CN107864671A - 星形细胞创伤节和神经创伤生物标志物 - Google Patents

星形细胞创伤节和神经创伤生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测或监测受试者的创伤性脑损伤(TBI)或脊髓损伤(SCI)的状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使从所述受试者获得的体液样本与用于测定选自醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP)的TBI标志物或ALDOC或BLBP的创伤特异性分解产物(BDP)的试剂接触。所述方法还包括测量与对照样品相比所述样本中存在的标志物的量，以及当与所述对照样品相比所述样本中存在升高量的标志物时确定TBI或SCI的存在。所述方法可包括测量以下的量：谷氨酰胺合成酶(GS)，星形细胞磷蛋白PEA‑15(PEA15)，αB‑晶体蛋白(CRYAB/HSP27)，ALDOC、GS、PEA15或CRYAB的裂解产物，或者其两种或更多种的组合。

Description

星形细胞创伤节和神经创伤生物标志物
本申请要求2015年5月5日提交的美国临时专利申请号62/157,389的权益，其全部内容以引用的方式并入本申请中。
对经由EFS-WEB提交的序列表的引用
在2016年5月5日创建并且与本申请一起经由EFS-Web以电子方式提交的大小为3kb的名称为“UCLA217_SL”的序列表的ASCII文本文件的内容以引用的方式整体并入本文。
政府资助的确认
本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的NS072606进行。政府享有本发明的某些权利。
本发明是在美国国防部USAMRMC CDMRP奖授予的批准号FSECSTS EMS#12339079的政府支持下完成进行。政府享有本发明的某些权利。
发明技术领域
本发明涉及物质组合物，包括抗体、探针、试剂盒和相关材料，以及其用于检测神经创伤、早期预测神经创伤的严重程度和结果、监测神经创伤的进展和治疗的用途，所述神经创伤包括创伤性脑损伤(TBI)、轻度TBI(脑震荡)和创伤性脊髓损伤(SCI)，以及所述神经创伤与慢性神经退行性疾病的区别。
发明背景
每年在美国170万人遭受TBI。每年发生介于160万与380万之间的通常未报告的脑震荡，从而使得TBI成为具有重要意义的无声流行病。美国急诊科每年对另外一百万名患者的脊髓损伤进行评估，其中其2％-3％患有脊髓损伤。由于不断发展的损伤进展，神经创伤患者的救生治疗决策需要快速诊断和重复精确的风险评估，因为脑创伤受害者的状况通常在TBI后每天变化。评估中度和重度创伤性脑损伤和脊髓损伤患者对于安全紧急护理、监测损伤演化以准备好对继发不良事件作出反应以及对于预测为神经创伤患者的恢复可能性的早期评估的结果至关重要。神经创伤患者评估受到患者之间的严重程度的广泛异质性的挑战。鉴别处于并发症风险的个体脑震荡受害者(这些是具有持续症状或阳性CAT扫描发现的轻度TBI患者)是紧急护理应答者以及运动和军事领域活动的优先事项。婴儿、儿童和青少年脑损伤构成全球儿童死亡和残疾的主要原因，但是诊断具有挑战性，因为TBI的病征和症状不存在或与常见的儿童疾病重叠。由于发育中大脑对CAT扫描的电离辐射更敏感，因此通过提供客观的生物标志物测试来减少不必要的CT扫描是必要的。除了青年之外，由于跌倒的原因，老年人也是TBI的常见目标群体，从而希望能将TBI生物标志物信号与慢性神经退行性标志物概况区分开。
对TBI受害者的诊断和监测对于评估脑干扰的严重程度以及准确地评估风险水平以用适当的预防性护理作出反应是至关重要的。对于重度TBI患者，及时外科手术干预可挽救生命。对于轻度TBI患者，鉴别处于发展慢性疼痛和认知或心理缺陷风险的脑震荡患者将有助于提供治疗选择、应对策略的指导并防止恢复脑部暴露于二次撞击。目前严重程度评估主要依赖于使用格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale)的昏迷深度和持续时间，昏迷深度和持续时间随着患者的进行性损伤过程每天改变并且受制于维持昏迷可能需要的药物(Iankova，2006)。轻度TBI通过无意识、认知或心理和疼痛症状的时间来评估，所述症状是主观的并可能受到动机的影响。神经影像学工具(尤其是高级模式)对于重症监护患者难以重复施用并且具有缺乏标准化的不同读出值，并非处处可用且对于轻度TBI和儿科患者使用有限。
测量替代化学生物标志物的血液水平可提供更简单、客观和更容易标准化的工具作为将TBI患者的风险和需求分类的诊断起点。神经创伤生物标志物应从受创伤的脑细胞急性释放，为脑和机械性创伤特异性的，容易通过血脑屏障并且在健康受试者中不显示或显示一致的低水平。
目前，对于为TBI患者的大多数的脑震荡患者，在临床使用中没有灵敏的、客观的、标准化的诊断测试，对于患有疑似TBI的儿科患者也没有。这些都是特别需要客观风险评估以防止使易受伤害的脑部处于遭受持久脑损伤风险的重复撞击的目标群体。重症监护病房头部创伤患者是另一个目标群体，所述患者可受益于用于监测、而不是或补充耗费时间和成本的成像的重复非侵入性血液样品分析，因为创伤进展因在可能需要知情干预的连续损伤后日期时二次恶化而众所周知。此外，仍然需要对脑损伤生物标志物的重复生物流体样品分析以确定短期急性后严重程度评估并确定对TBI患者施用的药物或其它治疗模式的功效。
发明概述
本发明通过提供一种用于在整个严重程度范围内检测或监测创伤性脑损伤(TBI)的状态(包括轻度TBI的诊断或/和确定处于并发症风险的轻度TBI患者)和/或检测或监测受试者的脊髓损伤(SCI)的状态的方法来满足这些需求和其它需求。在一个实施方案中，所述方法包括使从所述受试者获得的体液样本与用于测定选自醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP/FABP7)的TBI标志物或ALDOC或BLBP/FABP7的创伤特异性分解产物(BDP)的试剂接触。所述方法还包括测量与对照样品相比所述样本中存在的标志物的量，并且当与所述对照样品相比所述样本中存在升高量的标志物时确定TBI或SCI的存在。在一个实施方案中，TBI的标志物是ALDOC和/或其BDP，以及BLBP和/或其BDP。任选地，所述方法还包括测量以下的量：谷氨酰胺合成酶(GS)，星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)，αB-晶体蛋白(CRYAB/HSP27)，ALDOC、GS、PEA15或CRYAB的创伤特异性蛋白水解裂解产物，或者其两种或更多种的任何组合。在一个实施方案中，所述方法还包括测量神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或GFAP的20-30kDa BDP的量。
ALDOC的创伤特异性蛋白水解裂解产物的代表性实例包括38kDa主要片段、或35kDa片段、30kDa片段和25kDa片段。BLBP/FABP7的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例是3kDa分解产物。GS的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例包括37+35kDa双联体、32kDa片段、23kDa片段、20kDa片段和18kDa片段。PEA15的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例包括12+13kDa双联体和8kDa片段。αB-晶体蛋白的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例选自由以下组成的组：18+19kDa双联体、17kDa片段、15+14kDa双联体和8kDa片段。
在一个实施方案中，所述方法还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的血液特异性蛋白质的量。此类标志物的检测和监测可用于确定损伤后脑室内脑出血的状态。在一个实施方案中，所述血液特异性蛋白质是载脂蛋白B(APOB)。在另一个实施方案中，所述方法还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的前列腺素合酶(PTGDS)的量。PTGDS(也称为β微量蛋白)在与健康CSF组成正相关的对照非TBI CSF中是丰富的。TBI的存在是在PTGDS的量减少或随着恢复增加时确定的。因此，在TBI之后检测和监测如升高的血液特异性蛋白质或减少的CSF蛋白的此类标志物可用于确定损伤后恢复至对照或正常水平的状态。
在所述方法的一些实施方案中，除了本文列举的那些标志物以外，不测定另外的标志物。在其它实施方案中，仅测定本文所述的标志物。在一些实施方案中，与本文所述的标志物组合测定本领域的技术人员已知的另外标志物。在其它实施方案中，仅测定可能的标志物的子集。例如，所述方法可包括测定2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20种标志物。在一个具体实施方案中，测定不超过4种标志物。
用于本发明的方法中的试剂可包含特异性地结合TBI的标志物的抗体或其它分子。在一个实施方案中，所述测量包括免疫测定。免疫测定的实例包括蛋白质印迹法、免疫荧光、免疫发光、放射免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在另一个实施方案中，所述试剂包含蛋白质序列和蛋白质片段特异性肽。此类试剂对于其中所述测量包括靶向定量质谱法的方法是有用的。在一个实施方案中，所述测量包括使用多反应监测质谱法或平行反应监测质谱法，与添加的(“掺入的”)标记的(例如，重同位素标记的)已知量的相同蛋白特异性肽(内部标准)相比，内源性(样品中的)蛋白特征性(proteo-typic)肽的定量信号检测。
在一个实施方案中，对照样品是从所述受试者获得的损伤前样品。在另一个实施方案中，对照样品代表正常的健康受试者，如从健康受试者的对照组获得的平均值。
用于本发明中的体液样本的代表性实例包括但不限于血浆、血清、脑脊液(CSF)、鼻液、耳垢、尿液、唾液、泪液和脑微透析液。
本发明另外提供一种包括特异性地结合一组生物标志物的试剂的试剂盒。在一个实施方案中，所述生物标志物包含醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP)。所述试剂通常是多核苷酸或抗体，并且任选地用可检测标记进行标记。所述试剂盒任选地进一步由至少一个用于容纳所述试剂的容器和/或使用所述试剂来确定测试样品中的创伤性脑损伤的状态的说明书组成。在一些实施方案中，所述试剂盒包括单独的或与本文所述的或本领域中已知的另外标志物一起的特异性地结合星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)和/或神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP-BDP)的20-30千道尔顿片段的试剂。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述组生物标志物由至多3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物组成。
本发明进一步提供一种确定从受试者获得的血清样品中生物标志物ALDOC和BLBP的表达的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使所述血清样品与本发明的试剂盒接触并测量所述试剂与所述生物标志物的结合。
还提供了一种确定从受试者获得的血清样品中的创伤性脑损伤的状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使所述血清样品与本发明的试剂盒接触并测量所述试剂与所述生物标志物的结合，并将所述结合与对照样品进行比较。如果所述试剂与ALDOC和BLBP的结合在来自所述受试者的血清样品中相对于对照样品增加，则然后确定存在TBI。本发明进一步提供一种检测受试者的TBI的方法。在一个实施方案中，所述方法包括针对与对照样品相比升高量的ALDOC和BLBP来测定来自所述受试者的体液样本。升高量的ALDOC和/或BLBP指示TBI。在一个实施方案中，所述测定在疑似损伤24小时内进行，并且在损伤后至多一周进行。在一些实施方案中，所述测定在疑似损伤1-3小时内或早在15-30分钟内进行。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿或儿童，包括例如疑似已经历摇晃婴儿综合征的受试者。适用于此用途的是在早期发育中大脑中表达的生物标志物，如ALDOC或BLBP。在另一个实施方案中，所述受试者是老年人，并且所述方法用于通过测量ALDOC与其分解产物的比率来区分TBI和慢性神经退行性疾病。
本发明另外提供一种预测受试者中在SCI之后TBI的结果和/或步行恢复的方法。在一个实施方案中，所述方法包括针对与对照样品或与TBI存活者的样品相比升高量的PEA15或GFAP的小BDP来测定来自所述受试者的体液样本。其中升高量的PEA15或GFAP的小BDP预测死亡率。还提供了一种治疗受试者的TBI的方法。在一个实施方案中，所述方法包括针对如本文所述的TBI的标志物测定在损伤后的多个时间点从所述受试者获得的样品(纵向样品系列)；并且如果所述测定指示TBI的存在，则治疗所述患者的TBI。这种方法可用于随时间推移监测所述患者的状态，并且确定药物治疗功效或者是否将指示所述TBI患者的介入治疗。本领域的技术人员将会理解，本文所述的方法中的每种可用所述标志物中的任一种进行，这是由于所述标志物的极早损伤后释放和延长的检测窗口以及可变的生物流体清除动力学：ALDOC、BLBP、GS、PEA-15、CRYAB、前述中的任一种的BDP；单独或与一种或多种另外的标志物组合。
所述标志物ALDOC和BLBP以及PEA15和CRYAB从受伤者释放，即短暂损害人脑细胞，并且因此可用于追踪脑震荡相关的病理生理学过程，其是损伤后脑的脆弱状态。这些标志物与潜在可逆的损伤状态的这种关联提供了可有助于使轻度TBI的诊断更加敏感的病理机制信息，并且除了追踪反映组织损失的细胞死亡释放的标志物以外还可对TBI患者的药物代谢动力学监测有价值。
附图简述
图1：用条形图和描绘活细胞、渗漏细胞和死细胞的细胞核的活染色细胞的显微照片示出的机械性创伤后的人新皮层星形细胞命运。
图2：与小鼠星形细胞相比，受机械创伤的人星形细胞在受伤后的受损状态下显示延长的耐久性，如用条形图、来自经由共聚焦显微术在温度和气体控制的载台上成像的活细胞的延时拍摄视频的一系列显微照片、以及方案的示意性图示所示。
图3：人星形细胞的机械性创伤引起星形胶质细胞标志物显著释放到周围流体中，如用免疫印迹(A)和显示在损伤后的不同时间点标志物的量的条形图(B-G)所示。
图4：示出神经创伤生物标志物与人受创伤的星形细胞的命运相关的双标图。
图5：星形细胞损伤生物标志物选择策略的示意性图示。
图6A-6K：免疫印迹(6A-6C)，和显示在损伤当天和随后的损伤后5天的20-25名TBI患者和8-11名对照(n：每天的受试者数目)的CSF中，使用按比例缩放的密度测定法从免疫印迹信号测量(参见图3)的对数按比例缩放的光密度的与具有四分位距(第90和第10百分位)、中位数(线)和几何平均数(虚线)的盒须图一起绘制的散点图(6D-6K)，其显示星形胶质细胞损伤标志物在损伤当天和损伤后连续5天的回顾性观察群组中相对于对照在TBI患者的CSF中升高。
图7：生物标志物CSF量的TBI患者结果相关性。
图8：使用分组的星形胶质细胞损伤标志物的因子评估TBI的范围。
图9：细胞受伤相对于细胞死亡–BLBP相对于GFAP的比率区分人受创伤的星形细胞和TBI患者的创伤严重程度。
图10：ALDOC水平与TBI患者结果之间的相关性。
图11：在猪脊髓损伤后，与组织病理学严重程度量度、组织损失和出血相关的急性星形胶质细胞标志物释放。
图12：在猪脊髓损伤后急性升高的ALDOC和GFAP的结果相关性。
图13：定量质谱法、多反应监测记录星形胶质细胞TBI标志物的浓度并允许独立于抗体的标志物量比较。
图14：使用已知量的纯蛋白质对TBI CSF和血液中的ALDOC和BLBP量和浓度范围的基于定量抗体的评估。
图15：重度TBI患者的血液样品中的血液相容性星形胶质细胞生物标志物，如通过免疫印迹(A)和损伤后随时间推移测量的量的图表(B)所示。
图16：纵向重度TBI血清样品的免疫印迹显示ALDOC相对于GFAP的延长的检测窗口。
图17：示出在TBI后CSF和血浆中的BLBP分解产物的免疫印迹。
图18：由于直接穿过受损的血脑屏障所致的星形胶质细胞损伤标志物的急性循环出现的证据，如通过免疫印迹(A)和损伤后随时间推移测量的量的图表所示。
图19：在伴有或无并发症的脑震荡后的轻度TBI患者的血清中稳健地且较早地检测到示出顶层星形胶质细胞损伤标志物和PEA15的免疫印迹数据(CT+：伴有并发症–阳性CAT扫描；CT-：无并发症，无CAT扫描发现)。
图20：显示小儿TBI、婴儿中的血清ALDOC的急性和稳健检测的免疫印迹数据。
图21：显示全长ALDOC以大于38kDa BDP的量存在于急性TBI中、而两种大小的ALDOC以不同比例(在表2中给出)存在于阿尔茨海默氏病的慢性神经退行性病状中的免疫印迹数据。
图22：表3阈值的划分图示。
图23：表4阈值的划分图示。
图24：在人创伤培养模型中反复轻度损伤后神经胶质创伤释放标志物的水平增加，如通过在急性膜受伤和延迟的细胞死亡情况下的星形细胞百分比(A)以及在拉伸后GFAP和AldoC的条件培养基(CM)水平(B)所指示。
图25：GFAP的两次胶片曝光，其显示钙蛋白酶和半胱天冬酶活化在创伤后产生GFAP较大和较小分解产物。
发明详述
本发明提供若干新的TBI生物标志物，所述生物标志物最初在来自TBI患者和对照的CSF、血浆和血清上进行测试。新的神经创伤标志物通过它们的释放机制被定义为与创伤模型中的人脑星形神经胶质的细胞受伤和/或细胞死亡相关联。本文呈现的数据证明选择的生物标志物在体液中显示非常令人感兴趣的动力学和稳定性。显示了免疫学可检测性、灵敏度和特异性，并且已经选择了合适的单克隆抗体。在随附的实施例和附录中呈现了在TBI后的前数小时和数天期间CSF和血清中标志物的出现时间。结果表明本文描述的和可在患者血清或血浆中检测到的标志物可用于鉴别中度和重度TBI以及轻度TBI和指示致命TBI的模式。所述标志物总结在表1中。
定义
除非另外指明，在本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域中通常使用的意义。如在本申请中所使用，以下词语或短语具有指定的含义。
如本文所用，如在“主要BDP”中的“主要”是指最频繁和一致地观察到的分解产物，例如ALDOC的38kDa BDP是ALDOC的主要BDP。
如本文所用，“急性”是指早期损伤后时间，通常在损伤当天收集生物流体样品，因为其被认为是急性的。例如，在创伤模型中损伤后15-30分钟、轻度TBI患者中损伤后1-2小时、中度和重度TBI患者中损伤后3小时至24小时。
如本文所用，基于Buki等人，2015，复杂的轻度TBI用于具有阳性计算机断层摄影术、CT/CAT扫描发现或更广泛地具有持久症状的脑震荡患者。
如本文所用，“显著差异”是指可以本领域的技术人员认为可靠的方式检测的差异，如统计上显著的差异或在这种情况下可以合理的可靠性水平检测到的具有足够大小的差异。在本文提供的实施例中，对数转换的数据遵循高斯分布，并且由独立的统计学家用于统计分析。可在非常数方差混合模型情况下使用重复测量方差分析(Crowder和Hand，1990)。由于在对数转换时数据是线性的，所以显著的变化通常是多方面的，甚至是数量级的。在一个实例中，观察到TBI与对照之间的介于80倍至13,000倍之间范围内的增加或减少并且所述增加或减少被发现是显著的。在另一个实例中，跨越不同损伤后几天的介于6至32倍之间的变化被认为是显著的。在又一个实例中，观察到TBI的存活者与非存活者之间介于4倍与1,400倍之间的变化并且所述变化被发现是显著的。在又一个实例中，相对于参考或对照样品两倍的增加被认为是显著的。
如本文所用，“对照”或“对照样品”是指代表正常水平的样品或从已知健康的受试者获得的样品。
如本文所用，除非另外明确指出，否则“一个/种(a/an)”是指至少一个/种。
表1：星形胶质细胞损伤标志物
本发明的方法
本发明提供一种用于检测或监测受试者的创伤性脑损伤(TBI)、轻度TBI和/或脊髓损伤(SCI)的状态的方法。所述方法可用于确定受试者的TBI或SCI的存在、进展、预测和严重程度的区分。在一个实施方案中，所述方法包括使从所述受试者获得的体液样本与用于测定选自醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP/FABP7)的TBI标志物或ALDOC或BLBP/FABP7的创伤特异性分解产物(BDP)的试剂接触。所述方法还包括测量与对照样品相比所述样本中存在的标志物的量，并且当与所述对照样品相比所述样本中存在升高量的标志物时确定TBI或SCI的存在。在一个实施方案中，TBI的标志物是ALDOC和/或其BDP，以及BLBP和/或其BDP。任选地，所述方法还包括测量以下的量：谷氨酰胺合成酶(GS)，星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)，αB-晶体蛋白(CRYAB/HSP27)，ALDOC、GS、PEA15或CRYAB的创伤特异性蛋白水解裂解产物，或者其两种或更多种的任何组合。在一个实施方案中，所述方法还包括测量神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或GFAP的20-30kDa BDP的量。
在TBI后的随后几天监测BLBP和/或PEA15的升高通知损伤后的继发不良事件。例如，基于每个因子的标志物负载，ALDOC、BLBP、GS和PEA15的水平升高的检测可用于计算因子A，并且GFAP、S100β和APOB的水平可用于计算因子B。组合的因子A和因子B可用于根据严重程度划分患者。因子A和B阈值提供TBI存活者、非存活者和对照之间的界限。通过使用提供多种生物标志物读数的试剂盒并进行因子分析，临床试验或研究内的患者评估可更加稳健。这提供一种简化的方法来跟踪高度可变群组中的个别患者，而不是需要可能不是在财政上和其它方面可行的非常大的群组大小。可将每个临床试验或研究群组生物标志物组数据输入到数据库中，进行标准化并且基于组织死亡/出血对比组织受损/受伤因子评估每个患者。使用代表这两种类别的因子使得评估更加稳健，因为一个零读数将不会阻止整个因子分析为任何给定患者提供相对状态输出。边界指出每个群组的严重程度范围，在所述群组内每个患者在损伤后的给定时间将具有独特状态。
在一个实施方案中，所述方法还包括计算BLBP(细胞渗漏标志物的实例)与GFAP(细胞死亡标志物)的量之间的比率。所述量可使用光密度来测量。创伤模型中BLBP和GFAP的量之间的在0.6-1.2范围内的比率对应于轻度/中度创伤，而介于0.1-0.4之间的比率对应于重度创伤。这反映了在人培养创伤模型中的发现：在重度创伤中，发现比轻度创伤后成比例更多的GFAP。中度TBI患者中的BLBP/GFAP比率在介于0.4-0.3之间的范围内，而重度TBI患者中的所述范围是介于0.01与0.05之间，在重度对比中度TBI患者中再次表达成比例更大的GFAP比BLBP量。因此，使用此比率提供更稳健的患者严重程度分类。通过包括两种标志物，达到显著性，而单独一种标志物将需要更大的群组大小。因此，当在临床研究或试验中用作评价工具时，使用标志物组合可因此通过减少最低限度所需的患者入选人数而有助于评估TBI状态并监测TBI进展。
用于检测和监测受试者的TBI状态的方法可用于鉴别在轻度TBI或脑震荡后处于并发症风险的受试者。这种鉴别是通过使用急性存在进行的，如除了血清样品中的ALDOC外，使用在BLBP和/或PEA15损伤后的1-2小时和至多17小时内获得的样品。单独ALDOC升高可鉴别脑震荡，并且ALDOC和BLBP和/或PEA15的损伤当天升高与并发症风险相关。
ALDOC的创伤特异性蛋白水解裂解产物的代表性实例包括最一致地发现的主要38kDa片段、35kDa片段、30kDa片段和23kDa片段。GS的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例包括37+35kDa双联体、32kDa片段、23kDa片段、20kDa片段和18kDa片段。PEA15的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例包括12+13kDa双联体和8kDa片段。αB-晶体蛋白的创伤特异性蛋白水解裂解产物的实例选自由以下组成的组：18+19kDa双联体、17kDa片段、15+14kDa双联体和8kDa片段。
ALDOC全长(40kDa)的量比ALDOC裂解产物(38kDa)的量的比率指示损伤后时间，以及急性对比亚急性对比慢性脑损伤或神经退行性脑疾病(包括阿尔茨海默氏病(AD))的区别。因此，在一个实施方案中，所述检测和/或监测TBI或SCI的方法包括确定从所述受试者获得的样本中40kDa ALDOC水平比38kDa ALDOC水平的比率。在3.6-8.6范围内的大于1的比率指示TBI(急性和亚急性，在损伤后1-5天内)，因为全长ALDOC比38kDa ALDOC BDP丰富得多。在0.4-0.6范围内的小于1的比率指示阿尔茨海默氏病，因为38kDa ALDOC BDP与全长ALDOC光信号密度相似或比其更丰富，因为与急性损伤病状相比，慢性退行性病状允许长期部分降解和片段积聚。
在一个实施方案中，所述方法还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的血液特异性蛋白质的量。此类标志物的检测和监测可用于确定损伤后脑室内脑出血的状态。在一个实施方案中，所述血液特异性蛋白质是载脂蛋白B(APOB)。在另一个实施方案中，所述方法还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的前列腺素合酶(PTGDS)的量。PTGDS(也称为β微量蛋白)与健康CSF组成正相关。TBI的存在是在PTGDS的量减少或随着恢复增加时确定的。因此此类标志物的检测和监测可用于确定损伤后恢复至健康水平的状态。在一些实施方案中，急性创伤降低的PTGDS水平的恢复在随后的损伤后几天内监测并预测存活，而持续降低的PTGDS水平预测死亡率。
在所述方法的一些实施方案中，除了本文列举的那些标志物以外，不测定另外的标志物。在其它实施方案中，仅测定本文所述的标志物。在一些实施方案中，与本文所述的标志物组合测定本领域的技术人员已知的另外标志物。在其它实施方案中，仅测定可能的标志物的子集。例如，所述方法可包括测定2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20种标志物。在一个具体实施方案中，测定不超过4种标志物。
用于本发明的方法中的试剂可包含特异性地结合TBI的标志物的抗体或其它分子。在一个实施方案中，所述测量包括免疫测定。免疫测定的实例包括蛋白质印迹法、免疫荧光、免疫发光、放射免疫测定和ELISA。ALDOC同种型特异性抗体可作为来自EnCorBiotechnology Inc.(Gainesville,Florida)的单克隆抗体克隆4A9、1A1、5C9和E9获得。BLBP特异性单克隆抗体也可从EnCor Biotech Inc.获得。
在另一个实施方案中，所述试剂包含蛋白质序列和蛋白质片段特异性肽。此类试剂对于其中所述测量包括靶向定量质谱法的方法是有用的。在一个实施方案中，所述测量包括使用多反应监测质谱法或并行反应监测质谱法，与添加的(“掺入的”)标记的(例如，重同位素标记的)已知量的相同蛋白特异性肽(内部标准)相比，内源性(样品中的)蛋白特征性(proteo-typic)肽的定量信号检测。
在一个实施方案中，对照样品是从所述受试者获得的损伤前样品。在另一个实施方案中，对照样品代表正常的健康受试者，如从健康受试者的对照组获得的平均值。
用于本发明中的体液样本的代表性实例包括但不限于血浆、血清、脑脊液(CSF)、鼻液、耳垢、尿液、唾液、泪液和脑微透析液。
本发明进一步提供一种确定从受试者获得的血清或血浆样品中生物标志物ALDOC和BLBP的存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使所述血清或血浆样品与本发明的试剂盒接触并测量所述试剂与所述生物标志物的结合。
还提供了一种确定从受试者获得的血清或血浆样品中的创伤性脑损伤的状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使所述血清/血浆样品与本发明的试剂盒接触并测量所述试剂与所述生物标志物的结合，并将所述结合与对照样品进行比较。如果相对于对照样品，所述试剂与ALDOC和BLBP的结合在来自所述受试者的血清样品中增加，则然后确定存在TBI。对于中度至重度TBI患者，ALDOC和BLBP的量和浓度范围在图14和实施例13中给出，并且生物标志物比较用图13和实施例12中的浓度给出。本发明进一步提供一种检测受试者的TBI的方法。具体地说，其可用于检测其中诊断不明显的轻度TBI。在一个实施方案中，所述方法包括与对照样品相比，测定来自所述受试者的体液样本的升高量的ALDOC和BLBP。升高量的ALDOC和/或BLBP指示TBI。在一个实施方案中，所述测定在疑似损伤24小时内进行。在一些实施方案中，所述测定在疑似损伤1-3小时内或早在15-30分钟内进行。在一个实施方案中，所述测定在疑似损伤后至多7天进行。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿或儿童，包括例如疑似已经历摇晃婴儿综合征的受试者。所述方法允许评估损伤严重程度，以及在脊髓损伤后在受试者中急性地预测结果。
本发明另外提供一种预测受试者中在SCI之后TBI的结果和/或恢复的方法。在一个实施方案中，所述方法包括与对照样品相比，测定来自所述受试者的体液样本的升高量的PEA15和/或20-30kDa(小)GFAP片段，其中升高量的PEA15和/或小(即较小)GFAP片段预测死亡率。还提供了一种治疗受试者的TBI的方法。在一个实施方案中，所述方法包括针对如本文所述的TBI的标志物测定从所述受试者获得的样品；并且如果所述测定指示TBI的存在，则治疗所述患者的TBI。本发明进一步提供一种监测正在治疗TBI的受试者中的治疗指导的方法。在一个实施方案中，所述方法包括针对如本文所述的TBI的标志物测定从所述受试者获得的样品；并且如果所述测定指示涉及在损伤后几天期间患者状态的恶化，即显示本文所述的标志物中的任一种的继发升高水平，则开始治疗所述患者的TBI。本发明的方法另外提供药代动力学(治疗性诊断)应用，即用于监测药物或其它患者治疗以早期评价治疗效果并监测损伤后的TBI进展。本领域的技术人员将会理解，鉴于本文所述的标志物的不同释放和清除动力学，使用本文描述的多种标志物作为一组的益处。因此，患者的评估可包括以下标志物中的任一种：ALDOC、BLBP、GS、PEA-15、CRYAB、前述中的任一者的BDP；单独或与一种或多种另外的标志物组合。
本发明考虑的一些实施方案包括使用TBI标志物的组合，所述标志物包括醛缩酶C(ALDOC)、谷氨酰胺合成酶(GS)、星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)、αB-晶体蛋白(CRYAB)或脑脂质结合蛋白(BLBP/FABP7)，ALDOC、GS、PEA15、CRYAB或BLBP/FABP7的创伤特异性蛋白水解裂解产物，或其两种或更多种的任何组合。例如，实施方案包括其中TBI的标志物是GS和醛缩酶C，TBI的标志物是GS和PEA15，TBI的标志物是GS和αB-晶体蛋白，TBI的标志物是GS和BLBP，TBI的标志物是醛缩酶C和PEA15，TBI的标志物是醛缩酶C和αB-晶体蛋白，TBI的标志物是醛缩酶C和BLBP，TBI的标志物是PEA15和αB-晶体蛋白，TBI的标志物是PEA15和BLBP，TBI的标志物是αB-晶体蛋白和BLBP，TBI的标志物是GS、醛缩酶C和PEA15，TBI的标志物是GS、BLBP和PEA15，TBI的标志物是GS、αB-晶体蛋白和PEA15，TBI的标志物是GS、αB-晶体蛋白和BLBP，TBI的标志物是GS、αB-晶体蛋白和醛缩酶C，TBI的标志物是GS、BLBP和醛缩酶C，TBI的标志物是醛缩酶C、PEA15和αB-晶体蛋白，TBI的标志物是醛缩酶C、PEA15和BLBP，TBI的标志物是醛缩酶C、αB-晶体蛋白和BLBP，以及TBI的标志物是PEA15、αB-晶体蛋白和BLBP的那些实施方案。在以上实例中，TBI可以是所叙述的蛋白质、其分解产物或两者。
试剂盒
本发明另外提供一种包括特异性地结合一组生物标志物的试剂的试剂盒。在一个实施方案中，所述生物标志物包含醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP)。所述试剂通常是多核苷酸或抗体，并且任选地用可检测标记进行标记。所述试剂盒任选地进一步由至少一个用于容纳所述试剂的容器和/或使用所述试剂来确定测试样品中的创伤性脑损伤的状态的说明书组成。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括特异性地结合星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)和/或神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP-BDP)的20-30千道尔顿片段的试剂。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述组生物标志物由至多3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物组成。
实施例
呈现以下实施例以说明本发明并帮助普通技术人员制备和使用本发明。所述实施例并不意图以任何方式另外限制本发明的范围。
实施例1：机械性创伤后人新皮层星形细胞命运
本实施例显示使用不同的严重程度，在突发性压力-脉冲创伤性拉伸后30分钟和48小时，人星形细胞的群体得分(图1；对于较轻损伤PSI在2.6-4.0的范围内，并且对于重度损伤PSI在4.4-5.3的范围内)。人星形细胞分离自16-18周捐赠的胎儿新皮层脑样本，纯化，且然后在可变形膜上分化(Wanner,2012)。使用活体培养物中的碘化丙啶(PI)摄取伴随核形状评估(中图，染色的细胞核，在固定后Hoechst染色的，具有小的粉红色点，PI染色的核仁)来确定细胞膜受伤/受损、机械穿孔(Barbee，2005)。通过PI摄取伴随凝聚的细胞核(具有致密染色质和明亮的Hoechst和PI染色的固缩核)来确定细胞死亡。在损伤后30分钟显示显著百分比的细胞完整性损伤(左图)，而在损伤后两天存在显著细胞死亡(右侧的条形)。
实施例2:受机械创伤的人星形细胞在受损状态下显示延长的耐久性
本实施例证明与小鼠星形细胞相比，受机械创伤的人星形细胞在受伤后的受损状态下显示延长的耐久性(图2)。在温度和湿度受控的旋转盘共聚焦显微镜上使用延时成像监测拉伸期间的染料摄取(0.05mM 10kDa葡聚糖罗丹明)以及细胞凋亡的细胞死亡(使用10μM半胱天冬酶3底物的半胱天冬酶活化)(Levine等人，2016)。人创伤受伤的和重封合的人星形胶质细胞在完整性受损后显示延长的耐久性。
如图3中所示，人星形细胞的机械创伤引起星形胶质细胞标志物显著释放到周围流体中。图3A示出来自受创伤的星形细胞的浓缩的、变性的条件培养基(Levine等人，2016；Sondej等人，2011)的免疫印迹显示神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及其已知的和新鉴别的分解产物(BDP)对比醛缩酶C(ALDOC)、脑脂质结合蛋白(BLPB)、星形细胞磷蛋白(PEA15)和α晶体蛋白(CRYAB)的不同释放概况。为了捕获全部范围的信号强度，将来自免疫印迹的多次曝光的信号进行光密度测量(光密度)并按比例缩放以匹配单次曝光。来自指定数目的供体的信号的按比例缩放的密度绘制在图3B-3G中所示的图中的对数间隔轴上。已知的较大GFAP BDP(介于37-50kDa之间)随着时间(三角形)和严重程度(在损伤后5小时圆圈)显示增加的释放。新的较小GFAP BDP仅在损伤后一天和两天显著升高，从而将它们与细胞死亡相关联(参见图1)。ALDOC、BLBP和PEA15在损伤后30分钟已经显著升高了两个数量级以上，并且此类升高的水平在所测量的所有损伤后时间保持在流体中。CRYAB水平在损伤后5小时和2天时显示严重程度差异。
实施例3：与人受创伤的星形细胞的细胞命运相关的神经创伤生物标志物
图4A中示出在膜可渗透细胞百分比(受伤的％，红色数据，左)内ALDOC、BLBP、PEA15和CRYAB的创伤释放的星形胶质细胞标志物水平(参见图3)以及与使用PI-染料更新测定和核形态学的死亡人受创伤的星形细胞的百分比相关(参见图1+2)的双标图。回归线(R2值)和p值指示相关显著性。ALDOC、PEA15和CRYAB显示与人星形胶质细胞受伤的最好相关性。CRYAB、BLBP和ALDOC也与创伤后细胞死亡的延长相关。
图4B示出GFAP创伤释放的双标图，其示出GFAP与由机械创伤造成的细胞死亡的相关性，以及与细胞受伤的弱相关性/不相关。通过分组的GFAP片段大小(较大条带：50-37kD，较小条带：25-19kD)分隔绘图。
实施例4：星形细胞损伤生物标志物选择策略
通过以下策略选择候选星形细胞损伤生物标志物(图5)。使用来自19名重度TBI患者的CSF样品，通过自下而上质谱法编制TBI CSF蛋白质组，并与来自9名对照受试者(Crl)的CSF蛋白质组进行比较。这种TBI CSF蛋白质组(483种蛋白质)与来自对照CSF蛋白质组(402种蛋白质)的252种蛋白质重叠，留下231种独特的TBI CSF蛋白。60％的TBI CSF蛋白也存在于已公开的血浆蛋白质组中(Omenn等人，2005；Schenk等人，2008)，并且如果丰富的话，可能不适合作为TBI生物标志物。为了选择候选脑损伤标志物，在简单创伤模型中使用蛋白质组学方法测定了从受创伤的星形细胞释放的蛋白质。在压力-脉冲拉伸小鼠星形细胞之后鉴别了79种差别释放的蛋白质(Levine等人，2015；Sondej等人，2011)。
从这种“创伤节(traumatome)”，48种蛋白质(62％)存在于TBI CSF中。选择高度星形细胞富集的蛋白质(相对于其它细胞类型>/＝5倍富集，Cahoy等人，2008)产生11种损伤生物标志物蛋白质的小候选池(黑色轮廓包括3个区域)。这些包括3种蛋白质，GFAP和过氧化物还原酶6(Prdx6，两者均存在于血浆中)以及N,N-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH1，中心区域的3种)。另外3种蛋白质是星形细胞富集的，存在于TBI CSF中且也存在于对照CSF中的“创伤节”蛋白质，其是醛缩酶C(ALDOC)、丛生蛋白(CLUS)和载脂蛋白E(APOE，下部区域的3种)。丛生蛋白和APOE是由星形细胞分泌的，并且其水平在创伤后在流体中降低(箭头)。另外5种高度星形细胞富集的创伤释放的蛋白质未列入基于鸟枪法质谱的TBICSF蛋白质组列表中。这5种是埃兹蛋白(ezrin)(Ezr)、仅含F-盒的蛋白2(FBX2)、谷氨酰胺合成酶(GS)、星形细胞磷蛋白15(PEA15)和脑脂质结合蛋白(BLBP，上部区域的5种，虚线)。GFAP、ALDOC、GS、BLBP、PEA15和CRYAB被包括在随后的免疫学和质谱测试中。
实施例5.在损伤当天和损伤后连续5天，星形胶质细胞损伤标志物在TBI患者的 CSF中升高
本实施例证明在损伤当天和损伤后连续5天在回顾性观察群组中，星形胶质细胞损伤标志物相对于对照在TBI患者的CSF中升高。图6A示出来自54岁男性重度TBI患者(1a.-1f.)的损伤当天(i)和随后的损伤后5天(i+1至i+5)的30μl CSF样品连同30μl对照CSF(Crl)的纵向组的GFAP(50kDa，其中BDP 37、25、20和18kDa)和S100以及ALDOC(40kDa)、GS(45kDa)、BLBP(15kDa)和PEA15(15kDa)的免疫印迹。BLBP和PEA15在损伤当天显示最强信号，并且在损伤后第三天显示与此患者的继发性缺血事件相关的第二次上升。出血指标APOB(130和250kDa)在损伤后随时间推移具有可变强度并且不存在于健康CSF中；CSF标志物PTGDS(22kDa)在对照CSF中具有稳健信号，但是在TBI和损伤后一天后极性不存在并在随后的损伤后几天逐步恢复信号。
图6B示出来自四名TBI患者(2.-5.)(其示出在损伤当天(患者2、3、4a)和损伤后一天(4b、5)介于50与37kDa之间的GFAP和“较大”BDP以及包括25/23kDa双联体、20kDa和18kDa小BDP的“较小/新的”GFAP BDP的可变信号强度)连同来自健康43岁男性的对照CSF的六个CSF样品(30μl/泳道)。较大GFAP BDP内的各条带彼此具有相似的强度，而较小GFAP BDP之间的相对丰度在患者之间明显不同。
图6C示出CSF免疫印迹(30μl/泳道)，其展示在五名TBI患者(6.-10.)中的全长ALDOC(40kDa)和在三名TBI患者(8-10)中在损伤后四天具有可变强度的38kDa ALDOC BDP。健康对照受试者未显示ALDOC。
散点图(图6D-6K，同一天并且患者重复平均化)与具有四分位距(第90和第10百分位)、中位数(线)和几何平均数(虚线)的盒须图一起绘制，其示出在损伤当天和随后的损伤后5天的20-25名TBI患者和8-11名对照(n：每天的受试者数目)的CSF中，使用按比例缩放的密度测定法从免疫印迹信号测量的对数按比例缩放的光密度(参见图3)。(图6D)较大GFAP信号(50-37kDa)在所有TBI天数相对于对照升高(P<0.06)并且如所指示随时间推移下降(P<0.05，重复测量ANOVA，参见方法)。(图6E)较小GFAP BDP(25-18kD)相对于对照在TBI中升高(P<0.03)，并且在损伤后第一天与损伤后几天之间下降(P<0.05)。(图6F)ALDOC(P<0.004)和(图6G)GS(P<0.001)相对于对照在TBI CSF中在每一天升高而无下降。(图6H)BLBP(P<0.03)和(图6I)PEA15(P<0.004)在所指示的天数相对于对照在TBI中具有升高的水平，伴随较大的信号范围。血清蛋白APOB(图6J)相对于对照CSF在TBI中升高(P<0.005)，而CSF标准PTGDS相对于TBI在对照中更强(P<0.004)，其中水平急性消减至不同程度，随后结果依赖性恢复(参见图7)。
实施例6:生物标志物CSF量的TBI患者结果相关性
本实施例证明新的细胞死亡相关的较小GFAP降解产物的CSF水平相对于TBI的存活者在非存活者中升高两个数量级(图7)。在TBI后相对于存活者，PEA15水平在非存活者中升高2-3个数量级以上，在损伤后第三天的p值p＝0.07。损伤后急性降低的健康标志物PTGDS的水平在TBI存活者中到损伤后第三天显示显著恢复，而在非存活者中水平仍然下降。
实施例7:使用分组的星形胶质细胞标志物的因子评估TBI的范围
本实施例展示星形胶质细胞创伤标志物的分组，以创建适用于在损伤范围内评估TBI的因子。为了组合由标志物组所涵盖的不同数据，使用了采用基于斯皮尔曼(Spearman)相关系数的无监督学习算法的多变量方差分析(因子分析，Fabrigar和Wegener，2012；Tucker，1997)。这种方法对于神经创伤生物标志物领域是新的，并且通过基于它们的TBICSF信号将在此的标志物分组来揭示潜在神经创伤病状。已知的星形胶质细胞标志物S100β、具有已知的和新的BDP的细胞死亡标志物GFAP和出血指标APOB被分组至因子A中(图8A，灰色，具有组合负载，使用克朗巴赫系数α＝0.921)。新的“细胞渗漏”、细胞受伤标志物ALDOC与BDP、BLBP、GS和PEA15被分组至因子B中(α＝0.879)。如图8B中所示，因子A的时间曲线在损伤后数天内显著降低，而因子B的轨线没有。因子A数据显示在损伤后数天存活者与非存活者之间的显著差异(图8C)。因子B数据未显示存活差异(图8D)。使用图8A中所示的负载，将来自12名具有所有标志物存在的信号的TBI患者的标准化的标志物密度读数转换成因子A和B，并且然后相对于彼此绘图(图8E)。TBI范围之中的异质性反映在此双标图中的组合的组数据的扩展中。分类树分析(图8F)根据给定因子阈值(Breiman，1984)确定划分TBI的对照、存活者和非存活者的边界。通过图8E中的线示出使用被分组至因子中的生物标志物水平的患者划分阈值。
这种数学多变量无监督学习方法将这组的标志物与给定从相关性系数导出的权重(负载)的每个标志物组合，并表示患者群组中被这种标志物的贡献所捕获的差异的量。所列出的标志物的总体高负载(0.8-0.95)将稳健分类记载到所述两个因子中。因子A反映与细胞死亡、出血和组织损失相关的标志物。因子B反映与细胞渗漏、受伤和组织受损相关的标志物(参见图8A)。所得到的值基于给定群组内的其生物标志物组读数记录每个患者的独特位置。这种方法可靠地覆盖在此TBI群组中观察到的大部分患者变化。因子分析提供仅使用少数生物标志物读数，用于捕获在TBI中观察到的大量患者异质性的简化框架(与使用许多不同条目的更复杂的主成分分析相比)。在临床试验中，来自测试试剂盒的这些生物标志物组读数可被输入到不断增长的数据库中，所述数据库可提供与其它患者相比，个别TBI患者的有价值的监测信息。此工具可使用组织受损和组织死亡的生物流体签名来简化患者评估并加强正在进行的患者评估的稳健性。
实施例8：人受创伤的星形细胞和TBI患者中的差别创伤严重程度
本实施例证明受试者的样本中BLBP比GFAP水平的比率可用于区分人受创伤的星形细胞和TBI患者中的创伤严重程度。在体外(图9，CM，条件培养基，左)和TBI患者(CSF，图9的右图)中显示“细胞渗漏”标志物BLBP相对于“细胞死亡”标志物GFAP的流体水平比率的显著差异。使用所指示的PSI压力脉冲，使来自6个供体的人星形细胞受到不同严重程度的创伤。中度对比重度TBI患者通过CSF中的14倍不同的BLBP/GFAP比率进行区别(n＝9)。中度TBI患者通过复苏后格拉斯哥昏迷量表(GCS)>8定义，而重度TBI患者具有GCS<8。
实施例9：ALDOC水平与TBI患者结果之间的相关性。
图10中呈现的数据显示在TBI后6个月使用延伸的格拉斯哥结果评分(GOSe)评估的针对重度TBI患者的结果绘制的ALDOC和GFAP水平。来自12(11)名TBI患者的数据显示在具有不利结果的患者中的损伤后早期(白色，i、i+1、+2)和稍后(黑色，i+3、+4和+5损伤后天数)的ALDOC升高，而GFAP水平在稍后损伤后几天并不同样维持升高的水平。
实施例10:TBI标志物与脊髓损伤的严重程度和结果之间的相关性
本实施例证明猪动物模型中星形胶质细胞创伤标志物与脊髓损伤的严重程度之间的相关性。图11：在猪脊髓损伤后，与组织病理学严重程度量度、组织损失和出血相关的急性UCLA星形胶质细胞标志物释放。A)使用建立的损伤体重下降模型(Lee等人，2013)，将UCLA星形胶质细胞损伤标志物ALDOC、BLBP和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP的急性(损伤后15-30分钟)CSF信号密度针对脊髓挫伤后一周的Yucatan猪脊髓中的喙-尾腔直径绘图。斯皮尔曼相关性表明这些星形胶质细胞CSF标志物水平的与组织损失增加显著相关的急性升高。组织病理学：在苏丹黑染色的水平脊髓切片中测量空腔的喙-尾延伸(给出p值和R2值，n＝10只动物)。B)ALDOC和GS的急性(损伤后15-30分钟)CSF信号密度与在损伤的水平脊髓切片中使用猪免疫球蛋白(IgG)荧光测量的并通过平行染色的未损伤的水平脊髓切片标准化的损伤后一周的白质间质组织出血显著相关。绘制每只动物(n＝8只动物)的喙-尾连续图像的这种标准化的白质荧光信号，并且在具有上述未受损的信号水平的距离内测定曲线下的面积(AUC)。
图12示出在猪脊髓损伤后急性升高的ALDOC和GFAP与结果的相关性。行走恢复与在猪脊髓损伤后ALDOC和GFAP的急性CSF水平相关。绘制ALDOC(黑点)和GFAP(白点)的急性损伤后CSF水平(损伤后15-30分钟)，其使用猪胸部损伤行为量表(PTIBS)预测损伤后一周行走的恢复，所述量表是用于猪的步行恢复的建立的测试，其指示Yucatan猪的脊髓损伤后步行恢复的水平(Lee等人，2013)。在步行不良的动物中，较高的ALDOC(R2-0.88)和GFAP(R2-0.89)水平存在显著负相关，所述动物顶多拖动它们的后肢和爬行，并且在到损伤后一周行走的动物中低急性ALDOC和GFAP水平存在负相关。初步生物标志物阈值由背景颜色指示，从而显示恢复动物的非常早划分的可行性。
实施例11：星形胶质细胞TBI标志物的定量质谱
本实施例证明定量质谱证实损伤后星形胶质细胞TBI标志物的水平增加，从而提供当使用免疫学方法时受限制的客观标志物量比较，因为这些免疫学方法不是标准化的。多反应监测(抗体独立的同时和定量质谱法)首次用于神经创伤生物标志物领域以比较TBI患者的CSF中已知的和新的星形胶质细胞标志物的丰度。标志物特异性肽与限定量的添加的同位素标记的肽并行测量(参见表6)。图13A示出ALDOC和GFAP在损伤当天在TBI CSF中具有最高浓度，并且两者均与所示的其它标志物的水平显著不同。此外，BLBP水平在损伤当天显著高于GS水平。如图13B中所示，到TBI后3天，ALDOC水平显著超出GFAP浓度，相差一个数量级。
实施例12：TBI CSF和血液中的ALDOC和BLBP的定量免疫测定
本实施例提供使用标准曲线对TBI样本的CSF和血液中的ALDOC和BLBP水平的基于定量抗体的评估。图14中的盒形图示出ALDOC(左)和BLBP(右)的中位数和四分位数浓度范围以及它们在CSF和血液(血清和血浆)中的量。插图示出使用两种浓度范围和免疫印迹检测条件，使用已知量的同种型特异性重组蛋白ALDOC和BLBP的剂量反应(参见表7)。
实施例13：重度TBI患者的血液样品中的星形胶质细胞生物标志物的检测
本实施例证明，使用从患有重度TBI的患者获得的样品，星形胶质细胞创伤标志物与血液测试是相容的。图15A示出来自3名不同重度TBI患者的纵向血浆样品连同一个对照血浆样品(Cr1)。使用免疫亲和白蛋白和免疫球蛋白消减柱(Sigma，ProteoPrep)除去丰富的蛋白质。在损伤当天(i)从未检测到25kDa的新的GFAP分解产物，但在随后的损伤后几天出现。在所有3名患者中ALDOC一致地在所有时间点存在。短寿命标志物PEA15和BLBP在损伤当天稳健地存在，并且在每名患者中在损伤后的随后几天内显示不同的时间分布。图15B中绘制与多达11个对照血液样品(Cr1)相比，来自源自22名重度TBI患者的26个血清样品和24个血浆样品中的ALDOC(B1)、BLBP(B2)、GFAP/25kDa BDP(B3)和PEA15(B4)的按比例缩放的密度测定信号。纵向相同的患者数据通过灰线连接。ALDOC在损伤当天和损伤后每一天均显著升高，而GFAP在损伤后第一天开始显著升高。BLBP和PEA15在损伤当天与对照水平相比显著升高。
实施例14：ALDOC对比GFAP的延长的检测窗口
本实施例证明，使用纵向重度TBI血清样品，ALDOC相对于GFAP的延长的检测窗口。在第一次检测GFAP 25kDa BDP之前19小时检测到ALDOC，并且在超过最后特异性GFAP信号(37kDa已知的GFAP BDP)两天内存在ALDOC信号(图17)。
实施例15：BLBP分解产物
除了全长15kDa BLBP之外，在损伤当天和各种损伤后几天在TBI CSF和血浆中使用2种抗体检测到3kDa BLBP特异性片段。结果在图17中示出。
实施例16：TBI标志物的急性循环出现
图18呈现由于直接穿过受损的血脑屏障所致的新的星形胶质细胞损伤标志物的急性循环出现的证据。图18的图A示出在TBI后急性地(损伤后3小时)以及在损伤后第一天同一重度TBI患者的CSF和血清中的GFAP 25kDa BDP连同ALDOC、BLBP和PEA15的免疫印迹。虽然GFAP首先出现在CSF中并且在血清中具有一天延迟，但是在两个时间点在两种生物流体中均存在ALDOC。BLBP和PEA15首先存在于血清中，并在CSF中延迟出现。所有4种星形胶质细胞标志物的对数间隔轴上的迹线记录GFAP 25kDa BDP从CSF到血清中的转换，生物流体稳定的ALDOC的更稳定存在以及在它们在CSF中出现和延迟的升高之前血清中的短寿命的BLBP和PEA15的存在(图18B)。
这些观察结果表明ALDOC、BLBP和PEA15从损伤部位直接进入循环。所有三种标志物都位于星形胶质细胞过程中，其中已知细微末梢完全包裹毛细血管和血管(Mathiisen等人，2010)。创伤性损伤、即使轻度TBI也会引起血管周围星形胶质细胞纤维的破裂，从而允许这些标志物直接进入血液(Barzo等人，1996；Hicks等人，1993；Korn等人，2005)。GFAP不位于星形胶质细胞末梢中，并且如图3中所示，25kDa GFAP BDP需要时间来产生，从而表明在细胞死亡期间的延迟释放导致在CSF中首先积聚，并且随后出现在血清中。经由开放的血脑屏障直接通过星形胶质细胞终足(endfeet)的优点在于能够进行非常急性的损伤后血液测试。
实施例17：轻度TBI患者血清中的星形胶质细胞损伤标志物的早期检测
本实施例证明轻度TBI患者血清中的顶层星形胶质细胞损伤标志物的稳健和早期检测。图19中示出来自7名轻度TBI(mTBI)患者的在损伤后早期的10个血清样品连同一个对照血清(Cr1)。探测样品的GFAP、ALDOC、BLBP和PEA15。特异性GFAP信号是微弱的，并且限于4名mTBI患者，其中一名患者到损伤后31小时显示GFAP/25kDa BDP(患者#II)。相对于对照，ALDOC 38kDa BDP在所有mTBI患者中一致地且强烈地升高。BLBP和PEA15显示可变强度，并存在于5名mTBI患者中。ALDOC、BLBP和PEA15在损伤后1小时已被检测到。脑震荡患者接受计算机断层摄影术(CT)扫描，并且具有病变/出血的阳性发现的那些患者被归类为CT+，可能是复杂的mTBI患者，并且无可见伤口的那些患者是CT阴性的或不复杂的(Buki等人，2015)。ALBOC的稳健存在以及BLBP和PEA15的差异信号适合于增加脑震荡患者之间的风险鉴别。
实施例18：小儿TBI中血清ALDOC的急性和稳健检测
图20示出小儿TBI患者血清样品中ALDOC的急性和稳健检测。来自患有TBI的5名婴儿(1-4个月龄)的损伤当天血清样品在来自22个月龄的儿童的对照血清附近示出。相对于对照病例，在所有婴儿TBI中检测到稳健ALDOC信号，而只有两名婴儿显示弱GFAP信号(34kDa BDP，先前未描述，病例#I，III)。
实施例19：ALDOC作为阿尔茨海默氏病的CSF标志物
本实施例证明来自患有阿尔茨海默氏病的慢性神经退行性疾病的患者的CSF样品展现同样不同水平的全长(40kDa)和38kDa BDP ALDOC。相比之下，与38kDa BDP相比，在急性TBI患者的CSF中检测到的ALDOC显示全长(40kDa)的显著优势。图21中示出与1名重度TBI患者(病例#1)和两名年龄匹配的对照(病例#VI和VII)相比较的来自5名阿尔茨海默氏病患者(AD，0.5期，病例#II和III；1期，病例#IV和V；基于Fagan等人,ScienceTransl.Med.2014)的7个CSF样品以及用于负载的蛋白质染色(丽春红)。TBI患者在损伤后第4天主要具有全长的ALDOC和小的38kDa片段，而慢性退行性AD样品显示全长和38kDaALDOC BDP的同等存在。数据表明急性和慢性脑损伤可基于ALDOC/ALDOC BDP比率来区分。
表2：TBI与阿尔茨海默氏病之间的区别，使用全长ALDOC与其在患者CSF中的38kDa 蛋白水解片段之间的比率
所述表显示阿尔茨海默氏病(AD)患者和中度至重度TBI患者的CSF中全长ALDOC(40kDa)相对于其分解产物(38kDa)的平均比率。针对蛋白质的不同表位的不同ALDOC抗体导致40对比38kDa条带信号强度的不同强调。在左侧，将所有ALDOC抗体的数据组合，从而将20个AD样品和25个TBI样品平均化。平均AD比率比通过双尾T检验显著的平均TBI比率小6倍。在右侧，10个AD CSF样品和5名TBI患者的样品使用同一抗体(E9)进行分析以用于ALDOC检测。在TBI之间再次存在显著20倍差异，从而显示更多的全长信号，并且AD显示更多的BDPALDOC信号。数据实施例在图21中示出。这提供TBI与慢性神经退行性疾病之间的区别。基于表示慢性神经退行性疾病的ALDOC主要38kDa BDP的丰度增加，两种数据选择均产生显著不同的比率。急性TBI可容易地通过TBI后急性地且达5天的全长40kDa ALDOC的较高丰度来区分。
实施例20：多变量判别分析
使用多变量分类树分析(Breiman，1984)来确定将受试者群组最准确地分成对照以及损伤时的存活或非存活TBI患者的标志物，通过各自30μl CSF样品的免疫印迹进行分析。当仅用两种标志物AldoC和PTGDS获得100％的准确性时(表3)，重复进行分析，从而仅允许已知在血液中可检测到的那些标志物用于未来的非侵入性测定(表4)。用于表3中所示的数据的标志物是Aldo C和PTGDS，而所考虑但未使用的标志物是：GFAP、PEA15、GFAP较小、S100B、BLBP、GS、APOB、PTGDS和AldoC 38kD。表3因此总结了在分类树分析中使用所有标志物的TBI和存活结果预测的检测。所述分析选择了ALDOC和PTGDS作为最佳划分标志物。在所有检查的标志物中，那些通过数学无监督学习方法利用。组，n＝21，所有对照；以及30个TBI样品的所有损伤当天TBI。使用免疫印迹，所指示的7ng/30μl CSF等于233ng/ml CSF的浓度。准确性是优异的，因为分组和预测的结果正确地匹配100％。图22提供表3阈值的划分图示。
表3：TBI和存活结果预测的检测
表4示出使用新的血液相容性神经胶质标志物对TBI和存活结果预测的检测。用于表4(1)的标志物：总Aldo C。考虑但未使用的标志物是：GFAP较小、BLBP、PEA 15、Aldo C38kD分解产物(BDP)。不考虑(省略)的标志物是：总GFAP、S100B、GS、APOB和PTGDS。组是：n＝21全部对照；以及整个群组中总计30名损伤当天TBI患者。准确性是95％；未加权的正确概率是20/21，或0.952。存在96％同等优先级正确概率＝0.96＝(1.0+1.0+0.875)。图23提供表4阈值的划分图示。
表4：使用TBI标志物对TBI和存活结果预测的检测
组 n 总Aldo C[OD] 预测
A 4 0.078至0.22 TBI存活者
B 3 0.22至0.4 TBI非存活者
C 3 >＝0.4 TBI存活者
D 11 <0.078 对照(健康受试者)
表4中的数据的分类矩阵：
接受者操作特征(适用于较高n)：
组 面积 N N正确 正确概率
对照 1.0000 11 11 1.0
死亡 0.9737 2 2 1.0
存活 0.9904 8 7 0.875
实施例21:标志物信号密度[OD]与CAT扫描成像数据之间的斯皮尔曼相关性
继发性TBI进展可引起颅内压升高(ICP)，其通常与继发性损伤相关。观察到细胞死亡标志物GFAP较小BDP(19、20、25kDa双联体)的水平与ICP之间的显著相关性。出血标志物APOB与脑实质外+实质内病变体积和中线移位显著相关。这些CT表现均与脑出血相关，包括硬膜外血肿、硬膜下血肿、蛛网膜下出血和脑实质内病变。神经胶质损伤标志物BLBP和PEA15以及细胞死亡神经胶质标志物GFAP较小BDP与脑实质内病变(包括脑组织挫伤、颅内出血和弥漫性轴索损伤)相关。
表5：标志物信号密度与CAT扫描数据之间的斯皮尔曼相关性
实施例22:在人创伤培养模型中反复轻度损伤后神经胶质创伤释放标志物的水平 增加
图24示出使用重复轻度损伤的模型获得的结果。人星形细胞接受30分钟间隔(30')或一天间隔(1D)的单(·)或双(·-·)轻度压力脉冲。急性渗漏和延迟死亡的细胞群体通过重复创伤没有太多变化(图24A)。然而，创伤-释放标志物GFAP和AldoC的条件培养基(CM)流体水平在稍后重复轻度损伤后对比单次轻度拉伸升高，并且当两次损伤相隔一天时仅稍微升高。AldoC水平在稍后轻度拉伸后几乎达到单次严重损害(·)的那些，从而表明其对重复损伤的敏感性。
实施例23:钙蛋白酶和半胱天冬酶活化在创伤后产生GFAP较大和较小分解产物
图25中示出使用DAKO抗GFAP多克隆抗体在条件培养基样品中损伤后第48小时GFAP、较大和较小分解产物的两次胶片曝光(film exposure)。重度拉伸和未拉伸的培养物接受无药物、钙蛋白酶抑制剂PD150606(100μM，“Cali”)或泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD FMK(8.8μM，“Casi”)。创伤释放的GFAP较大和较小BDP通过钙蛋白酶和半胱天冬酶抑制剂两者降低，从而表明在损伤后两种酶降解GFAP的创伤诱导的活化。这种酶分解的部分在细胞中发生，部分在细胞外发生，如通过相同实验的细胞溶解产物级分的类似分析所表明。未拉伸培养物中的较小GFAP BDP的少量释放是由于少量非创伤性细胞死亡所致。
实施例24:用于星形胶质细胞损伤标志物的蛋白质印迹法的抗体和蛋白质
表6：用于标志物的蛋白质印迹的抗体和蛋白质
实施例25:多反应监测质谱法
通过靶向多反应监测(MRM)质谱法测量TBI损伤生物标志物蛋白质的生物流体浓度。首先使用胞内蛋白酶胰蛋白酶消化生物流体样品，从而将所有蛋白质裂解成它们各自的胰蛋白酶肽。蛋白质特异性肽信号被用作它们各自蛋白质的替代量度。在MRM-MS中，通过所谓的前体→至产物离子跃迁来测量肽信号，如以下表7中所示(例如554.821(2+)-->924.514(1+,y8))。目标特异性前体离子的选择允许灵敏度增加。通过测量来自选定前体的特异性产物离子的信号，MRM允许高度分析物特异性。为了定量，将限定量的含有重赖氨酸[K(标记：13C(6)15N(2))]或重精氨酸[R(标记：13C(6)15N(4))]的稳定同位素标记的标准(SIS)肽掺入生物流体样品中。这些重标准肽与其内源性(轻)对应物在化学上相同，但展示+8和+10Da(分别K和R)的质量位移以区别于内源性生物流体肽。轻与重MRM跃迁之间的峰面积比率的比较允许绝对定量生物标志物浓度。对于我们的测定，将胰蛋白酶消化的生物流体首先通过使用在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸洗脱系统的反相液相色谱法分离以进一步降低样品复杂性并提高信号灵敏度。
表7：多反应监测质谱法肽TBI生物标志物
参考文献
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贯穿本申请引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全部特此以引用的方式并入本申请以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术。
本领域的技术人员将会理解，在前述描述中公开的概念和具体实施方案可容易地用作修改或设计用于实施本发明的相同目的的其它实施方案的基础。本领域的技术人员还将理解，此类等效实施方案不脱离如所附权利要求书中阐述的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 加利福尼亚大学董事会
<120> 星形细胞创伤节和神经创伤生物标志物
<130> UCLA217WOU1
<150> 62/157,389
<151> 2015-05-05
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab 4A9: N-末端肽序列
<400> 1
Met Pro His Ser Tyr Pro Ala Leu Ser Ala Glu Gln Lys Lys Glu Leu
1 5 10 15
Ser
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Leu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Leu Ala Asp Val Tyr Gln Ala Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Thr Pro Ser Ala Leu Ala Ile Leu Glu Asn Ala Asn Val Leu Ala Arg
1 5 10 15
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Leu Ser Gln Ile Gly Val Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Asp Ile Val Glu Ala His Tyr Arg
1 5
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Asn Leu Ser Tyr Ile Glu His Ile Phe Glu Ile Ser Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ser Pro Ala Phe Thr Asp Leu His Leu Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln Asp Lys
1 5 10 15

Claims (29)

1.一种用于检测或监测受试者的创伤性脑损伤(TBI)和/或脊髓损伤(SCI)的状态的方法，所述方法包括：
(a)使从所述受试者获得的体液样本与用于测定选自醛缩酶C(ALDOC)和脑脂质结合蛋白(BLBP/FABP7)的TBI标志物或ALDOC或BLBP/FABP7的创伤特异性分解产物(BDP)的试剂接触；
(b)测量与对照样品相比所述样本中存在的标志物的量；以及
(c)当与所述对照样品相比所述样本中存在升高量的标志物时确定TBI或SCI的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述TBI标志物是ALDOC或其BDP，以及BLBP或其BDP。
3.如权利要求1所述的方法，其还包括测量以下的量：谷氨酰胺合成酶(GS)，星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)，αB-晶体蛋白(CRYAB/HSP27)，ALDOC、GS、PEA15或CRYAB的创伤特异性蛋白水解裂解产物，或者其两种或更多种的任何组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中ALDOC的所述创伤特异性蛋白水解裂解产物选自由以下组成的组：38kDa片段、35kDa片段、30kDa片段和23kDa片段。
5.如权利要求3所述的方法，其中GS的所述创伤特异性蛋白水解裂解产物选自由以下组成的组：37+35kDa双联体、32kDa片段、23kDa片段、20kDa片段和18kDa片段。
6.如权利要求3所述的方法，其中PEA15的所述创伤特异性蛋白水解裂解产物选自由以下组成的组：12+13kDa双联体和8kDa片段。
7.如权利要求3所述的方法，其中αB-晶体蛋白的所述创伤特异性蛋白水解裂解产物选自由以下组成的组：18+19kDa双联体、17kDa片段、15+14kDa双联体和8kDa片段。
8.如权利要求1所述的方法，其还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的血液特异性蛋白质的量。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述血液特异性蛋白质是载脂蛋白B(APOB)。
10.如权利要求1所述的方法，其还包括测量从所述受试者获得的脑脊液(CSF)样品中的前列腺素合酶(PTGDS)的量，并且当所述PTGDS的量减少时确定TBI的存在。
11.如权利要求1所述的方法，其还包括测量神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的20-30kDaBDP的量。
12.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述试剂包含特异性地结合所述TBI标志物的抗体，并且所述测量包括免疫测定。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述免疫测定包括蛋白质印迹法或ELISA。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述对照样品是从所述受试者获得的损伤前样品。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述对照样品是从健康受试者的对照群组获得的平均值。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中不测定另外的标志物。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定不超过4种标志物。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液样本包括血浆、血清、脑脊液(CSF)、鼻液、耳垢、尿液、唾液、泪液或脑微透析液。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含蛋白质序列和蛋白质片段特异性肽，并且其中所述测量包括靶向定量质谱法。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述测量包括多反应监测质谱法或平行反应监测质谱法。
21.一种试剂盒，其包括特异性地结合一组生物标志物的试剂，其中所述生物标志物包括：
(a)醛缩酶C(ALDOC)；以及
(b)脑脂质结合蛋白(BLBP)；
其中所述试剂是多核苷酸或抗体，所述试剂任选地用可检测标记进行标记，并且其中所述试剂盒任选地进一步由至少一个用于容纳所述试剂的容器和/或使用所述试剂来确定测试样品中的创伤性脑损伤或脊髓损伤的状态的说明书组成。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其还包括特异性地结合以下的试剂：
(c)星形细胞磷蛋白PEA-15(PEA15)；和/或
(d)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP-BDP)的20-30千道尔顿片段。
23.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。
24.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述一组生物标志物由至多4种生物标志物组成。
25.一种确定从受试者获得的血清样品中生物标志物ALDOC和BLBP的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述血清样品与如权利要求21所述的试剂盒接触；以及
(b)测量所述试剂与所述生物标志物的结合。
26.一种确定从受试者获得的血清样品中的创伤性脑损伤的状态的方法，所述方法包括：
(a)使所述血清样品与如权利要求21所述的试剂盒接触；以及
(b)测量所述试剂与所述生物标志物的结合；
(c)将所述结合与对照样品进行比较；以及
(d)如果所述试剂与ALDOC和BLBP的所述结合在来自所述受试者的所述血清样品中相对于所述对照样品增加，则确定存在TBI。
27.一种检测受试者的TBI的方法，所述方法包括针对与对照样品相比升高量的ALDOC和BLBP来测定来自所述受试者的体液样本，其中升高量的ALDOC和/或BLBP指示TBI。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述测定在疑似损伤24小时内进行。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述受试者是婴儿或儿童。
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