JPS61283345A - イムノアフイニテイ−クロマトグラフイ−用担体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、多孔性スチレン系共重合体ビーズにアクリル
アミドをグラフト重合することにより、高流速のカラム
反応に耐えるに充分な強度を有し、しかも不純物の非特
異的吸着が極めて少ない、高速イムノアフィニティーク
ロマトグラフィー用担体の製造に関する。

本発明は、醗酵工業、医薬品工業、化学工業、食品工業
等において有用な物質、とりわけバイオテクノロジー分
野における生理活性物質、免疫療法剤等の微量有用物質
の工業的規模における高純度の精製に利用され、短時間
で効率的かつ高純度の精製が可能である。

細胞工学、遺伝子工学における最近の進歩は、有用物質
の大量生産手段を提供したが、本発明はこれら有用物質
の培養培地からの効率的な精製を工業的規模で可能にす
るものである。

〔従来の技術〕

近年のバイオテクノロジーの急速な進歩は、醗酵工業、
医薬品工業、化学工業、食品工業などにおいて有用な物
質を、遺伝子工学、細胞工学により大量に生産すること
を可能にした。

これらの有用物質の精製は工業的に重要な技術であり、
特に医薬品工業においては、発熱性物質の除去など高純
度の精製が要求される。

分離精製手段は、物理的或いは化学的特性の差を利用し
た方法と生物学的な親和力を利用した方法に大別される
が、従来工業的規模での精製はほとんど前者のみであっ
た。後者の方法はアフィニティークロマトグラフィーと
して知られており、前者に比べ特異性が高く高純度で高
収率の精製が可能であるが、リガンド、とりわけ抗体を
リガンドとして使用する場合には、その大量入手が困難
であるため、工業的規模ではほとんど使用されなかった
。

抗原抗体反応は特異性および親和力が特に高いため、リ
ガンドとして抗体を使用するイムノアフィニティークロ
マトグラフィーは高純度の精製°に最適である。

従来、抗体は抗原を動物に免疫し、主にその血液から硫
安塩析、冷エタノール法等により精製して得ていたが、
力価および特異性に関し安定した製品が得られず、また
大量生産にも限界があった。

しかし、１９７５年にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ
により確立された細胞融合法は、どのような物質に対し
ても高い特異性を持った単一クローン性抗体を大量に生
産することを可能にし、イムノアフィニティークロマト
グラフィーを工業的規模で物質の精製に使用することを
可能にした。

イムノアフィニティークロマトグラフィーの工業的規模
での使用に際し、高流速のカラム反応はきわめて有利で
ある。反応時間の短縮によるプロセスの簡略化、それに
伴う発熱性物質など不純物混入の危険性の低下および比
較的不安定な物質の精製が可能になる。精製対象物質を
カラムから溶出する場合、ｐＨ１温度、イオン強度等適
当な条件を選択して抗原抗体反応の解離定数の値を太き
（するが、アフィニティーが強ければ強い程その条件は
厳しくなり、リガンドや精製対象物質を変性させる危険
性が増大する。したがって、反応時間の短縮は変性の危
険性を低下させ、不安定な物質の精製を可能にする。

アフィニティークロマトグラフィーにおいて従来使用さ
れた担体は、アガロース、デキストラン、セルロース、
ポリアクリルアミド、多孔性ガラス（多孔性シリカ）、
スチレン系共重合体のような合成高分子などであり、親
水性のアガロース、ポリアクリルアミドが多く使用され
、中でもアガロースは最もよく使用され、アフィニティ
ークロマトグラフィーによる精製例のほとんどがアガロ
ース担体を使用したものである。

アフィニティークロマトグラフィー用担体に要求される
条件は、主として下記のものである。

（１）　　親水性であること：水溶性の生体成分或いは
それに関連した物質が精製対象であるため親水性に富ん
だ担体が望ましい。

（２）非特異的吸着性の低いこと：不純物の混入を防ぐ
ため非特異的吸着をなくす必要がある。

（３）充分な機械的強度を有すること二カラム方式で高
流速の反応を行うためには充分な機械的強度が必要であ
る。

（４）多孔性であること二分子量致方或いはそれ以上の
巨大分子を取り扱う場合には、それらが障害なく担体の
表面及び内部に接近できるよう充分大きな孔径を有する
ことが必要である。イムノアフィニティークロマトグラ
フィーにおいては、分子量約１５万もの抗体をリガンド
として使用するためこの条件は非常に重要である。

（５）　　リガンド結合のための活性化が容易であるこ
と：リガンドを結合させるための活性化法が簡単でしか
も多種類もの活性化法が可能なことが望ましい。

理想的な担体とは前述の条件全てを満足する担体である
が、従来の担体については（１）から（５）の条件を同
時に満足するものは皆無であり、特に（１）、（２）と
（３）の条件は二律背反的である。例えば、アガロース
の場合は、（１）、（２）、（４）、（５）の条件は満
足するが、機械的強度が不足し、微生物に汚染されやす
い。ポリアクリルアミドは、（１）、（２）、（５）の
条件は満足するが、機械的強度が不足し多孔仕度も低い
ため排除限界分子量が小さいという欠点を有する。一方
、多孔性ガラスは（３）、（４）、（５）の条件は満足
するが非特異的吸着性が高く、むしろ水に難溶性のリガ
ンドの結合に優れている。しかも多孔性ガラスはｐＨ８
以上では溶解し、孔径が２５００Å以上では非常にもろ
くなるという欠点を有し、種類も少なく使用上不便であ
る。

以上述べたように、従来、親水性で非特異的吸着性が低
く、機械的強度の充分な担体は得られなかった。親水性
ポリマーにより、このような性能を有する担体を製造す
る試みはなされているが（例えばポリビニルアルコール
系担体及びポリヒドロキシエチルメタクリレート系担体
）、強度を大きくするため架橋度を高くしており、前述
の条件（４）が満足されていない。すなわち排除限界分
子量の値が小さく、高分子量の物質の精製には使用でき
ず、その応用範囲が限られていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、前述の（１）から１５）の条件を満足す
るイムノアフィニティークロマトグラフィー用担体の製
造に関し、単一材料系では（１）から（５）の条件を満
足することは不可能であるため、複合系の担体の開発を
試みた。すなわち、充分な機械的強度を有する基材（疎
水性が強く、非特異的吸着性が高い）の表面に親水性の
材料を結合させ、強度と親水性（非特異的吸着性が低い
）という従来の担体では二律背反的であった条件を同時
に満足させようとするものである。

〔問題を解決するための手段〕および〔作用〕本発明は
、充分な多孔性と強度と親水性とを有するイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー用担体及びその製法を提供
することを目的とし、その構成は、多孔性スチレン系共
重合体を基体とし、該スチレン系共重合体に親水性モノ
マーをグラフト重合させたものである。

すなわち、基体として多孔性スチレン系共重合体を使用
するものであり、多孔性スチレン系共重合体は現在ゲル
クロマト用充填剤として使用されており、各社から多く
のグレードが販売されているため入手が容易であり、又
使用者が自分で目的の性能を有するスチレン系共重合体
を製造することもできる。又ガラスのように担体の溶解
という問題がない。

スチレン系共重合体、特にスチレンージど二、ルベンゼ
ン系は硬くて粒子径、粒子径分布、孔径などを制御し易
く、カラムへの充虜が容易であり、現在疎水系の充填剤
として多用されている。本発明者らは、このスチレン系
共重合体にグラフト活性点を導入し、グラフト重合する
ことにより本発明を完成した。

スチレン系共重合体への親水性モノマーの結合は、高流
速反応、繰返し使用に耐えるに充分な安定性を有する必
要があり、又そのプロセスは簡便であることが望ましい
。スチレン系共重合体への親水性モノマーのグラフト重
合は上記条件を満たすプロセスであり、親木性モノマー
としては、アクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリ
レート、ポリビニルアルコールなどがあるが、親水性お
よびリガンド結合のための活性化法の容易さからアクリ
ルアミド及びその誘導体が最適である。又ポリアクリル
アミドは生化学の領域で用いられる通常の試薬に対し安
定であり、酵素微生物の作用も受けず、アミド基はｐＨ
２〜１０の領域で安定である。

以下、本発明について詳しく述べる。

本発明の担体の基材を構成するスチレン系共重合体の製
造方法は特に制限はなく、乳化重合、懸濁重合、塊状重
合、溶液重合の公知技術を任意に通用しうる。

本発明におけるスチレン系共重合体とは、スチレン及び
／又はその同族体と、２以上のビニル基ヲ有するモノマ
ーとの共重合体であり、スチレン及び／又はその同族体
とは、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン
、ｔ−ブチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロス
チレン、シアノスチレン、クロロメチルスチレン、アミ
ノスチレンなどである。

２以上のビニル基を有するモノマーとは、１分子内にエ
チレン性二重結合を２個以上有する化合物である。例え
ば、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリ
レート、１．３−ブチレングリコールジメタクリレート
、１．４−ブチレングリコールジメタクリレート、プロ
ピレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリ
コールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジ
メタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、
ポリエチレングリコールジアクリレート、シアヌル酸ト
リアリル、イソシアヌル酸トリアリル、トリメチロール
プロパントリメタクリレート、アリルアクリレート、ア
リルメタクリレート、ビニルアクリレート、ビニルメタ
クリレートなどが挙げられ、中でもジビニルベンゼンが
特に好ましい。

２以上のビニル基を有するモノマーを共重合させると、
架橋構造の付与、グラフト活性点の導入の効果が得られ
る。

更に、本発明の共重合体はスチレン及び／又はその同族
体と共重合可能な他のモノマーを共重合させることが可
能である。他のモノマーとしては、アクリロニトリル、
メタクリレートリル等のシアノ化ビニルモノマー、メチ
ルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレ
ート、ヘキシルアクリレート、シクロヘキシルアクリレ
ート、オクチルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリ
レート、グリシジルアクリレート等のアクリル酸エステ
ルモノマー、メチルメタクリレート、エチルメタクリレ
ート、ブチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタク
リレート、グリシジルメタクリレート等のメタクリル酸
エステルモノマー、アクリル酸、メタクリル酸、イタコ
ン酸等の不飽和カルボン酸モノマー、酢酸ビニル、プロ
パン酸ビニル、ブタン酸ビニル、オクタン酸ビニル、デ
カン酸ヒニル等の脂肪酸ビニルエステルモノマー、メチ
ルビニルエーテル、エチルビニルエーテル、−ブチルビ
ニルエーテル、フェニルビニルエーテル等のビニルエー
テルモノマー、アクリルアミド、メタクリルアミド等の
アミド系モノマー、マレイミド、Ｎ−メチルマレイミド
、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−プロピルマレイミド、Ｎ
−フェニルマレイミド、Ｎ−）ルイルマレイミド等のマ
レイミド系モノマー、塩化ビニル、塩化ビニリデン等の
ハロゲン化オレフィンモノマーなどが挙げられ、本発明
共重合体の５０重量％以下の量で使用することが可能で
ある。

更に、本発明のスチレン系共重合体は、グラフト活性点
を導入する目的で、エチレン性二重結合と過酸化結合（
−０−０−）を同一分子内に有するモノマーの共重合を
行うことができるが、このようなモノマーを例示すると
、 ｂＣＯ Ｃｌ−１２−ＣＨ−Ｃ−００−Ｃ（Ｃ庫）３ＣＨ２−Ｃ
Ｈ−Ｃ市０−Ｃ−００−Ｃ（Ｃ）ｂ　）３Ｃ）ｈ＝ｃＨ
Ｃ６Ｈ５Ｃ−００−Ｃ（Ｃ）（３）３などがある。

スチレン系共重合体を多孔性とする方法は特に制限はな
く、例えば乳化重合で製造したスチレン系共重合体ラテ
ックスに酸や水溶性塩を添加して、スチレン系共重合体
のガラス転移温度付近で攪拌する方法、懸濁重合で製造
したスチレン系共重合体ビーズの製造途中或いは製造後
にメタン、エタン、フロパン、ベンゼン、トルエン、エ
チルエーテル、四塩化炭素等の化合物を含浸せしめ、然
る後に加熱して多孔質化せしめる方法、スチレン系共重
合体溶液を沸騰水中に注加して攪拌する方法などがある
。

本発明では、多孔性スチレン系共重合体に親水性モノマ
ーをグラフト重合するが、グラフト重合方法に制限はな
い。

グラフト重合を効果的に行わしめるためには、スチレン
系共重合体の表面あるいは表面付近にグラフト活性点の
存在する必要があるが、グラフト活性点は前述した共重
合モノマーの共重合により、例えばビニル基、アリル基
、クロロメチル基、ヒドロキシル基、エポキシ基、アミ
ノ基、過酸化結合等の官能基として導入することができ
る。

又、いわゆる高分子反応によりグラフト活性点を導入す
ることも可能であり、例えば、スチレン系共重合体とク
ロロメチルエーテル （ＣＩ−ＣＨ２−０−ＣＨ３）とをルイス酸存在下で反
応させて、スチレン系共重合体のベンゼン核にクロロメ
チル基（−ＣＨ２Ｃｌ）を導入する方法（Ｇ、Ｄ。

Ｊｏｎｅｓ、Ｉｎｄ、＆　Ｅｎｇ、Ｃｈｅｍ、、４４．
２６８６　（１９５２）　）　、メチラール（ＣＨ２（
ＯＣＨｉ　）！　）を溶媒として塩化スルフリルまたは
クロロスルホン酸によりスチレン系共重合体のベンゼン
核にクロロメチル基を導入する方法（Ｆａｒｂ、Ｂａｙ
ｅｒ＾−Ｇ、Ｎｅｔｈ、Ａｐｐｌ、Ｐ、。

６４１４９４８　（１９６５））　、スチレン系共重合
体のビニルトルエン残基のメチル基を塩素化してクロロ
メチル基を導入する方法等によりクロロメチル化スチレ
ン系共重合体を合成する方法がある。　また、スチレン
系共重合体を水中に懸濁し、酸素存在下で過酸化物処理
して高分子鎖に一００Ｈ基を導入する方法などが可能で
ある。更に、クロロメチル化スチレン系共重合体にチオ
尿素を反応させてクロロメチル基をメルカプトメチル基
（−ＣＨ２ＳＨ）に変換する方法も有効である。基質高
分子鎖が官能基としてアミノ基を含有する場合には、亜
硝酸ナトリウムと反応せしめてジアゾニウムイオン基を
導入し、更に硫化水素を反応せしめて、基質高分子のア
ミノ基をメルカプト基に変換することができる。

グラフト重合は、グラフト活性点を有しているスチレン
系共重合体の存在下で所望する親水性モノマーを重合す
ることにより達成される。

ここで親水性モノマーとは、アクリル酸、メタクリル酸
、イタコン酸等の不飽和カルボン酸モノマー、アクリル
アミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルア
ミド、Ｎ、Ｎ−ジメチロールアクリルアミド、Ｎ−メチ
ロールメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチロールメタク
リルアミド、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ’−
エチレンビスアクリルアミド、Ｎ、Ｎ’−エチレンビス
メタクリルアミド等のアミド系モノマー、酢酸ビニル、
プロパン酸ビニル、ブタン酸ビニル等の脂肪酸ビニルエ
ステルモノマー、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリ
レート、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、
ヒドロキシ−エチルアクリレート、ヒドロキシエチルメ
タクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステルモノマ
ーなどであるが、アミド系モノマーが特に好ましい。又
、脂肪酸ビニルエステルモノマーをスチレン系共重合体
にグラフト重合した後に加水分解して、グラフト鎖をポ
リビニルアルコール鎮に変換することも有効である。

グラフト重合操作を例示すると、グラフト活性点を導入
した多孔性スチレン系共重合体を、界面活性剤あるいは
水溶性高分子物質（例えばポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコールーボリブロビレングリコールブロツ
クコポリマー、カルボキシメチルセルロース、スチレン
系共重合体スルホン酸、ポリビニルベンジルトリメチル
アンモニウムなど）を用いて水中に分散せしめ、所望す
るモノマーを添加して懸濁重合する方法、該スチレン系
共重合体ビーズを非水溶媒中に分散せしめ、所望するモ
ノマーを添加して懸濁重合する方法などがある。必要に
応じて、連鎖移動剤や重合開始剤を添加することができ
る。連鎖移動剤を例示するならば、オクチルメルカプタ
ン、デシルメルカブタン、ドデシルメルカプタン、チオ
グリコール酸、チオグリコール酸メチル、チオグリコー
ル酸エチル、チオグリコール酸ブチル、メルカプト安息
香酸エチル、■−ナフチルジスルフィド、硫黄、硫黄化
合物、四臭化炭素などのハロゲン化合物、リモネン、テ
ルピノレンなどの炭化水素、トリニトロフェノール、ト
リニトロベンゼン等のニトロ化合物、ベンゾキノンなど
がある。また重合開始剤としては、例えば過酸化水素、
過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、ｔ−ブチルハイ
ドロパーオキサイド等の水溶性過酸化物、ジベンゾイル
パーオキサイド、ジクミルパーオキサイド、クメンハイ
ドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーピバレート等の油
溶性過酸化物等が有効に用いられる。

スチレン系共重合体分子内に過酸化結合を有する場合に
は、グラフト重合時に還元剤を使用することが好ましく
、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硫酸第
一鉄、リチウムブロマイド等を例示することができる。

グラフト重合により得られた重合物は、一般に水溶性モ
ノマーの単独重合体を含有している。本発明の目的であ
るイムノアフィニティークロマトグラフィー用担体とし
て使用するためには、該単独重合体を除去することが好
ましい。精製方法は特に制限はなく、例えば、水、メタ
ノール、エチルエーテル、テトラヒドロフラン等を溶媒
としてソックスレー抽出すれば容易に除去される。

リガンドである抗体結合のためのポリアクリルアミドの
活性化は、ポリアクリルアミド担体の場合と全く同様の
活性化法が応用でき、ヒドラジド、アミノエチル、カル
ボキシル誘導体等を容易に導入することが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

〔実施例１〕 （ａ）　　スチレン、　　八　のクロロメチル多孔性ス
チレン系共重合体ビーズ（東洋曹達工業■製、粒子径２
０〜５０μ、浸透限界分子量約１１０８）５０をクロロ
メチルエーテル２００ｍ　Ｉ中で１５時間放置し、充分
に膨潤させてから、塩化第二錫１５ｎ＋１を徐々に加え
、５８℃で６時間ゆるやかに攪拌しながら反応させた。

反応後さらに１２時間放置し、クロロメチル化を完結さ
せてからビーズを濾過し、メタノールで３回洗浄した後
、減圧下で乾燥させた。

（ａ）で調製したクロロメチル化スチレン系共重合体２
０ｇを２０％アクリルアミドモノマー水溶液５０ｍ１（
Ｎ−メチロールアクリルアミド２ｇ、Ｎ−Ｎ’メチレン
ビスアクリルアミド１　ｇ、　Ｔｗｅｅｎ２０　０．５
％（ｗ／１１）を含む）に分散させ、ゆるやかに減圧下
２４時間攪拌した。次にビーズを濾別し、ロータリーエ
バポレーター中でゆるやかに回転しながら、５０℃、　
３０分減圧下で水を蒸発させた。

ｎ−へブタン１００ｍ１にビーズを分散させ、ゆるやか
に減圧下５時間攪拌した後、過酸化ベンゾイル２ｇを添
加し、窒素雰囲気下６０℃で１５時間ゆるやかに攪拌し
ながら反応させた。

反応後ｎ−へブタンで２回、メタノールで３回、蒸溜水
で３回洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、重量増加率
は０．５０％であった。ただし、とした。

（Ｃ）　　　　　・リ　　の。

由）で調製したポリアクリルアミドグラフト多孔性スチ
レン系共重合体ビーズ５ｍｌを１ｃｍφのカラムに充填
し、Ｔｗｅｅｎ　２０を０．５％（ｗ／ｗ）含む０．０
２Ｍホウ酸バッフｙ　−（ｐＨ８，０，０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ含有）で充分緩衝化した。

次に牛血清アルブミン５ｍｇをカラム上部より供給し、
０．０２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８，０，０，１５Ｍ
ＮａＣ１含有）を流下させた。カラムからの溶出液のＯ
Ｄｚｍｎｍが０．０１以下になるまで同一バーソファ−
を通液後、０．２Ｍグリシン−塩酸バフファー（ｐＨ２
，５）を通液した。このときの牛血清アルブミン回収率
を第１表に示した。第１表より、スチレン系共重合体ビ
ーズにポリアクリルアミドをグラフトすることにより、
非特異的吸着がほとんど排除されていることが判明した
。

なお、タンパク質の定量はＬｏｗｒｙの方法により（Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９３　、２５６（１９５１
））、カラム反応における流速は、５０ｍ１／ｃＴＩｔ
−ｈであった。

第１表 （１）　　抗体の調製 抗ウシアルブミン抗体をウサギの抗血清（富士臓器■製
）より、硫安塩析およびＤＥＡＥセルロースカラムクロ
マトグラフィーにより調製した。

（２）　　ヒドラジド誘導体の調製 偽）で調製したポリアクリルアミドグラフト多孔性スチ
レン系共重合体ビーズ１０ｇを蒸溜水１０ｍ１に分散し
、減圧下１５時間ゆるやかに攪拌した。次にあらかじめ
５０℃で４５分間加温した４、５Ｍ抱水ヒドラジン２０
ｍ１を加え、ゆるやかに攪拌しながら、５０℃で７時間
反応させた。反応終了後、０．１　Ｍ　ＮａＣ１を用い
て洗液が２．４．６−　トリニトロベンゼンスルホン酸
ナトリウム（ＴＮＢＳとする）反応によって青紫色を示
さなくなるまで洗浄を行った。

以上の方法により、約５０μｍｏｌｅ／ｇ（乾燥重量）
のヒドラジド基が導入された。なお、ヒドラジド基の定
量はケルゾール法による窒素含量の分析により求めた。

（有機定量分析、基礎分析化学講座１１、典型出版）（
以下の比較例においても同様である） （３）抗体の結合 前述の方法で調製したヒドラジド基導入ポリアクリルア
ミドグラフト多孔性スチレン系共重合体ビーズＩｇ（乾
燥重量）を、０．０１Ｍリン酸バッフｙ　−（ｐＨ８，
０，００１５Ｍ　ＮａＣ１含有）（以下ＰＢＳとする）
　５０ｍ１に分散し、減圧下１５時間ゆるやかに攪拌し
た。次に５％グルタルアルデヒド５０ｍ１で３０分間処
理し・０．０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐ）１８．０）で充
分洗浄した。

前記の方法で調製した抗体１００ｍｇを０．０１Ｍ　Ｐ
　Ｂ　５（ｐＨ８，０）　５０ｍ１に溶解し、グルグル
アルデヒドで活性化した上記スチレン系共重合体ビーズ
と４℃で一晩反応させた。さらに０．２　Ｍエタノール
アミン（ｐＨ８，５）により室温で２時間処理し、未反
応のアルデヒド基をブロックした。次にＮ　ａ　５　５
０ｍｇにより、４℃、５時間の反応でシッフ塩基を還元
し、高速イムノアフィニティークロマトグラフィー用吸
着体を得た。この場合の抗体結合量は、５０ｍｇ／ｇ（
乾燥重量）であった。

（ｄｌの（３）の方法で調製した抗ウシアルブミン抗体
結合吸着体５ｍｌを１ｃｍφのカラムに充填し、ウシ血
清０．２ｍｌをカラム上部より供給し、０．０２Ｍホウ
酸バッフｙ　−（ｐＨ８，０、０，１５Ｍ　ＮａＣ１含
有）を溶出液のＯＤｍｎｍが０．０１以下になるまで流
下させた。

次に０．２　Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２，５
）を通液して吸着されていたウシアルブミンを溶出した
。この結果を第１図に示す。カラム反応の流速は５０ｍ
１／ｃＡ−ｈであった。なお、この場合の抗原回収率は
４１％、精製純度は９８％であった。

精製純度は、グリシン−塩酸バッファー溶出画分をＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動後、クマジーブリリアン
トブルー染色し、島津二波長クロマトスキャナーＣＳ−
９１０（島津製作所製）により求めた。また抗原回収率
は下記の方法によって測定した。

（１１抗原の放射性ヨウ素（１２５１）標識クロラミン
Ｔ法（Ｎａｔｕｒｅ　１９４．４９５（１９６２）　）
により＋２５１で標識し、ゲル濾過により精製した。

（２）可溶性抗体の抗原結合量の測定 一定量の抗体溶液Ｇぴδ■標識した抗原溶液の希釈系列
溶液を等量論えてよく攪拌し、一定時間放置後遠心分離
し、上滑又は沈降物の放射活性を測定し、結合し得る抗
原量の最大値を求めた。（抗原濃度、抗体濃度及び放置
時間は予備実験により決定した。） （３）吸着体（固定化抗体）の抗原結合量の測定吸着体
をカラムに充填し、＋２５１で標識した抗原を供給して
アフイニテイクロマトグラフイーを行い、吸着された抗
原の放射活性を測定して、吸着体の抗原結合量を求めた
。

（４）抗原回収率の算出 実際のカラム反応において吸着された抗原量（Ｘ）と吸
着体の作製に使用した可溶性抗体が結合し得る抗原量の
最大値（Ｙ）の比率で求めた。

すなわち、抗原回収率＝　（Ｘ／Ｙ）　Ｘ１００（％）
とした。

〔実施例２〕 （ａ）　　スチレン、　　八　のクロロメチル　　の　
゛ホモジナイザーにスチレン３０部、Ｐ−クロロメチル
スチレン３０部、ジビニルベンゼン４０部、純水７８０
部、ポリビニルアルコール（重合度２４００、ケン化度
８８％’）　５．２５部、トルエン８０部、アゾビスイ
ソブチロニトリル２．５部を仕込み、高速で攪拌した。

内容物をステンレス製オートクレーブに移し、９０℃で
８時間攪拌して重合を終了した。次いで、オートクレー
ブを開放し、水蒸気を導入してトルエンと残余のモノマ
ーを除去した。

（ａ）で得られたクロロメチル化共重合体２０ｇを実施
例】と同様に処理してグラフト重合を実施した。

得られたグラフト重合体の重量増加率は、ｏ、５４％で
あった。

〔実施例３〕 （ａ）　　スチレン、　　Ａ　の゛　　　の　゛実施例
２で得たクロロメチル化共重合体２０部をオートクレー
ブに仕込み、純水８０部、ラウリルトリメチルアンモニ
ウムクロライド０．４部、過硫酸アンモニウム０．４部
を加え、内容を酸素で７ｋｇ／ＣＩＩＧに加圧した。次
いで内容物を８０℃で１時間、更に１００℃で１０分間
攪拌した。冷却後、スチレン系共重合体を冷水で水洗し
て、ポリマー表面に付着した過硫酸アンモニウムを除去
した。

山）　スチレン、　　＾　゛　　　へのアク１ルアミ゛
のグー　　　＾ （ａｌで得られたスチレン系共重合体の過酸化物３０部
を純水１００部、アクリルアミド２０部、Ｎ−メチロー
ルアクリルアミド１０部、ポリエチレンオキサイド−ポ
リプロピレンオキサイドブロックコポリマー（ポリプロ
ピレンオキサイドの分子量２３５０、総分子中のエチレ
ンオキサイド４２％）　０．２５部と共にオートクレー
ブに仕込み、内容を充分窒素置換した後、４％亜硝酸ナ
トリウム水溶液５０部を連続添加しつつ、５０℃で７時
間攪拌した。

グラフト重合体を分離し、メタノールでソックスレー抽
出した。精製したグラフト重合体の重量増加率は３２．
７％であった。

〔実施例４〕 （ａ）　　ス　レン、　　Ａ　の′　　　の　゛ホモジ
ナイザーにスチレン５０部、ジビニルベンゼン５０部、
純水７８０部、トルエン８０部、ポリビニルアルコール
５．２５部、 ＨＯ−Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ−００−Ｃ（ＣＨ３）３８部
、 ０．２部を仕込み、２℃で高速攪拌した。次いで内容を
オートクレーブに移し、４５℃で６時間加熱して重合を
終了した。次いでオートクレーブを開放して、水蒸気を
導入し、トルエンと残余のモノマーを除去した。

山）　スチレン、　　Ａ　の゛　　　のブーツ査 （ａ）で得られたスチレン系共重合体の過酸化物を実施
例３と同様に処理してグラフト重合体を得た。

精製したグラフト重合体の重量増加率は８．７５％であ
った。

〔実施例５〕 実施例２の（ａ）で得たクロロメチル化共重合体２０部
を、８０部の乾燥ヘキサン中に添加し、窒素雰囲気下で
三弗化硼素のエーテル溶液を５部添加した。

次いで、チオ尿素を１０部添加して３時間窒素雰囲気下
で還流した。

ポリマーを濾過し、水中に添加し、ＮａＯＨでｐ）１１
２とし、７０℃で３０分攪拌した。

ポリマーを水洗し、スチＣン系共重合体のメルカプトメ
チル化物を得た。

（ａ）で得られたメルカプトメチル化共重合体を実施例
１の（ｂ）と同様に処理してグラフト重合を実施した。

得られたグラフト重合体の重量増加率は３．４４％であ
った。

〔比較例１〕 実施例１の（ａ）で原料として使用した未グラフト処理
多孔性スチレン系共重合体ビーズを、実施例１の（Ｃ）
と同様に処理し、非特異的吸着量を測定し、その結果を
第１表に併記した。

〔比較例２〕 バイオゲルＰ−３００（バイオラッド社）１ｇをシリコ
ンで処理したフラスコに入れ、蒸留水４０ｍ１を加えて
１５時間放置し膨潤させた。次に５０℃で４５分加温し
た６Ｍ抱水ヒドラジン４０ｍ１を加え、攪拌下５０℃で
１時間反応させた。反応終了後、０．ＩＭＮａＣｌで、
洗液がＴＮＢＳ反応によって青紫色を示さなくなるまで
洗浄を行った。以上の方法によって約２００　ｐ　ｍｏ
ｌｅ／　ｇ　（乾燥重量）のヒドラジド誘導体が得られ
た。

〔比較例３〕 比較例２で調製したヒドラジド基導入バイオゲルＰ−３
０００，５ｇ　（乾燥重量）を０．０１Ｍ　ＰＢＳ　（
ｐＨ８，０）中で充分膨潤させた後、５％グルグルアル
デヒド５０ｍ　ｌで３０分間処理し、０．０１Ｍ　Ｐ　
Ｂ　Ｓ　（ｐＨ８，０）で充分洗浄した。次に実施例１
の（ｄ）の（１）で調製した抗体１００ｍｇを０．ＯＬ
Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ８，０）５０ｍｌに溶解し、グ
ルタルアルデヒドで活性化した上記担体と４℃で一晩反
応させた。さらに０．２Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，
５）で室温２時間の処理を行い、未反応のアルデヒド基
をブロックした。次にＮａＢＨ４５０＋＊ｇと、４℃、
５時間反応させシッフ塩基を還元した。抗体結合量は３
５ｍｇ／ｇ　（乾燥重量）であった。

〔比較例４〕 比較例３で調製した吸着体を１ｃｍφのカラムに充填し
、流速が５ｍｌ／ｃｊ−ｈである以外は、実施例１の（
ｉｌｌ）と全く同様の方法により、ウシ血清中のアルブ
ミンを精製した。抗原回収率は５％、精製純度は９９％
であった。なお、カラム流速は上記の値より大きくする
とカラムの目詰まりを起し、高流速での反応は不可能で
あった。この結果を第２図に示した。

〔発明の効果〕

かくの如く、本発明により高流速のカラム反応に耐える
に十分な強度を有し、しかも非特異的吸着の極めて少な
い高速イムノアフィニティークロマトグラフィー用担体
が得られ、工業的規模での実施が可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１の（ｅ）における、第２図は
比較例４における、ウシアルブミンの溶出量とカラム通
液時間との関係をそれぞれ示す。 特許出願人　電気化学工業株式会社 代理人　弁理士　　鈴　木　定　子 港１図 氾２図 時−間（ｈｒ、） 手続補正書 昭和６０年７月５日 特許庁長官　志　賀　　学　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１２３５１２号 ２、発明の名称 イムノアフィニティークロマトグラフィー用担体および
その製法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区有楽町１丁目４番１号名称　（３
２９）電気化学工業株式会社代表者　　　篠　原　　晃 ４、代理人　■１５０ 住所　東京都渋谷区桜五町２９番３１号７、補正の内容 ＋１１　　特許請求の範囲を別紙の通り訂正する・（２
）明細書第１９頁、４行目から５行目の「硫黄、硫黄化
合物」を「硫黄等の硫黄化合物」に訂正する。 （３）　　図面を別紙の通り訂正する・以上 訂正特許請求の範囲 （１）　　スチレン及び／又はその同族体と、２以上の
ビニル基を有するモノマーとの多孔性スチレン系共重合
体を基体とし、該スチレン系共重合体に親水性モノマー
がグラフト重合しているイムノアフィニティークロマト
グラフィー用担体。 （２）　　スチレン及び／又はその同族体と、２以上の
ビニル基を有するモノマーとの多孔性スチレン系共重合
体に、グラフト活性基を有する化合物を反応させてグラ
フト活性点を設け、該グラフト活性点に親水性モノマー
をグラフト重合させるイムノアフィニティークロマトグ
ラフィー用担体の製法（３）スチレン及び／又はその同
族体と、２以上のビニル基を有するモノマーと、グラフ
ト活性基を有する化合物とを共重合させてグラフト活性
点を設け、該グラフト活性点に親水性モノマーをグラフ
ト重合させるイムノアフィニティークロマトグラフィー
用担体の製法。 （４）　　スチレン及び／又はその同族体と、２以上の
ビニル基を有するモノマーと、１分子内にビニル基と一
〇−〇−基とを有する化合物とを共重合させて過酸化ス
チレン系共重合体とし、或いはスチレン及び／又はその
同族体と、２以上のビニル基を有するモノマーと、丈劣
≧Ｌ要ぶ」【以ｘ−グラフト活性基を有する化合物とΩ
共重合体に五酸化物を作用させて過酸化スチレン系共重
合体とし、該過酸化スチレン系異重合体に親水性モノマ
ーをグラフト重合させるイムノアフィニティークロマト
グラフィー用ｊ−、本の製法。 氾１図 氾２図 時　　　間　（ｈ「）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）スチレン及び／又はその同族体と、２以上のビニ
   ル基を有するモノマーとの多孔性スチレン系共重合体を
   基体とし、該スチレン系共重合体に親水性モノマーがグ
   ラフト重合しているイムノアフィニティークロマトグラ
   フィー用担体。
2. （２）スチレン及び／又はその同族体と、２以上のビニ
   ル基を有するモノマーとの多孔性スチレン系共重合体に
   、グラフト活性基を有する化合物を反応させてグラフト
   活性点を設け、該グラフト活性点に親水性モノマーをグ
   ラフト重合させるイムノアフィニティークロマトグラフ
   ィー用担体の製法。
3. （３）スチレン及び／又はその同族体と、 ２以上のビニル基を有するモノマーと、 グラフト活性基を有する化合物とを共重合させてグラフ
   ト活性点を設け、該グラフト活性点に親水性モノマーを
   グラフト重合させるイムノアフィニティークロマトグラ
   フィー用担体の製法。
4. （４）スチレン及び／又はその同族体と、 ２以上のビニル基を有するモノマーと、 １分子内にビニル基と−Ｏ−Ｏ−基とを有する化合物と
   を共重合させて過酸化スチレン系共重合体とし、或いは
   スチレン及び／又はその同族体と、２以上のビニル基を
   有するモノマーと、 グラフト活性基を有する化合物とを共重合させてグラフ
   ト活性点を設け、該グラフト活性点に過酸化物を作用さ
   せて過酸化スチレン系共重合体とし、該過酸化スチレン
   系共重合体に親水性モノマーをグラフト重合させるイム
   ノアフィニティークロマトグラフィー用担体の製法。