SU1311631A3

SU1311631A3 - Насадка дл жидкостной хроматографии

Info

Publication number: SU1311631A3
Application number: SU813303096A
Authority: SU
Inventors: Янагихара Юзо; Ногути Кохдзи; Хонда Макото
Original assignee: Асахи Касеи Когио Кабусики Кайся (Фирма)
Priority date: 1980-06-25
Filing date: 1981-06-24
Publication date: 1987-05-15
Also published as: DE3166309D1; EP0043074A2; DD159908A5; CA1157996A; EP0043074A3; EP0043074B1; US4368275A

Abstract

Изобретение относитс к насадкам дл жидкостной хроматографии. Насадка позвол ет проводить высокоскоростное разделение и анализ веществ, обеспечивает разделение смеси белков при скорости потока 0,5-2 мл/мин в течение 10-20 мин (степень извлече-. ки белков 90-100%). Насадка представл ет собой водный гель сшитого сополимера винилового спирта (ВО), винилацетата (ВА) или винилпропиона- та (ВП) и триаллилизоцианурата (ТАИЦ) при мол рном соотношении звеньев а/а+ + b 0,4-0,8 и 3 с/а + b + 3 с 0,25-0,4, где а, b и с - мол рные отношени соответственно звеньев ВС, ВА или ВП и ТАЩ к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц гел 4-198 мкм, максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекул рной массе полизти- ленгЛикол или декстрана, равной 1,910 - 1,010, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц гел , и содержании воды в геле 100-198 мае.ч. на 100 мае.ч. сшитого сополимера. 1 табл. О) оэ со см

Description

Изобретение относитс к методам хроматографического анализа, в частности к насадке дл жидкостной хроматографии (ЖХ), и может быть использовано в области биохимии и медицины дл высокоскоростного и высокоэффективного разделени или анализа веществ , растворенных в растворителе, в соответствии с механизмом разделени гельпроникающей хроматографии (ГПХ).

Цель изобретени - обеспечение пригодности насадки дл высокоскоростного разделени и анализа веществ

Предлагаемый гель получают омылением сшитых сополимеров винилацетата (БА) или винилпропионата (ВП) с три- аллилизоциануратом (ТАЩ). Отношение

а

-г - У-характеризует степень омыа + D

лени сополимера (т.е. количество педроксильных групп) и гидрофиль- ность гел .

Коэффициенты ы и b рассчитываютс по плотности гидроксильных групп (qOH) в геле и количеству звеньев ТАЩ, qOH обозначает эквивалент звеньев ВС на весовую единицу гел и может быть определено путем реагировани гел с уксусным ангидридом в пиридиновом растворителе,, при зтом измер етс количество израсходованного уксусного ангидрида в реакции с гидроксильными группами или изменение веса гел и рассчитываетс концентраци гидроксильных групп по это измеренной величине. Например, 1 ммол уксусного ангидрида израсходован в реакции с 1 г сухого гел , qOH этого гел - 1 миллиэквивалент/г.

Количетсво ТАЩ определ етс по содержанию азота, полученного с помощью элементарного анализа гел . Другими словами, q можно получить по qOH, а b - по величине, полученной путем вычитани общего количества звеньев ВС и ТАИЦ из общего количества звеньев в сополимере соответственно .

3с

а

ризует степень сшивки сополимера. Коэффициенты q и b определ ютс по указанному мтеоду, а с - по значени м элементарного анализа гел или путем расчета по мол м ВА и ТАЩ, которые поставл ютс вместе (а + Ь) ис , в указанной формуле.

Отношение

X характе

5

0

5

Когда X находитс в указанном диапазоне , гель с частицами небольшого размера имеет достаточную прочность дл выдерживани высокого давлени и высокой скорости. Такой гель также обладает достаточной гидрофильностью и плохо адсорбирует компоненты в вод- -ном растворе, в частности протеины и аминокислоты, что повьш1ает целесообразность его использовани в высокоскоростной ГПХ.

Количественный состав насадки (100 вес.ч. сополимера и 100-198 вес.ч. йоды) характеризует степень набухани гел - Wg, котора соответственно находитс в пределах 1,0-1,98 г воды/г сухого гел .

. Wn определ етс следующим образом.

Гель, погруженный в воду и полностью в уравновешенном состо нии, центрифугируетс дл удалени воды, прилипшей к поверхности гел , и измер етс его вес (W). Гель просушит- ваетс и определ етс его сухой вес Wg рассчитьшаетс по формуле

Wi - W2

(wp.

W,

w.

5

0

5

0

5

Предлагаемый гель характеризуетс максимальным размером пор в частицах гел , соответствующим молекул рному весу полиэтиленгликол или декстрана, равному 1,9-10 - 1,0-10, при кото- ром молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц гел .

Вещества с молекул рным весом ниже критической величины могут раздел тьс с помощью ГПХ, а вещества с более высоким молекул рным весом по сравнению с критической величиной не могут проникнуть в поры гел , а проход т непосредственно через зазоры в геле. Следовательно, эти вещества дают тот же объем элиировани , несмотр на молекул рный вес, и, следовательно , не могут раздел тьс с помощью ГПХ

Mj,- может определ тьс по калибровочной кривой ГПХ, котора может быть получена путем построени графика логарифмов молекул рных весов отдельньк образцов, молекул рный вес которых складываетс на ординате, а объем элюировани ка щого образца - на абсциссе относительно набитой гелем колонне.

График на фиг.1 показьтает зависимость между объемом элюировани

3. 1311631

(V) в миллилитрах и молекул рным весом материала, предназначенного дл разделени . Наклонна лини и лини , параллельна ординате, на этом графике представл ют собой по существу пр мые линии. Часть, на которой две линии пересекаютс , называетс кривой . Мр. выражаетс в виде величины

t1 rn

на ординате в точке, в которой про.имеющую мелкие поры, равномерно распределенные во внутренних част х частиц . Органические синтетические полимеры , имеющие сшитую структуру, разбухают в растворителе, имеющем сродство с зтими полимерами, и дают усадку при сушке. При использовании м гкого гел поры, заполненные растворителем при разбухании, поддерживаютс

должение наклонной пр мой линии пере- О только сшитой сеткой. Така стека не

секает продолжение линии, параллельной ординате. М. представл ет одно свойство, которое присуще гелю, и показывает исключительный молекул рный вес, при котором гель может оказывать раздел ющее действие на основе различи размеров молекул. Вещества, имеющие больший молекул рньй вес по сравнению с исклк1чительным молекул рным весом, элюируютс по существу вместе без разделени .

Мп.. определ етс путем использо-

качестве эталона веществ, имеющих известный молекул рньй вес,- полиэтиленгликолей или декстранов, и дистиллированной воды в качестве ; растворител . Поскольку поставл емые промьшшенностью водорастворимые стандартные полимеры имеют молекул рный вес меньше примерно 2000000, полную калибровочную, кривую нельз получить по гелю, имеющему Мд,- , превьш1ающему 2000000. Поэтому Mg,- такого гел точно не определ етс , а оцениваетс

15

вани в

20

25

30

поддерживаетс в разбухшем состо ни и, следовательно, гель дает усадку больша часть пор исчезает. В этом случае удельна площадь поверхности становитс по существу величиной на ружной поверхности частиц и имеет в общем очень низкую величину - менее 1 . При использовании твердого гел с твердой по1 истой структурой после сушки гел поры могут поддерживать по существу то же состо ние, что в момент разбухани , хот они дают незначительную усадку (т.е. поры имеют посто нный характер .Следова тельн5,твердьй гель имеет удельную площадь поверхности,котора намного больше по сравнению с м гким гелем.

Обычно предлагаемый гель удельную площадь поверхности (S) при мерно 5-1000 . Если гель имеет удельную площадь поверхности меньше нижнего предела диапазона, это означает , что гель имеет структуру однородного типа (м гкий гель), котора

по точке пересечени , в которой про- вр д ли содержит мелкие поры ипоэтому должение калибровочной кривой, опре- -не пригодна дл высокоскоростной ГПХ.

деленное по молекул рным весам менее 2000000, пересекает продолжение линии , параллельной ординате, котора определ етс при тех же услови х по гелю, имеющему меньший Мр,-,„.

Дл того, чтобы гель имел механическую прочность, пригодную дл высокоскоростной ГПХ, в сочетании с отсутствием адсорбционной способности , степень сшивки X предпочтительно должна быть в диапазоне примерно 0,25-0,32, когда М д, находитс в диапазоне примерно 10 - 10 , и степень сшивки предпочтительно должна составл ть примерно 0,27-0,35, когда Мр,- находитс в диапазоне примерно 10 - 10.

Предлагаемый гель вл етс полностью пористым твердым гелем, имеет большую удельную площадь поверхности в сухом состо нии. Полностью пориста структура означает структуру.

имеющую мелкие поры, равномерно распределенные во внутренних част х частиц . Органические синтетические полимеры , имеющие сшитую структуру, разбухают в растворителе, имеющем сродство с зтими полимерами, и дают усадку при сушке. При использовании м гкого гел поры, заполненные растворителем при разбухании, поддерживаютс

5

0

5

0

поддерживаетс в разбухшем состо нии и, следовательно, гель дает усадку и больша часть пор исчезает. В этом случае удельна площадь поверхности становитс по существу величиной наружной поверхности частиц и имеет в общем очень низкую величину - менее 1 . При использовании твердого гел с твердой по1 истой структурой после сушки гел поры могут поддерживать по существу то же состо ние, что в момент разбухани , хот они дают незначительную усадку (т.е. по . ры имеют посто нный характер .Следова- тельн5,твердьй гель имеет удельную площадь поверхности,котора намного больше по сравнению с м гким гелем.

Обычно предлагаемый гель , удельную площадь поверхности (S) при- мерно 5-1000 . Если гель имеет удельную площадь поверхности меньше нижнего предела диапазона, это означает , что гель имеет структуру одно;- родного типа (м гкий гель), котора

Удельна площадь поверхности определ етс по способу BET с использованием газообразного азота.

Предлагаемьш гель обычно имеет средневесовой диаметр части (D) примерно 4-198 мкм. В частности, наиболее благопри тные характеристики дл ЖХ гель имеет тогда, когда D,, имеет небольшое значение, например в диапазоне примерно 5-20 мкм. Когда требуетс высока раздел юща способность, Б гел должна быть в диапазоне примерно 5-12 мкм. D измер етс с помощью счетчика Коултера и рассчитываетс по формуле.

55

DW

.5(;df) IKnj-dt )

где d,- - диаметр частиц; п- - частота частиц d,-.

с диаметром

5131

В жидкостной хроматографии раздел юща способность может быть повышена за счет уменьшени размера частиц набивки. Однако при пропускании растворител через колонну, набитую гелем с частицами меньшего размера, значительно возрастают потери давлени по сравнению с гелем, имеющим большие размеры частиц. Следовательно , при небольшой механической прочности гел гель деформируетс или разрушаетс , вызыва ненормально большие потери давлени , что делает невозможным СЖХ при использовании гел с малыми размерами частиц. Так как механическа прочность предлагаемого гел может быть значительно улучшена за счет регулировани различных свойств, включа число o ЯJmeни и степень сшивани , гель может вьдержи- вать высокие скорости и давлени , несмотр на маленький размер частиц.

Размер пор предлагаемого гел может регулироватьс в широком диапазоне , поэтому гель может примен тьс не только дл разделени или анализа водорастворимых полимеров сахари- дов или протеинов, а также дл анализа компонентов с молекул рной массой в несколько сот тыс ч и миллионов, которые присутствуют в крови и моче, которые тесно взаимосв заны с болез

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10

5

0

5

0

н ми почек или печени или симптомами, например карцином. Поскольку предлагаемый гель обладает такими же высокими характеристиками, как гель дл высокоскоростной ГПХ, эти анализы могут, выполн тьс в течение короткого периода времени с получением большего количества информации.

Предпагаемьй гель используетс в виде насадки колонны. Используема колонна обычно представл ет собой цилиндр, изготовленный из нержавею- щей стали, но в зависимости от назначени может быть выбрана люба друга колонна

Примеры 1-19. Гели сшитого сополимера ВС с ВА и ТАИЦ (А) или ВС с ВП и ТАИЦ (В) помещают в качестве набивки в колонну из нержаве- к цей стали даиметром 7,5 мм и длиной 50 см.

Характеристические показатели примен емых гелей (X, Y, Dy, W, S . и Мр.) определ ют по описанным методикам . Определение Мр,- проводитс на водном растворе декстранов и поли- зтиленгликолей с использованием детектора дифференционного рефрактора 111одекскК1, модель S Е-11, насоса и инжектора модели 635А.

Показатели примен емых г елей сведены в таблицу.,

З-Ю

1,9-10

3

8-10

2.JO

5-10

2-10

1 -10

1-10

2-W

Мп. определ етс по полиэтйленгликолю, декстрану.

На колонне с насадкой согласно примеру 1 проводилс анализ v-глобулина , алюбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина с использованием в качестве ного раствора, рида натри и 0,1 М фосфата, натри , а также детектора ультрафиолетового спектра поглощени . Протеины элюиро- вались по пор дку, при этом выход протеина с большим молекул рным весом составил по существу 100%. Измерение всех образцов проводилось при скорости потока 1 мп/мин

Кроме того, анализировали раствор образца сублимированной человеческой сьшоротки, получаема хроматограмма представлена на фиг.2, на которой пик А в основном показыв ает алюбумнн пик В - креатинин и пик С - мочевую кислоту. Некоторые компоненты быпи элюированы в большем количестве по сравнению со свободным объемом колонны в св зи со слабой абсорбционной способностью гел , но р д компонентов был обнаружен и выделен после элюировани -j--глобулина и алюбумина.

На колонке с насадкой согласно примеру 2 проводили анализ образца

растворител вод содержащего 0,3 М хло

Продолжение таблицы

в остальных примерах - по

0

5

0

5

сублимированной человеческой сыво- I роткн. Полученна хроматограмг а представлена на фиг.З, где пик D показывает в основном алюбумин, пик Е - креагинин, а пик F - мочевую кислоту, Число пиков меньше по сравнению с фиг.2 вследствие низкой чувствительности измерений. Основна картина кривой элюировани така же, как на фиг.2. Следовательно, с помощью гел этого примера можно обнаружить и отделить р д компонентов.

На колонке с насадкой согласно примеру 5 провод т анализ стандартных образцов алюбумина бычьей сыворотки , овалюбумина и миоглобулина. Полученна хроматограмма представлена на фиг.4, где крива G показывает кривую элюировани алюбумина, крива И - кривую элюировани овалюбумина и крива I - кривую элюировани миоглобулина .

Результаты показывают, что гель этого примера очень эффективен дл отделени протеинов. Измерени на всех образцах проводились при скорости потока 1 мл/мин, каждый анализ проводилс в течение 20 мин.

9131

На колонке с насадками согласно примерам 3-4, 6-14 также проводили анализ протеинов, включа j -глобулин, ичный альбумин, овалюбумин и миогло- булин. Анализ проводилс при скорое- ти потока 0,5-2 мп(мин в течение 10-20 мин. Полученные хроматограммы показывают элюирование белков в пор дке возрастани - молекул рных весов, степень извлечени белков 90-100%.

На колонке с гел ми согласно сравнительным примерам 15-19 проводили анализ - -глобулина и альбумина бычьей сьшоротки, овалюбумина и миоглобули- на. Однако вследствие недостаточной прочности гел и больших потерь давлени в колонке и почти полной абсорбции на геле белков пики элюиро- вани на хроматограммак не бьши обнаружены .

Как следует из примеров, предлагаема насадка обеспечивает высоко- скоростно е разделение и анализ веществ методом гельпроникающей жидкостной хроматографии

Claims

Формула изобретени

Насадка дл жидкостной хроматографии на основе водного гел сшитого гидроксилсодержащего сополимера, отличающа с тем, что,.с целью обеспечени пригодности насадки дл высокоскоростного разделени

5

0

5

10

и анализа веществ, она содержит в качестве сшитого гидроксилсодержаще- го сополимера сополимер винилового спирта с винилацетатом или винилпро- пионатом и триаллилизодиануратом при мол рном отношении звеньев а/а + b 0,4-0,8 и Зс/а + b + 3с 0,25-0,4, где а, b и с - мол рные отношени соответственно звеньев винилового спирта , виниладетата и винилпропионата и триаллилизоцианурата к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц гел 4-198 мкм и максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекул рной массе поли- этиленгликол или декстрана, равной 1,9-10 - 1,0-10, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц гел , при следующем соотношении компонентов, мае,ч.: Сшитьп сополимер ТОО Вода100-198

Приоритет по признакам.:

25.06,80 - применение дл наладки водного гел сшитого сополимера с определенным по формуле размером частиц , диаметром пор и содержанием воды;

26,12.80 применение дл насадки водного гел сшитого сополимера с определенным по формуле мол рным отношением звеньев сомономеров;

МНт

1дМ

gjuff.l

V

ю

а

30мин

L.

г

7

т- 8

Редактор М.Петрова

Составитель Б.Филимонов

Техред, Л.Олейник Корректор А.Ильин

Заказ, 1907/58Тираж 777Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна , 4

72

10 // фиа

73 Л