WO2017038956A1 - くし型電極を用いた糖化タンパク質の測定方法 - Google Patents

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comb
glycated protein
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protease
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祐生 植田
早出 広司
若子 津川
昌昭 栗田
尚 西森
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有限会社アルティザイム・インターナショナル
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    • G01N2800/042Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a glycated protein in a sample and a biosensor for the measurement.
  • the blood concentration of glycated protein reflects the average blood glucose level over a certain period in the past, and the measured value of the blood concentration can be an important indicator for diagnosis and management of diabetes symptoms.
  • Known glycated proteins include hemoglobin A1c (HbA1c), which is a glycated protein of hemoglobin, and glycated albumin (GA), which is a glycated protein of albumin. Since the blood concentration of glycated protein is a stable index reflecting a long-term (several weeks to several months) blood glucose level, it is useful for determining the success or failure of blood glucose control for the diagnosis and treatment of diabetes.
  • Patent Document 1 discloses a method of measuring using fructosyl amino acid oxidase (hereinafter sometimes referred to as “FAOD”). Prior to reacting a sample with FAOD, the method disclosed in Patent Document 1 pretreats the sample with a protease to decompose a glycated protein into a glycated peptide and a glycated amino acid, thereby increasing the reaction rate of FAOD, The detection sensitivity of glycated protein is increased.
  • known methods such as a colorimetric method, a fluorescence method, and an electrochemical method are used.
  • the biosensor disclosed in Patent Document 2 is a biosensor in which FAOD is immobilized on an electrode together with an artificial electron mediator using a water-soluble photocurable resin, and is a biosensor that measures a glycated protein concentration by an electrochemical method. is there.
  • Patent Document 3 discloses a measurement method in which a biosensor using a comb-type electrode is applied to measurement of blood components such as glucose.
  • a biosensor having a comb-type electrode oxidizes a blood component with an oxidoreductase, detects an oxidation current due to the reaction product with the electrode, and measures the blood component.
  • Patent Documents 1 and 2 use a known method such as an electrical measurement method for FAOD titer measurement, both of which are insufficient in sensitivity and data stability, and are put into practical use. It was difficult.
  • the measurement method using the biosensor of Patent Document 3 relates to measurement of blood components such as glucose, and its application to measurement of glycated protein is unknown.
  • An object of the present invention is to solve such a problem and to make it possible to measure a glycated protein concentration in a sample with high sensitivity simply and inexpensively.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, it is surprising that a sample in which a protease is brought into contact and a decomposition product is generated from a glycated protein is reacted with a combination of an electron mediator and a comb-type electrode. In particular, the present inventors have found that the glycated protein concentration in a sample can be determined with high sensitivity simply and inexpensively, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for measuring glycated protein in a sample wherein (1) a sample in which a degradation product is produced from glycated protein by protease and oxidoreductase is reacted in the presence of an electron mediator to reduce the glycated protein. And (2) a step of detecting the reaction state in step (1) by an electrochemical method using a comb-type electrode.
  • the comb-shaped electrode has a total area of 1.8 mm 2 to 4 mm 2 , an interelectrode distance of less than 50 ⁇ m, a working electrode width of 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, and a counter electrode width of 5 ⁇ m to The measuring method according to any one of [1] to [6], which is 100 ⁇ m.
  • a biosensor for measuring glycated protein in a sample comprising (1) a composition comprising an electron mediator and an oxidoreductase, and (2) a comb-type electrode, which is produced from a glycated protein by a protease. Biosensor that reacts the decomposition product with oxidoreductase.
  • a biosensor for measuring glycated albumin in a sample comprising (1) a composition containing 300 mmol / L or more of hexaammineruthenium (III) chloride and 12 U / mL or more of fructosyl amino acid oxidase; 2) Comb-type electrode having a total area of 1.8 mm 2 to 4 mm 2 , an interelectrode distance of less than 50 ⁇ m, a working electrode width of 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, and a counter electrode width of 5 ⁇ m to 100 ⁇ m
  • a composition containing fructosyl amino acid oxidase and hexaammineruthenium (III) chloride is disposed on the comb-type electrode, and the degradation product produced from the glycated protein in contact with the protease is fructosyl amino acid oxidase Biosensor that can be reacted with.
  • a sample in which a degradation product is generated from a glycated protein by a protease is reacted with a combination of an electron mediator and a comb-type electrode, whereby the glycated protein concentration in the sample can be easily and inexpensively determined with high sensitivity.
  • a combination of an electron mediator and a comb-type electrode whereby the glycated protein concentration in the sample can be easily and inexpensively determined with high sensitivity.
  • 4 is a graph showing the relationship between the sensitivity at the time of measuring benzyloxycarbonyl-fructosyl lysine and the fructosyl amino acid oxidase concentration according to the example.
  • 4 is a graph showing the relationship between the sensitivity at the time of measuring benzyloxycarbonyl-fructosyl lysine and the hexaammineruthenium (III) chloride concentration according to an example. It is a graph which shows the standard curve (carbon printing electrode) at the time of the benzyloxycarbonyl fructosyl lysine measurement which concerns on a comparative example.
  • FIG. 2 is a graph showing a standard curve (comb electrode) when measuring benzyloxycarbonyl-fructosyl lysine according to an example. It is a graph which shows the standard curve at the time of the measurement of the benzyloxycarbonyl fructosyl lysine at the time of using the carbon electrode which arrange
  • the present embodiment an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be specifically described. However, it should not be understood that the present embodiment described below should limit the present invention.
  • the present embodiment is a method for measuring a glycated protein in a sample, (1) reacting a sample in which a degradation product is produced from a glycated protein with a protease and an oxidoreductase in the presence of an electron mediator to produce a reduced electron mediator; (2) a step of detecting the reaction state in step (1) by an electrochemical method using a comb electrode; It is the measuring method containing.
  • the glycated protein measured by the method according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a glycated protein.
  • a substance in which an amino group contained in a protein and a sugar form a Schiff base by a Maillard reaction and rearranged by Amadori is preferable, but is not limited thereto.
  • glycated albumin is mentioned as an example.
  • a sample in which a degradation product is generated from glycated protein by protease is an action in which a protease is brought into contact with a glycated protein that the sample may contain to generate a degradation product of glycated protein. Although it refers to a sample, it does not matter whether a decomposition product is actually produced.
  • the sample is a sample that may contain glycated protein, but the measurement may reveal that the sample does not contain glycated protein.
  • protease is not particularly limited as long as the glycated protein can be decomposed into a substrate for oxidoreductase.
  • protease derived from animals such as trypsin and chymotrypsin, plant derived from plants such as papain and bromelain.
  • examples include protease and microorganism-derived protease.
  • microorganism-derived proteases examples include proteases derived from the genus Bacillus typified by orientase 22BF (manufactured by HI), proteases derived from Aspergillus typified by protease type-XIII (manufactured by Sigma), etc. Penicillium-derived protease represented by PD enzyme (Kikkoman) etc., Streptomyces-derived protease represented by Pronase, endoproteinase Lys-c (Sigma), etc. Yeast typified by representative Lysobacter-derived protease, proteinase A (Proteinase A; manufactured by Sigma), etc.
  • Protease proteinase K (Proteinase K; manufactured by Sigma) and other proteases derived from Tritillachium, aminopeptidase T (Aminopeptidase T; manufactured by Boehringer Mannheim) and the like, thermus-derived protease, endo Proteinase Asp-N (Endoproteinase Asp-N; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like. Is mentioned. These specific examples are merely examples and are not limited in any way.
  • orientase 22BF manufactured by HBI Corporation.
  • the electron mediator in this embodiment is not particularly limited, and for example, potassium ferricyanide, m-PMS (1-methyl-5-methylphenylsulfate) or hexaammineruthenium (III) chloride can be used. Preferred is hexaammineruthenium (III) chloride.
  • the concentration of the electron mediator in the step (1) is not particularly limited as long as glycated protein can be measured, but in the case of hexaammineruthenium (III) chloride, for example, it is 300 mmol / L or more. If it is less than 300 mmol / L, the current required for measurement may not be obtained.
  • the oxidoreductase in the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, fructosyl amino acid oxidase (FAOD) using a protease degradation product of a glycated protein whose concentration is to be measured as a substrate.
  • FOD fructosyl amino acid oxidase
  • a protease degradation product of a glycated protein whose concentration is to be measured as a substrate.
  • the genus Gibberella, the genus Aspergillus, the genus Candida, the genus Penicillium, the genus Fusarium, the genus Acremonium, or the genus Debariomyce Tosyl amino acid oxidase is used, but is not limited thereto.
  • concentration of FAOD in the said (1) process will not be specifically limited if glycated protein can be measured, For example, it is 12 U / mL or more, Preferably it is 60 U / mL or more. If it is less than 12 U / mL, the current required for measurement may not be obtained.
  • the comb electrode in the method according to the present embodiment includes a working electrode and a counter electrode that are alternately arranged.
  • the shape of the comb electrode is not particularly limited as long as glycated protein can be measured.
  • the total area is 1.8 mm 2 to 4 mm 2
  • the distance between the electrodes is less than 50 ⁇ m
  • the electrode width of the working electrode is 5 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the electrode width of the counter electrode is 5 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • Examples of the method for manufacturing a comb-type electrode in the present embodiment include the following four modes.
  • a noble metal film is formed on an electrically insulative substrate, and a resist is printed in a comb shape by a screen printing method thereon, and a portion of the noble metal film not covered with the resist is etched. Thereafter, the resist is removed to form a comb-type electrode.
  • a noble metal film is formed on an electrically insulating substrate, a resist is applied or pasted thereon, and exposure is performed through a photomask to cure a portion of the resist where a comb-shaped electrode is to be formed.
  • the resist and the noble metal film other than the portion where the comb-shaped electrode is to be formed are etched, and further, the portion of the resist where the comb-shaped electrode is to be formed is removed to form a comb-shaped electrode.
  • a resist is printed on a portion where no comb-shaped electrode is formed on the electrically insulating substrate by a screen printing method, and a noble metal film is formed on the electrically insulating substrate and the resist.
  • the comb-shaped electrode is formed by removing the resist and the noble metal film formed on the resist.
  • the material for the electrically insulating substrate include polyester resin, polyethylene terephthalate, and engineering plastic.
  • the noble metal include gold, platinum, silver, palladium, ruthenium, iridium, rhodium, and a mixture thereof.
  • the manufacturing method of a comb-type electrode is not limited to the above.
  • a known method may be used as an electrochemical method in the method according to the present embodiment.
  • a constant potential method or the like is used, but is not limited thereto.
  • An example of the principle of measurement of glycated protein by the potentiostatic method is as follows. First, a protease is brought into contact with a glycated protein contained in a sample to generate a degradation product of the glycated protein. Next, the produced degradation product of glycated protein is oxidized with an oxidoreductase. By the oxidation reaction of the decomposition product, the electron mediator as the electron acceptor of the oxidation reaction is reduced. When a constant potential is applied to the comb-type electrode, the reduced electron mediator is reoxidized and a response current is obtained. Since the intensity of the response current correlates with the concentration of the glycated protein, the concentration of the glycated protein can be measured by measuring the value of the response current.
  • an oxidoreductase may be disposed on the comb electrode together with the electron mediator, but the present invention is not limited to this.
  • a method for arranging the electron mediator and the oxidoreductase on the comb electrode a known method may be used. For example, although the liquid mixture of an electron mediator and an oxidoreductase is dropped on a comb-shaped electrode and then dried and disposed, drying is not limited thereto.
  • the present embodiment is a biosensor for measuring glycated protein in a sample, (1) a composition comprising an electron mediator and an oxidoreductase; (2) a comb-type electrode; A biosensor that reacts with a oxidoreductase a degradation product produced from a glycated protein by a protease.
  • the glycated protein measured by the biosensor according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a substance in which the amino group and sugar contained in the protein form a Schiff base by the Maillard reaction and rearranged by Amadori, but for example, glycated albumin It is.
  • a sample in which a degradation product is generated from glycated protein by protease is an action in which a protease is brought into contact with a glycated protein that the sample may contain to generate a degradation product of glycated protein. Although it refers to a sample, it does not matter whether a decomposition product is actually produced.
  • the sample is a sample that may contain glycated protein, but as a result of measurement, it may become clear that the sample does not contain glycated protein.
  • the protease is not particularly limited as long as the glycated protein can be decomposed into a substrate for oxidoreductase.
  • protease derived from animals such as trypsin and chymotrypsin, plant derived from plants such as papain and bromelain. Examples include protease and microorganism-derived protease.
  • microorganism-derived proteases examples include proteases derived from the genus Bacillus typified by orientase 22BF (manufactured by HI), proteases derived from Aspergillus typified by protease type-XIII (manufactured by Sigma), etc. Penicillium-derived protease represented by PD enzyme (Kikkoman) etc., Streptomyces-derived protease represented by Pronase, endoproteinase Lys-c (Sigma), etc. Yeast typified by representative Lysobacter-derived protease, proteinase A (Proteinase A; manufactured by Sigma), etc.
  • Protease proteinase K (Proteinase K; manufactured by Sigma) and other proteases derived from Tritillachium, aminopeptidase T (Aminopeptidase T; manufactured by Boehringer Mannheim) and the like, thermus-derived protease, endo Proteinase Asp-N (Endoproteinase Asp-N; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like. Is mentioned. These specific examples are merely examples and are not limited in any way.
  • orientase 22BF manufactured by HBI Corporation.
  • the electron mediator in the biosensor according to the present embodiment is not particularly limited.
  • potassium ferricyanide, m-PMS (1-methyl-5-methylphenylsulfate) or hexaammineruthenium (III) chloride can be used.
  • Preferred is hexaammineruthenium (III) chloride.
  • the concentration of the electron mediator is not particularly limited as long as glycated protein can be measured, but in the case of hexaammineruthenium (III) chloride, it is set to be, for example, 300 mmol / L or more when the sample solution is added to the biosensor. If it is less than 300 mmol / L, the current required for measurement may not be obtained.
  • the oxidoreductase in the biosensor according to the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, fructosyl amino acid oxidase (FAOD) using a protease degradation product of a glycated protein whose concentration is to be measured as a substrate.
  • FOD fructosyl amino acid oxidase
  • a protease degradation product of a glycated protein whose concentration is to be measured as a substrate.
  • the genus Gibberella, the genus Aspergillus, the genus Candida, the genus Penicillium, the genus Fusarium, the genus Acremonium, or the genus Debariomyce Tosyl amino acid oxidase is used, but is not limited thereto.
  • the concentration of FAOD is not particularly limited as long as glycated protein can be measured, but is set to be, for example, 12 U / mL or more when a sample solution is added to the biosensor. If it is less than 12 U / mL, the current required for measurement may not be obtained.
  • the comb-type electrode in the biosensor according to the present embodiment includes a working electrode and a counter electrode that are alternately arranged.
  • the shape of the comb electrode is not particularly limited as long as glycated protein can be measured.
  • the total area is 1.8 mm 2 to 4 mm 2
  • the distance between the electrodes is less than 50 ⁇ m
  • the electrode width of the working electrode is 5 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the electrode width of the counter electrode is 5 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • a noble metal film is formed on an electrically insulative substrate, and a resist is printed in a comb shape by a screen printing method thereon, and a portion of the noble metal film not covered with the resist is etched. Thereafter, the resist is removed to form a comb-type electrode.
  • a noble metal film is formed on an electrically insulating substrate, a resist is applied or pasted thereon, and exposure is performed through a photomask to cure a portion of the resist where a comb-shaped electrode is to be formed.
  • the resist and the noble metal film other than the portion where the comb-shaped electrode is to be formed are etched, and further, the portion of the resist where the comb-shaped electrode is to be formed is removed to form a comb-shaped electrode.
  • a resist is printed on a portion where no comb-shaped electrode is formed on the electrically insulating substrate by a screen printing method, and a noble metal film is formed on the electrically insulating substrate and the resist.
  • the comb-shaped electrode is formed by removing the resist and the noble metal film formed on the resist.
  • the material for the electrically insulating substrate include polyester resin, polyethylene terephthalate, and engineering plastic.
  • the noble metal include gold, platinum, silver, palladium, ruthenium, iridium, rhodium, and a mixture thereof.
  • the manufacturing method of a comb-type electrode is not limited to the above.
  • the biosensor according to the present embodiment detects the state of reaction between the degradation product of glycated protein and the oxidoreductase by an electrochemical method.
  • a known method may be used as the electrochemical method.
  • a constant potential method or the like is used, but is not limited thereto.
  • An example of the principle of measurement of glycated protein by the potentiostatic method is as follows. First, a protease is brought into contact with a glycated protein contained in a sample to generate a degradation product of the glycated protein. Next, the produced glycated protein degradation product is oxidized by the oxidoreductase of the biosensor. By the oxidation reaction of the decomposition product, the electron mediator as the electron acceptor of the oxidation reaction is reduced. When a constant potential is applied to the comb-type electrode, the reduced electron mediator is reoxidized and a response current is obtained. Since the intensity of the response current correlates with the concentration of the glycated protein, the concentration of the glycated protein can be measured by measuring the value of the response current.
  • an oxidoreductase may be disposed on the comb electrode together with the electron mediator, but the present invention is not limited to this.
  • a method for arranging the electron mediator and the oxidoreductase on the comb electrode a known method may be used. For example, although the liquid mixture of an electron mediator and an oxidoreductase is dropped on a comb-shaped electrode and then dried and disposed, drying is not limited thereto.
  • the present embodiment is a biosensor for measuring glycated albumin in a sample, (1) Hexammineruthenium (III) chloride set to be 300 mmol / L or more when the sample solution is added and fructosyl set to be 12 U / mL or more when the sample solution is added A composition comprising an amino acid oxidase; (2) Comb type in which the total area is 1.8 mm 2 to 4 mm 2 , the distance between electrodes is less than 50 ⁇ m, the electrode width of the working electrode is 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, and the electrode width of the counter electrode is 5 ⁇ m to 100 ⁇ m Electrodes, A composition containing fructosyl amino acid oxidase and hexaammineruthenium (III) chloride is disposed on a comb-type electrode, and a biodegradation product produced from a glycated protein by a protease is reacted with fructosyl amino acid oxidase. It can be
  • glycated albumin concentration (GA) in the sample was measured using fructosyl amino acid oxidase (FAOD)
  • FOD fructosyl amino acid oxidase
  • the sample to be measured and the enzyme used are not limited to these.
  • the measurement of glycated albumin is based on the following principle. First, GA contained in a sample is digested with a protease to release fructosyl lysine ( ⁇ -FK), which is a structure in which the amino group at the ⁇ position of a lysine residue is glycated. Free ⁇ -FK is oxidized by FAOD.
  • ⁇ -FK fructosyl lysine
  • an artificial electron acceptor (mediator) as an electron acceptor of the oxidation reaction is reduced.
  • the reduced mediator is reoxidized and a response current is obtained. Since the strength of the response current correlates with the GA concentration, the GA concentration can be measured by measuring the response current value.
  • benzyloxycarbonyl-fructosyl lysine (Z-FK) in which the amino group at the ⁇ -position was masked with a benzyloxycarbonyl group was used as a synthetic substrate for ⁇ -FK.
  • FAOD was dissolved in 40 mmol / L PPB so as to be 4.8, 9.6, 24, 48, 96, 192, 240, 480, 640, and 960 U / mL.
  • Hexaammineruthenium (III) chloride was dissolved in purified water to 400 mmol / L.
  • Z-FK was dissolved in purified water to 100, 200, 600, and 1000 ⁇ mol / L.
  • Z-FK aqueous solution or purified water was mixed with 6 ⁇ L.
  • the final concentration of FAOD is 1.2, 2.4, 6, 9, 12, 24, 48, 60, 120, 160, 240 U / mL
  • the final concentration of hexaammineruthenium (III) chloride is 100 mmol.
  • the final concentration of Z-FK is 0, 50, 100, 300, 500 ⁇ mol / L. 3 ⁇ L of the above mixed solution was dropped on the working electrode and the counter electrode of the comb electrode.
  • Hexaammineruthenium (III) chloride was dissolved in purified water at 4, 40, 200, 400, 600, 800, 1200, 1600 mmol / L.
  • Z-FK was dissolved in purified water to 75, 150, 450, and 750 ⁇ mol / L.
  • FAOD was dissolved in 120 mmol / L PPB so as to be 720 U / mL.
  • Hexaammineruthenium (III) chloride was dissolved in purified water to 1200 mmol / L.
  • Z-FK was dissolved in purified water to 75, 150, 450, and 750 ⁇ mol / L.
  • the current density observed when the comb electrode was used was higher. That is, the value obtained by dividing the observed current value by the area of the working electrode; when comparing the current density between the comb-type electrode and the carbon printed electrode, for example, at the Z-FK concentration of 500 ⁇ mol / L, which is the highest concentration of this measurement 1.91 ⁇ A / mm 2 and 119 nA / mm 2 , respectively, and the current density observed with the comb-type electrode was about 16 times the current density observed with the carbon printed electrode.
  • high sensitivity can be achieved by applying a comb-type electrode.
  • FAOD was dissolved in 120 mmol / L PPB to 720 U / mL.
  • Hexaammineruthenium (III) chloride was dissolved in purified water to 1200 mmol / L.
  • Sucrose was dissolved in purified water to 0.375%.
  • Z-FK was dissolved in purified water to a final concentration of 50, 100, 300, 500 ⁇ mol / L.
  • a sensor was prepared by drying for 30 minutes and arranging the FAOD. Z-FK solution was sucked into 0.8 ⁇ L and 1.3 ⁇ L of the prepared FAOD sensor, respectively. After reacting for 60 seconds, a constant potential was measured by applying 100 mV, and the current values after 5 seconds (comb electrode) and after 20 seconds (carbon printed electrode) were compared. As a result of analyzing the correlation between the Z-FK concentration and the current value, as shown in FIG. 5, the slope of the calibration curve at the time of Z-FK measurement is about 6 times when using the comb-type electrode as compared with the carbon printed electrode. Became. Moreover, the current density observed when the comb electrode was used was higher.
  • the value obtained by dividing the observed current value by the area of the working electrode when comparing the current density between the comb-type electrode and the carbon printed electrode, for example, at the Z-FK concentration of 500 ⁇ mol / L, which is the highest concentration of this measurement , respectively, the current density observed 1.44 ⁇ A / mm 2 and 114nA / mm 2, and the comb-type electrode was about 13 times the current density observed in carbon print electrode. Sensors that can be measured with high sensitivity could be fabricated by applying comb-shaped electrodes.
  • Example 5 Measurement of protease digest of glycated albumin ⁇ Sample> ⁇ Glycated albumin (Low / High) ⁇ Reagent 1 (final concentration)> ⁇ Orientase 22BF (manufactured by HBI Corporation) (50mg / mL) ⁇ Reagent 2 (final concentration)> 10 mmol / L potassium phosphate buffer (PPB) (pH 8.0) ⁇ FAOD (60U / mL) -Hexaammineruthenium (III) chloride (300 mmol / L) ⁇ Sucrose (0.25%) Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • ⁇ Electrode> ⁇ Comb electrodes (comb electrodes developed by Tanaka Kikinzoku Co., Ltd. described in International Publication No. 2014 / 112,569) ⁇ Carbon printed electrode (manufactured by Biodevice Technology)
  • Orientase 22BF (manufactured by HIBI) was dissolved in purified water to 50 mg / mL. Further, glycated albumin (Low / High) and orientase 22BF solution were mixed at a volume ratio of 1: 1 and reacted at 37 ° C. for 1 hour to prepare a protease digest of glycated albumin. Furthermore, FAOD is dissolved in 120 mmol / L PPB to 720 U / mL, hexaammineruthenium (III) chloride is dissolved in purified water to 1200 mmol / L, and sucrose is 0.375%. The Z-FK was dissolved in purified water to a final concentration of 50, 100, 300, 500 ⁇ mol / L.
  • the carbon printed electrode had a current value difference of 21 nA after 20 seconds as shown in FIG. As shown in FIG. 7, the difference in current value after 5 seconds was 104 nA. Compared to conventional carbon printed electrodes, it was shown that even when measuring saccharified albumin, it can be measured with high sensitivity by applying a comb-type electrode.
  • the glycated protein concentration in the sample can be quantified with high sensitivity in a simple operation and in a short time. Therefore, by applying this invention, it is possible to provide a simple and inexpensive analytical instrument that can be used, for example, in blood tests in the clinical diagnostic field. Since the blood concentration of glycated protein can be an important index for diagnosis and management of diabetes symptoms, such an analytical instrument can be expected to be a useful tool for diagnosis and management of diabetes symptoms.

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Abstract

試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、(1)プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、(2)工程(1)における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、を含む測定方法。

Description

くし型電極を用いた糖化タンパク質の測定方法
 本発明は、試料中の糖化タンパク質の測定法、及び、その測定用バイオセンサに関する。
 糖化タンパク質の血中濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その血中濃度の測定値が、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることが知られている。糖化タンパク質としてはヘモグロビンの糖化タンパク質であるヘモグロビンA1c(HbA1c)やアルブミンの糖化タンパク質である糖化アルブミン(GA)が知られている。糖化タンパク質の血中濃度は長期(数週間~数ヶ月)の血糖値を反映した安定した指標であるため、糖尿病の診断及び治療のために行う血糖コントロールの成否の判定に有用である。
 この糖化タンパク質の血中濃度の測定法としては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(以下、「FAOD」と記す場合がある。)を利用して測定する方法が、特許文献1に開示されている。特許文献1に開示された方法は、試料と、FAODと、を反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解して、FAODの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めている。FAOD力価測定には、比色法、蛍光法、及び電気化学的方法等の公知の方法が用いられる。
 一方、0.3~10μL(マイクロリットル)程度の液体試料をセンサユニット内に吸い上げ、センサユニット内部で種々の試薬により試料を処理してその反応を計測することにより、試料の分析を行う手法が種々提案されている。また特に、試薬として酵素を用い、酵素の基質特異性を利用して試料中の特定の物質の濃度を測定可能なバイオセンサは、種々の物質を含む生体試料の分析に適するため、医療用の検査機器を始め、様々な分野で用いられるようになっている。このようなバイオセンサを上記の糖化タンパク質の血中濃度の測定に応用した例として、特許文献2に開示されたものが知られている。特許文献2に開示されたバイオセンサは、水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上にFAODを固定化したバイオセンサであって、電気化学的方法により糖化タンパク質濃度を測定するバイオセンサである。
 また、くし型電極を用いたバイオセンサを、グルコース等の血液成分の測定に応用した測定方法が特許文献3に開示されている。特許文献3に開示された方法においては、くし型電極を有するバイオセンサが、酸化還元酵素により血液成分を酸化し、その反応生成物による酸化電流を電極で検出し、血液成分を測定する。
国際公開第98/48043号 特開2009-171874号公報 国際公開第2014/112569号
 特許文献1及び2に開示の糖化タンパク測定方法は、FAODの力価測定に、電気的測定法等公知の方法を用いており、いずれも感度、データの安定性が不十分であり、実用化が困難であった。一方特許文献3のバイオセンサを用いた測定方法は、グルコース等の血液成分の測定に関するものであり、糖化タンパク質の測定への応用は未知である。
 本発明は、このような問題を解決し、簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度測定できるようにすることを目的とする。
 本発明者は、前記課題を解決すべく、鋭意検討したところ、プロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料に、電子メディエータとくし型電極を組み合わせて反応させることにより、驚くべきことに簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
 即ち本発明は以下に関する。
[1]試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、(1)プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、(2)工程(1)における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、を含む測定方法。
[2]酸化還元酵素と電子メディエータを含む組成物がくし型電極上に配置されている、[1]に記載の測定方法。
[3]酸化還元酵素がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼである、[1]又は[2]に記載の測定方法。
[4]電子メディエータがヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物である、[1]から[3]のいずれかに記載の測定方法。
[5]電気化学的方式が定電位電流測定方式である、[1]から[4]のいずれかに記載の測定方法。
[6]糖化タンパク質が糖化アルブミンである、[1]から[5]のいずれかに記載の測定方法。
[7]くし型電極は、総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmである、[1]から[6]のいずれかに記載の測定方法。
[8]上記(1)工程におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度が12U/mL以上である、[3]に記載の測定方法。
[9]上記(1)工程におけるヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の濃度が300mmol/L以上である、[4]に記載の測定方法。
[10]試料中の糖化タンパク質の測定用バイオセンサであって、(1)電子メディエータ及び酸化還元酵素を含む組成物と、(2)くし型電極と、を備え、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質を酸化還元酵素と反応させる、バイオセンサ。
[11]試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、(1)300mmol/L以上のヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物及び12U/mL以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、(2)総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmであるくし型電極と、を備え、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を含む組成物がくし型電極に配置されており、プロテアーゼを接触させた糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させられる、バイオセンサ。
 本発明によれば、プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料に、電子メディエータとくし型電極を組み合わせて反応させることによって、簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量することができる。
実施例に係るベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン測定時の感度と、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ濃度との関係を示すグラフである。 実施例に係るベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン測定時の感度と、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物濃度との関係を示すグラフである。 比較例に係るベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン測定時の標準曲線(カーボン印刷電極)を示すグラフである。 実施例に係るベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン測定時の標準曲線(くし型電極)を示すグラフである。 実施例に係る試薬を配置したカーボン電極及びくし型電極使用時のベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン測定時の標準曲線を示すグラフである。 比較例に係る糖化アルブミンのプロテーゼ消化物測定時の反応の時間変化(カーボン印刷電極)を示すグラフである。 実施例に係る糖化アルブミンのプロテーゼ消化物測定時の反応の時間変化(くし型電極)を示すグラフである。
 以下、本発明の実施の形態(以下、「本実施の形態」という。)につき具体的に説明する。ただし、以下の本実施の形態が、本発明を限定すべきものであると理解するべきではない。
 本実施の形態は、試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、
 (1)プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、
 (2)工程(1)における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、
 を含む測定方法である。
 本実施の形態に係る方法で測定される糖化タンパク質は、タンパク質の糖化物であれば特に限定されない。例えばタンパク質に含まれるアミノ基と糖とがメイラード反応によってシッフ塩基を形成しアマドリ転位した物質が好ましいが、これに限定されない。具体的には、糖化アルブミンが一例として挙げられる。
 「プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料」とは、プロテアーゼと、試料が含んでいる可能性のある糖化タンパク質とを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる行為を行った試料をいうが、実際に分解生成物質が生成されたがどうかは問わない。試料は糖化タンパク質を含む可能性のある試料であるが、測定の結果、試料が糖化タンパク質を含んでいないことが明らかになる場合もある。
 プロテアーゼは、糖化タンパク質を酸化還元酵素の基質に分解できれば特に限定されないが、例えばトリプシン(Trypsin)、キモトリプシン(Chymotrypsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
 微生物由来のプロテアーゼの例としては、オリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII(シグマ社製)等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、PD酵素(キッコーマン社製)等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase)等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c(シグマ社製)等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(ProteinaseA;シグマ社製)  等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase  K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(AminopeptidaseT;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeptidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は1例に過ぎず、なんら限定されるものではない。好ましくはオリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製)である。
 本実施の形態における電子メディエータとしては特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、m-PMS(1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)やヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を用いることができる。好ましくはヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物である。
 上記(1)工程における電子メディエータの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の場合は例えば300mmol/L以上である。300mmol/Lを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
 本実施の形態における酸化還元酵素としては、特に限定されないが、例えば、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解生成物質を基質とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)である。具体的には、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カンジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はデバリオマイセス(Debaryomyces)属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが用いられるが、これに限定されない。上記(1)工程におけるFAODの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば12U/mL以上、好ましくは60U/mL以上である。12U/mLを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
 本実施の形態に係る方法におけるくし型電極は、それぞれ交互に配置された作用極と対極を備える。くし型電極の形状は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmである。
 本実施の形態におけるくし型電極の製造方法としては、以下の4つの態様を挙げることができる。
 (1)電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にスクリーン印刷法によりレジストをくし型形状に印刷して、レジストで覆われていない部分の貴金属の膜をエッチングする。その後、レジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (2)電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にレジストを塗布又は貼付し、フォトマスクを介して露光を行なってくし型電極を形成する部分のレジストを硬化させる。その後、くし型電極を形成する部分以外のレジスト及び貴金属の膜をエッチングし、さらに、くし型電極を形成する部分のレジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (3)電気絶縁性の基板上に、製造すべきくし型電極パターンを抜いたテンプレートを重ね、テンプレートを介して電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成した後、テンプレートを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (4)電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷法により、くし型電極を形成しない部分にレジストを印刷し、電気絶縁性の基板及びレジスト上に貴金属の膜を形成する。その後、レジスト及びレジスト上に形成された貴金属の膜を除去することにより、くし型電極を形成する。
 電気絶縁性の基板の材料としては、例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、及びエンジニアリングプラスチック等が挙げられる。貴金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、及びこれらの混合物が挙げられる。ただし、くし型電極の製造方法は、上記に限定されない。
 本実施の形態に係る方法における電気化学方式としては、公知の方法を用いればよい。例えば定電位法等が用いられるが、これに限定されない。
 定電位法による糖化タンパク質の測定原理の一例は、以下のとおりである。まず試料中に含まれる糖化タンパク質にプロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる。次に、生成した糖化タンパク質の分解生成物質を、酸化還元酵素で酸化する。分解生成物質の酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての電子メディエータが還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元された電子メディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、糖化タンパク質の濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、糖化タンパク質の濃度を測定することが可能となる。
 本実施の形態における方法においては、電子メディエータと共に酸化還元酵素をくし型電極上に配置する場合があるが、これに限定されない。電子メディエータと酸化還元酵素をくし型電極上に配置する方法としては、公知の方法を用いればよい。例えば、電子メディエータと酸化還元酵素の混合液をくし型電極上に滴下した後、乾燥させて配置させる、乾燥等が用いられるが、これに限定されない。
 また、本実施の形態は、試料中の糖化タンパク質の測定用バイオセンサであって、
 (1)電子メディエータ及び酸化還元酵素を含む組成物と、
 (2)くし型電極と、
 を備え、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質を酸化還元酵素と反応させる、バイオセンサである。
 本実施の形態に係るバイオセンサで測定される糖化タンパク質は、タンパク質に含まれるアミノ基と糖とがメイラード反応によってシッフ塩基を形成しアマドリ転位した物質であれば、特に限定されないが、例えば糖化アルブミンである。
 「プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料」とは、プロテアーゼと、試料が含んでいる可能性のある糖化タンパク質とを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる行為を行った試料をいうが、実際に分解生成物質が生成されたかどうかは問わない。
 試料は糖化タンパク質を含む可能性のある試料であるが、測定の結果、試料が糖化タンパク質を含んでいないことが明らかになる場合もある。プロテアーゼは、糖化タンパク質を酸化還元酵素の基質に分解できれば特に限定されないが、例えばトリプシン(Trypsin)、キモトリプシン(Chymotrypsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
 微生物由来のプロテアーゼの例としては、オリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII(シグマ社製)等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、PD酵素(キッコーマン社製)等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase)等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c(シグマ社製)等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(ProteinaseA;シグマ社製)  等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase  K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(AminopeptidaseT;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonas)由来、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeptidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は1例に過ぎず、なんら限定されるものではない。好ましくはオリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製)である。
 本実施の形態に係るバイオセンサにおける電子メディエータとしては特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、m-PMS(1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)やヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を用いることができる。好ましくはヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物である。
 電子メディエータの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の場合、バイオセンサに試料溶液を加えたときに、例えば300mmol/L以上となるよう設定される。300mmol/Lを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
 本実施の形態に係るバイオセンサにおける酸化還元酵素としては、特に限定されないが、例えば、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解生成物質を基質とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)である。具体的には、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カンジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はデバリオマイセス(Debaryomyces)属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが用いられるが、これに限定されない。FAODの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、バイオセンサに試料溶液を加えたときに、例えば12U/mL以上となるよう設定される。12U/mLを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
 本実施の形態に係るバイオセンサにおけるくし型電極は、それぞれ交互に配置された作用極と対極を備える。くし型電極の形状は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmである。
 また本実施の形態に係るバイオセンサにおけるくし型電極の製造方法としては、以下の4つの態様を挙げることができる。
 (1)電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にスクリーン印刷法によりレジストをくし型形状に印刷して、レジストで覆われていない部分の貴金属の膜をエッチングする。その後、レジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (2)電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にレジストを塗布又は貼付し、フォトマスクを介して露光を行なってくし型電極を形成する部分のレジストを硬化させる。その後、くし型電極を形成する部分以外のレジスト及び貴金属の膜をエッチングし、さらに、くし型電極を形成する部分のレジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (3)電気絶縁性の基板上に、製造すべきくし型電極パターンを抜いたテンプレートを重ね、テンプレートを介して電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成した後、テンプレートを除去することにより、くし型電極を形成する。
 (4)電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷法により、くし型電極を形成しない部分にレジストを印刷し、電気絶縁性の基板及びレジスト上に貴金属の膜を形成する。その後、レジスト及びレジスト上に形成された貴金属の膜を除去することにより、くし型電極を形成する。
 電気絶縁性の基板の材料としては、例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、及びエンジニアリングプラスチック等が挙げられる。貴金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、及びこれらの混合物が挙げられる。ただし、くし型電極の製造方法は、上記に限定されない。
 本実施の形態に係るバイオセンサは、電気化学方式で、糖化タンパク質の分解生成物質と酸化還元酵素との反応の状態を検出する。電気化学方式としては、公知の方法を用いればよい。例えば定電位法等が用いられるが、これに限定されない。
 定電位法による糖化タンパク質の測定原理の一例は、以下のとおりである。まず試料中に含まれる糖化タンパク質にプロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる。次に、生成した糖化タンパク質の分解生成物質を、バイオセンサの酸化還元酵素で酸化する。分解生成物質の酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての電子メディエータが還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元された電子メディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、糖化タンパク質の濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、糖化タンパク質の濃度を測定することが可能となる。
 本実施の形態に係るバイオセンサにおいては、電子メディエータと共に酸化還元酵素をくし電極上に配置する場合があるが、これに限定されない。電子メディエータと酸化還元酵素をくし型電極上に配置する方法としては、公知の方法を用いればよい。例えば、電子メディエータと酸化還元酵素の混合液をくし型電極上に滴下した後、乾燥させて配置させる、乾燥等が用いられるが、これに限定されない。
 さらに、本実施の形態は、試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、
 (1)試料溶液を加えられたときに300mmol/L以上となるよう設定されたヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物及び試料溶液を加えられたときに12U/mL以上となるよう設定されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、
 (2)総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmであるくし型電極と、
 を備え、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を含む組成物がくし型電極に配置されており、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させる、バイオセンサであり得る。
 以下、試料中の糖化アルブミン濃度(GA)を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)を利用して測定した実施例について説明するが、測定対象の試料や用いる酵素等がこれらに限られないことは、もちろんである。糖化アルブミン測定は以下の原理に基づいている。まず試料中に含まれるGAをプロテアーゼにより消化し、リジン残基のε位のアミノ基が糖化された構造である、フルクトシルリジン(ε-FK)を遊離させる。遊離のε-FKをFAODにより酸化する。ε-FKの酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての人工電子受容体(メディエータ)が還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元されたメディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、GAの濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、GAの濃度を測定することが可能となる。以下の実施例では、ε-FKの合成基質としてα位のアミノ基がベンジルオキシカルボニル基でマスクされた、ベンジルオキシカルボニル-フルクトシルリジン(Z-FK)を用いた。
(実施例1)FAOD濃度の最適化
 <試薬(終濃度)>
 ・10mmol/L リン酸カリウム緩衝液(PPB) (pH8.0)
 ・FAOD(1.2~240U/mL)
 ・ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物(100mmol/L)
 <基質(終濃度)>
 ・Z-FK溶液(0~500μmol/L)
 <使用電極>
 ・くし型電極(国際公開第2014/112569号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極)
 FAODを40mmol/L PPBに4.8、9.6、24、48、96、192、240、480、640、960U/mLになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を400mmol/Lになるように精製水に溶解した。Z-FKを100、200、600、1000μmol/Lになるように精製水に溶解した。
 FAOD溶液3μL、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物水溶液3μLを混合した後に、Z-FK水溶液又は精製水を6μLと混合した。この時、FAODの終濃度は1.2、2.4、6、9、12、24、48、60、120、160、240U/mLとなり、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の終濃度は100mmol/Lとなり、Z-FKの終濃度は0、50、100、300、500μmol/Lとなる。上記混合液をくし型電極の作用極及び対極上に3μL滴下した。室温で60秒反応させた後、100mV印加して定電位測定をおこない、5秒後の電流値をそれぞれ比較した。感度(電流値/Z-FK濃度)と、FAOD濃度との関係を解析した結果、図1に示すように、FAOD濃度依存的に感度の上昇が観察された。観察の結果、FAODを終濃度で12U/mL以上含ませると感度が安定し、60U/mL以上含ませると、反応効率が十分良いと考えられた。
 (実施例2)メディエータ濃度の最適化
 <試薬(終濃度)>
 ・10mmol/L リン酸カリウム緩衝液(PPB) (pH8.0)
 ・FAOD (12U/mL)
 ・ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物(1~400mmol/L)
 <基質(終濃度)>
 ・Z-FK溶液(0~500μmol/L)
 <使用電極>
 ・くし型電極(国際公開第2014/112569号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極)
 FAODを120mmol/L PPBに144U/mLになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を4、40、200、400、600、800、1200、1600mmol/Lになるように精製水に溶解した。Z-FKを75、150、450、750μmol/Lになるように精製水に溶解した。
 FAOD溶液1μL、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物水溶液3μLを混合した後に、Z-FK水溶液又は精製水8μLと混合した。この時、FAODの終濃度は12U/mLとなり、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の終濃度は1、10、50、100、150、300、400mmol/Lとなり、Z-FKの終濃度は0、50、100、300、500μmol/Lとなる。上記混合液をくし型電極の作用極及び対極上に3μL滴下し、室温で60秒反応させた後、100mV印加して定電位測定をおこない、5秒後の電流値をそれぞれ比較した。感度(電流値/Z-FK濃度)と、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物濃度との関係を解析した結果、図2に示すように、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の濃度依存的に、感度の上昇が観察された。観察の結果、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を終濃度で300mmol/L以上含ませることが好ましいことが判明した。
 (実施例3)カーボン印刷電極とくし型電極の比較
 <試薬(終濃度)>
 ・10mmol/L リン酸カリウム緩衝液(PPB) (pH8.0)
 ・FAOD (60U/mL)
 ・ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物(300mmol/L)
 <基質(終濃度)>
 ・Z-FK水溶液(0~500μmol/L)
 <使用電極>
 ・くし型電極(国際公開第2014/112569号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極)
 ・カーボン印刷電極(バイオデバイステクノロジー社製)
 FAODを120mmol/L PPBに720U/mLになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を1200mmol/Lになるように精製水に溶解した。Z-FKを75、150、450、750μmol/Lになるように精製水に溶解した。
 FAOD溶液1μL、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物水溶液3μLを混合した後に、Z-FK水溶液を8μL混合した。くし型電極とカーボン印刷電極のそれぞれに3μL滴下して、60秒反応させ、100mV印加して定電位測定をおこない、5秒後(くし型電極)、20秒後(カーボン印刷電極)の電流値を比較した。Z-FK濃度と、電流値と、の相関を解析した結果、図3に示すカーボン印刷電極と比較して、図4に示すくし型電極におけるZ-FK測定時の検量線の傾きが約7倍になった。また、くし型電極を用いた場合の方が観察される電流密度が高かった。即ち、観察される電流値を作用極の面積で除した値;電流密度をくし型電極とカーボン印刷電極とで比較すると、例えば、今回の計測の最高濃度であるZ-FK濃度500μmol/Lにおいて、それぞれ、1.91μA/mm2及び119nA/mm2となり、くし型電極で観察される電流密度はカーボン印刷電極で観察される電流密度の約16倍であった。このように、くし型電極を適用することで高感度化が達成されることが判明した。
 (実施例4)くし型電極への試薬の配置
 <試薬(終濃度)>
 ・10mmol/L リン酸カリウム緩衝液(PPB) (pH8.0)
 ・FAOD (60U/mL)
 ・ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物(300mmol/L)
 ・スクロース(0.25%)和光純薬工業製
 <基質(終濃度)>
 ・Z-FK水溶液(0~500μmol/L)
 <使用電極>
 ・くし型電極(国際公開第2014/112569号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極)
 ・カーボン印刷電極(バイオデバイステクノロジー社製)
 FAODを120mmol/L PPBに720U/mLになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を1200mmol/Lになるように精製水に溶解した。スクロースを0.375%になるように精製水に溶解した。Z-FKを終濃度50、100、300、500μmol/Lになるように精製水に溶解した。FAOD溶液1μL、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物水溶液3μL、及びスクロース8μLを混合した後に、カバー付きのくし型電極及びカーボン印刷電極にそれぞれ0.8μLと1.3μL吸引させ、25℃の恒温インキュベータで30分乾燥させてFAODを配置したセンサを作製した。作製したFAODが配置されたセンサに、Z-FK溶液をそれぞれ0.8μLと1.3μL吸引させた。60秒反応させた後、100mV印加して定電位測定をおこない、それぞれ、5秒後(くし型電極)、20秒後(カーボン印刷電極)の電流値を比較した。Z-FK濃度と電流値の相関を解析した結果、図5に示すとおり、カーボン印刷電極と比較して、くし型電極を用いた時に、Z-FK測定時の検量線の傾きが約6倍になった。また、くし型電極を用いた場合の方が観察される電流密度が高かった。即ち、観察される電流値を作用極の面積で除した値;電流密度をくし型電極とカーボン印刷電極とで比較すると、例えば、今回の計測の最高濃度であるZ-FK濃度500μmol/Lにおいて、それぞれ、1.44μA/mm2及び114nA/mm2となり、くし型電極で観察される電流密度はカーボン印刷電極で観察される電流密度の約13倍であった。くし型電極の適用によって高感度に測定可能なセンサを作製することができた。
 (実施例5)糖化アルブミンのプロテアーゼ消化物の測定
 <サンプル>
 ・糖化アルブミン(Low/High)
 <試薬1(終濃度)>
 ・オリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製) (50mg/mL)
 <試薬2(終濃度)>
 ・10mmol/L リン酸カリウム緩衝液(PPB) (pH8.0)
 ・FAOD (60U/mL)
 ・ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物(300mmol/L)
 ・スクロース(0.25%) 和光純薬工業社製
 <使用電極>
 ・くし型電極(国際公開第2014/112569号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極)
 ・カーボン印刷電極(バイオデバイステクノロジー社製)
 オリエンターゼ22BF(エイチビィアイ社製)を50mg/mLになるように精製水に溶解した。また、糖化アルブミン(Low/High)と、オリエンターゼ22BF溶液と、を1:1の容量比で混合して、37℃、1時間反応させ、糖化アルブミンのプロテアーゼ消化物を作製した。さらに、FAODを120mmol/L PPBに720U/mLになるように溶解し、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を1200mmol/Lになるように精製水に溶解し、スクロースを0.375%になるように精製水に溶解し、Z-FKを終濃度50、100、300、500μmol/Lになるように精製水に溶解した。
 FAOD溶液1μL、ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物水溶液3μL、及びスクロース8μLを混合した後に、カバー付きのくし型電極及びカーボン印刷電極にそれぞれ0.8μLと1.3μL吸引させ、25℃の恒温インキュベータで30分乾燥させてFAOD配置センサを作製した。FAODが配置されたセンサにプロテアーゼ消化物を、それぞれ0.8μL(くし型電極)、1.3μL(カーボン印刷電極)吸引させた後に、60秒反応させ、100mV印加して定電位測定をおこない、それぞれ、5秒後(くし型電極)、20秒後(カーボン印刷電極)の電流値を比較した。糖化アルブミン(Low/High)測定時の電流値の差を解析した結果、カーボン印刷電極では、図6に示すとおり、20秒後の電流値の差異が21nAであったが、くし型電極では、図7に示すとおり、5秒後の電流値の差異が104nAであった。従来のカーボン印刷電極と比較して、糖化アルブミン測定時においても、くし型電極の適用によって高感度に測定することができることが示された。
 以上説明してきたように、本発明による糖化タンパク質濃度測定方法又はバイオセンサによれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量することができる。従って、この発明を適用することにより、例えば、臨床診断分野の血液検査で使用できる、簡便かつ安価な分析器具を提供することができる。糖化タンパク質の血中濃度は、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることから、このような分析器具は、糖尿病の症状の診断及び管理に関する有用なツールとなることが期待できる。

Claims (11)

  1.  試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、
     (1)プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、
     (2)工程(1)における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、
     を含む測定方法。
  2.  前記酸化還元酵素と前記電子メディエータを含む組成物が前記くし型電極上に配置されている、請求項1に記載の測定方法。
  3.  前記酸化還元酵素がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼである、請求項1又は2に記載の測定方法。
  4.  前記電子メディエータがヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物である、請求項1から3のいずれかに記載の測定方法。
  5.  前記電気化学的方式が定電位電流測定方式である、請求項1から4のいずれかに記載の測定方法。
  6.  前記糖化タンパク質が糖化アルブミンである、請求項1から5のいずれかに記載の測定方法。
  7.  前記くし型電極は、総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmである、請求項1から6のいずれかに記載の測定方法。
  8.  前記(1)工程における前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度が12U/mL以上である、請求項3に記載の測定方法。
  9.  前記(1)工程における前記ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物の濃度が300mmol/L以上である、請求項4に記載の測定方法。
  10.  試料中の糖化タンパク質の測定用バイオセンサであって、
     (1)電子メディエータ及び酸化還元酵素を含む組成物と、
     (2)くし型電極と、
     を備え、
     プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質を前記酸化還元酵素と反応させる、バイオセンサ。
  11.  試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、
     (1)300mmol/L以上のヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物及び12U/mL以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、
     (2)総面積が1.8mm2~4mm2であり、電極間距離が50μm未満であり、作用極の電極幅が5μm~50μmであり、かつ対極の電極幅が5μm~100μmであるくし型電極と、
     を備え、
     前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと前記ヘキサアンミンルテニウム(III)塩化物を含む組成物が前記くし型電極に配置されており、
     プロテアーゼを接触させた糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質が前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させられる、バイオセンサ。
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