CN1051847C - 用于内毒素特异检测的试剂、药盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了1)一种用固相反应特异检测内毒素用试剂，其中包括其上至少固定一种鲎属变形虫状细胞来源的内毒素敏感因子的不溶性载体；2)用固相反应特异检测内毒素的药盒，至少包含所说试剂和活化的因子的合成底物或凝固酶的合成底物；3)分析内毒素的方法，包括使样品中的内毒素与所说试剂中的因子反应并测定底物的变化。即使混浊或有色，样品中的内毒素均能方便而快速地加以测定而不受(1→3)－β－D－葡聚糖影响。

Description

用于内毒素特异检测的试剂、药盒和方法
本发明涉及一种特异地检测内毒素的试剂，它含有固定在不溶载体上的内毒素敏感的凝血因子，一种包括该试剂的内毒素检测药盒，一种用所说试剂特异检测内毒素的方法。
采用鲎血细胞(变形虫状细胞)提取物(即鲎变形虫状细胞溶胞产物，以下简称为溶胞产物)检测内毒素(以下叫作Et)的方法，称为鲎试验，已为公众所知。参予检测的溶胞产物的反应，叫作鲎反应。鲎试验具有高检出敏感性，而且广泛地用于药物、水测定法、临床试验等热原检查工作中。鲎试验基于痕量内毒素存在下溶胞产物的凝结作用。最近的生物学研究阐明了这样一个事实，即鲎反应由几种凝结因子的分步活化组成(参见Takanori Nakamura等，日本细菌学杂志，38，781-803(1983)。
所说的鲎反应现参照图1就由三刺鲎(Tachypleus tridentatus)得到的溶胞产物详细说明如下。在溶胞产物中加入Et时，在该溶胞产物中存在的Et-敏感因子(内毒素敏感的因子，分子量为123000)被活化。此活化的因子C在特定位点使因子B(分子量；64000)有限水解生成活化的因子B。此活化的因子B使预凝固酶(分子量；54000)活化，将其转化成凝固酶。此凝固酶使凝固原(Coagulogen，凝血蛋白，分子量19723)在由二硫键交联的环中，即在…Arg18和Thr19…以及…Arg46和Gly47…之间的特定位点处有限水解，释放出由
              H-Thr19……Arg46-OH所表示的肽C(28氨基酸残基)，同时将其余部分转化成凝固素凝胶。因此鲎反应由一系列反应(由Et引起的级联反应，以下叫作因子C系统反应)组成。
上面提到的溶胞产物的级联反应，不仅由Et，而且还由(1→3)-B-D-葡聚糖(以下简叫β-葡聚糖)所诱发。就是说，图1中的因子G被β-葡聚糖活化，而活化的因子G将预凝固酶转化成凝固酶，而且凝固酶在凝固作用时生成凝固素凝胶，其作用方式与上述的由β-葡聚糖引起的级联反应(以下叫作因子G系统反应)中的相同。
通过所说的级联反应产生的凝固酶，也能够使单独地加入该反应体系中的合成底物(例如叔丁基羰基-亮氨酸酰-甘氨酸-精氨酸-N硝基-N-苯胺)(Boc-Leu-Ely-Arg-PNA)的酰胺键水解，释放出对硝基苯胺。因此，Et或β-葡聚糖可以通过测量所释放出的对硝基苯胺之光吸收的方法定量测定。
有人提议使用已除去因子G的溶胞产物，只根据因子C体系特异测定Et，参见Obayashi T.等在临床化学学报，149，55-65(1985)中所披露的内容。
但是，此方法涉及极其复杂的制备元因子G体系的操作，其中包括采用其上固定有葡聚糖硫酸盐亲和载体的亲和色谱法分步分离溶胞产物以便除去β-葡聚糖敏感的因子(即凝血因子G)，以及重新构成因子C、因子B和预凝固酶。采用得到的无因子G的体系和凝固酶的合成底物进行Et的特异检测。人们还知道，同时使用Et-敏感的因子(即因子C)和活化的因子C的合成肽底物(例如叔丁氧基羰基-缬氨酰-脯氨酰-精氨酸-对硝基-N-苯胺，以下用Boc-Val-Pro-Arg-PNA表示)作特异的Et检定，参见NakamuraT.等在欧洲生物化学杂志，154，511-521(1986)中所述。此技术也需要分离和提纯的一些复杂操作。
上面提到明鲎检测技术，基于使用部分或全部溶胞产物的液相反应体系。
待分析的样品常常含有干扰鲎试验的各种物质，因而需要作预处理使干扰物质失活或除去。例如，重金属或盐容以高浓度存在时，则会强烈干扰此鲎反应，故不能获知准确的Et水平。在这些情况下，必须用蒸馏水将样品稀释到不产生干扰时为止，但是可以允许的稀释程度受此鲎试验的最低检出限所限制)。此外，还时常遇到这样一些情况，即样品呈混浊或有色状，甚至加以稀释之后仍不能分析。血样或乳样品需要一些复杂的预处理。因此，在这些情况下分析Et涉及有待解决的许多问题。
除了液相反应体系之外，人们还知道采用将溶胞产物固定在聚苯乙烯制微板的孔中的一种体系，参见临床微生物学杂志，17，1050-1053(1983)。但是，由于不仅此Et-敏感的凝血因子，而且β-葡聚糖敏感的因子都同时被固定，所以此体系也不能用于Et特异检测。还有人提出一种试纸，它是用溶胞产物和合成底物浸润后干燥制成的(JP-A-62-134563，短语“JP-A”在本文中指审查后公开的日本专利申请)。但是，由于用溶胞产物浸渍过的滤纸未经洗涤，所以其中含有溶胞产物的全部成分，因而不适于Et特异检测。
本发明的目的之一在于提供特异检测内毒素用试剂，其中包含由鲎变形虫状细胞得到的、固定在不溶载体上的内毒素敏感的因子，该试剂与内毒素具有特异反应而与β-葡聚糖不反应，借以能够在高度可靠性条件下定性和定量测定内毒素。
本发明的另一目的在于提供一种包括上面提到试剂的特异检测内毒素的药盒。
本发明的进一步目的在于提供一种利用上面提到的试剂简易而快速检测内毒素用方法。
就是说，本发明提供出一种用于特异检测内毒素的试剂，其中包括一种不溶性载体，该载体上至少固定有一种鲎变形虫状细胞源的内毒素敏感的因子而且与β-葡聚糖不显示反应。
本发明还提供出于用特异检测内毒素的干式分析元件，其中包括一种试剂层，此试剂层含有固定在其上至少一种Et敏感因子的不溶性载体以及活化的Et敏感因子的底物或凝固酶的底物。
本发明还提供出一种特异检测内毒素的药盒，其中至少包括(a)上面提到的试剂和(b)活化的内毒素敏感因子的底物或凝固酶底物。
本发明进一步提供这样一种特异检测内毒素的方法，其中包括：将样品溶液与上面提到的试剂接触，使样品中的内毒素至少与所说试剂中的内毒素敏感的因子反应，并且测定底物变化；或者提供这样一种特异检测内毒素的方法，其中包括将样品溶液与上面提到的试剂接触，使样品溶液与不溶性载体分离，必要时洗涤不溶性载体，进一步使不溶性载体单独与鲎变形虫状细胞溶胞产物接触或同时与鲎变形虫状细胞溶胞产物和凝固酶底物接触，并且测定所说溶胞产物或所说底物变化。
本发明而且还提供出制备上述试剂用的一种工艺方法，其中包括在不溶性载体上物理或化学固定鲎变形虫状细胞源的至少一种内毒素敏感因子。更具体讲，本发明提供出：(1)一种工艺方法，其中包括使鲎变形虫状细胞溶胞产物或含它的液体与一种不溶性载体接触，此载体可特异吸附内毒素敏感因子而不能吸附(1→3)-β-葡聚糖敏感因子，以便在该不溶性载体上吸附在所说的溶胞产物中的至少一种Et-敏感因子，从载体上除去残留的溶胞产物或液体得到一种基本上不含β-葡聚糖敏感因子并且与Et有特异反应能力的不溶性载体；(2)一种工艺方法，其中包括处理鲎变形虫状细胞溶胞产物除去(1→3)-β-D-葡聚糖敏感的凝血因子得到一种溶胞产物，此溶胞产物基本上不含(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子但是含内毒素敏感因子；使得到的溶胞产物与不溶性载体接触，以便物理或化学固定至少一种内毒素敏感因子于所说的不溶性载体上；以及(3)一种工艺方法，其中包括向鲎变形虫状细胞溶胞产物中加入(1→3)-β-葡聚糖敏感因子活化抑制剂，然后使所说的溶胞产物与不溶性载体接触，以便将所说的溶胞产物中至少一种内毒素敏感因子化学或物理固定在所说的不溶性载体上。
附图1是说明鲎试验机理的流程图。
本发明的试剂包含其上至少固定有一种Et敏感因子的不溶性载体使该因子特异地与Et反应并且设计得在样品中可能存在的β-葡聚糖和图1中的因子G(术语“因子G”下文中有时用作β-葡聚糖因子)之间不引起反应。这样一来，Et可以由适当的底物的变化加以定量测定。在此意义上，因子G可以存在于本发明的试剂之中，只要按照本发明工艺方法3用因子G活化抑制剂等抑制凝血因子G的活化即可。欲加使用的因子活化抑制剂包括：于WO 90/02951中描述的多聚葡糖苷和JP-A102064中所述的抗体等等。
必须的条件是：本发明的试剂应当含有至少一种固定在其不溶性载体上的Et-敏感因子(即因子C)。除了因子C之外，此试剂还含有参预由因子C的内毒素诱发的活化作用而触发的级联反应的一种或多种其它成分，即因子B、预凝固酶和凝固原。
可以用于本发明的不溶载体，用Et-敏感因子固定化法(无论用物理方式或化学方式)、Et分析法、试剂结构法等等加以适当选择。
术语“固定化”在本文中使用时是指假如以Et敏感因子为例，定将Et敏感因子用物理或化学结合在不溶性载体之上，从而使所说的Et-敏感因子基本上不溶于Et检测液体反应体系中而基本上维持其对Et的反应活化。
Et-敏感因子等在不溶载体上的物理或化学结合，可以按酶固定化的已知传统技术进行，例如按在《固定化酶》107页，Kodansha株氏会社(1975)和《应用酶学》28-31页，Kodansha株氏会社(1980)上所述的方法进行。本文所说的物理结合，是指通过将不溶载体和内毒素敏感因子等培养给定时间的方法产生的结合。此方法在上面引证的文献中以“物理吸附”或“离子结合”的形式提到过。本文所说的化学结合是指因采用交联剂或通过在不溶性载体和Et-敏感的凝血因子等之间因其化学活化的官能团的反应而形成的不可逆结合。这些化学结合法在上面引证的文献中以“共价结合”的形式提到过。
在不溶性载体上固定至少一种Et-敏感因子的方法，取决于载体的种类。本发明的固定化方法包括：(1)一种方法，其中包括使鲎变形虫状细胞溶胞产物或含此产物的液体，与特异吸附至少一种Et-敏感因子但是却不能吸附(1→)β-葡聚糖敏感因子的不溶性载体接触，以便获得一种其上物理吸附有至少一种Et-敏感因子而且基本上不含(1→)-β-葡聚糖敏感因子的不溶性载体，使之能够与Et特异反应(工艺方法1)；(2)一种方法，其中包括处理鲎变形虫状细胞溶胞产物以除去β-葡聚糖敏感因子，得到含至少一种内毒素敏感因子但基本上不含β-葡聚糖敏感因子(因子G)的溶胞产物，并且使此溶胞产物与不溶性载体接触以便将至少一种Et-敏感因子物理固定或化学(共价结合)固定在所说载体上(工艺方法2)；以及(3)一种方法，其中包括向鲎变形虫状细胞溶胞产物中加入β-葡聚糖敏感因子活化抑制剂，并且使此溶胞产物与不溶性载体接触，以便在所说载体上物理固定或化学固定至少一种Et-敏感因子(工艺方法3)。Et敏感因子的固定化，可以按照和上面提到过的同样方式以物理或化学法进行。
在工艺方法1中使用的载体，包括聚酰胺型不溶性载体(包含一种主链的结晶线型高聚物，其中各单元通过酸的酰胺键互相结合而且是用二胺和二羧酸的缩聚法或者用w-氨基酸或其相应的内酰胺，如尼龙6和尼龙66的缩聚法合成的)和纤维素型不溶性载体，如纤维素，纤维素酯(如乙酸纤维素和硝酸纤维素)，具有氨乙基、溴乙酰基、二氧磷基、羧甲基或类似取代基的纤维素衍生物以及羧甲基纤维素的酰肼衍生物。Et-敏感因子等在这些载体上的固定化可以按这样一种方法进行，即使溶胞产物或含溶胞产物的液体(如溶胞产物、葡聚糖、二份金属盐和各种缓剂的混合物)与所说载体在适于Et-敏感因子等在其上被吸附的条件下，例如0～40℃温度下接触几秒钟至几天的时间。可以利用任何已知的固-液接触手段。例如使溶胞产物通过滤纸类载体或使之通过装填有载体颗粒的柱，将溶胞产物置于微板状载体的孔中经过预定时间后放出溶胞产物，或者将任意形状的载体加到溶胞产物中并振荡此混合物或使该混合物放置给定时间后用通常的固液分离手段(如过滤、离心、吸滤和倾泻)除去溶胞产物。
加入葡聚糖于待接触的溶胞产物之中，增进Et-敏感因子的吸附作用。欲加入的葡聚糖的平均分子量，一般为5000～5,000,000，优选10,000～100,000。
能够用于工艺方法2和3中并通过接触能够简单地将Et-敏感因子固定在其上的不溶载体，包括聚酰胺、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯和二氧化硅型不溶性载体；以及通过化学手段将Et-敏感因子等固定在其上的那些不溶性载体，其中包括聚酰胺、纤维素、琼酯糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和乙烯基聚合物类(包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的多孔性共聚物)。所说的化学固定化法，按照所用载体的种类从已知的化学固定法中适当选择，已知的化学固定法包括：例如由利用载体的芳氨基的重氮偶合反应组成的重叠化法、用CNBr活化载体的羟基然后使之与肽结合的CNBr法、使载体的肼衍生物等经历肽结合的酸叠氮化物法、包括利用载体的活性官能团(如卤素)使蛋白质烷基化的烷基化法以及包括用对游离氨基有活性的交联剂(如戊二醛)连接载体和蛋白质的游离氨基的交联法等。例如，甲酰基-Cellulofine(它是具有导入到其中的甲酰基的一种纤维素凝胶载体)或FMP活化的Cellulofine(它是具有导入到其中的FMP的Cellulofine，FMP是2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸的缩写)，两种物质均由Seikagaku公司出售，被用作载体；而且该载体的甲酰基被结合到Et-敏感因子等的氨基上，或者Et-敏感因子等的FMP和氨基或硫醇基经过取代反应生成仲胺或硫醚键合。
利用方法2或3的吸附作用制备具有固定在其上的Et-敏感的凝血因子之载体时，可以按照与针对方法1所述基本相同的方式进行在不溶性载体和溶胞产物或无β-葡聚糖敏感因子的溶胞产物之间的接触操作。
即使在使用能够特异吸附和固定Et-敏感因子的不溶性载体时，可以采用上面提到的无β-葡聚糖敏感因子的溶胞产物通过化学手段进行固定化操作。
可以在本发明中使用的不溶性载体，可以呈任何形式，例如膜状(滤纸、空心纤维、管或薄膜等等)、粒状、胶乳状、片状、粒状和微板状。
所说的溶胞产物包括按通常方式由鲎(例如Limulus Polyphemus，Tachypleus tridentatus，Tachypleus qiqas和Carcinoscorpiusrotundicauda)的血淋巴制备的变形虫状细胞的提取物(参见例如J.Biochem.，80，1011-1021，(1976))。在方法2中，可以按任何已知方法对溶胞产物进行处理，以便制备基本上不含β-葡聚糖敏感因子(因子G)的无β-葡聚糖敏感因子的溶胞产物。例如，用凝胶过滤法、使用肝素或葡聚糖固定化的亲水和吸附剂的亲合色谱法，使用具有磺丙基的离子交换树脂的离子交换色谱法和类似的方法将溶胞产物加以分级分离，参见JP-B-3-23869(本文中所用的术语“JP-B”是指经审查公告的日本专利中请)；Nakamura T.等在欧洲生物化学杂志，154，511-521(1986)；临床化学学报，149，55-65(1985)和JP-A-3-75565中所述。
能够按本发明加以检测的样品不受具体限制，而且本发明的Et检测法可以用于需要检查其Et含量或Et是否存在的任何样品；例如可以检测的生物样品、药物和医用水。本发明的Et检测法特别适用于混浊或含颜料的样品，例如可以直接检测乳汁和尿液而无需作任何专门的预处理。
利用本发明试剂的Et检测法，是通过测定由Et造成的因子C的变化，或由Et活化因子C所触发的因子C的变化转换为所涉及的酶反应所产生的底物变化来完成的。可以在本发明中使用的底物不受具体限制；适用的底物实例包括：合成肽底物和天然底物，例如凝固原。
上面提到的因子C的变化，是在Et作用下因子C变成活化的因子C的变化：而因子C体系的变化，是通过因子C的链式活化，经由因子B和预凝固酶所产生的级联反应内的变化。因此测定因子C体系的变化就意味定量或定性测定如此活化的因子中任何因子的酶活性。
可以按已知方式完成使用合成肽底物的测定。例如，可以利用具有已知可检测基因的合成肽。可以作为合成肽底物使用的，是在下列文献中记载的那些：US 4188264、JP-B-59-19532、JP-B61-54400、JP-B-63-26871、JP-B3-66319、JP-B-3-11760、JP-B-4-40340、JP-A-58-77850、JP-A-62-289767、JP-A-3-220456、WO 79/00602、WO 82/02382、EP-A-0000063、EP-A-0018112等等。典型实例包括活化的因子C的底物，例如Boc-Val-Pro-Arg-PNA和Boc-Leu-Gly-Arg-PNA；凝固酶的底物，例如合成肽(如甲氧-羧基-D-六氢酪氨酰-Gly-Arg，N-端基被保护的Leu-Gly-Arg，Ile-Glu-Ala-Arg等等)，其中C-端基精氨酸的羰基被显色残基所取代[例如对硝基苯胺、对-(N，N-二乙氨基)苯胺、对-(N-乙基-N-β-羟乙基)苯胺等]，或被发荧光的残基所取代(如F-氨甲基香素等)或被发光的残基或通过酰氨键含的氨所取代。活化的因子C、凝固酶或其它因子的酰胺酶活性，可通过测定上述因子对合成肽底物的作用所形成的反应产物加以测量。更具体，讲本发明中所用的Et检测包括；(A)一种涉及使用活化因子C的肽合成底物的方法和(B)一和涉及使用凝固酶的肽合成底物的方法。按照方法(A)，使含Et的样品与本发明试剂接触以活化因子C，然后使活化的因子C与所说的底物在或无样品液(A-1)存在下接触，或者样品同时与试剂和底物接触，使因子C活化并且该活化的因子C同时使底物分解(A-2)。在方法(B)的情况下，必要的条件是；所说的反应体系不仅应当含有固定的因子C而且还应当含有因子B和预凝固酶使之通过所说的级联反应诱发预凝固酶的活化。这些其它的因子既可以通过分部分离单独制备的那些，也可以是从中除去因子G的溶胞放产物或者其中的因子G基本上被阻止活化的溶产物。在样品从不溶性载体上除去的情况下，因子被Et活化后使活化的因子C与其它因子接触，此时该其它因子可以是像含因子G的普通溶产物。因此，方法(B)包括方法下述的方法(B-1)、(B-2)和(B-3)；(B-1)使含Et的样品与本发明试剂接触以便活化因子C并且在不从此体系中除去样品的条件下使活化的因子C与经分部分离的其它因子，或者与其中因子G被阻止活化的溶胞产物和底物接触；(B-2)；使样品和本发明的试剂接触活化因子C，然后将产品从该重金属中移出，将活化的因子C与溶胞产物接触；(B-3)；使样品同时与所说试剂的分部分离的其它因子或其中的因子G被止活化的溶胞产物接触，使预凝固酶经历级联反应的活化作用与底物因凝固酶的分解作用同时发生。
使所说的合成肽底物如此经历由活化的因子C或其它的活化的因子(如凝固酶)造成的分解作用。必要时，分解产物可以进一步经历向其它染料等的转化过程。如此释放出的染料、荧光物质。发光物质或氨借助于分光光度计、荧光光度计、化学发光分析仪、氨检测电极等加以测定(参见JD-A-62-148860或JP-A-3-75565)。必要时，可以通过将测得值与基于标准Et制剂的测量结果进行比较的方法测定或检出Et。
在上述方法A-2或B-3中，所说的试剂可以呈所谓干式化学分析法作Et-专门分析用的干型分析元件形式，其中包括一种试剂层，此试剂层中包含；其上至少固定有一种Et敏感因子的不溶性载体，一种经活化的Et敏感因子的底物或凝固酶的底物，以及必要时还有一种进行因子体系反应所必须的其它部分，其中包括由鲎变形虫状细胞衍生得到的成分、二份金属盐、缓冲液等等。
此干型分析元件可以呈任何书已知的形式而且可以按已知方法制备，例如按US-3,992,158、4,042,335和4,258,001，JP-A-55-164356、JP-A-62-134563和临床化学，24，1343(1978)等之中所方法。除了试剂层之外，该元件还可以包括扩展层，显色层、检测层、阻光层、胶粘剂层、过滤层、吸水层、胶底层、装钉层和类似的已知层。这些层可以层叠在透明性底物上。本发明的干型分析元件优选包括透明底层，例如聚(对苯二甲酸二乙酯)膜，其上述的试剂层面且还有显色层。使用此干式分析元件的Et检测可以如下进行；将样品溶液滴在该元件的显色层上，在大约37℃下保温此元件约30分钟，同反射分光计从底物侧测定颜色变化。所说的显色层可以含二氧钛作为反射层。
可以使用凝固原作为凝固酶的底物来代替上面提到的合成肽底物。在这种情况下，可以通过目测或光学检测由酶反应形成的凝度来测定因子C体系的变化，参见Stanley.W.Watson等编《内毒素以及用鲎变形虫状细胞溶胞产物试验对其进行检测》161-171页，Alan R.Liss，Inc.(1982)；化学药理学公报，36(8)，3012-3019页(1988)和胃肠外科技杂志，40(6)，284-286页(1988)。
用本发明的试剂进行Et检测时，必要的条件是；反应当含活化凝血因子C有效的二价金属盐。可以将此二价金属盐加到底物溶液中或持分析的样品中等，也可以事先将其吸附在不溶性载体上。适用的二价金属盐实例，包括镁、钙、锶、等碱土金属的氢卤酸盐，氯化物或硫酸盐。
按照本发明，可以在不降低其活性的条件下，将溶胞产物中的Et敏感因子物理或化学固定在不溶性载体上，固定有Et敏感因子的这种载体提供了一种与内毒素持异反应的试剂。
本发明提供出一种含有在其上固定有内毒素敏感凝血因子的不溶性载体的，特异性地分析内毒素用试剂。含有各种干扰反应的物质的样品，可以用试剂测定而不涉及像传统的方法中所需的任何复杂的预处理。此外，本发明的试剂长时间稳定地保持其对内毒素的灵敏度。
现在参照实施例更详细地说明本发明，但是应当想到本发明并不受其限制。
实施例1
2.7升Tachypleus tridentatus的血淋巴在4℃和1500转/分(rpm)下离心10分钟，将重60克的沉积物(变形虫状细胞)分成20克三份，每份中加入200ml 0.02M tris-hcl缓冲液(PH 8.0)，将混合物在均化器中(由Kinematica Co制造的产品，商品名是″polytron R PTIO″)充分均化后，萃取，然后在冷却下于10000xG下离心30分钟，得到550ml上清液(溶胞产物)。
将一份2ml的溶胞产物在室温下于5秒内通过尼龙滤膜(Nalge Co制造的产品，商品名为“Nalgen Syringe Filter”，直径25mm，孔径0.20μm)，此尼龙滤膜用通过50ml0.02M tris-HCl缓冲液(PH 0.8)的方法洗涤，得到一种其上吸附了Et敏感的凝血因子的尼龙滤膜(以下叫作吸附有Et敏感凝血因子的尼龙滤膜)。
制备了四块吸附了Et敏感因子的尼龙滤膜，每块切成3mm×3mm方块。将该四块尼龙滤膜分别放入四支试管中，在其中三支内各加入0.1ml蒸馏水(以下记作DW)、0.1ml EscherichiaColi 0111：B4源的Et(由Sigma Co.出售的“Westphal”型)(30pg/管)或0.1ml按下法制备的β-葡聚糖。在第四支试管中加入浓度为上述样品中二倍的0.05ml Et和0.05mlβ-葡聚糖，使其各自的最终浓度分别为30ng/管和1ng/管。向各试管中加入0.1ml 0.3M tris-HCl缓冲液(PH 8.0)，其中含有0.04M MgCl和0.1m1 2.2mM Boc-Val-Pro-Arg-PNA，然后在37℃下保温30分钟，在保温的同时每5分钟用涡流搅拌机搅拌10秒钟。保温30分钟后，加入0.3ml1.2M乙酸终止反应，在405nm下测量所释放出对硝基苯胺的光吸收，以便检查本发明试剂的反应性。得到的结果列于表1之中。
                 β-葡聚糖的制备
遵循了WO 90/02951中描述的方法。将1克Curdlan(Wako化学公司出售品)悬浮在大约100ml 5nM NaOH水溶液中用5202 PZT型超声波仪(Sonicator，东京OtakeSeisakusho制造品)在20KHz和80瓦下和冰冷却下超声处理12分钟。得到的液体用5M NaOH溶液稀释到最终浓度为0.3M。形成的溶液用凝胶渗透色谱(GPC柱：两支“TSK凝胶G 3000PWxL”一支“G2500 PWXL；移动相：0.3M NaOH水溶液；流动速度：0.5ml/分)分离后，再次色谱分离收集分子量为216000的组份，制备GPC分部分离纯化的β-葡聚糖制剂。
                     表1
 样品                                   反应活性
  Et                                      0.384β-葡聚糖                                  0.000Et+β-葡聚糖                                  0.384
从表1看出：利用使溶胞产物通过包括在聚酰胺膜中的尼龙滤膜的方法制备的，其上吸附有Et敏感因子的不溶性载体，能够特异测定Et而不受β-葡聚糖干扰。换句话说，包含本发明之不溶性载体的试剂，据证明基本不含因子G。
实施例2
将1升Limulus Polyphemus的血淋巴在4℃和1500rpm下离心10分钟，收集沉积物(变形虫状细胞)重19克。向沉积物中加入190ml 0.02M的tris-HCl缓冲液(PH 8.0)，然后在“Polytron R PTIO”型均化器中均化和提取。均化液在10000xG条件下离心30分钟同时冷却，得到170ml上清液(溶胞产物)。
将此溶胞产物与等体积15％葡聚糖(分子量：40000)水溶液混合(形成的混合物以下叫作LD混合物)。按下述方式制备三张吸附有Et敏感因子的膜。
室温下于10秒钟内使8ml所说的LD混合物通过纤维素酯滤膜(”Sterifil D-GS”，M：llipore公司生产的商品名，用乙酸纤维素和硝酸纤维素的混合物制造，孔径：0.22μm，直径：47mm)，将滤膜通过50ml 0.02M tris-HCl缓(PH 8.0)的方法充分洗涤，得到一种其上吸附有Et敏感因子的纤维素酯滤膜(以下叫作试剂A)。
试剂B和试剂C按照与试剂A相同的方式制备，但是分别使用了乙酸纤维素滤膜(“Nalgen Filterware”，Nalgen公司生产产品的商品名，孔径：0.20μm，直径：47mm)和硝酸纤维滤膜(“Nalgen Fiterware”，Nalge公司产生产品的商品名，孔径：0.20μm，直径：47mm)。
将试剂A、B和C均切成边长约5mm方块，并将其分别放在每种试剂的四支试管中。在四支试管中的三支内，加入0.1ml DW、0.1ml E.Coli 0111：B4源的Et(10pg/试管)或0.1mlβ-葡聚糖(10ng/试管)。向其余的那支试管中加入上述样品二倍浓度的0.05ml Et和0.05mlβ-葡聚糖，使各自的最终深度为10pg/试管和10ng/试管。向每支试管中加入0.1ml 0.03M的Tris-HCl缓冲液(PH 8.0)，其中含0.08M MgCl和0.1ml 1.2mM的Boc-Val-Arg-PNa，然后在振荡下于37℃保温30分钟。30分钟保温后，按次序依次加入各为0.5ml的0.04％亚硝酸钠(0.48M盐酸溶液)、0.3％氨基磺酸铵和0.07％ N-1-萘亚乙基二胺二盐酸盐，使释放出来的对硝基苯胺进行重氮偶合。取出形成的有色液体，在545nm下测量光吸收以便检验本发明试剂的反光活性。得到的结果列于表2之中。
                       表2
                           反应活性(ΔA545nm/30分钟)试剂    材料      孔径    Et   β-葡聚糖   Et+β-葡聚糖
             (μm)A     纤维素酯   0.22   0.445   0.001         0.445B    乙酸纤维素  0.20   0.431   0.000         0.431C    硝酸纤维素  0.20   0.421   0.000         0.428
表2结果证明：将溶胞产物通过纤维素滤膜(纤维素酯滤膜、乙酸纤维素滤膜或硝酸纤维素滤膜)的方法而制备的。在其上吸附有Et敏感因子的不溶性载体，不含因子G而且能够在排除β-葡聚糖干扰的条件下进行Et特异测定。
实施例3
按照Obayashi T.等人在<Clin.Chim.Acta>，149，55-56页(1985)上描述的方法，制备了不含因子G的BC组份如下：
将按实施例1制备的400ml溶胞产物加到一支其上固定有葡聚糖硫酸酯的Sepharose CL-6B柱中[5×23cm，径含0.05M NaCl的0.02M tris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡过]，用含0.2M NaCl的0.02Mtris-HCl缓冲液(PH8.0)进行提洗，从而分离因子G。然后用含0.45MNaCl的0.02M tris-HCl缓冲液(PH8.0)进行提洗，收集含图1中所示组份B和C但是基本不含因子G的BC馏份。将40ml所获得的BC馏份在减压下浓缩至10ml，在浓缩液中加入0.23克EDTA四钠盐防止因子B和C活化。
在聚苯乙烯制的9.6孔培养微板(microplate)(“ToxipetPlate 96F”，Seikagaku公司出品)的每个孔中放置0.3ml BC组份。4℃下放置3小时后，吸出残面的液体，孔中加入0.3mlDW后再将其吸出。用DW的洗涤操作再重复两次制备其上吸附有Et敏感因子的微板。
向此微板的每个孔中加入0.05ml DW、0.05mlSalmonella typhimurium源Et(Sigma公司出售的“Westphal”型品)(40pg/孔)或0.05mlβ-葡聚糖(40ng/孔)。向其余的孔中加入浓度均为上述样品中的二倍的0.025ml Et和0.025mlβ-葡聚糖，使各自的最终浓度为40pg/孔和40ng/孔。向每个孔中加入含有0.03M MgSO4和0.025ml 2.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-PNa的0.025ml 0.4M Tris-HCl缓冲液(PH8.0)。盖上微板放在干型微板恒温器中37℃下保温30分钟。依次加入各为0.05ml的0.04％亚硝酸钠(1.0M盐酸溶液)、0.03％氨基磺酸铵和0.07％N-1-萘亚乙基二胺二盐酸盐(14％N-1-甲基-2-吡咯烷酮溶液)，使如此释放出的对硝基苯胺重氨偶合。使用微板读出器在545nm下(参比波长：630nm)测量所得到的有色溶液的光吸收，以便检查本发明试剂的反应活性。所得到的结果示于表3中。
                   表3
     样品                             反应活性
                                (ΔA545nm-630nm/30分)
     Et                                  0.831
  β-葡聚糖                              0.000
Et+β-葡聚糖                             0.831
从表3看出：使用仅仅通过敏感使含Et敏感因子但基本上不含因子G的组份与聚苯乙烯接触的方法制备的、其上吸附有Et敏感因子不溶性载体，可以特异分析Et而不受β-葡聚糖的干扰影响。
实施例4
将10ml按实施例3制备的无因子G但含Et敏感因子的组份(BC组份)加到10克乙烯聚合物颗粒(Tosoh公司出售品，商品名为“TSK凝胶AF-Formyl Toyoperl 650”)中，然后于4℃下搅拌过夜。此乙烯基颗粒用0.1M磷酸钠缓冲液(PH 7.1)充分洗涤，使Et敏感因子固定在此乙烯基聚合物粒(以下叫作固定有Et敏感因子的乙烯基聚合物粒)上。
在四支试管中每支内各放入0.05克固定了Et敏感因子的乙烯基聚合物粒。在四支试管的三支内各加入0.1ml DW和0.1ml Serratia marcescens源Et(Sigma公司出售的“Westphal”型)。(20pg/管)或0.1mlβ-葡聚糖(70ng/管)向另一支试管加入深度均为上述样品二倍的0.05ml Et和0.05ml β-葡聚糖，使各自的最终浓度为20pg/试管和20pg/试管。向四支试管中各加入含0.002M CaCl2和0.1ml 1.2mM Boc-Leu-Gly-Arg-PNA的0.1ml 0.3M Tris-HCl缓冲液(PH8.0)。然后在振荡下于37℃保温30分钟。按照与实施例1同样方式使如此释放出的对硝堪苯胺重氮偶合。取出有色的液体，在545nm下测量光吸收以检查本发明试剂的反应活性。所得到的结果汇于表4中。
                       表4
 样品                             反应活性(ΔA545nm/30分钟)
    Et                                              0.402
β-葡聚糖                                           0.000
Et+β-葡聚糖                                        0.402
从表4看出：其上固定有Et敏感因子的乙烯基聚合物载体能够特异地检测Et而不受β-葡聚糖的影响。
实施例5
使用在实施例3中制备的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板，向一孔中加入0.05ml DW、0.05ml E.Coli 0114：B4源Et(60pg/孔)的Et、0.05ml从健康人体无菌收集的乳汁、其中加有Et的使最终浓度为60pg/孔的0.05ml人乳或0.05ml其中加有Et和β-葡聚糖使各自的最终浓度为60pg/孔和60ng/孔的人乳汁。向各孔中加入0.05ml含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0)，然后振荡。盖上微板后放入干型微板恒温器中37℃下保温30分钟，使Et敏感因子活化。从孔中抽出残留的液体，向孔中加入0.3mlDW后吸出之。用DW洗涤重复两次。向每个孔中加入0.1ml含0.4mM Boc-Val-Pro-Arg-PNA的0.05M tris-HCl缓冲液(PH8.0)，然后在37℃下保温10分钟。按照实施例3相同的方式使如此释放出的对硝基苯胺重氮偶合。冈微板读出器在545nm(参比波长630nm)测量所形成有色液体的光吸收，以便检查本发明试剂的反应活性。所得到的结果汇于下表5中。
                     表5
样品                         反应活性(ΔA545nm-630nm/10分)
   Et                                            0.746
  乳汁                                           0.008
乳汁+Et                                          0.754
乳汁+Et+β-葡聚糖                                0.754
从表5可以看出：即使是白色混浊的样品(按照传统的液相反应体系不能作Et检测的体系)可以按本发明用吸附有Et敏感因子的载体加以检测，以简单而特异地测定Et并不受β-葡聚糖影响。
用上面制备的试剂检测患有革兰氏阴性细胞感染引起的乳腺炎的奶牛乳汁时，测到相当高的Et值。因此，用本试剂作Et检查能够诊断革兰氏阴性菌的感染。
实施例6
使用了按实施例3制备的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板。向每个孔中加入0.05ml DW、0.05ml E.Coli 0111：B4源Et(50pg/孔)、0.05ml β-葡聚糖(50ng/孔)或0.05ml由0.025ml Et和0.025mlβ-葡聚糖(其深度均为上述样品中的二倍，使各自的最终深度为50pg/孔和50ng/孔)的混合物。向每个孔中加入0.05ml含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0)，然后在37℃下培养30分钟从而活化Et敏感因子。从孔中抽出残留的液体后，加入0.3ml DW于孔中并将其吸收。用DW的洗涤操作重复两次。向每个孔中加入0.2ml鲎变形虫状细胞溶胞产物(LAL)凝胶试剂(由Seikagakcl公司出售和Cape Cod公司生产的产品“Pyrotel”)，然后在37℃下培养30分钟。在660nm下测量浊度的增加，以便检查本发明试剂的反应活性。得到的结果汇于下表6中。
                      表6
  样品                              反应活性(ΔA660nm/30分钟)
   Et                                              0.174
β-葡聚糖                                          0.002
Et+β-葡聚糖                                       0.176
从表6可以看出：固定有Et敏感因子的聚苯乙烯载体和LAL试剂并用，能够方便地由LAL的胶凝(浊度增加)特异性地测定Et而不受β-葡聚糖的影响。
实施例7
使用了按实施例3制备的吸附有Et敏感因子的聚苯乙烯微板。向一孔中各加入0.05ml DW、Salmonella abortus同源Et(Walldolf，Pyroquant Diagnostik GmbH出售的“Novo-Pyrexal.内毒素标准NPI”)(10pg/孔)、1mg/ml核黄素溶液，其中加有Et至最终浓度为10pg/孔的相同的核黄素溶液或其中加有Et和β-葡聚糖使各自的最终浓度为10pg/孔和30ng/孔的同样的核黄素溶液。向每个孔中加入0.05ml其中含0.01M MgCl2的0.2 tris-HCl缓冲液(PH8.0)然后振荡。盖好此微板放入干式微板恒温器中37℃下培养30分钟，使Et敏感因子活化。从孔中吸出残面的液体，向孔中加入0.3ml DW后将其吸出。用DW的洗涤操作再重复两次。向每个孔中加入0.2ml生色的LAL试剂(Seikagaku生产和出售的“Toxicolor”)，此试剂是利用向LAL中加入生色的合成底物(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)的方法制备的。将此微板放在装有恒温器的微板读出装置(Seikagaku公司出售品，“Well Reader SK601”)上后，在37℃下培养30分钟。在405nm下(参见波长492nm)连续测量即对释出对硝基苯胺的消光(动力学分析法)以检查本发明试剂的反应活化。所得到的结果汇于下表之中。
                       表7
   样品                反应活性(ΔA405nm-492nm/30分钟)
        Et                               0.226
      核黄酸                             0.003
    核黄酸+Et                            0.229
核黄酸+Et+β-葡聚糖                      0.229
从表7可以看出：即使是不能像传统的液相反应体系那样用生色的合成底物作Et分析体系的黄色样品例如核黄素，也能按本发明用吸附有Et敏感因子的载体加以检测，灵敏度高和方便地测定Et而不受β-葡聚糖的影响。
实施例8
把实施例1制备的三个吸附有Et敏感因子的尼龙滤膜分别放入三个培养皿中，在每个尼龙滤膜的中心滴三种混合物，这些混合物含0.05ml(其中含0.01M MgCl2和0.8mM Boc-Val-Pro-Arg-PNA的)0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0)和DW、E.Coli0111：B4源Et(1ng/ml)或β-葡聚糖(100ng/ml)各0.05ml。盖好培养皿在培养器中37℃下培养60分钟。用目视法观察黄色，得到的结果汇于下表8中。
                         表8
    样品                                  反应活性
    DW                                        -
    Et                                        +
β-葡聚糖                                     -
从表8可以看出，使用其上吸附有Et敏感因子的膜状不溶性载体可以简易而快速地检测Et而不受β-葡聚糖影响。
实施例9
向溶胞产物中加入按WO 90/02951中所述的方法用Curdlan制备的β-葡聚糖凝血因子活化抑制剂(分子量：5800)。将所得到的混合物加到Toxipet Plate 96F的每个孔中使此板吸附Et敏感因子。
按照与实施例3相同的方式分析了与实施例3所用相同的样品，结果Et被特异测定而来受β-葡聚糖影响。
实施例10
本例的药盒由下列三种元件组成：
1.盛有25片在无Et的0.02M tris-HCl缓冲液(PH8.0)中浸过的，吸附有Et敏感因子的尼龙滤膜的小瓶；
2.盛有4.1mg无Et的生色合成肽底物(Boc-Val-Pro-Arg-PNA乙酸盐)的小瓶；
3.盛有5.5ml无Et的含0.02M MgCl2的0.15Mtris-HCl缓冲液(PH8.0)的小瓶。
使用时，在一片吸附有Et敏感因子的尼龙滤液膜上加入0.1ml样品，向其中加入将生色的合成肽底物小瓶内容物全部溶于缓冲液小瓶内容物(5.5ml)中制备的溶液0.2ml，然后在37℃下培养。
实施例11
本例的药盒由下列三种元件组成：
1.在无Et的0.02M tris-HCl缓冲液中(PH 8.0)浸泡过的用聚苯乙烯制造的、96孔吸附有Et敏感因子的微板；
2.盛有3.0mg无Et的生色合成的肽底物(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA盐酸盐)的小瓶：
3.盛有5.0ml含0.015M MgSO4的无Et的、0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0_的小瓶。
使用时，将0.05ml待分析的样品加到微板的每个孔中，向其中加入将生色的合成肽底物小瓶内容物全部溶解在缓冲液小瓶全部内容物(5.0ml)的方法制备的溶液0.05ml，然后在37℃下培养。
实施例12
本例的药盒由下列五种元件组成：
1.由聚苯乙烯制作诉、在无Et的0.02M tris-HCl缓冲液(PH8.0)中浸泡过的96孔吸附有Et敏感因子的微板；
2.盛有5.0ml的无Et的0.2M含0.01M MgCl2的tris-HCl缓冲液(缓冲液A)的小瓶；
3.盛有100ml无Et蒸馏水的小瓶：
4.盛有2.7mg无Et的生色合成肽底物(Boc-Vol-Pro-Arg-PNA乙酸盐)的小瓶：
5.盛有10ml无Et的0.05M tris-HCl缓冲液(PH 8.0)(缓冲液B)的小瓶。
使用时，将0.05ml样品加到微板的各孔中，向其中加入0.05ml缓冲液A在37℃活化。吸出此液体，用蒸馏水洗孔。然后向孔中加入0.1ml利用水发色合成肽底物瓶全部内容物溶于全部缓冲液B(10ml)中的方法制备的溶液，使此体系反应。
实施例13
本例的药盒由下列三部分组成：
1.由聚苯乙烯制成的、于无Et的0.02M tris-HCl缓冲液中(PH8.0)浸泡过的吸附有Et敏感因子的96孔微板；
2.盛有5.0ml无Et的其中含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0)的小瓶；
3.盛有100ml无Et蒸馏水的小瓶。
使用时，将0.05ml待检测的样品加到微孔板的各孔中，向其中加入0.05ml缓冲液于37℃活化。从孔中吸出液体，孔用蒸馏水洗涤。然后向孔中加入LAL、市售LAL凝胶试剂、LAL和适当的合成肽底物的组合物或市售的适于合成肽底物法使用的LAL试剂等等，接着按照所用的试剂选择适当的方法。
实施例14
本例的药盒由下列三部分组成：
1. 50片吸附有Et敏感因子的尼龙滤膜；
2.盛有1.5mg无Et的生色用合成肽底物(Boc-Val-Pro-Arg-PNA乙酸盐)的小瓶；
3.盛有2.7ml无Et的其中含0.01M MgCl2的0.2M tris-HCl缓冲液(PH8.0)的小瓶。
使用时，将0.05ml由溶解合成肽底物于全部缓冲液(2.7ml)中的方法制备的底物溶液滴在一片吸附有Et敏感因子的尼龙滤膜上，在其上再滴加0.05ml样品，然后在37℃使此体系反应。
虽然本发明参照其实施例的方法作了详细说明，但是对本领域中普遍技术人员来冰，显然可以在不违背本发明的思想和范围情况下作出各种变化和改进。

Claims (9)

1.一种用于内毒素特异检测的试剂，它是按下述方法得到的：将鲎变形虫状细胞溶胞产物或含有溶胞产物的液体施加到特异性吸附内毒素敏感因子但不能吸附(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子的不溶性载体上，以在该不溶性载体上吸附所述溶胞产物中的内毒素敏感因子，并从载体上除去残余的溶胞产物或液体，得到基本上不含(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子并对内毒素具有特异反应性的不溶性载体，其中所述不溶性载体选自聚酰胺化合物和纤维素化合物。
2.权利要求1的试剂，其中所述试剂含有对活化内毒素敏感因子有效的二价金属盐。
3.一种用于内毒素特异检测的药盒，该药盒包括(a)含有不溶性载体的用于内毒素特异检测的试剂，所述载体具有固定在其上的内毒素敏感因子，该因子来源于鲎变形虫状细胞溶胞产物，所述试剂对(1→3)-β-D-葡聚糖没有反应性；(b)活化内毒素敏感因子的底物或凝固酶的底物。
4.权利要求3的药盒，其中所述用于内毒素特异检测的试剂是权利要求1至2中任一权项的试剂。
5.权利要求3或4的药盒，其中所述药盒还包括(c)对活化内毒素敏感因子有效的二价金属盐。
6.一种用于内毒素特异检测的方法，该方法包括将样品溶液施加到用于内毒素特异检测的试剂中，使样品中的内毒素至少与该试剂中的内毒素敏感因子反应，并确定活化内毒素敏感因子的底物或凝固酶的底物的改变，所述试剂含有不溶性载体，所述载体具有固定在其上的内毒素敏感因子，该因子来源于鲎变形虫状细胞溶胞产物，所述试剂对(1→3)-β-D-葡聚糖没有反应性，并且所述样品溶液是在对活化内毒素敏感因子有效的二价金属盐的存在下与所述试剂接触的。
7.权利要求6的方法，其中所述不溶性载体选自聚酰胺化合物和纤维素化合物。
8.一种用于内毒素特异检测的方法，该方法包括将样品溶液施加到用于内毒素特异检测的含有不溶性载体的试剂中，从不溶性载体中除去残余的样品溶液，然后将不溶性载体只与鲎变形虫状细胞溶胞产物，或与鲎变形虫状细胞溶胞产物和凝固酶的合成肽底物的结合物接触，并确定所述溶胞产物或所述底物的改变，所述不溶性载体具有固定在其上的内毒素敏感因子，该因子来源于鲎变形虫状细胞溶胞产物，所述试剂对(1→3)-β-D-葡聚糖没有反应性，并且所述样品溶液是在对活化内毒素敏感因子有效的二价金属盐的存在下，被施加到试剂中的。
9.权利要求8的方法，其中所述不溶性载体选自聚酰胺化合物和纤维素化合物。
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