JPS5967456A - クロマトグラフイ−によるアルブミンの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクロマトグラフィーを用いてアルブミンを少な
くともメルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミ
ンとに分離する新規なアルブミンの分離方法に関する。

アルブミンは生体細胞や体液中に広く含まれる蛋白質で
、血漿の膠質浸透圧の保持や生体内における物質の移送
等の機能を有し、細胞の生活にきわめて密接な関連をも
つ。アルブミンは構造の異なる複数の成分からなること
が知られているが、蛋白質の分離、分析に用いられる通
當の電気泳動や６１１体クロマトグラフィーでは均一な
成分としてしか検出されない。アルブミンを迅速かつ簡
便に複数の成分に分離することは生化学や医学の５１甲
ｔにおいて極めて有用であり、例えば分離情＋侵のし甚
床検査への利用やアルブミン中の特に有用な成／７）の
分離等が可能になる。

アルブミンを構造の異なる複数の成分へ分角１１する方
法についてはこれまでにいくつかの報告力くある。例え
ば等電点又はそれ以下のｐＨでのＴｉ５ｅｌｉｕｓ電気
泳動ではアルブミンが不均一なものとして観察されると
いわれている（平田、右田編「血りｎタンパク質」医歯
薬出版、昭和５４年）。し力１し、電気泳動による分離
、分析は長時間を要し、し力・も定量性が不十分で大量
処理も困難である。またスルボエチルセファデノクス（
商品名、ファ）レマシア社、スウェーデン）を用いたイ
オン交換クロマ１〜グラフイーによってメルカプトアル
ブミンとノンメルカプトアルブミンが分離されるとし）
われている。（Ｒ，Ｄ、ＩＩａｇｅｎｍａｉｅｒ　ｅｔ
　ａｌ＋　Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙｌｏ、６３７　　
（１９７１））Ｌかしながら、この方法もゲルの強度」
二の理由から低流速で行なわざるを得す、分８１【、分
析に極めて長時間を要し、かつ溶離溶媒を途中で変える
操作を伴なうので迅速、簡便なアルブミンの分離法とは
いえなし）。

本発明考らは移動相に液体を用いるクロマトグラフィー
用の固定相（以下ゲルと称する）及びそれを用いたクロ
マトグラフィーの条件を鋭意検ｄ１した結果、迅速かつ
簡便な操作でアルブミンを複数の成分に分離する方法を
見出し本発明を完成さ一已るに到った。

すなわち本発明は硬質の全多孔質ゲルよりなる固定相に
アルブミンを含む溶液及び移動相を通液又は展開するこ
とによって、アルブミンを少なくともメルカプトアルブ
ミンとノンメルカプトアルブミンとに分離することを特
徴とするクロマトグラフィーによるアルブミンの分離方
法に関１−る。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明で固定相として用いるゲルは硬質で全多孔質の構
造のものが良い。本発明におＬＪる硬質の全多孔質ゲル
とは機械的強度が大でしかもゲル内部までボアが分布し
た構造を有するゲルのことである。このようなゲルは、
前述したセフアゾ・ノクスのような硬質のゲルと異なり
、乾燥状態でも膨潤時のボア構造を実質的に維持するた
め乾燥状態での比表面積が大である。本発明のゲルは通
禽乾燥ゲル重量あたり２　ｍ　／　ｇ以上、好ましくは
５〜１０００ｒ＋？／ｇの比表面積を有する。一方軟質
ゲルの乾燥時の比表面積は１ｍ／ｇ以下の小さい値を示
す。比表面積が本発明の範囲にあるゲルは機械的強度が
大きいのでクロマトグラフィー用の担体として用いたと
きに溶離溶媒を高流速で通液することができ、迅速な分
離、分析が可能となる。

ゲル中のボアの大きさは少なくともアルブミンが浸透し
得る程度の大きさであれば良い。ボアの大きさは、デキ
ストラン、ポリエチレングリコール等の分子量既知の標
準サンプルを用いてゲルパーミェーションクロマトグラ
フィーを行ない、得られた検量線から公知の方法で推定
することができる。

更にゲルは親水性基を有する架橋性共重合体よりなるこ
とが好ましシイ０親水性茫としては、水酸基、アミド基
、エーテル法等の非イオン性基が好ましく、中でも水酸
基は特に好ましい。またアミノ基、ジエヂルアミノ基、
あるいはトリスアミノ貼等の１〜３級アミノ基よりなる
弱酸基性アニオン交換基やカルボキシル基で代表される
弱酸性のカチオン交換基は少量であればゲル中に含まれ
ていて良い。特に１〜３級アミノ基は移動相との組合せ
によっては含まれている方が好ましい場合もある。これ
らの旧型イオン交換基の量はゲル乾燥重置あたり１ｍｅ
ｑ／ｇ以下であるのが良く、好ましくは０．０５〜１ｍ
ｅｑ／ｇ、更に好ましくは０．０５〜０．５　　ｍｅｑ
／である。また強酸性又は強塩詰性のイオン交換基はケ
ルの分配又は吸着特性を強めすぎるので、一定組成の移
動相のもとて使用する場合はゲルに含まれるのは好まし
くない。以上の官能基の他には本発明のゲルの刊格に含
まれる官能基は特に限定されない。例えばニステルハ、
インシアヌレート環あるいはシアヌレート環等も含まれ
ていて良い。本発明を実施する」−で好ましい、又は支
障のない、これらの官能基はゲル全体に分布しても、ま
たボア形成部分つまりボア表面のめに分布しても良い。

本発明のゲルの粒径は通常は１〜２０００μｍの範囲に
あるのが良い。高速液体クロマｌ−グラフィー（以下Ｈ
Ｌ　Ｃと表す）用充填剤として用いる場合は平均粒径が
５〜１５μＩｎの範囲にあるのが好ましい。大量サンプ
ルの分離を目的とする場合はより大きい粒径で良い。

次に本発明で用いられるゲルの一例を紹介する。

例えば、カルボン酸ビニルエステル単量体、イソシアヌ
レート環を有する架橋性単量体、単量体を／８解するが
水にｉ’８ｗ？、Ｌにくい有機溶媒及び重合開始剤を少
なくとも含んでなる混合物を懸濁重合して得られる共重
合体のエステル基を水酸基に変換−ｕしめた粒状架橋共
重合体よりなるゲルは本発明において好適に用いること
ができる。

ここでカルボン酸ビニルエステル単量体とは、重合可能
なカルボン酸ビニルエステル基を一つ以」１有する化合
物のことで、例えば酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、
酪酸ビニル、吉草酸ビニル及びピバリン酸ビニルなどの
中から選ばれ、単独又は二種以上の組合せで用いられる
。なかでも重合やエステル交換又はケン化の容易性及び
人手の容易さから酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが特
に好ましい。またイソシアヌレ−１・環を有する架橋性
単量体とは、例えば下記の構造式で表わされるものであ
る。

１ Ｒミ （ただしＲ，、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に−ＣＨ２
−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃｌ−１、又はＣＨ−
ＣＲ２であるトリアリルイソシアヌレ−１−は酢酸ビニ
ルとの共重合性が良く、かつエステル交換又はケン化に
対しても安定性が大きいので架橋性単量体として好まし
い。

全単量体中のイソシアヌレート環を有する架橋性単量体
の割合は特に限定されないが、例えばＨＬＣ用ゲルのよ
うな機械的強度が特に大きいゲルを作る場合は次式の範
囲にあるのが良い。

０．２≦３ｂ／（ａ＋３ｂ）≦０．４ ここで ａ：カルボン酸ビニルエステル基のモル数り：イソシア
ヌレート環を有する架橋性単量体のモル数 前記単量体以外の単量体をゲルの物性にほとんど影響し
ない程度に併用し共重合させることは本発明のゲルを得
るうえで何ら支障ない。

これらの単量体を懸濁重合させる際に、生成共重合体を
ポーラスな構造にするために、単量体を溶解するが水に
溶解しにくい有機溶媒を単量体と共存させるのが良い。

有機溶媒は単量体１ｏｏ重量部に対して通常２０〜２５
０重量部の範囲で用いられるが、小粒径で機械的強度の
特に大きいゲルが用いられるＨ　Ｌ　Ｃ用のゲルを作る
場合はやや少ない方が良く、例えば２０〜１００重量部
の範囲で用いられる。ただし全有機溶媒中の５重量％以
上、好ましくは５〜５０市量％はカルボン酸ビニルエス
テル重合体を熔解しにくい有機溶媒であるのが良い。こ
のような有機溶媒の具体例としては、ヘプタン、オクタ
ン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン等の炭
素数７〜１５の鎖状炭化水素化合物、プロピルブチルエ
ーテル、ジブデルエーテル、ジー２−エチルヘキシルエ
ーテル、ジデシルエーテル、ジドデシルエーテル等炭素
数７〜２５のエーテル化合物があげられる。またこのよ
うな有機溶媒と組合せて用いられる他の有機溶媒として
は、前記有機溶媒以外でかつ水に／８解しにくいもので
あれば特に限定されないが、１−ルエン、キシレン、酢
酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ヘキシル、メチルイソブチ
ルケトン等の比較的酢酸ビニル重合体を熔解し易い有機
溶媒が好ましい。

またポリ酢酸ビニルやボリスヂレン等の線状重合体を前
記有機溶媒と併用して用いても良い。

重合に際して用いられる開始剤は、２．２’−アブビス
イソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等の通常の：Ｙ
！　？Ｂ重合に用いられる一般的なラジカル重合開始剤
で良い。

懸濁重合は一般に良く知られている方法で行うことがで
きる。

次に重合によって得られた共重合体のエステル交換又は
ケン化反応を行う。反応は水やアルコールを溶媒として
酸又はアルカリを用いて行なわれるが、好ましくは共重
合体中のエステル基のモル分率で０．２以上、更に好ま
しくは０．４〜０．８を水酸基に変換−已しめるのが良
い。反応のコン１−ロールは酸やアルカリの量や濃度あ
るいは反応温度や時間等と反応率の関係を事前に把握し
ておきその中から条件を選択することによって行うこと
ができる。反応率の測定は、例えば特開昭５７−１０８
６６２号公報に示された方法で行うことができる。

このようにしてｆ−ｌたゲルは必要により分級してアル
ブミンの分８１１のためのクロマトグラフィー用固定相
として用いることができる。

カルボン酸ビニルエステル単量体及びイソシアヌレート
環を有する架橋性単量体を用いてゲルをつくる場合、ゲ
ルが本発明の目的に使い（ワる物性を有するためには、
重合時に共存させる有機溶媒の種類や口比、あるいはケ
ン化又はエステル交換反応のコン（−ロールが重要であ
り、これらの条件が前記範囲にある場合にアルブミンを
メルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミンに特
に良好に分離し得るゲルが得られる。

またこのゲルに少量の１〜３級のアミノ基やカルボキシ
ル基を導入したゲルも本発明の目的に用いることができ
る。カルボン酸ビニルエステル単量体とイソシアヌレー
ト環を有する架橋性単量体を用いて、全く骨格の異なる
ゲル、例えばシリカゲルやスチレン共重合体よりなるゲ
ルのボア表面へのグラフト又はコーティングを行なう場
合、又は全く他の単量体を用いて本発明の目的に使い得
るケルをつくる場合は必ずしも前記有機溶媒やケン化条
件の制約を受りない。

アルブミンの分離は通常はカラムに充填したゲルヘアル
ブミンを含む溶液及び液体よりなる移動相を通液する、
いわゆる液体クロマトグラフィーにより行なわれるが、
′／′！ｆ層クロマトグラフィーを用いて行°なっても
良い。ここでカラムはクロマトグラフィーを１テうため
に通常用いられるもので良く、材質、形状、寸法等は目
的やクロマトグラフイーのイルの条件に応して任意に選
択することができる。アルブミンを含む／８液とは人や
他の動物の血清や血漿等の体液あるいはアルブミンを含
む溶液のことである。中でも人血清又は人血υにあるい
は人アルブミンを含む溶液が好ましい。

移動層は、例えば水もしくはｐ　Ｉｌ、ｔｔ　ｆＪｊ剤
及び／又は無機塩を含む水溶液などのタンパク質の分離
に用いられる通常のクロマトグラフィー用移動相で良い
。必要によりメタノール、エタノール、エチレングリコ
ール等の有機溶媒を含む液を用いても良い。

前記のカルボン酸ビニルエステルＲ量体とイソシアヌレ
−ｊ−環を有する架橋性単量体を主たる原料単量体とし
て得られるゲルを固定相として用いる場合は、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニ
ウム等の無機塩やリン酸二水素−ナトリウム、リン酸−
水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム
等のｐＨｉｄ街剤の中から一種又は二種以上を熔解した
溶液を用いるのが良い。中でもリン酸、酢酸、乳酸、酒
石酸あるいはクエン酸等の弱酸とその塩又はその組合セ
よりなる緩衝基剤及び、硫酸す１〜リウム、硫酸カリウ
ム、硫酸アンモニウム等又はそれらの組合せよりなる硫
酸塩が共存し、該緩衝基剤の濃度が０．０１〜０．４Ｍ
＃！、好ましくは０．０１〜０．２Ｍ／βまた硫酸塩の
濃度が０．０５〜０．３Ｍ／ｐの範囲にある水溶液が良
い。緩衝用基剤や硫酸塩の濃度が前記範囲にあることに
よりメルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミン
の分離あるいはそれらと他の成分との分離をより短時間
にかつ良好に行うことが可能になる。クロマトグラフィ
ーを行う間、移動相は通當は組成を変化さ−Ｕることな
く一定組成であるが、必要により段階的又は連続的に変
えても良い。

本発明で行うクロマトグラフィーによってアルブミンが
少なくともメルカプトアルブミンとノンメルカプトアル
ブミンに分離される理由は必ずしも明らかではないが、
ある移動相とゲルを用いた場合にメルカプトアルブミン
とノンメルカプトアルブミンのゲルへの親和性が異なっ
たためと推定される。

被分離成分がメルカプトアルブミン又はノンメルカプト
アルブミンを含むことの確認は通當溶出容量の標準サン
プルとの比較又は官能基の分析で行い得る。あるいは被
分離成分をシスチン、ジチオスライドールあるいは２価
の銅イオン等と反応さゼたのち生成物の官能基分析又は
溶出容量の変化等によって確認することも可能である。

アルブミンを少なくともメルカプトアルブミンとノンメ
ルカプトアルブミンとに分離した報告は、従来多くはな
い。しかもその方法は前述したように特定条件での電気
泳動や、軟質のゲルを用いしかも移動相の変化を伴なう
イオン交換クロマトグラフィーで行うものであり、これ
らは定量性、迅速性あるいは簡便性等に問題があった。

それに対し本発明のクロマトグラフィーによるアルブミ
ンの分離においては、硬質の全多孔質ゲルを固定相に用
いるため移動相を高流速で通液することができ、短時間
の分離、分析が可能である。しかも移動相を途中で変え
ることなく一定組成のまま行ない得るため、目的とする
分離を迅速に繰返し行うことができ、かつ得られるクロ
マトグラムの再現性も良い。従って操作の自動化が容易
であり、１！７られるデータの信頼性も大きい。このよ
うに本発明の方法は再現性、迅速性あるいは簡便性等あ
らゆる点において従来法よりもはるかに優れている。

例えば本発明の方法により血清中のアルブミンを迅速に
分析できるので、臨床検査に用いて得られた情報を直ち
に治療に結びつけることができる。

また大規模分離も容易に行ない得るのでアルブミン中の
特定成分の分離、精製に用いることも可能である。この
ようなことば本発明ではじめて可能になったのである。

以下に本発明方法の実施例を示すが、本発明の範囲をこ
れらの実施例に限定するものでないことはいうまでもな
い。

実施例１ 酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート４−
１．４ｇ、酢酸ｎ−ブチル７４ｇ、デカン２５ｇ及び２
，２′−アゾビスイソブチロニトリル３，４ｇよりなる
均一混合液と、少量のポリビニルアルコール及びリン酸
ナトリウムを／８解した水８００ｍβとをフラスコに入
れ十分攪拌したのち、６５°Ｃで１８時間、更に７５°
Ｃで５時間加熱して１び濁重合を行ない粒状共重合体を
得た。濾過、水洗、次いでアセトン抽出後、カセイソー
ダ４７ｇ及びメタノール２Ｃよりなる溶液中で１５°Ｃ
で２０時間１児押して共重合体のエステル交換反応を行
った。得られた粒子を分級して平均粒径９．５μｍのゲ
ルを得た。ゲルの水酸基密度から求めたエステル基の反
応率は５２％であった。このゲルを充填したステンレス
製カラム（内径７．５−１長さ５Ｑｃ１１）を４本連結
し、０．３Ｍ硫酸ナトリウム及び０．１Ｍリン酸ナトリ
ウムを含む水溶液を溶媒として健布人の血清及び標準人
血清アルブミン（（１１）り十字型）を分析してそれぞ
れ第１図及び第２図のクロマトグラムを得た。標準人血
清アルブミンを分析した際の溶出アルブミンの回収率は
９７％であった。第１図のビークａとｂ及び第２図のａ
′とｂ′を分取してそれぞれ市販の水系ゲルパーミェー
ションクロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫ−ＧＩＥＬ
　Ｇ３０００ＳＷ−東洋曹達（１菊製）で分析したとこ
ろ、すべて人血〆青アルブミンと同じ溶出容量を示し、
すべて人血清アルブミンであることが確認された。更に
人血清アルブミンをシスチンと反応さ−Ｕて得たノンメ
ルカプトアルブミンは本実施例でつくったカラムで分析
するとｂ′の位置に７容出し、また人血清アルブミンを
ジチオスライトールと反応させて得たメルカプトアルブ
ミンはａ′の位置に溶出することが確認された。また分
取したａ′とｂ′をそれぞれシスチンと反応させて得た
生成物はいずれもｂ′の位置に熔出し、それぞれジチオ
スライトールと反応さ一已て得た生成物はいずれもａ′
の位置に７容出した。そして２価の３同イオンとの反応
ではａ′ばアルブミンニ巨体になることをＧ（’ｌ　ｌ
できたが、ｂ′は変化しながった。

これらの事実からａとａ′はメルカプトアルブミン、ｂ
とｂ′はノンメルカプトアルブミンであると判断した。

なお移動相の流速は１ｍβ／ｍｉｎで行ない、アルブミ
ンをメルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミン
に分％ＳＩＩ　ｉ−るための所要時間は約７０分であっ
た。

比較例 市販の水系ＧＰＣ用カシカラムＴＳＫ−ＧＥＩ、Ｇ３０
００舖、東洋曹達（株製）３本（長さ合計１８Ｑｃｍ）
を用いて実施例１と同様の条件で人血清及び人血清アル
フミンを分析したがいずれもアルブミンの主成分は１本
のピークとして検出され、実施例１のようなアルブミン
が分離したクロマトグラムは得られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に示した方法によって健常人の血清を
分析してｆＧられたクロマトグラムであり、第２図は実
施例１に示した方法によって人血清アルブミン標準ザン
プルを分析し−で得られたクロマトグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、硬質の全多孔質ゲルよりなる固定相にアルブミンを
   含む溶液及び移動相を通液又は展開することによって、
   アルブミンを少なくともメルカプトアルブミンとノンメ
   ルカプトアルブミンとに分離することを特徴とするクロ
   マトグラフィーによるアルブミンの分Ｍｌｉ方法。 ２、クロマトグラフィーを行なう間、移動相が一定組成
   でかつ水溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載のアルブミンの分離方法。 ３、固定相がカラムに充填された全多孔質ゲルよりなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   のアルブミンの分離方法。 ４、ゲルが水酸基を有する粒状架橋共重合体よりなるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項のい
   ずれか１項に記載のアルブミンのイソシアヌレート環を
   有する架橋性単量体、前記酸基に変換せしめた粒状架橋
   共重合体よりなることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項ないし第４項のいずれか１項に記載のアルブミンの分
   離方法。 ６、単量体を熔解するが水に熔解しにくい有機？８Ｂの
   ５重Ｍ％以上がカルボン酸ビニルエステル重合体を溶解
   しにくい有機溶媒であることを特徴とする特許請求の範
   囲第５項記載のアルブミンの分離方法。 ７、単量体を熔解するが水に溶解しにくい有機ｚ８媒の
   ５〜５０重量％がカルボン酸ビニルエステル重合体を溶
   解しにくい有機溶媒であることを特徴とする特許請求の
   範囲第５項記載のアルブミンの分離方法。 ８、単量体を熔解するが水に熔解しにくい有機溶媒が鎖
   状炭化水素化合物、エーテル化合物又はこれらの混合物
   からなることを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第
   ７項記載のアルブミンの分離方法。 ９、懸濁重合して得られた共重合体のエステル基のモル
   分率で０．２以上を水酸基に変換せしめることを特徴と
   する特許請求の範囲第５項ないし第８項のいずれか１項
   に記載のアルブミンの分離方法。 １０、懸ｉ重合して得られた共重合体のエステル基のモ
   ル分率で０．４〜０．８を水酸基に変換せしめることを
   特徴とする特許請求の範囲第５項ないし第８項のいずれ
   か１項に記載のアルブミンの分離方法。 １１、移動相が少なくとも弱酸と弱酸塩よりなる１ｊｔ
   　南用基剤及び硫酸塩が共存し該緩衝用基剤の濃度が０
   ．０１〜０．４Ｍ／ρである水／８液であることを特徴
   とする特許請求の範囲第５項ないし第１０項のいずれか
   １項に記載のアルブミンの分離方法。 １２、硫酸塩の濃度が０．０５〜０．３Ｍ／ｆｆｉであ
   る特許請求の範囲第１１項記載のアルブミンの分離方法
   。 １３、アルフ゛ミンが人血ン青アルフ゛ミンであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第１２項のい
   ずれか１項に記載のアルブミンの分離方法。