ES2628596T3 - Procedimientos y composiciones para monitorizar la actividad fagocítica - Google Patents

Abstract

Procedimiento de diagnóstico, monitorización y/o evaluación del riesgo de una enfermedad neurodegenerativa en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una muestra obtenida de un paciente, comprendiendo dicha muestra un tipo de célula seleccionado del grupo que consiste en leucocitos, monocitos, macrófagos y macrófagos activados; y b) detectar el nivel del péptido que tiene al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 en dicha muestra, en el que una disminución en el nivel de dicho péptido en relación con el nivel del control es indicativa de la presencia o gravedad de dicha enfermedad neurodegenerativa en dicho paciente.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos y composiciones para monitorizar la actividad fagodtica Campo de la invencion

La invencion se refiere a procedimientos para diagnosticar, monitorizar y/o evaluar el riesgo de enfermedades neurodegenerativas (p.ej. enfermedad de Alzheimer (EA)).

Antecedentes de la invencion

La EA, la causa mas comun de demencia, es un deterioro cognitivo y conductual adquirido que interfiere en el funcionamiento social y ocupacional. La EA es un problema para la salud publica importante desde el punto de vista economico, pues no solamente supone una tremenda carga economica en lo que se refiere a los propios pacientes, sino que tambien por el impacto social, economico, ffsico y psicologico que supone para los cuidadores. En los Estados Unidos, el coste que conlleva la atencion sanitaria y los servicios de cuidado a largo plazo por paciente fue 33.007 $ aproximadamente en 2004, segun los datos disponibles mas recientes (Alzheimer's Association (2010) Alzheimer's & Dementia 6:158-194).

La EA afectaba a aproximadamente 5.300.000 de personas en los Estados Unidos en 2010 (Alzheimer's Association (2010) Alzheimer's & Dementia 6:158-194) y a 26.600.000 de pacientes en todo el mundo en 2006. Un gran numero de pacientes presentan un descenso de las funciones cognitivas (p.ej., deterioro cognitivo leve (DCL) cuantificable o incluso solo un deterioro cognitivo subjetivo (SCI) mas temprano), que suele evolucionar en demencia completa, con lo que aumenta el numero de personas afectadas. En 2030, se estima que 7.700.000 de norteamericanos de 65 anos de edad tendran EA (Hebert y col. (2003) Arch. Neurol. 60(8):1119-22). Las proyecciones estadfsticas indican que el numero de personas afectadas por este trastorno en los Estados Unidos podna oscilar entre 11 y 16 millones para el ano 2050 (Hebert y col. (2003) Arch. Neurol. 60(8):1119-22).

Los factores causantes de EA esporadica siguen sin precisarse, si bien la progresion de la enfermedad esta correlacionada con signos patologicos anatomicos evidentes entre los que se incluyen ovillos neurofibrilares (NFT); placas seniles (SP) a niveles microscopicos; y atrofia cerebrocortical. Los depositos amiloides tambien tienen que ver con otras dos de las causas comunes de demencia, demencia vascular (DVa) y demencia con cuerpos de Lewy (DCL), asf como la miositis con inclusion de cuerpos, una enfermedad muscular. Si bien EA sigue un curso de progresion tfpico, escasean los procedimientos de diagnostico definitivos, en particular para EA en los primeros estadios. Esto es particularmente problematico ya que DCL y EA en los primeros estadios son penodos clmicamente valiosos para la implementacion de terapias de modificacion de la enfermedad. (Vellas y col. (2007) Lancet Neurol. 6:56-62). Es importante dado que la extension del dano que provoca la EA es practicamente irreversible en los ultimos estadios de la progresion de la enfermedad (Braak y col. (1991) Acta Neuropathol.82:239-259).

El documento WO2010/011947 se refiere a analogos de peptido R-amiloide en los que la secuencia forma un bucle y tiene al menos un 66 % de identidad con el peptido AR-humano o una porcion del mismo y comprende al menos 6 restos de aminoacido contiguos y tiene al menos 2 restos de aminoacidos no continuos que estan unidos covalentemente entre sr

Se necesita nuevos procedimientos para la deteccion, diagnostico y monitorizacion de enfermedades neurodegenerativas, p.ej. EA.

Sumario de la invencion

Un gran numero de enfermedades y afecciones implican la activacion de macrofagos y la proteolisis de protemas, p.ej., agregados patologicos de protemas endogenas. Por ejemplo, en EA, se produce la formacion de placas amiloides en el cerebro cuando se forman agregados de peptidos beta amiloides (AR) tras la proteolisis de protema precursora amiloide (PPA). La inmunizacion de un individuo con peptidos AR desencadena la fagocitosis (Schenk y col. (1999) Nature 400:173-177). La actividad inmune tambien puede participar en la evolucion natural de patologfas amiloides, p.ej., el nivel continuo de actividad fagodtica puede contribuir a la formacion de placas con el tiempo. Existe evidencia de que los macrofagos circulan desde la medula osea hasta el sistema nervioso central en los estados patologicos y contribuyen a la eliminacion de placa en modelos de raton de EA (Simard y col. (2006) Neuron 49:489-502), y los macrofagos aislados de pacientes EA presentan una menor fagocitosis de peptidos AR en comparacion con los macrofagos de pacientes sin EA (Fiala y col. (2005) J. Alzheimers Dis. 7:221-232). Los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de algunas realizaciones de la presente invencion han identificado un AR peptido presente en macrofagos activados aislados de muestras de sangre periferica (SEQ ID NO 2). El peptido tiene 11 aminoacidos de longitud. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la determinacion del nivel, presencia o ausencia del peptido AR (SEQ ID NO 2) en leucocitos o macrofagos (p.ej. macrofagos activados) de un paciente sirve como procedimiento de diagnostico, monitorizacion y/o evaluacion del riesgo de enfermedad (p.ej., Ea, demencia vascular, demencia con cuerpos de Lewy, miositis con cuerpos de inclusion).

Los procedimientos de la presente invencion comprenden proporcionar una muestra que se puede obtener de un paciente (p.ej., un paciente humano), comprendiendo dicha muestra leucocitos, monocitos y/o macrofagos (p.ej.,

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macrofagos activados). La muestra puede comprender sangre (p.ej. sangre periferica), fluido cerebroespinal (FCE), tejido (p.ej. pulmon, bazo, tngado, cerebro, pancreas, intestino delgado, tumor). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de lavado broncoalveolar (LBA). En algunas realizaciones la muestra es medula osea. En realizaciones particularmente preferentes, la muestra es una muestra de sangre de una muestra FCE.

En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion comprenden una etapa de aislamiento de macrofagos (p.ej. macrofagos activados), sin limitacion en cuanto a la tecnica utiliza para dicho aislamiento (p.ej. tal como se describe en Macrophages (2000) ed. Paulnock, D.M., Oxford Univ. Press, Oxford, UK). Entre los ejemplos de aislamiento de macrofagos o tecnicas de purificacion se incluyen, pero sin limitarse solo a ellas los procedimientos de adhesion o adherencia (p.ej. adherencia a soporte solido (p.ej. plastico, vidrio), ya este revestido o no dicho soporte (p.ej. revestido con gelatina, microexudado, colageno, lisina) o no este revestido, centrifugacion diferencial (p.ej. centrifugacion gradiente, centrifugacion de gradiente isopfcnica, centrifugacion de gradiente Ficoll- Hypaque, centrifugacion de gradiente Percoll), citometna de flujo, separacion de celulas activadas por fluorescencia (fAcS), tecnicas de flotacion, tecnicas de afinidad mediadas por anticuerpos (p.ej. inmunoprecipitacion, union a soporte solido mediada por anticuerpo (p.ej. perlas magneticas, partfculas no magneticas, placas, pocillos, tarjetas, chips, portaobjetos, matrices, etc.). En algunas realizaciones, tecnica de purificacion o aislamiento el macrofago (p.ej. macrofago activado) implica la union de macrofagos con un socio de union (p.ej. un anticuerpo) que esta asociado de forma no covalente o covalente con una fraccion utilizada para deteccion directa o indirecta (p.ej. una marca fluorescente, biotina, estreptavidina, un radioisotopo, un epftopo, una marca de afinidad).

En algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente invencion comprenden la deteccion del nivel de peptido AU (SEQ ID.NO 2) de un estado patologico neurodegenerativo (p.ej. EA) presente en leucocitos y/o macrofagos (p.ej. macrofagos activados) sin limitacion en cuanto a la tecnica utilizada para dicha deteccion. El nivel de biomarcador (peptido AU, SEQ ID.NO 2) se puede determinar cuantitativamente o cualitativamente. Un descenso del nivel de biomarcador (p.ej. en una muestra de tejido o fluido biologico, en una muestra enriquecida para leucocitos y/o macrofagos (p.ej. macrofagos activados)) en relacion con un control esta correlacionado con un mayor riesgo de enfermedad (p.ej. EA), diagnostico de enfermedad (p.ej. EA). En algunos aspectos de la presente divulgacion, se evaluan las muestras que comprenden macrofagos y/o microglias para determinar el nivel de actividad fagocftica, p.ej. se exponen a un primer polipeptido (p.ej. un peptido AU, PPA) durante un penodo de tiempo y se determina el nivel de fagocitosis del polipeptido. En algunos aspectos de la divulgacion, la presencia, ausencia o el nivel de polipeptidos de menor longitud que el primer polipeptido (p.ej. un segundo peptido AU, SEQ ID NO: 1-5) sirve como indicacion del nivel de actividad fagocftica y/o proteolftica en la muestra original.

En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion implican la comparacion del nivel del biomarcador (peptido AU, SEQ ID.NO 2) en muestras del mismo paciente en uno o mas momentos diferentes (p.ej. muestreo longitudinal), p.ej., en los casos en los que dichos niveles estan correlacionados con la progresion de enfermedad. En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion implican la comparacion del nivel de biomarcador (peptido AU, SEQ ID.NO 2) en una muestra de un paciente en relacion con el nivel observado en una muestra de un paciente de control que no presenta la enfermedad (p.ej. EA). En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion implican la comparacion del nivel de biomarcador (peptido AU, SEQ ID.NO 2) en una muestra de un primer paciente en relacion con el promedio, la media u otro(s) nivel(es) estadfsticamente determinados (p.ej. los “nivel(es) normal(es)” observados en muestras de una pluralidad de pacientes de control que no presentan la enfermedad (p.ej. EA), en los que el nivel del biomarcador en el primer paciente es anormal si existe una diferencia estadfsticamente significativa con respecto al nivel normal.

La presente invencion proporciona un procedimiento para el diagnostico, monitorizacion y/o evaluacion del riesgo de una enfermedad neurodegenerativa en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento 1) proporcionar una muestra obtenida de un paciente, comprendiendo dicha muestra un tipo de celula como leucocitos, monocitos, macrofagos o macrofagos activados, y b) detectar el nivel de un peptido en la muestra, en la que el peptido tiene al menos al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2, en el que un descenso del peptido en relacion con el nivel normal es indicativo de la presencia o gravedad de la enfermedad neurodegenerativa en el paciente. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es de un tipo como EA, demencia vascular, y demencia con cuerpos de Lewy. En algunas realizaciones, la muestra es de un tipo como una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra de fluido cerebroespinal. En algunas realizaciones, el tipo de celulas es un macrofago. En algunas realizaciones, el tipo de celula es un macrofago activado. En algunas realizaciones, el nivel de control es el nivel en el paciente en un momento diferente, el nivel en un paciente diferente que no presenta la enfermedad neurodegenerativa, o el nivel promedio en una pluralidad de pacientes que no presentan la enfermedad neurodegenerativa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende ademas el aislamiento del tipo de celula, como, por ejemplo, leucocitos, monocitos, macrofagos, o macrofagos activados. En algunas realizaciones, las celulas aisladas son macrofagos. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende ademas la incubacion de las celulas aisladas con polipeptido Ap42

Descripcion de los dibujos

La Figura 1 proporciona una representacion del contenido Ap en monocitos.

La Figura 2 proporciona los datos que asocian el contenido intracelular de Ap con diagnostico clmico.

La Figura 3 proporciona una curva de respuesta a dosis tfpica para un ensayo de fagocitosis in vitro, presenta

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microscop^a confocal de un macrofago incubado con 0,5 ng/ml Api-42 durante toda la noche y marcada con anticuerpos espedficos de Api-42 de fluorescencia verde ((6E10 y 4G8). Izquierda, senal fluorescente observada durante la microscopfa inmunoconfocal. Derecha, transiluminacion.

La Figura 4 presenta una representacion de peptidos Ap identificados a traves del analisis de espectrometna de masas (EM) tal como se describe en el presente documento. Los campos sombreados del centro presentan la localizacion de los peptidos individuales dentro de la molecula Api-42. La region sombreada que se solapa a la derecha de la region sombreada central muestra la region de transmembrana. Todos los peptidos bordean la region intramembrana (transmembrana) de la molecula.

La Figura 5 presenta los resultados del analisis de espectrometna de masas (EM) durante los experimentos llevados a cabo a lo largo del desarrollo de algunas realizaciones de la presente invencion. El panel superior presenta el espectro EM en bruto desde lisosomas de celulas incubadas en presencia de Api-42 y de celulas de control. El panel inferior presenta otros analisis de los datos de EM del panel superior basados en la secuencia Api-42; las barras grises indican fragmentos potenciales y los rectangulos oscuros indican hits significativos de estos fragmentos.

La Figura 6 proporciona una representacion esquematica de un ensayo para la deteccion y cuantificacion de metabolitos de PPA espedfico de Alzheimer utilizando PCR en tiempo real.

La Figura 7 proporciona un grafico de amplificacion de PCR en tiempo real.

La Figuras 8a y 8b proporcionan histogramas de celulas THP-1 tras la citometna de flujo. El histograma 8a presenta celulas THP-1 a las que se ha anadido Api-42 en medio. El histograma 8b presenta celulas THP-1 sin Api .42 en medio. El contenido de Ap intracelular se ilustra en los histogramas. La mediana de isotipo de senal FITC-A Abeta es i02 (no se muestran los resultados). Un desplazamiento de FITC-A Abeta hacia la derecha en comparacion con el isotipo indica celulas con presencia de Ap intracelular. La elipse en el histograma 8 a muestra la presencia de una cola de celulas Ap positivas, que esta ausente en el histograma 8b. Esta cola indica una cantidad mas alta de celulas que contienen Ap intracelular fagocitado en el histograma 8b.

La Figura 9 proporciona una curva de PCR patron que muestra el ciclo umbral (valor Ct) frente al log de la

concentracion de peptido. El grafico presenta el ciclo umbral (valor Ct) frente al log de concentracion. La

ecuacion para la curva es y = -0,6056x + 32.629. R2 = 0,8653.

La Figuras 10a and 10b proporcionan histogramas de monocitos/macrofagos de paciente y control tras la citometna de flujo. i0a presenta una muestra del paciente intracelular manchada con 6Ei0/4G8. i0b presenta una muestra de control manchada intracelular con 6Ei0/4G8. En los histogramas se ilustra el contenido Api-42 intracelular en macrofagos/monocitos del paciente y el control. La mediana de isotipo de senal FITC-A Abeta es i02 (no se muestran los resultados). Un desplazamiento de FITC-A Abeta hacia la derecha en comparacion con el isotipo indica celulas con presencia de Api-42 intracelular. Los histogramas 3 y 4 indican la presencia aproximada de Api-42 intracelular cuando se compara con isotipos.

La Figura 11 proporciona una curva PCR normal que presenta el ciclo umbral (valor Ct) frente al log de la

concentracion de peptido. El grafico presenta el ciclo umbral (valor Ct) frente al log de concentracion. La

ecuacion para la curva es y = -3.8956x + 37.275. R2 = 088i8.

Definiciones

Para facilitar la comprension de la presente invencion, a continuacion, se define una serie de terminos y expresiones:

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “sensibilidad” se define como una medida estadfstica del rendimiento de un ensayo (p.ej., procedimiento, prueba), calculado dividiendo el numero de verdaderos positivos entre la suma de los verdaderos positivos y los falsos negativos.

Tal como se utiliza en el presente documento, “especificidad” se define como una medida estadfstica del rendimiento de un ensayo (p.ej. procedimiento, prueba), calculado dividiendo el numero de verdaderos negativos por la suma de verdaderos negativos y falsos positivos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “informativo” o “capacidad informativa” se refiere a la calidad de un marcador o panel de marcadores, y espedficamente a la probabilidad de encontrar un marcador (o panel de marcadores) en una muestra positiva.

Tal como se utiliza en el presente documento “un individuo sospechoso de ser susceptible de riesgo de EA” se refiere a un individuo que esta en riesgo por encima de la media de desarrollar EA (EA). Entre los ejemplos de individuos que se encuentran en particular riesgo de desarrollar EA se incluyen aquellos cuya historia medica familiar indica una incidencia por encima de la media de EA, individuos de edad avanzada, individuos que presentan signos o smtomas de CDL o SCI. Otros factores que pueden contribuir al riesgo por encima de la media de desarrollar EA pueden basarse en la genetica, asf como los antecedentes y las caractensticas geneticas, medicas, fisiologicas, psicosociales y/o conductuales espedficos del individuo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “aislado” cuando se emplea en relacion con un material (p.ej., una celula, un leucocito, un macrofago, un macrofago activado, una microglia) se refiere a un material que se identifica y esta separado por al menos un componente o contaminante con el que esta normalmente asociado en su fuente natural. Un material aislado esta presente asf en una forma o situacion que es diferente de aquella en la que

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se encuentra en la naturaleza.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos “inmunoglobulina” y “anticuerpo” se refieren a protemas que se unen a un antigeno espedfico. Inmunoglobulinas incluye, sin limitarse solo a ellas, anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, e incluye inmunoglobulinas de las siguientes clases: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE, e inmunoglobulinas secretadas (sIg). Las inmunoglobulinas generadas comprenden dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras. Sin embargo, los terminos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” tambien abarcan anticuerpos de cadena simple y anticuerpos de doble cadena.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “protema de union a antfgeno” se refiere a protemas que se unen a un antfgeno espedfico. “Protemas de union a antfgeno” incluyen, sin limitarse a ellas, inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos y humanizados; fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y genotecas de expresion Fab; y anticuerpos de cadena simple.

El termino “epttopo” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la porcion de un antfgeno que hace contacto con una inmunoglobulina en particular.

Las expresiones “union espedfica” o “que se une espedficamente”, cuando se utilizan en referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protema o peptido significa que la interaccion depende de la presencia de una estructura en particular (es decir, el determinante antigenico o epftopo) en la protema; es decir, el anticuerpo reconoce y se une a una estructura de protema espedfica en lugar de a protemas en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es espedfico para el epttopo “A”, la presencia de una protema que contiene epttopo A (o A libre, sin marcar) en una reaccion que contienen “A” marcado y el anticuerpo reducira la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

Tal como se utilizan en el presente documento las expresiones “union no espedfica” y “union de fondo” cuando se emplean haciendo referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protema o peptido se refieren a una interaccion que no depende de la presencia de una estructura en particular (es decir, el anticuerpo se une a protemas en general, en lugar de a una estructura en particular, como pueda ser un epttopo).

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “paciente” se refiere a cualquier animal (p.ej. un mairnfero), incluyendo, sin limitarse a ellos, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares (p.ej., que sera el receptor de un tratamiento en particular (p.ej. un injerto o trasplante) o que es el donante de un injerto. Los terminos “paciente” y “sujeto” se utilizan indistintamente para hacer referencia un paciente humano, a no ser que se indique de otro modo en el presente documento (p.ej., cuando el paciente es un donador de injerto).

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “muestra” se utiliza en su mas amplio sentido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, incluye una muestra de ensayo (p.ej., muestra de sangre, muestra de fluido cerebroespinal FCE). En realizaciones preferentes, incluye una muestra biologica.

La presente invencion no queda limitada por el tipo de muestra biologica utilizada o analizada. La presente invencion es util con diversas muestras biologicas, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, tejido (p.ej., organo (p.ej., corazon, tngado, cerebro, pulmon, estomago, intestino, bazo, rinon, pancreas u organos reproductores (p.ej. ovarios); biopsia pulmonar), glandular, de piel y de tejido muscular), celular (.ej. celulas sangumeas (p.ej., linfocitos o eritrocitos), celulas musculares, celulas tumorales, celulas bronquiales, celulas bronquioalveolares, y celulas de la piel), gas, fluido corporal (p.ej., fluido de aspirado traqueal, fluido broncoalveolar, muestra de lavado broncoalveolar, sangre o porciones de la misma, suero, plasma, orina, semen, saliva, etc.) o solidas (p.ej. heces) muestras obtenidas de un ser humano (p.ej., un adulto, un nino, o un embrion) o animales (p.ej., ganado bovino, aves, ratones, ratas, perros, cerdos, gatos, caballos y similares).Las muestras biologicas se pueden obtener de todas las familias de animales domesticos, asf como de fieras o animales salvajes, incluyendo, sin limitarse a ellos , animales como los ungulados, osos, peces, lagomorfos, roedores, etc.

Las muestras biologicas incluyen tambien biopsias y secciones de tejido (p.ej. biopsia o secciones de tumor, tumor, sarpullido, infeccion o secciones embebidas en parafina), muestras medicas u hospitalarias (p.ej. incluyendo, pero sin limitarse a ellas, fluido de lavado broncoalveolar (LBA), fluido de aspirado traqueal, muestras de sangre, saliva, hisopo bucal, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, calostro, ganglio linfatico, esputo, vomito, bilis, semen, ovocitos, celulas cervicales, fluido amniotico, orina, heces, pelo y sudor) y muestras de laboratorio (p.ej., fracciones subcelulares).

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “purificado” o “purificar” se refiere a la eliminacion de componentes (p.ej., contaminantes) de una muestra. Por ejemplo, se purifican anticuerpos eliminando protemas que no son inmunoglobulinas contaminantes; tambien se purifican eliminando la inmunoglobulina que no se une a la molecula diana. La eliminacion de protemas que no son inmunoglobulina y/o la eliminacion de inmunoglobulinas que no se unen a la molecula diana tienen como resultado un aumento del porcentaje de inmunoglobulinas reactivas con la diana en la muestra. En otro ejemplo, los polipeptidos recombinantes se expresan en celulas huesped bacterianas y se purifican los polipeptidos por eliminacion de las protemas de las celulas huesped; en virtud de lo cual, aumenta el porcentaje de polipeptidos recombinantes en la muestra. En otro ejemplo mas, se puede purificar o enriquecer un tipo de celula espedfico (p.ej. leucocito, macrofago, macrofago activado, celula microglial) utilizando una tecnica de separacion de celulas (p.ej., citometna de flujo, separacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS)).

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Tal como se aplica para polipeptidos, el termino “sustancial identidad” significa que dos secuencias de polipeptido, cuando se alinea optimamente, como por ejemplo con los programas GAP o BESTFIT utilizando los pesos de hueco por defecto, comparten al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, mas preferentemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia (p.ej., 99 por ciento de identidad de secuencia). Preferentemente, las posiciones de los restos que no son identicos difieren por sustituciones de aminoacido conservadoras. Sustituciones de aminoacido conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifaticas es serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contiene amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cistema y metionina. Los grupos de sustitucion de aminoacidos conservadores preferentes son: valina-leucina-isoleucina; fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona procedimientos que se refiere a la deteccion, monitorizacion, diagnostico o valoracion del riesgo de desarrollar enfermedad neurodegenerativa (p.ej. EA, demencia vascular, demencia con cuerpos de Lewy, miositis con cuerpos de inclusion u otras enfermedades neurodegenerativas).

En los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de algunas realizaciones de la presente invencion, se ha demostrado que los monocitos/macrofagos derivados de la sangre internalizan AP1-42 en una situacion in vitro. En la Figura 1 se muestra una descripcion del contenido en Ap. En la Figura 2 se proporcionan los datos que asocian el contenido intracelular de Ap con el diagnostico clmico. En la Figura 3 se proporciona una curva de respuesta a dosis tfpica para un ensayo de fagocitosis in vitro y demuestra que tiene lugar la internalizacion a traves del sistema endosomal-lisosomal, ya que aparece fluorescencia verde espedfica de Api-42 en los granulos intracelulares; vease tambien (Boland y col. (2010), en prensa, doi: 10.1074/jbc.M110.186411; Lorenzen y col. (2010) Mol. Brain 3:11). Se postula que el procedimiento de evaluacion de la eficacia de dicha eliminacion es necesario para mejorar el proceso de diagnostico, p.ej., cuando se diagnostica EA.

En algunos aspectos, la presente divulgacion describe procedimientos para diagnosticar actividad fagodtica de monocito/macrofago en muestras, p.ej., muestras de fluido corporal, por deteccion de fragmentos de peptido fagocitados. Los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de algunas realizaciones de la presente invencion permitieron identificar estructuras de fragmento de peptido espedficas para protema precursora amiloide (PPA) fagocitada y parcialmente degradada, p. ej., tal como se describe en el Ejemplo 1 (p.ej., SEQ ID NO: 1-5). En algunos aspectos de la divulgacion, se sintetizan los fragmentos de Peptido AU (p. ej, SeQ ID NO: 1-5) (p.ej., se sintetizan qmmicamente, se sintetizan por expresion recombinante) y se inmuniza a los animales con peptidos individuales (p.ej., peptidos codificados por SEQ ID NO: 1-5) para producir anticuerpos espedficos de peptido. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos espedficos de peptido pueden utilizarse en un kit (p.ej., un kit para el diagnostico, monitorizacion o determinacion del riesgo de desarrollo) de una enfermedad (p.ej. EA) tal como se describe con mayor detalle a continuacion.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invencion proporciona el uso de inmunoglobulinas que se unen a peptidos que son identicos en al menos un 80 %, 90 %, o 100 % al peptido codificado por SEQ ID NO: 2 en un procedimiento de la invencion. En aspectos de la divulgacion, los peptidos tienen una longitud de 5 a 20 aminoacidos y los peptidos que son identicos al menos en un 80 %, 90 %, o 100 % con los peptidos codificados por la SEQ ID NO: 1-5 proporcionan al menos una porcion de un epftopo dentro de la secuencia de peptido mas larga. Tal como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo o anticuerpo policlonal” significa una protema que se produce como respuesta a la inmunizacion con un antfgeno o receptor. El termino “anticuerpo monoclonal” significa una inmunoglobulina derivada de un unico clon de celulas. Todos los anticuerpos monoclonales derivados del clon son qrnmica y estructuralmente identicos, y espedficos para un determinante antfgeno unico.

Los procedimientos de laboratorio para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, asf como para deducir sus correspondientes secuencias de acido nucleico, son conocidos en la tecnica, vease Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988) and Sambrook y col. (1989) supra. Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion se pueden producir biologicamente introduciendo un peptido tal como se ha descrito o una protema de fusion o un fragmento de protema mas largo que comprende el peptido en un animal, p.je., un raton o un conejo. Se afslan las celulas que producen anticuerpo en el animal y se fusionan con celulas de mieloma o celulas de heteromieloma para producir celulas hforidas o hibridomas.

Por lo tanto, al utilizar los peptidos descritos, y procedimientos muy conocidos, las personas especializadas en la tecnica pueden producir y explorar las celulas de hibridoma y los anticuerpos de la presente divulgacion para detectar anticuerpos que tienen la capacidad de unirse al peptido deseado (p.ej., SEQ ID NO: 1-5).

Si un anticuerpo monoclonal que se esta sometiendo a ensayo se une con el peptido, entonces el anticuerpo sometido a ensayo y los anticuerpos proporcionados por los hibridomas de la presente divulgacion son equivalentes.

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Tambien es posible determinar sin una experimentacion indebida, si el anticuerpo tiene la misma especificidad o no que el anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion determinando si el anticuerpo que se esta sometiendo a ensayo evita que un anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion se una al peptido con el que el anticuerpo monoclonal es normalmente reactivo. Si el anticuerpo que se somete a ensayo compite con el anticuerpo monoclonal de la divulgacion, tal como se muestra por una menor union con el anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion, entonces, es probable que los dos anticuerpos se unan con el mismo epttopo o un epftopo mtimamente relacionado. Alternativamente, se puede pre-incubar el anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion con el peptido con el que es normalmente reactivo y determinar si el anticuerpo monoclonal sometido a ensayo es inhibido en su capacidad para unirse al antigeno. Si el anticuerpo monoclonal sometido a ensayo es inhibido, entonces, con toda probabilidad, tiene a misma especificidad epitopica o mtimamente relacionada, que el anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion.

Se pretende que el termino anticuerpo incluya tambien anticuerpos de un isotipo diferente que el anticuerpo monoclonal de la presente divulgacion. Los isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal pueden prepararse o bien directamente seleccionandolos de una fusion inicial, o bien pueden prepararse secundariamente a partir del hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de diferente isotipo utilizando la tecnica de seleccion sib para aislar variantes de cambios de clase aplicando el procedimiento descrito en Steplewski y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8653 o Spira y col. (1984) J. Immunol. Methods 74:307. Por tanto, los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion podnan incluir variantes de cambio de clase que tienen especificidad con el peptido deseado (p.ej., SEQ ID NO: 1-5).

La presente divulgacion describe asimismo fragmentos biologicamente activos de los anticuerpos policlonales y monoclonales descritos. Dichos fragmentos de anticuerpo retienen la capacidad para unirse selectivamente con su antfgeno o inmunogeno. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden incluir, sin limitarse a ellos: (1) Fab, el fragmento que contienen un fragmento de union a antfgeno monovalente de una molecula de anticuerpo producida por digestion con la enzima papama para producir una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molecula de anticuerpo obtenida por tratamiento con pepsina, seguido de reduccion para producir una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molecula de anticuerpo; (3) (Fab')2, el fragmento del anticuerpo que se obtiene por tratamiento con la enzima pepsina sin la posterior reduccion; F(ab')2 es un dfmero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos mediante dos enlaces disulfuro; (4) Fv, definido como un fragmento obtenido por ingeniena genetica que contienen la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (5) SCA, definido como una molecula obtenida por ingeniena genetica que contiene la region variable de la cadena ligera, la region variable de la cadena pesada, unidas por un engarce polipeptido adecuado, como la molecula de cadena fusionada geneticamente.

Los ejemplos espedficos de “fragmento de anticuerpo biologicamente activo” incluyen las regiones CDR de los anticuerpos. Los procedimientos para fabricar estos fragmentos son conocidos en la tecnica, vease por ejemplo, Harlow and Lane, (1988) supra.

Los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden modificar tambien para crear anticuerpos quimericos (Oi, y col. (1986) BioTechniques 4(3):214). Los anticuerpos quimericos son aquellos en los que varios dominios de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos estan codificados por ADN de mas de una especie.

Los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden unir a un agente detectable o un hapteno. El complejo es util para detectar los peptidos de la muestra utilizando tecnicas inmunoqmmicas normales, tales como inmunohistoqmmica, tal como describe Harlow and Lane (1988) supra y a traves de los procedimientos que se describen con mas detalle a continuacion. Entre los ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar los anticuerpos monoclonales de la divulgacion se incluyen inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Como ejemplos de dichos inmunoensayos se pueden mencionar ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y los ensayos tipo sandwich (inmunometrico) e inmuno-PCR. La deteccion del (los) peptido(s) utilizando los anticuerpos monoclonales de la divulgacion se puede realizar empleando inmunoensayos que se ponen en marcha de forma directa, inversa o simultanea, incluyendo ensayos inmunohistoqmmicos en muestras fisiologicas. Las personas especializadas en la tecnica sabran o podran discernir facilmente otros formatos de inmunoensayo sin una experimentacion indebida.

Otra tecnica que puede tener como resultado una mayor sensibilidad consiste en el acoplamiento de anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular. Dichos haptenos se pueden detectar espedficamente por medio de una segunda reaccion. Por ejemplo, esta extendido el uso de haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitroferrilo, pirodoxal y fluorescema que pueden reaccionar con anticuerpos anti-hapteno espedficos. Vease Harlow and Lane (1988) supra.

Los anticuerpos monoclonales de la invencion se pueden unir a muchos vehmulos diferentes. Entre los ejemplos de vehmulos conocidos se incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehmulo puede ser soluble o insoluble para los fines de la invencion. Las personas especializadas en la tecnica conoceran otros veldculos adecuados para la union de anticuerpos monoclonales, o podran determinarlos aplicando la experimentacion de

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rutina.

Existen muchos marcadores diferentes y procedimientos de marcado, conocidos entre las personas especializadas en la tecnica. Entre los ejemplos de los tipos de marcas que se pueden utilizar en la presente invencion se incluyen enzimas, radioisotopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Las personas especializadas en la tecnica conoceran otros marcadores adecuados para su union con el anticuerpo monoclonal, o podran determinarlos aplicando la experimentacion de rutina. Asimismo, la union de estos marcadores con el anticuerpo monoclonal de la divulgacion puede realizarse aplicando las tecnicas convencionales habituales entre las personas especializadas en la tecnica.

En algunas realizaciones, la presente invencion facilita el diagnostico, monitorizacion y/o determinacion del riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa (p.ej., EA) sobre la base del nivel de un peptido biomarcador (p.ej., fragmento de peptido AU, SEQ ID NO: 2) en celulas (p.ej. macrofagos, macrofagos activados). En algunas realizaciones, las celulas (p.ej. macrofagos, macrofagos activados) se afslan desde sangre (p.ej., sangre periferica) y/o fluido cerebroespinal. En algunos aspectos, el penodo de tiempo que transcurre entre el aislamiento de la celula (p.ej., macrofago, macrofago activado) y el ensayo es menos de menos de 5 dfas, menos de 4 dfas, menos de 3 dfas, menos de 2 dfas, menos de 1 dfa, menos de 18 horas, menos de 12 horas, menos de 8 horas, preferentemente menos de 6 horas, siendo sobre todo preferente menos de 4 horas. En algunos aspectos, se afslan o se purifican una o mas fracciones subcelulares, desde un tipo de celula (p.ej., macrofago, macrofago activado) desde una muestra. En algunos aspectos, la fraccion subcelular es una fraccion lisosomal. En algunos aspectos, los procedimientos de la presente invencion se combinan con evaluacion ex vivo de la actividad fagocitosis (p.ej., tal como se describe en el Ejemplo 1 y en PCT App. No. PCT/EP09/001210). En algunos aspectos, dicha valoracion de la actividad de fagocitosis comprende la incubacion de celulas (p.ej. macrofagos, macrofagos activados) desde una muestra con o sin peptidos (p.ej. fragmentos de peptido AU (p.ej., SEQ ID NO: 1-5). En algunos aspectos, la fagocitosis se evalua empleando tecnicas como separacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) y/o microscopfa confocal. En algunos aspectos, los procedimientos de la presente invencion incluyen el uso de tecnicas como inmunoprecipitacion en solitario o combinada con espectroscopia de masas (p.ej. IP-EM). En algunas realizaciones, la presente invencion se refiere al uso de anticuerpos espedficos de fragmento de peptido AU (SEQ ID NO 2) en el procedimiento de la invencion. En algunos aspectos, los procedimientos de la presente invencion encuentran uso en la monitorizacion de la eficacia del tratamiento y/o el avance de la enfermedad. En algunos aspectos, los procedimientos de la presente invencion encuentran uso en el diagnostico, monitorizacion, y/o evaluacion del riesgo de desarrollar enfermedades que implican la activacion de monocito/macrofago, extravasacion, fagocitosis y reentrada en la circulacion. En algunos aspectos, los procedimientos de la presente invencion encuentran uso en la monitorizacion de la fagocitosis de protema de precursor amiloide (PPA). Si bien la presente invencion no esta limitada a ningun mecanismo en particular, y no es necesaria una comprension del mecanismo para poner en practica la presente invencion, se contempla que la fagocitosis de PPA es un mecanismo central en la homeostasis PPA-amiloide alterada durante el avance de la enfermedad de Alzheimer.

A continuacion, se describira una realizacion de la presente invencion. Se obtiene una muestra de fluido cerebroespinal (FCE) de un paciente por puncion lumbar. Se manchan los macrofagos de la muestra con anticuerpos anti-CD 14 y anti-C16 marcados con fluorescente y, a continuacion, se extraen los macrofagos de la muestra por separacion de celulas activadas por fluorescencia.

Se seleccionan las celulas sobre la base de la expresion CD14 y CD16 ya que esto permite diferenciar los macrofagos activados de las celulas quiescentes (el aumento de la expresion CD16 significa un estado activado). Esta tecnica tambien evita el muestreo inadvertido de otros tipos de celulas como celulas dendnticas CD68 positivas. Este enfoque contrasta con el indicado por Fiala y col (39) en el que se seleccionan celulas CD68 positivas.

Se lisan las celulas macrofagos resultantes y se preparan para analisis de protemas. Se mezcla el lisado celular con anticuerpos monoclonales capaces de unirse a fragmentos de la protema Ap (SEQ. ID NO: 6, DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIA). Ejemplos de anticuerpos son 6E10, 4G8 y 11A50- B10 de los Signet Laboratories Inc., y los anticuerpos espedficos por ejemplo SEQ ID No: 1-5 antes descritos. Se usa el anticuerpo 6E10 para inmunoprecipitar los fragmentos Ap 1-16, los fragmentos Ap inmunoprecipitados 17-24 de anticuerpo 4G8 y los fragmentos Ap inmunoprecipitados 1-40 de anticuerpo 1 1A50-B10. En realizaciones alternativas, se puede utilizar un panel de anticuerpos diferente, espedfico para otros fragmentos. Los anticuerpos monoclonales tambien se acoplan a perlas magneticas, por ejemplo, con perlas unidas a anticuerpos anti-IgG. Las perlas magneticas se utilizan para extraer los fragmentos de la protema Ap. Los anticuerpos y las perlas se separan posteriormente de los fragmentos de peptido. Se analizan los fragmentos de peptido por espectrometna de masas MALDI-TOF y la secuencia de los fragmentos derivados de la masa molecular de cada fragmento. Se visualizan los resultados cuantitativamente para indicar la cantidad relativa de cada fragmento. Cuando no se detecta protema Ap ni fragmentos de protema Ap en los macrofagos, es indicativo de que el paciente tiene EA.

Los fragmentos Ap presentados en los espectros IP-EM son el resultado de la degradacion intracelular de acuerdo con el caracter del sitio catalfticamente activo y las condiciones de accion de proteasa/ peptidasas intracelulares. Dichos fragmentos no necesariamente corresponden a las secuencias de los fragmentos Ap encontrados extracelularmente en FCE. Por tanto, en algunos aspectos, para identificar la longitud exacta de cada fragmento Ap

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obtenido en el experimento, se a^slan los peptidos para determinar sus correspondientes secuencias de aminoacido.

Se podra apreciar que el procedimiento descrito detecta la presencia de los fragmented de protema Ap que estan presentes in vivo en el paciente. El procedimiento no implica una etapa por separado de exposicion de los macrofagos a la protema Ap in vivo, despues de la extraccion desde el paciente.

En algunas realizaciones, se compara el nivel de los fragmentos de protema Ap detectado con el nivel detectado en un individuo de control que no tienen EA. En dichas realizaciones, se hace una comparacion entre el nivel y el patron de los fragmentos de protema Ap del paciente y los del individuo de control. Cuando el nivel de los fragmentos de protema Ap esta significativamente por debajo de aquel del individuo de control, es indicativo de EA en el paciente. De manera similar, si el tipo de fragmentos de protema Ap presente en el individuo es significativamente diferente de los del individuo de control, es indicativo de EA en el paciente. En realizaciones alternativas, se genera un nivel normal de fragmentos de protema Ap detectando la presencia de dichos fragmentos en los macrofagos en FCE en una pluralidad de individuos de control que no tienen EA. A continuacion, se compara el nivel y el patron de fragmentos de protema Ap del paciente con el nivel normal y una reduccion estadfsticamente significativa del nivel o diferencia con el patron de la presencia de fragmentos es indicativa de EA.

En otros aspectos, se examina un solo paciente anualmente durante un pertedo de tiempo (p.ej. 10 anos). En cada ocasion, se estudian los niveles de los fragmentos de protema Ap en los macrofagos de una muestra de FCE del paciente, tal como se ha descrito. Un cambio significativo en el nivel o el patron de los fragmentos de protema Ap cada ano, en particular, una reduccion en el nivel de los fragmentos de protema Ap de ano en ano, es indicativa de la presencia de EA.

En ciertos aspectos de la divulgacion, se miden en el paciente tambien otros marcadores de EA, al mismo tiempo que se lleva a cabo el analisis descrito. Dichos marcadores de EA adicionales incluyen niveles anormales de Ap42, Tau, Fosfo-Tau o la relacion Ap42/Ap40 en la muestra de FCE obtenida del paciente o en el perfil de ARN de la sangre o muestra de FCE obtenida del paciente. Un nivel anormal de alguno de estos marcadores de EA adicionales, asf como un nivel anormal de fragmentos de protema Ap en los macrofagos en el FCE del paciente es indicativo de la presencia de EA. A modo de ejemplo, un nivel anormal (es decir patologico) de Ap42 es una concentracion en FCE de menos de 550 pg/ml. La concentracion de Tau depende de la edad, siendo los niveles altos patologicos. Un nivel patologico de Fosfo-tau es una concentracion en FCE de mas de 85 pg/ml. Un nivel patologico de la relacion Ap42/Ap40 es aquella en la que (Ap42/Ap4o) x 10 es menos de 1.

En los aspectos que se han descrito, se obtiene una muestra de FCE del paciente. Sin embargo, alternativamente, se estudia un tipo de muestra diferente, como por ejemplo una muestra de sangre. Dicha muestra alternativa se puede utilizar, ya que los macrofagos circulan desde la medula osea al SNC y por tanto, los macrofagos en la sangre del paciente pueden haber sido expuestos a protemas en el SNC. Naturalmente, es mas facil obtener una muestra de sangre que una muestra de FCE del paciente.

Un aspecto de la presente divulgacion aplica los siguientes criterios como base de una prueba de diagnostico para evaluar la enfermedad de Alzheimer en macrofagos activados/microglfas del paciente: 1) Se cumplen todos los criterios de la enfermedad, 2) Presencia y separacion de poblacion de celulas CD16+ en FCE y sangre segun la citometna de flujo; 3) Presencia/ausencia de fragmentos de peptido AU en el espectro EM despues de la inmunoprecipitacion con anticuerpos, 4) Procedimientos adoptados en la clmica. Se puede reemplazar la citometna de flujo e IPEM por otros procedimientos de separacion y diferenciacion de subtipos de celulas y analisis de fragmentos de peptidos.

Procedimientos de evaluacion del cumplimiento de los criterios de la enfermedad. Se somete al paciente a una investigacion clmica exhaustiva incluyendo un estudio de su historia medica, un examen ffsico, neurologico y psiquiatrico, pruebas de exploracion en laboratorio e imagenes MRI y PET del cerebro. Se realiza el diagnostico de EA de acuerdo con los criterios publicados recientemente [12]. El paciente es sometido a un examen ffsico y fisiologico exhaustivo al incorporarse en el programa de diagnostico en el hospital. El examen incluye cuestionarios neurofisiologicos para la identificacion de deficits cognitivos, examen neurologico, analisis genetico, biomarcadores FCE, imagenes y perfil metabolico.

Procedimientos para evaluar la presencia y separacion de poblacion de celulas CD16+ en FCE y sangre por citometna de flujo. Se adquieren las celulas en un sistema de separacion de celulas FACSAria y se analizan utilizando un software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Se separan las poblaciones de celulas FCE sobre la base de su expresion de marcadores superficiales pertinentes (CD). Se seleccionan las celulas con arreglo a las propiedades de dispersion de la luz directa o lateral y se seleccionan positivamente segun la presencia de CD45+ CD3+ CD4+ CD8 (caracterizacion de poblacion de linfocitos T), y Cd45+ CD14+ CD16+ CD19 (caracterizacion de macrofagos activados y poblacion de linfocitos B). Para preservar intactas las celulas inmunes, se realiza la separacion de celulas a un maximo de cuatro horas tras la puncion. Se lisan las celulas separadas CD14+/CD16+ y se mantienen congeladas a - 80 °C para posterior analisis (analisis de protemas). Ademas de recoger las celulas para el analisis de protemas, los resultados de citometna indican la distribucion de celulas inmunes de FEC y (sangre) periferica del paciente.

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Procedimiento de preparacion de celulas para inmunoprecipitacion. Se separan poblaciones de celulas FCE sobre la base de su expresion de marcadores superficiales pertinentes (CD). Se seleccionan las celulas con arreglo a las propiedades de dispersion de luz directa y lateral y se seleccionan positivamente segun la presencia de CD45+ CD3+ CD4+ CD8 (caracterizacion de poblacion de linfocitos T), y CD45+ CD14+ CD16+ Cd19 (caracterizacion de macrofagos activados y poblacion de celulas B). Se obtiene y se registra la poblacion de celulas y el numero de celulas de cada poblacion. El numero de celulas activadas en pacientes a los 7-10 dfas de un ictus es alto, lo que indica la circulacion de celulas reclutadas tambien en el compartimento de FCE de un gran numero de celulas inmunes. El numero de macrofagos activados en EA equivale en gran medida al del grupo DCL/no-EA. El total del % de celulas activadas en EM es inferior que en EA; lo que puede deberse al proceso inmune en EM implica principalmente linfocitos T. Se lavan las celulas separadas con 400 pl de PBS y se centrifugan (4 °C, 750 x g, 5 min). Se retira el sobrenadante y se prepara para analisis IPEM anadiendo 10 mil de tampon RIPA para lisis celular y manteniendolo a - 80°C antes del analisis de protemas.

Procedimiento de inmunoprecipitacion. Se anaden por separado una parte almuota (4 pg) de anticuerpos monoclonales 6E10 (1 mg/ml, epftopo 4-9), 4G8 (1 mg/ml, epftopo 18-22), o 11A50-B10 (0,5 mg/ml, reactivo con el termino C) (Signet Laboratories, Inc.) a 50 pl de perlas magneticas Dynabeads (IgG anti raton de oveja) y se incuba durante toda la noche en una plataforma oscilante a + 4 °C. Se separa el anticuerpo sin unir restante por lavado dos veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Despues de anadir 1 ml de FCE a las perlas revestidas con anticuerpo, se continua la incubacion durante 1 hora mas a + 4 °C. Se aglomeran las perlas durante 5 minutos utilizando un concentrador de partmulas magnetico (Dynal MPC) y se lavan dos veces con PBS (pH 7,4) y dos veces con 50 mM bicarbonato de amonio (pH 7,3). Despues del lavado final, se eluyen los peptidos AU extrafdos anadiendo 20 pl de acido formico al 0,5 % (AF) en agua. Despues de aplicar agitacion vorticial durante 2 minutos a temperatura ambiente, se aglomeran las perlas utilizando el concentrador de partmulas magnetico y se recoge el sobrenadante. Se seca el sobrenadante recogido en una centnfuga de vado y se vuelve a disolver en 5 pl de 0,1 % de AF en 20 % de acetonitrilo (ACN). Todos los disolventes utilizados tienen calidad HPLC y todas las soluciones acuosas se preparan utilizando 18,2 M de agua desionizada obtenida de un sistema de purificacion Millipore.

Procedimientos de evaluacion de la presencia /ausencia de Ap en espectros de EM tras inmunoprecipitacion. Se utiliza IP-EM para aislar y determinar el contenido en peptido AU (signatura AU) en macrofagos CD14+/CD16+ separados por citometna de flujo. Los peptidos AU procesados proteolfticamente son diffciles de detectar aplicando los procedimientos proteomicos normales, posiblemente porque comprenden un grupo heterogeneo de peptidos N- y C-terminalmente truncados, algunos en baja cantidad. El analisis IP-EM ha sido utilizado anteriormente para obtener una signatura de peptido AU con exito [43] [44]. Brevemente, se han aislado peptidos AU de macrofagos lisados utilizando anticuerpos monoclonales anti AU y perlas magneticas Dynabead. A continuacion, se realiza un analisis de espectrometna de masas de desorcion e ionizacion por laser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) sobre los peptidos inmunoprecipitados y se calcula la signatura Ap de macrofago. La ausencia de senal Ap en la muestra de ensayo se interpreta como un diagnostico EA positivo.

Procedimientos alternativos. En las variantes de los procedimientos descritos se aplican las siguientes tecnicas.

1. En lugar de utilizar citometna de flujo para separar las celulas, se extraen las celulas macrofagos activados /microglia por extraccion magnetica, tecnicas de flotacion u otras tecnicas de extraccion basadas en anticuerpos o por afinidad, p.ej. cromatograffa, centrifugacion de gradiente. Alternativamente, se estudian las celulas utilizando inmunohistoqmmica.

2. Inmunoprecipitacion utilizando otros anticuerpos espedficos para el peptido/protema de interes.

3. En lugar de utilizar espectrometna de masas, se emplea otra tecnica para el analisis cuantitativo o semi- cuantitativo de peptido/protema como por ejemplo: HPLC-fluorescencia o - UV, luminiscencia, sistemas estreptavidina/biotina, inmunohistoqmmica.

Afecciones alternativas. En aspectos alternativos, se estudia un estado patologico diferente caracterizado por la presencia de fragmentos de una protema marcadora en el cerebro del paciente. En cada caso, es necesario identificar la afeccion que se va a estudiar y la correspondiente protema que caracteriza la afeccion. Entre los ejemplos de afecciones se incluyen: enfermedad de Parkinson, en la que la protema de caracterizacion es ubiquitina; Esclerosis multiple, en la que la protema basica mielina caracteriza la afeccion; Demencia FrontoTemporal y esclerosis lateral amiotrofica que se caracterizan por la protema tau; y enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y EA que se caracterizan por protema alfa-sinuclema. En cada uno de estos casos, el procedimiento de deteccion o monitorizacion se lleva a cabo tal como se ha descrito en relacion con EA, con la excepcion de que los anticuerpos utilizados para inmunoprecipitar los peptidos desde los macrofagos se sustituyen por anticuerpos que son capaces de unirse a fragmentos de la protema que caracteriza la afeccion. Asimismo, en el caso de esclerosis multiple, unos niveles anormalmente altos de protema marcadora ubiquitina son indicativos de la presencia de la enfermedad.

En algunos aspectos, se determinan por ensayo varias de estas afecciones simultaneamente por inmunoprecipitacion de lisados celulares con multiples grupos de anticuerpos, siendo espedfico cada grupo de anticuerpos para fragmentos de diferentes protemas de caracterizacion.

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En algunos aspectos de la divulgacion, se proporciona un kit de diagnostico con el fin de dar cabida a la deteccion de un estado patologico segun la invencion (es decir una afeccion caracterizada por la presencia de fragmented de una protema marcadora en el cerebro de un paciente que padece dicha afeccion). El kit es adecuado para su uso en los laboratorios clmicos habituales, ya que se basa en una tecnica ELISA/inmuno-PCR y por tanto no requiere el uso de tecnicas MALDI-TOF o IP-EM, tal como se ha descrito en algunas realizaciones anteriores. El kit comprende un panel de anticuerpos espedficos diana que son espedficos para un primer epftopo de la protema marcadora. Por tanto, por ejemplo, en los casos en los que el estado patologico que se ha detectar es enfermedad de Alzheimer, la protema marcadora es una protema Abeta 42. El kit comprende asimismo un suministro de perlas magneticas que despliegan anticuerpos espedficos de macrofago (por ejemplo, anticuerpos espedficos para marcadores celulares CD14 y CD16); un agente de lisado celular como, por ejemplo, tampon de ensayo de radioinmunoprecipitacion (RIPA) que contiene 25 mM Tris- HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 % desoxicolato de sodio y 0,1 % SDS (Pierce Biotechnology); y un anticuerpo secundario que es espedfico para un segundo epftopo de la protema marcadora. Se conjuga el anticuerpo secundario con una molecula marcadora de ADN de doble cadena.

A continuacion, se describira el kit en la practica. Se obtiene una muestra, como por ejemplo sangre periferica o FCE, de un paciente y se afslan las celulas macrofago de la muestra por mezclando con las perlas magneticas proporcionadas en el kit. Los anticuerpos espedficos de macrofago que se despliegan en las perlas magneticas se unen a los macrofagos en la muestra el paciente y a continuacion, se retiran los macrofagos y las perlas magneticas de la muestra por medios magneticos. A continuacion, se liberan las celulas macrofago de los anticuerpos espedficos de macrofago ajustando el pH de la solucion y se lisan las celulas macrofago con un agente de lisado para liberar el contenido de celulas que incluye la protema marcadora. En el kit de diagnostico se proporciona tambien un soporte solido en el que se inmoviliza una pluralidad de anticuerpos diana que son espedficos para la protema marcadora. El contenido de la celula macrofago lisada se pone en contacto despues con el soporte solido de manera que el primer epftopo de la protema marcadora se une al anticuerpo diana.

Se pone en contacto el soporte solido con un anticuerpo secundario que se conjuga con una molecula marcadora de ADN de doble cadena. El anticuerpo secundario es espedfico para el segundo epftopo de la protema marcadora de manera que el anticuerpo secundario se inmoviliza sobre el soporte solido cuando esta presente la protema marcadora. A continuacion, se lavan las protemas sin unir y el anticuerpo secundario sin unir y se retiran.

A continuacion, se somete el soporte solido lavado a PCR en tiempo real que funde la molecula marcadora de ADN de doble cadena y amplifica el numero de copias para identificar el numero de copias de la molecula marcadora de ADN. El numero de copias de la molecula marcadora de ADN tras una serie de ciclos predeterminados de amplificacion por PCR es indicativo del numero de partida de moleculas de ADN. Por otra parte, existe una relacion uno-a-uno entre el numero de partida de moleculas de ADN y el numero de protemas marcadoras unidas. Por lo tanto, esta tecnica de inmuno-PCR proporciona una indicacion precisa del numero de moleculas de protema marcadora en la muestra del paciente.

Por consiguiente, dichos kits de diagnostico dan cabida a un procedimiento inmunologico sencillo que se puede utilizar en los laboratorios clmicos normales disponibles en todos los hospitales, clmicas privadas y laboratorios comerciales para analizar muestras de paciente de acuerdo con la presente invencion. El uso del kit del procedimiento de la invencion no requiere el uso de instrumentos caros o avanzados de laboratorio y la deteccion mediante el uso de la tecnica inmuno-PCR asegura una alta sensibilidad.

En algunas variantes de los kit de diagnostico que se han descrito, se proporciona una pluralidad de paneles de anticuerpos en el kit. Por ejemplo, en una variante, el kit comprende anticuerpos de primera diana que son espedficos de un primer epftopo (p.ej. SEQ ID No: 1-5) de la protema Ap y anticuerpos de segunda diana que son espedficos para un segundo epftopo de protema Ap (p.ej. SEQ ID No: 1-5). En otros aspectos mas, se proporciona una pluralidad de paneles de anticuerpo en el kit y los anticuerpos son espedficos para protemas marcadoras que corresponden a uno o mas estados patologicos. Por ejemplo, en una variante en particular, se proporciona un panel de anticuerpos espedfico para la protema Abeta (la protema marcadora para la enfermedad de Alzheimer) y se proporciona un panel de anticuerpos espedfico para esclerosis multiple (en la que la protema mielina basica es la protema marcadora). En estas variantes, es preferible, que los diferentes paneles de anticuerpos secundarios, cada uno de ellos espedfico para la correspondiente protema marcadora y conjugados cada uno de ellos con una molecula marcadora de ADN diferente, se proporcionen de modo que la senal para la deteccion de cada protema marcadora se pueda distinguir.

En los aspectos del kit de diagnostico que se han descrito, la marca detectable es una molecula marcadora de ADN. Sin embargo, en otros aspectos, se utiliza una marca detectable diferente. Por ejemplo, la marca detectable puede ser un fluoroforo, una microperla de latex o una partteula de oro. Dichas marcas detectables alternativas son utiles cuando se proporciona el kit solamente para proporcionar un resultado cualitativo en lugar de un resultado cualitativo.

En algunos aspectos alternativos del kit, no se proporciona agente de lisado como tal, sino que se lisan las celulas mecanicamente, p.ej., por centrifugacion, antes del aislamiento de los macrofagos.

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Se debe apreciar tambien que los kit de diagnostico de la presente divulgacion no se limitan a kits que comprenden anticuerpos. En realizaciones alternativas, los anticuerpos de kit estan reemplazados por otros reactivos de union como fragmentos de union a antigeno (p.ej., fragmentos F(ab')2 o fragmentos Fab) o una secuencia de polinucleotidos. Normalmente, dichos reactivos de union distintos tienen afinidades de union a sus dianas comparables a las de los anticuerpos como por ejemplo tienen afinidad de union de menos de 100 nm en una solucion acuosa tamponada a un pH comprendido entre 4 y 8.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para demostrar e ilustrar mejor ciertas realizaciones y aspectos preferentes de la presente invencion y no deben interpretarse como limitativos de su ambito.

Ejemplo 1 Identificacion de peptidos beta amiloides (Ap) en monocitos /macrofagos aislados

Se aislaron monocitos/macrofagos de sangre periferica de un voluntario sano y se incubaron con la adicion de Ap42 sintetico en el medio de cultivo durante toda la noche para facilitar la absorcion y fagocitosis de Ap42. Se incluyo una muestra sin la adicion de Ap42. La recogida de la muestra y el aislamiento de monocito/macrofago se realizaron tal como se describe en el documento PCT App. No. PCT/EP09/001210.

Despues de recoger las celulas, se extrajeron organulos celulares (ER, mitocondria, endosomas, lisosomas, etc.) y se separaron posteriormente en un gradiente iodixanol por centrifugacion. Se analizaron polipeptidos presentes en la fraccion de organulos que correspondfan a los lisosomas por espectroscopia de masa con busqueda de bases de datos basadas en la secuencia de aminoacido Ap42.

Se identificaron varios fragmentos Ap42 y se observo que eran espedficos para el estado de fagocitosis de Ap42. Asimismo, dos peptidos mas cortos fueron identificados ineqrnvocamente y aun con ello suficientemente largos para epttopos antigenicos presentes con bastante probabilidad, los tramos GSNKGAI (25-32 de la molecula Ap42, que corresponde a la secuencia 621-627 de la PPA), y FAEDVG (20-25 de la molecula Ap42, que corresponde a 616621 en PPA) ambos parcialmente en la region de transmembrana (Figura 4).

Se identificaron cinco nuevos fragmentos Ap1-42 y estos epftopos de antfgeno presentes con bastante probabilidad. Estos fragmentos se representan como SEQ iD NO: 1-5 en la Figura 2 y tienen las siguientes secuencias de aminoacido:

SEQ ID NO: 1: FAEDVG (20-25 de la molecula Ap1-42, que corresponde a 616-621 en PPA)

SEQ ID NO: 2: AEDVGSNKGAI (21-31 de la molecula Ap1-42, que corresponde a la secuencia 617-627 de la PPA)

SEQ ID NO: 3: GSNKGAIIGLM (25-35 de la molecula Ap1-42, que corresponde a 621-631 en PPA)

SEQ ID NO: 4: GSNKGAI (25-32 de la molecula Ap1-42, que corresponde a la secuencia 621-627 en PPA)

SEQ ID NO: 5: VGSNKGAIGL (24-34 de la molecula Ap1-42, que corresponde a el tramo 620-630 en PPA)

Todos los fragmentos estan localizados dentro de la region de transmembrana de la molecula Ap1-42. Aunque la presente invencion no esta limitada a ningun mecanismo en particular, ni es necesario comprender el mecanismo para poner en practica la presente invencion, se contempla que es probable que se generen mediante enzimas de segmentacion de Ap como la enzima degradante de la insulina (EDI) y neprilisina (Malito y col. (2008) Cell Mol Life Sci, 65:2574-2585).

Ejemplo 2

Sintesis de Antfgenos

Sobre la base del experimento descrito en el Ejemplo 1, se seleccionaron los siguientes peptidos para un posterior estudio y se produjeron por Eurogentec, (MedProbe Noruega):

Antfgeno 1 (SEQ ID NO: 2): H2N - AED VGS NKG AI - CONH2 Antfgeno 2 (SEQ ID NO: 3): H2N - GSN KGA IIG LM - CONH2 Antfgeno 3: (SEQ ID NO: 5): H2N - VGS NKG AIG L- CONH2

Ejemplo 3

Inmunizacion de ratones para obtener respuesta a los peptidos sinteticos. Establecimiento de clones que producen anticuerpos monoclonales contra metabolitos de AP1-42 espedficos de Alzheimer desde dentro de lisosomas de monocitos

Animales: 6 ratones hembra BALB/c, 10 ratones NMRI

Se inmunizo a los ratones BALB/c 27/12-10 siguiendo la pauta que se registra en la Tabla 1. Se realizo una segunda inmunizacion (refuerzo), 31/1-11, con la misma pauta aplicada sin adyuvantes y se inyecto el peptido i.p. e i.v. Se extrajo sangre de los ratones y se analizo en Diatec Monoclonals AS para determinar la presencia de anticuerpos

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35

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45

espedficos. Los macrofagos de ratones NMRI sirvieron como celulas nutrientes para la produccion de anticuerpos in vitro. La exploracion de las muestras de sangre de los ratones n. 1-6 contra la mezcla de antigenos con y sin KLH tuvo como resultado hits de los ratones n. 1,4 y 5, asf como hits negativos del raton n. 6. La sangre del raton n. 2 fue negativa mientras que la sangre del raton n. 3 fue fuertemente positiva para la mezcla de peptidos que inclma KLH, lo que indica una respuesta inmune contra KLH en lugar de los peptidos. Se extrajeron los bazos de los tres ratones positivos + el raton de control en la semana 7 de 2011, concluyendo asf el trabajo con animales sin un tercer refuerzo de inmunizacion.

Tabla 1

N raton

Peptido Adyuvante

1

Ag1 200 pl IP Adyuvante completo de Freund 200 pl IP (1:1 emulsion con peptido)

2

Ag2 200 pl IP

3

Ag1 66,7 pl IP Ag2 66,7 pl IP Ag3 66,7 pl IP

4

5

6

PBS 200 pl IP

Se disgregaron los bazos de los ratones que incluyeron anticuerpos contra los peptidos y se incubaron las celulas con celulas nutrientes de ratones NMRI para expansion clonal. Tras ELISA y una segunda reclonacion de clones seleccionados que presentaban buena especificidad contra el clon antigeno 6D3/1/15 (raton 5), 2A3/1/13 (raton 1) y 3B7/1/16 (raton 5) dieron buenos resultados. Los tres clones dieron una respuesta espedfica contra Antigeno 1 y fueron incluidos en el banco de celulas y el banco de celulas maestras (MCB). Se realizo una produccion de ensayo de una ampolla (el MCB) de cada clon. Concentracion: 1mg/ml, 0,09% azida. 3B7/2/6 (6,7 ml), 2A3/2/15 (12,2 ml), 6D3/2/22 (28 ml). Entregado 29.06.2011. IgG de raton isotipo.

Ejemplo 4

Medida de la presencia de antigeno en una muestra biologica utilizando celulas de leucemia monocitica aguda THP-1 (coleccion de cultivos tipo de Estados Unidos (ATCC).

En la Figura 6 se proporciona una descripcion esquematica de un ensayo inmune-PCR utilizando los anticuerpos descritos en el Ejemplo 3. El anticuerpo de captura es uno de los tres anticuerpos desarrollados por inmunizacion. Los otros dos anticuerpos se conjugaran directamente con una marca ADN espedfica que se amplifica por PCR en tiempo real.

Para el ensayo, se cultivan celulas THP-2 en 2 botellas con medio RPMI que contiene 10 % FBS y 1 % de antibiotico. Las celulas se diferencian utilizando una concentracion final de 100 nM TPA durante 17 h. Se anade a una botella AP1-42 sintetico hasta una concentracion final de 2,5 ng/pl, el otro se mantiene sin tratar. Se incuban las celulas durante toda la noche a 37 °C en una atmosfera humidificada con 5 % de CO2. A continuacion, se lavan las celulas y se tripsinizan (Trypsin-Versene (EDTA) de Lonza) para liberar las celulas unidas de la superficie del fondo.

Citometna de flujo de celulas THP-1. Se hace un recuento de las celulas y se someten cuatro tubos con un contenido de 100.000 celulas cada uno a fijacion y permeabilizacion utilizando un equipo IntraPrep de Beckman Coulter, Inc. Estados Unidos para permitir el manchado de dianas intracelulares. Se manchan dos tubos (un tubo que ha recibido Ap y otro sin tratar) con dos anticuerpos monoclonales con AP1-42 disponibles en el mercado (6E10 y 4G8 originados en ratones) y se manchan dos tubos (un tubo que ha recibido Ap y un tubo sin tratar) con anticuerpos de control de isotipo apropiado (IgG1 e IgG2b de raton). Todos estos anticuerpos se obtienen de Nordic BioSite AS, Noruega. Se utiliza el anticuerpo secundario anti raton de cabra AlexaFluor488 (Invitrogen Dynal AS, Noruega) para detectar tanto los anticuerpos espedficos de Ap como los controles isotipos. Se mantienen las celulas en una solucion fijadora IOTest3 (Beckman Coulter, INC, Estados Unidos) a 4 °C durante toda la noche antes de realizar el analisis de citometna de flujo en un FACS CantoII de BD. Finalmente se adquieren las celulas y se seleccionan sobre la base de sus propiedades de dispersion y fluorescencia. Los monocitos/macrofagos positivos para AlexaFluor488, es decir con una senal fluorescente mayor que los controles isotipo, se consideran Ap-positivos. Se realiza el analisis utilizando un software FACS Diva (BD).

Preparacion de muestras para inmuno-PCR. Se centrifuga el resto de las celulas (Aprox. 319 000 celulas que reciben AP1-42 y aprox. 560 000 celulas sin tratar), a 1000 g durante 10 minutos. Se separa el sobrenadante y se anaden 40 pl de agente de lisado, M-PER® (reactivo de extraccion de proterna de mairnfero de Pierce)), se anade 1 % de coctel de inhibidor de proteasa (Sigma Life Sciences) al aglomerado de celulas.

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10

15

20

25

30

Se incuban los lisados en una mezcladora durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubacion, se mantienen las muestras congeladas hasta el analisis.

Se biotinila el anticuerpo de deteccion 3B7/2/6 internamente (kit de conjugacion de biotina Lightning-Link tipo A (Innova Biosciences)) para su union a un conjugado de deteccion anti-iotina.

Se realiza el desarrollo de inmuno-PCR utilizando el kit de desarrollo de ensayo Imperacer® (Chimera Biotec, Alemania).

Ensayo de pre-preparacion - Inmovilizacion de anticuerpo de captura. Se diluye anticuerpo 6D3/2/22 en tampon de revestimiento (concentracion final 10 pmg/ml). Se anaden 30 pl de anticuerpo diluido a cada uno de los pocillos. Se sellan los pocillos con papel metalizado y se incuban durante al menos 16 horas a 4 °C. Se lavan los pocillos y se anade bloque directo de quimera (240 pl/pocillo) durante 30-60 segundos a temperatura ambiente con agitacion orbital. Se anaden 30 pl de cuatro diluciones utilizando el antigeno 1 sintetizado a cada pocillo (0 ng/ml, 0,1 ng/ml, I ng/ml, y 10 ng/ml) como patrones. Se anaden 30 pl del lisado de celulas tratadas con Ap y celulas sin tratar a cada pocillo. Se incuban las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la agitacion orbital.

Despues de la incubacion del analito, se anaden 30 pl de anticuerpo de deteccion primario biotinilado (anticuerpo 3B7/2/6, concentracion final 1 pg/ml) a la muestra para acoplarlo al analito inmovilizado. Se incuban las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion orbital.

Despues de la incubacion con anticuerpo de deteccion primario, se anaden 30 pl/pocillo de conjugado Imperacer® CHI-biotina (1:3000) a las muestras. Se incuban las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion orbital.

Se lavan las muestras y se anaden 35 pl de mezcla maestra de PCR. A continuacion, se incuban los pocillos a 95 °C durante 5 minutos. Despues de la incubacion, se transfieren 30 pl de las muestras a la placa de reaccion (placa de reaccion de 96 pocillos Micro Amp Fast Optical (Applied Biosystems)). Ademas de los patrones y las muestras, se incluye un control de PCR positivo y negativo en la placa de reaccion.

PCR en tiempo real. Se lleva a cabo la PCR utilizando un sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast (Applied Biosystems). Se establece FAM como fluoroforo (emision a 518 nm).

Tabla 2. Programa de PCR en tiempo real:

Tiempo

Temperatura Repeticiones

4 minutos

CD cn o o 1x

12 segundos

CD cn o o 50x

30 segundos

cn o o O

30 segundos

o o CM

En la figura 7, la Figura 8 y la Tabla 3 se dan los resultados.

Tabla 3.

Muestra

Valor Ct

0 ng/ml

33,497

0,1 ng/ml

33,216

1 ng/ml

30,347

10 ng/ml

26,734

lisado celular de celulas THP-1 que recibieron Ap

29,65

lisado celular de THP-1 sin tratar

30,332

El valor Ct representa el primer ciclo de PCR en el que la senal indicadora excede la senal de un “umbral” uniforme dado.

Conclusion.

El valor Ct para la muestra que recibio Ap adicional es inferior que el de la muestra sin tratar. La concentracion para esta muestra es 4, 91 ng/ml cuando se aplica la ecuacion para una curva normal. La concentracion para la muestra sin tratar es 3, 79 ng/ml. Esto indica una mayor presencia de antfgeno 1 en el lisado celular que recibio Ap y

5

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15

20

25

30

35

40

demuestra que es posible medir los productos de degradacion de Ap en muestras biologicas con este procedimiento. Ejemplo 5

Medida de la presencia de antigeno en monocitos/macrofagos de paciente con EA (F, edad 62 anos) y control de persona sana (conyuge) (M, edad 60 anos).

Se extrajo sangre heparinizada (8 ml) por venipuntura. Se aislaron de la muestra de sangre, celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con Histopaque®1077 de Sigma-Aldrich Corporation, Estados Unidos, es decir, los granulocitos y los globulos rojos se excluyen de las siguientes etapas. Se afslan monocitos/macrofagos de otras celulas por citometna de flujo. Se analizan las celulas en un FACS Aria de BD. Se adquieren las celulas y se seleccionan sobre la base de sus propiedades de dispersion directa (tamano) y dispersion lateral (granularidad). Se separa la poblacion de monocitos/macrofagos en tubos dedicados (paciente y control).

Citometna de flujo de monocitos/macrofagos de paciente y control

Manchado intracelular de macrofagos/monocitos de paciente y control utilizando anticuerpos monoclonales disponibles en el comercio contra Appi-42. Se sometio todas las celulas a fijacion y permeabilizacion empleando el kit IntraPrep de Beckman Coulter, Inc, EE.UU. para permitir el manchado de dianas intracelulares. Un tubo (100.000 PBMC) tanto del paciente como el control se mancha con dos anticuerpos monoclonales disponibles en el mercado contra Ap42 (6E10 y 4G8 originados de ratones) y un tubo tanto del paciente como del control se mancha con anticuerpos de control de isotipo apropiado (IgG1 e IgG2b de raton). Todos estos anticuerpos se obtienen de Nordic BioSite AS, Noruega. Se utiliza el anticuerpo secundario anti-raton de cabra AlexaFluor488 (Invitrogen Dynal AS, Noruega) para detectar tanto los anticuerpos espedficos de Ap como los controles de isotipo. Se mantienen las celulas en solucion fijadora IOTest3 (Beckman Coulter, INC, Estados Unidos) a 4°C durante hasta 5 dfas antes del analisis de citometna de flujo en un FACS CantoII de BD. Los monocitos/macrofagos positivos para AlexaFluor488, es decir con una senal fluorescente mayor que los controles de isotipo, se consideran Ap-positivos. Se realiza el analisis utilizando software FACS Diva (BD).

Preparacion de celulas para inmuno-PCR

Se centrifugan monocitos/macrofagos (440 000 celulas) a 1200 g durante 10 min. Se retira el sobrenadante y se anaden 50 pl de agente de lisado, M-PER® (reactivo de extraccion de protema de mairtifero de Pierce) se anade 1 % de coctel de inhibidor de proteasa (Sigma Life Sciences) al aglomerado celular.

Se incuban los lisados en una mezcladora durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubacion se mantienen las muestras congeladas hasta el analisis.

Inmuno-PCR.

Se lleva a cabo la Inmuno-PCR tal como se ha descrito antes. Se anaden30 pl de cuatro diluciones utilizando el antigeno sintetizado 1 a cada pocillo (0 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, y 1,0 ng/ml) como patrones.

Resultados del ejemplo 5

En la Figura 10 se dan los resultados del analisis de citometna de flujo (histogramas 10a y 10b).

PCR en tiempo real

En la Tabla 4 y la Figura 11 se dan los resultados.

Tabla 4

Muestra

Valor Ct

0 ng/ml

38,005

0,1 ng/ml

36,419

0,5 ng/ml

34,708

1 ng/ml

33,736

Paciente

36,415

Control

35,71

El valor Ct representa el primer ciclo de PCR en el que la senal indicadora excede la senal de un “umbral” uniforme dado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Conclusion: El valor Ct para el control es mas bajo que para el paciente. La concentracion para el control es 0, 40 ng/ml cuando se aplica la ecuacion para la curva patron. La concentracion para el paciente es 0, 22 ng/m, lo que demuestra una mayor cantidad de antfgeno 1 en celulas de control en comparacion con el paciente. Aunque tanto el paciente como el control parecen tener una cantidad proxima o igual de AP1-42 intracelular segun la citometna de flujo, este resultado de PCR en tiempo real indica que este procedimiento de puede utilizar para medir productos de degradacion espedficos en muestras biologicas diferenciando pacientes de controles.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Akershus universitetssykehus Fladby, Tormod Johnsen, Lisbeth Mollergard, Hanne Mali

<120> Procedimientos y composiciones para monitorizar actividad fagodtica

<130> INVEN-31699/WO-1/ORD

<150> US 61/417.559 <151>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Phe Ala Glu Asp Val Gly 1 5

<210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie 15 10

<210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 3

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met 15 10

<210> 4 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

Sly Ser Asn Lys Gly Ala lie 1 5

<210>5 <211> 10

5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>5

Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie Gly Leu 15 10

10

<210>6 <211> 42 <212> PRT

15 <213> Homo sapiens

<400> 6

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40

20

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de diagnostico, monitorizacion y/o evaluacion del riesgo de una enfermedad neurodegenerativa en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento:

   a) proporcionar una muestra obtenida de un paciente, comprendiendo dicha muestra un tipo de celula seleccionado del grupo que consiste en leucocitos, monocitos, macrofagos y macrofagos activados; y

   b) detectar el nivel del peptido que tiene al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 en dicha muestra, en el que una disminucion en el nivel de dicho peptido en relacion con el nivel del control es indicativa de la presencia o gravedad de dicha enfermedad neurodegenerativa en dicho paciente.
2. 2. Procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia con cuerpos de Lewy.
3. 3. Procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre, una muestra de tejido y una muestra de fluido cerebroespinal.
4. 4. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho tipo de celula es un macrofago.
5. 5. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho nivel de control se selecciona del grupo que consiste en el nivel en dicho paciente en un momento diferente, el nivel en un paciente diferente que no presenta dicha enfermedad neurodegenerativa y el nivel promedio en una pluralidad de pacientes que no presentan dicha enfermedad neurodegenerativa.
6. 6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende ademas el aislamiento de dicho tipo de celula seleccionado del grupo que consiste en leucocitos, monocitos, macrofagos y macrofagos activados.
7. 7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas la incubacion de dichas celulas aisladas con el polipeptido sintetico Ap42.
8. 8. Uso de una inmunoglobulina que se une a un peptido que tiene al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 en un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. Uso de una inmunoglobulina de la reivindicacion 8, estando la inmunoglobulina marcada o haptenilada.
10. 10. Uso de un kit que comprende uno o mas de un primer anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un peptido que tiene al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
11. 11. Uso de un sistema que comprende dos inmunoglobulinas que se unen a un peptido que tiene al menos 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. 12. Uso de un sistema de la reivindicacion 11, en el que al menos una de dichas inmunoglobulinas esta preferentemente haptenilada o marcada.
13. 13. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, o uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, teniendo el peptido al menos 85 %, preferentemente 90 %, mas preferentemente 95 % de identidad con SEQ ID NO: 2.
14. 14. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, consistiendo el peptido en SEQ ID NO: 2.