JPH0248063B2 - - Google Patents
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- JPH0248063B2 JPH0248063B2 JP57177505A JP17750582A JPH0248063B2 JP H0248063 B2 JPH0248063 B2 JP H0248063B2 JP 57177505 A JP57177505 A JP 57177505A JP 17750582 A JP17750582 A JP 17750582A JP H0248063 B2 JPH0248063 B2 JP H0248063B2
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- albumin
- separating
- gel
- organic solvent
- monomer
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-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明はクロマトグラフイーを用いてアルブミ
ンを少なくともメルカプトアルブミンとノンメル
カプトアルブミンとに分離する新規なアルブミン
の分離方法に関する。 アルブミンは生体細胞や体液中に広く含まれる
蛋白質で、血漿の膠質浸透圧の保持や生体内にお
ける物質の移送等の機能を有し、細胞の生活にき
わめて密接な関連をもつ。アルブミンは構造の異
なる複数の成分からなることが知られているが、
蛋白質の分離、分析に用いられる通常の電気泳動
や液体クロマトグラフイーでは均一な成分として
しか検出されない。アルブミンを迅速かつ簡便に
複数の成分に分離することは生化学や医学の分野
において極めて有用であり、例えば分離情報の臨
床検査への利用やアルブミン中の特に有用な成分
の分離等が可能になる。 アルブミンを構造の異なる複数の成分に分離す
る方法についてはこれまでにいくつかの報告があ
る。例えば等電点又はそれ以下のPHでのTiselius
電気泳動ではアルブミンが不均一なものとして観
察されるといわれている（平山、右田編「血漿タ
ンパク質」医歯薬出版、昭和54年）。しかし、電
気泳動による分離、分析は長時間を要し、しかも
定量性が不十分で大量処理も困難である。またス
ルホエチルセフアデツクス（商品名、フアルマシ
ア社、スウエーデン）を用いたイオン交換クロマ
トグラフイーによつてメルカプトアルブミンとノ
ンメルカプトアルブミンとに分離されるといわれ
ている。（R.D.Hagenmaier et al、
Biochemistry 10、637（1971））しかしながら、
この方法もゲルの強度上の理由から低流速で行な
わざるを得ず、分離、分析に極めて長時間を要
し、かつ溶離溶媒を途中で変える操作を伴なうの
で迅速、簡便なアルブミンの分離方法とはいえな
い。 本発明者らは移動相に液体を用いるクロマトグ
ラフイー用の固定相（以下ゲルと称する）及びそ
れを用いたクロマトグラフイーの条件を鋭意検討
した結果、迅速かつ簡便な操作でアルブミンを複
数の成分に分離する方法を見出し本発明を完成さ
せるに至つた。 即ち、本発明によれば、(1)カルボン酸ビニルエ
ステル単量体、(2)イソシアヌレート環を有する架
橋性単量体、(3)前記両単量体を溶解するが水に溶
解しにくい有機溶媒で、その５重量％以上がカル
ボン酸ビニルエステル重合体を溶解しにくい有機
溶媒よりなる有機溶媒及び(4)重合開始剤を少なく
とも含んでなる混合物を懸濁重合して得られた共
重合体のエステル基を水酸基に変換せしめた粒状
架橋共重合体よりなる硬質の全多孔質ゲルで形成
された固定相に、アルブミンを含む溶液及び移動
相を通液又は展開することによつて、アルブミン
を少なくともメルカプトアルブミンとノンメルカ
プトアルブミンとに分離することから成るクロマ
トグラフイーによるアルブミンの分離方法が提供
される。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明で固定相として用いるゲルは硬質で全多
孔質の構造のものが良い。本発明における硬質の
全多孔質ゲルとは機械的強度が大でしかもゲル内
部までポアが分布した構造を有するゲルのことで
ある。このようなゲルは、前述したセフアデツク
スのような軟質のゲルと異なり、乾燥状態でも膨
潤時のポア構造を実質的に維持するため乾燥状態
での比表面積が大である。本発明のゲルは通常乾
燥ゲル重量あたり２m2／ｇ以上、好ましくは５〜
1000m2／ｇの比表面積を有する。一方軟質ゲルの
乾燥時の比表面積は１m2／ｇ以下の小さい値を示
す。比表面積が本発明の範囲にあるゲルは機械的
強度が大きいのでクロマトグラフイー用の担体と
して用いたときに溶離溶媒を高流速で通液するこ
とができ、迅速な分離、分析が可能となる。ゲル
中のポアの大きさは少なくともアルブミンが浸透
し得る程度の大きさであれば良い。ポアの大きさ
は、デキストラン、ポリエチレングリコール等の
分子量既知の標準サンプルを用いてゲルパーミエ
ーシヨンクロマトグラフイーを行ない、得られた
検量線から公知の方法で推定することができる。 更にゲルは水酸基を有する架橋性共重合体より
なることが好ましい。またアミノ基、ジエチルア
ミノ基、あるいはトリスアミノ基等の１〜３級ア
ミノ基よりなる弱塩基性アニオン交換基やカルボ
キシル基で代表される弱酸性のカチオン交換基は
少量であればゲル中に含まれていて良い。特に１
〜３級アミノ基は移動相との組合せによつては含
まれている方が好ましい場合もある。これらの弱
型イオン交換基の量はゲル乾燥重量あたり
1meq／ｇ以下であるのが良く、好ましくは0.05
〜1meq／ｇ、更に好ましくは0.05〜0.5meq／で
ある。また強酸性又は強塩基性のイオン交換基は
ゲルの分配又は吸着特性を強めすぎるので、一定
組成の移動相のもとで使用する場合はゲルに含ま
れるのは好ましくない。 本発明のゲルの粒径は通常は１〜2000μｍの範
囲にあるのが良い。高速液体クロマトグラフイー
（以下HLCと表す）用充填剤として用いる場合は
平均粒径が５〜15μｍの範囲にあるのが好まし
い。大量サンプルの分離を目的とする場合はより
大きい粒径で良い。 次に本発明で用いられるゲルは、(1)カルボン酸
ビニルエステル単量体、(2)イソシアヌレート環を
有する架橋性単量体、(3)前記両単量体を溶解する
が水に溶解しにくい有機溶媒で、その５重量％以
上がカルボン酸ビニルエステル重合体を溶解しに
くい有機溶媒よりなる有機溶媒及び(4)重合開始剤
を少なくとも含んでなる混合物を懸濁重合して得
られた共重合体のエステル基を水酸基に変換せし
めた粒状架橋共重合体よりなる。 ここでカルボン酸ビニルエステル単量体とは、
重合可能なカルボン酸ビニルエステル基を一つ以
上有する化合物のことで、例えば酢酸ビニル、プ
ロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル及
びピバリン酸ビニルなどの中から選ばれ、単独又
は二種以上の組合せで用いられる。なかでも重合
やエステル交換又はケン化の容易性及び入手の容
易さから酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが特に
好ましい。またイソシアヌレート環を有する架橋
性単量体とは、例えば下記の構造式で表わされる
ものである。 （ただしR1、R2及びR3はそれぞれ独立に−CH2
−CH＝CH2、−CH2−Ｃ≡CH、又は
ンを少なくともメルカプトアルブミンとノンメル
カプトアルブミンとに分離する新規なアルブミン
の分離方法に関する。 アルブミンは生体細胞や体液中に広く含まれる
蛋白質で、血漿の膠質浸透圧の保持や生体内にお
ける物質の移送等の機能を有し、細胞の生活にき
わめて密接な関連をもつ。アルブミンは構造の異
なる複数の成分からなることが知られているが、
蛋白質の分離、分析に用いられる通常の電気泳動
や液体クロマトグラフイーでは均一な成分として
しか検出されない。アルブミンを迅速かつ簡便に
複数の成分に分離することは生化学や医学の分野
において極めて有用であり、例えば分離情報の臨
床検査への利用やアルブミン中の特に有用な成分
の分離等が可能になる。 アルブミンを構造の異なる複数の成分に分離す
る方法についてはこれまでにいくつかの報告があ
る。例えば等電点又はそれ以下のPHでのTiselius
電気泳動ではアルブミンが不均一なものとして観
察されるといわれている（平山、右田編「血漿タ
ンパク質」医歯薬出版、昭和54年）。しかし、電
気泳動による分離、分析は長時間を要し、しかも
定量性が不十分で大量処理も困難である。またス
ルホエチルセフアデツクス（商品名、フアルマシ
ア社、スウエーデン）を用いたイオン交換クロマ
トグラフイーによつてメルカプトアルブミンとノ
ンメルカプトアルブミンとに分離されるといわれ
ている。（R.D.Hagenmaier et al、
Biochemistry 10、637（1971））しかしながら、
この方法もゲルの強度上の理由から低流速で行な
わざるを得ず、分離、分析に極めて長時間を要
し、かつ溶離溶媒を途中で変える操作を伴なうの
で迅速、簡便なアルブミンの分離方法とはいえな
い。 本発明者らは移動相に液体を用いるクロマトグ
ラフイー用の固定相（以下ゲルと称する）及びそ
れを用いたクロマトグラフイーの条件を鋭意検討
した結果、迅速かつ簡便な操作でアルブミンを複
数の成分に分離する方法を見出し本発明を完成さ
せるに至つた。 即ち、本発明によれば、(1)カルボン酸ビニルエ
ステル単量体、(2)イソシアヌレート環を有する架
橋性単量体、(3)前記両単量体を溶解するが水に溶
解しにくい有機溶媒で、その５重量％以上がカル
ボン酸ビニルエステル重合体を溶解しにくい有機
溶媒よりなる有機溶媒及び(4)重合開始剤を少なく
とも含んでなる混合物を懸濁重合して得られた共
重合体のエステル基を水酸基に変換せしめた粒状
架橋共重合体よりなる硬質の全多孔質ゲルで形成
された固定相に、アルブミンを含む溶液及び移動
相を通液又は展開することによつて、アルブミン
を少なくともメルカプトアルブミンとノンメルカ
プトアルブミンとに分離することから成るクロマ
トグラフイーによるアルブミンの分離方法が提供
される。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明で固定相として用いるゲルは硬質で全多
孔質の構造のものが良い。本発明における硬質の
全多孔質ゲルとは機械的強度が大でしかもゲル内
部までポアが分布した構造を有するゲルのことで
ある。このようなゲルは、前述したセフアデツク
スのような軟質のゲルと異なり、乾燥状態でも膨
潤時のポア構造を実質的に維持するため乾燥状態
での比表面積が大である。本発明のゲルは通常乾
燥ゲル重量あたり２m2／ｇ以上、好ましくは５〜
1000m2／ｇの比表面積を有する。一方軟質ゲルの
乾燥時の比表面積は１m2／ｇ以下の小さい値を示
す。比表面積が本発明の範囲にあるゲルは機械的
強度が大きいのでクロマトグラフイー用の担体と
して用いたときに溶離溶媒を高流速で通液するこ
とができ、迅速な分離、分析が可能となる。ゲル
中のポアの大きさは少なくともアルブミンが浸透
し得る程度の大きさであれば良い。ポアの大きさ
は、デキストラン、ポリエチレングリコール等の
分子量既知の標準サンプルを用いてゲルパーミエ
ーシヨンクロマトグラフイーを行ない、得られた
検量線から公知の方法で推定することができる。 更にゲルは水酸基を有する架橋性共重合体より
なることが好ましい。またアミノ基、ジエチルア
ミノ基、あるいはトリスアミノ基等の１〜３級ア
ミノ基よりなる弱塩基性アニオン交換基やカルボ
キシル基で代表される弱酸性のカチオン交換基は
少量であればゲル中に含まれていて良い。特に１
〜３級アミノ基は移動相との組合せによつては含
まれている方が好ましい場合もある。これらの弱
型イオン交換基の量はゲル乾燥重量あたり
1meq／ｇ以下であるのが良く、好ましくは0.05
〜1meq／ｇ、更に好ましくは0.05〜0.5meq／で
ある。また強酸性又は強塩基性のイオン交換基は
ゲルの分配又は吸着特性を強めすぎるので、一定
組成の移動相のもとで使用する場合はゲルに含ま
れるのは好ましくない。 本発明のゲルの粒径は通常は１〜2000μｍの範
囲にあるのが良い。高速液体クロマトグラフイー
（以下HLCと表す）用充填剤として用いる場合は
平均粒径が５〜15μｍの範囲にあるのが好まし
い。大量サンプルの分離を目的とする場合はより
大きい粒径で良い。 次に本発明で用いられるゲルは、(1)カルボン酸
ビニルエステル単量体、(2)イソシアヌレート環を
有する架橋性単量体、(3)前記両単量体を溶解する
が水に溶解しにくい有機溶媒で、その５重量％以
上がカルボン酸ビニルエステル重合体を溶解しに
くい有機溶媒よりなる有機溶媒及び(4)重合開始剤
を少なくとも含んでなる混合物を懸濁重合して得
られた共重合体のエステル基を水酸基に変換せし
めた粒状架橋共重合体よりなる。 ここでカルボン酸ビニルエステル単量体とは、
重合可能なカルボン酸ビニルエステル基を一つ以
上有する化合物のことで、例えば酢酸ビニル、プ
ロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル及
びピバリン酸ビニルなどの中から選ばれ、単独又
は二種以上の組合せで用いられる。なかでも重合
やエステル交換又はケン化の容易性及び入手の容
易さから酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが特に
好ましい。またイソシアヌレート環を有する架橋
性単量体とは、例えば下記の構造式で表わされる
ものである。 （ただしR1、R2及びR3はそれぞれ独立に−CH2
−CH＝CH2、−CH2−Ｃ≡CH、又は
【式】を示す）。
とりわけR1、R2及びR3がすべて−CH2−CH＝
CH2であるトリアリルイソシアヌレートは酢酸ビ
ニルとの共重合性が良く、かつエステル交換又は
ケン化に対しても安定性が大きいので架橋性単量
体として好ましい。 全単量体中のイソシアヌレート環を有する架橋
性単量体の割合は特に限定されないが、例えば
HLC用ゲルのような機械的強度が特に大きいゲ
ルを作る場合は次式の範囲にあるのが良い。 0.2≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 ここで ａ：カルボン酸ビニルエステル基のモル数 ｂ：イソシアヌレート環を有する架橋性単量体の
モル数 前記単量体以外の単量体をゲルの物性にほとん
ど影響しない程度に併用し共重合させることは本
発明のゲルを得るうえで何ら支障ない。 これらの単量体を懸濁重合させる際に、生成共
重合体をポーラスな構造にするために、単量体を
溶解するが水に溶解しにくい有機溶媒を単量体と
共存させるのが良い。有機溶媒は単量体100重量
部に対して通常20〜250重量部の範囲で用いられ
るが、小粒径で機械的強度の特に大きいゲルが用
いられるHLC用のゲルを作る場合はやや少ない
方が良く、例えば20〜100重量部の範囲で用いら
れる。ただし全有機溶媒中の５重量％以上、好ま
しくは５〜50重量％はカルボン酸ビニルエステル
重合体を溶解しにくい有機溶媒であるのが良い。
このような有機溶媒の具体例としては、ヘプタ
ン、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、
トリデカン等の炭素数７〜15の鎖状炭化水素化合
物、プロピルブチルエーテル、ジブチルエーテ
ル、ジ−２−エチルヘキシルエーテル、ジデシル
エーテル、ジドデシルエーテル等炭素数７〜25の
エーテル化合物があげられる。またこのような有
機溶媒と組合せて用いられる他の有機溶媒として
は、前記有機溶媒以外でかつ水に溶解しにくいも
のであれば特に限定されないが、トルエン、キシ
レン、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ヘキシル、
メチルイソブチルケトン等の比較的酢酸ビニル重
合体を溶解し易い有機溶媒が好ましい。またポリ
酢酸ビニルやポリスチレン等の線状重合体を前記
有機溶媒と併用して用いても良い。 重合に際して用いられる開始剤は、２，2′−ア
ゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等
の通常の懸濁重合に用いられる一般的なラジカル
重合開始剤で良い。 懸濁重合は一般に良く知られている方法で行う
ことができる。 次に重合によつて得られた共重合体のエステル
基を水酸基に変換せしめるために、共重合体のエ
ステル交換又はケン化反応を行う。反応は水やア
ルコールを溶媒として酸又はアルカリを用いて行
なわれるが、好ましくは共重合体中のエステル基
のモル分率で0.2以上、更に好ましくは0.4〜0.8を
水酸基に変換せしめるのが良い。反応のコントロ
ールは酸やアルカリの量や濃度あるいは反応温度
や時間等と反応率の関係を事前に把握しておきそ
の中から条件を選択することによつて行うことが
できる。反応率の測定は、例えば特開昭57−
108662号公報に示された方法で行うことができ
る。 このようにして得たゲルは必要により分級して
アルブミンの分離のためのクロマトグラフイー用
固定相として用いることができる。 アルブミンの分離は通常はカラムに充填したゲ
ルへアルブミンを含む溶液及び液体よりなる移動
相を通液する、いわゆる液体クロマトグラフイー
により行なわれるが、ここでカラムはクロマトグ
ラフイーを行うために通常用いられるもので良
く、材質、形状、寸法等は目的やクロマトグラフ
イーの他の条件に応じて任意に選択することがで
きる。アルブミンを含む溶液とは人や他の動物の
血清や血漿等の体液あるいはアルブミンを含む溶
液のことである。中でも人血清又は人血漿あるい
は人アルブミンを含む溶液が好ましい。 移動層は、例えば水もしくはPH緩衝剤及び／又
は無機塩を含む水溶液などのタンパク質の分離に
用いられる通常のクロマトグラフイー用移動相で
良い。必要によりメタノール、エタノール、エチ
レングリコール等の有機溶媒を含む液を用いても
良い。 前記のカルボン酸ビニルエステル単量体とイソ
シアヌレート環を有する架橋性単量体を主たる原
料単量体として得られるゲルを固定相として用い
る場合は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機塩やリン
酸二水素−ナトリウム、リン酸−水素二ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等のPH緩
衝剤の中から一種又は二種以上を溶解した溶液を
用いるのが良い。中でもリン酸、酢酸、乳酸、酒
石酸あるいはクエン酸等の弱酸とその塩又はその
組合せよりなる緩衝基剤及び、硫酸ナトリウム、
硫酸カリウム、硫酸アンモニウム等又はそれらの
組合せよりなる硫酸塩が共存し、該緩衝基剤の濃
度が0.01〜0.4M／、好ましくは0.01〜0.2M／
また硫酸塩の濃度が0.05〜0.3M／の範囲に
ある水溶液が良い。緩衝用基剤や硫酸塩の濃度が
前記範囲にあることによりメルカプトアルブミン
とノンメルカプトアルブミンの分離あるいはそれ
らと他の成分との分離をより短時間にかつ良好に
行うことが可能になる。クロマトグラフイーを行
う間、移動相は通常は組成を変化させることなく
一定組成であるが、必要により段階的又は連続的
に変えても良い。 被分離成分がメルカプトアルブミン又はノンメ
ルカプトアルブミンを含むことの確認は通常溶出
容量の標準サンプルとの比較又は官能基の分析で
行い得る。あるいは被分離成分をシスチン、ジチ
オスライトールあるいは２価の銅イオン等と反応
させたのち生成物の官能基分析又は溶出容量の変
化等によつて確認することも可能である。 アルブミンを少なくともメルカプトアルブミン
とノンメルカプトアルブミンとに分離した報告
は、従来多くはない。しかもその方法は前述した
ように特定条件での電気泳動や、軟質のゲルを用
いしかも移動相の変化を伴なうイオン交換クロマ
トグラフイーで行うものであり、これらは定量
性、迅速性あるいは簡便性等に問題があつた。そ
れに対し本発明のクロマトグラフイーによるアル
ブミンの分離においては、硬質の全多孔質ゲルを
固定相に用いるため移動相を高流速で通液するこ
とができ、短時間の分離、分析が可能である。し
かも移動相を途中で変えることなく一定組成のま
ま行ない得るため、目的とする分離を迅速に繰返
し行うことができ、かつ得られるクロマトグラム
の再現性も良い。従つて操作の自動化が容易であ
り、得られるデータの信頼性も大きい。このよう
に本発明の方法は再現性、迅速性あるいは簡便性
等あらゆる点において従来法よりもはるかに優れ
ている。例えば本発明の方法により血清中のアル
ブミンを迅速に分析できるので、臨床検査に用い
て得られた情報を直ちに治療に結びつけることが
できる。また大規模分離も容易に行ない得るので
アルブミン中の特定成分の分離、精製に用いるこ
とも可能である。このようなことは本発明ではじ
めて可能になつたのである。 以下に本発明方法の実施例を示すが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル74ｇ、デカン25ｇ及び
２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.4ｇより
なる均一混合液と、少量のポリビニルアルコール
及びリン酸ナトリウムを溶解した水800mlとをフ
ラスコに入れ十分撹拌したのち、65℃で18時間、
更に75℃で５時間加熱して懸濁重合を行ない粒状
共重合体を得た。濾過、水洗、次いでアセトン抽
出後、カセイソーダ47ｇ及びメタノール２より
なる溶液中で15℃で20時間撹拌して共重合体のエ
ステル交換反応を行つた。得られた粒子を分級し
て平均粒径9.5μｍのゲルを得た。ゲルの水酸基密
度から求めたエステル基の反応率は52％であつ
た。このゲルを充填したステンレス製カラム（内
径7.5mm、長さ50cm）を４本連結し、0.3M硫酸ナ
トリウム及び0.1Mリン酸ナトリウムを含む水溶
液を溶媒として健常人の血清及び標情人血清アル
ブミン（(株)ミドリ十字製）を分析してそれぞれ第
１図及び第２図のクロマトグラムを得た。標準人
血清アルブミンを分析した際の溶出アルブミンの
回収率は97％であつた。第１図のピークａとｂ及
び第２図のa′とb′を分取してそれぞれ市販の水系
ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフイー用カラ
ム（TSK−GEL G3000SW−東洋曹達(株)製）で
分析したところ、すべて人血清アルブミンと同じ
溶出容量を示し、すべて人血清アルブミンである
ことが確認された。更に人血清アルブミンをシス
チンと反応させて得たノンメルカプトアルブミン
は本実施例でつくつたカラムで分析するとb′の置
に溶出し、また人血清アルブミンをジチオスライ
トールと反応させて得たメルカプトアルブミンは
a′の位置に溶出することが確認された。また分取
したa′とb′をそれぞれシスチンと反応させて得た
生成物はいずれもb′の位置に溶出し、それぞれジ
チオスライトールと反応させて得た生成物はいず
れもa′の位置に溶出した。そして２価の銅イオン
との反応ではa′はアルブミン二量体になることを
確認できたが、b′は変化しなかつた。これらの事
実からａとa′はメルカプトアルブミン、ｂとb′は
ノンメルカプトアルブミンであると判断した。な
お移動相の流速は１ml／minで行ない、アルブミ
ンをメルカプトアルブミンとノンメルカプトアル
ブミンに分離するための所要時間は約70分であつ
た。 実施例 ２ 実施例１において、酢酸ｎ−ブチルを78ｇ、デ
カンのかわりにジ（２−エチルヘキシル）エーテ
ル20ｇを用いた以外は実施例１と同様に行つて、
平均粒径9.5μｍのゲルを得た。このゲルの水酸基
密度から求めたエステル基の反応率は55％であつ
た。実施例１と同様にこのゲルを充填したカラム
を用いて、標準人血清アルブミンを分析して、メ
ルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミン
が分離したクロマトグラムを得た。 比較例 市販のシリカゲルを基本骨格とする水系GPC
用カラム（TSK−GEL G3000SW、東洋曹達(株)
製）３本（長さ合計180cm）を用いて実施例１と
同様の条件で人血清及び人血清アルブミンを分析
したがいずれもアルブミンの主成分は１本のピー
クとして検出され、実施例１のようなアルブミン
が分離したクロマトグラムは得られなかつた。
CH2であるトリアリルイソシアヌレートは酢酸ビ
ニルとの共重合性が良く、かつエステル交換又は
ケン化に対しても安定性が大きいので架橋性単量
体として好ましい。 全単量体中のイソシアヌレート環を有する架橋
性単量体の割合は特に限定されないが、例えば
HLC用ゲルのような機械的強度が特に大きいゲ
ルを作る場合は次式の範囲にあるのが良い。 0.2≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 ここで ａ：カルボン酸ビニルエステル基のモル数 ｂ：イソシアヌレート環を有する架橋性単量体の
モル数 前記単量体以外の単量体をゲルの物性にほとん
ど影響しない程度に併用し共重合させることは本
発明のゲルを得るうえで何ら支障ない。 これらの単量体を懸濁重合させる際に、生成共
重合体をポーラスな構造にするために、単量体を
溶解するが水に溶解しにくい有機溶媒を単量体と
共存させるのが良い。有機溶媒は単量体100重量
部に対して通常20〜250重量部の範囲で用いられ
るが、小粒径で機械的強度の特に大きいゲルが用
いられるHLC用のゲルを作る場合はやや少ない
方が良く、例えば20〜100重量部の範囲で用いら
れる。ただし全有機溶媒中の５重量％以上、好ま
しくは５〜50重量％はカルボン酸ビニルエステル
重合体を溶解しにくい有機溶媒であるのが良い。
このような有機溶媒の具体例としては、ヘプタ
ン、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、
トリデカン等の炭素数７〜15の鎖状炭化水素化合
物、プロピルブチルエーテル、ジブチルエーテ
ル、ジ−２−エチルヘキシルエーテル、ジデシル
エーテル、ジドデシルエーテル等炭素数７〜25の
エーテル化合物があげられる。またこのような有
機溶媒と組合せて用いられる他の有機溶媒として
は、前記有機溶媒以外でかつ水に溶解しにくいも
のであれば特に限定されないが、トルエン、キシ
レン、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸ヘキシル、
メチルイソブチルケトン等の比較的酢酸ビニル重
合体を溶解し易い有機溶媒が好ましい。またポリ
酢酸ビニルやポリスチレン等の線状重合体を前記
有機溶媒と併用して用いても良い。 重合に際して用いられる開始剤は、２，2′−ア
ゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等
の通常の懸濁重合に用いられる一般的なラジカル
重合開始剤で良い。 懸濁重合は一般に良く知られている方法で行う
ことができる。 次に重合によつて得られた共重合体のエステル
基を水酸基に変換せしめるために、共重合体のエ
ステル交換又はケン化反応を行う。反応は水やア
ルコールを溶媒として酸又はアルカリを用いて行
なわれるが、好ましくは共重合体中のエステル基
のモル分率で0.2以上、更に好ましくは0.4〜0.8を
水酸基に変換せしめるのが良い。反応のコントロ
ールは酸やアルカリの量や濃度あるいは反応温度
や時間等と反応率の関係を事前に把握しておきそ
の中から条件を選択することによつて行うことが
できる。反応率の測定は、例えば特開昭57−
108662号公報に示された方法で行うことができ
る。 このようにして得たゲルは必要により分級して
アルブミンの分離のためのクロマトグラフイー用
固定相として用いることができる。 アルブミンの分離は通常はカラムに充填したゲ
ルへアルブミンを含む溶液及び液体よりなる移動
相を通液する、いわゆる液体クロマトグラフイー
により行なわれるが、ここでカラムはクロマトグ
ラフイーを行うために通常用いられるもので良
く、材質、形状、寸法等は目的やクロマトグラフ
イーの他の条件に応じて任意に選択することがで
きる。アルブミンを含む溶液とは人や他の動物の
血清や血漿等の体液あるいはアルブミンを含む溶
液のことである。中でも人血清又は人血漿あるい
は人アルブミンを含む溶液が好ましい。 移動層は、例えば水もしくはPH緩衝剤及び／又
は無機塩を含む水溶液などのタンパク質の分離に
用いられる通常のクロマトグラフイー用移動相で
良い。必要によりメタノール、エタノール、エチ
レングリコール等の有機溶媒を含む液を用いても
良い。 前記のカルボン酸ビニルエステル単量体とイソ
シアヌレート環を有する架橋性単量体を主たる原
料単量体として得られるゲルを固定相として用い
る場合は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機塩やリン
酸二水素−ナトリウム、リン酸−水素二ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等のPH緩
衝剤の中から一種又は二種以上を溶解した溶液を
用いるのが良い。中でもリン酸、酢酸、乳酸、酒
石酸あるいはクエン酸等の弱酸とその塩又はその
組合せよりなる緩衝基剤及び、硫酸ナトリウム、
硫酸カリウム、硫酸アンモニウム等又はそれらの
組合せよりなる硫酸塩が共存し、該緩衝基剤の濃
度が0.01〜0.4M／、好ましくは0.01〜0.2M／
また硫酸塩の濃度が0.05〜0.3M／の範囲に
ある水溶液が良い。緩衝用基剤や硫酸塩の濃度が
前記範囲にあることによりメルカプトアルブミン
とノンメルカプトアルブミンの分離あるいはそれ
らと他の成分との分離をより短時間にかつ良好に
行うことが可能になる。クロマトグラフイーを行
う間、移動相は通常は組成を変化させることなく
一定組成であるが、必要により段階的又は連続的
に変えても良い。 被分離成分がメルカプトアルブミン又はノンメ
ルカプトアルブミンを含むことの確認は通常溶出
容量の標準サンプルとの比較又は官能基の分析で
行い得る。あるいは被分離成分をシスチン、ジチ
オスライトールあるいは２価の銅イオン等と反応
させたのち生成物の官能基分析又は溶出容量の変
化等によつて確認することも可能である。 アルブミンを少なくともメルカプトアルブミン
とノンメルカプトアルブミンとに分離した報告
は、従来多くはない。しかもその方法は前述した
ように特定条件での電気泳動や、軟質のゲルを用
いしかも移動相の変化を伴なうイオン交換クロマ
トグラフイーで行うものであり、これらは定量
性、迅速性あるいは簡便性等に問題があつた。そ
れに対し本発明のクロマトグラフイーによるアル
ブミンの分離においては、硬質の全多孔質ゲルを
固定相に用いるため移動相を高流速で通液するこ
とができ、短時間の分離、分析が可能である。し
かも移動相を途中で変えることなく一定組成のま
ま行ない得るため、目的とする分離を迅速に繰返
し行うことができ、かつ得られるクロマトグラム
の再現性も良い。従つて操作の自動化が容易であ
り、得られるデータの信頼性も大きい。このよう
に本発明の方法は再現性、迅速性あるいは簡便性
等あらゆる点において従来法よりもはるかに優れ
ている。例えば本発明の方法により血清中のアル
ブミンを迅速に分析できるので、臨床検査に用い
て得られた情報を直ちに治療に結びつけることが
できる。また大規模分離も容易に行ない得るので
アルブミン中の特定成分の分離、精製に用いるこ
とも可能である。このようなことは本発明ではじ
めて可能になつたのである。 以下に本発明方法の実施例を示すが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル74ｇ、デカン25ｇ及び
２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.4ｇより
なる均一混合液と、少量のポリビニルアルコール
及びリン酸ナトリウムを溶解した水800mlとをフ
ラスコに入れ十分撹拌したのち、65℃で18時間、
更に75℃で５時間加熱して懸濁重合を行ない粒状
共重合体を得た。濾過、水洗、次いでアセトン抽
出後、カセイソーダ47ｇ及びメタノール２より
なる溶液中で15℃で20時間撹拌して共重合体のエ
ステル交換反応を行つた。得られた粒子を分級し
て平均粒径9.5μｍのゲルを得た。ゲルの水酸基密
度から求めたエステル基の反応率は52％であつ
た。このゲルを充填したステンレス製カラム（内
径7.5mm、長さ50cm）を４本連結し、0.3M硫酸ナ
トリウム及び0.1Mリン酸ナトリウムを含む水溶
液を溶媒として健常人の血清及び標情人血清アル
ブミン（(株)ミドリ十字製）を分析してそれぞれ第
１図及び第２図のクロマトグラムを得た。標準人
血清アルブミンを分析した際の溶出アルブミンの
回収率は97％であつた。第１図のピークａとｂ及
び第２図のa′とb′を分取してそれぞれ市販の水系
ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフイー用カラ
ム（TSK−GEL G3000SW−東洋曹達(株)製）で
分析したところ、すべて人血清アルブミンと同じ
溶出容量を示し、すべて人血清アルブミンである
ことが確認された。更に人血清アルブミンをシス
チンと反応させて得たノンメルカプトアルブミン
は本実施例でつくつたカラムで分析するとb′の置
に溶出し、また人血清アルブミンをジチオスライ
トールと反応させて得たメルカプトアルブミンは
a′の位置に溶出することが確認された。また分取
したa′とb′をそれぞれシスチンと反応させて得た
生成物はいずれもb′の位置に溶出し、それぞれジ
チオスライトールと反応させて得た生成物はいず
れもa′の位置に溶出した。そして２価の銅イオン
との反応ではa′はアルブミン二量体になることを
確認できたが、b′は変化しなかつた。これらの事
実からａとa′はメルカプトアルブミン、ｂとb′は
ノンメルカプトアルブミンであると判断した。な
お移動相の流速は１ml／minで行ない、アルブミ
ンをメルカプトアルブミンとノンメルカプトアル
ブミンに分離するための所要時間は約70分であつ
た。 実施例 ２ 実施例１において、酢酸ｎ−ブチルを78ｇ、デ
カンのかわりにジ（２−エチルヘキシル）エーテ
ル20ｇを用いた以外は実施例１と同様に行つて、
平均粒径9.5μｍのゲルを得た。このゲルの水酸基
密度から求めたエステル基の反応率は55％であつ
た。実施例１と同様にこのゲルを充填したカラム
を用いて、標準人血清アルブミンを分析して、メ
ルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミン
が分離したクロマトグラムを得た。 比較例 市販のシリカゲルを基本骨格とする水系GPC
用カラム（TSK−GEL G3000SW、東洋曹達(株)
製）３本（長さ合計180cm）を用いて実施例１と
同様の条件で人血清及び人血清アルブミンを分析
したがいずれもアルブミンの主成分は１本のピー
クとして検出され、実施例１のようなアルブミン
が分離したクロマトグラムは得られなかつた。
第１図は実施例１に示した方法によつて健常人
の血清を分析して得られたクロマトグラムであ
り、第２図は実施例１に示した方法によつて人血
清アルブミン標準サンプルを分析して得られたク
ロマトグラムである。
の血清を分析して得られたクロマトグラムであ
り、第２図は実施例１に示した方法によつて人血
清アルブミン標準サンプルを分析して得られたク
ロマトグラムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (1)カルボン酸ビニルエステル単量体、(2)イソ
シアヌレート環を有する架橋性単量体、(3)前記両
単量体を溶解するが水に溶解しにくい有機溶媒
で、その５重量％以上がカルボン酸ビニルエステ
ル重合体を溶解しにくい有機溶媒よりなる有機溶
媒及び(4)重合開始剤を少なくとも含んでなる混合
物を懸濁重合して得られた共重合体のエステル基
を水酸基に変換せしめた粒状架橋共重合体よりな
る硬質の全多孔質ゲルで形成された固定相に、ア
ルブミンを含む溶液及び移動相を通液又は展開す
ることによつて、アルブミンを少なくともメルカ
プトアルブミンとノンメルカプトアルブミンとに
分離することを特徴とするクロマトグラフイーに
よるアルブミンの分離方法。 ２ クロマトグラフイーを行う間、移動相が一定
組成でかつ水溶液であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載のアルブミンの分離方法。 ３ 固定相がカラムに充填された全多孔質ゲルよ
りなることを特徴とする特許請求の範囲第１項又
は第２項記載のアルブミンの分離方法。 ４ 単量体を溶解するが水に溶解しにくい有機溶
媒の５〜50重量％がカルボン酸ビニルエステル重
合体を溶解しにくい有機溶媒であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１
項に記載のアルブミンの分離方法。 ５ 単量体を溶解するが水に溶解しにくい有機溶
媒が鎖状炭化水素化合物、エーテル化合物又はこ
れらの混合物からなることを特徴とする特許請求
の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載のア
ルブミンの分離方法。 ６ 懸濁重合して得られた共重合体のエステル基
のモル分率で0.2以上を水酸基に変換せしめるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第５項の
いずれか１項に記載のアルブミンの分離方法。 ７ 懸濁重合して得られた共重合体のエステル基
のモル分率で0.4〜0.8を水酸基に変換せしめるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項の
いずれか１項に記載のアルブミンの分離方法。 ８ 移動相が少なくとも弱酸と弱酸塩よりなる緩
衝用基剤及び硫酸塩が共存し該緩衝用基剤の濃度
が0.01〜0.4M／である水溶液であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれ
か１項に記載のアルブミンの分離方法。 ９ 硫酸塩の濃度が0.05〜0.3M／である特許
請求の範囲第８項記載のアルブミンの分離方法。 １０ アルブミンが人血清アルブミンであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第９項のい
ずれか１項に記載のアルブミンの分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57177505A JPS5967456A (ja) | 1982-10-12 | 1982-10-12 | クロマトグラフイ−によるアルブミンの分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57177505A JPS5967456A (ja) | 1982-10-12 | 1982-10-12 | クロマトグラフイ−によるアルブミンの分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5967456A JPS5967456A (ja) | 1984-04-17 |
| JPH0248063B2 true JPH0248063B2 (ja) | 1990-10-23 |
Family
ID=16032075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57177505A Granted JPS5967456A (ja) | 1982-10-12 | 1982-10-12 | クロマトグラフイ−によるアルブミンの分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5967456A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ212523A (en) * | 1985-06-24 | 1989-01-06 | Univ Massey | Mobile phase for purification of proteins by high performance liquid chromatography |
| JP2562576B2 (ja) * | 1985-10-16 | 1996-12-11 | 旭メディカル 株式会社 | アルブミンとグロブリンの分離方法 |
| JP6749590B2 (ja) * | 2015-09-17 | 2020-09-02 | 国立大学法人 東京大学 | 酸化型及び還元型アルブミンの分析方法、酸化型及び還元型アルブミンの分析装置、及び酸化型及び還元型アルブミンの分析キット |
| ES2600386B8 (es) * | 2016-11-16 | 2017-08-04 | Grifols Worldwide Operations Limited | Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de alzheimer basado en el nivel redox de la albúmina en el líquido cefalorraquídeo |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5730945A (en) * | 1980-06-25 | 1982-02-19 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Hydrophilic filler for gel permeation chromatography |
| JPS57108662A (en) * | 1980-12-26 | 1982-07-06 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Filler for high speed liquid chromatography |
-
1982
- 1982-10-12 JP JP57177505A patent/JPS5967456A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5967456A (ja) | 1984-04-17 |
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