JPS5938649A - 液体クロマトグラフイ−用充填剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体りＩＪマドグラフィー充填剤の製造法に関
し、更にｒｌＹルくは、体液中の成分、特に蛋白質等の
分子量の高い成分の分離、又は分析に通ずる液体クロマ
トグラフィー用充填剤の製造法に関する。

血液、リンパ液あるいは組織液等の体液はそれぞれ多数
の成分を含み、その組成は健康状態によって変るといわ
れている。またその中には体内への投入又は体内からの
除去によって病気の治療に役立つものもある。そのため
体液中の成分を簡便、迅速かつ高度に分Ｍｌｌする方法
、特に従来良い方法がほとんどなかった蛋白質等の分子
量の高い成分の分離、分析法は、生化学、医学等の分野
から當に求められている。

液体クロマトグラフィー、中でも分子ふるいクロマトグ
ラフィーは、血漿、血清等の蛋白質の分ｌ１Ｉｌｌ法と
しては、電気泳動法や分別沈澱法にくらべて迅速性、簡
便性あるいは通用物質範囲の広さ等においてずくれてい
るため近年注目を隼めでいる。

液体クロマトグラフィーは分離原理によって分子ふるい
クロマ１−グラフィー（ケル濾過、又はゲルパーミェー
ションクロマ１−グラフィーともいい、以下Ｇ　Ｉ）　
Ｃと表す）と、吸着又は／）１配り１１１マドクラフイ
ーとに大別される。ＧＰＣは充填剤（以下ゲルと旨う）
のボアより小さい分子サイズの成分はその大きさに応し
てケルのボア内へ浸透し、大きい成分はゲルの外を素通
りする原理を利用して分子す′イズの大きい成分から溶
媒と共に順次熔出させる方法である。各成分の溶出容量
は一定の範囲内にあり、カラＪ・内のゲル粒子間溶媒容
稍をＶ。

リール粒子内部の溶媒容積をＶｉとするとＶｏとＶ　ｏ
　４−　Ｖ　ｉの間の値になる。一方吸着又は分配クロ
マトグラフィーは被分離物質の固定相つまりリール内又
は表面への吸着や分配を利用し、その強さに応じて分ｌ
１３１ｔ−ｖシめる方法である。この方法はＧｐｃより
も熔出容量を広い範囲で設定でき、低分子物質の詳２１
１１な分離に通ずるが、ケルへ吸着され易い高分子物質
の分離には不適当とされている。

体液中の物質をＧＰＣで分８１目゛る場合、被分離物質
のゲルへの吸着がないので血清等の有形成分を含まない
体液をカラムへ直接注入することができ、溶媒つまり移
動相を途中で変えることもないため操作が簡便である。

しかし破骨８１［物質の溶出容量が一定の範囲内にある
ため、例えば血清中の蛋白質のように数万から数十万の
狭い範囲で分子量が近接した多数の物質を明々に分離す
ることは困ｆｆ１ｌｔである。従来水溶媒系でのＧＰＣ
に通ずるとされる充填剤は多数報告されているが、いず
れも被分離物質が吸着されることなり５３子量の順に溶
出することを狙ったもので、前記したＧＰＣの欠点を解
決するものはない。

一方吸着又は分配クロマトグラフィーによる血清等の分
析では低分子成分については検出されるピークの数はＧ
ＰＣよりも多いが前処理として除蛋白が必要で、しかも
分析中に移動相の組成を変えることもあり、全体に複雑
な操作を伴う。

更に近年水系ＧＰＣ用ゲルにイオン交換基を導入して分
子ふるいと吸着又は分配を同時に作用させて、血清等の
試料の前処理の簡略化と検出ピーク数の増大とを同時に
満たず試のもなされ°ζいるが、この方法も途中で移動
相を変える操作を伴うものであり、繰り返し迅速に分Ｆ
ｊｌｔするには不適当である。

液体クロマｌ−グラフィーによる体液の分離、う）折で
は、ＧＰＣのようにザンプルの直接注入と一定の移動相
の使用が可能で、しがも蛋白質についても吸着又は分配
クロマトグラフィーのように多数のピークを検出できる
ことが好ましい。

本発明壱はこのような観点から液体り１」７トグラフイ
ーにより体液の直接’Ｊ）離又は分析をｉｉＪ能にずべ
く鋭意検ｔ＋・Ｉを重ねた結果、有形成分を含まない体
液の直接分析が可能で一定組成の移動相のもとに蛋白質
等の高分子成分についても詳細に分離し得るゲルの新規
な製造法を開発し、本発明を完成するに到った。

ずなわら本発明は、カルボン酸ビニルエステル単量体、
・イソシアヌレート環を自する架橋性単量体、前記両車
量体を溶解するが水に熔解しにくい有機溶媒及び重合開
始剤を少なくとも含んでなる混合物を懸濁重合して得ら
れた共重合体をケン化又はエステル交換せしめる液体ク
ロマｌルブラフィー用充填剤の製造法において前記有機
溶媒の５〜５０重量％が前記カルボン酸ビニルエステル
ｆｔ１ｉｔ体の重合体を熔解しにくい鎮状炭化水素化合
物、エーテル化合物又はこれらの混合物よりなる有機溶
媒であり、更にケン化又はエステル交換反応によって共
重合体中のエステル基のモル分率で０．４〜０．８を水
酸基に変換せしめることを特徴とする液体り１コマトゲ
ラフイー用充填剤の＋Ｍ造法に関する。

このようにカルボン酸ビニルエステル単量体及びイソシ
アヌレ−１−環を有する架橋性単量体を主たる原料単量
体として水溶媒系で用い得る液体り１：Ｊマドグラフィ
ー用充填剤の製造に際して重合時に単量体と共に用いる
有機溶媒の組成、及びケン化又はエステル交換反応にお
りるエステルの反応率を二ｌントロールすることによっ
て、デギス１−ランやポリエチレングリコールについて
ばＧ　ｌ）　Ｃによる分離が可能で、蛋白質が浸ｉ３Ｌ
うる大きさのボアをもち、しかもある種の蛋白質に対し
てば１阪少な分配又は吸着作用を示すゲルが得られる。

ここで微少な分配又は吸着作用とは、被分離物質がカラ
ム内に残留されることなく高い回収率で溶出されるが、
溶出容■」がＧＰＣにおける類似物質の検量線より予想
される値から明確にはずれる程度のケルと被分離物質の
相互作用をいう。ゲルにこのような作用をもた一Ｕるこ
とにより、体液の分析に用いたとき、除蛋白を必要とせ
ず直接注入が可能で、しかも一定組成の移動相のもとで
成分によってはう）子量の近接したもの相互の分！’ｉ
ｌｔが可能になる。従って本発明のゲルを用いることに
よって、体液の分析を迅速かつ簡便に行うことができ、
しかも蛋白’Ｉ（等の高分子成分についても詳細な分Ｍ
ＩＩが可能になった。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明で用いられるカルボン酸ビニルエステル単量体と
は重合可能なカルボン酸ビニルエステル晶を一つ以上有
する化合物のことで、例えば酢酸ビニル、プじ１ピオン
酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル及びピバリン酸ビ
ニルの中から選ばれ、これらは単独又は二種以上の組合
−Ｕで用いられる。

なかでも重合やエステル交換又はケン化及び入手の容易
さから酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが特に好ましい
。

次に本発明で用いられるイソシアヌレ−１・環を有する
架橋性単量体とは下記の構造式で表わされるものである
。

１ ３ （ただしＲ，、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に−ＣＩ＋
２−ＣＩ（＝ＣＩ、２　、　−ＣＩ＋２−ＣミＣ１＋又
はＣＩ堀 とりわけ、Ｒ，、ｌ？２及び穐がすべて−Ｃ１１２−Ｃ
Ｈ−Ｃ１１２７−あるトリアリルイソシアヌレ−１・は
酢酸ビニルとの共重合性が良く、かつエステル交換又は
ケン化に２１１．でも安定性が大きいので架橋剤として
好ましい。

全単臣体中のイソシアヌレ−１・環を自する架橋性単量
体の割合は特に限定されないが、機械的強度が特に大き
いゲルを作る場合は次式の範囲にあるのが良い。

０．２≦３ｂ／（ａ＋３ｂ）≦０．４ ここで ａｚ力月Ｇｊξン酸ヒニルエステル単量体のモル数１＋
　ニー（ソシアヌレ−１・環をイ１する架橋性単量体の
モル数 カルボン酸ビニルエステル単量体やイソシアヌレート環
を有する架橋性単量体以外の単量体をゲルの物性にほと
んど影響しない程度に併用し共重合さ一υることは／ｌ
：発明のゲルを１■Ｉるうえて何ら支障ない。

また本発明ではカルボン酸ビニルエステル小量体とイソ
シアヌレート環をイｊする架橋性小量体とを：Ｕ澗ｍ合
さゼる際に、生成共重合体をポーラスな構造にするため
に、単量体を溶解するが水に溶１’ｔｌ　シにくい有機
溶媒をモノマーと共存させる。

有機溶媒混合液は単量体１００重量部に対して通糸′は
２０〜２５０重量部の範囲で用いられるが、小粒径のゲ
ルが用いられる高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＬ
　Ｃと表す）用ゲルをつくる場合はやや少ない方が良く
、例えば２０〜１００重量部の範囲で用いるのが好まし
い。ただし全有機溶媒中の５〜５０重■％はカルボン酸
ビニルエステル重合体を熔解しにくい有機溶媒であるの
がよい。

このような有機溶媒の具体例としては、ヘプタン、オク
タン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン等の
炭素数７〜１５の鎮状炭化水素化合物、プロピルブチル
エーテル、ジブチルエーテル、シアミルエーテル、ジデ
シルエーテル、シー２−エチルヘキシルエーテル、ジデ
シルエーテル、ジドデシルエーテル等炭素数７〜２５の
エーテル化合物等があげられる。またこのような有機溶
媒と組合せて用いられる他のを機溶媒としては、前記有
機溶媒以外でかつ水に溶解しにくいものであれば特に限
定されないが、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸
ブチル、酢酸へキシル、メチルイソブヂルケトン等の比
較的酢酸ビニル重合体を熔解し易い有機溶媒が好ましい
。

このような有機溶媒を前記範囲で組合・Ｕて用いること
によって蛋白質の分離、分析に適した大きさのボアをも
も、更に蛋白質によっては微少な分配又は吸着作用をも
たらすゲルを得ることが可能になる。

ゲルの孔径、孔径分布あるいは吸着、分配作用をコンｌ
−１１１−ルするために単量体と有機溶媒を主成分とす
る単量体混合物に熔解する綿状重合体を前記有機溶媒と
（ｊｆ用してもよい。ｆｌｉ　ｆＪ体混合物に熔解する
線状重合体とは、単量体混合物に１重量％以上の濃度で
溶解する線状重合体のことで例えばポリ酢酸ビニルやポ
リスチレンがあげられ、単量体１００重Ｍ部に対して１
０重Ｍ部以下、好ましくは５重ｕ部以下で用いられる。

前記１１機溶媒や線状重合体を用いることによって、デ
・トス１ランの排除限界分子量力月−以上のゲルをｉｑ
ることが可能となる。排除限界分子量はボア内−・浸透
できない分子の分子量の下限を表す値であってｃ　ｒ）
ｃの検量線から公知の方法で求められる。

また前記のカルボン酸ビニルエステル重合体を溶解しに
くい有機溶媒を重合時に用いるごとによって、得られる
ケルが蛋白質等に対して微少な分配又は吸着作用ををす
るようになる理由は必ずしも明らかではないが、重合時
の骨格分子の配向がポーラス化剤として用いられる有機
溶媒等の種類によって影響を受りるためと推定される。

重合に際して用いられる開始剤は、Ｊ’＋Ｒの懸濁重合
に用いられる一般的なラジカル重合開始剤でよく、例え
ば２，２′−アゾヒスイソブチロニトリル、２，２′−
アゾビス−（２，４−ジメチルハレしにトリル ヘンソイル、過酸化ラウロイル、ジーｔ　−　フチ／ｌ
ｚパーオキザイド又はクメンハイドロパーオキザイド等
の過酸化物系の開始剤を用いることができる。

懸濁重合は一般に良く知られノこ方法で行うことができ
る。

重合によって得られた粒状共重合体を洗浄又は抽出して
線状重合体、残留単量体あるいは自機溶媒等を除いたの
ち、生成共重合体のエステルタ喚又はケン化反応を行う
。反応は水やアル」−ル又はその混合液を溶媒として酸
又はアルカリを用いて行われるが、共重合体中のエステ
ル基のモル分率で０．４〜０．８を水酸基に変換せしめ
るよう反応をコンｌ−　ＬＪ−ルするのが良い。反応率
は前述した重合時に用いる有ｔａ熔媒と同様ゲルがちつ
ＧＰＣ作用と？Ａ’ｘ少な分配又は吸着作用のバランス
に影響する。反応率が前記範囲にあることは本発明の目
的とするゲルをｆｌる上で重要である。反応のコントし
】−ルは酸・やアルカリの量、反応溶媒、反応温度又は
反応時間と反応率の関係を事前にｌＩ２握しておき、そ
の中から条（）１を選択することによって行うことがで
きる。

ケン化反応又はエステル交換反応後、冑られたゲルは必
要により分級してＩ−Ｉ　Ｌ　Ｃ用充填剤として用いる
ことが一ζきる。

ケルのケン化率は、原料として用いた単量体の種類と量
比がわかっている場合は、ゲルの水酸基密度（ｑｏｌ．
、ｌ）を測定すれば、δＩＷ．シて知ることができる。

（４。８はゲル０１位屯量当りの水酸基の量をいい、リ
ールはピリジン溶媒中で無水酢酸と共に加熱し、水酸基
と反応して消費した無水酢酸の量又はゲルの重量変化を
測定し、これから求めることがてきる。乾燥ケル１ｇが
ｌ　ｍｍｏｌの無水酢酸と反応したときのＱｏｔ４がｌ
　ｍｅｑ　／　ｇである。また原オ′、１小川体の種類
や■が不明な場合は、架橋性用Ｍ体の種１ｎをゲルの赤
外線吸収スペクトルから、量をゲルの窒素の元素分析・
から求め、エステル基の種すｎをゲルの再ケン化により
生成するカルボン酸を同定すれば、同様にｑ。８を測定
したのち計算して求め得る。

本発明により製造されるゲルの平均粒子条（Ｄｗ）は通
常５〜１０００７７　ｒｎの範囲にある。ただしＨＬ　
Ｃ用ゲルとして用いる場合は小さい方が好ましく、例え
ば５〜２０μｍ、更に好ましく　＆Ｊ：　５〜１５μｍ
の範囲にあるのが良く、特に高分離能をａ・要とする場
合ば５〜ｌ　２／７　ｔｎの範囲にあるのが好ましい。

またアフィニティークロマトグラフィー用担体や、工業
規模の分団ｌ用充填剤として用いる場合はＨＬ　Ｃ用ケ
ルよりも人きい粒ｉイＣ良い。

本発明におりるゲルは刊格に主として水酸基、エステル
基及び・イソシアヌレ−１・環を有する架橋性単量体単
位を含み、十分な親水性を有するため、糖、ポリエチレ
ングリコール等多くの物７１を水溶媒系Ｇ　Ｉ）　Ｃで
分８１Ｆ、分析するための充ｊ眞刑としζ４ｉＪい得る
。ただし生体中のある種の蛋白質、例えばアルブミン等
をわずかに吸着又は分配する傾向を示す。このようなゲ
ルに対して微少な吸着又は分配の傾向を白する物質を分
析すると溶出容量がＧＰＣの検量線から予想される値と
異なり通常は大きい値を示す。中には小さい値を示すも
のもある。体液中の蛋白質の多くは数カから数十万の分
子層をイｊＪる。そのため単なるＧＰＣでは体液中の蛋
白質を多数のピークにう３ＩｉｌＩＩすること番Ｊ通常
は困Ｈである。しかしケルが前記のような微少な吸着又
はう）配作用を有することによってノことえろ）子頃が
同一の成分相互でも分離可能になることがある。従っ−
（（１１なるＧＰＣよりもりｉ」マドグラム」二で分離
されるピークの数はＧＰＣの特徴である操作の簡便性を
維持したまま体液中の蛋白成分を多数のピークに分δ１
［できることはその情報が特に臨床検査あるいは病気の
診断等に有効であるばかりでなく、特定成分の工業的’
１＝３１１ｆｔに対しても有効である。

以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明するが、
本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものでないこ
とはいうまでもない。

実施例１ 酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレ−Ｌ　３
７．５　ｇ　、酢酸ｎ−ブチル１１０ｇ、１Ｓｏ−オク
タン２７．５　ｇ及び２．２′−アゾビスイソブチロニ
トリル３．４ｇよりなる均一混合液と、少量のポリビニ
ルアルコールとリン酸ナトリウムを４蛸！した水８００
ｍｊ！とを２１フラスコに入れ、十うｌ攪拌したのち６
５°Ｃで１８時間、更に７５°Ｃで５時間加熱攪拌して
懸ｉ’Ｗ１重合を行ない粒状共重合体を得た。濾過、水
洗、次いでアセトン抽出後、カセイソーダ４７ｇ及びメ
タノール２Ｃよりなるｌ８液中で１５℃で２０時間共重
合体のエステル交換反応を行なった。得られた粒子を分
級して平均粒径１１．５　ｐ　ｎｔのゲルを得た。ゲル
の水酸、Ｉ＆重密度ら求めたエステル基の反応率は５８
％であった。

次にこのゲルを内径７．５１ｆ１ｍ、ＪＷさ５０　ｃａ
ｎのステンレス製カラＪ・に充填して蒸留水を溶出溶媒
として種々の分子量をもつデキストランやポリエチレン
グリコールの水溶液を測定し）ことごろ、それぞれ分子
量の大きい順に溶出され、これらの物質に列してはＧＰ
Ｃによる分離が行なわれていることが確認された。また
デキストランの排除限界分子■ば約２　Ｘ　１　０６で
あった。また０、３Ｍ塩化すトリウム及びＯ，Ｉ　Ｍリ
ン酸す１〜リウムを含む水溶液を溶媒として人血清グ１
コブリン（Ｉ　ｇＧ、　　Ｉ　ｇＭ）、千ログロブリン
、人血清アルブミン、トランスフェリン及び卵白アルブ
ミンを分析したところいずれも８０％以十の高い回収率
で溶出し、各溶出容量と分子層の関係は第１図のよ・）
になった。第１図によるとアルブミンの溶出位置（点ｅ
）は実線で示した蛋白Ｔ（の検量線から人きくはずれて
いる）こめＩｇＧＣ点Ｃ）とアルブミンの分δ１ｔが良
くなると共にＧ　））　Ｃではアルブミンのピークによ
ってかくれていたピークを検出できるよ・うになり、全
体としてピーク数を増すことが可能となった。

比較例１ 実施例１において酢酸ｎ−ブチル１１０ｇと１ｓｏ−オ
クタン２７．５ｇのかわりに酢ａ７　ｎ−ブチルだけを
１３７．５ｇを用いた以外は実施例１と同様に行なって
ゲルをｉηた。このゲルのデキストランの排除限界分子
量は約９Ｘ１０４であった。更に各種蛋白質について求
めた溶出容量と分子量の関係は第２図のようになり、実
施例１で見られたよ・うなアルブミン（点ｅ）の遅れは
見られず、しかも排除限界分子量がやや小さいため高う
１子量の蛋白質の分離には適さない検量線であった。

実施例２ 酢酸ビニル１００ｇ、Ｉ−りアリル・イソシアヌレート
４１．４ｇ、酢酸ｎ−ブチル５９ｇ１ジー２−エヂルヘ
キシルエーテル４０　ｇ及ヒ２．　２　’−アゾビスイ
ソブチロニトリル３．４ｇよりなる均一混合液を用いて
実施例１と同様に重合及び反応を行なってケルを１８た
。このゲルを充填したカラムを用いて実施例１と同様に
各種蛋白質を分Ｊｌｉ′シだところいずれも高い回収率
で溶出しかつ第１図と１１僚のアルブミンが遅れた検量
線が得られた。

実施例３ 酢ｆｆｙビニルｌ（Ｎ１ｇ、ｌ・リアリルイソシアヌレ
−ｌ−４１，４ｇ、酢酸ｒｌ−ブチル７９ｇ、デカン２
０ｇ及び２．２′−アゾビス・イソブチ１」ニトリル３
．４ｇよりなる均一混合液を用いて実施例１と同様に重
合及び反応を行なってケルを得た。このゲルを充１．Ｆ
したカラムを用いて実施例１と同様に各種蛋白９．１（
を分１１ｉ’　Ｌ、たところ、いずれも８０％以、トの
高い回収率で溶出し、実施例１のゲルよりは排除限界分
子量が少し低いが、第１図と人体類似したアル〕゛ミン
が遅れた１ｉｆｔ綿をもつことが６■忍さ　れゾこ。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得たゲルを充填しにカラムを用いて
、各種蛋白質を分析したときの熔出容■と分子量の関係
を表すグラフ図であり、第２図は比較例１で得たゲルを
充填したカラムを用い“ζ、各種蛋白質を分析したとき
の溶出容量とう）子量の関係を表すグラフ図である。 なお、第１図及び第２図において点ａ〜ｆはそれぞれ以
下の物質の溶出容量と分子量の関係を示す。 ａ・・・ＩｇＭ、　　　ｂ・・・ヂログＵプリン、Ｃ・
　・・ＩｇＧ、　　　ｄ・・・１−ランスフェリン、ｅ
・・・人血清アルブミン、　。 ｆ・・・卵白アルブミン。 特許出願人 旭化成工業株式会社 特許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　石　１）　　敏 弁理士　山　口　昭　之

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、カルボン酸酸二ニルエステル単量体イソシアヌレー
   ト環を有する架橋性単量体、前記両車量体を溶解するが
   水に熔解しにくい有ｔａ熔媒及び重合開始剤を少なくと
   も含んでなる混合物を懸濁重合して得られた共重合体を
   ケン化又はエステル父換反応せしめる液体クロマトグラ
   フィー用充填斉１１の製造法において、前記有機溶媒の
   ５〜５０車量％が前記カルボン酸ビニルエステル単Ｍイ
   ２本の重合体を／８解しにくい鎖状炭化水素化合物、エ
   ーテル化合物又はこれらの混合物から成る有機１８々装
   でＪ）す、更にケン化又はエステル交換反応ＧこＪミツ
   てＪ（重合体中のエステル基のモルう）率で０．４〜０
   ．８を水酸基に変換せしめることを特徴とするｌ＆　（
   本りし１マトグラノイー川充填剤の製造法。 ２、カルボン酸ビニルエステル単量体とイ・ノソアヌレ
   −１・環を有する架橋性単量体の占１１φ１力毫ヱ（，
   ０，２≦３　　ｂ／（ａ＋３ｂ）　　≦０．４（ここで
   、ａはカルボン酸ビニルエステル単量体のモル数を示し
   、ｂはイソシアヌレート環を自する架橋性単量体のモル
   数を示す） で表わされる範囲にある特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。 ３、カルボン酸ビニルエステル１１１体の重合体を溶解
   しにくい有機溶媒が炭素数７〜１５の範囲にある鎖状炭
   化水素である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製
   造法。 ４、カルボン酸ビニルエステル小屋体の重合体を熔解し
   にくい有機溶媒が式、Ｃ〕Ｉ　Ｈ２Ｑｔｌ　ＯＣＩｎ　
   Ｈｚｍ）１（ただし８≦ｚ　−１−ｒｎ≦２５）で表わ
   されるエーテル化合物である特許請求の範囲第１項又は
   第２項に記載の製造法。