KR101354476B1 - 크로마토그래피 매질 성능을 향상시키기 위한 그라프팅 방법 - Google Patents

크로마토그래피 매질 성능을 향상시키기 위한 그라프팅 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 분리에 사용되는 기재로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 방법을 개선시키는 것에 관한 것으로서, 이에 의해, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity), 개선된 정제 공정 조작 윈도우 및 수지 선택성을 갖는 기재를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.

Description

크로마토그래피 매질 성능을 향상시키기 위한 그라프팅 방법{GRAFTING METHOD TO IMPROVE CHROMATOGRAPHY MEDIA PERFORMANCE}
본 발명은 폴리머 리간드를 그라프팅(grafting)하는 개선된 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 분리에 사용되는 기재로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 방법을 개선시키는 것에 관한 것으로서, 이에 의해, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity), 개선된 정제 공정 조작 윈도우 및 수지 선택성을 갖는 기재를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.
생체(living organism)로부터 생성된 치료 단백질(therapeutic protein)은 현대의 건강 관리에서 점점 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 단백질들은 전통적인 약학에 있어서 질병 타겟에 대한 특이성과 효율성을 증가시키는 등, 많은 이점들을 제공한다. 포유류 면역 시스템은 다양한 단백질들을 사용하여 질병의 위협을 억제하고 제어한다. 유전공학 및 단백질 공학의 출현으로 많은 "설계된" 또는 재조합 단백질 치료법의 발전이 가능하게 되었다. 이러한 치료법들은 단일 단백질, 화학적 개질된 단백질, 단백질 절편 또는 단백질 컨쥬게이트에 기초한 것일 수 있다. 이러한 치료 단백질의 서브클래스 중 하나인 단일클론 항체(monoclonal antibody; MAb)는 건강 관리 및 진단에 광범위하게 적용되어 왔다. 크로마토 그래피 분리법은 이러한 생물약제학상 제조에 널리 사용되고 있다. 산업이 발전함에 따라서, 분리기술을 강화하기 위한 신규/선진 기술 및 방법들이 이행되어 생물치료의 생산자들이 보다 적은 비용으로 더 많은 환자들에게 이러한 약제를 제공할 수 있도록 하였다.
단백질을 정제하기 위해 사용되는 일반적인 크로마토그래피 방법에는, 친화성, 생체친화성(bioaffinity), 이온 교환, 역상(reversed phase), 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 크기 배제(size exclusion) 및 다른 것들과의 혼합 모드(상술한 카테고리의 조합)가 포함된다. 각 타입의 크로마토그래피 과정의 적용 및 효율은, 용질 분자와, 각각이 액체 이동상(mobile liquid phase)과 상호작용하는 크로마토그래피 시스템의 고정상(stationary phase)(크로마토그래피 매질) 간의 표면-표면 상호작용의 선택성에 의존한다. 다양한 고정상 크로마토그래피 지지체 물질이 상업적으로 이용가능하다.
불순물로부터 생성물의 성공적으로 분리하는 비결은 종종, 고정상, 베이스 매트릭스(base matrix) 및 리간드 특성(리간드 타입, 리간드 밀도, 공극 구조, 리간드 분포, 물질 조성), 및 이동상 또는 용액 특성(버퍼 타입, pH 및 전도성)의 올바른 조합에 의존된다. 베이스 매트릭스 및 리간드의 특정적인 설계에 의해, 단백질 결합 용량, 스루풋(throughput), 선택성, 베드 투과성(bed permeability) 및 화학적 안정성 등의 몇 가지 핵심적인 속성들로 특징될 수 있는 크로마토 그래피 매질을 얻게 된다. 정제 방법에는, 생성물에 우세하게 결합하는 것(결합 및 용출), 불순물에 우세하게 결합하는 것(플로-스루) 및 상술한 것들의 조합(소위, 약한 분할 및 기타) 등이 포함된다. 이러한 기술을 설계하는데 있어서는, 확실하게 분리될 수 있도록 앞서 언급된 크로마토그래피 매질 특성을 제어하여 정제된 단백질 생성물을 얻는 것이 매우 중요하다.
단백질 분리는 다양한 기재 또는 베이스 매트릭스에서 수행될 수 있다. 수지 또는 비드(bead) 구조를 위한 통상적인 물질에는, 다당류(아가로오스, 셀룰로오스), 합성 폴리머(폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴아미드) 및 세라믹, 예컨대, 실리카, 지르코니아 및 제어된 공극 글래스(controlled pore glass) 등이 포함된다. 이들 물질들은, 전형적으로 약 5μm를 초과하는 "대류 공극(convective pore)"보다 훨씬 작은 약 200Å 내지 3,000Å의 "확산 공극(diffusive pore)"을 통하여 단백질을 흡수한다.
또한, 막(membrane)과 모노리스(monolith) 물질이 일반적으로 크로마토그래피용으로, 특히 플로-스루 적용에 사용된다. 전형적인 막 조성물에는, 합성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론, 및 다당류, 예컨대, 셀룰로오스가 포함된다.
모노리스는 폴리스티렌, 다당류, 폴리메타크릴레이트 및 다수의 기타 합성 폴리머로부터 개발되어 왔다. 막과 모노리스 크로마토그래피는 이들 물질이, 막과 모노리스 물질의 투과성을 조절하는 동일한 "대류 공극"에서 단백질을 흡수한다는 점에서 비드와 다르다. 전형적인 막과 모노리스 대류 공극 크기는 약 0.6μm 내지 약 10μm이다. 이들 기재와 더불어 리간드 역시 다양한 개발 기술을 통하여 수행될 수 있다.
단백질 결합 용량을 개선하고 수지 선택성을 조정하기 위해 리간드 "텐터클(tentacle)" 또는 "익스텐더"를 사용하는 것은, 예컨대, 베이스 매트릭스로부터 확장시키는 그라프팅(grafting)에 의해 베이스 매트릭스에 커플링된 폴리머 사슬에 리간드를 위치시키는 것을 포함한다. 리간드 익스텐더는 전형적으로 보다 우수한 결합 용량을 제공하는데, 이는 타겟 분자의 결합이 폴리머 지지체 표면상 단백질의 단층(monolayer) 흡착을 초과하여, 익스텐더가 리간드의 이용을 증가시키기 때문이다.
그라프팅 폴리머 익스텐더를 위한 두 가지 표준 방법론은 단백질 분리 등을 위해 크로마토그래피에 사용되는 것과 같이 기재상에 표면 익스텐더를 생성하기 위해 개발되어 왔다: 1) 표면 라디칼을 통해 지지체로부터 모노머의 그라프팅("~로부터 그라프팅 모노머") 및 2) 미리 형성된 폴리머를 활성기를 통해 지지체로 그라프팅("~으로 그라프팅 폴리머").
라디칼 중합 반응을 사용하는 물질로부터 그라프팅 모노머는 잘 발전된 기술이다. 일반적으로, 반응을 표면 물질로부터, 또는 용액내 개시제로부터 개시한다.
표면으로부터 라디칼 중합의 개시는, 복사, 금속 산화 및 흡수된 개시 종 등의 반응 환경으로의 노출을 통해 표면에서 라디칼을 발생시켜 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 "~로부터 그라프팅 모노머" 접근법은 매우 통제된 용액 조건 및/또는 특별 장치를 요구하고, 이는 복잡한 실시와 시간 소비를 필요로 한다.
지지체에 폴리머를 그라프팅하기 위한 한가지 방법이 "Studies on Preparation of PGMA/Al2O3 and its Effect on Impact Strength of Epoxy Resin" (Ruixin Wang, et. al.,)[Journal of Applied Polymer Science, Vol.113, 41-48(2009)] 에 개시되어 있다. 상기 문헌에는 개질된 Al2O3를 제조하기 위해, 개시제로서 퍼옥사이드기를 사용하여 알루미나 표면상으로 폴리글리시딜-메타크릴레이트(PGMA)를 그라프팅하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법에 제1 단계는 Al2O3의 하이드록시기를 SOCl2로 염소화시키는 것을 포함한다. 그 후, 염소기를 t-부틸하이드로퍼옥사이드로 처리하여 고정된 퍼옥사이드 분자를 생성한다. 다음 단계에서, 공유 결합된 퍼옥기로 Al2O3 표면에서 GMA의 그라프트 중합을 개시한다. GMA/Al2O3 입자를 사용하여 에폭시 수지에 강도를 부여한다. 상기 문헌에는 이와 관련된 폴리머 기재와 적용에 관해서는 개시되어 있지 않다.
폴리머 리간드를 물질 표면에 첨가하는 것은 개선된 단백질 결합 용량 및 수지 선택성에서 원하는 퍼텐셜 변화를 제공하게 된다. 그러나, 단백질 분리가 더욱 요구됨에 따라, 새로운 기술 및 방법을 개발하여 신규한 폴리머 구조를 창출하는 것이 보다 중요하다. 따라서, 단백질 결합 용량 및 단백질 분리에 사용되는 폴리머 기재의 수지 선택성을 개선시키는 것이 바람직하다.
새로운 폴리머 기재에 대한 상기 필요성들에 대하여, 단백질 분리에 유용하고, 개선된 단백질 결합 용량 및 수지 선택성을 갖는, 폴리머 기재상으로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 새로운 방법이 개발되어 왔다.
본 발명에 따르면,
(i) 작용기를 포함하는 폴리머 기재를 제공하는 단계;
(ii) 상기 작용기에 자유 라디칼 리간드를 공유 결합시켜 표면 반응성기를 생성하는 단계; 및
(iii) 자유 라디칼에 의해 표면 반응성기를 비닐 모노머와 반응시켜 폴리머 리간드를 생성하는 단계를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 면으로서, 폴리머 기재상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하는 크로마토그래피용 흡착물질이 제공되고,
여기에서, 상기 폴리머 기재는 표면 반응성기를 생성하기 위해 자유 라디칼 리간드에 공유 결합하는 작용기를 포함하며,
또한, 상기 표면 반응성기는 자유 라디칼에 의해 비닐 모노머와 반응하여 폴리머 리간드를 생성한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 자유 라디칼을 쉽게 발생시키는 표면 반응성기로 라디칼 그라프팅하는 것을 포함하는, 폴리머 기재상으로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 신규한 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 폴리머 기재는, 폴리머 기재 표면의 작용기상으로 표면 반응성기를 공유 결합시켜 개질된다. 이러한 결합 후, 비닐 모노머와의 자유 라디칼 반응에 의해 폴리머 리간드를 생성한다. 이러한 구체예에는, t-부틸하이드로퍼옥사이드(tBHP) 또는 퍼아세트산으로 에폭사이드 함유 기재를 작용화(functionalization)하는 것과 이어서 (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(AMPTAC)로 퍼옥시 개질된 기재를 작용화하는 것이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에 교시된 모든 범위들은, 그 안에 속하는 모든 범위들도 포함하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, "1 내지 10"의 범위에는 1의 최소값과 10의 최대값 사이의(포함하는) 임의의 모든 범위, 즉, 1 이상의 최소값 또는 10 이하의 최대값을 갖는 임의의 모든 범위, 예를 들면, 5.5 내지 10이 포함된다.
본 발명을 더욱 상세하게 설명하기에 앞서, 많은 용어들을 정의할 것이다. 이러한 용어들의 사용은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며, 단지 본 발명을 용이하게 설명하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 용어의 단수형은 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
본원에서 사용될 수 있는 "폴리머 기재" 또는 "베이스 매트릭스" 또는 "기재"에는, 공유 결합된 자유 라디칼 개시제로 개질된 임의의 폴리머 물질이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 적절한 폴리머 기재의 구조에는, 막, 입자, 표면, 및 모노리스가 포함된다. 본원에서 사용될 수 있는 기재 또는 베이스 매트릭스의 적절한 물질에는, 다당류, 합성 폴리머, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 및 이들의 혼성 또는 조합이 포함된다.
본원에서 사용될 수 있는 "작용기"의 예에는, 분자와 반응하여 표면 반응성기를 생성할 수 있는 친전자성기, 예컨대, 에폭사이드, 알킬 할라이드, 활성화된 알코올, 활성화된 에스테르가 포함되나, 이에 한하지 않는다.
폴리머 기재상의 작용기는 자유 라디칼 리간드로 작용화되어, 작용화된 폴리머를 생성한다. 이러한 작용화된 폴리머는 기재상으로 다양한 폴리머 리간드를 공유 결합시키는데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "자유 라디칼 리간드"는 표면 반응성기를 생성하기 위해 작용기와 반응할 수 있는 임의의 그룹이다. 이라헌 자유 라디칼 리간드에는, 퍼옥사이드, 예컨대, t-부틸하이드록퍼옥사이드, 큐멘 하이드로퍼옥사이드; 퍼옥시아세테이트, 예컨대, 퍼아세트산, 클로로퍼벤조산; 퍼설페이트, 예컨대, 암모늄 퍼설페이트, 소듐 퍼설페이트, 포타슘 퍼옥소디설페이트, 아조, 기타 다른 것들이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에서 사용되는 "표면 반응성기"는 폴리머 기재상의 고정된 중합성기(polymerizable group)를 의미한다.
일부 구체예로서, 자유 라디칼은 가열이나 산화화원(redox) 반응에 의해 표면 반응성기로부터 발생된다.
본원에서 사용되는 "폴리머 리간드"는 폴리머 기재상에 공유 결합으로 고정된 폴리머를 의미한다.
본 발명의 폴리머 리간드는 폴리머 기재상으로 비닐 모노머를 자유 라디칼 중합시켜 생성된다. 본 발명에서 적절한 비닐 모노머의 예에는, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 메타크릴아미드 및 아크릴아미드 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 모노머에는, 아크릴산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, [3-(메타크릴로일아미노)프로필]트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아크릴아미도-글리콜산, 이타콘산 또는 에틸 비닐 케톤, 글리시딜 메타크릴레이트, N,N-디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, N-페닐아크릴아미드, 하이드록시에틸 아크릴아미드, 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에서 사용될 수 있는 폴리머 리간드의 예에는, 이온 교환기(ion exchange group), 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 친황성(thiophilic) 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 및 혼합 모드기(mixed mode group)(상술한 것들의 조합) 등을 포함하는 폴리머가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드에는, 강한 양이온 교환기, 예컨대, 설포프로필, 설폰산; 강한 음이온 교환기, 예컨대, 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환기, 예컨대, 카복시산; 약한 음이온 교환기, 예컨대, N,N-디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용기, 예컨대, 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성기, 예컨대, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L 및 다른 작용기로의 추가 변형이 가능한 비작용성 모노머 또는 매개(intermediary) 모노머(예: 친화성 리간드로 변형되는 글리시딜 메타크릴레이트), 및 이들의 혼합물 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
또한, 폴리머 리간드의 라이게이션(ligation) 중에 추가의 개시제(들)를 반응 혼합물에 첨가하는 것을 고려할 수 있다. 예를 들면, 퍼설페이트, 아조 및/또는 퍼옥사이드 개시제(들)를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.
본 화학의 일부 구체예로서, 폴리머 리간드의 라이게이션 중에 사슬 전달제를 첨가하는 것이 적절할 수 있다. 적절한 사슬 전달제에는, 예를 들면, 할로메탄, 디설파이드, 티올(머캅탄이라고도 함), 및 금속 복합체가 포함된다. 추가적으로 적절한 사슬 전달제에는 적어도 하나의 쉽게 앱스트랙트 할 수 있는(abstractable) 수소 원자를 갖는 다양한 기타 화합물들 및 이들의 혼합물들이 포함된다. 사슬 전달제를, 하나 이상의 첨가로, 또는 연속적으로, 선형으로(linearly) 또는 그렇지 않게, 전체 반응 시간의 대부분 또는 전부에 걸쳐 또는 반응 시간의 제한된 부분에만 첨가할 수 있다.
가교제, 가지화제(branching agent) 및 비작용성 모노머는, 폴리머 리간드의 형태학 또는 상호작용을 제어하기 위한 목적으로 폴리머 리간드에 결합될 수 있다. 그러나, 폴리머 리간드 상의 이러한 가교제 또는 가지화제는, 적절하게 5% 미만, 보다 바람직하게 1% 미만의 낮은 수준으로 존재한다. 적절한 가교제 또는 가지화제에는, 모노머, 예컨대, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디비닐 벤젠, 트리메틸프로필 트리메타크릴레이트 및 메틸렌 비스아크릴아미드 또는 다작용성 사슬 전달제가 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본 발명은 단백질 분리에 사용되는 기재로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 방법을 개선시키는 것에 관한 것으로서, 이에 의해, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity), 개선된 정제 공정 조작 윈도우 및 수지 선택성을 갖는 기재를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.
테스트 방법
BSA 용량의 측정
용액 1(50 mM 트리스/HCl, pH 8.8)의 제조
12.1 g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Fisher Scientific)을 2 L 용량 플라스크(volumetric flask)에 첨가하였다. 그 후, 0.01N HCl 용액(Fisher Scientific)을 적용하여 2 리터 마크까지 채웠다. 용량 플라스크를 캡핑(capping)한 후 내용물을 흔들었다. 용액을 5분간 방치하고, 용액의 부피를 다시 체크하였다. 추가의 HCl을 첨가하여 2 L 마크까지 부피를 조정하였다. 8.8±0.05에서 pH를 측정하였다. 용액에 라벨을 붙이고 4℃에서 냉장하였다.
용액 2의 제조:
2 mg/ml BSA(소혈청(bovine serum)으로부터의 알부민, Sigma-Aldrich) 용액
0.806 g의 BSA를 유리 쟈(glass jar)무게를 달고, 403 g의 용액 1에 첨가하였다. 내용물을 부드럽게 흔들어 용해시켰다. 0.5시간 동안 용액을 가라 앉혀 BSA 용해를 확실하게 하였다.
BSA 용량 흡수 과정
1 ml의 DI 수를 크로마토그래피 컬럼에 천천히 첨가하여 임의의 트랩핑된(trapped) 공기를 방지하였다. 실시예 3 또는 4의 슬러리 용액을 컴럼 안에 첨가하였다. 컬럼내 1 ml의 수지를 측정하였다. 용액이 수지 위로 1-2 cm가 될 때까지 온화한 진공을 컬럼에 적용하여 제거하였다. 수지의 수준이 1 ml 마크 미만으로 떨어졌을 때, 더 많은 수지 슬러리를 추가로 진공을 유지하면서 첨가하였다. 수지 비드를 절대 공기에 노출시키지 않았다. 패킹된 1 ml 수지를 약 10 ml의 DI 수로 헹구어 슬러리 용액을 교체하고, 패킹된 베드 위로 물의 수준이 1-2 cm가 될 때까지 액체를 부어 내었다. 그 후, 패킹된 1 ml 수지를 10 ml의 용액 1로 씻어내었다. 용액 1을 컬럼으로부터 진공으로 제거하고, 1분간 컬럼을 통해 공기를 빨아들였다. 웨트 케이크(wet cake)를 포함하는 1회용 컬럼을 매니폴드로부터 제거하였다.
컬럼으로부터의 웨트 케이크를 스파츌라(spatula)로 8 oz 유리 쟈로 옮기고, 200 mL의 용액 2(2 mg/mL BSA 용액)을 첨가하였다. 유리 쟈 내 샘플을 18시간 동안 부드럽게 흔들었다.
18시간 후, 쉐이커로부터 샘플을 제거하고, 수지를 15분간 가라앉혔다.
흡수 결합 용량(uptake binding capicity)의 측정:
18시간의 인큐베이션 후, 여과된 표면상의 BSA 용액의 278 nm UV 흡수로부터 BSA 결합 용량을 측정하였다. 용액 1로 채워진 큐벳을 사용하여 UV 분광기를 0으로 하였다. 278 nm에서 흡수를 모든 샘플, 표준 용액, 및 대조 샘플(Q Sepharos™ Fast Flow Ion Exchange Resin, GE Healthcare)에 대하여 측정하였다.
BSA 결합 용량의 계산:
샘플 및 대조군에 대한 풀린(unbound) BSA의 값을 기록하였다(Q Sepharose FF). 다음 식을 적용하여 결합 용량을 측정하였다:
식 1
BSA 용량 = [400-(샘플 mg/mL × 200)] × 1 mL = BSA의 mg/수지의 mL
실시예
실시예 1: t-부틸하이드로퍼옥사이드(tBHP)에 의한 에폭사이드 함유 비드의 작용화. 모든 물질들은 공급자로부터 얻은 것을 사용함.
웨트 케이크로서 15 g의 에폭사이드 함유 비드(미국 특허 공보 US 2007-0066761 A1의 실시예 25에 개시된 것과 유사한 방법으로 제조된, 60μm 폴리GMA-GlyDMA 비드 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 및 글리세롤-1,3-디메타크릴레이트(GlyDMA))를 기계 교반기가 장착된 3-목(three neck) 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 후, 18 mL의 물을 첨가하여 슬러리를 형성하였다. t-부틸하이드로퍼옥사이드(tBHP, Sigma-Aldrich) 및 트리에틸아민(Et3N)(Sigma-Aldrich)을 슬러리에 첨가하고, 반응 혼합물을 N2 분위기하에 실온에서 밤새도록 교반하였다. 비드를 여과해내고, 물로 헹구었다. 생성된 물질을 수중의 슬러리로 저장하였다.
실시예 2: 퍼아세트산에 의한 에폭사이드 함유 비드의 작용화
실시예 1의 에폭사이드 함유 비드(GMA/GLYDMA 코폴리머) 웨트 케이크 25 g을 테플론 교반 패들이 장착된 250 ml 반응 플라스크에 넣고, 오버헤드(overhead) 교반기를 145 RPM으로 세팅하였다. 30 g의 Milli Q 워터, 0.5 g의 4 하이드록시 템포, (Aldrich lot 77997KJ), 0.08 g의 트리부틸아민, (Aldrich lot A0256662) 및 1.8 g의 37% 퍼아세트산을 반응기에 첨가하였다. 반응기를 1시간에 걸쳐 50℃로 가열한 후, 50℃로 18시간을 유지하였다. 실온으로 냉각하여 비드를 350 ml 용융 글래스 깔때기(fritted glass funnel)에 분리하고, 1 리터의 Milli Q 워터로 헹구었다. BSA 용량 162 mg/ml.
실시예 3: (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(AMPTAC)에 의한 퍼옥사이드 개질된 비드의 작용화
10 g의 퍼옥사이드 개질된 비드(실시예 1에서 얻음), 13.6 g의 AMPTAC(Sigma-Aldrich) 및 10 mL의 물을 기계 교반기가 장착된 3-목 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 용액을 15분간 N2 퍼지(purge)하였다. 반응 혼합물을 85℃로 가열하고 N2 하에서 밤새 교반하였다. 비드를 여과해내고, 물로 헹구었다. 생성된 물질을 수중의 슬러리로 저장하였다.
실시예 4: (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(AMPTAC)에 의한 퍼옥시 에스테르 개질된 비드의 작용화
실시예 2의 생성물 웨트 케이크 25 g을 테플론 교반 패들이 장착된 250 ml 반응 플라스크에 넣고, 오버헤드 교반기를 145 RPM으로 세팅하였다. 6 g의 75% (3-아크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드(Aldrich lot # 02523MH)를 반응 플라스크에 교반하면서 첨가하였다. 그 후, 0.12 g의 암모늄 퍼설페이트(Aldrich lot # A0264270) 및 13.6 g의 Milli Q 워터를 반응기에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응기를 1시간에 걸쳐 80℃로 가열한 후, 80℃로 5시간을 유지하였다. 50℃로 냉각하여, 56 ml의 1 NaOH를 반응기에 천천히(5분에 걸쳐) 첨가하였다. 50℃에서 1시간을 유지하였다. 그 후, 반응기를 실온으로 냉각시켰다. 비드를 350 ml 용융 글래스 깔때기에 분리하고, 3 리터의 Milli Q 워터로 헹구었다. BSA 용량 74 mg/ml.

Claims (5)

  1. (i) 작용기를 포함하는 폴리머 기재를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 작용기에 자유 라디칼 리간드를 공유 결합시켜 표면 반응성기(surface reactive group)를 생성하는 단계; 및
    (iii) 상기 표면 반응성기를 비닐 모노머와 자유 라디칼 반응시켜 폴리머 리간드를 생성하는 단계를 포함하며,
    여기에서,
    상기 작용기가 에폭사이드, 알킬 할라이드, 활성화된 알코올 및 활성화된 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    상기 자유 라디칼 리간드가 t-부틸하이드로퍼옥사이드 및 퍼아세트산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
    크로마토그래피용 흡착 물질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 비닐 모노머가 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 메타크릴아미드, 아크릴아미드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리머 리간드가 강한 양이온 교환기, 강한 음이온 교환기, 약한 양이온 교환기, 약한 음이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친화성기, 다른 작용기로의 추가 변형이 가능한 비작용성 모노머 또는 매개(intermediary) 모노머, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항의 방법에 의해 제조된 크로마토그래피용 흡착물질.
  5. 제1항에 있어서, 작용기가 에폭사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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