JP7196203B2 - バイオセパレーションのための複合材料 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的供給原料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）から得られるタンパク質の精製に有用な複合材料に関する。

多くの治療及び診断用途において、タンパク質をバイオ医薬品として使用することの妥当性は、ここ数十年間で高まる一方である。特に関心が寄せられている分野の一つが組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用である。炎症性疾患、糖尿病、各種がん及び血液疾患の治療に承認される治療用ｍＡｂ及びその断片の数は年々増加している。

ｍＡｂの初回の単回投与量は、多くの場合、その薬物動態特性により、患者一人当たり約０．１～１ｇの範囲とすることが必要であり、その後、同等の用量が毎週又は毎月投与される。そのため、多量の治療用ｍＡｂが必要となる。つまり、治療用ｍＡｂは工業規模で製造しなければならない。ｍＡｂは、発酵ブロス（濾過液）や細胞培養液等の生物学的供給原料で製造されるが、分泌される組換え抗体の発現量及びその不純物含有量は様々である。

医薬品としての適格性が認められるためには、目的タンパク質は、回収後（例えば、細胞培養液中に分泌された目的タンパク質から細胞又は細胞片を回収した後）の細胞培養液上清又は濾液中に必ず含まれている、生成物由来又は製造工程由来不純物を基本的に含んでいてはならない。これらの夾雑物は、遺伝子組替え宿主由来タンパク質及び核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、例えば、チャイニーズハムスター卵巣宿主由来タンパク質（ＣＨＯ－ＨＣＰ）又はＤＮＡ（ＣＨＯ－ＤＮＡ）のみならず、残存している、栄養素として添加されたタンパク質又は安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はトランスフェリン）をはじめとした細胞培養液添加物、塩、緩衝剤に加えて、エンドトキシン及び病原菌又はその断片も含んでいる。

目的タンパク質を精製するための公知の方法には、適切な膜濾過工程による（例えば、高強度のイオン交換膜に結合させることによる）、ウィルス、エンドトキシン及びある程度の核酸の除去、並びにダウンストリーム工程（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＤＳＰ）で行われるその後の単位操作における低分子量水溶性夾雑物の除去が含まれる。しかしながら、広範囲に亘る様々なＨＣＰを完全に除去することは困難な作業であり、これまでは主として、複数の専用の分取クロマトグラフィー工程を適用することによって対応されてきた。

ｍＡｂ及び他の組換えタンパク質製品のＤＳＰにおいて使用されるクロマトグラフィーによる精製方法には、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換、疎水性相互作用並びに金属キレートアフィニティーが含まれる。更に最近になって、様々なマルチモード及び偽アフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ－ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィー媒体が利用できるようになり、各製造プロセスにおける用途、例えば、イオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー工程後の生成物をポリッシングするための用途が見出されている（欧州特許出願公開第１８０７２０５（Ａ）号）。現在適用されているクロマトグラフィー方法には、通常、２種の古典的なクロマトグラフィー方式が用いられている：１つは連続溶出クロマトグラフィープロセスに基づくものであり、もう１つは「結合溶出」概念に基づくものである。

これらのクロマトグラフィー分離方法に共通する原理は、様々なクロマトグラフィー媒
体が、生物学的試料の１種以上の成分に対し選択的吸着能を有していることにある。したがって、結合していない（又は弱く結合する）成分は、（より）強力に結合している成分から分離し、対応するブレークスルー画分に出現する。また、結合している成分を互いに分離できるようにするためには、個々の成分を選択的に脱着させる、体積及び時間に応じて変化する条件が得られるように、イオン強度、ｐＨ又は特定の置換物質（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）の濃度を増加又は減少させて、連続的又は段階的勾配を形成することによって溶出条件を調整することが多い。

利用可能なクロマトグラフィー方法の中でも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、生産性が低く、分解能が低く、且つ速度が遅いことから、ポリッシング目的を除いて、大規模操作に有用ではないと考えられている。それとは対照的に、工業的なｍＡｂのクロマトグラフィー精製のプラットフォームに最も広く使用されている第１工程の１つが、「捕捉」又は「結合溶出」親和性機構に基づくものである。この種のプロセスは、目的化合物を結合（「捕捉」）させることを含む一方で、望ましくない生成物の大部分を結合しないままであるか、或いは、結合した不純物を目的物質よりも先又は後に遊離させる選択的溶出工程により分離してもよい。この種の結合溶出プロセスの代表例には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使用するものが含まれる。

ｍＡｂのアフィニティー精製においては、目的タンパク質がクロマトグラフィー材料に非常に強固に結合することを容易にする条件下で、免疫グロブリンは、固定化されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａに特異的に結合し、一方、ＨＣＰ及び他の不純物の大部分は結合しないままである。したがって、未結合成分を洗い流した後、カラムに適切な酸性緩衝液を流して各カラムのｐＨを中性付近から幾分酸性の条件（例えば、ｐＨ３）に変化させることにより、結合している免疫グロブリンを遊離させることができる。理論上、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは、別個の遺伝的に保存されている抗体分子の構造モチーフに結合する選択性が極めて高く且つ特異的であることから、この工程の後に回収される免疫グロブリン生成物は完全に純粋となるはずである。しかし、実際に実用されている製造プロセスにおいては、多くの副次的な作用がこの完璧な１段階精製を妨げる。その中でも、残存ＨＣＰが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに、クロマトグラフィーマトリクス材料に、又は免疫グロブリンにさえ結合して、同時に溶出することが観測されている。更に、微量のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ及びその分解物の漏出も起こり得、特に、抗体の安定化に適したｐＨ範囲に戻すために必要な、急速なｐＨ調整を行った後に、目的タンパク質に再び結合する可能性もある。免疫グロブリンをＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーの特定のプロセス条件に曝すことも、内在タンパク質の不安定性に起因して、例えば、凝集物の形成、タンパク質分解による一部の分解及び他の有害作用により、ある程度の不可逆な生成物の損失を促す可能性がある。

したがって、医薬品用抗体製品に関し規定されている高水準の純度を達成するために、追加の精製工程が必ず必要となる。イオン交換法及び様々なマルチモードクロマトグラフィー法を含むこうした工程を行うことは、ＨＣＰ及び核酸の量を更に低減すると共に、タンパク質凝集物及びより分子量の小さい抗体分解物を除去するために必要である。そのような精製工程は、生成物の収率を更に低下させる原因となり、また、全体の製造プロセスに、費用が嵩む作業及び時間のかかる労力を追加する。したがって、不純物の大部分を１段階の処理で除去することができる技術が求められている。

ｍＡｂ及び他のタンパク質を精製するために複合吸着材を利用する多くの方法が知られている。これらの方法において、複合吸着材は、通常、クロマトグラフィーカラムに充填される。

国際公開第９５／０２５５７４号には、生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）から夾雑物を除去するための方法が開示されており、これは、多孔性無機酸化物マ
トリックスを覆っているが、共有結合はしていない、架橋された疎水性高分子の網目（前記疎水性の網目によって、内部の空孔容積が実質的に充填されている）に、前記生物学的流体を接触させることを含み、それによって、平均分子質量が１０，０００Ｄａ未満である疎水性及び両親媒性分子が除去される。

米国特許第６，７８３，９６２（Ｂ１）号は、生体高分子の単離／精製に有用な粒子状材料に関する。この粒子状材料は密度が少なくとも２．５ｇ／ｍＬであり、粒子状材料の粒子は平均径が５～７５μｍであり、粒子状材料の粒子は基本的に高分子ベースマトリックス及び非多孔性の芯材から構成されており、前記芯材は密度が少なくとも３．０ｇ／ｍＬである。高分子ベースマトリックスは、ｐＨ４．０で正に帯電しているか又は生体分子の親和性リガンドである側基を含む。

国際公開第２００４／０７３８４３号は、複数の孔を有する支持部材及び支持部材の孔に充填されているマクロ孔を有する架橋ゲルを含む複合材料を開示している。生物学的分子又は生物学的イオンを液体から吸着するためのプロセスも開示されており、これは、生物学的分子又は生物学的イオンを含む液体を、マクロ孔ゲル上に生体分子と特異的に相互作用する結合部位を有する複合材料に通過させることを含む。

欧州特許出願公開第２５４５９８９（Ａ）号には、多孔性支持体及び多孔性支持体表面上の架橋されたポリマーを含む、クロマトグラフィー用途のための複合材料が開示されており、多孔性支持体の孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）［ｎｍ］及び架橋ポリマーの架橋度［％］の比は０．２５～２０［ｎｍ／％］であり、架橋ポリマー中の架橋性基の総数を基準とする架橋度は５～２０％である。

国際公開第２０１８／０５０８４９号には、孔径が２５ｎｍである多孔性シリカゲル及び架橋されたポリ（ビニルホルムアミド－ｃｏ－ポリビニルアミン）を含む複合材料の調製が開示されている。

国際公開第２００６／０１５４９５号は、耐久性非架橋ポリマーで充填又は被覆された多孔性支持部材を含む複合材料に関する。多孔性支持体の孔径は０．１～５μｍの範囲内であり得る。この複合材料はタンパク質の吸着に使用することができる。この参考文献は、ポリマーが充填された多孔性支持体の外面に未架橋ポリマーを共有結合させることは述べておらず示唆もしていない。

国際公開第２００５／１２０７０１号には、その内部に延びている複数の孔を有する支持部材と、支持部材の孔内に位置し、それを充填しているマクロ孔を有する架橋ゲルと、を含み、架橋ゲルは、実質的に水不溶性であるが水膨潤性である安定化ポリマーを捕捉している、複合材料が開示されている。

欧州特許出願公開第２０２７９２１（Ａ）号には、第１外面及び第２外面と、それらの間の多孔性厚みとを有し、両面が多孔性である基材を含む、多孔性収着性媒体が記載されており、前記基材は、基材の中実（ｓｏｌｉｄ）マトリックス並びに前記第１及び第２外面を実質的に覆っている収着性材料を有し、前記収着性材料は、１級アミン基が結合している架橋ポリマーを含む。

国際公開第２０１１／１４０４０６号には、不織基材上に支持されている混合セルロースエステルを含み、１級アミン基が結合している架橋ポリマーで被覆された、多孔性収着性媒体が開示されている。

本発明は、生体分子の精製における既存の技術の限界を克服するべく設計された。

本発明の目的は、ｍＡｂ等のタンパク質を含む生物学的供給原料からの該タンパク質の精製を向上する複合材料を提供することにある。

本発明の目的は、添付の請求項１に記載の複合材料によって達成される。

具体的には、本発明は：
平均孔径が５～５００ｎｍである多孔性支持体であって、架橋された第１ポリマーが充填されている、多孔性支持体と、
架橋されたポリマーが充填された多孔性支持体の外面に共有結合している、未架橋の第２ポリマーと、
を含む複合材料を提供する。

本発明は、未架橋の第２ポリマーの存在が、架橋ポリマーが充填されている多孔性支持体のみから構成される複合材料と比較して、複合材料の精製能力を大幅に向上するという驚くべき発見に基づいている。

本発明は、溶液又は懸濁液中に含有されている望ましくない化合物から目的タンパク質を精製するための複合材料を提供する。この複合体は、製造されたｍＡｂ等のバイオ医薬品から不純物を効率的に除去するのに特に適しており、清澄化やダウンストリーム精製工程（ＤＳＰ）に容易に統合することができる。

本発明の複合材料は、好ましくは、タンパク質製造時に得られるタンパク質含有溶液からＤＮＡ及びＨＣＰを同時に除去（ｄｅｐｌｅｔｅ）することができると共に、非常に高いタンパク質回収率を達成することもできる。

本発明はまた、
ａ）平均孔径が５～５００ｎｍである多孔性支持体を、第１ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程；
ｂ）第１ポリマーを２５０℃未満の温度で架橋剤により架橋する工程；及び
ｃ）工程ｂ）で得られた複合材料の外面に第２ポリマーを共有結合させる工程
を含む、複合材料の製造方法にも関する。

更に、供給原料中の目的タンパク質を精製するための本発明の複合材料の使用も提供する。

更に本発明は、供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
ｉ）供給原料を本発明の複合材料と十分な時間接触させる工程；
ｉｉ）精製された供給原料から複合材料を分離する工程；
ｉｉｉ）任意に、精製された目的タンパク質を供給原料から単離する工程；及び
ｉｖ）任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
を含む方法を提供する。

複合材料
本明細書において、「複合体」、「複合材料」及び「吸着材」という語は互換的に使用
される。

本明細書において、「孔径」に言及する場合は常に「平均孔径」を意味する。

多孔性支持材料の平均孔径は５ｎｍ～５００ｎｍである。上述又は後述の任意の実施形態と組み合わせて、平均孔径は、好ましくは１５ｎｍ～３００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍ、更に好ましくは２５ｎｍ～２５０ｎｍ、一層好ましくは３０ｎｍ～２００ｎｍ、最も好ましくは４０ｎｍ～１００ｎｍ、例えば、５０ｎｍ～１００ｎｍである。本明細書における多孔性支持材料の平均孔径は、ＤＩＮ ６６１３３に準拠する水銀圧入により決定される。

多孔性支持材料は、膜、中空繊維、不織布、モノリシックな材料又は粒子状材料であり得る。粒子状及びモノリシックな多孔性材料が好ましい。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、不規則又は球状形状を有する粒子状多孔性支持材料である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、金属酸化物、半金属酸化物、セラミック材料、ゼオライト又は天然若しくは合成のポリマー材料から構成される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、多孔性シリカ、アルミナ又はチタニア粒子である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、多孔性シリカゲルである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、セルロース、キトサン、アガロース等の多孔性多糖類である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエーテルケトン、ポリアルキルエーテル（ｐｏｌｙａｌｋｙｍｅｔｈｅｒ）、ポリアリールエーテル、ポリビニルアルコール若しくはポリスチレン又はこれらの混合物若しくはコポリマー等の多孔性合成ポリマーである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、多孔性支持材料は、平均粒子径（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）（直径）が１μｍ～５００μｍ、好ましくは２０μｍ～２００μｍの間、より好ましくは３０～１５０μｍの間、最も好ましくは３５～１００μｍの間にある粒子状材料である。

本明細書における多孔性支持体の平均粒子径（直径）及び粒度分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ
Ｌａｓｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎにより求められる。

本明細書においては、特段の指定がない限り、「第１ポリマー」という語は架橋前のポリマーを指す。

第１ポリマー（即ち、架橋前）は、いかなる形でも制限を受けないが、好ましくは、ヒドロキシル（－ＯＨ）、チオール（－ＳＨ）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、スルホニル（－ＳＯ_３Ｈ）、アミノ又はこれらの組合せから選択される官能基を含む。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーはヒドロキシル基を含み、より好ましくは、第１ポリマーは、ポリ（ビニルアルコール）、アガロース又はセルロースである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーはカルボキシル基を含み、より好ましくは、第１ポリマーは、ポリ（メタ）アクリレートである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーはアミノ基を含み、好ましくはポリアミンである。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリアミンは１級及び／又は２級アミノ基を含む。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーは、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリブチルアミン、ポリリジン及びこれらのコポリマーから選択されるポリアミンである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーは、ポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。ポリビニルアミン及びポリアリルアミンには、ビニルアミン又はアリルアミンの直鎖又は分岐ホモポリマー及びビニルアミン又はアリルアミンとアミノ基又はアミド基とのコポリマーが含まれる。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、ビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーは、ビニルホルムアミド単位を、ポリマーの構造単位の総数を基準として、１％～７０％、より好ましくは、ビニルホルムアミド単位を２％～４０％、最も好ましくは、ビニルホルムアミド単位を５％～２５％含む。上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリアリルアミン（ｐｏｌｙａｌｌｙａｍｉｎｅ）は、アリルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はアリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、アリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーは、ポリマーの構造単位の総数を基準として、アリルホルムアミド単位を１％～７０％、より好ましくは、アリルホルムアミド単位を２％～４０％、最も好ましくは、アリルホルムアミド単位を５％～２５％を含む。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は２，０００～５００，０００Ｄａ、好ましくは１０，０００～４５０Ｄａ、より好ましくは１５，０００～４００，０００Ｄａ、一層好ましくは２０，０００～３００，０００Ｄａ、最も好ましくは２５，０００～２５０，０００Ｄａである。

本明細書において、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ－ＲＩ）により決定される。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーは、ホルムアミド基の加水分解度が、少なくとも５０％、好ましくは６０％～９９％、より好ましくは６６％～９４％、一層好ましくは６８％～９０％、最も好ましくは７０％～８６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。

本明細書における「加水分解度」という語は、「ポリマーのホルムアミド基の加水分解度」を指す。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第１ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１５，０００～８０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００～７０，０００Ｄａ、より好ましくは２５，０００～５０，０００Ｄａであり、ホルムアミド基の加水分解度が６６％～９９％、好ましくは６７％～９０％、一層好ましくは６８％～８０％、最も好ましくは６８％～７５％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第１ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１００，０００～５００，０００Ｄａ、好ましくは１５０，０００～４００，０００Ｄａ、より好ましくは２００，０００～３００，０００Ｄａであり、加水分解度が７０％～９９％、好ましくは７５％～９５％、より好ましくは７５％～９０％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。

本明細書におけるポリマーのホルムアミド基の加水分解度は、次に示す方法に従い^１Ｈ－ＮＭＲにより求められる：
ポリマー５．２５ｇをフラスコに秤り取り、水１０ｍＬを加える。得られた混合物を回転させて均質な混合物を得、そして、乾燥固体が認められるまで５０℃の真空下で蒸発させる。固体を８０℃のオーブンで１５時間高真空下（≦０．１ｍｂａｒ）に乾燥させることにより乾燥残渣を得る。

加水分解度は、^１Ｈ－ＮＭＲ（Ｂｒｕｃｋｅｒからの４００ＭＨｚの装置、溶媒：Ｄ_２Ｏ）にて、参考文献に記載されている方法に従い、加水分解可能な基全体に対する加水分解された基の定量に基づき求められる。

Ｑ．Ｗｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｖｉｎｃｅｌｌｉ，Ｒ．Ｐｅｌｔｏｎ，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ ｙｉｅｌｄｓ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．３６９（２０１２）２２３－２３０。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第１ポリマーは、架橋度が５～２５％になるように架橋されている。上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、架橋度は６～１５％、好ましくは７～１２％、より好ましくは８～９％である。

本明細書における「架橋度」は、架橋剤／ポリマーの比として定義される（「架橋剤比」とも称する）。「架橋剤比」は、反応に使用されるポリマー溶液中に存在するビニルアミン構造単位（平均分子量に基づく）に対する架橋剤のモル数の百分率として定義される。

即ち、架橋剤比は、次式（１）に従い求められる：

（式中、Ｖ１（ｍｌ）は架橋剤の体積、ｄ１（ｇ／ｍｌ）は架橋剤の密度、Ｃ１（ｗｔ％）は架橋剤の濃度、Ｗ２（ｇ）はポリマー溶液の重量、Ｃ２（ｗｔ％）はポリマーの濃
度、Ｍｗ１（ｇ／ｍｏｌ）は架橋剤の分子量、Ｍｗ２（ｇ／ｍｏｌ）はモノマー単位の平均分子量である）。

Ｍｗ２は次式（２）に従い求められる：

（式中、Ｎｋは、ポリマーを構成するタイプｋのモノマー単位の個数であり、Ｍｋは、タイプｋのモノマー単位の分子量（ｇ／ｍｏｌ）である）。

第２ポリマーは、いかなる形でも制限を受けないが、好ましくは、ヒドロキシル（－ＯＨ）、チオール（－ＳＨ）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、スルホニル（－ＳＯ_３Ｈ）、アミノ又はこれらの組合せから選択される官能基を含む。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーはヒドロキシル基を含み、より好ましくは、第２ポリマーは、ポリ（ビニルアルコール）、アガロース又はセルロースである。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーは、カルボキシル基を含み、より好ましくは、第２ポリマーは、ポリ（メタ）アクリレートである。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーはアミノ基を含み、好ましくはポリアミンである。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリアミンは１級及び／又は２級アミノ基を含む。

上述又は後述の実施形態と組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーは、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリブチルアミン、ポリリジン及びこれらのコポリマーから選択されるポリアミンである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーは、ポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。ポリビニルアミン及びポリアリルアミンには、ビニルアミン又はアリルアミンの直鎖又は分岐ホモポリマー及びビニルアミン又はアリルアミンとアミノ基又はアミド基とのコポリマーが含まれる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマーは、ビニルホルムアミド単位を、ポリマーの構造単位の総数を基準として、１％～７０％、より好ましくは、ビニルホルムアミド単位を２％～４０％、最も好ましくは、ビニルホルムアミド単位を５％～２５％含む。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ポリアリルアミン（ｐｏｌｙａｌｌｙａｍｉｎｅ）は、アリルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はアリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーである。好ましくは、アリルアミンとアリルホルムアミドとのコポリマーは、ポリマーの構造単位の総数を基準として、アリルホルムアミド単位を１％～７０％、より好ましくは、アリルホルムアミド単位を２％～４０％、最も好ましくは、アリルホルムアミド単位を５％～２５％含む。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、少なくとも１５，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００～１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは２５，０００～５００，０００Ｄａ、更に好ましくは３０，０００～３００，０００、一層好ましくは５０，０００～３００，０００Ｄａ、最も好ましくは８０，０００～２５０，０００Ｄａである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーは、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも５０％、好ましくは６０％～９９％、より好ましくは６６％～９４％、一層好ましくは６８％～９０％、最も好ましくは７０％～８６％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第２ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１５，０００～８０，０００、好ましくは２０，０００～７０，０００、より好ましくは２５，０００～５０，０００であり、加水分解度が６６％～９９％、好ましくは６７％～９０％、一層好ましくは６８％～８０％、最も好ましくは６８％～７５％であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第２ポリマーは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１００，０００～５００，０００、好ましくは１５０，０００～４００，０００、より好ましくは２００，０００～３００，０００であり、加水分解度が７０％～９９％、好ましくは７５％～９５％、より好ましくは７５％～９０％である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマーは第２ポリマーと等しい重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマー（即ち、架橋前）は、第２ポリマーと同一である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた他の好ましい実施形態において、第２ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は第１ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）よりも大きい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第１ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０，０００～１００，０００、好ましくは１５，０００～５０，０００、より好ましくは２０，０００～３０，０００であり、第２ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１００，０００～５００，０００、好ましくは１５０，０００～３００，０００、より好ましくは２００，０００～２５０，０００である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第１ポリマー及び第２ポリマーの総濃度は、乾燥した複合材料の総重量を基準として、少なくとも３％ｗ／ｗ、好ましくは少なくとも５％ｗ／ｗ、より好ましくは、少なくとも７％ｗ／ｗ、且つ好ましくは２５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは２０％ｗ／ｗ未満、最も好ましくは１５％未満である。

本発明の複合材料は未架橋ポリマーの追加の層を含むことができ、前記未架橋ポリマーは、架橋ポリマーを充填した多孔性支持体、及び／又は第２未架橋ポリマーに共有結合している。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、複合材料は、第２ポリマーと同一であっても異なっていてもよい未架橋ポリマーの、１～３の追加の層を含む。前記未架橋ポリマーの追加の層は、互いに、且つ架橋ポリマーが充填された多孔性支持体、及び／又は第２ポリマーに、共有結合しているべきである。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた他の好ましい実施形態において、複合材料は、未架橋ポリマーの追加の層を含まない（即ち、複合材料に存在するポリマーは第１ポリマー及び第２ポリマーのみである）。

複合材料の製造方法
本発明の複合材料は、以下の方法に従い製造することができる:
ａ）平均孔径が５～５００ｎｍである多孔性支持体を、第１ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸し；
ｂ）第１ポリマーを２５０℃未満の温度で架橋剤を用いて架橋し；
ｃ）工程ｂ）で得られた複合材料の外面に第２ポリマーを共有結合させる。

本発明には、少なくとも２個の反応性基を有する任意の架橋剤を使用することができる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、架橋剤は、ビスエポキシド、ジアルデヒド及びジグリシジルエーテルから選択される。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせたより好ましい実施形態において、架橋剤は、プロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択される。より好ましくは、架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル及びヘキサンジオールジグリシジルエーテルから選択される。

第１ポリマーが架橋性基を含まない場合、上述の方法の工程ａ）の前に、第１ポリマーを、当該技術分野において知られている任意の方法により、架橋性基で官能化させる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、架橋剤比は、６～１５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、より好ましくは７～１２％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、最も好ましくは８～９％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

上述の方法の工程ｂ）の条件下において、架橋剤及びポリマーと反応しないか、又はゆっくりとしか反応しないのであれば、ポリマー及び架橋剤を溶解又は分散することができる任意の溶媒又は媒体を使用することができる。この文脈における、ゆっくり、とは、工程ｂ）を行う間、架橋剤と溶媒との間、及びポリマーと溶媒との間に観測可能な反応が起こらないことを意味する。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、溶媒は、極性プロトン性溶媒又は極性非プロトン性溶媒である。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、溶媒は、水、Ｃ_１～_６アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びブタノール）及びその混合物から選択される極性プロトン性溶媒である。水が最も好ましい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ａ）で使用されるポリマー及び架橋剤の溶液のｐＨは、８～１３、好ましくは９～１１、最も好ましくは１０～１１に調整される。ｐＨの調整は、ＮａＯＨやＫＯＨ等の強塩基を添
加することにより行うことができる。

上述の方法の工程ｂ）を行う際の温度は、好ましくは２０～１８０℃、より好ましくは４０～１００℃、最も好ましくは５０℃～８０℃である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ｂ）を行う時間は、好ましくは１時間～１００時間、より好ましくは８～６０時間、最も好ましくは１８時間～４８時間である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、工程ｂ）は、４０～１００℃で８～６０時間、好ましくは５０～８０℃で１２～５０時間、より好ましくは６０℃で２４～４８時間実施される。

工程ｂ）で得られる複合材料の外面への第２ポリマーの共有結合は、当該技術分野において知られている任意の手段で達成することができる。工程ｂ）で得られる複合材料の外面上で起こる反応は、重合又は任意のｇｒａｆｔｉｎｇ－ｆｒｏｍ法及び任意のｇｒａｆｔｉｎｇ－ｔｏ法を含み得る。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、第２ポリマーは、好適な溶媒又は媒体に溶解されている。上述の方法の工程ｃ）の条件下において、ポリマーと反応しないか又はゆっくりとしか反応しないのであれば、第２ポリマーを溶解することができる任意の溶媒を使用することができる。この文脈において、ゆっくり、とは、工程ｃ）を行う間、第２ポリマーと溶媒との間に観測可能な反応が起こらないことを意味する。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーの溶媒は、極性プロトン性溶媒又は極性非プロトン性溶媒である。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、第２ポリマーの溶媒は、水、Ｃ_１～_６アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びブタノール）及びこれらの混合物から選択される極性プロトン性溶媒である。水が最も好ましい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ｃ）で使用することができる第２ポリマー含有溶液のｐＨは、８～１３、好ましくは９～１１、最も好ましくは１０～１１に調整される。ｐＨの調整は、ＮａＯＨやＫＯＨ等の強塩基を添加することにより行うことができる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、工程ｂ）で得られる複合材料の外面への第２ポリマーの共有結合は、工程ｂ）で得られる複合材料の外面上に依然として存在する架橋剤を介して達成される。

本明細書における「未架橋ポリマー」という語は、ポリマーに架橋剤を添加して架橋を活性化させていないポリマーを指す。したがって、第２ポリマーを溶媒中に溶解する実施形態に関しては、前記溶媒は架橋剤を含まない。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、本方法は、工程ｃ）の後に、架橋剤の未反応の架橋性基を加水分解する工程ｄ）を更に含む。

複合材料の使用
本明細書において、「供給原料（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）」及び「供給物（ｆｅｅｄ）」という語は互換的に使用される。

本明細書における「タンパク質」という語は、ポリペプチドを包含する。この種のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、より好ましくは４０～８０個のアミノ酸残基を含む。

本発明の複合材料は、供給原料中の目的タンパク質の精製に有用である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料は、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡ、並びに任意にＲＮＡ及び他の核酸を含む。

本発明における供給原料は、任意に、アルブミン、エンドトキシン、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）及び微生物又はそれらの断片が含まれる。

本発明はまた、供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
ｉ）供給原料を本発明による複合材料と十分な時間接触させる工程；
ｉｉ）精製された供給原料から複合材料を分離する工程；
ｉｉｉ）任意に、精製された目的タンパク質を供給原料から単離する工程；及び
ｉｖ）任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程を含む、方法を提供する。上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、目的タンパク質は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇＧ））等の組換えタンパク質である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料の溶媒は、任意に、緩衝剤、塩及び／又は調整剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含む水である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料は、目的タンパク質及びＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸並びに不純物としての宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を含む発酵ブロスの上清（濾過の前又は後）又は細胞培養液の上清（ＣＣＳ）である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、複合材料は、バッチ吸着法で使用される。この実施形態における本発明の精製方法の工程ｉ）において、複合材料を供給原料中に分散させ、工程ｉｉ）において、複合材料を供給原料から分離する（例えば、遠心分離による）。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた他の好ましい実施形態において、複合材料はクロマトグラフィーカラムに充填される。

本発明の目的タンパク質の回収方法においては、供給原料を本発明による複合材料と十分な時間接触させる。後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、接触時間は１分間～１０時間、好ましくは３分間～５時間、より好ましくは５分間～１時間である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態においては、複合材料を供給原料と接触させる前に、複合材料を、ｐＨが８未満、好ましくは３～７．５、より好ましくは４～７、最も好ましくは５～６の水溶液中で平衡化させる。水溶液のｐＨ
は任意の好適な緩衝剤により調整することができる。例えば、一塩基酸又はその塩をｐＨの調整に使用することができる。好ましい一塩基酸は、ギ酸、酢酸、スルファミン酸、塩酸、過塩素酸及びグリシンである。一塩基酸の好ましい塩は、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ナトリウム及びカリウム塩である。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、ｐＨは酢酸アンモニウムを用いて調整される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた更なる好ましい実施形態において、ｐＨはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調整される。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、供給原料対複合材料（供給物の体積対乾燥複合材料の重量）の比は、２：１～１００：１、好ましくは５：１～８０：１、より好ましくは１０：１～７０：１、最も好ましくは２０：１～５０：１の範囲にある。供給原料対複合材料の比が高い方が、複合材料を効率的に利用するという意味で好ましい。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、上述の方法の工程ｉｉ）で分離される、吸着された不純物を含む複合材料を、前記不純物を溶出するための溶出手順に付し、それにより、複合材料を更に使用するために再生する。

本発明の目的タンパク質の精製方法は、当該技術分野において知られている更なる精製工程を含むことができる。この種の精製工程の例には、イオン交換クロマトグラフィー、凝集剤又は沈殿剤の添加、遠心分離、結晶化、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ又はこれらの組合せを収容している分離媒体を用いる）、膜濾過、深層濾過（珪藻土又は活性炭を用いる）及びモノリシックな分離剤（ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）の適用が含まれる。

上述又は後述の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態において、本発明の目的タンパク質を分離するための方法の工程ｉ）及びｉｉ）は、本発明による同一又は異なる複合材料を用いて連続して複数回（例えば、２、３、４、５、６回）繰り返す。

次に示す実施例により本発明を説明する。

実施例に使用する出発物質
次に示す出発物質を実施例の複合材料の調製に使用した：
ポリマー：
Ａ１ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０（ＢＡＳＦから供給）（ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマー）
Ａ２ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度６８％まで更に加水分解したもの
Ａ３ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度８６％まで更に加水分解したもの
Ａ４ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５７０を加水分解度９９％まで更に加水分解したもの
Ａ５ Ｌｕｐａｍｉｎ ９０９５（ＢＡＳＦから供給）（ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマー）
Ａ６ Ｌｕｐａｍｉｎ ９０９５を加水分解度９９％まで更に加水分解したもの
Ａ７ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５００（ＢＡＳＦから供給）（ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマー）
Ａ８ Ｌｕｐａｍｉｎ ４５００を加水分解度２３％まで更に水分解したもの
Ａ９ Ｌｕｐａｍｉｎ ９０３０（ＢＡＳＦから供給）（ビニルアミン及びビニルホルム
アミドのコポリマー）
Ａ１０ ポリ（アリルアミン塩酸塩）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから供給）
ポリマーＡ２～Ａ４及びＡ６及びＡ８は、ポリマーＡ１、Ａ５及びＡ７を次に示すように更に加水分解することにより得たものである。

ポリマーＡ１又はＡ５又はＡ７を回転台上で穏やかに撹拌することにより均質化した。この均質化したポリマーを丸底フラスコに秤り取り、水酸化ナトリウム水溶液を加えて８０℃で数時間、Ｎ_２気流で保護しながら加熱した。次いで混合物を室温に冷却し（２３℃）、塩酸溶液を用いてｐＨを調整した。正確な条件を表１に列挙する。

ポリマーＡ１～Ａ１０の特性を次の表２に示す。

１）加水分解度
ポリマーＡ１～Ａ９のホルムアミド基の加水分解度を次に示すように^１Ｈ－ＮＭＲを用いて測定した。

ＮＭＲ分析用のポリマー試料を次に示す一般手順により調製した：
市販のポリマー又は更に加水分解したポリマー５．２５ｇをフラスコに秤り取り、水１０ｍＬを加えた。混合物を回転させて均質な組成物を得、そして５０℃の真空下で蒸発させ、乾燥固体を得た。固体を８０℃のオーブンを用いて高真空下で（≦０．１ｍｂａｒ）１５時間乾燥させることにより、乾燥した残渣を得た。

^１Ｈ－ＮＭＲによるホルムアミド基に対する遊離アミン基の定量に基づき、参考文献に記載されている方法に従い加水分解度を決定した：
Ｑ．Ｗｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｖｉｎｃｅｌｌｉ，Ｒ．Ｐｅｌｔｏｎ，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ ｙｉｅｌｄｓ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．３６９（２０１２）２２３－２３０。

測定に使用した^１Ｈ－ＮＭＲシステムは４００ＭＨｚとした。乾燥サンプルをＤ_２Ｏに溶解した。

２）ポリマー濃度
ポリマーＡ１～Ａ１０のポリマー濃度を元素分析に基づき決定した。試料を^１Ｈ－ＮＭＲの項に記載した手順と同じ手順で調製し、乾燥残渣が得られるまで実施した。元素分析装置はＦＬＡＳＨ ２０００ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とした。

３）ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及び固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）
ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及び固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）を次に示すように求めた。

多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ－ＲＩ）を使用し、重量平均分子量（Ｍｗ）を、Ｚｉｍｍ形式によるレイリー・ガンズ・デバイ（Ｒａｙｌｅｉｇｈ－Ｇａｎｓ－Ｄｅｂｙｅ）の式を用いて決定した。

この手法においては、光散乱シグナルが、クロマトグラムの任意の点における平均分子量及び試料濃度並びに固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）に比例すると仮定する。したがって、濃度検出器としての屈折率検出器を連結した光散乱検出器は、クロマトグラムの任意の点の平均分子量を正確に求めることができ、ｄｎ／ｄｃの値が得られた場合、クロマトグラフィーの分布全体の分析を用いて重量平均分子量（Ｍｗ）を決定することができる。

レイリー・ガンズ・デバイの式（式（１））において、光散乱シグナルは、クロマトグラムの任意の点における平均分子量及び試料濃度並びに固有の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）に比例する。

Ｒ（θ）＝Ｋ^＊ＭＣＰ（θ）［１－２Ａ_２ＭＣＰ（θ）］ （１）

式（１）中、Ｒ（θ）は、過剰（溶質単独に対する）レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）比（即ち、散乱体積及び散乱体積からの距離に関し補正された、散乱光及び入射光強度の比）、Ｍはモル質量（分子量）、Ｃは分析物の濃度、Ｋ^＊は式（２）に従い定められるレイリー比の定数であり：

Ｋ^＊＝（４π^２（ｎ_０）^２／Ｎ_Ａ（λ_０）^４）（ｄｎ／ｄｃ） （２）

式（２）中、ｎ_０は溶媒の屈折率、Ｎ_Ａはアボガドロ数、λ_０は入射光の真空波長、ｄｎ／ｄｃは固有の屈折率増分、Ｐ（θ）は形状因子又は散乱関数であり、粒子の平均二乗半径（ｒ_ｇ）に対する散乱強度の角度変化に関連し、Ａ_２は、溶質と溶媒の相互作用の目安である、第２ビリアル係数である。

この解析から、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）及びピーク分子量（Ｍｐ）を求めることができる。

測定装置：
ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ ２０Ａシステム、Ｗｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＲＩ検出器及びＷｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ－ＩＩ ＭＡＬＳ検出器から構成されるものとした。

分子量（Ｍｗ及びＭｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ＷｙａｔｔからのＡｓｔｒａ（バージョン：５．３．４．２０）ソフトウェアを用いて算出した。

ポリマーのＳＥＣ分析を行うために、プレカラムＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷｘＬ（１３μｍ、７．８ｍｍＩ．Ｄ×３０ｃｍ）を取り付けたＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷｘＬ（７μｍ、７．８ｍｍＩ．Ｄ×３０ｃｍ）を使用した。

分析条件：
移動相：０．４５Ｍ 硝酸ナトリウム水溶液＋０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：
ＭＡＬＳの直線偏光レーザーの波長：６５８ｎｍ
ＲＩ
温度：２５℃
注入量：５０μＬ
試料の希釈：ポリマー１０ｍｇ（表２に示した濃度）を移動相１．５ｍＬで希釈
運転時間：５８ｍｉｎ

多孔性支持体：
Ｂ１ シリカゲルＤａｖｉｓｉｌ ＬＣ ２５０、４０～６３μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）
Ｂ２ シリカゲルＸＷＰ５００Ａ、３５～７５μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）
Ｂ３ シリカゲルＸＷＰ１０００Ａ、３５～７５μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅから供給）

多孔性支持体Ｂ１～Ｂ３の特性を次の表３に示す。

多孔性支持体の孔径は、ＤＩＮ ６６１３３に準拠し、水銀圧入により求めた。

多孔性支持体の粒度分布はＭａｌｖｅｒｎ Ｌａｓｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎにより求めた。

架橋剤：
１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ；Ｉｐｏｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから供給されているｉｐｏｘ ＲＤ１８）
１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＧＥ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから供給、及びＩｐｏｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから供給されているｉｐｏｘ ＲＤ３）

実施例１：
工程１
ポリマーＡ２の水溶液（ポリマーＡ２の１１％溶液）１５ｍＬを、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ）の溶液（７０４μＬ）と混合することにより、
架橋剤が７～９％になるようにした。架橋剤比は、反応に使用したポリマー溶液中に存在するビニルアミン単位に対する反応性基の量を考慮して算出した。混合後、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを１１に調整した。

乾燥粉末状の多孔性支持体Ｂ１を１０ｇ、底が平らな直径８ｃｍのステンレス鋼製の皿に敷いた。ポリマー－架橋剤溶液３９．５ｇを、多孔性支持体全体に均しく行き渡るように滴下し、スパチュラを用いてかき混ぜた。得られたペーストを、表面が滑らかな均質なまとまりになるように、旋回シェーカーにて６００ｒｐｍで１分間振盪した。皿にステンレス鋼の蓋を被せた後、ペーストを更に混ぜたり動かしたりすることなく、６０℃のオーブンで２４時間加熱し、湿った複合体を得た。

工程２
０．５Ｍ ＮａＯＨ１．３ｍＬをポリマーＡ５の水溶液（ポリマーＡ５の７％溶液）６．３ｇに加えた。混合後、溶液に水１７ｍＬを加え、次の合成工程に使用するポリマーＡ５溶液を構成した。

工程１で調製した湿った複合体を２９ｇ分取し、フリット上において水２５ｍＬで４回洗浄した。次いでこの複合体のケークを、三角フラスコ内でポリマーＡ５溶液２２ｍＬ中に懸濁させ、６０℃で２４時間振盪した。

次いで、湿潤したペーストをフリット上において水２５ｍＬで３回洗浄した。次いで、未反応のエポキシ基を停止（加水分解）するために、複合体のケークを１０％硫酸２０ｍＬ中に懸濁させ、振盪恒温槽（ｓｈａｋｅｒ ｂａｔｈ）において２時間周囲温度（２３℃）で処理した。そして、生成物をフリット上において再び水２５ｍＬで６回洗浄した後、２０％エタノール水中で保管した。

実施例２～１０：
実施例２～１０を、出発物質及び架橋剤比を表４に列挙した通りにしたことを除いて、実施例１と同様にして調製した。

工程１のポリマーの量は、充填されるシリカの孔容積が全て同一である訳ではないことを考慮に入れながら、多孔性支持体の孔径及び表面積を考慮して調整した。ここに提示した実施例に関しては、工程２で湿った複合体に添加する第２ポリマーの量（ポリマー対シリカ重量の比）を一定に維持した。

架橋ポリマーを充填した多孔性支持体から形成された複合体の外面に第２ポリマーを共有結合させることの利点を実証するために、架橋ポリマーが充填された多孔性支持体から構成される複合体を次に示すように調製した。

比較例１：
ポリマーＡ１の水溶液１５ｍＬ（ポリマーＡ１の１５％溶液）を１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＧＥ）の溶液（７０４μＬ）と混合して、架橋剤が７～９％となるようにした。架橋剤比を、反応に使用するポリマー溶液中に存在するビニルアミン単位（モノマー）に対する反応性基の量を考慮して算出した。混合後、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを１１に調整した。

乾燥粉末状の多孔性支持体Ｂ１を１０ｇ、底が平らな直径８ｃｍのステンレス鋼製の皿に敷いた。ポリマー－架橋剤溶液３９．５ｇを多孔性支持体上に均しく行き渡るように滴下して多孔性支持体Ｂ１に含浸させ、スパチュラで混ぜた。得られたペーストを、表面が滑らかな均質なまとまりとなるように、旋回シェーカーで６００ｒｐｍ１分間振盪した。皿にステンレス鋼の蓋を被せた後、ペーストを更に混ぜたり動かしたりせずに６０℃のオーブンで４８時間加熱して、湿った複合体４９．６ｇを得た。

次いでこの湿った複合体４１．３ｇをフリット上において水２５ｍＬで５回洗浄した。次いで、未反応のエポキシ基を停止するために、この複合体のケークを１０％硫酸３１．６ｍＬ中に懸濁させ、振盪恒温槽において２時間周囲温度（２３℃）で処理した。そして、生成物をフリット上において再び水２５ｍＬで５回洗浄した後、２０％エタノール水中で保管した。

比較例２～７：
比較例２～７を、表５に列挙する出発物質を使用したことを除いて比較例１と同様にして調製した。

実施例の複合材料の除去性能及びｈＩｇＧ回収率の測定
複合材料の精製能力を測定するために、目的物質から不純物又は望ましくない化合物が除去（分離）された度合いを測定する。この目的のために、供給物中の個々の成分の濃度を、選択的測定（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｓｓａｙ）を用いて決定する。精製工程の後、精製された画分に対し濃度測定を繰り返す。このようにして、これらの濃度及び対応する体積から、純度及び回収率の両方を算出することが可能である。

供給物
未処理且つ未希釈の細胞培養液上清ＣＨＯ Ｋ１に、ヒト血漿由来ｈＩｇＧ（Ｏｃｔａｇａｍ、１０％溶液、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｖｉｅｎｎａ）を２ｍｇ／ｍＬスパイクしたものを供給物とした。

細胞培養液上清（ＣＣＳ）
ＣＣＳ１
ＣＨＯ－Ｋ１（Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ）
細胞株：ＣＨＯ－Ｋ１（２．５×１０^６生細胞／ｍＬ）
電気伝導度：１５ｍＳ／ｃｍ
平均宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）濃度：１００～１５０μｇ／ｍＬ
平均ＤＮＡ濃度：７００～１，０００ｎｇ／ｍＬ
ＣＣＳ２
ＣＨＯ－Ｋ１（Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ）
細胞株：ＣＨＯ－Ｋ１
電気伝導度：１３ｍＳ／ｃｍ
平均宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）濃度：６５～８２μｇ／ｍＬ
平均ＤＮＡ濃度：２５０～５００ｎｇ／ｍＬ
ＣＣＳ３
ＣＨＯ－Ｋ１（Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ）
細胞株：ＣＨＯ－Ｋ１
電気伝導度：１３ｍＳ／ｃｍ
平均宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）濃度：１５０～２００μｇ／ｍＬ
平均ＤＮＡ濃度：５００～１，１００ｎｇ／ｍＬ

吸着材は全て供給物と接触させる前に５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いてｐＨ６．５で平衡化させた。

吸着材２０ｍｇをエッペンドルフ管又は遠心管を用いて供給物１ｍＬと一緒にインキュベートした。供給物の体積対吸着材重量の比を５０：１（供給物１ｍＬ：吸着材０．０２ｇ）とした。５分間穏やかに振盪した後、続いて分析を行うため上清を遠心分離した。特段の指定がない限り、接触時間は５分間とした。

宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡの除去効率並びにｈＩｇＧの回収効率を求めるために、複合材料と規定の時間接触させた後、上に示した３種の物質の定量を、未精製供給物及び除去処理後の供給物において実施した。次いで両方の値を比較した。

宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）測定
宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の除去効率を求めるためにＣｙｇｎｕｓ ＣＨＯ ＨＣＰ Ｅｌｉｓａ Ｋｉｔ ３Ｇを使用した。Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ（ＵＳＡ）のＣｙｇｎｕｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３^ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（＃Ｆ５５０）を製造業者の指示（取扱説明書“８００－Ｆ５５０，Ｒｅｖ．３，２１ＪＵＬ２０１５”）に従い使用し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）からのＶｉｃｔｏｒＸ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び対応するソフトウェアを読取り及びデータ評価に使用した。試料をサンプル希釈液で希釈した（製品カタログ番号＃Ｉ０２８、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）。

ＨＣＰ除去率を次に示すように表す：
ＨＣＰ除去率（％）＝１００×（上清中のＨＣＰ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のＨＣＰ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

ＤＮＡ測定
分析試料は初期ＣＣＳ（スパイクｈＩｇＧ含有又は非含有）及び除去処理後の試料とした。

ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃Ｄ１００Ｔ），Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ（ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従いＤＮＡを抽出した後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（＃Ｐ７５８９），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＤＮＡ特異的蛍光アッセイ（ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）によりＤＮＡの定量を行った。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）からのＶｉｃｔｏｒＸ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ及び対応するソフトウェアを読取り及びデータ評価に使用した。

ＤＮＡ除去率を次に示すように表す：
ＤＮＡ除去率（％）＝１００×（上清中のＤＮＡ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のＤＮＡ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるｈＩｇＧ回収率測定
ｈＩｇＧ回収率を次に示すように定量ＳＥＣによって求めた。

供給物中のｈＩｇＧ濃度及び精製後の溶液中のｈＩｇＧ回収率を次に示す条件でＳＥＣを用いて求めた。

カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＣＣからのＴＳＫｇｅｌ ＵＰ ＳＷ３０００ ４．６ × ３００ｍｍ（粒子径２μｍ）
移動相：１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）＋１００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４＋０．０５％ ＮａＮ_３
注入量：１０μＬ（試料を移動相で希釈）
流速：０．３５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＤＡＤ ２８０ｎｍ
温度：２５℃

この高効率カラム及びそれに付随する分析条件により、単量体及び二量体ピークを適切に定量することが可能になる。

ｈＩｇＧ回収率を次に示すように表す：
回収率（％）＝１００×（上清中のｈＩｇＧ濃度）／（初期スパイク時のＣＣＳ中のｈＩｇＧ濃度）
上式における「上清」は精製後のＣＣＳを指す。

結果を表６に示す。

供給物：複合体比が５０：１である実施例１～８及び１０のｈＩｇＧの回収率はほぼ定量的であった（≧９６％）。実施例９の回収率は９０％を僅かに下回っていた。

上述の測定を実施例１～６に関し、供給原料：複合体比を５：１として繰り返した。

実施例１～６の複合体は供給原料：複合体比を５：１とした場合、９５％を超えるＤＮＡ及びＨＣＰを供給原料から除去した。

特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ｈＩｇＧの大部分は粒子から排除されたままであり、より小さいタンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡは粒子内及び粒子周囲に吸着されたままになると考えられる。

表６から分かるように、実施例１及び比較例２の除去性能は同程度である。ところが、実施例２（平均孔径が５００Åである多孔性支持体を含む）は、比較例３（平均孔径が５００Åである多孔性支持体を含むが、第２ポリマーを含まない）よりも性能が大幅に優れている。同様に、実施例４及び６～８は、比較例５（第２ポリマーを含まない）よりも性能が大幅に優れており、実施例９及び１０は、それぞれ、比較例６及び７よりも大幅に優れている。第２ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）が第１ポリマーよりも大きい実施例２、３、７及び９は特にＤＮＡ及びＨＣＰ除去性能が高い。

Claims (15)

1. 平均孔径が５～５００ｎｍである多孔性支持体であって、架橋された第１ポリマーが充填されている多孔性支持体と、
   前記架橋されたポリマーが充填された多孔性支持体の外面に共有結合している未架橋の第２ポリマーと、
   を含む複合材料であって、
   前記第１ポリマーがポリビニルアミン及びポリアリルアミンから選択され；並びに
   前記第２ポリマーがポリビニルアミン及びポリアリルアミンから選択される、複合材料。
2. 前記ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミンとビニルホルムアミドとのコポリマーである、請求項１に記載の複合材料。
3. 前記ポリビニルアミン又はポリアリルアミンは、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも５０％である、請求項１又は２に記載の複合材料。
4. 前記多孔性支持体は、平均粒子径が１～５００μｍである粒子状材料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合材料。
5. 前記第２ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、前記第１ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）よりも大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合材料。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の複合材料の製造方法であって、
   ａ）平均孔径が５～５００ｎｍである多孔性支持体を、第１ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程；
   ｂ）前記第１ポリマーを２５０℃未満の温度で架橋剤により架橋する工程；及び
   ｃ）工程ｂ）で得られた前記複合材料の外面に第２ポリマーを共有結合させる工程
   を含む、方法。
7. 前記第１ポリマーは重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００～５００，０００Ｄａであり、及び／又は前記第２ポリマーは重量平均分子量（Ｍｗ）が少なくとも１５，０００Ｄａ
   である、請求項６に記載の方法。
8. 前記架橋剤は、プロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択される、請求項６又は７に記載の方法。
9. 供給原料中の目的タンパク質を精製するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の複合材料の使用。
10. 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項９に記載の使用。
11. 供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって：
    ｉ）前記供給原料を請求項１～５のいずれか一項に記載の複合材料と十分な時間接触させる工程；及び
    ｉｉ）精製された供給原料から前記複合材料を分離する工程
    を含む、方法。
12. 精製された前記目的タンパク質を前記供給原料から単離する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記接触の時間が少なくとも１分間である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。