JPS63131061A - 組織特異性、不溶性細胞骨格蛋白質の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、不溶性構造の組織特異性蛋白質をその蛋白質
の組織特異性断片を特徴とする特異的抗体によって同定
する方法に関する。

細胞形質膜と会合する細胞質プラーク組織の蛋白質は、
生化学的緩衝液中にきわめて溶解し難く、また、細胞特
異的な主蛋白質を生じる。この主蛋白質については、髄
膜および骨膜腫のような上皮および上皮腫瘍の組織学的
診断に際して特異性を示すデスモグレイン、プラコグロ
ビンならびにデスモブラキンエおよび■のデスモソーム
ーブラークの構造に関し、とくに詳細に研究されている
。

これらの主蛋白質のフラグメントの体液中への出現は、
上皮および髄膜組織における細胞病変および細胞の崩壊
過程の適当な指標となる。このような蛋白質を同定する
ことは望ましい。

特異的な抗体を用い、組織学的診断のために中間フィラ
メント蛋白質を同定することは公知である。中間フィラ
メント蛋白質は細胞骨格の構成成分であり、それぞれ組
織の種類により特異性を有する。転移または組織病変の
中間フィラメント蛋白質の同定によって、原発組織ある
いは一次腫瘍の解析が可能になる。

組織学的検討は繁雑であり、その使用は限定される。当
該組織がｉｎ　ｖ；ｔｒｏで同定可能であるか、検査の
ために入手しやすい組織である場合にのみ、結果を導く
ことができるにすぎない。

本発明の課題は、実施が容易で頻繁に利用できて可能な
限り発見の機会を大きくできる、冒頭に述べたような方
法を企図するものである。

本発明は、抗原を保持し、特徴的な断片に相当するフラ
グメントを溶液に導き、ついで免疫学的に検出または定
石することを特徴とするものである。

不溶性構造の組織特異性蛋白質は細胞骨格蛋白質でよく
、好ましくは中間フィラメント蛋白質である。中間フィ
ラメント蛋白質の場合は、α−ヘリツクス中央部分また
はその部分に相当するフラグメントを含有する。このよ
うなフラグメントはα−へワックス中央部フラグメント
と呼ばれる。

本川［１書におけるα−ヘリツクス中央部フラグメント
はすべて、抗原を保持し、上述の特性を有する断片を意
味する。

本発明は、細胞生物学における以下の知識を利用するも
のである。

すなわち、細胞骨格の構成成分として不溶性細胞構成成
分に属する中間フィラメント（ＩＦ）蛋白質は、高い安
定性と細胞特異性を有する蛋白質である。その配置は第
１表に示すとおりである。

第１表 組織　　　　中間フィラメント蛋白質 筋肉　　　　デスミン 神経　　　　ニューロフィラメント蛋白質（ＮＦ−Ｌ、
ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈ） 間葉　　　　ビメンチン 星細胞　　　ダリアフィラメント 上皮　　　　シトケラチン 検出方法は、各フィラメント種について、それぞれ２個
の抗体から構築されるサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによる
。

ほかに、転位の検出には、ひとつの組織の別個の細胞種
を同定することが望ましい。これは細胞組織からホモゲ
ネートを作成し、このホモゲネートを少なくとも中間フ
ィラメント蛋白質のかなりの部分からα−へワックス中
央部フラグメントが遊離されるまで分解反応に付し、つ
いで可溶性分画を分離し、可溶性分画に含まれる可溶相
中のα−へワックス中央部フラグメントを免疫学的に同
定することにより行われる。

本発明のさらに他の課題は、転位の範囲を確実に予測す
ることである。この課題は細胞ホモゲネートの様々な中
間フィラメント蛋白質を同定し、相Ｈの量的関係を求め
ることにより達成される。

多様なシトケラチンが存在しくＣＫ　　Ｎ０１〜１つ）
、その発現パターンｔま上皮組織によって変動する。し
たがって、シトケラチンの場合は、それぞれの上皮組織
との相関性を、同定されたシトケラチンの相対的割合に
基づいて決定、定量することが望ましい。この相関性に
ついてもα−へワックス中央部フラグメントの豊富な特
性によるものである。

分解に際してα−へワックス中央部分が破壊されすぎて
同定が妨害されないことを保証するためには、０〜４０
℃の温度で８０〜１０１！ｆｆｉ％が生理的食塩溶液に
溶解するまで分解を行うことが推せんされる。プロテア
ーゼ活性の停止には適当な阻害剤を使用する。

同じ理由から、ＩＦ−蛋白質も少なくともα−へワック
ス中央部分の８０重量％が無傷に残っている程度まで分
解を行うことが好ましい。

これらの方法は、転位は一般にリンパ組織にも起こるの
で、寄生組織としてリンパ組織を用いて行うことも好ま
しい。この場合、ＩＦ−蛋白質は、原発部位のマーカー
として、異種組織として触さ、たとえば乳房［１織とし
てリンパ小節に検出される。

部分的分解は、化学的に、たとえば酸または塩基で実施
することもできる。また、物理的な部分分解、たとえば
加熱や照射によることもできる。

しかしながら、部分的分解は蛋白分解酵素によって行う
のが好ましい。この方法では問題の蛋白質の分解を、一
方では中央部が可溶化するように、他方では同定に十分
な無傷の中央部が残存するように、比較的容易に調節で
きるからである。

細胞障害後には、不溶性蛋白質および不溶性構造は様々
に蛋白分解酵素で分解される。このような分解反応後に
も、ＩＦ−蛋白質からは比較的安定なα−へワックス中
央部を含有し、したがって、体液中から免疫学的方法で
検出、定量することができる。このような病変の検出に
は、血液、血清、脳脊髄液、尿、羊水、穿刺液または他
の体液に溶解して含有される中央部フラグメントを免疫
学的に同定する。

体液中では、中間フィラメント蛋白質が、不溶性の形で
混入することも可能性である。したがって、血液、血清
、脳脊髄液、尿、羊水、穿刺液または他の体液中に含有
される蛋白質を、少なくともかなりの部分の存在する可
能性のある不溶性細胞骨格蛋白質からそれぞれのα−へ
ワックス中央部フラグメントを：ｉｉｍするまで分解反
応に付し、ついで可溶性分画に含有されるα−へワック
ス中央部フラグメントを免疫学的に同定する方法も考慮
される。

本発明によれば、検出および定量結果を、体液の採取後
即座に得ることができる。これは著しい利点である。

また、本発明によれば、病理的または治療的経過の進行
、たとえば照射および化学療法を組織の障害に応じてコ
ントロールすることが可能になる。

１１織障害性処置の継続をコントロールするためには、
体液を採取し、障害性処置中および／またはその後に、
頻繁な間隔で測定および定量を実施する。

［ｌ胞障害によって体液中に遊離した細Ｉｔｓ骨格蛋白
質フラグメントは相当する抗体産生の原因ともなる。こ
のような抗体の検出により、問題のフラグメントが確認
されれば、固有のｉｌｌ胞障害があることになる。これ
はまた本発明の利点であり、血液、血清、脳脊髄液、尿
、羊水、穿刺液または他の体液中の該当する精製蛋白質
から得られた試験プレパラートを、含有される可能性が
ある抗体に暴露し、この試験物質に結合した抗体を定性
または定石的に測定することを特徴とする方法も本発明
を構成する。

体液に含有される、相当する抗体の信頼性の高い追求は
、検討すべき障害の発見の可能性がきわめて高いもので
ある。

α−へラックス中央部フラグメントからの試験プレパラ
ートがとくに好ましい。

一定の標準に基づき定量化を行う場合に必要な標準化は
、精製した細胞骨格蛋白質またはそのフラグメントを用
いて標準を生成する。

抗原形成細胞骨格蛋白質断片と同一であるかまたはそれ
を短縮したポリペプチド、ならびに合成によりあるいは
原核生物もしくは酵素中で合成もしくは組換えＤＮＡの
発現により製造されるポリペプチドが、標準物質として
使用するのに好ましい。

次に、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明す
る。

例　　１ リンパ組織における転位の検出 ａ）　リンパ組織の湿重量をまず測定する。この組織を
湿重量に対して３倍容のリン酸緩衝食塩溶液（１０ａＨ
リン酸ナトリウム、Ｉ）＋１７．４，１５０ｍＭ食塩）
中、ナイフホモゲナイザーを用いて粥状になるまで破砕
する［キネマチイカ（に１ｎｅＩａｔｉＣａ社）、ルゼ
ルン（Ｌｕｚｅｒｎ）　／スイスのポリトロンホモゲナ
イザーが推賞できる］。この粥状にした組織に組織の湿
重量に対して１：１０００の割合でキモトリプシンを加
える。インキュベーションは３０℃で（好ましくは熱板
上、場合によっては水浴中で）行い、６０分後に中止す
る。酵素活性の停止には５ｍＨのＮＧＤＣ（２−ニドｏ
−４−カルボキシフェニル−Ｎ、Ｎ−ジフェニルカルバ
メート）を加える。次にホモゲネートを１１０４９（は
重量定数）で３０分間遠心分離する。この条件下で、８
０〜９５重量％のα−ヘリツクス中央フラグメントが同
定可能な状態でＩＦ、蛋白質から遊離される。

ｂ）　ビメンチンの検出およびビメンチン含吊の定量 遠心分離上清について、ビメンチンをサンドイッチ−Ｅ
ＬＩＳＡによって免疫学的に測定する。

この場合、第一のモノクロナール抗体ＧＰ−８は、α−
ヘリツクス中央フラグメントの第一のエピトープに結合
する、いわゆる捕捉抗体として作用し、第二のモノクロ
ナール抗ｍＶ−１００はα−ヘリツクス中央フラグメン
トの、第一のエピトープとは独立で異種の第二のエピト
ープに結合する、いわゆる検出抗体として作用する。抗
体Ｖ−１００はペルオキシダーゼと連結され、α−ヘリ
ツクス中央フラグメントと結合すると、ペルオキシダー
ゼの酵素活性によって確認される。標準化には既知の精
製α−ヘリツクスビメンチンフラグメントを用い、同一
のサンドイッチ−ＥＬＩＳＡにより同一の抗体で試験を
行う。得られたビメンチン値は、測定結果の定量化に際
して係数になる。

Ｃ）シトケラチンの検出およびシトケラチン含量の定量 遠心分離した上清について、シトケラチンの存在もサン
ドイッチ−ＥＬＩＳＡで免疫学的に定量する。この場合
、第一のモノクロナール抗体ＰＡＮ−ＣＩはすべてのシ
トケラチンの第一のエピトープに結合し、いわゆる捕捉
抗体として作用する。いわゆる検出抗体としては、それ
ぞれ単独の１９種の公知のシトケラチンに特異的に付着
する１９種のモノクロナール抗体Ｃ−４０１からＣ−４
１９までを準備する。検出抗体は、検出抗体Ｖ−１００
と同様に酵素で標識する。検出と標準化はｂ）に記載し
たと同様に実施するが、１９種の可能性あるシトケラチ
ンに特異的に適用し、したがって、個々のシトケラチン
の相対比を計算できる。

シトケラチン１ｋ１５、随７．１ｋ１８、随１４、随１
７およびＮα１９のみでほぼ全量を占め、場合によりシ
トケラチンＮｎ１５および随１８が補足的に確認される
場合は、乳癌の転移が推定される。

例　　２ 例１において乳癌の転位が認められた場合の転位の精密
な同定 例１のｂ）およびＣ）の試験により、腋窩リンパ小節に
乳癌の転移が認められた場合には例１のａ）工程におけ
るホモゲネートについて、ニストロジエンおよびプロゲ
ステロンに対する受容体含量を測定する。この受容体含
量は、例１の工程Ｃ）で得られたα−ヘリツクスシトケ
ラチンフラグメントの含量に関係する。得られた数値は
、そのホルモン受容体を有する転移［ｌ砲の存在程度を
示す尺度となる。このような数値は公知の方法ではこれ
まで得られなかったものである。これは適切な化学療法
を導入するための指標となる。

鼠ユ 骨盤突起生検標本における転移の検出 リンパ小節に代えて骨盤突起生検標本を用いるほかは例
１と同様にして検出を行う。

匠Ａ 内障眼穿刺液における転位の検出 リンパ小節に代えて内障眼穿刺液を用いるほかは例１と
同様にして検出を行う。

匠二 鑑別診断のための上皮組織における病変の検出患者血液
の血清１ｍｌについて、シトケラチンの存在をサンドイ
ッチ−ＥＬＩＳＡにより免疫学的に測定する。この場合
、すべての血清中に存在するシトケラチンフラグメント
複合体に見出される第一のエピトープに対して結合する
第一のモノクロナール抗体ＰＡＮ−ＣＩをいわゆる捕捉
抗体として用いる。さらに、いわゆる検出抗体として、
それぞれ第二のエピトープに結合し、既知の１９種のシ
トケラチンそれぞれに特異的に付着するモノクロナール
抗体Ｃ−４０１〜Ｇ−４１９を準備する。第二のエピト
ープはいずれも第一のエピトープとは独立、異種である
。検出抗体はペルオキシダーゼで酵素的に標識される。

標準化には、１９種の各シトケラチンの精製α−へリッ
ク中央フィラメントを同一のサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ
により同一の抗体で試験を行う。

この、ようにして得られた１９種のシトケラチン値は、
測定結果の定量化に際しての標準値として利用される。

この方法により、個々のシトケラチンの相対金回が明ら
かになる。障害上皮組織に十分な特異性があり、障害の
程度が推測できる。

シトケラチン８および１８のみが確認されたときは、肝
ｌｌ１ｌｌ！、腎上皮ないし膵臓小細胞の病変およびこ
の種の細胞の転移！！！瘍が推測され、病変部位として
他の組織は考えにくい。

λｌ 内部上皮組織の病変の検出 捕捉抗体をＰＡＮ−ＣＩ、検出抗体をシトケラチンＮＱ
８、社１８および騎１９に付着するＣ−４０８、Ｄ−４
１８およびＣ−４１９に限定するほかは例６と同様に操
作する。シトケラチンに８、社１８およびＮ１１１９が
比率の高い構成成分として検出された場合は、腸管の上
皮の範囲における病変が推測され、病変部位として他の
臓器は考えにくい。

［ 妊娠時における神経系欠陥の疑いに際しての早期診断 羊水穿刺液１０Ｍ１を遠心分離する。沈澱物をその湿重
量に対して３倍容のリン酸！１ｖＮ食塩溶液（１０ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，１５０ｍＭ食塩）中、
ナイフホモゲナイザーを用いて粥状になるまで破砕する
。このホモゲネートに、組織湿重量に対して１：１００
０の割合でキモトリプシンを加える。インキュベーショ
ンは水浴中３０℃で実施し、６０分後に停止する。酵素
活性の停止は５ＩＩＨの２−二トロー４−カルボキシフ
ェニル−Ｎ、Ｎ−ジフェニルカルバメート（ＮＧＤＣ）
によって生じる。ついでホモゲメートを３０分間、１０
４９（９−重力定数）で遠心分離する。

この条件下で、８０〜９５重量％のα−へリック中央フ
ィラメントが同定可能な状態にＩＦ−蛋白質から遊離さ
れる。

得られた遠心分離上清を２つに分け、それぞれ神経フィ
ラメントおよびダリアフィラメントの含量をサンドイッ
チ−ＥＬＩＳＡにより免疫学的に検討する。この場合、
２種のフィラメント種に対し、それぞれ第一のモノクロ
ナール抗体Ｎ　Ｆ−８ないしはＧＬ−８が、いわゆる捕
捉抗体として作用し、それぞれフィラメント蛋白質、α
−ヘリツクス中央フラグメントの第一のエピトープに結
合する。一方、第二のモノクロナール抗体ＮＦ−１００
ないしはＧＬ−１００はいわゆる検出抗体として作用し
、付着したフィラメントのα−へリツクス中央部分の第
二のエピトープに結合する。第二のエピトープは第一の
エピトープとは独立、異種である。

検出抗体ＮＦ−１００またはＧＬ−１００はペルオキシ
ダーゼと連結し、α−ヘリツクス中央フラグメントに結
合するとペルオキシダーゼの酵素活性によって確認され
る。標準は例５に記載したと同様にして行われる。

羊水サンプル中のグリアないしは神経フィラメント断片
の出現は神経系欠陥を示し、従来使用されていた公知方
法に比べて、信頼性が高く、迅速な、出産前診断試験が
提供される。

例８〜１０ 単独のシトケラチンを付着する単独の捕捉抗体に代えて
、単独のシトケラチンの組合せを３！ｌ！識するような
捕捉抗体を用いて例５〜７と同様に実施する。たとえば
、Ｃ−５０１とＣ−５０４の組合せはシトケラチンＮ［
ｌＸを認識し、Ｃ−５０１とＣ−５０３の組合せはシト
ケラチン（Ｘ＋１）を認識する。

例１１〜２０ 標準化のペプチドとして働く標準物質として、α−へリ
ツクス中央フラグメントからの抗原形成断片と同一であ
り、特定の構造および欠失構造のｃＤＮｓ配列データに
基づいて遺伝子工学的に得られた標準物質を用いるほか
は例１から１０までにおける記載と同様に実施する。

例２１ 上皮組織病変の検出（鑑別診断） 患者血液の血清１ｍｌについて、シトケラチンに対する
抗体の存在をサンドイッチ−ＥＬＩＳＡにより免疫学的
に調べる。この場合は、１９個の各区画に１９種の異な
るシトケラチン（ＣＫ　　Ｎｎ１〜１９）の精製α−ヘ
リツクス中央フラグメントをとったミクロ滴定板を用い
る。それに体液の蛋白質を注ぐ。ついでプレパラートを
注意深く洗浄する。

プレパラートにより特異的に吸着された患者血液からの
抗体を、それぞれペルオキシダーゼで酵素的に４１１！
識された、ＩＱＭまたはＩＱＧに対する特異的抗体で免
疫学的に同定する。標準には、ヒト血液からの精ＶＩｏ
ＧまたはＩＱＭを使用する。

例２１および２３ 患者血液の血清に代えて他の体液を加えるほかは、例２
１と同様に実施する。すなわち、例２２では尿を、 例２３では間接穿刺液 を使用する。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）不溶性構造の組織特異性蛋白質を、その蛋白質の
   組織特異性断片を抗原として産生する抗体を用いて同定
   する方法において、その抗原を保持し、その特徴的断片
   に対応するフラグメントを溶液に導き、ついで免疫学的
   に検出および定量することを特徴とする方法。
2. （２）組織特異性蛋白質は細胞骨格蛋白質である特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）細胞骨格蛋白質は中間フイラメント蛋白質であり
   、フラグメントはそのα−ヘリツク中央部フラグメント
   またはその部分を含有することを特徴とする特許請求の
   範囲第２項に記載の方法。
4. （４）細胞組織からホモゲネートを生成させこのホモゲ
   ネートを少なくとも中間フイラメントのかなりの部分か
   らα−ヘリツクス中央部フラグメントが遊離されるまで
   分解反応に付し、可溶性分画を分離し、可溶性分画に含
   有される溶液相中のα−ヘリツクス中央部フラグメント
   を免疫学的に同定することを特徴とする特許請求の範囲
   第３項に記載の方法。
5. （５）細胞ホモゲネートの各種中間フイラメント蛋白質
   を同定し、相互の量的関係を定めることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項に記載の方法。
6. （６）血液、血清、脳脊髄液、尿、羊水、穿刺液または
   その他の体液中に溶解して含まれるα−ヘリツク中央部
   フラグメントを免疫学的に同定することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項に記載の方法。
7. （７）血液、血清、脳脊髄液、尿、羊水、穿刺液または
   その他の体液中に溶解して含まれる蛋白質を少なくとも
   かなりの部分の不溶性細胞骨格蛋白質からそれぞれのα
   −ヘリツクス中央部フラグメントが遊離するまで分解反
   応に付し、可溶性分画を分離し、可溶性分画に含有され
   るα−ヘリツクス中央部フラグメントを免疫学的に同定
   することを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方
   法。
8. （８）血液、血清、脳脊髄液、尿、羊水、穿刺液または
   その他の体液中の該当する精製蛋白質またはそのフラグ
   メントから得られた試験プレパラートを、含有される可
   能性がある抗体に暴露し、この試験物質に結合した抗体
   を定性および定量的に測定することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
9. （９）一定の標準に基づいた定量化を実施するに際し、
   精製した細胞骨格蛋白質またはそのフラグメントから標
   準を形成することを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。
10. （１０）標準物質ポリペプチドとして、抗原を形成する
    細胞骨格蛋白質の断片と同一もしくはそれを短縮化した
    ポリペプチド、合成によりあるいは原核生物もしくは酵
    素中での合成もしくは組換えＤＮＡの発現により製造さ
    れたポリペプチドを使用することを特徴とする特許請求
    の範囲第９項に記載の方法。