JPH06130064A - 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 - Google Patents
固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤Info
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- JPH06130064A JPH06130064A JP4269189A JP26918992A JPH06130064A JP H06130064 A JPH06130064 A JP H06130064A JP 4269189 A JP4269189 A JP 4269189A JP 26918992 A JP26918992 A JP 26918992A JP H06130064 A JPH06130064 A JP H06130064A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 β−グルカンと反応せずエンドトキシン(Et)
と特異的に反応するEt感受性因子を不溶性担体に固定化
した固相系反応用Et測定剤、それを含むキット、該測定
剤の製造法および該測定剤を用いる簡便・迅速なEtの測
定法の提供。 【構成】 カブトガニ・アメボサイト由来の少なくと
もEt感受性因子（Ｃ因子）を固定化した不溶性担体から
なり、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに反応性を示さな
い固相系反応用Et特異的測定剤、該測定剤と活性型Ｃ
因子の合成基質またはクロッティングエンザイムの基質
とを構成試薬として含む固相系反応用エンドトキシン特
異的測定キット、検体溶液を前記測定剤と接触させ、
検体中のEtと該測定剤中のＣ因子とを反応させ、該反応
による基質の変化を測定するEtの測定法、カブトガニ
・アメボサイト由来の少なくともＣ因子を、不溶性担体
に物理的または化学的に固定化する固相系反応用Et特異
的測定剤の製造法。
と特異的に反応するEt感受性因子を不溶性担体に固定化
した固相系反応用Et測定剤、それを含むキット、該測定
剤の製造法および該測定剤を用いる簡便・迅速なEtの測
定法の提供。 【構成】 カブトガニ・アメボサイト由来の少なくと
もEt感受性因子（Ｃ因子）を固定化した不溶性担体から
なり、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに反応性を示さな
い固相系反応用Et特異的測定剤、該測定剤と活性型Ｃ
因子の合成基質またはクロッティングエンザイムの基質
とを構成試薬として含む固相系反応用エンドトキシン特
異的測定キット、検体溶液を前記測定剤と接触させ、
検体中のEtと該測定剤中のＣ因子とを反応させ、該反応
による基質の変化を測定するEtの測定法、カブトガニ
・アメボサイト由来の少なくともＣ因子を、不溶性担体
に物理的または化学的に固定化する固相系反応用Et特異
的測定剤の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エンドトキシン感受性
因子を不溶性担体に固定化した固定化エンドトキシン感
受性因子を含む固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤、該測定剤を含むキット、該測定剤を使用するエンド
トキシンの特異的測定法および該測定剤の製造法に関す
る。
因子を不溶性担体に固定化した固定化エンドトキシン感
受性因子を含む固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤、該測定剤を含むキット、該測定剤を使用するエンド
トキシンの特異的測定法および該測定剤の製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】カブトガニの血球細胞（アメボサイト；
変形細胞）の抽出物、すなわちカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート（以下単にライセートともいう）を用い
て、エンドトキシン（内毒素；以下Etということもあ
る）を測定する方法（一般的にこの測定法は「リムルス
テスト」と呼ばれ、この測定に関与するライセートの反
応は「リムルス反応」と呼ばれている）が従来から知ら
れており、検出感度が高いため、医薬品、水などの汚染
試験、臨床検査など多方面に汎用されている。この方法
は、微量のEtによりライセートが凝固することに基づい
ているが、その後の生化学的解明により、該反応はいく
つかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかに
されている（中村隆範他、日本細菌学雑誌、38,781-803
(1983)）。
変形細胞）の抽出物、すなわちカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセート（以下単にライセートともいう）を用い
て、エンドトキシン（内毒素；以下Etということもあ
る）を測定する方法（一般的にこの測定法は「リムルス
テスト」と呼ばれ、この測定に関与するライセートの反
応は「リムルス反応」と呼ばれている）が従来から知ら
れており、検出感度が高いため、医薬品、水などの汚染
試験、臨床検査など多方面に汎用されている。この方法
は、微量のEtによりライセートが凝固することに基づい
ているが、その後の生化学的解明により、該反応はいく
つかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかに
されている（中村隆範他、日本細菌学雑誌、38,781-803
(1983)）。
【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ (Ta
chypleus tridentatus) から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにEtが加わる
と、ライセート中に存在するＣ因子（Et感受性因子、分
子量123,000）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子が
Ｂ因子（分子量 64,000）の特定箇所を限定水解して活
性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティン
グエンザイム（分子量 54,000）を活性化してクロッテ
ィングエンザイムに変換し、クロッティングエンザイム
はコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19,723）
のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所
を、すなわち…Arg18-Thr19 …の間および…Arg46-Gly
47 …の間を限定水解して H-Thr19…Arg46-OHで表され
るペプチドＣ（アミノ酸28残基）を遊離しつつ残余の部
分がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応
（カスケード反応とも呼ばれる）である。
chypleus tridentatus) から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにEtが加わる
と、ライセート中に存在するＣ因子（Et感受性因子、分
子量123,000）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子が
Ｂ因子（分子量 64,000）の特定箇所を限定水解して活
性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティン
グエンザイム（分子量 54,000）を活性化してクロッテ
ィングエンザイムに変換し、クロッティングエンザイム
はコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19,723）
のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所
を、すなわち…Arg18-Thr19 …の間および…Arg46-Gly
47 …の間を限定水解して H-Thr19…Arg46-OHで表され
るペプチドＣ（アミノ酸28残基）を遊離しつつ残余の部
分がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応
（カスケード反応とも呼ばれる）である。
【０００４】一方、このカスケード反応は、Etの存在に
よって起こるだけでなく、ライセートに（１→３）−β
−Ｄ−グルカン（以下β−グルカンということもある）
が加わると同様に生起する。すなわち、図１におけるＧ
因子が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッ
ティングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性
化し、以下Etの場合と同様に反応してコアギュリンゲル
を生成する。
よって起こるだけでなく、ライセートに（１→３）−β
−Ｄ−グルカン（以下β−グルカンということもある）
が加わると同様に生起する。すなわち、図１におけるＧ
因子が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッ
ティングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性
化し、以下Etの場合と同様に反応してコアギュリンゲル
を生成する。
【０００５】また、上記カスケード反応により生成する
クロッティングエンザイムは、反応系に別に添加される
合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−
グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド (Boc-Leu-
Gly-Arg-pNA)のアミド結合を水解してパラニトロアニリ
ンを遊離させるので、その生成した発色物質（パラニト
ロアニリン）の吸光度を測定することによりEtまたはβ
−グルカンの定量を行うことができる。
クロッティングエンザイムは、反応系に別に添加される
合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−
グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド (Boc-Leu-
Gly-Arg-pNA)のアミド結合を水解してパラニトロアニリ
ンを遊離させるので、その生成した発色物質（パラニト
ロアニリン）の吸光度を測定することによりEtまたはβ
−グルカンの定量を行うことができる。
【０００６】一方、従来から、Ｇ因子を除去したライセ
ート中のＣ因子系のみを用いることによりEtを特異的に
測定する方法が報告されている (Obayashi T. et al.,
Clin. Chim. Acta, 149, 55-65(1985))。しかし、この
方法は、ライセートをデキストラン硫酸を固定化したア
フィニティー担体を用いるクロマトグラフィーにより分
画し、β−グルカン感受性因子であるＧ因子を除去し
て、Ｃ因子、Ｂ因子およびプロクロッティングエンザイ
ムを再構成して、これとクロッティングエンザイムの合
成基質とでEtを特異的に測定する方法であって、極めて
煩雑な操作を必要とする方法である。また、Et感受性因
子であるＣ因子のみと活性型Ｃ因子の合成基質（例、Ｂ
ｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）とを用いてEt
を特異的に測定する方法も知られている（Nakamura T.
et al., Eur. J. Biochem., 154, 511-521(1986) ）
が、いずれも煩雑な分離・精製操作を必要とする方法で
ある。
ート中のＣ因子系のみを用いることによりEtを特異的に
測定する方法が報告されている (Obayashi T. et al.,
Clin. Chim. Acta, 149, 55-65(1985))。しかし、この
方法は、ライセートをデキストラン硫酸を固定化したア
フィニティー担体を用いるクロマトグラフィーにより分
画し、β−グルカン感受性因子であるＧ因子を除去し
て、Ｃ因子、Ｂ因子およびプロクロッティングエンザイ
ムを再構成して、これとクロッティングエンザイムの合
成基質とでEtを特異的に測定する方法であって、極めて
煩雑な操作を必要とする方法である。また、Et感受性因
子であるＣ因子のみと活性型Ｃ因子の合成基質（例、Ｂ
ｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）とを用いてEt
を特異的に測定する方法も知られている（Nakamura T.
et al., Eur. J. Biochem., 154, 511-521(1986) ）
が、いずれも煩雑な分離・精製操作を必要とする方法で
ある。
【０００７】このような従来技術は、ライセート成分全
体あるいは一部を用いた液相系反応である。ところで、
試料には、種々のリムルステスト妨害物質が含まれてい
る場合が多く、リムルステストを行う際にはそれらを失
活あるいは除去する前処理が必要である。たとえば、重
金属や塩を高濃度に含む試料はリムルス反応を強く阻害
し、正しいEt量が求められない。この場合は、阻害がな
くなるまで蒸留水で希釈する必要があるが、リムルステ
ストの感度以下にまでは希釈できない欠点を有してい
る。また、試料を希釈しても濁っているものや着色して
いるものは測定できない場合が多く、また血液や乳汁で
は煩雑な前処理を施さなければならず、これらの試料中
のEtをリムルステストで測定するには多くの問題を残し
ている。
体あるいは一部を用いた液相系反応である。ところで、
試料には、種々のリムルステスト妨害物質が含まれてい
る場合が多く、リムルステストを行う際にはそれらを失
活あるいは除去する前処理が必要である。たとえば、重
金属や塩を高濃度に含む試料はリムルス反応を強く阻害
し、正しいEt量が求められない。この場合は、阻害がな
くなるまで蒸留水で希釈する必要があるが、リムルステ
ストの感度以下にまでは希釈できない欠点を有してい
る。また、試料を希釈しても濁っているものや着色して
いるものは測定できない場合が多く、また血液や乳汁で
は煩雑な前処理を施さなければならず、これらの試料中
のEtをリムルステストで測定するには多くの問題を残し
ている。
【０００８】なお、ライセートをポリスチレン製マイク
ロプレートのウェルに吸着固定化した例も知られている
が、これにはEt感受性因子だけでなくβ−グルカン感受
性因子も同時に吸着固定されるので、Etの特異的な測定
には使用できない（J. Clin.Microbiol., 17, 1050-105
3(1983)。また、濾紙にライセート、合成基質等を含有
させ、乾燥して試験具とした例も知られているが、ライ
セートに浸漬した後、洗浄操作を行っていないため、ラ
イセートの全ての成分が濾紙に含まれ、やはりEtの特異
的な測定には使用できない（特開昭６２−１３４５６
３）。
ロプレートのウェルに吸着固定化した例も知られている
が、これにはEt感受性因子だけでなくβ−グルカン感受
性因子も同時に吸着固定されるので、Etの特異的な測定
には使用できない（J. Clin.Microbiol., 17, 1050-105
3(1983)。また、濾紙にライセート、合成基質等を含有
させ、乾燥して試験具とした例も知られているが、ライ
セートに浸漬した後、洗浄操作を行っていないため、ラ
イセートの全ての成分が濾紙に含まれ、やはりEtの特異
的な測定には使用できない（特開昭６２−１３４５６
３）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、カブトガニ
・アメボサイト由来のエンドトキシン感受性因子を不溶
性担体に固定化した固定化エンドトキシン感受性因子を
用いることによって、β−グルカンと反応せず、エンド
トキシンと特異的に反応する、エンドトキシンを定量的
または定性的に信頼性高く測定可能な固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定剤、それを含むキット、該測定剤
を容易な手法で製造できる方法、および該測定剤を用い
る簡便・迅速なエンドトキシンの測定法を提供すること
を目的とする。
・アメボサイト由来のエンドトキシン感受性因子を不溶
性担体に固定化した固定化エンドトキシン感受性因子を
用いることによって、β−グルカンと反応せず、エンド
トキシンと特異的に反応する、エンドトキシンを定量的
または定性的に信頼性高く測定可能な固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定剤、それを含むキット、該測定剤
を容易な手法で製造できる方法、および該測定剤を用い
る簡便・迅速なエンドトキシンの測定法を提供すること
を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、カブトガニ・
アメボサイト由来の少なくともエンドトキシン感受性因
子を固定化した不溶性担体からなることを特徴とする固
相系反応用エンドトキシン特異的測定剤を提供するもの
である。そして、本発明は、前記測定剤と活性型エンド
トキシン感受性因子の合成基質またはクロッティングエ
ンザイムの合成基質とを構成試薬として少なくとも含む
固相系反応用エンドトキシン特異的測定キットを提供す
る。
アメボサイト由来の少なくともエンドトキシン感受性因
子を固定化した不溶性担体からなることを特徴とする固
相系反応用エンドトキシン特異的測定剤を提供するもの
である。そして、本発明は、前記測定剤と活性型エンド
トキシン感受性因子の合成基質またはクロッティングエ
ンザイムの合成基質とを構成試薬として少なくとも含む
固相系反応用エンドトキシン特異的測定キットを提供す
る。
【００１１】また本発明は、検体溶液を上記の固相系反
応用エンドトキシン特異的測定剤と接触させ、検体中の
エンドトキシンと該測定剤中の少なくともエンドトキシ
ン感受性因子とを反応させることにより、基質の変化を
測定することを特徴とするエンドトキシンの測定法、あ
るいは、検体溶液を該固相系反応用エンドトキシン特異
的測定剤と接触させ、次いで検体溶液を分離除去した
後、必要に応じて洗浄し、さらにカブトガニ・アメボサ
イト・ライセート単独または該ライセートおよびクロッ
ティングエンザイムの合成基質と接触させて、該ライセ
ートまたは合成基質の変化を測定することを特徴とする
エンドトキシンの測定法を提供するものである。
応用エンドトキシン特異的測定剤と接触させ、検体中の
エンドトキシンと該測定剤中の少なくともエンドトキシ
ン感受性因子とを反応させることにより、基質の変化を
測定することを特徴とするエンドトキシンの測定法、あ
るいは、検体溶液を該固相系反応用エンドトキシン特異
的測定剤と接触させ、次いで検体溶液を分離除去した
後、必要に応じて洗浄し、さらにカブトガニ・アメボサ
イト・ライセート単独または該ライセートおよびクロッ
ティングエンザイムの合成基質と接触させて、該ライセ
ートまたは合成基質の変化を測定することを特徴とする
エンドトキシンの測定法を提供するものである。
【００１２】さらに本発明は、カブトガニ・アメボサイ
ト由来の少なくともエンドトキシン感受性因子を、不溶
性担体に物理的または化学的に固定化することを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。以下、本発明の第１の製造法と
いう。特に本発明は、上記製造法において、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートまたはそれを含む液体を、
少なくともエンドトキシン感受性因子を特異的に吸着
し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を吸着し
ない不溶性担体に接触させ、少なくともエンドトキシン
感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１→３）−β−
Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含まず、エンドトキ
シンと特異的に反応する不溶性担体を得ることを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。
ト由来の少なくともエンドトキシン感受性因子を、不溶
性担体に物理的または化学的に固定化することを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。以下、本発明の第１の製造法と
いう。特に本発明は、上記製造法において、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートまたはそれを含む液体を、
少なくともエンドトキシン感受性因子を特異的に吸着
し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を吸着し
ない不溶性担体に接触させ、少なくともエンドトキシン
感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１→３）−β−
Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含まず、エンドトキ
シンと特異的に反応する不溶性担体を得ることを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。
【００１３】本発明の第２の製造法は、カブトガニ・ア
メボサイト・ライセートを（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン感受性因子除去処理に付すことによって得られた、
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含
まず、エンドトキシン感受性因子を含むカブトガニ・ア
メボサイト・ライセート処理物を用い、少なくともエン
ドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理的または化
学的に固定化することを特徴とする固相系反応用エンド
トキシン特異的測定剤の製造法である。
メボサイト・ライセートを（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン感受性因子除去処理に付すことによって得られた、
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含
まず、エンドトキシン感受性因子を含むカブトガニ・ア
メボサイト・ライセート処理物を用い、少なくともエン
ドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理的または化
学的に固定化することを特徴とする固相系反応用エンド
トキシン特異的測定剤の製造法である。
【００１４】更に、本発明の第３の製造法は、（１→
３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子活性化阻害剤をカブ
トガニ・アメボサイト・ライセートに添加した後、少な
くともエンドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理
的または化学的に固定化することを特徴とする固相系反
応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法を提供する。
以下本発明を、より詳細に説明する。
３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子活性化阻害剤をカブ
トガニ・アメボサイト・ライセートに添加した後、少な
くともエンドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理
的または化学的に固定化することを特徴とする固相系反
応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法を提供する。
以下本発明を、より詳細に説明する。
【００１５】本発明のEt特異的測定剤は、少なくともEt
感受性因子が固定化され、かつ特異的にEtと反応し、更
に、図１におけるＧ因子（以下、β−グルカン感受性因
子をＧ因子ということもある）とβ−グルカンとの反応
が生起し得ないよう調製されたものであるから、適当な
基質の変化からEtが定量できるのである。従って、該Ｇ
因子は、その活性化がＧ因子活性化阻害剤等により抑制
されるならば、本発明のEt測定剤に含まれてもかまわな
い（前述の第３の製造法参照）。
感受性因子が固定化され、かつ特異的にEtと反応し、更
に、図１におけるＧ因子（以下、β−グルカン感受性因
子をＧ因子ということもある）とβ−グルカンとの反応
が生起し得ないよう調製されたものであるから、適当な
基質の変化からEtが定量できるのである。従って、該Ｇ
因子は、その活性化がＧ因子活性化阻害剤等により抑制
されるならば、本発明のEt測定剤に含まれてもかまわな
い（前述の第３の製造法参照）。
【００１６】また、本発明のEt特異的測定剤には、少な
くともEt感受性因子（日本産カブトガニではＣ因子；以
下Et感受性因子をＣ因子ということもある）が不溶性担
体に固定化された状態で含まれることが必要であり、図
１のエンドトキシンによるＣ因子の活性化を引き金とす
るカスケード反応のＣ因子以外の成分（Ｂ因子、プロク
ロッティングエンザイム、コアギュローゲン）のうちの
任意の１種以上の成分を含んでいてもよい。
くともEt感受性因子（日本産カブトガニではＣ因子；以
下Et感受性因子をＣ因子ということもある）が不溶性担
体に固定化された状態で含まれることが必要であり、図
１のエンドトキシンによるＣ因子の活性化を引き金とす
るカスケード反応のＣ因子以外の成分（Ｂ因子、プロク
ロッティングエンザイム、コアギュローゲン）のうちの
任意の１種以上の成分を含んでいてもよい。
【００１７】本発明に使用される不溶性担体は、少なく
ともEt感受性因子を物理的に固定化するのか、あるいは
化学的に固定化するかなどの固定化法の相違、Etの測定
法の相違、本測定剤の構成の相違等によって適宜選択さ
れ得る。本発明において、「固定化」とは、例えば、Et
感受性因子を例に取れば、Et感受性因子が不溶性担体に
物理的または化学的に結合し、Etと反応する活性が実質
的に低下せず、Etを測定する際の反応液に実質的に溶解
しない状態となることをいう。
ともEt感受性因子を物理的に固定化するのか、あるいは
化学的に固定化するかなどの固定化法の相違、Etの測定
法の相違、本測定剤の構成の相違等によって適宜選択さ
れ得る。本発明において、「固定化」とは、例えば、Et
感受性因子を例に取れば、Et感受性因子が不溶性担体に
物理的または化学的に結合し、Etと反応する活性が実質
的に低下せず、Etを測定する際の反応液に実質的に溶解
しない状態となることをいう。
【００１８】したがって、本発明の固定化は、酵素の固
定化法として公知の方法〔「固定化酵素」、１０７頁、
１９７５年、（株）講談社発行；「応用酵素学」、２８
〜３１頁、１９８０年、（株）講談社発行〕を用いてEt
感受性因子等を不溶性の担体に物理的または化学的に結
合することによって行うことができる。ここで、物理的
な結合とは、不溶性担体とEt感受性因子等を、一定時間
インキュベートすることによって生起する結合をいう。
この方法は、上記文献では「物理吸着法」または「イオ
ン結合法」と称されている。また、化学的な結合とは、
化学的架橋試薬を使用するか、担体またはEt感受性因子
等の官能基を化学的に活性化し、両者を不可逆的に結合
することをいう。この方法は、上記文献では「共有結合
法」と称されている。
定化法として公知の方法〔「固定化酵素」、１０７頁、
１９７５年、（株）講談社発行；「応用酵素学」、２８
〜３１頁、１９８０年、（株）講談社発行〕を用いてEt
感受性因子等を不溶性の担体に物理的または化学的に結
合することによって行うことができる。ここで、物理的
な結合とは、不溶性担体とEt感受性因子等を、一定時間
インキュベートすることによって生起する結合をいう。
この方法は、上記文献では「物理吸着法」または「イオ
ン結合法」と称されている。また、化学的な結合とは、
化学的架橋試薬を使用するか、担体またはEt感受性因子
等の官能基を化学的に活性化し、両者を不可逆的に結合
することをいう。この方法は、上記文献では「共有結合
法」と称されている。
【００１９】不溶性担体に、少なくともEt感受性因子を
固定化させる方法は、担体の種類によって異なる。担体
には、ライセートをそのまま単に担体と接触させるだ
けで少なくともEt感受性因子が特異的に担体に物理的に
固定化されるもの（第１の製造法）、ライセートをβ
−グルカン感受性因子除去処理に付し、β−グルカン感
受性因子（Ｇ因子）を実質的に含まないライセート処理
物を調製し、これと担体を接触させることによって少な
くともEt感受性因子が担体に物理的に固定化されるもの
（第２の製造法）、または該ライセート処理物を使用
し、化学的な固定化法（共有結合法）を施すことによっ
て少なくともEt感受性因子が担体に化学的に固定化され
るもの、β−グルカン感受性因子活性化阻害剤を含む
ライセートを使用して、担体に少なくともエンドトキシ
ン感受性因子が物理的または化学的に固定化されるもの
（第３の製造法）等がある。第３の製造法におけるEt感
受性因子の固定化は、上記と同様の物理的または化学的
方法によって行うことができる。
固定化させる方法は、担体の種類によって異なる。担体
には、ライセートをそのまま単に担体と接触させるだ
けで少なくともEt感受性因子が特異的に担体に物理的に
固定化されるもの（第１の製造法）、ライセートをβ
−グルカン感受性因子除去処理に付し、β−グルカン感
受性因子（Ｇ因子）を実質的に含まないライセート処理
物を調製し、これと担体を接触させることによって少な
くともEt感受性因子が担体に物理的に固定化されるもの
（第２の製造法）、または該ライセート処理物を使用
し、化学的な固定化法（共有結合法）を施すことによっ
て少なくともEt感受性因子が担体に化学的に固定化され
るもの、β−グルカン感受性因子活性化阻害剤を含む
ライセートを使用して、担体に少なくともエンドトキシ
ン感受性因子が物理的または化学的に固定化されるもの
（第３の製造法）等がある。第３の製造法におけるEt感
受性因子の固定化は、上記と同様の物理的または化学的
方法によって行うことができる。
【００２０】第１の製造法で使用される担体としては、
ポリアミド系不溶性担体（酸アミド結合の繰り返しによ
って主鎖を構成する結晶性の線状高分子物質で、ジアミ
ンとジカルボン酸との重縮合物ないしは、ω−アミノカ
ルボン酸または相当するラクタムから重縮合によって合
成された化合物（例えばナイロン６、ナイロン66等））
およびセルロース系不溶性担体（セルロース、セルロー
スエステル（例、酢酸セルロース、硝酸セルロース
等）、アミノエチル−、ブロモアセチル−、ホスホ−、
カルボキシメチル−等の置換基を有するセルロース誘導
体、カルボキシメチルセルロースのヒドラジド誘導体
等）を挙げることができる。このような担体へのEt感受
性因子等の吸着固定化操作は、ライセートまたはそれを
含む液体（ライセートに、必要に応じてデキストラン、
２価金属塩、各種緩衝剤を添加したもの等）と上記担体
とを、Et感受性因子等が担体に吸着固定化されるに十分
な条件下（例えば、０〜４０℃、数秒〜数日）で接触さ
せればよい。両者の接触方法は、公知の固液接触手段に
よればよく、例えば、フィルター状の担体にライセート
を通液させる方法；粒状の担体を充填したカラムにライ
セートを通液させる方法；マイクロプレート状の担体の
ウェルにライセートを入れ、一定時間静置した後、ライ
セートを除去する方法；任意の形状の担体をライセート
に添加し、一定時間振盪するか、静置し、通常の固液分
離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーション等）
によってライセートを除去する方法等を一例に挙げるこ
とができる。なお、この場合、ライセートを接触させる
際にライセート中にデキストランを添加しておくと、Et
感受性因子の吸着効果が高まる。デキストランとしては
平均分子量5,000〜5,000,000、好ましくは10,000〜100,
000の範囲を挙げることができる。第２または第３の方
法による場合は、単に接触させるだけでよい担体として
は、ポリアミド系、セルロース系、ポリスチレン系、ポ
リプロピレン系およびシリカ系の不溶性担体を挙げるこ
とができ、化学的な固定化方法を用いる担体としては、
ポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアク
リルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グ
リシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタク
リレートとの多孔性共重合体）の不溶性担体を挙げるこ
とができる。化学的な固定化法としては、担体の芳香族
アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化
法、担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合
させるＣＮＢｒ法、担体のヒドラジン誘導体等を用いて
ペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に
富む担体の官能基を利用して蛋白質をアルキル化するア
ルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ
基と反応する架橋試薬によって担体と蛋白質の遊離のア
ミノ基の間を架橋する方法等の公知の固定化法から担体
の種類に応じて適宜に選択して本発明によるEt感受性因
子等の固定化に利用することができる。例えば、セルロ
ースゲル担体にホルミル基を導入したホルミル−セルロ
ファインや２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトル
エン−４−スルホン酸（ＦＭＰ）を導入したＦＭＰ活性
化セルロファイン（共に生化学工業（株）販売）の該ホ
ルミル基とEt感受性因子等のアミノ基とを結合させた
り、ＦＭＰとEt感受性因子等のアミノ基あるいはチオー
ル基と置換反応に供し、２級アミンあるいはチオエーテ
ル結合を形成することができる。
ポリアミド系不溶性担体（酸アミド結合の繰り返しによ
って主鎖を構成する結晶性の線状高分子物質で、ジアミ
ンとジカルボン酸との重縮合物ないしは、ω−アミノカ
ルボン酸または相当するラクタムから重縮合によって合
成された化合物（例えばナイロン６、ナイロン66等））
およびセルロース系不溶性担体（セルロース、セルロー
スエステル（例、酢酸セルロース、硝酸セルロース
等）、アミノエチル−、ブロモアセチル−、ホスホ−、
カルボキシメチル−等の置換基を有するセルロース誘導
体、カルボキシメチルセルロースのヒドラジド誘導体
等）を挙げることができる。このような担体へのEt感受
性因子等の吸着固定化操作は、ライセートまたはそれを
含む液体（ライセートに、必要に応じてデキストラン、
２価金属塩、各種緩衝剤を添加したもの等）と上記担体
とを、Et感受性因子等が担体に吸着固定化されるに十分
な条件下（例えば、０〜４０℃、数秒〜数日）で接触さ
せればよい。両者の接触方法は、公知の固液接触手段に
よればよく、例えば、フィルター状の担体にライセート
を通液させる方法；粒状の担体を充填したカラムにライ
セートを通液させる方法；マイクロプレート状の担体の
ウェルにライセートを入れ、一定時間静置した後、ライ
セートを除去する方法；任意の形状の担体をライセート
に添加し、一定時間振盪するか、静置し、通常の固液分
離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーション等）
によってライセートを除去する方法等を一例に挙げるこ
とができる。なお、この場合、ライセートを接触させる
際にライセート中にデキストランを添加しておくと、Et
感受性因子の吸着効果が高まる。デキストランとしては
平均分子量5,000〜5,000,000、好ましくは10,000〜100,
000の範囲を挙げることができる。第２または第３の方
法による場合は、単に接触させるだけでよい担体として
は、ポリアミド系、セルロース系、ポリスチレン系、ポ
リプロピレン系およびシリカ系の不溶性担体を挙げるこ
とができ、化学的な固定化方法を用いる担体としては、
ポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアク
リルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系（グ
リシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタク
リレートとの多孔性共重合体）の不溶性担体を挙げるこ
とができる。化学的な固定化法としては、担体の芳香族
アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化
法、担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合
させるＣＮＢｒ法、担体のヒドラジン誘導体等を用いて
ペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に
富む担体の官能基を利用して蛋白質をアルキル化するア
ルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ
基と反応する架橋試薬によって担体と蛋白質の遊離のア
ミノ基の間を架橋する方法等の公知の固定化法から担体
の種類に応じて適宜に選択して本発明によるEt感受性因
子等の固定化に利用することができる。例えば、セルロ
ースゲル担体にホルミル基を導入したホルミル−セルロ
ファインや２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトル
エン−４−スルホン酸（ＦＭＰ）を導入したＦＭＰ活性
化セルロファイン（共に生化学工業（株）販売）の該ホ
ルミル基とEt感受性因子等のアミノ基とを結合させた
り、ＦＭＰとEt感受性因子等のアミノ基あるいはチオー
ル基と置換反応に供し、２級アミンあるいはチオエーテ
ル結合を形成することができる。
【００２１】上記第２の製造法によって、Et感受性因子
等が吸着固定化された担体を製造する際に不溶性担体と
ライセートもしくはその処理物との接触方法も基本的に
は上記の第１の製造法の場合と同様である。なお、ポリ
アミド系、セルロース系の不溶性担体のようなEt感受性
因子が特異的に吸着固定化される担体を使用する場合で
あっても、上記ライセート処理物を用いて化学的な固定
化方法で担体に固定化してもよい。
等が吸着固定化された担体を製造する際に不溶性担体と
ライセートもしくはその処理物との接触方法も基本的に
は上記の第１の製造法の場合と同様である。なお、ポリ
アミド系、セルロース系の不溶性担体のようなEt感受性
因子が特異的に吸着固定化される担体を使用する場合で
あっても、上記ライセート処理物を用いて化学的な固定
化方法で担体に固定化してもよい。
【００２２】本発明に使用する不溶性担体の形状として
は、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜
形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイク
ロプレート状等の形態を有するものを挙げることができ
る。本発明の測定剤の必須固定化成分であるEt感受性因
子はカブトガニ・アメボサイトから得られる、Etと特異
的に反応する因子で、通常Ｃ因子と称され、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートから製造される。該ライセ
ートとしては、リムルス・ポリフェムス（Limulus poly
phemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus
tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus g
igas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Ca
rcinoscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ
液から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-
1021(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げるこ
とができる。また、本発明の第２の製造法において、該
ライセートからβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）を実
質的に含まないライセート処理物を調製する際のライセ
ートの処理法は公知の方法から適宜に選択して利用する
ことができる。例えば、ゲル濾過、ヘパリンもしくはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィー、スルホプロピル基を有するイオ
ン交換樹脂等により分画し、ライセートからＧ因子を実
質的に含まないライセート処理物を得ることができる
（特公平3-23869、Nakamura T. et al., Eur. J. Bioch
em., 154, 511-521(1986)、Clin. Chim. Acta，149，
55-65(1985)、特開平3-75565）。本発明によりEtを測定
する試料は、基本的には特に制限なくEtの定量あるいは
その存否を測定あるいは確認する要請があるものであれ
ばよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用す
る水等を挙げることができる。特に、乳汁、尿、その他
着色物等の濁り、色素等を有する検体であっても特別な
前処理なしにそのまま測定に供することができるという
利点を有する。
は、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜
形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイク
ロプレート状等の形態を有するものを挙げることができ
る。本発明の測定剤の必須固定化成分であるEt感受性因
子はカブトガニ・アメボサイトから得られる、Etと特異
的に反応する因子で、通常Ｃ因子と称され、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートから製造される。該ライセ
ートとしては、リムルス・ポリフェムス（Limulus poly
phemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus
tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus g
igas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Ca
rcinoscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ
液から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-
1021(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げるこ
とができる。また、本発明の第２の製造法において、該
ライセートからβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）を実
質的に含まないライセート処理物を調製する際のライセ
ートの処理法は公知の方法から適宜に選択して利用する
ことができる。例えば、ゲル濾過、ヘパリンもしくはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィー、スルホプロピル基を有するイオ
ン交換樹脂等により分画し、ライセートからＧ因子を実
質的に含まないライセート処理物を得ることができる
（特公平3-23869、Nakamura T. et al., Eur. J. Bioch
em., 154, 511-521(1986)、Clin. Chim. Acta，149，
55-65(1985)、特開平3-75565）。本発明によりEtを測定
する試料は、基本的には特に制限なくEtの定量あるいは
その存否を測定あるいは確認する要請があるものであれ
ばよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用す
る水等を挙げることができる。特に、乳汁、尿、その他
着色物等の濁り、色素等を有する検体であっても特別な
前処理なしにそのまま測定に供することができるという
利点を有する。
【００２３】本発明の測定剤を用いてEtを測定するに
は、Etとの反応によるＣ因子の変化、またはＣ因子のEt
による活性化を引き金とするＣ因子系の変化を、酵素反
応による基質の変化として測定できる。このような基質
としては、特に制限はないが、合成基質（例、活性型Ｃ
因子の基質であるBoc-Val-Pro-Arg-pNA 、クロッティン
グエンザイムの基質でもあるBoc-Leu-Gly-Arg-pNA 等)
または天然基質であるコアギュローゲンが挙げられる。
は、Etとの反応によるＣ因子の変化、またはＣ因子のEt
による活性化を引き金とするＣ因子系の変化を、酵素反
応による基質の変化として測定できる。このような基質
としては、特に制限はないが、合成基質（例、活性型Ｃ
因子の基質であるBoc-Val-Pro-Arg-pNA 、クロッティン
グエンザイムの基質でもあるBoc-Leu-Gly-Arg-pNA 等)
または天然基質であるコアギュローゲンが挙げられる。
【００２４】ここで、Ｃ因子の変化とは、EtによるＣ因
子の活性型Ｃ因子への変換をいい、Ｃ因子系の変化とは
上記Ｃ因子の活性化とそれに続くＢ因子およびプロクロ
ティングエンザイムの連鎖的活性化（カスケード反応）
による反応系の変化をいう。従って、その測定とは、カ
スケード反応における活性型の各因子の任意のものの酵
素活性の定量的または定性的な測定を意味する。
子の活性型Ｃ因子への変換をいい、Ｃ因子系の変化とは
上記Ｃ因子の活性化とそれに続くＢ因子およびプロクロ
ティングエンザイムの連鎖的活性化（カスケード反応）
による反応系の変化をいう。従って、その測定とは、カ
スケード反応における活性型の各因子の任意のものの酵
素活性の定量的または定性的な測定を意味する。
【００２５】合成基質を使用する測定法としては、従来
公知の方法が適用でき、例えば、ペプチドのＣ末端のア
ルギニンのカルボキシル基に公知の発色性残基、発蛍光
性残基、発光性残基あるいはアンモニアなどがアミド結
合により置換したペプチド合成基質を使用することがで
きる。活性型Ｃ因子またはクロッティングエンザイム等
の上記他の因子がこれらの合成基質に作用して生成する
反応生成物を測定することによって、そのアミダーゼ活
性の測定を行うことができる。具体的には、合成基質と
して（Ａ）活性型Ｃ因子に対するペプチド合成基質を使
用する方法、または（Ｂ）クロッティングエンザイムに
対するペプチド合成基質を使用する方法が例示される。
より具体的には、例えば、上記（Ａ）の場合、（Ａ−
１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を接触させて固
相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存させたまま、
もしくは分離した後、活性化されたＣ因子と基質とを接
触させる方法、（Ａ−２）測定試料と本発明の測定剤と
基質を同時に接触させ、Ｃ因子の活性化と活性型Ｃ因子
による基質の分解反応を同時に行う方法等を採用するこ
とができる。また、上記（Ｂ）の場合、前記カスケード
反応によってプロクロッティングエンザイムを活性化す
る必要があるので、測定に際して固定化されたＣ因子以
外にＢ因子およびクロッティングエンザイムを存在させ
る必要がある。これら他の因子は分画されたものであっ
てもよいが、Ｇ因子を除去するか、あるいはＧ因子の活
性化が実質的に阻害されたライセートをこれら因子とし
て使用してもよい。さらに、EtによるＣ因子の活性化
後、測定試料を不溶性担体から分離し、担体上の活性化
されたＣ因子と上記他の因子を接触させる場合には、Ｇ
因子を含む通常のライセートを上記他の因子の供給源と
して使用することも可能である。従って、上記（Ｂ）の
場合、具体的には、例えば、（Ｂ−１）Etを含む測定試
料と本発明の測定剤を接触させて固相上でＣ因子を活性
化し、測定試料を共存させたままの状態で、分画された
上記他の因子もしくはＧ因子の活性化が阻害された状態
のライセートと基質とを活性化されたＣ因子に接触させ
る方法、（Ｂ−２）測定試料と本発明の測定剤を接触さ
せて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を分離した
後、活性化されたＣ因子とライセートを接触させる方
法、（Ｂ−３）測定試料と本発明の測定剤と分画された
上記他の因子もしくはＧ因子の活性化が阻害された状態
のライセートと基質を同時に接触させ、カスケード反応
によるプロクロッティングエンザイムの活性化とクロッ
ティングエンザイムによる基質の分解反応を同時に行う
方法等を採用することができる。
公知の方法が適用でき、例えば、ペプチドのＣ末端のア
ルギニンのカルボキシル基に公知の発色性残基、発蛍光
性残基、発光性残基あるいはアンモニアなどがアミド結
合により置換したペプチド合成基質を使用することがで
きる。活性型Ｃ因子またはクロッティングエンザイム等
の上記他の因子がこれらの合成基質に作用して生成する
反応生成物を測定することによって、そのアミダーゼ活
性の測定を行うことができる。具体的には、合成基質と
して（Ａ）活性型Ｃ因子に対するペプチド合成基質を使
用する方法、または（Ｂ）クロッティングエンザイムに
対するペプチド合成基質を使用する方法が例示される。
より具体的には、例えば、上記（Ａ）の場合、（Ａ−
１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を接触させて固
相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存させたまま、
もしくは分離した後、活性化されたＣ因子と基質とを接
触させる方法、（Ａ−２）測定試料と本発明の測定剤と
基質を同時に接触させ、Ｃ因子の活性化と活性型Ｃ因子
による基質の分解反応を同時に行う方法等を採用するこ
とができる。また、上記（Ｂ）の場合、前記カスケード
反応によってプロクロッティングエンザイムを活性化す
る必要があるので、測定に際して固定化されたＣ因子以
外にＢ因子およびクロッティングエンザイムを存在させ
る必要がある。これら他の因子は分画されたものであっ
てもよいが、Ｇ因子を除去するか、あるいはＧ因子の活
性化が実質的に阻害されたライセートをこれら因子とし
て使用してもよい。さらに、EtによるＣ因子の活性化
後、測定試料を不溶性担体から分離し、担体上の活性化
されたＣ因子と上記他の因子を接触させる場合には、Ｇ
因子を含む通常のライセートを上記他の因子の供給源と
して使用することも可能である。従って、上記（Ｂ）の
場合、具体的には、例えば、（Ｂ−１）Etを含む測定試
料と本発明の測定剤を接触させて固相上でＣ因子を活性
化し、測定試料を共存させたままの状態で、分画された
上記他の因子もしくはＧ因子の活性化が阻害された状態
のライセートと基質とを活性化されたＣ因子に接触させ
る方法、（Ｂ−２）測定試料と本発明の測定剤を接触さ
せて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を分離した
後、活性化されたＣ因子とライセートを接触させる方
法、（Ｂ−３）測定試料と本発明の測定剤と分画された
上記他の因子もしくはＧ因子の活性化が阻害された状態
のライセートと基質を同時に接触させ、カスケード反応
によるプロクロッティングエンザイムの活性化とクロッ
ティングエンザイムによる基質の分解反応を同時に行う
方法等を採用することができる。
【００２６】活性型Ｃ因子、クロッティングエンザイム
等の活性化された因子による合成基質の分解反応（さら
に、必要に応じて分解反応生成物の他色素等への変換反
応）によって生成する色素、蛍光物質、発光物質または
アンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭62-148860
、特開平3-75565 ）等によって測定し、必要に応じて
その測定値をEt標準物質を用いて測定した結果と比較す
ることによってEtを定量もしくは検出することができ
る。
等の活性化された因子による合成基質の分解反応（さら
に、必要に応じて分解反応生成物の他色素等への変換反
応）によって生成する色素、蛍光物質、発光物質または
アンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭62-148860
、特開平3-75565 ）等によって測定し、必要に応じて
その測定値をEt標準物質を用いて測定した結果と比較す
ることによってEtを定量もしくは検出することができ
る。
【００２７】なお、上記（Ａ−２）または（Ｂ−３）の
方法による場合、Ｃ因子が固定化された不溶性担体に合
成基質、必要に応じて上記他の因子を吸着させた系によ
る反応〔化学と生物, 25(6), 379-386(1987); Clin. Ch
em., 24, 1343(1978); 特開昭６２−１３４５６３〕に
よるEtの特異的測定剤とすることもできる。また、基質
として、上記クロッティングエンザイムの合成基質の代
わりにコアギュローゲンを使用してもよい。この場合、
Ｃ因子系の変化の測定は、酵素反応によるゲル形成の有
無を肉眼的に判定するか、光学的に検知すればよい。
〔Stanley W. Watson ら編集、「Endotoxins And Their
Detection With The LimulusAmebocyte Lysate Test
」, pp.161-171, 1982年, Alan R. Liss, INC. ;Chem.
Pharm. Bull., 36(8), 3012-3019(1988); J. Parentera
l Sci. Technol., 40(6), 284-286(1988) 〕。
方法による場合、Ｃ因子が固定化された不溶性担体に合
成基質、必要に応じて上記他の因子を吸着させた系によ
る反応〔化学と生物, 25(6), 379-386(1987); Clin. Ch
em., 24, 1343(1978); 特開昭６２−１３４５６３〕に
よるEtの特異的測定剤とすることもできる。また、基質
として、上記クロッティングエンザイムの合成基質の代
わりにコアギュローゲンを使用してもよい。この場合、
Ｃ因子系の変化の測定は、酵素反応によるゲル形成の有
無を肉眼的に判定するか、光学的に検知すればよい。
〔Stanley W. Watson ら編集、「Endotoxins And Their
Detection With The LimulusAmebocyte Lysate Test
」, pp.161-171, 1982年, Alan R. Liss, INC. ;Chem.
Pharm. Bull., 36(8), 3012-3019(1988); J. Parentera
l Sci. Technol., 40(6), 284-286(1988) 〕。
【００２８】本発明の測定剤を使用してEtの測定を行う
際に、反応系にＣ因子の活性化に有効な２価金属塩を共
存させる必要がある。この共存形態としては、測定時に
基質溶液または測定試料等に添加しても、予め不溶性担
体に吸着させておいてもかまわない。このような２価金
属塩としては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩
化物など）、硫酸塩等が例示される。
際に、反応系にＣ因子の活性化に有効な２価金属塩を共
存させる必要がある。この共存形態としては、測定時に
基質溶液または測定試料等に添加しても、予め不溶性担
体に吸着させておいてもかまわない。このような２価金
属塩としては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩
化物など）、硫酸塩等が例示される。
【００２９】
【作用】本発明によれば、不溶性担体にEt感受性因子の
活性が損なわれることなく、ライセート中のEt感受性因
子が物理的または化学的に固定化され、該担体によりEt
に特異的に反応する固相系でのEt測定剤が得られる。
活性が損なわれることなく、ライセート中のEt感受性因
子が物理的または化学的に固定化され、該担体によりEt
に特異的に反応する固相系でのEt測定剤が得られる。
【００３０】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ カブトガニ (T. tridentatus) 血リンパ液2.7Lを４℃、
1,500rpmで10分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイ
ト）60gを20gずつに分割し、各々に200mLの0.02Mトリス
ー塩酸緩衝液 (pH8.0) を加え、ホモゲナイザー（ポリ
トロンR PT10（商品名）、Kinematica社製造）にて均一
に破砕および抽出し、10,000×Ｇで30分間冷却遠心し、
上澄液（ライセート）550mLを得た。このライセート2mL
を孔径0.20μmのポリアミド系膜であるナイロン膜フィ
ルター（ナルゲンシリンジフィルター（商品名）、直径
25mm、ナルジェ社製）に室温で５秒間かけて通過させた
後、0.02Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0) を50mL通過させ
てよく洗浄し、ナイロン膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Et感受性因子吸着ナイロン膜という）。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ カブトガニ (T. tridentatus) 血リンパ液2.7Lを４℃、
1,500rpmで10分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイ
ト）60gを20gずつに分割し、各々に200mLの0.02Mトリス
ー塩酸緩衝液 (pH8.0) を加え、ホモゲナイザー（ポリ
トロンR PT10（商品名）、Kinematica社製造）にて均一
に破砕および抽出し、10,000×Ｇで30分間冷却遠心し、
上澄液（ライセート）550mLを得た。このライセート2mL
を孔径0.20μmのポリアミド系膜であるナイロン膜フィ
ルター（ナルゲンシリンジフィルター（商品名）、直径
25mm、ナルジェ社製）に室温で５秒間かけて通過させた
後、0.02Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0) を50mL通過させ
てよく洗浄し、ナイロン膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Et感受性因子吸着ナイロン膜という）。
【００３１】Et感受性因子吸着ナイロン膜を４枚用意
し、各々ほぼ３mm角に細断して、４本の試験管に入れ、
その試験管３本に蒸留水（以下DW）、大腸菌 (Escheric
hia coli)Olll:B4 由来Et（シグマ社販売のWestphal t
ype）または下記調製法により調製したβ−グルカンを
それぞれ0.1mL加え、残り１本の試験管にはそれぞれ２
倍濃度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。この
すべての試験管に0.04M塩化マグネシウム含有0.3Mトリ
スー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.1mLと2.2mM t-ブトキシカル
ボニル−バリル−プロリル−アルギニン−パラニトロア
ニリド (以下Boc-Val-Pro-Arg-pNA)0.1mLを添加し、37
℃、30分間加温して反応させた。加温中、５分ごとに試
験管ミキサーにて10秒間攪拌した。30分後に1.2M酢酸0.
3mLを加えて反応を停止させ、遊離したパラニトロアニ
リンの吸収を405nmの吸光度を測定、本発明の測定剤の
反応性を検討した。
し、各々ほぼ３mm角に細断して、４本の試験管に入れ、
その試験管３本に蒸留水（以下DW）、大腸菌 (Escheric
hia coli)Olll:B4 由来Et（シグマ社販売のWestphal t
ype）または下記調製法により調製したβ−グルカンを
それぞれ0.1mL加え、残り１本の試験管にはそれぞれ２
倍濃度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。この
すべての試験管に0.04M塩化マグネシウム含有0.3Mトリ
スー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.1mLと2.2mM t-ブトキシカル
ボニル−バリル−プロリル−アルギニン−パラニトロア
ニリド (以下Boc-Val-Pro-Arg-pNA)0.1mLを添加し、37
℃、30分間加温して反応させた。加温中、５分ごとに試
験管ミキサーにて10秒間攪拌した。30分後に1.2M酢酸0.
3mLを加えて反応を停止させ、遊離したパラニトロアニ
リンの吸収を405nmの吸光度を測定、本発明の測定剤の
反応性を検討した。
【００３２】その結果を表１に示した。この結果から、
ライセートをポリアミド系膜であるナイロン膜フィルタ
ーを通過させて調製したEt感受性因子吸着担体を使用す
れば、β−グルカンの影響を受けずに、Etを特異的に測
定することができることがわかる。言い換えれば、本発
明の不溶性担体を含む測定剤には、Ｇ因子が実質的に含
まれないことを証明している。
ライセートをポリアミド系膜であるナイロン膜フィルタ
ーを通過させて調製したEt感受性因子吸着担体を使用す
れば、β−グルカンの影響を受けずに、Etを特異的に測
定することができることがわかる。言い換えれば、本発
明の不溶性担体を含む測定剤には、Ｇ因子が実質的に含
まれないことを証明している。
【００３３】
【表１】
【００３４】（β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開
WO90/02951に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬
工業（株）販売）の１gを約100mLの５mM NaOH水溶液に
懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーターTM（大岳製
作所、型式5202PZT、東京）により20KHZ、80Wで12分間
音波処理による低分子化を行った。処理液を５M NaOH水
溶液を用い、最終0.3M水溶液とし、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（GPCカラム：TSK gel G3000PWXL
２本、G250OPWXL １本、移動相：0.3M NaOH水溶液、流
速0.5mL/min）により分画採取し、再クロマトグラフィ
ーにより分子量216,000画分を分画採取し、GPC分画精製
標品β−グルカン標品を得た。
WO90/02951に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬
工業（株）販売）の１gを約100mLの５mM NaOH水溶液に
懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーターTM（大岳製
作所、型式5202PZT、東京）により20KHZ、80Wで12分間
音波処理による低分子化を行った。処理液を５M NaOH水
溶液を用い、最終0.3M水溶液とし、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（GPCカラム：TSK gel G3000PWXL
２本、G250OPWXL １本、移動相：0.3M NaOH水溶液、流
速0.5mL/min）により分画採取し、再クロマトグラフィ
ーにより分子量216,000画分を分画採取し、GPC分画精製
標品β−グルカン標品を得た。
【００３５】実施例２ カブトガニ (L. polyphemus) 血リンパ液1.0Lを４℃、
1,500rpmで10分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイ
ト）19gに190mLの0.02Mトリスー塩酸緩衝液(pH8.0)を加
え、ホモゲナイザー（ポリトロンR PT10）にて均一に
破砕および抽出し、10,000×Ｇで30分間冷却遠心し、上
澄液（ライセート）170mLを得た。
1,500rpmで10分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイ
ト）19gに190mLの0.02Mトリスー塩酸緩衝液(pH8.0)を加
え、ホモゲナイザー（ポリトロンR PT10）にて均一に
破砕および抽出し、10,000×Ｇで30分間冷却遠心し、上
澄液（ライセート）170mLを得た。
【００３６】このライセートに15%デキストラン（分子
量40,000）水溶液を等容量加えて混合し（以下LD混
液）、以下の方法で３種のEt感受性因子吸着膜を調製し
た。このLD混液8mLを孔径0.22μmのセルロースエステル
膜フィルター（ステリフィルD-GS（商品名）、酢酸セル
ロースと硝酸セルロースとの混合物、直径47mm、ミリポ
ア社製）に室温で１０秒間かけて通過させた後、0.02M
トリスー塩酸緩衝液(pH8.0) を50mL通過させてよく洗浄
し、セルロースエステル膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Ａ剤という）。孔径0.20μmのセルロースアセテ
ート膜フィルター（ナルゲンフィルターウェア（商品
名）、直径47mm、ナルジェ社製）および孔径0.20μmの
セルロースニトレート膜フィルター（ナルゲンフィルタ
ーウェア（商品名）、直径47mm、ナルジェ社製）につい
ても同様にＬＤ混液8mLをそれぞれ通過させ、緩衝液で
洗浄して、それぞれの膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Ｂ剤、Ｃ剤という）。
量40,000）水溶液を等容量加えて混合し（以下LD混
液）、以下の方法で３種のEt感受性因子吸着膜を調製し
た。このLD混液8mLを孔径0.22μmのセルロースエステル
膜フィルター（ステリフィルD-GS（商品名）、酢酸セル
ロースと硝酸セルロースとの混合物、直径47mm、ミリポ
ア社製）に室温で１０秒間かけて通過させた後、0.02M
トリスー塩酸緩衝液(pH8.0) を50mL通過させてよく洗浄
し、セルロースエステル膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Ａ剤という）。孔径0.20μmのセルロースアセテ
ート膜フィルター（ナルゲンフィルターウェア（商品
名）、直径47mm、ナルジェ社製）および孔径0.20μmの
セルロースニトレート膜フィルター（ナルゲンフィルタ
ーウェア（商品名）、直径47mm、ナルジェ社製）につい
ても同様にＬＤ混液8mLをそれぞれ通過させ、緩衝液で
洗浄して、それぞれの膜にEt感受性因子を吸着させた
（以下Ｂ剤、Ｃ剤という）。
【００３７】Ａ〜Ｃ剤を各々ほぼ５mm角に細断して、各
４本の試験管に入れ、その試験管各３本にDW、E. coli
Olll:B4由来Etまたはβ-グルカンを0.1mL加え、残り各
１本の試験管にはそれぞれ２倍濃度のEtとβ-グルカン
を0.05mLずつ添加した。このすべての試験管に0.08M塩
化マグネシウム含有0.3Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.
1mLと1.2mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 0.1mLを添加し、37
℃、30分間振盪しながら加温した。30分後に生じたパラ
ニトロアニリンを0.04%亜硝酸ナトリウム（0.48M塩酸溶
液）、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.07% N-１-
ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各々0.5mL順次添
加してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、
545nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検
討した。
４本の試験管に入れ、その試験管各３本にDW、E. coli
Olll:B4由来Etまたはβ-グルカンを0.1mL加え、残り各
１本の試験管にはそれぞれ２倍濃度のEtとβ-グルカン
を0.05mLずつ添加した。このすべての試験管に0.08M塩
化マグネシウム含有0.3Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.
1mLと1.2mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 0.1mLを添加し、37
℃、30分間振盪しながら加温した。30分後に生じたパラ
ニトロアニリンを0.04%亜硝酸ナトリウム（0.48M塩酸溶
液）、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.07% N-１-
ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各々0.5mL順次添
加してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、
545nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検
討した。
【００３８】その結果を表２に示した。この結果から、
ライセートをセルロース系膜であるセルロースエステル
膜、セルロースアセテート膜、セルロースニトレート膜
にそれぞれ通過させて調製したEt感受性因子吸着担体を
使用すれば、Ｇ因子が除去され、β−グルカンの影響を
受けずに、Etを特異的に測定することができることがわ
かる。
ライセートをセルロース系膜であるセルロースエステル
膜、セルロースアセテート膜、セルロースニトレート膜
にそれぞれ通過させて調製したEt感受性因子吸着担体を
使用すれば、Ｇ因子が除去され、β−グルカンの影響を
受けずに、Etを特異的に測定することができることがわ
かる。
【００３９】
【表２】
【００４０】実施例３ 大林らの方法 (Clin. Chim. Acta，149，55-65(1985))
に準じ、実施例１で調製したライセート400mLをデキス
トラン硫酸固定化セファロースCL-6Bカラム（５×23c
m、0.05M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩衝液（pH8.0)で
平衡化）に添加し、0.2M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩
衝液 (pH8.0)２Lで溶出（Ｇ因子が溶出される）後、0.4
5M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0) にて溶
出される画分、すなわち図１に示すＢおよびＣ因子を含
むＢＣ画分（Ｇ因子を実質的に含まない）を得た。その
40mLを10mLに減圧濃縮後、Ｃ，Ｂ両因子の活性化を防ぐ
ために0.23gのEDTA-4Naを添加した。
に準じ、実施例１で調製したライセート400mLをデキス
トラン硫酸固定化セファロースCL-6Bカラム（５×23c
m、0.05M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩衝液（pH8.0)で
平衡化）に添加し、0.2M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩
衝液 (pH8.0)２Lで溶出（Ｇ因子が溶出される）後、0.4
5M NaCl含有0.02Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0) にて溶
出される画分、すなわち図１に示すＢおよびＣ因子を含
むＢＣ画分（Ｇ因子を実質的に含まない）を得た。その
40mLを10mLに減圧濃縮後、Ｃ，Ｂ両因子の活性化を防ぐ
ために0.23gのEDTA-4Naを添加した。
【００４１】その0.3mLをポリスチレン製96穴マイクロ
プレート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工業
（株）販売）の各ウェルに加え、4℃で3時間静置した
後、液を吸い取り、DWを0.3mL加え吸い取った。このDW
洗浄操作をさらに2回繰り返し、Et感受性因子吸着マイ
クロプレートを得た。
プレート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工業
（株）販売）の各ウェルに加え、4℃で3時間静置した
後、液を吸い取り、DWを0.3mL加え吸い取った。このDW
洗浄操作をさらに2回繰り返し、Et感受性因子吸着マイ
クロプレートを得た。
【００４２】このプレートの各ウェルにDW、サルモネラ
・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)由来Et（シ
グマ社販売のWestphal type）またはβ-グルカンを0.05
mL加え、また、他のウェルにそれぞれ２倍濃度のEtとβ
-グルカンを0.025mLずつ加えた。さらに、これらすべて
のウェルに0.03M硫酸マグネシウム含有0.4Mトリスー塩
酸緩衝液(pH8.0)0.025mLと2.0mM ｔ−ブトキシカルボニ
ル−ロイシル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニ
リド(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)0.025mLを添加し、振盪して
混合し、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温槽に
セットして、37℃、30分間加温した。生じたパラニトロ
アニリンを0.04％亜硝酸ナトリウム（1.0M塩酸溶液）、
0.3％スルファミン酸アンモニウム、0.07％Ｎ−１−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩（14% Ｎ−１−メチル
−２−ピロリドン溶液）を各々0.05mL順次添加してジア
ゾカップリングし、マイクロプレートリーダーにより54
5nm（対照波長：630nm）で吸光度を測定して本発明の測
定剤の反応性を検討した。その結果を表３に示した。こ
の結果から、Ｇ因子を実質的に含まないEt感受性因子含
有画分をポリスチレンに単に接触させて調製したEt感受
性因子吸着担体を使用すれば、β-グルカンの影響を受
けずに、Etを特異的に測定することができることがわか
る。
・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)由来Et（シ
グマ社販売のWestphal type）またはβ-グルカンを0.05
mL加え、また、他のウェルにそれぞれ２倍濃度のEtとβ
-グルカンを0.025mLずつ加えた。さらに、これらすべて
のウェルに0.03M硫酸マグネシウム含有0.4Mトリスー塩
酸緩衝液(pH8.0)0.025mLと2.0mM ｔ−ブトキシカルボニ
ル−ロイシル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニ
リド(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)0.025mLを添加し、振盪して
混合し、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温槽に
セットして、37℃、30分間加温した。生じたパラニトロ
アニリンを0.04％亜硝酸ナトリウム（1.0M塩酸溶液）、
0.3％スルファミン酸アンモニウム、0.07％Ｎ−１−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩（14% Ｎ−１−メチル
−２−ピロリドン溶液）を各々0.05mL順次添加してジア
ゾカップリングし、マイクロプレートリーダーにより54
5nm（対照波長：630nm）で吸光度を測定して本発明の測
定剤の反応性を検討した。その結果を表３に示した。こ
の結果から、Ｇ因子を実質的に含まないEt感受性因子含
有画分をポリスチレンに単に接触させて調製したEt感受
性因子吸着担体を使用すれば、β-グルカンの影響を受
けずに、Etを特異的に測定することができることがわか
る。
【００４３】
【表３】
【００４４】実施例４ 実施例３で調製したＧ因子を実質的に含まないEt感受性
因子含有画分（BC画分）10mL をビニルポリマー系粒状
担体であるTSKgelAFーホルミルトヨパール650（商品名、
東ソー（株）販売）10gに加え、4 ℃で一夜攪拌しなが
ら反応させ、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
１）で十分に洗浄し、ビニルポリマー粒子にEt感受性因
子を固定化させた（以下Et感受性因子固定化ビニルポリ
マー粒子という）。
因子含有画分（BC画分）10mL をビニルポリマー系粒状
担体であるTSKgelAFーホルミルトヨパール650（商品名、
東ソー（株）販売）10gに加え、4 ℃で一夜攪拌しなが
ら反応させ、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
１）で十分に洗浄し、ビニルポリマー粒子にEt感受性因
子を固定化させた（以下Et感受性因子固定化ビニルポリ
マー粒子という）。
【００４５】Et感受性因子固定化ビニルポリマー粒子0.
05gを各々４本の試験管に入れ、その試験管３本にDW、
セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens) 由来Et
（シグマ社販売のWestphal type）またはβ−グルカン
を0.1mL加え、残りの１本の試験管にはそれぞれ２倍濃
度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。このすべ
ての試験管に0.002M塩化カルシウム含有0.3Mトリスー塩
酸緩衝液(pH8.0)0.1mLと1.2 mM Boc-Leu- Gly-Arg-pNA
0.1mLを添加し、37℃、30 分間振盪しながら加温した。3
0分後に生じたパラニトロアニリンを実施例１と同様に
してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、54
5nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検討
した。
05gを各々４本の試験管に入れ、その試験管３本にDW、
セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens) 由来Et
（シグマ社販売のWestphal type）またはβ−グルカン
を0.1mL加え、残りの１本の試験管にはそれぞれ２倍濃
度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。このすべ
ての試験管に0.002M塩化カルシウム含有0.3Mトリスー塩
酸緩衝液(pH8.0)0.1mLと1.2 mM Boc-Leu- Gly-Arg-pNA
0.1mLを添加し、37℃、30 分間振盪しながら加温した。3
0分後に生じたパラニトロアニリンを実施例１と同様に
してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、54
5nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検討
した。
【００４６】その結果を表４に示した。この結果から、
Et感受性因子をビニルポリマーに固定化した担体を使用
すれば、β−グルカンの影響を受けずにEtを特異的に測
定することができることがわかる。
Et感受性因子をビニルポリマーに固定化した担体を使用
すれば、β−グルカンの影響を受けずにEtを特異的に測
定することができることがわかる。
【００４７】
【表４】
【００４８】実施例５ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来E
t、無菌的に採取した健常人の乳汁、またはその乳汁に
それぞれ1/10容量（濃度は10倍）のEt、1/10容量（濃度
は10倍）のβ−グルカン、もしくは1/20容量ずつのEtと
β−グルカン（濃度はともに20倍）を添加した検体を0.
05mL加えた。さらにこれらすべてのウェルに0.01M塩化
マグネシウム含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.05m
L加え、振盪して混合後、ふたをしてドライ式マイクロ
プレート恒温槽にセットし、37℃で30分間加温してEt感
受性因子を活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを
0.3mL加え、吸い取った。このDW洗浄をあと２回繰り返
した後、0.4mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 含有0.05M トリス
−塩酸緩衝液(pH8.0)0.1mLを加え、37℃、10分間加温し
た。生じたパラニトロアニリンを実施例３と同様にして
ジアゾカップリングし、マイクロプレートリーダーによ
り545nm （対照波長：630nm）で吸光度を測定して本発
明の測定剤の反応性を検討した。
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来E
t、無菌的に採取した健常人の乳汁、またはその乳汁に
それぞれ1/10容量（濃度は10倍）のEt、1/10容量（濃度
は10倍）のβ−グルカン、もしくは1/20容量ずつのEtと
β−グルカン（濃度はともに20倍）を添加した検体を0.
05mL加えた。さらにこれらすべてのウェルに0.01M塩化
マグネシウム含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.05m
L加え、振盪して混合後、ふたをしてドライ式マイクロ
プレート恒温槽にセットし、37℃で30分間加温してEt感
受性因子を活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを
0.3mL加え、吸い取った。このDW洗浄をあと２回繰り返
した後、0.4mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 含有0.05M トリス
−塩酸緩衝液(pH8.0)0.1mLを加え、37℃、10分間加温し
た。生じたパラニトロアニリンを実施例３と同様にして
ジアゾカップリングし、マイクロプレートリーダーによ
り545nm （対照波長：630nm）で吸光度を測定して本発
明の測定剤の反応性を検討した。
【００４９】その結果を表５に示した。この結果から従
来の液相系の反応では直接測定することができなかった
白濁した検体である乳汁中のEtが、本発明のEt感受性因
子吸着担体を用いれば、β−グルカンの影響も受けるこ
ともなく、簡単に特異的に測定できることがわかる。
来の液相系の反応では直接測定することができなかった
白濁した検体である乳汁中のEtが、本発明のEt感受性因
子吸着担体を用いれば、β−グルカンの影響も受けるこ
ともなく、簡単に特異的に測定できることがわかる。
【００５０】
【表５】
【００５１】また、グラム陰性菌感染によって乳房炎と
なったウシの乳汁についても同様に該測定剤でEtを測定
したところ、明らかな高値を示した。従って、該測定剤
でEtを測定することにより、グラム陰性菌感染の診断が
できる。 実施例６ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来の
Etまたはβ−グルカンを0.05mL加え、また、他のウェル
にはそれぞれ２倍濃度のEt、β−グルカンを0.025 mLず
つ加えた。これらの全てのウェルに0.01M 塩化マグネシ
ウム含有0.2Mトリスー塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え
た。ひきつづき、37℃で30分間加温してEt感受性因子を
活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3 mL加
え、吸い取った。このDW洗浄をあと２回繰り返した後、
リムルス・アメボサイト・ライセート(LAL) ゲル化法試
薬（パイロテル、ケープコッド社製造、生化学工業
（株）販売）0.2 mLを加え、37℃で30分間加温した。濁
度上昇を660nm で測定し、本発明の測定剤の反応性を検
討した。その結果を表６に示した。この結果から、Et感
受性因子吸着担体とLAL を使用すれば、β−グルカンの
影響を受けずにEtをLAL のゲル形成（濁度増加）により
容易にかつ特異的に測定できることがわかる。
なったウシの乳汁についても同様に該測定剤でEtを測定
したところ、明らかな高値を示した。従って、該測定剤
でEtを測定することにより、グラム陰性菌感染の診断が
できる。 実施例６ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来の
Etまたはβ−グルカンを0.05mL加え、また、他のウェル
にはそれぞれ２倍濃度のEt、β−グルカンを0.025 mLず
つ加えた。これらの全てのウェルに0.01M 塩化マグネシ
ウム含有0.2Mトリスー塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え
た。ひきつづき、37℃で30分間加温してEt感受性因子を
活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3 mL加
え、吸い取った。このDW洗浄をあと２回繰り返した後、
リムルス・アメボサイト・ライセート(LAL) ゲル化法試
薬（パイロテル、ケープコッド社製造、生化学工業
（株）販売）0.2 mLを加え、37℃で30分間加温した。濁
度上昇を660nm で測定し、本発明の測定剤の反応性を検
討した。その結果を表６に示した。この結果から、Et感
受性因子吸着担体とLAL を使用すれば、β−グルカンの
影響を受けずにEtをLAL のゲル形成（濁度増加）により
容易にかつ特異的に測定できることがわかる。
【００５２】
【表６】
【００５３】実施例７ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、サルモネラ・アボルタ
ス・イクイ（S.abortus equi）由来Et(Novo-Pyrexal en
dotoxin standard NP1, Pyroquant Diagnostik GmbH 販
売, Walldolf)、リボフラビン溶液（１mg/mL ) 、また
はそのリボフラビン溶液にそれぞれ1/10容量（濃度は10
倍）のEt、もしくは1/20容量ずつのEt（濃度は20倍量）
とβ−グルカンを添加した検体を0.05mLずつを加えた。
さらにこれらすべてのウェルに0.01M塩化マグネシウム
含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え振盪
して混合後、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温
槽にセットして、37℃で30分間加温してEt感受性因子を
活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3mL加
え、吸い取った。この洗浄操作を２回繰り返した後、リ
ムルス・アメボサイト・ライセート(LAL) に発色合成基
質(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) を加えて調製された発色合成
基質法ＬＡＬ試薬（トキシカラー、生化学工業（株）製
造販売）0.2 mLを加え、恒温槽付きマイクロプレートリ
ーダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）
販売）にセットし、37℃で30分間反応させた。経時的に
生じるパラニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍ（対照
波長：４９２ｎｍ）で連続的に測定して（カイネティッ
ク アッセイ）、本発明の測定剤の反応性を検討した。
イクロプレートの各ウェルにDW、サルモネラ・アボルタ
ス・イクイ（S.abortus equi）由来Et(Novo-Pyrexal en
dotoxin standard NP1, Pyroquant Diagnostik GmbH 販
売, Walldolf)、リボフラビン溶液（１mg/mL ) 、また
はそのリボフラビン溶液にそれぞれ1/10容量（濃度は10
倍）のEt、もしくは1/20容量ずつのEt（濃度は20倍量）
とβ−グルカンを添加した検体を0.05mLずつを加えた。
さらにこれらすべてのウェルに0.01M塩化マグネシウム
含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え振盪
して混合後、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温
槽にセットして、37℃で30分間加温してEt感受性因子を
活性化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3mL加
え、吸い取った。この洗浄操作を２回繰り返した後、リ
ムルス・アメボサイト・ライセート(LAL) に発色合成基
質(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) を加えて調製された発色合成
基質法ＬＡＬ試薬（トキシカラー、生化学工業（株）製
造販売）0.2 mLを加え、恒温槽付きマイクロプレートリ
ーダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）
販売）にセットし、37℃で30分間反応させた。経時的に
生じるパラニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍ（対照
波長：４９２ｎｍ）で連続的に測定して（カイネティッ
ク アッセイ）、本発明の測定剤の反応性を検討した。
【００５４】その結果を表７に示した。この結果から従
来の液相系の発色合成基質法ＬＡＬ反応では直接測定す
ることができなかったリボフラビンのような黄色検体中
のEtが、本発明のEt感受性因子吸着担体を用いれば、β
−グルカンの影響も受けることもなく、簡単にしかも高
感度で測定できることがわかる。
来の液相系の発色合成基質法ＬＡＬ反応では直接測定す
ることができなかったリボフラビンのような黄色検体中
のEtが、本発明のEt感受性因子吸着担体を用いれば、β
−グルカンの影響も受けることもなく、簡単にしかも高
感度で測定できることがわかる。
【００５５】
【表７】
【００５６】実施例８ 実施例１で調製したEt感受性因子吸着ナイロン膜を３
枚、シャーレの中に並べた。それらの膜の中央に0.01M
塩化マグネシウムと0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-pNAとを含
む0.2Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.05mLとE.coli 011
1:B4由来Etまたはβ−グルカンを含む試料0.05mLを加え
滴下し、シャーレのフタをした後、ふ卵器のなかで37
℃、60分間反応させ、着色（黄色）の有無を肉眼で判定
した。
枚、シャーレの中に並べた。それらの膜の中央に0.01M
塩化マグネシウムと0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-pNAとを含
む0.2Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.05mLとE.coli 011
1:B4由来Etまたはβ−グルカンを含む試料0.05mLを加え
滴下し、シャーレのフタをした後、ふ卵器のなかで37
℃、60分間反応させ、着色（黄色）の有無を肉眼で判定
した。
【００５７】その結果を表８に示した。この結果から、
Et感受性因子を膜状物質に吸着した担体を使用すれば、
Etを簡便かつ迅速にしかもβ−グルカンの影響を受けず
に検出できることがわる。
Et感受性因子を膜状物質に吸着した担体を使用すれば、
Etを簡便かつ迅速にしかもβ−グルカンの影響を受けず
に検出できることがわる。
【００５８】
【表８】
【００５９】実施例９ ライセートにＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０２９５１に記
載の方法に準じてカードランより調製したβ−グルカン
感受性因子活性化阻害剤（分子量 ５，８００）を添加
後、トキペツトプレート９６Ｆの各ウェルに加え、実施
例３と同様にEt感受性因子を吸着させた。
載の方法に準じてカードランより調製したβ−グルカン
感受性因子活性化阻害剤（分子量 ５，８００）を添加
後、トキペツトプレート９６Ｆの各ウェルに加え、実施
例３と同様にEt感受性因子を吸着させた。
【００６０】以後、実施例３と同様に各種検体について
測定したところ、β−グルカンの影響を受けずにEtを特
異的に測定することができた。次に本発明のキットの実
施例を示す。 実施例１０ 本実施例のキットは次の１〜３の要素からなる。
測定したところ、β−グルカンの影響を受けずにEtを特
異的に測定することができた。次に本発明のキットの実
施例を示す。 実施例１０ 本実施例のキットは次の１〜３の要素からなる。
【００６１】１．Et感受性因子吸着ナイロン膜片（Etフ
リーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)浸漬、25枚）
1バイアル ２．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、4.1
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.02M 塩化マグネシウム含有0.15M トリス
ー塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.5mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、Et感受性因子吸着ナイロン膜片1 枚に
試料0.1 mLを加え、それに発色合成基質1 バイアルを緩
衝液1 バイアルの全量(5.5mL) を加えて溶解した発色合
成基質混合液0.2 mLを加え、37℃で反応させる。
リーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)浸漬、25枚）
1バイアル ２．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、4.1
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.02M 塩化マグネシウム含有0.15M トリス
ー塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.5mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、Et感受性因子吸着ナイロン膜片1 枚に
試料0.1 mLを加え、それに発色合成基質1 バイアルを緩
衝液1 バイアルの全量(5.5mL) を加えて溶解した発色合
成基質混合液0.2 mLを加え、37℃で反応させる。
【００６２】実施例１１ 本実施例のキットは次の１〜３の要素からなる。 １．Et感受性因子吸着ポリスチレン製９６穴マイクロプ
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．発色合成基質 (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA・塩酸塩、3.0
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.015M 硫酸マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、それに発色合成基質１バイアルを緩衝液
１バイアルの全量（５．０mL）を加えて溶解した発色合
成基質混合液０．０５mLを加え、３７℃で反応させる。
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．発色合成基質 (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA・塩酸塩、3.0
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.015M 硫酸マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、それに発色合成基質１バイアルを緩衝液
１バイアルの全量（５．０mL）を加えて溶解した発色合
成基質混合液０．０５mLを加え、３７℃で反応させる。
【００６３】実施例１２ 本実施例のキットは次の１〜５の要素からなる。 １．Et感受性因子吸着ポリスチレン製９６穴マイクロプ
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液Ａ(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル ４．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、2.7
mg 、Etフリー) 1 バイアル ５．緩衝液Ｂ(0.05Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)、10 m
L 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液Ａを0.05mL加え、緩衝液ＡをO.O5
mL加えて、37℃で活性化させた後、液を吸い取り、蒸留
水で洗浄後、緩衝液Ｂの全量（10mL）を加えて溶解した
発色合成基質混合液0.1 mLを加えて反応させる。
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液Ａ(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル ４．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、2.7
mg 、Etフリー) 1 バイアル ５．緩衝液Ｂ(0.05Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)、10 m
L 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液Ａを0.05mL加え、緩衝液ＡをO.O5
mL加えて、37℃で活性化させた後、液を吸い取り、蒸留
水で洗浄後、緩衝液Ｂの全量（10mL）を加えて溶解した
発色合成基質混合液0.1 mLを加えて反応させる。
【００６４】実施例１３ 本実施例のキットは次の１〜３の要素からなる。 １．Et感受性因子吸着ポリスチレン製９６穴マイクロプ
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー塩
酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液を0.05mL加えて、37℃で活性化さ
せた後、液を吸い取り、蒸留水で洗浄する。その後は、
リムルス・アメボサイト・ライセート（ＬＡＬ）、市販
のＬＡＬゲル化法試薬、ＬＡＬに種々の合成基質を組み
合わせたもの、市販の合成基質法ＬＡＬ試薬等を加え、
それぞれの方法で反応させ測定する。
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー塩
酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液を0.05mL加えて、37℃で活性化さ
せた後、液を吸い取り、蒸留水で洗浄する。その後は、
リムルス・アメボサイト・ライセート（ＬＡＬ）、市販
のＬＡＬゲル化法試薬、ＬＡＬに種々の合成基質を組み
合わせたもの、市販の合成基質法ＬＡＬ試薬等を加え、
それぞれの方法で反応させ測定する。
【００６５】実施例１４ 本実施例のキットは次の１〜３の要素からなる。 １．Et感受性因子吸着ナイロン膜 50 枚 ２．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、1.5
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.01M塩化マグネシウム含有0.2 M トリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、2.7mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、Et感受性因子吸着ナイロン膜 1枚に、
緩衝液の全量(2.7 mL)を加えて溶解した発色合成基質混
合液 0.05 mLを滴下し、その上に試料 0.05 mLを滴下し
て、37℃で反応させる。
mg 、Etフリー) 1 バイアル ３．緩衝液(0.01M塩化マグネシウム含有0.2 M トリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、2.7mL 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、Et感受性因子吸着ナイロン膜 1枚に、
緩衝液の全量(2.7 mL)を加えて溶解した発色合成基質混
合液 0.05 mLを滴下し、その上に試料 0.05 mLを滴下し
て、37℃で反応させる。
【００６６】
【発明の効果】本発明によってEt感受性因子を固定化し
た固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤が初めて提
供された。該測定剤を使用して種々の反応妨害成分を含
有する検体中のEtを測定する際には、従来法のような煩
雑な前処理を必要としない。また、本発明の測定剤はEt
感受性因子を長期間安定に保持することができる。
た固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤が初めて提
供された。該測定剤を使用して種々の反応妨害成分を含
有する検体中のEtを測定する際には、従来法のような煩
雑な前処理を必要としない。また、本発明の測定剤はEt
感受性因子を長期間安定に保持することができる。
【図１】リムルス反応の機構を説明する図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２】 不溶性担体が、ポリアミド系、セルロー
ス系、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、シリカ系、
アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系
およびビニルポリマー系化合物からなる群から選ばれた
少なくとも１種類の化合物を含み、エンドトキシンを測
定する際の反応液に不溶性の担体である請求項１記載の
固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤。
ス系、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、シリカ系、
アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系
およびビニルポリマー系化合物からなる群から選ばれた
少なくとも１種類の化合物を含み、エンドトキシンを測
定する際の反応液に不溶性の担体である請求項１記載の
固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤。
【請求項３】 前記測定剤は、エンドトキシン感受性因
子の活性化に有効な２価金属塩を含む請求項１の固相系
反応用エンドトキシン特異的測定剤。
子の活性化に有効な２価金属塩を含む請求項１の固相系
反応用エンドトキシン特異的測定剤。
【請求項４】 請求項１の測定剤と活性型エンドトキシ
ン感受性因子の合成基質またはクロッティングエンザイ
ムの基質とを構成試薬として含む固相系反応用エンドト
キシン特異的測定キット。
ン感受性因子の合成基質またはクロッティングエンザイ
ムの基質とを構成試薬として含む固相系反応用エンドト
キシン特異的測定キット。
【請求項５】 構成試薬として、エンドトキシン感受性
因子の活性化に有効な２価金属塩を含有する緩衝剤をさ
らに含むことを特徴とする請求項４の固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定キット。
因子の活性化に有効な２価金属塩を含有する緩衝剤をさ
らに含むことを特徴とする請求項４の固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定キット。
【請求項６】 検体溶液を請求項１〜３のいずれかに記
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、検体中のエンドトキシンと該測定剤中の少なくとも
エンドトキシン感受性因子とを反応させ、基質の変化を
測定することを特徴とするエンドトキシンの測定法。
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、検体中のエンドトキシンと該測定剤中の少なくとも
エンドトキシン感受性因子とを反応させ、基質の変化を
測定することを特徴とするエンドトキシンの測定法。
【請求項７】 検体溶液を請求項１〜３のいずれかに記
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、次いで検体溶液を分離除去した後、必要に応じて洗
浄し、さらにカブトガニ・アメボサイト・ライセート単
独または該ライセートおよびクロッティングエンザイム
の合成基質と接触させて、該ライセートまたは合成基質
の変化を測定することを特徴とするエンドトキシンの測
定法。
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、次いで検体溶液を分離除去した後、必要に応じて洗
浄し、さらにカブトガニ・アメボサイト・ライセート単
独または該ライセートおよびクロッティングエンザイム
の合成基質と接触させて、該ライセートまたは合成基質
の変化を測定することを特徴とするエンドトキシンの測
定法。
【請求項８】 カブトガニ・アメボサイト由来の少なく
ともエンドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理的
または化学的に固定化することを特徴とする固相系反応
用エンドトキシン特異的測定剤の製造法。
ともエンドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理的
または化学的に固定化することを特徴とする固相系反応
用エンドトキシン特異的測定剤の製造法。
【請求項９】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
またはそれを含む液体を、エンドトキシン感受性因子を
特異的に吸着し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性
因子を吸着しない不溶性担体に接触させ、少なくともエ
ンドトキシン感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１
→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含ま
ず、エンドトキシンと特異的に反応する不溶性担体を得
ることを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的
測定剤の製造法。
またはそれを含む液体を、エンドトキシン感受性因子を
特異的に吸着し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性
因子を吸着しない不溶性担体に接触させ、少なくともエ
ンドトキシン感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１
→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含ま
ず、エンドトキシンと特異的に反応する不溶性担体を得
ることを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的
測定剤の製造法。
【請求項１０】 カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トを（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子除去処理
に付すことによって得られた、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン感受性因子を実質的に含まず、エンドトキシン感
受性因子を含むカブトガニ・アメボサイト・ライセート
処理物を用い、少なくともエンドトキシン感受性因子
を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化すること
を特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤
の製造法。
トを（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子除去処理
に付すことによって得られた、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン感受性因子を実質的に含まず、エンドトキシン感
受性因子を含むカブトガニ・アメボサイト・ライセート
処理物を用い、少なくともエンドトキシン感受性因子
を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化すること
を特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤
の製造法。
【請求項１１】 （１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性
因子活性化阻害剤をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートに添加した後、少なくともエンドトキシン感受性因
子を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化するこ
とを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤の製造法。
因子活性化阻害剤をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートに添加した後、少なくともエンドトキシン感受性因
子を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化するこ
とを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤の製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ (Ta
chypleus tridentatus) から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにEtが加わる
と、ライセート中に存在するＣ因子（Et感受性因子、分
子量123,000）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子が
Ｂ因子（分子量 64,000）の特定箇所を限定水解して活
性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティン
グエンザイム（分子量 54,000）を活性化してクロッテ
ィングエンザイムに変換し、クロッティングエンザイム
はコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19,723）
のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所
を、すなわち…Arg18-Thr19 …の間および…Arg46-Gly
47…の間を限定水解して H-Thr19…Arg46-OHで表される
ペプチドＣ（アミノ酸28残基）を遊離しつつ残余の部分
がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応
（カスケード反応とも呼ばれる；以下、エンドトキシン
による活性化に起因するカスケード反応をＣ因子系反応
という）である。
chypleus tridentatus) から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにEtが加わる
と、ライセート中に存在するＣ因子（Et感受性因子、分
子量123,000）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子が
Ｂ因子（分子量 64,000）の特定箇所を限定水解して活
性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティン
グエンザイム（分子量 54,000）を活性化してクロッテ
ィングエンザイムに変換し、クロッティングエンザイム
はコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19,723）
のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所
を、すなわち…Arg18-Thr19 …の間および…Arg46-Gly
47…の間を限定水解して H-Thr19…Arg46-OHで表される
ペプチドＣ（アミノ酸28残基）を遊離しつつ残余の部分
がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応
（カスケード反応とも呼ばれる；以下、エンドトキシン
による活性化に起因するカスケード反応をＣ因子系反応
という）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、カブトガニ・
アメボサイト由来の少なくともエンドトキシン感受性因
子を固定化した不溶性担体からなり、（１→３）−β−
Ｄ−グルカンに反応性を示さないことを特徴とする固相
系反応用エンドトキシン特異的測定剤を提供するもので
ある。そして、本発明は、前記測定剤と活性型エンドト
キシン感受性因子の合成基質またはクロッティングエン
ザイムの基質とを構成試薬として含む固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定キットを提供する。
アメボサイト由来の少なくともエンドトキシン感受性因
子を固定化した不溶性担体からなり、（１→３）−β−
Ｄ−グルカンに反応性を示さないことを特徴とする固相
系反応用エンドトキシン特異的測定剤を提供するもので
ある。そして、本発明は、前記測定剤と活性型エンドト
キシン感受性因子の合成基質またはクロッティングエン
ザイムの基質とを構成試薬として含む固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定キットを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】さらに本発明は、カブトガニ・アメボサイ
ト由来の少なくともエンドトキシン感受性因子を、不溶
性担体に物理的または化学的に固定化することを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。本発明の第１の製造法は、カブ
トガニ・アメボサイト・ライセートまたはそれを含む液
体を、少なくともエンドトキシン感受性因子を特異的に
吸着し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を吸
着しない不溶性担体に接触させ、少なくともエンドトキ
シン感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１→３）−
β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含まず、エンド
トキシンと特異的に反応する不溶性担体を得ることを特
徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製
造法である。
ト由来の少なくともエンドトキシン感受性因子を、不溶
性担体に物理的または化学的に固定化することを特徴と
する固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製造法
を提供するものである。本発明の第１の製造法は、カブ
トガニ・アメボサイト・ライセートまたはそれを含む液
体を、少なくともエンドトキシン感受性因子を特異的に
吸着し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を吸
着しない不溶性担体に接触させ、少なくともエンドトキ
シン感受性因子を物理的に吸着固定化し、（１→３）−
β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含まず、エンド
トキシンと特異的に反応する不溶性担体を得ることを特
徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤の製
造法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明のEt特異的測定剤は、少なくともEt
感受性因子が固定化され、かつ特異的にEtと反応し、更
に、図１におけるＧ因子（以下、β−グルカン感受性因
子をＧ因子ということもある）とβ−グルカンとの反応
が生起し得ないよう調製されたものであるから、適当な
基質の変化からEtが定量できるのである。従って、該Ｇ
因子は、その活性化がＧ因子活性化阻害剤等（ＰＣＴ国
際公開ＷＯ９０／０２９５１に記載のポリグリコシド、
あるいは特開平４−１０２０６４に記載の抗体など）に
より抑制されるならば、本発明のEt測定剤に含まれても
かまわない（前述の第３の製造法参照）。
感受性因子が固定化され、かつ特異的にEtと反応し、更
に、図１におけるＧ因子（以下、β−グルカン感受性因
子をＧ因子ということもある）とβ−グルカンとの反応
が生起し得ないよう調製されたものであるから、適当な
基質の変化からEtが定量できるのである。従って、該Ｇ
因子は、その活性化がＧ因子活性化阻害剤等（ＰＣＴ国
際公開ＷＯ９０／０２９５１に記載のポリグリコシド、
あるいは特開平４−１０２０６４に記載の抗体など）に
より抑制されるならば、本発明のEt測定剤に含まれても
かまわない（前述の第３の製造法参照）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】不溶性担体に、少なくともEt感受性因子を
固定化させる方法は、担体の種類によって異なる。担体
には、ライセートをそのまま単に担体と接触させるだ
けで少なくともEt感受性因子が特異的に担体に物理的に
固定化され、β−グルカン感受性因子は吸着されないも
の（第１の製造法）、ライセートをβ−グルカン感受
性因子除去処理に付し、β−グルカン感受性因子（Ｇ因
子）を実質的に含まないライセート処理物を調製し、こ
れと担体を接触させることによって少なくともEt感受性
因子が担体に物理的に固定化されるもの、または該ライ
セート処理物を使用し、化学的な固定化法（共有結合
法）を施すことによって少なくともEt感受性因子が担体
に化学的に固定化されるもの（第２の製造法）、 β−
グルカン感受性因子活性化阻害剤を含むライセートを使
用して、担体に少なくともエンドトキシン感受性因子が
物理的または化学的に固定化されるもの（第３の製造
法）等がある。第２及び第３の製造法におけるEt感受性
因子の固定化は、上記と同様の物理的または化学的方法
によって行うことができる。
固定化させる方法は、担体の種類によって異なる。担体
には、ライセートをそのまま単に担体と接触させるだ
けで少なくともEt感受性因子が特異的に担体に物理的に
固定化され、β−グルカン感受性因子は吸着されないも
の（第１の製造法）、ライセートをβ−グルカン感受
性因子除去処理に付し、β−グルカン感受性因子（Ｇ因
子）を実質的に含まないライセート処理物を調製し、こ
れと担体を接触させることによって少なくともEt感受性
因子が担体に物理的に固定化されるもの、または該ライ
セート処理物を使用し、化学的な固定化法（共有結合
法）を施すことによって少なくともEt感受性因子が担体
に化学的に固定化されるもの（第２の製造法）、 β−
グルカン感受性因子活性化阻害剤を含むライセートを使
用して、担体に少なくともエンドトキシン感受性因子が
物理的または化学的に固定化されるもの（第３の製造
法）等がある。第２及び第３の製造法におけるEt感受性
因子の固定化は、上記と同様の物理的または化学的方法
によって行うことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】上記第２または第３の製造法によって、Et
感受性因子等が吸着固定化された担体を製造する際に不
溶性担体とライセートもしくはその処理物との接触方法
も基本的には上記の第１の製造法の場合と同様である。
なお、ポリアミド系、セルロース系の不溶性担体のよう
なEt感受性因子が特異的に吸着固定化される担体を使用
する場合であっても、上記ライセート処理物を用いて化
学的な固定化方法で担体に固定化してもよい。
感受性因子等が吸着固定化された担体を製造する際に不
溶性担体とライセートもしくはその処理物との接触方法
も基本的には上記の第１の製造法の場合と同様である。
なお、ポリアミド系、セルロース系の不溶性担体のよう
なEt感受性因子が特異的に吸着固定化される担体を使用
する場合であっても、上記ライセート処理物を用いて化
学的な固定化方法で担体に固定化してもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】本発明に使用する不溶性担体の形状として
は、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜
形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイク
ロプレート状等の形態を有するものを挙げることができ
る。本発明の測定剤の必須固定化成分であるEt感受性因
子はカブトガニ・アメボサイトから得られる、Etと特異
的に反応する因子で、通常Ｃ因子と称され、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートから製造される。該ライセ
ートとしては、リムルス・ポリフェムス（Limulus poly
phemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus
tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus g
igas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Ca
rcinoscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ
液から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-
1021(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げるこ
とができる。また、本発明の第２の製造法において、該
ライセートからβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）を実
質的に含まないライセート処理物を調製する際のライセ
ートの処理法は公知の方法から適宜に選択して利用する
ことができる。例えば、ゲル濾過、ヘパリンもしくはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィー、スルホプロピル基を有するイオ
ン交換樹脂等により分画し、ライセートからＧ因子を実
質的に含まないライセート処理物を得ることができる
（特公平3-23869、Nakamura T. et al., Eur. J. Bioch
em., 154, 511-521(1986)、Clin. Chim. Acta，149，
55-65(1985)、特開平3-75565）。本発明によりEtを測定
する試料は、基本的には特に制限はなくEtの定量あるい
はその存否を測定あるいは確認する要請があるものであ
ればよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用
する水等を挙げることができる。特に、乳汁、尿、その
他着色物等の濁り、色素等を有する検体であっても特別
な前処理なしにそのまま測定に供することができるとい
う利点を有する。
は、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜
形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイク
ロプレート状等の形態を有するものを挙げることができ
る。本発明の測定剤の必須固定化成分であるEt感受性因
子はカブトガニ・アメボサイトから得られる、Etと特異
的に反応する因子で、通常Ｃ因子と称され、カブトガニ
・アメボサイト・ライセートから製造される。該ライセ
ートとしては、リムルス・ポリフェムス（Limulus poly
phemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus
tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus g
igas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Ca
rcinoscorpius rotundicauda）等のカブトガニ血リンパ
液から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-
1021(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げるこ
とができる。また、本発明の第２の製造法において、該
ライセートからβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）を実
質的に含まないライセート処理物を調製する際のライセ
ートの処理法は公知の方法から適宜に選択して利用する
ことができる。例えば、ゲル濾過、ヘパリンもしくはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィー、スルホプロピル基を有するイオ
ン交換樹脂等により分画し、ライセートからＧ因子を実
質的に含まないライセート処理物を得ることができる
（特公平3-23869、Nakamura T. et al., Eur. J. Bioch
em., 154, 511-521(1986)、Clin. Chim. Acta，149，
55-65(1985)、特開平3-75565）。本発明によりEtを測定
する試料は、基本的には特に制限はなくEtの定量あるい
はその存否を測定あるいは確認する要請があるものであ
ればよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使用
する水等を挙げることができる。特に、乳汁、尿、その
他着色物等の濁り、色素等を有する検体であっても特別
な前処理なしにそのまま測定に供することができるとい
う利点を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】本発明の測定剤を用いてEtを測定するに
は、Etとの反応によるＣ因子の変化、またはＣ因子のEt
による活性化を引き金とするＣ因子系の変化を、酵素反
応による基質の変化として測定できる。このような基質
としては、特に制限はないが、下記のペプチド合成基質
または天然基質であるコアギュローゲンが挙げられる。
は、Etとの反応によるＣ因子の変化、またはＣ因子のEt
による活性化を引き金とするＣ因子系の変化を、酵素反
応による基質の変化として測定できる。このような基質
としては、特に制限はないが、下記のペプチド合成基質
または天然基質であるコアギュローゲンが挙げられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】ペプチド合成基質を使用する測定法として
は、従来公知の方法が適用でき、ペプチド合成基質とし
ては、例えば、ペプチドのＣ末端のアルギニンのカルボ
キシル基に公知の発色性残基、発蛍光性残基、発光性残
基あるいはアンモニアなどがアミド結合により置換した
ペプチド合成基質を使用することができる。具体的に
は、例えば、ＵＳＰ４１８８２６４、特公昭６１−５４
４００、特公昭６３−２６８７１、特公平３−１１７６
０、特公昭５９−１９５３２、特公平３−６６３１９、
特公平４−４０３４０、ＷＯ８２／０２３８２、特開昭
５８−７７８５０、特開昭６２−２８９７６７、特開平
３−２２０４５６、ＷＯ７９／００６０２、ＥＰ−Ａ−
０００００６３、ＥＰ−Ａ−００１８１１２等に記載さ
れたペプチド合成基質が挙げられる。代表的なペプチド
合成基質としては、活性型Ｃ因子の基質であるBoc-Val-
Pro-Arg-pNA 、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 等およびクロッテ
ィングエンザイムの基質で（も）あるBoc-Leu-Gly-Arg-
pNA 等が例示される。活性型Ｃ因子またはクロッティン
グエンザイム等の上記他の因子がこれらの合成基質に作
用して生成する反応生成物を測定することによって、そ
のアミダーゼ活性の測定を行うことができる。具体的に
は、合成基質として（Ａ）活性型Ｃ因子に対するペプチ
ド合成基質を使用する方法、または（Ｂ）クロッティン
グエンザイムに対するペプチド合成基質を使用する方法
が例示される。より具体的には、例えば、上記（Ａ）の
場合、（Ａ−１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を
接触させて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存
させたまま、もしくは分離した後、活性化されたＣ因子
と基質とを接触させる方法、（Ａ−２）測定試料と本発
明の測定剤と基質を同時に接触させ、Ｃ因子の活性化と
活性型Ｃ因子による基質の分解反応を同時に行う方法等
を採用することができる。また、上記（Ｂ）の場合、前
記カスケード反応によってプロクロッティングエンザイ
ムを活性化する必要があるので、測定に際して固定化さ
れたＣ因子以外にＢ因子およびプロクロッティングエン
ザイムを存在させる必要がある。これら他の因子は分画
されたものであってもよいが、Ｇ因子を除去するか、あ
るいはＧ因子の活性化が実質的に阻害されたライセート
をこれら因子の供給源として使用してもよい。さらに、
EtによるＣ因子の活性化後、測定試料を不溶性担体から
分離し、担体上の活性化されたＣ因子と上記他の因子を
接触させる場合には、Ｇ因子を含む通常のライセートを
上記他の因子の供給源として使用することも可能であ
る。従って、上記（Ｂ）の場合、具体的には、例えば、
（Ｂ−１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を接触さ
せて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存させた
ままの状態で、分画された上記他の因子もしくはＧ因子
の活性化が阻害された状態のライセートと基質とを活性
化されたＣ因子に接触させる方法、（Ｂ−２）測定試料
と本発明の測定剤を接触させて固相上でＣ因子を活性化
し、測定試料を分離した後、活性化されたＣ因子とライ
セートを接触させる方法、（Ｂ−３）測定試料と本発明
の測定剤と分画された上記他の因子もしくはＧ因子の活
性化が阻害された状態のライセートと基質を同時に接触
させ、カスケード反応によるプロクロッティングエンザ
イムの活性化とクロッティングエンザイムによる基質の
分解反応を同時に行う方法等を採用することができる。
は、従来公知の方法が適用でき、ペプチド合成基質とし
ては、例えば、ペプチドのＣ末端のアルギニンのカルボ
キシル基に公知の発色性残基、発蛍光性残基、発光性残
基あるいはアンモニアなどがアミド結合により置換した
ペプチド合成基質を使用することができる。具体的に
は、例えば、ＵＳＰ４１８８２６４、特公昭６１−５４
４００、特公昭６３−２６８７１、特公平３−１１７６
０、特公昭５９−１９５３２、特公平３−６６３１９、
特公平４−４０３４０、ＷＯ８２／０２３８２、特開昭
５８−７７８５０、特開昭６２−２８９７６７、特開平
３−２２０４５６、ＷＯ７９／００６０２、ＥＰ−Ａ−
０００００６３、ＥＰ−Ａ−００１８１１２等に記載さ
れたペプチド合成基質が挙げられる。代表的なペプチド
合成基質としては、活性型Ｃ因子の基質であるBoc-Val-
Pro-Arg-pNA 、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 等およびクロッテ
ィングエンザイムの基質で（も）あるBoc-Leu-Gly-Arg-
pNA 等が例示される。活性型Ｃ因子またはクロッティン
グエンザイム等の上記他の因子がこれらの合成基質に作
用して生成する反応生成物を測定することによって、そ
のアミダーゼ活性の測定を行うことができる。具体的に
は、合成基質として（Ａ）活性型Ｃ因子に対するペプチ
ド合成基質を使用する方法、または（Ｂ）クロッティン
グエンザイムに対するペプチド合成基質を使用する方法
が例示される。より具体的には、例えば、上記（Ａ）の
場合、（Ａ−１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を
接触させて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存
させたまま、もしくは分離した後、活性化されたＣ因子
と基質とを接触させる方法、（Ａ−２）測定試料と本発
明の測定剤と基質を同時に接触させ、Ｃ因子の活性化と
活性型Ｃ因子による基質の分解反応を同時に行う方法等
を採用することができる。また、上記（Ｂ）の場合、前
記カスケード反応によってプロクロッティングエンザイ
ムを活性化する必要があるので、測定に際して固定化さ
れたＣ因子以外にＢ因子およびプロクロッティングエン
ザイムを存在させる必要がある。これら他の因子は分画
されたものであってもよいが、Ｇ因子を除去するか、あ
るいはＧ因子の活性化が実質的に阻害されたライセート
をこれら因子の供給源として使用してもよい。さらに、
EtによるＣ因子の活性化後、測定試料を不溶性担体から
分離し、担体上の活性化されたＣ因子と上記他の因子を
接触させる場合には、Ｇ因子を含む通常のライセートを
上記他の因子の供給源として使用することも可能であ
る。従って、上記（Ｂ）の場合、具体的には、例えば、
（Ｂ−１）Etを含む測定試料と本発明の測定剤を接触さ
せて固相上でＣ因子を活性化し、測定試料を共存させた
ままの状態で、分画された上記他の因子もしくはＧ因子
の活性化が阻害された状態のライセートと基質とを活性
化されたＣ因子に接触させる方法、（Ｂ−２）測定試料
と本発明の測定剤を接触させて固相上でＣ因子を活性化
し、測定試料を分離した後、活性化されたＣ因子とライ
セートを接触させる方法、（Ｂ−３）測定試料と本発明
の測定剤と分画された上記他の因子もしくはＧ因子の活
性化が阻害された状態のライセートと基質を同時に接触
させ、カスケード反応によるプロクロッティングエンザ
イムの活性化とクロッティングエンザイムによる基質の
分解反応を同時に行う方法等を採用することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】なお、上記（Ａ−２）または（Ｂ−３）の
方法による場合、Ｃ因子が固定化された不溶性担体に合
成基質、必要に応じて上記他の因子を吸着させた系によ
る反応、いわゆるドライケミストリー方式によるEtの特
異的測定剤とすることができる。すなわち、少なくとも
Et感受性因子が固定化され、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンと反応しない不溶性担体をドライケミストリー方式
の構成要素とすることができる。ドライケミストリー方
式は、文献に公知であり、例えば、〔化学と生物, 25
(6), 379-386(1987); Clin. Chem., 24, 1343(1978);
特開昭６２−１３４５６３〕等に記載されている。この
ような文献には、本発明の不溶性担体に対応すると考え
られる試薬層のほかに、展開層、反射層、半透層、指示
層などの層および透明支持体を含む分析エレメントを開
示している。そして、例えば、展開層は展開層上に点着
された血液から血球成分を残し、試薬層に血漿成分のみ
を浸透させる機能を有し、反射層は酸化チタンが混入さ
れ試薬層の発色反応等の反応結果を反射測光するための
反射板の役割も兼ねるものであることが記載されてい
る。また、基質として、上記クロッティングエンザイム
の合成基質の代わりにコアギュローゲンを使用してもよ
い。この場合、Ｃ因子系の変化の測定は、酵素反応によ
るゲル形成の有無を肉眼的に判定するか、光学的に検知
すればよい。〔Stanley W. Watson ら編集、「Endotoxi
ns And Their Detection With The LimulusAmebocyte L
ysate Test 」, pp.161-171, 1982年, Alan R. Liss, I
NC. ;Chem.Pharm. Bull., 36(8), 3012-3019(1988); J.
Parenteral Sci. Technol., 40(6), 284-286(1988)
〕。
方法による場合、Ｃ因子が固定化された不溶性担体に合
成基質、必要に応じて上記他の因子を吸着させた系によ
る反応、いわゆるドライケミストリー方式によるEtの特
異的測定剤とすることができる。すなわち、少なくとも
Et感受性因子が固定化され、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンと反応しない不溶性担体をドライケミストリー方式
の構成要素とすることができる。ドライケミストリー方
式は、文献に公知であり、例えば、〔化学と生物, 25
(6), 379-386(1987); Clin. Chem., 24, 1343(1978);
特開昭６２−１３４５６３〕等に記載されている。この
ような文献には、本発明の不溶性担体に対応すると考え
られる試薬層のほかに、展開層、反射層、半透層、指示
層などの層および透明支持体を含む分析エレメントを開
示している。そして、例えば、展開層は展開層上に点着
された血液から血球成分を残し、試薬層に血漿成分のみ
を浸透させる機能を有し、反射層は酸化チタンが混入さ
れ試薬層の発色反応等の反応結果を反射測光するための
反射板の役割も兼ねるものであることが記載されてい
る。また、基質として、上記クロッティングエンザイム
の合成基質の代わりにコアギュローゲンを使用してもよ
い。この場合、Ｃ因子系の変化の測定は、酵素反応によ
るゲル形成の有無を肉眼的に判定するか、光学的に検知
すればよい。〔Stanley W. Watson ら編集、「Endotoxi
ns And Their Detection With The LimulusAmebocyte L
ysate Test 」, pp.161-171, 1982年, Alan R. Liss, I
NC. ;Chem.Pharm. Bull., 36(8), 3012-3019(1988); J.
Parenteral Sci. Technol., 40(6), 284-286(1988)
〕。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】Et感受性因子吸着ナイロン膜を４枚用意
し、各々ほぼ３mm角に細断して、４本の試験管に入れ、
その試験管３本に蒸留水（以下DW）、大腸菌 (Escheric
hia coli)Olll:B4 由来Et（シグマ社販売のWestphal t
ype）または下記調製法により調製したβ−グルカンを
それぞれ0.1mL加え、残り１本の試験管にはそれぞれ２
倍濃度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。この
すべての試験管に0.04M塩化マグネシウム含有0.3Mトリ
スー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.1mLと2.2mM t-ブトキシカル
ボニル−バリル−プロリル−アルギニン−パラニトロア
ニリド (以下Boc-Val-Pro-Arg-pNA)0.1mLを添加し、37
℃、30分間加温して反応させた。加温中、５分ごとに試
験管ミキサーにて10秒間攪拌した。30分後に1.2M酢酸0.
3mLを加えて反応を停止させ、遊離したパラニトロアニ
リンの吸収を405nmの吸光度を測定して、本発明の測定
剤の反応性を検討した。
し、各々ほぼ３mm角に細断して、４本の試験管に入れ、
その試験管３本に蒸留水（以下DW）、大腸菌 (Escheric
hia coli)Olll:B4 由来Et（シグマ社販売のWestphal t
ype）または下記調製法により調製したβ−グルカンを
それぞれ0.1mL加え、残り１本の試験管にはそれぞれ２
倍濃度のEtとβ−グルカンを0.05mLずつ添加した。この
すべての試験管に0.04M塩化マグネシウム含有0.3Mトリ
スー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.1mLと2.2mM t-ブトキシカル
ボニル−バリル−プロリル−アルギニン−パラニトロア
ニリド (以下Boc-Val-Pro-Arg-pNA)0.1mLを添加し、37
℃、30分間加温して反応させた。加温中、５分ごとに試
験管ミキサーにて10秒間攪拌した。30分後に1.2M酢酸0.
3mLを加えて反応を停止させ、遊離したパラニトロアニ
リンの吸収を405nmの吸光度を測定して、本発明の測定
剤の反応性を検討した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】（β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開
WO90/02951に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬
工業（株）販売）の１gを約100mLの５mM NaOH水溶液に
懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーターTM（大岳製
作所、型式5202PZT、東京）により20KHZ、80Wで12分間
音波処理による低分子化を行った。処理液を５M NaOH水
溶液を用い、最終0.3M水溶液とし、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（GPCカラム：TSK gel G3000PWXL
２本、G250OPWXL １本、移動相：0.3M NaOH水溶液、流
速0.5mL/min）により分画採取し、再クロマトグラフィ
ーにより分子量216,000画分を分画採取し、GPC分画精製
標品（β−グルカン標品）を得た。
WO90/02951に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬
工業（株）販売）の１gを約100mLの５mM NaOH水溶液に
懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーターTM（大岳製
作所、型式5202PZT、東京）により20KHZ、80Wで12分間
音波処理による低分子化を行った。処理液を５M NaOH水
溶液を用い、最終0.3M水溶液とし、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（GPCカラム：TSK gel G3000PWXL
２本、G250OPWXL １本、移動相：0.3M NaOH水溶液、流
速0.5mL/min）により分画採取し、再クロマトグラフィ
ーにより分子量216,000画分を分画採取し、GPC分画精製
標品（β−グルカン標品）を得た。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】Ａ〜Ｃ剤を各々ほぼ５mm角に細断して、各
４本の試験管に入れ、その試験管各３本にDW、E. coli
Olll:B4由来Etまたはβ-グルカンを0.1mL加え、残り各
１本の試験管にはそれぞれ２倍濃度のEtとβ-グルカン
を0.05mLずつ添加した。このすべての試験管に0.08M塩
化マグネシウム含有0.3Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.
1mLと1.2mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 0.1mLを添加し、37
℃、30分間振盪しながら加温した。30分後に生じたパラ
ニトロアニリンに0.04%亜硝酸ナトリウム（0.48M塩酸溶
液）、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.07% N-１-
ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各々0.5mL順次添
加してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、
545nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検
討した。
４本の試験管に入れ、その試験管各３本にDW、E. coli
Olll:B4由来Etまたはβ-グルカンを0.1mL加え、残り各
１本の試験管にはそれぞれ２倍濃度のEtとβ-グルカン
を0.05mLずつ添加した。このすべての試験管に0.08M塩
化マグネシウム含有0.3Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.
1mLと1.2mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 0.1mLを添加し、37
℃、30分間振盪しながら加温した。30分後に生じたパラ
ニトロアニリンに0.04%亜硝酸ナトリウム（0.48M塩酸溶
液）、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.07% N-１-
ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各々0.5mL順次添
加してジアゾカップリングし、その発色液を取り出し、
545nmの吸光度を測定して本発明の測定剤の反応性を検
討した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４８】実施例５ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来E
t、無菌的に採取した健常人の乳汁、またはその乳汁に
その1/10容量（濃度は10倍）のEt、もしくは1/20容量ず
つのEtとβ−グルカン（濃度はともに20倍）を添加した
検体を0.05mL加えた。さらにこれらすべてのウェルに0.
01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0) を0.05mL加え、振盪して混合後、ふたをしてドライ
式マイクロプレート恒温槽にセットし、37℃で30分間加
温してEt感受性因子を活性化させた。その後、液を吸い
取り、DWを0.3mL加え、吸い取った。このDW洗浄をあと
２回繰り返した後、0.4mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 含有0.
05M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.1mLを加え、37℃、10
分間加温した。生じたパラニトロアニリンを実施例３と
同様にしてジアゾカップリングし、マイクロプレートリ
ーダーにより545nm （対照波長：630nm）で吸光度を測
定して本発明の測定剤の反応性を検討した。
イクロプレートの各ウェルにDW、E.coli 0111:B4由来E
t、無菌的に採取した健常人の乳汁、またはその乳汁に
その1/10容量（濃度は10倍）のEt、もしくは1/20容量ず
つのEtとβ−グルカン（濃度はともに20倍）を添加した
検体を0.05mL加えた。さらにこれらすべてのウェルに0.
01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0) を0.05mL加え、振盪して混合後、ふたをしてドライ
式マイクロプレート恒温槽にセットし、37℃で30分間加
温してEt感受性因子を活性化させた。その後、液を吸い
取り、DWを0.3mL加え、吸い取った。このDW洗浄をあと
２回繰り返した後、0.4mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA 含有0.
05M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)0.1mLを加え、37℃、10
分間加温した。生じたパラニトロアニリンを実施例３と
同様にしてジアゾカップリングし、マイクロプレートリ
ーダーにより545nm （対照波長：630nm）で吸光度を測
定して本発明の測定剤の反応性を検討した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】
【表５】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】実施例７ 実施例３で調製したEt感受性因子吸着ポリスチレン製マ
イクロプレートの各ウェルにDW、サルモネラ・アボルタ
ス・イクイ（S.abortus equi）由来Et(Novo-Pyrexal en
dotoxin standard NP1, Pyroquant Diagnostik GmbH 販
売, Walldolf)、リボフラビン溶液（１mg/mL ) 、また
はそのリボフラビン溶液にその1/10容量（濃度は10倍）
のEt、もしくは1/20容量ずつのEt（濃度は20倍量）とβ
−グルカンを添加した検体を0.05mLずつを加えた。さら
にこれらすべてのウェルに0.01M塩化マグネシウム含有
0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え振盪して
混合後、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温槽に
セットして、37℃で30分間加温してEt感受性因子を活性
化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3mL加え、吸
い取った。この洗浄操作を２回繰り返した後、リムルス
・アメボサイト・ライセート(LAL) に発色合成基質(Boc
-Leu-Gly-Arg-pNA) を加えて調製された発色合成基質法
ＬＡＬ試薬（トキシカラー、生化学工業（株）製造販
売）0.2 mLを加え、恒温槽付きマイクロプレートリーダ
ー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）販
売）にセットし、37℃で30分間反応させた。経時的に生
じるパラニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍ（対照波
長：４９２ｎｍ）で連続的に測定して（カイネティック
アッセイ）、本発明の測定剤の反応性を検討した。
イクロプレートの各ウェルにDW、サルモネラ・アボルタ
ス・イクイ（S.abortus equi）由来Et(Novo-Pyrexal en
dotoxin standard NP1, Pyroquant Diagnostik GmbH 販
売, Walldolf)、リボフラビン溶液（１mg/mL ) 、また
はそのリボフラビン溶液にその1/10容量（濃度は10倍）
のEt、もしくは1/20容量ずつのEt（濃度は20倍量）とβ
−グルカンを添加した検体を0.05mLずつを加えた。さら
にこれらすべてのウェルに0.01M塩化マグネシウム含有
0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を0.05mL加え振盪して
混合後、ふたをしてドライ式マイクロプレート恒温槽に
セットして、37℃で30分間加温してEt感受性因子を活性
化させた。その後、液を吸い取り、DWを0.3mL加え、吸
い取った。この洗浄操作を２回繰り返した後、リムルス
・アメボサイト・ライセート(LAL) に発色合成基質(Boc
-Leu-Gly-Arg-pNA) を加えて調製された発色合成基質法
ＬＡＬ試薬（トキシカラー、生化学工業（株）製造販
売）0.2 mLを加え、恒温槽付きマイクロプレートリーダ
ー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）販
売）にセットし、37℃で30分間反応させた。経時的に生
じるパラニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍ（対照波
長：４９２ｎｍ）で連続的に測定して（カイネティック
アッセイ）、本発明の測定剤の反応性を検討した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】実施例８ 実施例１で調製したEt感受性因子吸着ナイロン膜を３
枚、シャーレの中に並べた。それらの膜の中央に0.01M
塩化マグネシウムと0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-pNAとを含
む0.2Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.05mLとDW、E.coli
0111:B4由来Etまたはβ−グルカンを含む試料0.05mLを
滴下し、シャーレのフタをした後、ふ卵器のなかで37
℃、60分間反応させ、着色（黄色）の有無を肉眼で判定
した。
枚、シャーレの中に並べた。それらの膜の中央に0.01M
塩化マグネシウムと0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-pNAとを含
む0.2Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)0.05mLとDW、E.coli
0111:B4由来Etまたはβ−グルカンを含む試料0.05mLを
滴下し、シャーレのフタをした後、ふ卵器のなかで37
℃、60分間反応させ、着色（黄色）の有無を肉眼で判定
した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】その結果を表８に示した。この結果から、
Et感受性因子を膜状物質に吸着した担体を使用すれば、
Etを簡便かつ迅速にしかもβ−グルカンの影響を受けず
に検出できることがわかる。
Et感受性因子を膜状物質に吸着した担体を使用すれば、
Etを簡便かつ迅速にしかもβ−グルカンの影響を受けず
に検出できることがわかる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】実施例１２ 本実施例のキットは次の１〜５の要素からなる。 １．Et感受性因子吸着ポリスチレン製９６穴マイクロプ
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液Ａ(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル ４．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、2.7
mg 、Etフリー) 1 バイアル ５．緩衝液Ｂ(0.05Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)、10 m
L 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液ＡをO.O5mL加えて、37℃で活性化
させた後、液を吸い取り、蒸留水で洗浄後、緩衝液Ｂの
全量（10mL）を加えて溶解した発色合成基質混合液0.1
mLを加えて反応させる。
レート（Etフリーの0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)
浸漬） 1枚 ２．緩衝液Ａ(0.01M塩化マグネシウム含有0.2Mトリスー
塩酸緩衝液 (pH8.0)、5.0mL 、Etフリー) 1 バイアル ３．蒸留水（１００mL、Etフリー）１バイアル ４．発色合成基質 (Boc-Val-Pro-Arg-pNA・酢酸塩、2.7
mg 、Etフリー) 1 バイアル ５．緩衝液Ｂ(0.05Mトリスー塩酸緩衝液 (pH8.0)、10 m
L 、Etフリー) 1 バイアル 使用に際しては、マイクロプレートの各ウェルに試料0.
05 mL を加え、緩衝液ＡをO.O5mL加えて、37℃で活性化
させた後、液を吸い取り、蒸留水で洗浄後、緩衝液Ｂの
全量（10mL）を加えて溶解した発色合成基質混合液0.1
mLを加えて反応させる。
Claims (12)
- 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト由来の少なく
ともエンドトキシン感受性因子を固定化した不溶性担体
からなることを特徴とする固相系反応用エンドトキシン
特異的測定剤。 - 【請求項２】 前記測定剤は、実質的に（１→３）−β
−Ｄ−グルカン感受性因子を含まないことを特徴とする
請求項１記載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤。 - 【請求項３】 不溶性担体が、ポリアミド系、セルロー
ス系、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、シリカ系、
アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系
およびビニルポリマー系化合物からなる群から選ばれた
少なくとも１種類の化合物を含み、エンドトキシンを測
定する際の反応液に不溶性の担体である請求項１記載の
固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤。 - 【請求項４】 前記測定剤は、エンドトキシン感受性因
子の活性化に有効な２価金属塩を含む請求項１の固相系
反応用エンドトキシン特異的測定剤。 - 【請求項５】 請求項１の測定剤と活性型エンドトキシ
ン感受性因子の合成基質またはクロッティングエンザイ
ムの合成基質とを構成試薬として少なくとも含む固相系
反応用エンドトキシン特異的測定キット。 - 【請求項６】 構成試薬として、エンドトキシン感受性
因子の活性化に有効な２価金属塩を含有する緩衝剤をさ
らに含むことを特徴とする請求項５の固相系反応用エン
ドトキシン特異的測定キット。 - 【請求項７】 検体溶液を請求項１〜４のいずれかに記
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、検体中のエンドトキシンと該測定剤中の少なくとも
エンドトキシン感受性因子とを反応させ、基質の変化を
測定することを特徴とするエンドトキシンの測定法。 - 【請求項８】 検体溶液を請求項１〜４のいずれかに記
載の固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤と接触さ
せ、次いで検体溶液を分離除去した後、必要に応じて洗
浄し、さらにカブトガニ・アメボサイト・ライセート単
独または該ライセートおよびクロッティングエンザイム
の合成基質と接触させて、該ライセートまたは合成基質
の変化を測定することを特徴とするエンドトキシンの測
定法。 - 【請求項９】 カブトガニ・アメボサイト由来の少なく
ともエンドトキシン感受性因子を、不溶性担体に物理的
または化学的に固定化することを特徴とする固相系反応
用エンドトキシン特異的測定剤の製造法。 - 【請求項１０】 カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トまたはそれを含む液体を、エンドトキシン感受性因子
を特異的に吸着し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受
性因子を吸着しない不溶性担体に接触させ、少なくとも
エンドトキシン感受性因子を物理的に吸着固定化し、
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を実質的に含
まず、エンドトキシンと特異的に反応する不溶性担体を
得ることを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異
的測定剤の製造法。 - 【請求項１１】 カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トを（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子除去処理
に付すことによって得られた、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン感受性因子を実質的に含まず、エンドトキシン感
受性因子を含むカブトガニ・アメボサイト・ライセート
処理物を用い、少なくともエンドトキシン感受性因子
を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化すること
を特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤
の製造法。 - 【請求項１２】 （１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性
因子活性化阻害剤をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートに添加した後、少なくともエンドトキシン感受性因
子を、不溶性担体に物理的または化学的に固定化するこ
とを特徴とする固相系反応用エンドトキシン特異的測定
剤の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26918992A JP3322700B2 (ja) | 1992-09-14 | 1992-09-14 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
| EP93114763A EP0588303B1 (en) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | Reagent for endotoxin-specific assay |
| DE69327211T DE69327211T2 (de) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | Reagens für endotoxinspezifischen Assay |
| CA002106119A CA2106119A1 (en) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | Reagent for endotoxin-specific assay |
| AU47339/93A AU678173B2 (en) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | Reagent for endotoxin-specific assay |
| US08/120,469 US5550030A (en) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | Reagent for endotoxin-specific assay |
| CN93119272A CN1051847C (zh) | 1992-09-14 | 1993-09-14 | 用于内毒素特异检测的试剂、药盒和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26918992A JP3322700B2 (ja) | 1992-09-14 | 1992-09-14 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06130064A true JPH06130064A (ja) | 1994-05-13 |
| JP3322700B2 JP3322700B2 (ja) | 2002-09-09 |
Family
ID=17468922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26918992A Expired - Lifetime JP3322700B2 (ja) | 1992-09-14 | 1992-09-14 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5550030A (ja) |
| EP (1) | EP0588303B1 (ja) |
| JP (1) | JP3322700B2 (ja) |
| CN (1) | CN1051847C (ja) |
| AU (1) | AU678173B2 (ja) |
| CA (1) | CA2106119A1 (ja) |
| DE (1) | DE69327211T2 (ja) |
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