。

生理学的ペプチド濃度でＡβ_1-40に対する亜鉛の効果
を測定するために、分光法よりも感度の高いアッセイが
必要である。（緩衝液中、0.8μＭでヒトＡβ_1-40の１
は、214nmで0.090吸光度に相当する。より低い開始濃度
でのペプチドの凝集研究は、感度限界での測定を含み得
る）。従って、非標識ペプチドの存在下でトレーサーと
して用いられる¹²⁵I−ヒトＡβ_1-40に対する亜鉛の効果
が特徴づけられた。その非標識前駆体とは異なり、¹²⁵I
−Ａβ_1-40（1.6μＭの総ペプチドで）は、増加する亜
鉛の濃度の存在下で安定に保持され、¹²⁵I−Ａβ_1-40が
適切なトレーサーでないことを示した（図6B）。このト
レーサーは、ラットペプチドではフェニルアラニンであ
る、10位のチロシン残基上でヨード化されている。従っ
て、このチロシン残基はヒトペプチドの安定性に必須で
あり得る。これらのデータはまた、最近の報告（P.W.Ma
ntyhら、J.Neurochem.61:1171（1993））では、遠心分
離研究で、¹²⁵I−ヒトＡβ_1-40を沈澱させるために比較
的高濃度のZn²⁺（1mM）を必要とする理由を説明し得
る。図6Aの曲線に0.6nMを外挿すると、現在のところ、
生理学的Ａβ濃度（M.Shojiら、Science 258:126（199
2）:P.Seubertら、Nature 359:325（1992））に対する
亜鉛の効果の最良の評価を与え、そしてペプチドの25％
が、これらの条件下で、＞0.2μ粒子に凝集し得ること
を示す。このZn²⁺に対するヒトＡβ_1-40の特有のもろさ
は、Zn²⁺が、ただ１つ、等モルをベースにして試験され
た（Al³⁺を含む）いくつかの金属イオンの中で、この系
におけるヒトＡβ_1-40の有意な凝集を誘導するという観
察（図6C）により示される。

次いで、亜鉛で誘導されるヒトＡβ_1-40凝集物（図6
D）の会合（assembly）の速度論を調査した（１分未満
の時点測定を達成するために、サンプルを2500gで遠心
分離し、サンプル量を40秒で完全に濾過するように手順
を改変した）。得られたデータは、水中の保存Ａβ_1-40
（15.9μＭ、pH5.6）を、緩衝化生理食塩水（pH7.4）中
のZn²⁺（25μＭ）に添加した後、２相が２時間以上観察
され、ペプチド（1.6μＭ最終濃度）の濾過可能な粒子
への凝集がほぼ瞬時に起こることを示す。最初の相は急
速であり、約0.4μM/分の半−最大会合速度である。第
２の相の定常状態が約２分以内に達成されるとすぐに、
粒子の会合は、２時間以内では飽和の証拠なしに、3.2n
M/分の速度で進行する。この速度では、利用可能なペプ
チドは、開始から５時間以内に枯渇する。EDTA緩衝液の
添加は、1.6μＭのＡβ_1-40溶液の20％を＞0.2μ粒子へ
のほぼ瞬時の凝集を引き起こしたが、実験の時間経過に
わたってさらなる粒子会合は観察されなかった。対照的
に、ヒトＡβ_1-40（PBS中20μＭ、pH7.4）は、10日間安
定であることが報告されており（J.T.Jarrett、E.P.Ber
ger、P.T.Lansbury、Biochemistry 32:4693（199
3））、そしてこの溶液に、より多くのアミロイド産生
Ａβ種であるＡβ_1-40（２μＭ）を接種すると、４〜５
日後にだけ、半−最大であったこの溶液の凝集を誘導し
た。従って、本明細書中で提示される結果は、分泌され
たＡβ（Ａβ_1-40）の主要な種である野生型形態を用い
る、インビトロでのアミロイド形成を誘導する試みの中
で、大きな進歩を提示する。

亜鉛存在下で形成されたＡβ凝集物のサイズを推定す
るために、Ａβ_1-40（1.6μＭ）をZn²⁺（25μＭ）また
はEDTAと共にインキュベートし、次いで種々の孔サイズ
のフィルターを通過させた（図7aおよび図7b）。EDTA中
でインキュベーションした後、ヒトＡβ_1-40は、不均質
な粒子サイズの集団、＞0.1/μ:47％、＞0.22μ:40％、
＞0.65μ:32％に会合した。濾過されたラットＡβ_1-40
粒子の匹敵する割合は、＞0.1μ:36％、＞0.22μ:27
％、＞0.65μ:25％であった。Zn²⁺（25μＭ）とのイン
キュベーションに際し、＞0.65μラットペプチド粒子の
割合が、わずかに増加したに過ぎなかったが、＞0.65μ
ヒトペプチド粒子の割合は劇的に増加し、利用可能なペ
プチドの82％を利用した。興味深いことに、ヒトＡβ
_1-40から形成された＞0.1μ粒子および＞0.22μ粒子の
割合はまた、Zn²⁺とのインキュベーション後、それぞれ
50％および55％に増加したが、ラットペプチドから会合
したこれらの粒子の量では、同じ反応で、それぞれ20％
および30％だけの増加を誘導した。注目すべきことに、
Zn²⁺とインキュベートしたヒトＡβ_1-40のわずか４％
が、0.1μ濾過後の溶液に残存していた。まとめると、
これらのデータは、ヒト種のＡβ_1-40は、亜鉛で誘導さ
れる粒子形成の程度およびサイズの両方において、ラッ
ト種のＡβ_1-40とは異なることを示す。

これらの凝集物における亜鉛：ヒトＡβの化学量論は
少なくとも1:1（図7c）であるが、より小さい孔サイズ
（0.1μ）のフィルターを用いると、1.3:1に増加する。
なぜなら、高いおよび低い親和性Zn:Aβ結合についての
化学量論は、それぞれ約1:1および約2:1であり、これら
のデータは、＞0.65μＡβ凝集物の形成が、高親和性亜
鉛相互作用により仲介され、その一方低親和性亜鉛相互
作用は、より小さな凝集物（＜0.22μ）の形成に最も寄
与している可能性が大きいことを示す。興味深いこと
に、保持された凝集物をEDTAで洗浄する場合、複合体化
された亜鉛（トレーサーとして⁶⁵Znを用いる）は完全に
回収されたが（図7d）、このペプチドの22％だけが、＞
0.65凝集物から回収された。このことは、亜鉛で誘導さ
れるＡβ凝集が、キレート化により大部分不可逆的であ
ることを示す。EDTA処置により再可溶化される≦0.22μ
のペプチド量は７％以上であり、この量は、より小さ
な、キレート化−可逆的な、Ａβ粒子形成に対する、低
親和性の亜鉛結合の増加した寄与を反映し得る。

遠心分離による亜鉛誘導Ａβ粒子の沈澱により、染色
アミロイド形成の基準に合致する、コンゴーレッドで染
まり（図8a）、そして偏光下で緑の複屈折性を示す（図
8b）、ヒトＡβ_1-40の大量の沈澱が得られた。しかし、
同一条件下でのZn²⁺とのインキュベーション後、ラット
ペプチドは、最小の複屈折性を有して、有意により少な
くおよびより小さな粒子を形成した。10μＭ未満のZn²⁺
濃度で誘導されるラットＡβアミロイドは存在せず、そ
の一方、染色基準によっては、ヒトＡβアミロイドは、
３μＭもの低いZn²⁺濃度で誘導された。いずれの場合で
も、EDTA含有緩衝液とのインキュベーション後にコンゴ
ーレッド染色物質は検出されなかった。

まとめると、これらのデータは、生理学的亜鉛濃度の
存在下で、可溶性ヒトＡβ_1-40が、ラットＡβ_1-40より
も、アミロイドを形成する劇的により大きな傾向を有す
ることを示す。染色アミロイド凝集物は、しばしばAD脳
組織から精製された無定形アミロイドプラークコアと同
程度の大きさである（C.L.Mastersら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 82:4245（1985））。その一方、EDTAとのＡβ
_1-40のインキュベーション後に観察される小度合（10〜
20％）の＞0.2μＡβ_1-40粒子会合は、中性pH（S.Tomsk
iおよびR.M.Murphy,Arch.Biochem.Biophys.294:630（19
92））およびNaCl（C.Hilbich,B.Kisters−Woike,J.Ree
d,C.L.Masters,K.Beyreuther,J.Mol.Biol.218:149（199
1））の存在下で起こる比較的遅い凝集をおそらく反映
する。それ故、亜鉛で誘導されるアミロイド形成に対す
るヒトＡβの特有のもろさは、ADおよび関連する発病状
態の病理学的局面に対する有望な解釈である。

大脳皮質、および特に海馬は、体内で最も高濃度の亜
鉛を含み（C.J.Frederickson,M.A.Klitenick,W.I.Manto
n,J.B.Kirkpatrick,Brain Res.273:335（1983））、そ
して、例えばシナプス伝達の間（S.Y.AssafおよびS.H.C
hung,Nature 308:734（1984）;G.A.Howell,M.G.Welch,
C.J.Frederickson,Nature 308:736（1984））に、細胞
外亜鉛レベルの極端な変動（0.15〜300μＭ、C.J.Frede
rickson,Int.Rev.Neurobiol,31:145（1989））に曝され
る。皮質血管系は20μＭの管内亜鉛濃度を含むが（I.J.
T.Devies,M.Musa,T.L.Dormandy,J.Clin.Pathol.21:359
（1968））、脈管周囲の間隙の亜鉛濃度は0.15μＭであ
る（C.J.Frederickson,Int.Rev.Neurobiol.31:145（198
9））。両部位の高い亜鉛濃度勾配は、ADの病理学的病
変により厳しくおよび一貫して影響を受ける（B.T.Hyma
n,G.W.Van Hoesen,L.J.Kroner,A.R.Damasio,Ann.Neuro
l.20:472（1986）;G.G.GlennerおよびC.W.Wong,Bioche
m.Biophys.Res.Commun.120:885（1984））。興味深いこ
とに、ADにおける顕著な神経化学的欠損は、海馬のコリ
ン作動性の求心路遮断で起こり、これはこの領域の亜鉛
濃度を上昇させる（G.R.Stewart,C.J.Frederickson,G.
A.Howell,F.H.Gage,Brain Res.290:43（1984））。ADに
おける改変した大脳亜鉛代謝についてのさらなる証拠
は、減少した側頭葉の亜鉛レベル（D.Wenstrup,W.D.Ehm
ann,W.R.Markesbery,Brain Res.533:125（1990）;J.Con
stantinidis,Encephale 16:231（1990）;F.M.Corrigan,
G.P.Reynolds,N.I.Ward,Biometals 6:149（1993））、
上昇した（80％）CSFレベル（C.O.Hersheyら、Neurolog
y 33:1350（1983））、AD海馬における細胞外Zn²⁺−メ
タロプロテイナーゼ活性の増加（J.R.Backstrom,C.A.Mi
ller,Z.A.Tｋs,J.Neurochem.58:983（1992））、お
よび、星状膠細胞増殖阻害因子である、亜鉛をキレート
化するメタロチオネイン様タンパク質の減少したレベル
（Y.Uchida,K.Takio,K.Titani,Y.Ihara,M.Tomonaga,Neu
ron 7:337（1991））を含む。最近、臨床研究で、AD被
験体および同齢のコントロールにおける知覚および血漿
APPレベルに対する、経口亜鉛補給の効果がアッセイさ
れた（通常栄養補給物で見出される用量である推奨され
る１日の許容量の6.7倍）。５人の順次研究されたAD被
験体の各々は、亜鉛用量の摂取の48時間以内の知覚にお
いて、急速な衰退を経験した。同一条件下で、同齢のコ
ントロール被験体は、その用量により影響を受けないま
まであった。AD群の受けた神経生理学的測定の異常な変
化の中で、小−精神状態試験（Mini−Mental State Exa
mination）では、亜鉛補給の４日後、31％の低下を記録
した（M.F.Folstein,S.E.Folstein,P.R.McHugh,J.Psych
iatr.Res.12:189（1975））。これは、疾病の通常の経
過において、２〜４年後に予想されるだけの低下を示し
た（Galaskoら、JAGS 39:932（1991））。血漿APPレベ
ルもまた、ADおよびコントロール群の両方で、亜鉛に応
じて有意に増加した。すべての変化は、４日間の補給の
停止後、急速に回復した。まとめると、これらの報告
は、AD脳内の亜鉛の摂取または分配に異常が存在し得る
ことを示す。亜鉛代謝の浸透異常、および早発性ADの病
状がまた、ダウン症の共通の臨床的合併症である（C.Fr
anceschiら、J.Ment.Defic.Res.32:169（1988）;B.Rumb
leら、N.Engl.J.Med.320:1446（1989））。

本明細書中に表されたデータは、生理学的濃度の亜鉛
存在下の安定性により、アミロイドを形成するヒトおよ
びラットＡβ_1-40ペプチド種の傾向が明らかに区別され
ることを示す。染色ヒトＡβアミロイドの急速な誘導
が、生理学的に相当する条件下で、Ａβ_1-40凝集のため
に従前に達成された最低レベルよりも１桁以上低いペプ
チド濃度（１分未満での時点測定を達成するために、サ
ンプルを2500gで遠心分離し、40秒で完全に濾過される
サンプル量にするように手順が改変された）、および２
分以内のインキュベーションは、Ａβアミロイド症の研
究のための新規アッセイ系を確立する。さらに重要なこ
とに、これらの知見は、アルツハイマー関連の神経病発
生における亜鉛の可能な役割のために重要な示唆を有し
得る。

以下の実施例では、本発明の特定の好適な実施態様を
さらに記載するために例示によって提供され、特定しな
ければ、本発明を限定することを意図しない。

実施例 実験手順 特に示さない限り、以下の実験手順、材料、および試
薬を本発明に使用した。

試薬。亜鉛の混在を避けるためにとられた予備措置と
しては、分析グレード試薬、電気泳動用Tris−HCl（Bio
−Rad）、および光度の脱イオン水の使用を含めた。Ａ
β_1-17は、Biopolymers Laboratory、MITで合成され
た。Ａβ_40-1（逆ペプチド）をBachem（Torrance,CA）
から購入した。他の試薬はSigmaから購入した。Ａβ
_1-40およびＡβ_1-28合成物を、BachemおよびSigmaのペ
プチドから複製した。Ａβ_1-40合成物はまた、Yale Uni
versityのW.M.Keck Foundation Biotechnology Resourc
e Laboratoryによって合成されたペプチドでも複製可能
であった。⁶⁵ZnをAmersham Corp.より購入した。

⁶⁵Zn²⁺結合の研究。溶解ペプチド（1.2nM、特に記述
しない限り）を0.2μｍポリビニリデンジフルオリド膜
（Pierce Chemical Co.）上にドットブロットし、キレ
ート緩衝液（200μｌ×100mM NaCl、20mM Tris−HCl、1
mM EDTA、pH7.4）で２回洗浄し、次いでブロック緩衝液
（200μｌ×100mM NaCl、20mM Tris−HCl、1mM MnCl₂、
pH7.4）で５回洗浄し、そして⁶⁵Zn（特に記述しない限
り、130,000cpm、74mM ⁶⁵ZnCl₂を含むブロック緩衝液20
0μｌ±競合金属イオン塩化物）とともにインキュベー
ト（60分、20℃）した。次いで、ドットブロットをブロ
ック緩衝液（５×200μｌ）で洗浄し、ドットを切り出
し、テストチューブに入れ、そしてγ−計測（11％の有
効度）によりアッセイした。化学量論推定値についての
平衡容量を６×200μｌとみなした。非結合の透過物の2
14nmにおける紫外線吸光をアッセイし、フィルター上に
結合したペプチド残留物の全量を決定した。ペプチドス
トックの濃度をアミノ酸分析により確認した。pHを変え
るために、⁶⁵Znのインキュベーションを100mM緩衝液（M
OPS（pH6.5〜7.0）、MES（pH5.0〜6.0）、酢酸（pH3.5
〜4.5））の存在下で行った。ドットブロット装置を界
面活性剤およびEDTA（50mM）で洗浄し、次いで濯ぎ、そ
して使用の合間にシリコン化した。

Ａβクロマトグラフィー。Ａβ（55μｇ）を、100mM
NaCl、20mM Tris−HCl、pH7.4を含むシリコン化1.5ml容
プラスチック反応容器中で、金属塩溶液またはEDTAとと
もにインキュベートした。（「TBS」、100μｌ、１時
間、37℃）。Ａβを、水中で0.52mg/mlのアリコートで
−20℃で保存し、次いで溶解するときには４℃に保っ
た。試薬をボルテックスミキサーを使用せずに撹拌し
た。インキュベートしたＡβを、TBS中で20℃で、金属
塩溶液またはEDTA（50μＭ）であらかじめ平衡化された
G50 SF（Pharmacia、Uppsale、Sweden）カラム（Bio−R
ad Econo−Column、30×0.7cm）へ直接載せ、そして8ml
/hで溶出した（Wiz peristaltic pump、Isco、Lincol
n、NE）。吸光度を、254および214nmにおいて測定した
（Type 6 optical unit、Isco）。種々のピークで溶出
するＡβの量を、曲線より下の面積から推定した。この
ことは、これらの研究で用いられたＡβ希釈物の範囲に
わたって紫外線吸光の関係が直線的であることが決定さ
れたことにより可能で、吸光度は、ポリマー化状態に関
わらず、ペプチドの存在量に比例することを示す（以下
を参照のこと）。Ａβの最大の回収はEDTAの存在下で起
こる。サンプルを約15mlの容量で溶出したので、カラム
上のペプチドの平均濃度は0.8μＭであった。

クロマトグラフィーカラムへのＡβの吸着を阻止する
タンパク質の影響を研究するために、以前にＡβの挙動
について特徴付けられたSephadex G50 SFカラムを３％
ウシ血清アルブミン（BSA）を含むTBS（50ml）で溶出
し、そしてBSAを含まない緩衝液で平衡化し、続いてＡ
β実験を繰り返した。

スペクトルアッセイ。測定を、1cm透過長石英キュベ
ットを用いてHewlett−Packard 8452A二極管配列分光分
析器で行った。濃度に対する吸光度曲線を、214nm、254
nm、280nm、および全波長において行った。ペプチドの
検出において、214nmの読みとり値は254nmの読みとり値
と比較して50倍高い感受性であった。その一方、低マイ
クロモル濃度Ａβ溶液の280nmにおける読みとり値は感
受性限界よりも低く、これゆえに、これらの研究におい
て使用し得なかった。作成された標準曲線は、0.1mg/ml
より低い濃度では直線であった。さらに、吸光度に対す
るCu²⁺、Zn²⁺、EDTA、およびTBSの影響を試験した。0.1
mg/mlより低い濃度において、水中のペプチドのTBSへの
調製は15％の減少をもたらした。Cu²⁺、Zn²⁺、およびED
TAを含有するＡβ溶液で、214nm吸光曲線の直線範囲に
わたる人工的吸光度について研究した。1mM EDTAは60％
の減少をもたらし、これゆえ、50μM EDTAを用い、Cu²⁺
およびZn²⁺で観察される減少と同程度の減少の一因であ
る。

カオリン（珪酸アルミニウム）に結合するＡβ。カオ
リン懸濁液を高速液体クロマトグラフィー水（Fisher）
中で調製し、50％（v/v）に規定し、そして調製した。
Ａβ（40μｇ）を、シリコン化反応容器中で、カオリン
またはCu²⁺、Zn²⁺、もしくはEDTAを含むSephadex G50 S
F（10μｌ×50％（v/v））のいずれかとインキュベート
した（TBS中100μｌ、５分、室温）。次いで、懸濁液を
ペレット化（1500×ｇ、３分）し、上清を除去し、そし
て水で20倍希釈して紫外線吸光読みとり値を直線範囲内
に入れた。サンプルを、カオリンまたはSephadexとのイ
ンキュベーション前後に、214nmでアッセイした。

Ａβのトリプシン消化。Ａβ_1-40（13.9μｇ）をZn²⁺
とともにインキュベート（ブロック緩衝液中12μｌ、１
時間、37℃）し、次いでトリプシン（12ng、３時間、37
℃）で消化した。反応を、フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（1mM）を含有するSDSサンプル緩衝液の添加に
より停止し、サンプルを煮沸し（５分）、そしてサンプ
ルをTris/Tricineゲル電気泳動にかけ、そしてトランス
ファーした。ブロットをEDTAで洗浄し、クーマシー染色
し、⁶⁵Zn²⁺とともにインキュベートし、個々のバンドを
切り出し、⁶⁵Zn²⁺結合をアッセイし、そしてＮ末端配列
決定をして消化産物の同定を確実にした。トリプシン活
性に対するZn²⁺（TBS中で100μＭまで）自身の影響をＺ
−Arg−アミド−４−メチルクマリン（methylcoumari
n）（Sigma）蛍光切断産物アッセイによりアッセイし、
そして無視できるものとみなされた。しかし、200μM Z
n²⁺がトリプシン活性を12％阻害することが見出され
た。

実施例1:Aβに結合する⁶⁵Zn²⁺の分析 Ａβのアリコートを、異なる濃度の非標識Zn²⁺（全体
で0.01〜50μＭ）の存在下で⁶⁵Zn²⁺とともにインキュベ
ート（60分）した。固定化ペプチド（1.0nmol）に結合
する⁶⁵Zn²⁺の割合は、図1aに示される２つの結合曲線に
記載した（スキャッチャードプロット）。示された値は
平均±標準偏差、ｎ３である。高親和性結合曲線は、
低親和性成分を引くことにより補正されており、そして
低親和性曲線は高親和性成分を引いている。（図1b）
は、種々の金属に対して特異的なZn²⁺結合部位を表す。
Ａβを、⁶⁵Zn²⁺（157nM、138,000cpm）および競合非標
識金属イオン（全体で50μＭ）とともにインキュベート
（60分）した。（図1c）は、陰性コントロールタンパク
質（アプロチニン、インスリンα鎖、逆ペプチド40−
１）および陽性コントロールタンパク質（ウシ血清アル
ブミン（BSA））、ならびにＡβフラグメント（Ａβ配
列内の残基番号により同定される。gln11は残基11がグ
ルタミンのＡβ_1-28を言う）に結合する⁶⁵Zn²⁺（74nM、
104,000cpm）を表す。添加された⁶⁵Zn²⁺/分の全カウン
トの結合率は、膜に付着するペプチドの量（ナノモル
で）によって訂正されている。（図1d）は、図1aに関し
て、Ａβ_1-40の代わりにＡβ_1-28ペプチドを用いた場合
を表す。157nM ⁶⁵Zn（138,000cpm）が本実験で、固定化
ペプチド（1.6nmol）をプローブするために用いられ
る。（図1e）は、Ａβ_1-40に結合する⁶⁵Zn²⁺のpH依存性
を表す。

実施例2:G50ゲル濾過クロマトグラフィーを使用する、
Ａβポリマー化におけるZn²⁺および他の金属の影響 55μｇのＡβをカラムに載せ、そして15mlで溶出し、
254nmの吸光度をモニターしたｎ３の実験の結果が示
される。（図2a）は、50μM EDTA、0.4μM Zn²⁺;25μM
Zn²⁺;および25μM Cu²⁺の存在下でのＡβのクロマトグ
ラムを表す。分子量標準物の溶出点およびＡβピーク溶
出物の相対的な割り当てが示される。分子量標準物は、
ブルーデキストラン（２×10⁶kDa、V₀はボイド容積）、
BSA（66kDa）、カルボニックアンヒドラーゼ（29kD
a）、シトクロムＣ（12.4kDa）、およびアプロチニン
（6.5kDa）であった。Ａβの分子量は4.3kDaである。
（図2b）は、種々の金属イオン（25μＭ）、異なる濃度
のZn²⁺またはCu²⁺（Trisのキレート化の見込みは上限推
定値で示される）、およびEDTAの存在下で、モノマー、
ダイマー、またはポリマーとして溶出された可溶性Ａβ
の比較量（曲線の下の面積より推定した）を表す。銅の
存在下で行われた実験のデータは214nmの読みとり値よ
り得られ、そして比較のために校正された。図2cは、亜
鉛（25μＭ）、銅（25μＭ）、またはキレート剤の存在
下での、BSAによるクロマトグラフィーカラムのプレブ
ロックのＡβ種の収量に対する影響を表す。

実施例3:カオリン（珪酸アルミニウム）へのＡβ結合：
亜鉛（25μＭ）、銅（25μＭ）、およびEDTA（50μＭ）
の影響 （図3a）は、G50 Sephadex 10mgとインキュベートし
た後の上清中に残留するＡβの濃度（214nmの吸光度）
を表す。（図3b）は、カオリン10mgとインキュベートし
た後の上清中に残留するＡβの、開始吸光度の百分率と
して表される濃度（214nmの吸光度）を表す。

実施例4:トリプシン消化に耐性のＡβに対するZn²⁺の影
響 （図4a）は、亜鉛の濃度を増加して（標識レーン、μ
Ｍ）インキュベートした後の、クーマシーブルー染色さ
れたＡβ（13.9μｇ）のトリプシン消化物のブロットを
表す。3.6kDa（Ａβ_6-40）、および2.1kDa（Ａ
β_17-40）の消化産物、ならびに非消化Ａβ_1-40（4.3kD
a）を左側に示した。低分子サイズマーカー（STD）の移
動度を右側に示す（キロダルトン）。（図4b）は、Ａβ
のトリプシン消化産物に結合する⁶⁵Zn²⁺を表す。図4a中
のブロットを⁶⁵Zn²⁺とインキュベートし、目に見えるバ
ンドを切り出し、そしてそれぞれのバンドの結合カウン
トを測定した。これらのデータは、ｎ＝３の反復の実験
の代表値である。

Ａβが亜鉛と結合するか否かを決定するために、分泌
Ａβ_1-40の代わりである合成ペプチドを⁶⁵Zn²⁺とともに
インキュベートした。１時間で平衡に達した、迅速な結
合（１分で60％ B_max）が観察された。⁶⁵Zn²⁺結合のス
キャッチャード分析は、２つの飽和結合曲線（高親和性
曲線（K_a＜107nM）、および低親和性曲線（K_a＜5.2μ
Ｍ））を表す（図1a）。推定親和定数は、Tris緩衝液が
亜鉛に結合しないという仮定により校正され得る。実際
は、Tris−HClは亜鉛および銅と、それぞれ安定定数4.0
および2.6で結合する（Dawsonら、Data for Biochemica
l Research,Oxford University Press（1986））。より
高濃度のTris（150mMおよび500mM）の存在下でのＡβの
インキュベートは⁶⁵Zn²⁺のＡβへの結合を阻止し（それ
ぞれ約50％および約95％）、Tris誘発のZn²⁺キレート化
は無視し得ないことを示す。本発明者が算定した親和定
数は、それゆえ、上限推定値である。

⁶⁵Zn²⁺結合は非常に特異的であり、試験された非標識
金属イオンで唯一Zn²⁺が標識と競合し得る（図1b）。亜
鉛結合に関与するＡβの特異的領域を決定するため、お
よびドットブロット結合系を確証するために、Ａβ_1-40
フラグメントの代わりになる種々のペプチドおよびペプ
チドコントロールの等量を、⁶⁵Zn²⁺結合についてこの系
でアッセイした（図1cおよび図1d）。

逆配列（40−１）コントロールペプチドのみが、Ａβ
_1-40と比較して50％のB_maxで結合し（図1c）、亜鉛結合
が単に好適な残基の存在の結果でないことを示してい
る。Ａβ_1-28は30％B_maxで結合した。これは、カルボキ
シル末端が、亜鉛との結合の促進において重要な役割を
果たしていることを示している。Ａβ_1-28の11位のグル
タミンのグルタミン酸への置換（GlennerおよびWong、B
iochem.Biophys.Res.Commun.120:885−890（1984）によ
り報告されたダウン症候群に関するＡβ配列）は、⁶⁵Zn
²⁺の結合を妨害しない。Ａβ_1-28に結合する⁶⁵Zn²⁺のス
キャッチャードプロットは、Ａβ_1-40の場合と同様の低
親和性結合状態（K_a＜15μＭ）および高親和性結合状態
（K_a＜334nM）を表すが（図1d）、Ａβ_1-28ペプチド全
体がより低めの親和性で亜鉛と結合する。Ａβ_1-28ペプ
チドは明らかに亜鉛と結合するが、この領域（１〜17お
よび12〜28）に重複するペプチドは亜鉛と個々に結合し
ない。さらに、カルボキシル末端（25〜35）領域をカバ
ーするペプチドはまた、亜鉛と結合し得ない（図1c）。

スキャッチャードプロット（図1aおよびｄ）上のｘ軸
切片より導びかれた高親和性Zn²⁺の結合のＡβに対する
算定化学量は、0.7:1（Ａβ_1-40）および1:4（Ａ
β_1-28）である。低親和性結合の場合、Zn²⁺:Aβ比は、
2.5:1（Ａβ_1-40）および（Ａβ_1-28）である。

⁶⁵Zn²⁺の配列決定されたＡβのトリプシン消化産物と
の結合（図4b）は、６〜40フラグメントは亜鉛と結合す
るが、その他の見られる消化17〜40フラグメント（図4
b）（分泌酵素（Eschら、Science 248:1122−1124（199
0）;Sisodiaら、Science 248:492−495（1990））処理
後のカルボキシル末端産物を表す）は亜鉛と結合しない
ことを示す。Zn²⁺結合に対するヒスチジン（残基６、1
3、および14）の寄与が、低pHでの結合の低下により示
される（30％ B_max、pH6.0、図1e）。まとめて考慮する
と、これらのデータは、亜鉛配位は３つのヒスチジン残
基すべてを含む領域であり、残基６〜28の間の隣接配列
を必要とするが、最適な亜鉛結合はまた、カルボキシル
末端ドメインの存在を必要とすることを示す。

次に、ゲル濾過クロマトグラフィーでの移動によりア
ッセイされるように、亜鉛結合がＡβ構造に影響し得る
か否かを試験した。モノマー、ダイマー、およびポリマ
ー形態に対応すると考えられる主要なＡβ種が観察され
た（図2a）。0.4μＭと同程度に低い総Zn²⁺濃度は、EDT
Aおよび他の金属の存在下で得られた溶出プロフィール
と比較したときに、カラムより溶出する回収可能なＡβ
を減少させる（図2aおよび図2b）。全量25μＭのZn²⁺で
は、20％より低いＡβが溶出する。この損失は、明らか
にゲルに侵入しない高次のポリマーおよびダイマー種に
主に影響する。一方で、モノマーＡβの相対的な量が保
持される。いくつかの金属の系統的な評価は、クロマト
グラフィーにより回収可能なＡβの減少は、Zn²⁺に対し
て最も感受性であり、遷移金属であるCo²⁺、Ni²⁺、およ
びFe²⁺（25μＭ）に関しては、10μM Zn²⁺のみで得られ
た場合と同様のクロマトグラフィーにおける影響を示す
ことを示唆する（図2b）。他の遷移金属、重金属、およ
びAl³⁺（25μＭ）は、Ａβの可溶性に対して、全量３μ
ＭのZn²⁺の場合に匹敵する部分的影響を有する。一方、
40％より少ない全ペプチドが溶出すると考えられるが、
Ba²⁺、Ag²⁺、Mg²⁺、およびCa²⁺（25μＭ）は、EDTAプロ
フィールと比較してＡβに最少の影響を有している。Pb
²⁺（25μＭ）はモノマーペプチドの溶出を最も強く促進
して、高次ポリマーを阻止している：全収量は全量0.4
μＭのZn²⁺で得られた場合と同様である。これらの金属
イオンの影響を比較した場合に、再度重要なことは、先
に述べたTrisとは異なる金属イオンのキレート化の影響
を考慮することである。

Ａβのダイマー化において劇的な増加が、Cu²⁺（全量
25μＭ）で観察される。この金属はまた、214nmの吸光
度と比較して過大なＡβ吸光度（４倍）を254nmで誘導
し、そしてモノマー種にネガティブな読みとり値（図2
a）（214nmにおいては比例してポジティブである（図2
b））を引き起こす明白な蛍光発光を254nmで誘導する。
より高濃度のCu²⁺（全量80μＭ）は、Ａβの収量の増加
を促進し、これはこの系においてCu²⁺の存在が可溶性に
好ましいことを示している。

Ａβの可溶性に最も好ましい金属イオン（Mg²⁺、25μ
ＭおよびCu²⁺、全量25μＭ）を、全量25μＭのZn²⁺の存
在下で、可溶形態にあるＡβを安定化するそれらの能力
について試験した。これらの組み合わせは、Zn²⁺で誘導
されるＡβの収量の損失を奪回する、または悪化するこ
とのいずれもしない（図2b）。総体的に、これらのデー
タはZn²⁺結合はＡβの収量を減少するが、その一方キレ
ート剤がこの影響を減少させることを示唆する。

クロマトグラフィーの間に亜鉛で誘導されるＡβの損
失が、装置表面へのＡβの沈澱により生じるか否かを決
定するために、影響の阻止を試みた。吸着ブロッカーと
して３％のBSAで前処理したカラムは、カラムより回収
されるＡβの量を著しく増加し、これはペプチドがカラ
ム構成物上に沈澱することを示している（図2c）。カラ
ムをブロックすることにより、Zn²⁺（全量25μＭ）の存
在下ではＡβの回収量が200％増加し、Cu²⁺（全量25μ
Ｍ）の存在下では75％増加するが、EDTA（50μＭ）の存
在下では10％の増加のみである。このことは、カラム上
への沈澱が、亜鉛により最も特異的に促進されることを
確証する。

Ａβが沈澱していたカラムの部分を決定するために、
Ａβ溶液を種々のカラム成分とともにインキュベート
し、そして紫外線吸光によりインキュベートの前後のＡ
βの濃度についてアッセイした。クロマトグラフィー実
験条件を模倣し、Ａβ（平衡化緩衝液中に100μＭ）を
プラスチック反応容器中で１時間、Sephadexの存在下ま
たは非存在下でインキュベートした。プラスチックによ
る損失は、観察された沈澱の５％より少ない量であり、
シリコン化プラスチックでは１％より少なく、そしてSe
phadexに結合する量は１％よりも少ない。これにより、
Ａβの沈澱物は、Sephadexまたはプラスチック支持体に
は吸着していないと考えられる。しかし、ホウ珪酸ガラ
ス試験管においての同様のインキュベートでは20％が吸
着し、さらに亜鉛（25μＭ）の存在下で35％まで増加す
る。

Bio−Rad Econo Columnのガラスは、7740 Pyrex（Cor
ning,Park Ridge,IL）からなり、そしてSiO₂、80.6％;B
₂O₃、13.0％;Na₂O、4.0％；およびAl₂O₃、2.3％で構成
される。アルミノ珪酸塩がβアミロイド沈澱物と会合す
るという報告（Mastersら、EMBO J.4:2757−2763（1985
a）;Candyら、Lancet 1:354−357（1986））により、Ａ
βが珪酸アルミニウムに結合するか否かを試験する実験
を行った。急速かつ大量のＡβのカオリンへの結合、お
よび不溶性珪酸アルミニウム水和物が観察された。さら
に、亜鉛、銅、またはEDTAの存在下でのＡβ（0.4mg/m
l）のSephadex（５％、v/v）とのインキュベーション
は、溶解性にわずかな変化をもたらすのみであり、これ
は反応容器内のプラスチックへの結合が原因であり得る
（図3a）。Ａβ（0.4mg/ml）のカオリン（５％、v/v、
５分、室温）とのインキュベーションは、存在するペプ
チドの87％までの沈澱をもたらす。この沈澱は亜鉛（25
μＭ）の存在下で最大であり、亜鉛インキュベーション
上清から回収されるＡβの量は、EDTAインキュベーショ
ン上清から回収される量のほぼ半分である（図3a）。カ
オリンで誘導されるＡβ沈澱への銅（25μＭ）の影響
は、EDTAの影響と同様である（図3a）。Ａβのカオリン
への結合は、その後の10mM EDTAでの処置に対して可逆
的でないが、2M NaOHにより溶出され得る。

亜鉛が、カオリンの非存在下で、Ａβの非可逆的な沈
澱を誘導するか否かをさらに試験するために、Zn²⁺とと
もにインキュベートされた（200μＭ、１〜24時間、20
℃）Ａβを、SDS Tris/Tricineゲル電気泳動にかけた。
モノマー種は、クーマシー染色ゲル上で検出される主要
なバンドであり、そしてインキュベートしていないＡβ
と同様に移動した。このことは、亜鉛が、共役性または
SDS耐性のＡβのポリマー形態化をもたらさないことを
示している。

ＡβのAPP分泌酵素部位Lys−16位（Eschら、Science
248:1122−1124（1990）;Sisodiaら、Science 248:492
−495（1990））は必須亜鉛結合領域内にあることか
ら、亜鉛により影響されない活性が見出されたセリンプ
ロテアーゼであるトリプシンによる分泌酵素型切断から
Ａβを保護するZn²⁺の能力を、次に試験した。SDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に続いてポリビニリデンジ
フルオリド膜に移されたＡβのトリプシン消化産物のア
ミノ末端配列は、残基６〜40および17〜40に対応する２
つの検出可能なフラグメントを示した（図4a）。残基29
〜40を表す予測されたトリプシン消化切断産物はブロッ
ト上に出現せず、そして移動および処置の間にポリビニ
リデンジフルオリド膜により保持され得ない。消化は、
増加する濃度のZn²⁺の存在により阻害される。200μＭ
では、Zn²⁺はＡβの加水分解の完全な阻害をもたらす；
しかし、この亜鉛レベルでは、トリプシン活性もまたわ
ずかに阻害される。⁶⁵Zn²⁺でブロットをプローブする工
程は、ペプチドフラグメントの亜鉛結合同一性を確実に
し、そして亜鉛結合部位の加水分解の定量を容易にした
（図4b）。Ａβ_1-40およびＡβ_6-40フラグメントの消化
率は、亜鉛の存在により阻害される。しかし、Ａβ
_17-40フラグメントの消化は、増加する亜鉛濃度により
阻害されない。これにより、Ａβの完全な亜鉛結合ドメ
イン（残基６〜28）を有するペプチドのみ、そしてそれ
ゆえZn²⁺に結合し得るペプチド（図4b）のみが、この実
験において、亜鉛により阻害される消化率を有する。こ
れらのデータは、Ａβの分泌酵素型切断がＡβ基質に結
合するZn²⁺により阻害され得ることを示す。

上記のデータは、可溶性Ａβ_1-40が高親和性および低
親和性亜鉛結合親和力を有することを示す。Ａβ上の亜
鉛結合部位は残基６〜28にマップされ、おそらく構造的
な、およびヒスチジン依存性の特性を有する。亜鉛結合
の親和定数は、両方の結合会合が生理学的亜鉛濃度範囲
内にあることを示すが、低親和性結合部位の占有が珪酸
アルミニウム（カオリン）によるＡβの促進された沈澱
に関連し得ることを示す。高親和性部位の占有は、Ａβ
の沈澱にほとんど影響しないようであり、そして非常に
高い特異性である。しかしデータは、Ａβ上の他の部位
における代替金属に特異的な結合部位の可能性を排除し
得ない。銅のＡβとの強い構造的相互作用（ダイマー化
および蛍光発光）は、銅がまた直接ペプチドと相互作用
し得、そして珪酸アルミニウム上のＡβの沈澱を防ぐ役
割を有し得ることを示す。

細胞外の亜鉛は、APPの細胞外マトリクスエレメント
への接着性を改変することにより、APP機能の生理学に
おいて役割を果たし得る（Bushら、J.Biol.Chem.268:16
109−16112（1993））。これは、APPが、細胞接着（Shi
versら、EMBO J.7:1365−1370（1988））および神経突
起伸長（Milwardら、Neuron 9:129−137（1992））にお
いて役割を果たし得ることから重要である。Ａβ−亜鉛
相互作用の生理学的機能は不明瞭さが残るが、しかし、
亜鉛の存在下で、Ａβのタンパク質分解切断に対して増
加した耐性は、ペプチドの生物学的半減期を延長し、そ
して増加した接着性がまた、細胞外マトリクスエレメン
トへのその結合を促進し得る。細胞外マトリクスにおい
てラミニンおよびフィブロネクチンと複合体化すること
により、Ａβが神経突起伸長を促進することが最近報告
されている（Kooら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4748
−4752（1993））。これにより、APPおよびＡβの両方
が、細胞接着を調整するために細胞外マトリクスと相互
作用し得る。亜鉛がこの相互作用を調整する局所環境コ
ファクターである可能性をさらに調査する価値がある。

APPは血小板および脳において大量に存在し（Bush
ら、J.Biol.Chem.265:15977−15983（1990））、そこで
は亜鉛はまた高度に濃縮されている（Bakerら、Thromb.
Haemostasis 39:360−365（1978）;Frederickson,C.
J.、Int.Rev.Neurobiol.31:145−328（1989））。APPは
これら両方の組織の小胞体中で濃縮されており（Bush
ら、J.Biol.Chem.265:15977−15983（1990）;Schubert
ら、Brain Res.563:184−194（1991））、亜鉛は活発に
摂取され（Wolfら、Neurosci.Lett.51:277−280（198
4））、そして終脳各所の神経末端のシナプス小胞中に
蓄積されている（Perez−ClausellおよびDanscher、Bra
in Res.3371:91−98（1985））が、これらの小胞におい
てAPPと亜鉛との同時局在化はまだ示されていない。小
胞の亜鉛蓄積は、不溶性の小胞内沈澱物であるNGFおよ
びインスリンのような機能性分子を安定化する役割を果
たすと考えられる（Fredericksonら、J.Histochem.Cyto
chem.35:579−583（1987））。亜鉛は、同様に、APPお
よびＡβを安定化する役割を果たし得る。

Ａβと亜鉛との間の相互作用は、亜鉛結合特性がよく
特徴付けられているペプチドであるインスリンとの相互
作用と比較され得る。Ａβのように、インスリンは、ヒ
スチジン依存性の高親和性亜鉛結合（K_a＝５μＭ）およ
び低親和性亜鉛結合（K_a＝140μＭ）を、それぞれ、化
学量論的に1:1（インスリン：亜鉛）および1:2で示す
（GoldmanおよびCarpenter、Biochemistry 13:4566−45
74（1974））。さらに、金属を含有しないインスリン
は、pH依存性の、モノマー、ダイマー、テトラマー、ヘ
キサマー、およびより高い凝集状態からなるポリマー化
パターンを動力学的平衡において示す。中性pHでは、亜
鉛および他の２価金属イオンは、平衡をより高い凝集状
態へシフトする。Zn²⁺:インスリンの化学量論的な比が
0.33を超える場合、ペプチドは沈澱し（Fredericq,E.、
Arch.Biochem.Biophys.65:218−228（1956））、連想さ
せる亜鉛のＡβに対する影響が本研究において観察され
た。

Ａβは、ニューロン培養物における亜鉛の神経毒性作
用の報告（Yanknerら、Science 250:279−282（1990）;
Kohら、Brain Res.533:315−320（1990））が亜鉛の恒
常性の妨害により説明され得たような高親和性で亜鉛と
キレート化する。Ａβは一貫して海馬に最も蓄積し、こ
こでは亜鉛濃度の極端な変動（0.15〜300μＭ）（Frede
rickson,C.J.、Int.Rev.Neurobiol.31:145−328（198
9））が、例えば、シナプス伝達の間に生じる（Assafお
よびChung、Nature 308:734−736（1984）;Howellら、N
ature 308:736−738（1984）;XieおよびSmart、Nature
349:521−524（1991））。Choiおよび共同研究者（Weis
sら、Nature 338:212（1989））は、この亜鉛のシナプ
スを経由する移動は正常なシグナル機能を有し得、そし
て長期間の相乗作用に関与し得ることを提唱している。
海馬は、両方が最高の亜鉛濃度を含む脳の領域であり
（Fredericksonら、Brain Res.273:335−339（198
3））、そしてアルツハイマー病の病的損傷により最も
激しくかつ一貫して影響される（Hymanら、Ann.Naurol.
20:472−481（1986））。アルツハイマー病の顕著な神
経化学的欠失の１つは、海馬のコリン作用性求心路の遮
断である。これにより、この領域の亜鉛濃度を上昇させ
ることが示されている（Stewartら、Brain Res.290:43
−51（1984））。

珪酸アルミニウム（カオリン）による急速な亜鉛促進
性のＡβ沈澱は著しく、これはADにおける病因因子とし
てのアルミニウムの候補資格によるからである（Perlお
よびBrody、Science 208:297−299（1980））。ＡβのZ
n²⁺ならびにAl³⁺誘導沈降（Mantyhら、J.Neurochem.61:
1171−1174（1993））、およびアルミノ珪酸塩によるＡ
β沈澱核形成（Candyら、Biochem.Soc.Trans.21:53S
（要約）（1992））の最近の報告はまた、これらの観察
を支持する。

ADにおける改変された亜鉛代謝の証拠は以下を包含す
る；一次的な脳葉の亜鉛レベルの減少（Wenstrupら、Br
ain Res.533:125−131（1990）;Constantinidis、Encep
hale 16:231−239（1990）;Corriganら、Biometals 6:1
49−154（1993））、脳脊髄液レベルの上昇（80％）（H
ersheyら、Neurology 33:1350−1353（1983））、メタ
ロチオネインに結合される亜鉛の減少に付随する肝臓の
亜鉛の増加（Luiら、J.Am.Geriatr.Soc.38:633−639（1
990））、AD血漿におけるZn²⁺で改変されたAPP異常（Bu
shら、Ann.Neurol.32:57−65（1992））、AD海馬におけ
る細胞外Zn²⁺金属タンパク質分解酵素活性の増加（Back
stromら、J.Neurochem.58:983−992（1992））、および
亜鉛をキレート化するメタロチオネイン様タンパク質で
ある、星状細胞増殖阻害因子レベルの減少（Uchidaら、
Neuron 7:337−347（1991））。集約的には、これらの
報告は、亜鉛の摂取または分配の異常がAD脳において存
在し、脳内で細胞外高濃度および細胞内低濃度を引き起
こし得ることを示す。その一方、環境的に誘導される亜
鉛（Duncanら、J.Neurosci.12:1523−1537（1992））お
よびアルミニウム（Garrutoら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 81:1875−1879（1984）;Perlら、Science 217:1053−
1055（1982））の両方の脳内濃度の上昇は、神経腺維の
もつれによりまた特徴付けられる病気であるグアマニア
ン筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン痴呆症候群の病因
と関連している（Guiroyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4:2073−2077（1987））。興味深いことに、免疫学的に
および内分泌機能不全により表される亜鉛代謝の全面的
に広がる異常が、初老期のＡβ沈着およびアルツハイマ
ー病の一定の発症により特徴付けられる症状（Rumble
ら、N.Engl.J.Med.320:1446−1452（1989））であるダ
ウン症候群（Franceschiら、J.Ment.Defic.Res.32:169
−181（1988）;Bjorkstenら、Acta.Pediatr.Scand.69:1
83−187（1980））の一般の合併症として記載されてい
る。

これらの結果は、異常に高い亜鉛濃度が、分泌酵素型
切断に対するＡβ耐性を増加し、そしてまたアルミノ珪
酸塩上へのＡβ沈澱を促進することを示す。神経網にお
ける亜鉛誘導性のＡβの蓄積は、次に、グリア炎症応
答、フリーラジカル攻撃、および最終的に「成熟」アミ
ロイドを形成するための酸化的架橋をもたらし得る。集
約的には、これらの知見は、アルツハイマー病の治療に
おけるキレート化アプローチの生化学的合理性を支持す
る（Crapper McLachianら、Lancet 337:1304−1308（19
91））。なぜなら、アルミニウムおよび亜鉛両者の脳内
濃度の減少はＡβの沈澱を潜在的に減速し得たからであ
る。

実施例5:ラットＡβ_1-40に結合する⁶⁵Znのスキャッチャ
ード分析 溶解ペプチド（1.2nmol）を0.20μPVDF膜（Pierce）
上にドットブロットし、そして実施例１に記載のような
競合分析を行い、ヒトＡβ_1-40に結合する亜鉛のK_Aを測
定した（図１）。

本発明において、ラットＡβ_1-40およびヒトＡβ_1-40
を固層Fmoc化学により合成した。逆相HPLCによる精製お
よびアミノ酸配列決定により合成を確認した。表にされ
た結果を図５に示す。回帰線は3.8μＭのK_Aを示す。結
合の化学量論は1:1である。スキャッチャード曲線のデ
ータの点はわずかに二相の曲線を示唆するが、二相の反
復は会合定数２および９μＭを生じ、これは、生理学的
に分離した結合部位の説明を正当化しない。

実施例6:ヒト、¹²⁵I−ヒトおよびラットＡβ_1-40の0.2
μより大きい粒子への凝集に対する亜鉛の影響 ヒトおよびラットＡβ_1-40ペプチドストック水溶液
（16μＭ）を予め濾過し（Spin−Ｘ、Costar、0.2μ酢
酸セルロース、700g）、100mM NaCl、20mM Tris−HCl、
pH7.4（緩衝液１）±EDTA（50μＭ）または塩化金属塩
へ移し、インキュベートし（30分、37℃）、そして再度
濾過した（700g、４分）。濾液中のＡβ_1-40画分を、濾
液OD₂₁₄の、濾過していないサンプルのOD₂₁₄に対する比
率により算出した（OD₂₁₄の応答を、ヒトおよびラット
Ａβ_1-40濃度に対して滴定し（本実験で使用した緩衝液
中20μＭまで）直線であることが決定された）。結果を
図６で表に示した。すべてのデータは、示さない限り、
３連による。（図6a）Ａβ_1-40の割合、±Zn²⁺（25μ
Ｍ）またはEDTA（50μＭ）とインキュベートし、次いで
0.2μで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定した。（図6
b）0.2μ濾過し、Zn²⁺濃度に対して滴定したＡβ
_1-40（1.6μＭ）の割合。¹²⁵I−ヒトＡβ_1-40（¹²⁵I−
ヒトＡβ_1-40をJ.E.Maggio、PNAS USA 89:5462−5466
（1992）の方法に従って調製した（15,000CPM、John Ma
ggio博士、Harvard Medical Schoolの好意的な提供））
を、非標識Ａβ_1-40（1.6μＭ）にトレーサーとして添
加し、インキュベートし、そして上記のように濾過し
た。濾液中および摘出したフィルター上に保持されるCP
Mをγカウンターにより測定した。（図6c）種々の金属
イオン（３μＭ）とともにインキュベートした後に0.2
μフィルターで濾過したＡβ_1-40（1.6μＭ）の割合。
金属種の原子番号を示す。（図6d）0.2μ濾過により測
定されたヒトＡβ_1-40凝集の動力学におけるZn²⁺（25μ
Ｍ）またはEDTA（50μＭ）の影響。データの点は２連に
よる。

実施例7:亜鉛誘導性Ａβ凝集物のサイズの推定 （図7aおよび図7b）Ａβ_1-40（緩衝液１（100mM NaC
l、20mM Tris−HCl、pH7.4）中に1.6μＭ）の割合は、
±Zn²⁺（25μＭ）またはEDTA（50μＭ）とインキュベー
トし、次いで、示された孔サイズのフィルターで濾過し
た。（Duraporeフィルター（Ultrafree−MC,Millipor
e）を本実験で使用した。従って、図２で0.2μ Costar
フィルターを使用して得られた値と比較して本実験で0.
22μフィルターで得られた値との間にはわずかに不一致
が存在する）。（図7c）⁶⁵ZnCl₂（130,000CPM、74nM）
を、図3Aで産生された亜鉛誘導性ヒトＡβ_1-40凝集物集
合体のトレーサーとして使用した。濾液中のＡβ_1-40お
よび⁶⁵Znの量の測定により、フィルターにより阻止され
た量を決定し得、そして亜鉛:Aβ集合体の化学量論的な
量を推定した。（図7d）この手順に続き、亜鉛:Aβ集合
体を保持するフィルターを緩衝液１（100mM NaCl、20mM
Tris−HCl、pH7.4）＋EDTA（50μＭ×300μｌ、700g、
４分）で洗浄した。濾過画分中の再溶解された亜鉛沈澱
Ａβ_1-40の量をOD₂₁₄により測定し、当初各フィルター
に保持された量の百分率として示した。濾液中に放出さ
れる⁶⁵Znをγカウントにより測定した。

実施例8:亜鉛誘導性着色アミロイド形成 （図8a）Congo Redで染色された亜鉛誘導性ヒトＡβ
_1-40沈澱物を示す。粒子の直径は40μである。Ａβ_1-40
（200μｌ×25μＭ、緩衝液１（100mM NaCl、20mM Tris
−HCl、pH7.4）中）を、25μM Zn²⁺の存在下でインキュ
ベートした（30分、37℃）。次いで、混合物を遠心分離
し（16,000g×15分）、ペレットを緩衝液１（100mM NaC
l、20mM Tris−HCl、pH7.4）＋EDTA（50μＭ）で洗浄
し、再度ペレット化し、そしてコンゴーレッド（50％エ
タノール中に１％、５分）中に最懸濁した。非結合色素
を除去し、ペレットを緩衝液１（100mM NaCl、20mM Tri
s−HCl、pH7.4）で洗浄し、そして顕微鏡観察用にマウ
ントした。（図8b）同凝集物を、緑色複屈折を示す偏光
下で可視化した。この実験はEDTA（50μＭ）をZn²⁺に置
換して繰り返したが、目に見える物質は生じなかった。

実施例9:ヒト、¹²⁵I−ヒトおよびラットＡβ_1-40の0.2
μより大きい粒子への凝集における亜鉛および銅の影響 ヒトおよびラットＡβ_1-40ペプチドストック水溶液
（16μＭ）を予め濾過し（Spin−Ｘ、Costar、0.2μ酢
酸セルロース、700g）、100mM NaCl、20mM Tris−HCl、
pH7.4（緩衝液１）±EDTA（50μＭ）または塩化金属塩
へ移し、インキュベートし（30分、37℃）、そして再度
濾過した（700g、４分）。濾液中のＡβ_1-40画分を、濾
液OD₂₁₄の、濾過していないサンプルのOD₂₁₄に対する割
合により算出した（OD₂₁₄の応答を、ヒトおよびラット
Ａβ_1-40濃度に対して滴定し（本実験で使用した緩衝液
中20μＭまで）直線であることが決定された）。すべて
のデータ点は、示されていない限り３連による。（図
９）Ａβ_1-40の割合を示すグラフ、±Zn²⁺（25μＭ）、
Cu²⁺またはEDTA（50μＭ）でインキュベートし、次いで
0.2μフィルターで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定
した。

実施例10:細胞培養で産生されるＡβにおける亜鉛の影
響 ヒトAPPを発現する、好ましくは過剰発現する、細胞
培養、好ましくは哺乳動物細胞培養が、当該分野で周知
の方法に従って確立されている。例えば、N.Suzukiら、
Science 264:1336−1340（1994）;X−D Caiら、Science
259:514−516（1993）;F.S.Eschら、Science 248:1122
−1124（1990）。次に、亜鉛を、最終濃度が約200nM〜
約５μＭになるように培養培地に添加する。次いで、亜
鉛を含む細胞培養物を、約15分からそれらが培養物中で
生存し得る限りインキュベートする。好ましくは、細胞
を３〜４日間培養する。新鮮な培地を培養物に添加し得
るが、アミロイドまたは亜鉛誘導性Ａβ凝集物を含めた
消費培地は除去すべきではない。

使用され得る培地は等張性または生理学的培地であ
り、生理学的pH（約7.4）である。好ましくは、タイロ
ード緩衝液をカルシウム、マグネシウム、およびカリウ
ム、ならびにグルコースとともに使用する。いかなる使
用培地もシステイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、
およびヒスチジンを欠失しなければならない。なぜな
ら、これらのアミノ酸は亜鉛とキレート化するからであ
る。基本的には、亜鉛とキレート化する成分を最少にす
る任意の等張緩衝液または生理学的培地を使用し得る。
例えば、クレブス哺乳動物リンゲル溶液（in Data for
Biochemical Research、第３版、Dawsonら、Oxford Sci
ence Publications、446頁、N.Y.1986）および平衡塩溶
液（Balanced Salt Solutions）（同447頁）は、種々の
有用な培地を調製する処方を提供する。除去すべき組成
物は血清および上述の４つのアミノ酸である。

細胞培養物は、約37℃で、大気またはO₂/CO₂（CO₂の
最大濃度は５％）とともにインキュベートされるべきで
ある。

次に、脂肪および培地をともに回収する。Triton（濃
度約１〜２％v:v）のような界面活性剤を添加し、そし
て混合物を約３分から一晩インキュベートする。しか
し、好ましくは、約１〜２時間インキュベートする。

インキュベーション後、細胞の残骸ならびにアミロイ
ドおよび亜鉛誘導性Ａβ凝集物を、遠心分離によりペレ
ット化する。ペレットをペプシン（約２％）または他の
任意のペプチダーゼに懸濁し、そして細胞残骸の消化を
可能にするために約１時間から一晩インキュベートし
た。

再度、ペレット化し、PBSまたは他の任意の適切な塩
溶液で洗浄し、Congo Redで染色し、再度洗浄し、非結
合Congo Redを除去するためにペレット化し、そして水
溶液に最懸濁する。この時点で、サンプルは顕微鏡で視
覚的に観察され得る。さらに、それはグリッドを使用し
て計測され得る。

実施例11:細胞培養物における候補となる試薬の有効性
を予測するためのアッセイ アッセイは、実施例10に記載されるように、２連で設
定される。しかし、候補となる試薬を２つの細胞培養物
の１つに添加し、そしてEDTAを他の細胞培養物に添加し
た。実施例10の最後の工程後、アミロイドおよび亜鉛誘
導性Ａβ凝集物の量を顕微鏡下で比較する。候補となる
試薬の影響の見込みおよびレベルを、細胞培養物中のア
ミロイドおよび亜鉛誘導性Ａβ凝集物形成の減少の程度
に基づき評価する。

実施例12:生物学的液体におけるＡβアミロイドの形成
を検出する迅速アッセイ 脳脊髄液（CSF）を健康なヒト被験体（コントロー
ル）およびアミロイド症を患うと考えられるヒト患者よ
り得る。両方のCSFサンプルを系列希釈物により滴定す
る。例えば、原液、1:2、1:4、1:6、…；希釈物は、1:1
0,000まで作製され得る。

それぞれのサンプルに水中の等量のＡβペプチドを最
終濃度が約10μＭを超えるまで添加する。好ましくは、
約10μＭ〜約25μＭである。

次に、ペプチド（少なくともＡβのアミノ酸６〜28を
含む）との結合が可能な重金属カチオンを含む溶液、好
ましくは、Zn²⁺＋NaClおよび緩衝液、例えば、Tris（pH
7.4）を、最終（final）重金属カチオン（例えば、Z
n²⁺）に最終濃度が約300nMを超えるまで添加する。好ま
しくは、25μＭである。

次いで、サンプルを遠心分離しペレットを形成する。
ペレットをアミロイド染色色素（例えば、Congo Red）
で染色し、そして顕微鏡下で観察する。それにより、コ
ントロールとアミロイド症患者由来のサンプルとのＡβ
アミロイドレベルを比較する。アミロイドの定量が所望
される場合、グリッドを使用し得る。

実施例13:³H−Ａβを使用する生物学的液体中のＡβア
ミロイド形成を検出する迅速アッセイ アッセイを実施例12で説明されるように設定する。た
だし、添加されるＡβペプチドをあらかじめトリチウム
により標識する。さらに、遠心分離後、ペレットをシン
チレーションカウンターで計測する。

しかし、アミロイドの検出に好適な方法は、遠心分離
の代わりに上記のような濾過手法を使用することによ
る。サンプルをフィルターを通して濾過した後、フィル
ターをシンチレーション液に添加し、そしてカウントを
測定する。

コントロールサンプル由来のCPMとアミロイド症と考
えられる患者のサンプル由来のCPMとの比較から、患者
が実際にアミロイド症を患うか否かを決定し得る。即
ち、コントロールサンプルと比較して患者のサンプルの
増加したCPM測定値が、アミロイド症を示す。

これまで本発明を十分に記載してきたが、本発明また
は本発明の任意の実施態様の範囲を逸脱することなく、
等価の操作様式ならびに他のパラメーターの広汎な範囲
内で本発明を実施し得ることが当業者に理解される。

本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は、
その全体が本明細書中で参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/66 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 33/00 33/00 33/06 33/06 33/34 ＡＥＤ 33/34 ＡＥＤ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 ブッシュ， アシュレー アイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02114， ボストン，ウィッティアー プレイス ８， アパートメント ３ケ イ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/566 C12N 5/06 G01N 33/15 G01N 33/50 G01N 33/53 A61K 31/66 A61K 33/00 A61K 33/06 A61K 33/34 C12P 21/00

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物学的液体中のＡβアミロイド形成を検
   出するための迅速な分析方法であって、以下の工程： （ａ）コントロールのヒト被験体由来の生の生物学的液
   体を含む第１のセットの反応混合物、および水性緩衝液
   または生理学的溶液中に作製した該反応混合物の系列希
   釈物を調製する工程； （ｂ）アミロイド症の疑いがあるヒト患者由来の生の生
   物学的液体を含む第２のセットの反応混合物、および水
   性緩衝液または生理学的溶液中に作製した該反応混合物
   の系列希釈物を調製する工程； （ｃ）各系列希釈サンプルに、少なくともＡβのアミノ
   酸６〜28を含有する等量のＡβペプチドを添加する工
   程； （ｄ）第１および第２のセットの各反応混合物と、少な
   くともＡβのアミノ酸６〜28を含有するＡβペプチドに
   結合し得る300nM以上の重金属カチオンとを接触させる
   工程； （ｅ）第１および第２のセットの各反応混合物を遠心分
   離し、第１および第２のセットのペレットをそれぞれ提
   供する工程；および （ｆ）第１および第２のセットのペレット中のアミロイ
   ド量を比較し、それによりアミロイド症の疑いがあるヒ
   ト患者由来の生物学的液体中の過剰なＡβアミロイド形
   成を検出する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】生物学的液体中のＡβアミロイド形成を検
   出するための迅速な分析方法であって、該生物学的液体
   がCSFである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】生物学的液体中のＡβアミロイド形成を検
   出するための迅速な分析方法であって、工程（ｃ）にお
   いて、少なくともＡβのアミノ酸６〜28を含有するＡβ
   ペプチドに結合し得る前記重金属カチオンが亜鉛であ
   る、請求項２に記載の方法。