JPH01199579A

JPH01199579A - 生物学的活性たんぱく質の固定方法

Info

Publication number: JPH01199579A
Application number: JP7965588A
Authority: JP
Inventors: Chiaki Azuma; 千秋東; Shigeo Shiyouami; 正阿弥　重雄
Original assignee: Toyo Ink Mfg Co Ltd
Current assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Priority date: 1987-10-13
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1989-08-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕（産業上の利用分野）本発明は、架橋ゲル粒子を担体材料とする生物学的活性
たんぱく質の固定方法に関する。

（従来の技術）近年、医薬５診断薬など製剤化学および分析化学の分野
において、酵素、ホルモン、抗原−抗体反応あるいはハ
プテン抗体反応に関与する能力のある物質、凝固因子な
ど生物学的活性たんぱく質を固定化する技術が重要とな
ってきている。

生物学的活性たんぱく質である酵素を用いる酵素的測定
法は１強酸９強アルカリなど強い試薬を使用せず、比較
的おだやかな条件で体液中の病理学的成分を測定できる
ため、特公昭４５−１８７８号公報記載のブドウ糖検出
用品など診断試験試薬として広く用いられるようになっ
てきた。これらの用途には。

酵素を固定化して用いると簡便である。

酵素の固定化については、千畑一部編「固定化酵素」　
（講談社、昭和６１年８月刊）に詳細に記載されており
、酵素を固定化することにより活性が長期間持続し、安
定化し、また分離がしやすくなることが、また、固定化
の方法としては、担体結合法（共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着法）、架橋法。

および包括法（格子型包括法、マイクロカプセル型旬括
法）があることが、それぞれ示されている。これらの固
定化の方法のうち、最も一般的な担体結合法の担体材料
としては各種ポリマー類、セルロース類、でん粉などの
他、特定の用途においては多孔性ガラス、活性炭、酸性
白土、シリカゲルが用いられる。汎用性の高い各種ポリ
マー類あるいはセルロース類を担体材料とするものにつ
いては定性的な確認に限られるという欠点があり、これ
らの担体のうち粒子状のものについても１粒子の大きさ
が一定ではないために定性的な確認に限られるという欠
点があった。また、でん粉を担体材料とするものについ
て　　・は用途が非水系に限られるという欠点があるな
どそれぞれ一長一短があった。

また、抗原−抗体反応を利用した微量血中物質の測定法
が最近用いられるようになり、各種の病原が確認できる
ようになった。例えば、モノクロナール抗体法により特
定の病原を確認する方法も開発されている。これらの確
認法には、ラテックス凝集法。

発色法などがあり１分析装置の開発も進んでいる。

しかしながら、これらの方法に用いられる各種のポリマ
ー類からなる担体は、その粒子径が一定ではなく、定性
的な確認に限られるなどの欠点があった。

（発明が解決しようとする課題）本発明は、上記した従来の生物学的活性たんぱく質の固
定方法の欠点を改良し、保存安定性が良好で。

担体の粒子径が一定であるために１診断薬や分析測定剤
とりわけ抗原−抗体反応法、特にモノクローナル抗体法
による診断薬として用いたときに定量性が高く、信頼性
が高く、細胞レセプターのマーカー。

たとえば細胞表面の糖たんぱくを認識するためのマーカ
ーなどとしても利用でき、また、ｒｓ酵分野において用
いた及きに２分離が容易なため操作性が向上する生物学
的活性たんぱく質の固定方法を提供するものである。

〔発明の構成〕

（課題を解決するための手段）本発明は、担体材料として架橋ゲル粒子を用いて生物学
的活性たんぱく質を固定する生物学的活性たんぱく質の
固定方法であって、上記架橋ゲル粒子が下記（Ａ）かつ
（Ｂ）、　　（Ａ）、　　（Ｂ）、またはこれらの混合
物であることを特徴とする生物学的活性たんぽ（質の・
固定方法である。

（Ａ）上記たんぱく質と反応する基、上記たんぱく質に
吸着する基、エポキシ基、およびエチレン不飽和二重結
合の少なくとも１個を有する架橋ゲル粒子またはこれら
の混合物。

（Ｂ）活性水素を有する架橋ゲル粒子および活性水素と
反応する基を有する架橋ゲル粒子からなる混合物。

本発明は、゛また上記架橋ゲル粒子が２０００ｎｍ以下
の粒子径を有するものである上記固定方法である。

本発明において生物学的活性たんぽ（質としては。

特に制限はなく、植物性または動物性の生物学的活性た
んぱく質、あるいはこれらに架橋剤がブレットした形の
変性体が用いられるが２診断薬や分析測定剤などの用途
に用いる場合には酵素、および抗原−抗体反応をおこす
生物学的活性たんぱく質が用いられる。酵素としては、
生体内とりわけ体液中に含有される病理学的成分２例え
ば、グルコースなどのグリコース、コレストロール、尿
素、中性脂肪、りん脂質、二酸化炭素、アンギニア、乳
酸、ピルビン酸。

シアル酸、　　ＧＰＴ、ＧＯＴ、　　コリンエステラー
ゼ。

ロイシンアミノペプチターゼ、アミラーゼ、ＬＣＡＴ、
タレアチンホスホナーゼなどと反応し、指示薬の色調変
化をおこすもの、あるいは前記反応によって生成した物
質がさらに他の酵素と反応して指示薬の色調変化をおこ
すもの、あるいはこれらの反応の結果、紫外線吸収スペ
クトル、けい光スペクトルなどの分光光度計によって分
析できるものが用いられる。また、抗原−抗体反応をお
こす生物学的活性たんぱく質としては、特に制限はなく
、たんぱく質などの高分子物質に結合すると免疫応答を
示す物質としてのハプテンや免疫グロブリンと総称され
る抗体などであり、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ
。

ウサギ、ウシ、ウマ、鳥類、は土類１両棲類、魚類。

同口類などから得られる免疫グロブリンを用いることが
できるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、架橋ゲル粒子としては、　ＩＡ、　Ｆ
ｕｎｋｅ　：’Ｍａｃｒｏｍｏ１．　Ｃｈｅｍ、、７６
、２５９　（１９７９）に示されているような、エチレ
ン不飽和二重結合を１個有する化合物と、エチレン不飽
和二重結合を２個以上有する化合物とをエマルション重
合法などにより共重合して得られる架橋型のゲル粒子で
あり、その粒子径は２０００ｎｍ以下、好ましくは２０
０ｎｍ以下、さらに好ましくは１１００ｎ以下のミクロ
ゲルであり、下記（Ａ）かつ（Ｂ）、　　（Ａ）、　　
（Ｂ）、またはこれらの混合物である。架橋ゲル粒子と
して、上記架橋ゲル粒子にさらに架橋剤がグラフトした
形のものを用いてもよい。

（Ａ）上記生物学的活性たんぱく質と反応する基。

上記生物学的活性たんぱく質に吸着する基、エポキシ基
、およびエチレン不飽和二重結合の少なくとも１個を有
する架橋ゲル粒子またはこれらの混合物。

上記エチレン不飽和二重結合を１個有する化合物として
は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸アルキルエ
ステル、メタクリル酸アルキルエステル。

アクリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシジル。

アクリル酸２−ヒドロキシアルキル、メタクリル酸２−
ヒドロキシアルキル、アクリロニトリル、メタクリコニ
トリル。アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン
、α−アルキルスチレン、塩化ビニル。

酢酸ビニル、塩化ビニリデン、ビニルエーテル類。

アリルアルコールなど、あるいはこれらの混合物があり
、エチレン不飽和二重結合を２個以上有する化合物とし
ては、ジアクリレート類、ジメタクリレート類、ジアク
リルアミド類、ジメタクリルアミド類。

ジアリルフタレート、ジビニルベンセン、トリアリル化
合物、トリアクリレート類、トリメタクリレート類など
、あるいはこれらの混合物がある。

本発明において、固定の方法としては担体結合法（共有
結合法、物理的吸着法）、架橋法、包括法。

あるいはこれらが複合した方法がある。担体結合法のう
ち共有結合法により生物学的活性たんぱく質を固定する
場合には、上記生物学的活性たんぱく質と反応する反応
性基を有する架橋ゲル粒子が用いられる。このような反
応性基としては、上記生物学的活性たんぱく質の有する
官能基によって、カルボキシ基、水酸基、アミノ基、イ
ソシアネート基、チオシアネート基、エポキシ基、エチ
レン不飽和二重結合。

チオール基、アルデヒド基、酸無水物基、イミダゾール
基、ハロゲン基などから適宜選択される。また。

担体結合法のうち物理的吸着法により生物学的活性たん
ぱく質を固定する場合には、上記生物学的活性たんぱく
質に吸着する吸着性基を有する架橋ゲル粒子が用いられ
る。このような吸着性基としてはアルキル基とりわけ高
級アルキル基や芳香族基がある。

包括法により生物学的活性たんぱく質を固定する場合に
は、架橋ゲル粒子同士が反応するような反応性基を有す
る架橋ゲル粒子が用いられる。このような反応性基とし
ては、前記担体結合法のうち、共有結合法により固定す
る場合の架橋ゲル粒子の反応性基と同様のものでよい。

また、架橋法により固定する場合は、架橋剤を介して、
生物学的活性たんぱく質に架橋ゲル粒子を反応または吸
着させるか架橋ゲル粒子同士を反応させられ、架橋剤と
しては、生物学的活性たんぱく質の有する官能基の種類
および架橋ゲル粒子の有する反応性基または吸着性基の
種類により、上記吸着性基および反応性基のうちから２
個以上を有するものが適宜選択される。

本発明において架橋ゲル粒子とともに必要に応じて、有
機溶剤、顔料、染料１体質顔料、指示薬、架　−橋剤、
硬化触媒１重合禁止剤、消泡剤、滑剤、充填剤、無機塩
、水などの添加剤、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、感光
性樹脂などの樹脂を用いてもよい。

（実　施　例）以下、実施例により本発明を説明する。

例中１部とは重量部を９％とは重量％を、それぞれ表わ
す。

（実施例１）メタクリル酸ｎ−ブチルエステル２８，４部、メタクリ
ル酸メチルエステル７５．１部およびジビニルベンゼン
６．５部を、ドデシル硫酸ナトリウム２８．８部を含む
水溶液８００部中に投入し乳化した。これに。

重合開始剤として過硫酸カリウム８部を加えて６０℃の
温度において重合反応を行った。８時間反応後。

食塩を加え、遠心分離機を用いて架橋ゲル粒子を分離し
た後、真空乾燥した。得られた架橋ゲル粒子の粒子径は
４０〜５０ｎｍの範囲にあり、均一であった。

得られた架橋ゲル粒子１部を濃硫酸２０部中に氷冷しな
がらゆっくり加え、５°Ｃ以下で約１時間加水分解させ
た後、氷水中に加え、少量の食塩を加えて遠心分離し、
真空乾燥し２表面にカルボキシル基を有する架橋ゲル粒
子を得た。

得られた表面にカルボキシル基を有する架橋ゲル粒子１
部を、塩化カルシウム（０，０２ｍｏｌ　ｄｍ−３）を
含むほう酸塩緩衝液（０，０２５ｍｏｌ　ｄｍ−３，ｐ
Ｈ８）５０部中に分散し、これに、同じほう酸緩衝液に
溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩溶液（４０ｍ　ｍｏｌ　ｄｍ
−３）２５部を混合し、４℃で１時間かきまぜた。得ら
れた分散液７６部に、前述のほう酸緩衝液に溶解したα
−キモトリプシン溶液（０，４ｍｇ／ｍｌ）　　２５部
を加え、４℃で１８時間反応させた。反応後、遠心分離
機にて分離し、イオン交換水でよく洗浄し、乾燥し、固
定化α−キモトリプシン架橋ゲル粒子を得た。

塩酸（０，００１ｍｏｌ　ｄｍ−３）中に、固定化α−
キモトリプシン架橋ゲル粒子の濃度が２％となるように
固定化α−キモトリプシン架橋ゲル粒子を分散した分散
液１部をＮ−アセチル−α−チロシンエチルエステル溶
液（２，７０ｇ／ｄｍ　３）　２５部に添加し、ｐＨを
８に保つために水酸化ナトリウム溶液を加え、その消費
量から活性を求めた。

固定化しないα−キモトリプシンと架橋ゲル粒子に固定
化したα−キモトリプシンの活性を比較した結果、はと
んど活性に変化がなかった。

（実施例２）メタクリル酸ｎ−ブチルエステル２８．４部、メタクリ
ル酸メチルエステル６０部、メタクリル酸１２゜９部お
よびエチレングリコールジメタクリレート９゜９部を、
ドデシル硫酸ナトリウム３０部を含む水溶液７００部中
に投入し乳化し・た。これに３重合開始剤として過硫酸
カリウム７．５部を加えて６０℃の温度において重合反
応を行った。１０時間反応後２食塩を加え、遠心分離機
を用いて架橋ゲル粒子を分離し、真空乾燥した。得られ
た架橋ゲル粒子の粒子径は６０〜７０ｎｍの範囲にあり
、均一であった。

得られた架橋ゲル粒子５部、ジメチルスルオキシド４０
部、グルコースオキシダーゼ（東洋紡績■製。

Ｇｒａｄｅ　　Ｉ　）　　０．１部およびＮ、Ｎ−シク
ロへキシルカルボジイミド１部を、０〜５°Ｃの条件下
で８時間反応後、尿素をろ過で除去し、冷水で透析精製
し、凍結乾燥し、グルコースオキシダーゼを架橋ゲル粒
子に固定化した。

得られた固定化架橋ゲル粒子２部、パーオキシダーゼ０
．０１部および０−トリジン０．０５部をｐＨ７の緩衝
液５０部に加え、試験管中に５ｍｌを取り出し。

その中にグルコース（０，２％濃度）の１ｍｌを加えて
色調の変化を調べた。青色の発色が確認でき、グルコー
スオキシダーゼが固定化されていることを判定できた。

グルコース濃度を変化させ色調の変化をみた結果。

グルコース濃度により色調が明瞭に変化し定量性のよい
ことがわかった。

また、４０℃で７日間放置しても酵素の活性は失われず
、安定性にもすぐれたものであった。

（実施例３）スチレン７２．８部、メタクリル酸２−ヒドロキシエチ
ル６．５部、ジビニルヘンゼン６．５部およびメタクリ
ル酸メチルエステル２０部を、ドデシル硫酸ナトリウム
２８．８部を溶かした水溶液８００部に投入し乳化し、
さらに過硫酸カリウム８部を加え、実施例１と同様の処
理により１粒子径が７０〜８０ｎｍの範囲にある均一な
架橋ゲル粒子の水分散液を得た。

得られた架橋ゲル粒子の水分散液に水を加えて。

架橋ゲル粒子の濃度がＬｏｇ／／！になるように調整し
た。

抗体としてヒトγ−グロブリン（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ社
製）を精製したものをＩｇＧ分画したものを用いた。こ
のＩｇＧの種々の濃度のもの１部を得られた架橋ゲル粒
子溶液１部中に加えて３７℃で１時間振とうした後、遠
心分離して得た上澄液中のＩｇＧ量を分光光度計（＠日
立製作所型）を用いて２８０部ｍの波長で吸着量を定量
した。

抗体の固定化により架橋ゲル粒子の粒子径が８０〜１２
０ｎｍとなり抗体が吸着していることが確認された。こ
の結果では未吸着の架橋ゲル粒子がほぼ６０％存在した
。

また、抗原としてはウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）
（和光純薬工業■製）をグリシン−水酸化ナトリウム塩
緩衝液に２倍希釈した溶液を用い、大塚電子■レーザー
粒径解析システムＬＰＡ３０００で凝集特性を調べた。

　　　　　　　□ 抗原のウシ血清アルブミン溶液を加えると凝集が起こり
１粒子径８０〜１２０ｎｍの架橋ゲル粒子がほとんど存
在しなくなり、抗原−抗体反応が起こり凝集が起こった
ことが判った。

このような粒子径解析方法は抗原−抗体反応の確認に有
効であり、定量性にも優れていることが判った。

〔発明の効果〕

本発明により、保存安定性が良好で、担体の粒子径が一
定であるために２診断薬や分析測定剤、とりわけ抗原−
抗体反応法、特にモノクロナール抗体法による診断薬と
して用いたときに定量性が高く、信転性が高い固定化さ
れた生物学的活性たんぱく質が得られるようになった。

本発明は、細胞レセプターのマーカー、たとえば細胞表
面の糖たんぱくを認識するだめのマーカーにも利用でき
る。また１本発明による分離の容易さにより、醗酵分野
での操作性の向上が可能となった。

Claims

【特許請求の範囲】１、担体材料として架橋ゲル粒子を用いて生物学的活性
たんぱく質を固定する生物学的活性たんぱく質の固定方
法であって、上記架橋ゲル粒子が下記（Ａ）かつ（Ｂ）
，（Ａ），（Ｂ），またはこれらの混合物であることを
特徴とする生物学的活性たんぱく質の固定方法。（Ａ）上記たんぱく質と反応する基、上記たんぱく質に
吸着する基、エポキシ基、およびエチレン不飽和二重結
合の少なくとも１個を有する架橋ゲル粒子またはこれら
の混合物（Ｂ）活性水素を有する架橋ゲル粒子および活性水素と
反応する基を有する架橋ゲル粒子からなる混合物２、架橋ゲル粒子が２０００ｎｍ以下の粒子径を有する
ものである特許請求の範囲第１項記載の固定方法。