JP5561613B2 - エンドトキシンの濃度検出方法及びエンドトキシン検出用電極チップ - Google Patents

Description

本発明は、エンドトキシンの濃度検出方法及びエンドトキシン検出用電極チップに関する。

エンドトキシンとは、血中に入るとショック症状を起こして死に至るおそれのある発熱性物質であり、注射液など血液投与する医薬品では厳重な管理が求められている。しかし、エンドトキシンは、グラム陰性菌の外膜成分のリポ多糖であるために環境中に普遍的に存在し、さらに耐熱性であるために加熱除去が困難であり、混入防止管理は大変に難しい。

エンドトキシンの検出では、その活性を測定することが重要である。エンドトキシンの活性は、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｕｎｉｔ（ＥＵ）という単位で表され、米国食品医薬品局はエンドトキシン標準品のＥＣ−２を５ＥＵ／ｎｇと定義した。

エンドトキシンの検出法としては、現在のところ、ウサギを用いる発熱試験による方法と、カブトガニの血球成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｓｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ; ＬＡＬ）を用いる方法（ＬＡＬ法）が知られており、実験の簡便性、精度、感度、再現性の点からはＬＡＬ法が有利であると言われる。ＬＡＬ法は、検出をどのように行うかで、ゲル化法、比濁法、比色法に分かれる。

ＬＡＬ法で利用されている反応のひとつは、ＬＡＬのカスケード反応である。特許文献１には、このカスケード反応が記載されている。すなわち、カブトガニの血球細胞の抽出物（ライセート）にエンドドキシンが加わると、ライセート中に存在するＣ因子が活性化され、生成した活性型Ｃ因子がＢ因子の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティングエンザイムを活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロッティングエンザイムはコアギュローゲンのジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を限定水解してペプチドＣを遊離しつつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される。

特開平６−１３００６４号公報

上述のように、血液投与の際には、エンドトキシンの厳重な混入防止管理が求められるが、既存の検出法や検出装置では、迅速性かつ高感度が求められる医療現場に適用できるものではなかった。

例えば、エンドトキシンの検出限界は、ゲル化法では３０ＥＵ／Ｌ程度、比濁法では１５ＥＵ／Ｌ程度であり、検出の精度が高いとされる比色法であっても、１ＥＵ／Ｌに到達するのは困難であった。さらに、カブトガニ血球由来の試薬が高価なため、１回当たりの分析にコストがかかり、効果的な混入防止管理に必要な回数の測定を行うことができなかった。また、比色法は、光により検出する方法であるため、透明性の低い被検体や、多成分系の被検体（組織液等）を測定対象にできないという問題があった。

そこで、本発明の目的は、用いる試薬量は少量で、かつ、極微量のエンドトキシンしか含まれない被検体に対してもエンドトキシンの定量が可能なエンドトキシンの濃度検出方法、及びこのために用いることのできる電極チップを提供することにある。

本発明は、エンドトキシンを含む被検体と、Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体、及び色素が結合したペプチドを含む試薬を接触させて、Ｃ因子から活性型Ｃ因子を、Ｂ因子から活性型Ｂ因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させるカスケード反応と、当該活性型凝固酵素による、ペプチドからの色素の遊離反応と、を生じさせて、遊離反応後の、被検体及び試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用し、測定される電流値に基づいてエンドトキシンを定量する、エンドトキシンの濃度検出方法を提供する。

遊離反応後の被検体及び試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用することによって、ペプチドから遊離した色素を高感度に定量することができる。当該測定法によると、ペプチドから遊離して生じる極微量の色素の濃度を、ペプチドと結合した色素をはじめ、被検体が含まれる混合物に存在するその他の物質の影響を受けることなく定量することが可能となる。

ここで、本発明に係るエンドトキシンの濃度検出方法においては、色素が結合したペプチドは、一端に色素が結合し、他端にペプチド保護基が結合したオリゴペプチドであることが好ましい。

一端に色素が結合し、他端にペプチド保護基が結合したオリゴペプチドは、活性型凝固酵素の作用を受け、容易に色素を放出するために、エンドトキシンの検出精度を向上でき、測定も効率化させることができる。

本発明においては、ディファレンシャルパルスボルタンメトリにより測定される、遊離した色素の還元反応に由来するピーク電流値と、エンドトキシン濃度との相関に基づいて、エンドトキシンを定量することができる。

カスケード反応により生じる活性型凝固酵素によって、ペプチドから遊離して生じる極微量の色素と、ペプチドと結合した色素とは、酸化還元電位が非常に近接したものであると考えられる。しかし、本発明者らは、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用することによって、遊離した色素が極微量であっても、遊離した色素の還元反応に由来する電流ピークと、ペプチドと結合した色素の還元反応に由来する電流ピークとを明確に分離することが可能になることを見出した。これにより、例えば、遊離した色素の還元反応に由来するピーク電流値と、遊離した色素の濃度との相関、すなわち、遊離した色素の還元反応に由来するピーク電流値と、エンドトキシンの濃度との相関に基づいて、極微量のエンドトキシンを定量することができる。

また、測定をディファレンシャルパルスボルタンメトリで行なうため、電極表面での反応の検出が可能となり、非常に少量の被検体でも濃度測定ができるようになる。よって、僅かな量の被検体でもエンドトキシンの濃度検出が可能になるのみならず、検出の迅速性を高めることができ、非常に有用である。さらに、カブトガニ血球由来の高価な試薬の使用を大幅に節減することができ、安価な測定法の提供が可能になる。

本発明はまた、上記濃度検出方法に適用する、エンドトキシン検出用電極チップであって、基板に形成された、被検体及び試薬を収容する複数のウェルと、複数のウェル内にそれぞれ配置され、カスケード反応後の混合物に対して電圧を印加するための電極と、を備える、電極チップを提供する。この場合において、ウェルの容量は１〜２００ｍｍ^３であると好適である。ウェルの容量は１〜１００ｍｍ^３が好ましく、１〜５０ｍｍ^３がより好ましい。

上記電極チップは、一度に複数の被検体のエンドトキシン濃度を検出でき、また非常に少量の試薬及び被検体でも濃度測定が可能になる。よって、僅かな量の被検体でも安価にエンドトキシンの濃度検出が可能になるのみならず、検出の迅速性を高めることができ、非常に有用である。また、医療現場で、手軽に、迅速に、かつ高精度なエンドトキシンの定量が可能となり、血液投与を行う医薬品や医療器具に対して、エンドトキシンの厳重な混入防止管理ができるようになる。

本発明によれば、用いる試薬量は少量で、かつ、極微量のエンドトキシンしか含まれない被検体に対してもエンドトキシンの定量が可能なエンドトキシンの濃度検出方法、及びこのために用いることのできる電極チップを提供することができる。

ＬＡＬ分析における、エンドトキシンがｐＮＡを生成するプロセスの模式図である。 本発明に係る電極チップの一例を模式的に示した斜視図である。 電極チップのサイクリックボルタモグラムである。 ＬＧＲ−ｐＮＡ及びｐＮＡを含む混合物の（Ａ）ライナースイープボルタモグラム、並びに、（Ｂ）ディファレンシャルパルスボルタモグラムである。 ＬＡＬ分析における、（Ａ）反応時間１時間後、及び（Ｂ）２時間後のディファレンシャルパルスボルタモグラムである。 ＬＡＬ分析における、反応時間１時間後、及び２時間後に測定された電流値から求められたエンドトキシンの検量線である。 ＬＡＬ分析における、（Ａ）反応時間１時間後のディファレンシャルパルスボルタモグラム、及び（Ｂ）反応時間１時間後に測定された電流値から求められたエンドトキシンの検量線である。 ｒＦＣ分析における、（Ａ）反応時間１時間後、及び（Ｂ）３時間後のディファレンシャルパルスボルタモグラムである。 ｒＦＣ分析における、反応時間１時間後、及び３時間後に測定された電流値から求められたエンドトキシンの検量線である。

以下、場合により図面を参照しながら、本発明のエンドトキシンの濃度検出方法及び電極チップについて説明する。なお、図面の寸法比率は実際の寸法比率と異なっていてもよい。

[エンドトキシンの検出方法]
実施形態に係るエンドトキシンの検出方法について説明する。当該エンドトキシンの検出方法は、下記（ｉ）、（ｉｉ）のステップを含んで構成され得る。
（ｉ）エンドトキシンを含む被検体と、Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体、及び色素が結合したペプチドを含む試薬を接触させ、カスケード反応とペプチドからの色素の遊離反応とを生じさせるステップ。
（ｉｉ）遊離反応後の、被検体及び試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用し、測定される電流値に基づいてエンドトキシンを定量するステップ。
以下、（ｉ）、（ｉｉ）について詳述する。

まず、（ｉ）について説明する。
カスケード反応は、図１に示すように、エンドトキシンを含む被検体をＣ因子に作用させることにより、Ｃ因子から活性型Ｃ因子を、Ｂ因子から活性型Ｂ因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させ、当該活性型凝固酵素により、色素が結合したペプチドから色素を遊離させる反応である。

ここで、Ｃ因子とは、エンドトキシン感応性の細胞内セリンプロテアーゼ前駆体をいい、グラム陰性菌に対するカブトガニの生体防御機構カスケードの最初の反応を担当しているものである。Ｃ因子は、分子量１２３０００の糖タンパク質であり、分子量８００００の重鎖と分子量４３０００の軽鎖で構成されている。

エンドトキシンによりＣ因子は活性型Ｃ因子へと変化するが、生成した活性型Ｃ因子はＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子は凝固酵素前駆体（分子量５４，０００）を活性化して活性型凝固酵素に変換する。

なお、Ｃ因子、Ｂ因子、及び凝固酵素前駆体を含む物質として、カブトガニ・アメボサイト・ライセート（カブトガニ血球抽出液）が挙げられる。

色素が結合したペプチドとしては、一端に色素が結合し、他端にペプチド保護基が結合したオリゴペプチドを用いることができる。当該オリゴペプチドは、例えば、Ｘ−Ａ−Ｙ（式中、Ｘは保護基、Ｙは色素、Ａはオリゴペプチドである）で示されるものを挙げることができる。保護基Ｘは、ペプチドの保護基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（ＢｏＣ）、ベンゾイル基等を挙げることが可能であり、色素Ｙとしては、例えば、ｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリン）、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、ＤＮＰ（２、４−ジニトロアニリン）、Ｄａｎｓｙｌ色素等が挙げられる。オリゴペプチドとしては、アミノ酸数が２〜１０、好ましくは２〜５、さらには３〜４のものがよく、トリペプチドとしては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ；一文字表記）、及び、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＴＧＲ；一文字表記）等を例示することができる。

エンドトキシンを含む被検体と、Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体及び色素が結合したペプチドを含む試薬とを接触させる際、好ましくはｐＨ６．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．０〜８．５の緩衝液を併用することが好ましい。これにより、上記色素の遊離量を増加させることができる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉs−Ａｃ緩衝液、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液が挙げられる。

カスケード反応により生じた活性型凝固酵素によって、上記被検体及び上記試薬の混合物中には、色素が結合したペプチドから色素が遊離する。具体的には、当該色素は、例えば、色素が結合したペプチドが、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡである場合、ｐＮＡである。

カスケード反応及び遊離反応の反応温度は、好ましくは２０℃〜５０℃、より好ましくは２５〜４５℃である。また、反応時間は好ましくは３０分以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上である。これにより、充分な量の遊離色素を得ることができる。なお、被検体と試薬の合計容量が１〜２００ｍｍ^３（特には１〜１００ｍｍ^３、さらには１〜５０ｍｍ^３）のように少ない場合は、反応温度を３０〜４０℃とし、反応時間を１５分〜１時間とすることができる。

続いて、（ｉｉ）について説明する。
（ｉｉ）遊離反応後、上記被検体及び上記試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用し、測定される電流値に基づいてエンドトキシンを定量する。すなわち、反応後の上記被検体及び上記試薬の混合物には、ペプチドから遊離した色素が存在しており、特定の電位において、当該色素が酸化及び還元反応する。この酸化又は還元反応に由来する電流ピークのピーク電流値と、色素の濃度、すなわち、エンドトキシンの濃度との間には相関が成り立ち、当該相関を利用して、色素の濃度を定量する。

具体的には、色素がｐＮＡである場合、電極電位が還元電位以下になると、ｐＮＡは下記式（１）のスキームに従って電極から電子を受取り、還元される。このときの電子の受け渡しが電流として観察される。ディファレンシャルパルスボルンメトリ法で測定されるピーク電流値は、ｐＮＡの濃度に比例する。エンドトキシン濃度とカスケード反応の進行には相関があるため、エンドトキシン濃度と生じたｐＮＡの濃度、すなわちピーク電流値にも相関が生じる。したがって、エンドトキシン濃度とピーク電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、ピーク電流値から、エンドトキシンの濃度を測定することができる。

上記被検体及び上記試薬の混合物には、ペプチドから遊離した色素のほかに、ペプチドに結合した色素も存在する。ペプチドから遊離した色素と、ペプチドに結合した色素とは、酸化還元電位が非常に近接しており、一般に、分離が非常に困難であると考えられている。また、これらの濃度が微量であるほど、酸化還元電流を得ることは難しい。本発明によれば、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用することにより、極微量のペプチドから遊離した色素の還元に由来する電流ピークと、極微量のペプチドに結合した色素の還元に由来する電流ピークとを分離して得ることができ、エンドトキシンの濃度を高い精度で検出することができる。

上述のように、極微量のペプチドから遊離した色素の還元に由来する電流ピークと、極微量のペプチドに結合した色素の還元に由来する電流ピーク両者の電流値のピークを明確に分離できたことは驚くべき効果である。また、比色法のように、光により検出する方法ではないため、透明性の低い被検体や、多成分系の被検体（組織液等）も測定対象にできると考えられ、実用性が極めて高い。

次に、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを行う際の具体的な操作を説明する。上記被検体及び上記試薬の混合物に、電極を入れ、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）に基づく測定を行う。すなわち、作用極に、時間変化に伴って電位を一定方向に走査しながら複数のパルス電位を印加する。電位は参照極に対して制御し、電流は作用極と対極の間に流す。複数のパルス電位は、パルス幅ΔＥが互いに等しく、かつ、第１のパルス電位の電位ステップ(ΔＥ_１）が終了した直後の電位Ｅ_１，ｅと、当該第１のパルスのすぐ後の第２のパルス電位の電位ステップ（ΔＥ_２）が開始する直前の電位Ｅ_２，ｓとが等しい。第１の電位ステップが開始する直前の電流値Ｉ（ｔ_１，ｓ）と、当該第１の電位ステップが終了する直前の電流値Ｉ（ｔ_１，ｅ）との差ΔＩをＤＰＶの電流値として測定する。印加電位を横軸に、ＤＰＶの電流値を縦軸にプロットしたグラフを用いることで、ピーク電流値を求める。エンドトキシン濃度とピーク電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、ピーク電流値からエンドトキシンの濃度を算出すことができる。

使用する電極に特に制限はないが、作用極には、例えばグラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト電極、グラファイト電極を、対極にはＡｕ、Ｐｔ等の電気化学的に安定で挙動がよく知られている電極を、参照極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極等を用いることができる。測定装置としては、通常電気化学測定に使用されるポテンショスタットや同等の機能をもつ装置を使用することができる。

電位の印加は、例えば、通常のＤＰＶの電位パルスの印加モードであればよい。例えば、パルス幅ΔＥ（ΔＥ_１、ΔＥ_２）は、１〜２５０ｍＶとすることができる。また、パルス電解時間（ｔ_１，ｅ−ｔ_１，ｓ）は、５〜２００ｍｓとすることができる。また、電位走査速度は、１〜２００ｍＶ／ｓとすることができ、検出感度を向上させる観点から、１〜１０ｍＶ／ｓとすることがより好ましい。

次に、エンドトキシン検出用電極チップについて説明する。図２は、実施形態に係る電極チップの斜視図である。図２に示す電極チップ１は、表面に絶縁層を有する矩形状のガラス基板２の主面上に、複数の貫通孔が形成された矩形状プレート５が設けられたものである。ガラス基板２の表面には、複数の炭素電極３及び端子７がガラス基板２の長手方向にそれぞれ一列に形成されている。また、ガラス基板２と絶縁層との間には、上記炭素電極３と端子７とを一対にして、両者を電気的に接続させる導線４が複数形成されている。複数の貫通孔が形成された矩形状プレート５が、炭素電極３がウェル６内に配置されるようにガラス基板２の主面上に配置されることにより、電極チップ１は、ウェル６内に１つの炭素電極３が設けられたウェルを複数備えることとなる。

ガラス基板２としては、ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）フィルムが表面に形成されたガラス基板を使用できる。これにより、炭素電極３や、場合により導線４や端子７をエッチングにより形成することができる。炭素電極３がウェル６内に設けられることにより、電極チップ１をエンドトキシンの検出装置に好適に用いることができる。なお、ウェル内部に設けられた炭素電極３に接続する導線４及び、導線４に炭素電極３と一対となるように接続される端子７は、導電性の観点から、金または白金電極であることが好ましい。

貫通孔が形成されたプレート５としては、耐薬品性、耐衝撃性に優れる等の観点から、ポリジメチルシロキサン、アクリル樹脂等が挙げられる。

ＤＬＣが表面に形成された基板、及び貫通孔が形成されたプレートの形状は特に制限されず、正方形、矩形、円形、楕円形等いずれの形状であってもよい。また、ウェル６の形状も特に制限されないが、プレートへの貫通孔の形成させやすさの観点から、ウェル６の断面形状は、円形、楕円形が好ましい。電極チップは、検出対象物を含む液を数μＬ〜数十μＬ程度用いて測定することから、ウェルの大きさは、ウェルの断面が円形の場合は、φ＝１〜５ｍｍであればよく、深さは１〜１０ｍｍであればよい。

[エンドトキシン検出用電極チップの製造方法]
以下、エンドトキシン検出用電極チップの製造方法について説明する。エンドトキシン検出用電極チップは、下記（ａ）〜（ｅ）のステップを含む方法により製造し得る。
（ａ）基板の洗浄
導電性ＤＬＣ基板の表面を、アセトン、２−プロパノール、超純水等を用いて洗浄する。さらに、Ｏ_２プラズマアッシング処理を行ってもよい。
（ｂ）フォトレジストパターニング
炭素電極を形成するエッチング工程に先立ち、ウェル６内部に配置される電極になる部分をフォトレジストで覆う。フォトレジストは、スピンコータ等でフォトレジスト前駆体を塗布し、７５〜１１０℃、６０〜１２０秒間のプレベークの後、水銀ランプ等で露光し現像する。フォトレジストとしては、ナフトキノンアジド系アルカリ可溶性シリコーンポリマー等を使用できる。
（ｃ）エッチング
例えば、Ｏ_２プラズマアッシング装置により、ＤＬＣのエッチングを行う。さらに、Ｏ_２エッチングの終了した基板を、ガラスとＤＬＣの間に介在する金属等から構成される中間層をエッチングする。
（ｄ）導線部の作製
炭素電極の対になる端子７及び導線４を形成するために、スパッタリング装置で、所望の金属のスパッタリングを行う。金スパッタの場合、ガラスとの密着性を向上させる観点から、金スパッタの前に、ＴｉあるいはＣｒスパッタ及びＰｄスパッタを行うことが好ましい。
（ｅ）絶縁膜パターニング
導線４を被覆する目的で、絶縁膜のパターニングを行う。絶縁膜の前駆体を塗布した後、７５〜１１０℃で１〜３０分間べークした後、フォトマスクを用い、水銀ランプを露光し、露光部の架橋反応を行うために８０〜１２０℃で３〜１２０分間ポストべークする。現像し、リンスを行った後、１５０〜２００℃で３０〜１２０分間ハードべークを行うことによって、絶縁膜を得ることができる。絶縁膜の材料としては、エポキシ系フォトレジスト、ポリイミドレジスト等を使用できる。

上述のようにして、本実施形態に係る電極チップを製造することができる。本電極チップは、ウェルを複数有するため、連続的に測定が可能であり、かつ、小型化が可能であるため、医療用現場で実用的に使用することができる。

次に、上記電極チップを用いたエンドトキシンの検出について説明する。

[エンドトキシンの検出]
上記電極チップを用いたエンドトキシンの検出法においては、上記ウェル６中に、エンドトキシンを含む被検体溶液と、Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体及び色素が結合したペプチド（合成基質）を含む試薬とを混合した液を収容し、一定時間反応させる。次に電極を配置し、時間変化に伴って電位を一定方向に走査しながら複数のパルス電位を印加する。複数のパルス電位は、パルス幅ΔＥが互いに等しく、かつ、第１のパルス電位の電位ステップΔＥ_１が終了した直後の電位Ｅ_１，ｅと、当該第１のパルスのすぐ後の第２のパルス電位の電位ステップΔＥ_２が開始する直前の電位Ｅ_２，ｓとが等しく、第１の電位ステップが開始する直前の電流値Ｉ（ｔ_１，ｓ）と、当該第１の電位ステップが終了する直前の電流値Ｉ（ｔ_１，ｅ）との差を測定することにより、エンドトキシンの濃度を算出すことができる。

色素としてｐＮＡを用いる態様においては、ｐＮＡが結合したペプチド（合成基質）から分離して生じるｐＮＡに由来する電流値のピークと、合成基質に結合したｐＮＡに由来する電流値のピークとを、精度よく分離して検出することができる。したがって、合成基質から分離して生じるｐＮＡと合成基質に結合したｐＮＡとを直接分離せずとも、合成基質から分離して生じるｐＮＡのみを、選択的かつ高精度に検出できる。また、上記電極チップは、ウェルを複数有するため、連続的に測定が可能であり、かつ、小型化が可能であるため、医療用現場で実用的に使用することができる。

以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。

以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

本実施例で使用した試薬は以下の通りである。
［試薬］
１）標準エンドトキシン溶液：エンドトキシン標準品はＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）キット添付のＥ．ｃｏｌｉ０５５：Ｂ５由来Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄを用いた。ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）キットはＣａｍｂｒｅｘ社又はＬｏｎｚａ社より購入した。標準エンドトキシン溶液は、ＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）キット添付のエンドトキシンフリー水を用いて調製し、使用の直前に１５分間以上ボルテックスミキサーで激しく攪拌した。なお、エンドトキシン濃度は測定溶液中の最終濃度で示した。
２）５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃ緩衝液（ｐＨ ７．５）：混入エンドトキシンを除去するためにＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）ｍｅｍｂｒｅｎ付きＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ｕｎｉｔｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＵＳＡ)でフィルタリングした。
３）ＬＡＬ酵素溶液としては、Ｃ因子、Ｂ因子および凝固酵素前駆体を含むライセート試薬と、合成基質のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＬＧＲ−ｐＮＡ）が凍結乾燥状態で１テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ−２４Ｓセットの試薬を用いた。
４）ｒＦＣ（組み換えＣ因子）酵素溶液としてはＰｙｒｏＧｅｎｅ（登録商標）キットの試薬を用いた。合成基質のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＶＰＲ−ｐＮＡ；渡辺化学工業社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍＭのストック溶液として−２０℃で保管した。ＶＰＲ−ｐＮＡの希釈には上記Ｔｒｉｓ−Ａｃ緩衝液を用いた。試薬の調製はエンドトキシンのコンタミネーションを防ぐためにクリンベンチ内で行った。
５）ＬＧＲ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ社製)及びｐＮＡ（和光純薬工業社製)：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍＭのストック溶液として−２０℃で保管した。ＬＧＲ−ｐＮＡ及びｐＮＡの希釈にはエンドスペシー（登録商標）に添付されている緩衝液を用いた。

本実施例における電気化学測定法で用いた装置及び測定法は以下の通りである。
［装置及び測定法］
１） 測定装置：ポテンショスタット（Ｉｖｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＣｏｍｐａｃｔＳｔａｔ）
２） 電極：９６ウェルを用いる測定；作用極には直径１ｍｍのグラッシーカーボン（ＧＣ）ディスク電極（ＢＡＳ株式会社製）を、対極にはＡｕシートを、参照極にはＡｇ／ＡｇＣｌをそれぞれ用いた。作用極表面の状態を一定に保つため、1回の測定ごとにＧＣ電極表面を０．０５μｍのアルミナスラリー（Ｂｕｅｈｌｅｒ）で1分以上研磨した。電極チップを用いる測定；チップ上の直径１．０ｍｍの炭素電極を作用極として使用し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極とＰｔ対極（φ＝２００μｍのＰｔ線）をウェルへ挿入して測定を行った。
３）測定法：ライナースィープボルタンメトリ（ＬＳＶ）；走査速度２０ｍＶ／ｓで行った。ディファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）；パルス時間７０ｍｓ、パルス幅５０ｍＶ、電位ステップ５ｍＶ、走査速度５ｍＶ／ｓで行った。電位はすべてＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基準にした。

本実施例におけるエンドトキシンの検出法は以下の通りである。

＜ＬＡＬカスケード反応を用いるエンドトキシンの検出＞
ライセート試薬、ＬＧＲ−ｐＮＡおよび緩衝液は、エンドスペシー（登録商標）添付の試薬を用いた。ライセート試薬および基質の凍結乾燥試薬の入った試験管へ、緩衝液２００μＬおよびエンドトキシン標準溶液２００μＬを添加して撹拌し、２００μＬを９６ウェルプレートへ移した。エンドトキシンがＣ因子への結合する反応がトリガーとなり、Ｂ因子、凝固酵素を次々に活性化してＬＡＬカスケード反応が進む。室温で１時間または２時間後、凝固酵素によりＬＧＲ−ｐＮＡから遊離したｐＮＡを直径１ｍｍのＧＣ電極でＤＰＶにより検出した。

＜電極チップを用いるエンドトキシンの検出＞
［電極チップの作製］
炭素電極チップは、下記に示した方法で電極が形成される導電性ＤＬＣ基板と、貫通孔が形成されたポリジメチルシロキサンプレートとから構成される。
（導電性ＤＬＣ基板への電極の形成）
（ａ）基板の切り落としと洗浄
基板には、ナノテック株式会社製のＤＬＣがガラス基板の表面に製膜された、導電性ＤＬＣ基板を用いた。基板をガラスカッターで２．０ｃｍ×３．０ｃｍに切り出し、表面をアセトン、２−プロパノール、超純水の順に用いて洗浄した。さらに３０秒間Ｏ_２プラズマアッシング処理を行って、表面を清浄化した。
（ｂ）フォトレジストパターニング
ナフトキノンアジド系フォトレジストでアルカリ可溶性シリコーンポリマーを含有するポジ型フォトレジストのＦＨ−ＳＰ（富士ハントエレクトロニクステクノロジー社製）を５０００ｒｐｍでＤＬＣ表面に３０秒間スピンコートした。９０℃、９０秒間プレべークの後、水銀ランプで３０秒間露光した。主成分がＴＭＡＨである専用現像液ＦＨＤ−５（富士フィルムエレクトロニクス）で現像し、蒸留水中でリンスした。
（ｃ）エッチング
Ｏ_２プラズマアッシング装置（ヤナコ社製、ＬＴＡ−１０１）を用いて導電性ＤＬＣ基板のエッチングを行った。１００Ｗで約６０分間アッシングを行うと、導電性ＤＬＣのパターンが作製された。さらに、ガラスと導電性ＤＬＣの中間層であるバインダー金属をエッチングするために、所定のエッチング液へ、Ｏ_２エッチングの終了した基板を浸漬し、溶液をパドルしながら約１時間反応させた。
（ｄ）導線４及び端子７の作製
高周波マグネトロンスパッタリング装置（キヤノンアネルバ社製、Ｌ−３３２Ｓ−ＦＨ）を用いた。バインダーとしてＴｉとＰｄを用いた。スパッタリング条件は下記の通りである。
Ａｒ流量：１０ｃｍ^３／ｍｉｎ
チャンバー内圧：１０Ｐａ
チャンバー内温度：１００℃
ＲＦ出力：２００Ｗ
Ｔｉ析出時間：７分間、Ｐｄ析出時間：４分間、Ａｕ析出時間：７分間
（ｅ）絶縁膜パターニング
導線４を被覆する目的で、ガラス基板表面に下記の方法でＳＵ−８絶縁膜のパターニングを行った。
疎水化剤としてＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＰＲＩＭＥＲを３０００ｒｐｍで１０秒間スピンコートした後、エポキシ系のネガ型フォトレジストＳＵ−８ ３０１０（マイクロケム社製）を３０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。次に、レジストの溶媒を蒸発させるため、９５℃で５分間べークした後、フォトマスクを用い、水銀ランプ（ミカサ社製、ＭＡ−２０）を３０秒間露光した。露光部の架橋反応を行うために、９５℃で５分間ポストべークした。室温まで冷却後、ＳＵ−８ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（有効成分：１−メトキシ−２−プロピルアセトン；ミクロケム社製）で現像した。リンスは２−プロパノールで行った。さらに、１８０℃で３０分間ハードべークを行うことによって、架橋反応を進めた。

（ウェルが形成されたポリジメチルシロキサンプレート）
内径３．０ｍｍ、深さ５．０ｍｍの貫通孔が６個形成されたポリジメチルシロキサンプレートを準備した。

ポリジメチルシロキサンプレートのウェルの内部に、炭素電極が配置されるように、ガラス基板上にポリジメチルシロキサンプレートを取り付けた。図２に、作製された電極チップの斜視図を示す。得られた電極チップは、コンタミネーションを防ぐために、使用直前に３０秒のプラズマアッシング処理を行った。

［電極の評価］
電極チップの評価を下記のとおり行った。ウェルが形成されたポリジメチルシロキサンプレートを取り付けた電極チップを３０秒間プラズマアッシング処理し、ウェルへ４ｍＭフェロシアン化カリウム水溶液（０．１Ｍ ＫＣｌ含む）を４０μＬ添加した。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極とＰｔ対極（φ＝２００μｍ Ｐｔ線）をウェルへ挿入し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を行った。電位は１００ｍＶ／ｓで−０．５Ｖ→１．０Ｖ→−０．５Ｖと走査した。６チャネルの測定結果を図３に示す。チャネル１が他のピークと比較して少しピークセパレーションが広く、ボルタモグラム全体が還元方向にシフトした形状となったが、その他のピークはほぼ同じ形状になった。下記式（２）に示す可逆系のボルタモグラムのピーク電流の式から電極直径を計算した。

ここで、Ｉｐａは酸化電流ピーク（Ａ）、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数（９．６５×１０^４Ｃ・ｍｏｌ^−１）、Ａは電極面積（ｃｍ^２）、Ｄ_Ｒは還元種の拡散係数（ｃｍ^２・ｓ^−１）、ｖは走査速度（Ｖ・ｓ^−１）、Ｃ_Ｒ ^＊は還元種のバルク濃度（ｍｏｌ・ｃｍ^−３）、Ｒは気体定数（８．３１Ｊ・ｍｏｌ^−１・Ｋ^−１），Ｔは温度（Ｋ）である。Ｆｅ（ＣＮ）_６ ^４−の拡散係数は６．５×１０^−６ｃｍ^２・ｓ^−１とした。その結果、チャネル１は電極直径が０．９５６ｍｍ、その他の電極は０．９９４から１．００１ｍｍと計算された。算出された電極面積の統計値を表１に示す。

炭素電極は直径が１．０ｍｍになるように設計して作製しており、ほぼ設計どおりの大きさの電極が出来上がった。また、標準偏差および変動係数も非常に小さく、大きさの揃った電極が作製できた。また，サイクリックボルタモグラムのピークは、チャネル１は酸化ピークが０．３１Ｖ、還元ピークが０．１５Ｖ、その他のチャネルは酸化ピークが０．２８Ｖ（チャネル５のみ０．２７Ｖ）、還元ピークが０．１８Ｖに現れた。この結果より、ピークセパレーションは０．０９Ｖから０．１６Ｖでフェロシアン化イオンの電極反応は十分に速く，どの電極も同様の反応性をもつことが分かった。

エンドスペシー（登録商標）のライセート試薬および基質の凍結乾燥試薬の入った試験管へ、エンドスペシー（登録商標）に添付されている緩衝液２００μＬを添加して試薬を溶解し、反応試薬とした。反応試薬２０μＬおよびエンドトキシンサンプル溶液２０μＬを電極チップのウェルへ添加し、軽く撹拌して室温で１時間または２時間反応させた。反応後、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極とＰｔ対極（φ＝２００μｍ Ｐｔ線）をウェルへ挿入し、ＤＰＶによる測定を行った。

以下、各種評価結果について説明する。
（１）ＬＳＶに対するＤＰＶの有用性の評価
ＬＧＲ−ｐＮＡとｐＮＡの混合溶液（エンドスペシー（登録商標）に添付されている緩衝液溶液、ＬＧＲ−ｐＮＡとｐＮＡの濃度合計：１００μＭ）に対して、ＬＳＶとＤＰＶを行った。測定の結果を図４に示す。ＬＳＶのボルタモグラムには−０．６５Ｖ付近と−０．８４Ｖ付近に（図４（Ａ）参照）、また、ＤＰＶのボルタモグラムには−０．６０Ｖ付近と−０．７７Ｖ付近（図４（Ｂ）参照）にピークがみられ、それぞれＬＧＲ−ｐＮＡとｐＮＡのピークであることがわかった。ＬＳＶのピークと比較して、ＤＰＶのピークは二つのピークが明確に分離され、ピークの大きさと対応する分子種の濃度の相関が良好であった。すなわち、グラフ（ａ）〜（ｆ）に対応するＬＧＲ−ｐＮＡとｐＮＡの濃度比（Ｍ_{ＬＧＲ−ｐＮＡ}：Ｍ_ｐＮＡ）は、（ａ）１００μＭ：０μＭ、（ｂ）９０μＭ：１０μＭ、（ｃ）７５μＭ：２５μＭ、（ｄ）５０μＭ：５０μＭ、（ｅ）２５μＭ：７５μＭ、（ｆ）０μＭ：１００μＭであった。
これらの結果から、ＬＧＲ−ｐＮＡとｐＮＡの混合溶液からｐＮＡを定量検出するには、ＤＰＶが適当であるとわかった。

（２）ＬＡＬカスケード反応を用いるエンドトキシンの電気化学検出
実施例１
ライセート試薬および基質の凍結乾燥試薬の入った試験管へ、緩衝液２００μＬおよびエンドトキシン標準溶液２００μＬを添加して撹拌し、２００μＬを９６ウェルプレートへ移した。室温で１時間または２時間反応し、直径１ｍｍのＧＣ電極でＤＰＶ測定を行った。結果を図５に示した（図５（Ａ）は反応時間１時間後、図５（Ｂ）は反応時間２時間後）。ＬＧＲ−ｐＮＡ及びｐＮＡ由来のピークがそれぞれ−０．６４Ｖと−０．７５Ｖ付近に観察された。ＬＧＲ−ｐＮＡのピークには−０．６Ｖ付近にみられる別のピークが重なっていた。エンドトキシンの濃度は、（ａ）０ＥＵ／Ｌ、（ｂ）０．５ＥＵ／Ｌ、（ｃ）５ＥＵ／Ｌ、（ｄ）５０ＥＵ／Ｌ、（ｅ）５００ＥＵ／Ｌであり、エンドトキシンの濃度が高くなるに従って−０．６４Ｖ付近のＬＧＲ−ｐＮＡ由来のピークが減少し、−０．７５Ｖ付近のｐＮＡ由来のピークが増大した。
０ＥＵ／Ｌの電流値を基準とした−０．７５Ｖ付近のピーク電流値をシグナルに採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを図６に示す。それぞれの点は５回の繰り返し実験の平均値であり、エラーバーは±標準偏差を示す。ＤＰＶのシグナルはエンドトキシン濃度および反応時間に依存した．本手法によって反応時間１時間では５ＥＵ／Ｌ以上のエンドトキシンの検出が可能であり、反応時間２時間では０．５ＥＵ／Ｌ以上の検出が可能であった。カスケード反応を利用しない、後述のｒＦＣ分析（図８及び９）と比較するとＬＡＬのカスケード反応を利用することによって、約１万倍の感度上昇効果を得ることができたことが分かった。

（３）炭素電極チップによるエンドトキシンの検出
実施例２
炭素電極チップによるエンドトキシンの検出を行った。エンドスペシー（登録商標）の凍結乾燥試薬を緩衝液で溶解した反応試薬とエンドトキシン水溶液をそれぞれ２０μＬずつ各ウェルへ入れて混合し、１時間反応させた後にＤＰＶで測定したボルタモグラムを図７（Ａ）に示す。エンドトキシンの濃度は、（ａ）０ＥＵ／Ｌ、（ｂ）０．５ＥＵ／Ｌ、（ｃ）５ＥＵ／Ｌ、（ｄ）５０ＥＵ／Ｌ、（ｅ）５００ＥＵ／Ｌであり、エンドトキシンの濃度が高くなるに従って、−０．６３Ｖのピークが減少し、−０．８５Ｖから−０．８Ｖに新たなピークが出現した。このことから、−０．６３ＶのピークはＬＧＲ−ｐＮＡ由来であり、−０．８５Ｖから−０．８ＶのピークはｐＮＡ由来であると分かる。
検量線の作製には、０ＥＵ／Ｌのサンプルを３回測定したときの−０．８５Ｖの平均電流値（−０．２０９μＡ）とそれぞれのサンプルについて−０．８５Ｖから−０．８Ｖに現れるピーク電流値との差を用いた。作製した検量線を図７（Ｂ）に示す．ドットは３回の繰り返し実験の平均値，エラーバーは３回の測定の±標準偏差を表す．この検量線から、本手法によって５ＥＵ／Ｌ以上のエンドトキシンが１時間の反応時間で検出できることがわかった。炭素電極チップを用いた本結果は、実施例１の結果とほぼ同じであった。

比較例１
（４）ｒＦＣを用いるエンドトキシンの電気化学検出
エンドトキシンを含む被検体と、Ｃ因子（９９４アミノ酸残基をもつ１０９６４８Ｄａの組み換えＣ因子：ｒＣＦ）及び色素が結合したペプチドを含む試薬と、を接触させて、Ｃ因子から活性型Ｃ因子を発生させ、色素が結合したペプチドから色素を遊離させた。遊離反応後の、被検体及び試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用し、エンドトキシンの検出を行った。９６ウェルプレートにＴｒｉｓ−Ａｃ緩衝液、ｒＦＣ酵素溶液、ＶＰＲ−ｐＮＡ溶液、エンドトキシン標準溶液を入れて３７℃で１時間あるいは３時間反応させ、遊離したｐＮＡを直径１ｍｍのＧＣ電極でＤＰＶにより検出した。ＤＰＶ法によるエンドトキシンの検出の（Ａ）反応１時間後、（Ｂ）反応３時間後のボルタモグラムを図８に示す。エンドトキシンの濃度は、（ａ）０ＥＵ／Ｌ、（ｂ）１０ＥＵ／Ｌ、（ｃ）１００ＥＵ／Ｌ、（ｄ）１０００ＥＵ／Ｌ、（ｅ）５０００ＥＵ／Ｌ、（ｆ）１００００ＥＵ／Ｌであり、１００ＥＵ／Ｌから１０，０００ＥＵ／Ｌの範囲で、エンドトキシン濃度が高くなるに従ってＶＰＲ−ｐＮＡ由来の−０．６０Ｖ付近のピークが減少し、ｐＮＡ由来の−０．７５Ｖ付近のピークが増大した。０ＥＵ／Ｌの電流値を基準とした−０．７５Ｖ付近のピーク電流値をシグナルに採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを図９に示す。それぞれの点は５回の繰り返し実験の平均値、エラーバーは±標準偏差を表す。ＤＰＶのシグナルはエンドトキシン濃度および反応時間に依存することが分かった。
本手法によって反応時間１時間では５，０００ＥＵ／Ｌ以上のエンドトキシンの検出が可能であり、反応時間３時間では１，０００ＥＵ／Ｌ以上の検出が可能であった。しかし、一般的なエンドトキシン検出法であるＬＡＬ法は３０分で１０ＥＵ／Ｌの検出が可能であり、また、長期透析液の管理など医療現場では３０分で１ＥＵ／Ｌの検出法が求められていることから、実用化には大幅な感度の改善が必要である。

以上、本実施例によれば、反応時間２時間で０．５ＥＵ／Ｌのエンドトキシン検出が可能になり、ｒＦＣを用いるエンドトキシンの電気化学検出法と比較しても感度が顕著に向上することとが明らかである。

１…電極チップ、２…ガラス基板、３…炭素電極、４…導線、５…プレート、６…ウェル、７…端子。

Claims (5)

1. エンドトキシンを含む被検体と、
   Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体、及び色素が結合したペプチドを含む試薬を接触させて、
   前記Ｃ因子から活性型Ｃ因子を、前記Ｂ因子から活性型Ｂ因子を、前記凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させるカスケード反応と、当該活性型凝固酵素による、前記ペプチドからの前記色素の遊離反応と、を生じさせて、
   前記遊離反応後の、前記被検体及び前記試薬の混合物に対して、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用し、測定される電流値に基づいてエンドトキシンを定量する、エンドトキシンの濃度検出方法。
2. 前記ペプチドは、一端に前記色素が結合し、他端にペプチド保護基が結合したオリゴペプチドである、請求項１記載の濃度検出方法。
3. ディファレンシャルパルスボルタンメトリにより測定される、遊離した前記色素の還元反応に由来するピーク電流値と、エンドトキシン濃度との相関に基づいて、エンドトキシンを定量する、請求項１又は２記載の濃度検出方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の濃度検出方法に適用する、エンドトキシン検出用電極チップであって、
   基板に形成された、前記被検体及び前記試薬を収容する複数のウェルと、
   前記複数のウェル内にそれぞれ配置され、前記カスケード反応後の前記混合物に対して電圧を印加するための電極と、を備える、電極チップ。
5. 前記ウェルの容量は１〜２００ｍｍ^３である、請求項４記載のエンドトキシン検出用電極チップ。
   

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