JP2003279553A - Ｓｅｃ用カラム充填剤 - Google Patents
Ｓｅｃ用カラム充填剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 優れた蛋白分離能を有するＳＥＣ用カラム充
填剤を提供する。 【解決手段】 シリカゲルの表面に下記一般式（I）で
表される化合物が結合されていることを特徴とするＳＥ
Ｃ用カラム充填剤。 【化１】
填剤を提供する。 【解決手段】 シリカゲルの表面に下記一般式（I）で
表される化合物が結合されていることを特徴とするＳＥ
Ｃ用カラム充填剤。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＳＥＣ用カラム充
填剤、特にその蛋白分離能の向上に関する。
填剤、特にその蛋白分離能の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ
Ｃ）は、溶媒中における溶質の分子サイズによって分離
を行う方法であり、小さな分子はカラム充填剤の細孔中
へ浸透することにより長くカラム中に保持され、大きな
分子は細孔中へ入り込むことができずに早く溶出してく
るといった原理によるものである。ＳＥＣは、高分子量
の物質の分子量による分離に非常に適しており、このよ
うな分離・分析の手段として非常によく用いられてい
る。
Ｃ）は、溶媒中における溶質の分子サイズによって分離
を行う方法であり、小さな分子はカラム充填剤の細孔中
へ浸透することにより長くカラム中に保持され、大きな
分子は細孔中へ入り込むことができずに早く溶出してく
るといった原理によるものである。ＳＥＣは、高分子量
の物質の分子量による分離に非常に適しており、このよ
うな分離・分析の手段として非常によく用いられてい
る。
【０００３】一般に、ＳＥＣ用のカラム充填剤として
は、シリカゲル等の無機系充填剤と、スチレン・ジビニ
ルベンゼン共重合体等の有機ポリマーよりなる有機系充
填剤とに大別することができる。しかしながら、有機系
のカラム充填剤は、耐圧性に劣る、溶媒により膨潤・収
縮する、加熱殺菌が不可能である等の難点があるため
に、実際には無機系充填剤、特にシリカゲルを基剤とし
た充填剤が主に用いられている。これらシリカゲル系充
填剤は優れた分離能を示し、機械的強度も良好である。
は、シリカゲル等の無機系充填剤と、スチレン・ジビニ
ルベンゼン共重合体等の有機ポリマーよりなる有機系充
填剤とに大別することができる。しかしながら、有機系
のカラム充填剤は、耐圧性に劣る、溶媒により膨潤・収
縮する、加熱殺菌が不可能である等の難点があるため
に、実際には無機系充填剤、特にシリカゲルを基剤とし
た充填剤が主に用いられている。これらシリカゲル系充
填剤は優れた分離能を示し、機械的強度も良好である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方で、ＳＥＣにおい
ては、前述したように分子サイズによる分離を行うもの
であるために、基本的に溶質とゲルとの間の相互作用が
起こらないようにする必要がある。すなわち、通常の分
配・吸着クロマトグラフィーとは異なり、ゲル表面での
吸着・脱離は生じさせてはならない。このために、吸着
が生じないように、移動相に極性の強い溶媒を用いた
り、また、充填剤表面を処理して親水性官能基を修飾し
たりするといった工夫がなされ、このような充填剤が多
く市販されてきた。しかしながら、従来のシリカゲル系
充填剤は、シリカゲルと蛋白質との間で吸着が起こって
しまうために、ＳＥＣにおいては精度の良い蛋白質の分
離・分析を行うことができず、この問題は未だ解決され
ていなかった。本発明は、このような従来の課題に鑑み
なされたものであり、その目的は優れた蛋白分離能を有
するＳＥＣ用カラム充填剤を提供することである。
ては、前述したように分子サイズによる分離を行うもの
であるために、基本的に溶質とゲルとの間の相互作用が
起こらないようにする必要がある。すなわち、通常の分
配・吸着クロマトグラフィーとは異なり、ゲル表面での
吸着・脱離は生じさせてはならない。このために、吸着
が生じないように、移動相に極性の強い溶媒を用いた
り、また、充填剤表面を処理して親水性官能基を修飾し
たりするといった工夫がなされ、このような充填剤が多
く市販されてきた。しかしながら、従来のシリカゲル系
充填剤は、シリカゲルと蛋白質との間で吸着が起こって
しまうために、ＳＥＣにおいては精度の良い蛋白質の分
離・分析を行うことができず、この問題は未だ解決され
ていなかった。本発明は、このような従来の課題に鑑み
なされたものであり、その目的は優れた蛋白分離能を有
するＳＥＣ用カラム充填剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記従来
技術の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シ
リカゲルの表面にＮ-(３-トリエトキシシリルプロピル)
グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を結合したものをカラム
充填剤として用いると、シリカゲルと蛋白質との吸着が
低減されることにより、蛋白質の分離能が向上すること
を見出し、本発明を完成するに至った。
技術の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シ
リカゲルの表面にＮ-(３-トリエトキシシリルプロピル)
グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を結合したものをカラム
充填剤として用いると、シリカゲルと蛋白質との吸着が
低減されることにより、蛋白質の分離能が向上すること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明にかかるＳＥＣ用カラム
充填剤は、シリカゲルの表面に下記一般式（I）で表さ
れる化合物が結合していることを特徴とする。
充填剤は、シリカゲルの表面に下記一般式（I）で表さ
れる化合物が結合していることを特徴とする。
【化２】
また、前記ＳＥＣ用カラム充填剤は、蛋白質の分離に用
いられることが好適である。
いられることが好適である。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に本発明の好適な実施形態に
ついて説明する。本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤
は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表される化
合物が結合されていることを特徴とする。このために、
本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルと
蛋白質との吸着を低減することにより、蛋白質の分離能
を向上することができる。
ついて説明する。本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤
は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表される化
合物が結合されていることを特徴とする。このために、
本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルと
蛋白質との吸着を低減することにより、蛋白質の分離能
を向上することができる。
【０００８】本発明のＳＥＣ用カラム充填剤に用いるシ
リカゲルは、粒子の形状、粒径及び細孔径により特に限
定されるものではなく、分離目的に合わせて適した性質
のものを適宜選択し用いることができる。このようなシ
リカゲルとしては、通常カラム充填剤用として市販され
ている多孔質球状シリカゲルを好適に用いることができ
る。また、蛋白質分離の目的で用いる場合には、通常、
粒径５〜１０μｍ、細孔径１０〜５０ｎｍのシリカゲル
が好適である。本発明のＳＥＣ用カラム充填剤に用いる
上記一般式（I）で表される化合物は、公知の方法によ
り製造したものを用いることができる。例えば、上記一
般式（I）で表される化合物は、市販の３−アミノプロ
ピルトリエトキシシランとグルコノ−δ−ラクトンを等
モル反応させることによって容易に製造することがで
き、このようにして製造したものを用いることができ
る。
リカゲルは、粒子の形状、粒径及び細孔径により特に限
定されるものではなく、分離目的に合わせて適した性質
のものを適宜選択し用いることができる。このようなシ
リカゲルとしては、通常カラム充填剤用として市販され
ている多孔質球状シリカゲルを好適に用いることができ
る。また、蛋白質分離の目的で用いる場合には、通常、
粒径５〜１０μｍ、細孔径１０〜５０ｎｍのシリカゲル
が好適である。本発明のＳＥＣ用カラム充填剤に用いる
上記一般式（I）で表される化合物は、公知の方法によ
り製造したものを用いることができる。例えば、上記一
般式（I）で表される化合物は、市販の３−アミノプロ
ピルトリエトキシシランとグルコノ−δ−ラクトンを等
モル反応させることによって容易に製造することがで
き、このようにして製造したものを用いることができ
る。
【０００９】本発明のＳＥＣ用カラム充填剤の製造方法
は、シリカゲルと上記一般式（I）で表される化合物と
を結合させる方法であれば特に限定されない。例えば、
シリカゲルを上記一般式（I）で表される化合物の酸性
水溶液中に浸漬し、室温中で反応させる方法が好適な方
法として挙げられる。また、シリカゲルに、予め前記３
−アミノプロピルトリエトキシシランを修飾し、この後
に、前記グルコノ−δ−ラクトンを結合させても、本発
明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤と同一のものを製造す
ることができるが、このようなものも本発明の範疇であ
る。
は、シリカゲルと上記一般式（I）で表される化合物と
を結合させる方法であれば特に限定されない。例えば、
シリカゲルを上記一般式（I）で表される化合物の酸性
水溶液中に浸漬し、室温中で反応させる方法が好適な方
法として挙げられる。また、シリカゲルに、予め前記３
−アミノプロピルトリエトキシシランを修飾し、この後
に、前記グルコノ−δ−ラクトンを結合させても、本発
明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤と同一のものを製造す
ることができるが、このようなものも本発明の範疇であ
る。
【００１０】このようにして得られる本発明のＳＥＣ用
カラム充填剤の構造を図１に示す。すなわち、本発明の
ＳＥＣ用カラム充填剤のシリカゲル表面には、上記一般
式（I）で表される化合物がシロキサン結合を介して修
飾されている。本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、カラ
ムに充填することによりＳＥＣ用のカラムとして用い
る。カラムの材質は特に限定されず、ステンレス、合成
樹脂等、いずれのものも用いることができる。また、カ
ラムへの充填方法も特に限定されるものではなく、平衡
密度法、スラリー充填法等の公知の充填方法を用いるこ
とができる。
カラム充填剤の構造を図１に示す。すなわち、本発明の
ＳＥＣ用カラム充填剤のシリカゲル表面には、上記一般
式（I）で表される化合物がシロキサン結合を介して修
飾されている。本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、カラ
ムに充填することによりＳＥＣ用のカラムとして用い
る。カラムの材質は特に限定されず、ステンレス、合成
樹脂等、いずれのものも用いることができる。また、カ
ラムへの充填方法も特に限定されるものではなく、平衡
密度法、スラリー充填法等の公知の充填方法を用いるこ
とができる。
【００１１】そして、このようなＳＥＣ用カラムを用い
て蛋白質の分離を行うと、蛋白質分子を含む流体は、カ
ラムの一端から入ってシリカゲル粒子の細孔及び／又は
間隙を通過して他端から溶出する。この通過途中で、従
来のシリカゲル系充填剤においてはシリカゲル粒子と蛋
白質分子との吸着が起こっていたのに対し、本発明にか
かるＳＥＣ用カラム充填剤においてはシリカゲル表面に
上記一般式（I）の化合物を結合させることにより、蛋
白質との吸着反応を低減することができるため、より高
い精度で分離・分析を行うことが可能となる。このた
め、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、蛋白質の分離に
用いることが好適である。また、通常、ＳＥＣにおいて
は、溶離液として非水系の有機溶媒を用いて分離を行う
場合をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、溶離液
として水系の溶媒を用いて分離を行う場合をゲル濾過ク
ロマトグラフィー（ＧＦＣ）と呼び、この両者は区別さ
れているが、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は特に限定
されるものではなく、このどちらの場合においても用い
ることができる。
て蛋白質の分離を行うと、蛋白質分子を含む流体は、カ
ラムの一端から入ってシリカゲル粒子の細孔及び／又は
間隙を通過して他端から溶出する。この通過途中で、従
来のシリカゲル系充填剤においてはシリカゲル粒子と蛋
白質分子との吸着が起こっていたのに対し、本発明にか
かるＳＥＣ用カラム充填剤においてはシリカゲル表面に
上記一般式（I）の化合物を結合させることにより、蛋
白質との吸着反応を低減することができるため、より高
い精度で分離・分析を行うことが可能となる。このた
め、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、蛋白質の分離に
用いることが好適である。また、通常、ＳＥＣにおいて
は、溶離液として非水系の有機溶媒を用いて分離を行う
場合をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、溶離液
として水系の溶媒を用いて分離を行う場合をゲル濾過ク
ロマトグラフィー（ＧＦＣ）と呼び、この両者は区別さ
れているが、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は特に限定
されるものではなく、このどちらの場合においても用い
ることができる。
【００１２】以下に、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充
填剤の作用について説明する。ＳＥＣにおける溶質分子
とカラム充填剤粒子の模式図を図２に示す。カラム充填
剤粒子１０の細孔の孔径より大きなサイズの溶質分子ａ
１２は細孔に入れず、充填剤粒子の間隙を通って溶出す
る。これに対して、カラム充填剤粒子１０の細孔の孔径
より小さなサイズの溶質分子ｂ１４及び溶質分子ｃ１６
は細孔から充填剤粒子１０の細孔の内部へ入り込むた
め、遅れて溶出してくる。この結果、サイズの大きな溶
質分子が小さな溶質分子よりも先に溶出されてくること
となり、分子のサイズによる分離が可能となる。
填剤の作用について説明する。ＳＥＣにおける溶質分子
とカラム充填剤粒子の模式図を図２に示す。カラム充填
剤粒子１０の細孔の孔径より大きなサイズの溶質分子ａ
１２は細孔に入れず、充填剤粒子の間隙を通って溶出す
る。これに対して、カラム充填剤粒子１０の細孔の孔径
より小さなサイズの溶質分子ｂ１４及び溶質分子ｃ１６
は細孔から充填剤粒子１０の細孔の内部へ入り込むた
め、遅れて溶出してくる。この結果、サイズの大きな溶
質分子が小さな溶質分子よりも先に溶出されてくること
となり、分子のサイズによる分離が可能となる。
【００１３】すなわち、前記サイズの小さい溶質分子ｃ
１６は充填剤の細孔の体積(ＶＩ)、及び充填剤の外側の
体積(Ｖｏ)を利用できるが、前記サイズの大きい溶質分
子ａ１２は充填剤の外側の体積(Ｖｏ)のみしか利用でき
ない。そしてこれらの中間のサイズの溶質分子ｂ１４
は、一部の充填剤の細孔の体積(ＶＩ)を利用することが
できる。ここで、ＳＥＣにおける保持容量ＶＲは、下記
一般式（a）により表される。
１６は充填剤の細孔の体積(ＶＩ)、及び充填剤の外側の
体積(Ｖｏ)を利用できるが、前記サイズの大きい溶質分
子ａ１２は充填剤の外側の体積(Ｖｏ)のみしか利用でき
ない。そしてこれらの中間のサイズの溶質分子ｂ１４
は、一部の充填剤の細孔の体積(ＶＩ)を利用することが
できる。ここで、ＳＥＣにおける保持容量ＶＲは、下記
一般式（a）により表される。
【数１】
ＶＲ＝ＶＯ＋αＶＩ （０≦α≦１） … （a）
ここで、αは試料分子が細孔内のどこまで入り込むこと
ができるかを示すものであり、α＝０のときは全く入り
込むことができず、α＝１のときは完全に入り込むこと
ができる。
ができるかを示すものであり、α＝０のときは全く入り
込むことができず、α＝１のときは完全に入り込むこと
ができる。
【００１４】前記保持容量ＶＲと分子量の対数との関係
をプロットした校正曲線とこれに対応した溶出量検出曲
線の模式図を図３に示す。前記保持容量ＶＲと分子量の
対数はＡ〜Ｂ間で直線関係を示し、分子量がＡよりも大
きい溶質はα＝０となりすべてＶＯに溶出し、Ｂよりも
小さい溶質はα＝１となりすべてＶＯ＋ＶＩに溶出す
る。ここで、Ａを排除限界分子量、Ｂを全浸透限界分子
量という。そして、図２において分子量がＡとＢの間
（αが０〜１の間）にある溶質については、得られたＶ
Ｒを前記校正曲線の直線部分に当てはめることによっ
て、その分子量を求めることができる。
をプロットした校正曲線とこれに対応した溶出量検出曲
線の模式図を図３に示す。前記保持容量ＶＲと分子量の
対数はＡ〜Ｂ間で直線関係を示し、分子量がＡよりも大
きい溶質はα＝０となりすべてＶＯに溶出し、Ｂよりも
小さい溶質はα＝１となりすべてＶＯ＋ＶＩに溶出す
る。ここで、Ａを排除限界分子量、Ｂを全浸透限界分子
量という。そして、図２において分子量がＡとＢの間
（αが０〜１の間）にある溶質については、得られたＶ
Ｒを前記校正曲線の直線部分に当てはめることによっ
て、その分子量を求めることができる。
【００１５】以上説明したＳＥＣの機構においては、溶
質分子とカラム充填剤との間に相互作用を生じると、分
子サイズによる分離挙動の妨げとなる。すなわち、前述
したように、溶質分子とカラム充填剤との間に相互作用
の無い理想的な系においては、保持容量ＶＲと分子量対
数は直線関係となる。しかしながら、溶質分子とカラム
充填剤との間で吸着が生じている場合、カラム充填剤と
の間の吸着強度の低い溶質分子は早く溶出し、吸着強度
の高い溶質分子は溶出が遅れるというように、保持容量
ＶＲに吸着の影響を及ぼしてしまう。
質分子とカラム充填剤との間に相互作用を生じると、分
子サイズによる分離挙動の妨げとなる。すなわち、前述
したように、溶質分子とカラム充填剤との間に相互作用
の無い理想的な系においては、保持容量ＶＲと分子量対
数は直線関係となる。しかしながら、溶質分子とカラム
充填剤との間で吸着が生じている場合、カラム充填剤と
の間の吸着強度の低い溶質分子は早く溶出し、吸着強度
の高い溶質分子は溶出が遅れるというように、保持容量
ＶＲに吸着の影響を及ぼしてしまう。
【００１６】これによって、試料の溶出ピークはブロー
ドとなり、保持容量ＶＲの近い試料のピーク同士が重な
ってしまうために分離が困難となり、また、前述の保持
容量ＶＲと分子量対数との直線関係も崩れてしまうた
め、保持容量ＶＲの実測値から正確な分子量を算出する
ことができなくなる。したがって、ＳＥＣにおいて、よ
り精度の高い分離・分析を行うためには、ＳＥＣ用カラ
ム充填剤と試料との間で吸着反応が起こらないようにす
る必要がある。
ドとなり、保持容量ＶＲの近い試料のピーク同士が重な
ってしまうために分離が困難となり、また、前述の保持
容量ＶＲと分子量対数との直線関係も崩れてしまうた
め、保持容量ＶＲの実測値から正確な分子量を算出する
ことができなくなる。したがって、ＳＥＣにおいて、よ
り精度の高い分離・分析を行うためには、ＳＥＣ用カラ
ム充填剤と試料との間で吸着反応が起こらないようにす
る必要がある。
【００１７】ここで、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充
填剤は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表され
る化合物が結合されていることによって、シリカゲルと
蛋白質との吸着を著しく低減することができる。そし
て、これを用いてＳＥＣによる蛋白質の分離・分析を行
うと、前述したような溶質（蛋白質）分子とカラム充填
剤との間に相互作用の無い理想的な系へと近づけること
ができ、より高い精度で蛋白質の分離・分析を行うこと
が可能となるのである。
填剤は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表され
る化合物が結合されていることによって、シリカゲルと
蛋白質との吸着を著しく低減することができる。そし
て、これを用いてＳＥＣによる蛋白質の分離・分析を行
うと、前述したような溶質（蛋白質）分子とカラム充填
剤との間に相互作用の無い理想的な系へと近づけること
ができ、より高い精度で蛋白質の分離・分析を行うこと
が可能となるのである。
【００１８】
【実施例】以下、本発明の好適な実施例について更に詳
しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるも
のではない。 ＳＥＣ用カラム充填剤の製造 市販のシリカゲル（洞海化学製、粒径５μｍ、細孔径３
０ｎｍ）５ｇを、０．０６ｍｏｌ Ｎ-(３-トリエトキシ
シリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）０．０
１Ｍ酢酸水溶液５０ｍｌ中に浸漬し、室温にて１昼夜反
応させた。 ＳＥＣ用カラムの作製 により得られたカラム充填剤を、溶媒として水を用
い、スラリー充填法により、内径２ｍｍ、長さ３００ｍ
ｍのステンレス管に充填し、ＳＥＣ用カラムを作成し
た。
しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるも
のではない。 ＳＥＣ用カラム充填剤の製造 市販のシリカゲル（洞海化学製、粒径５μｍ、細孔径３
０ｎｍ）５ｇを、０．０６ｍｏｌ Ｎ-(３-トリエトキシ
シリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）０．０
１Ｍ酢酸水溶液５０ｍｌ中に浸漬し、室温にて１昼夜反
応させた。 ＳＥＣ用カラムの作製 により得られたカラム充填剤を、溶媒として水を用
い、スラリー充填法により、内径２ｍｍ、長さ３００ｍ
ｍのステンレス管に充填し、ＳＥＣ用カラムを作成し
た。
【００１９】ＳＥＣによる蛋白質分離能試験
、により作製したＳＥＣ用カラムを用い、ブルーデ
キストラン（分子量２００万）、アルブミン（分子量６
６０００）、カルボアンヒドロゲナーゼ（分子量２９０
００）、インシュリン（分子量７０００）の４種の蛋白
質試料について、それぞれの分離能について調べた。
尚、移動相には0.1M Tris-buffer(pH6.95)-0.15M Na2SO
4を流量０．１μl/minで送液し、検出は２７８ｎｍにお
ける吸光度の測定により行った。また、試料注入量は、
３、５、１０μｌのそれぞれで行った。
キストラン（分子量２００万）、アルブミン（分子量６
６０００）、カルボアンヒドロゲナーゼ（分子量２９０
００）、インシュリン（分子量７０００）の４種の蛋白
質試料について、それぞれの分離能について調べた。
尚、移動相には0.1M Tris-buffer(pH6.95)-0.15M Na2SO
4を流量０．１μl/minで送液し、検出は２７８ｎｍにお
ける吸光度の測定により行った。また、試料注入量は、
３、５、１０μｌのそれぞれで行った。
【００２０】上記試験の結果を表１〜３に示す。また、
各種蛋白質試料におけるクロマトグラム（試料注入量３
μｌ）を図４〜７に示す。
各種蛋白質試料におけるクロマトグラム（試料注入量３
μｌ）を図４〜７に示す。
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】上記表１〜３より、いずれの蛋白質試料に
おいても、保持時間の測定結果にばらつきが少なく、優
れた再現性が得られた。また、３、５、１０μｌの各試
料注入量の間においても、得られた測定結果にばらつき
は少なかった。また、図４〜７より、いずれの蛋白質試
料においてもシャープな溶出ピークが検出された。これ
らのことから、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤
が、蛋白質試料に対して優れた分離能を有することが示
された。
おいても、保持時間の測定結果にばらつきが少なく、優
れた再現性が得られた。また、３、５、１０μｌの各試
料注入量の間においても、得られた測定結果にばらつき
は少なかった。また、図４〜７より、いずれの蛋白質試
料においてもシャープな溶出ピークが検出された。これ
らのことから、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤
が、蛋白質試料に対して優れた分離能を有することが示
された。
【００２４】つづいて、上記表１〜３の試験結果（保持
時間の測定結果）から、ブルーデキストラン（排除限界
分子量に相当）の保持容量をＶ０、他の各蛋白質試料の
保持容量をＶＲとして、各蛋白質試料の保持容量比ＶＲ
／Ｖ０を求め、各蛋白質試料の既知の分子量対数ととも
にプロットし、分子量対数−保持容量比プロットを得
た。この結果を図８〜１０に示す。
時間の測定結果）から、ブルーデキストラン（排除限界
分子量に相当）の保持容量をＶ０、他の各蛋白質試料の
保持容量をＶＲとして、各蛋白質試料の保持容量比ＶＲ
／Ｖ０を求め、各蛋白質試料の既知の分子量対数ととも
にプロットし、分子量対数−保持容量比プロットを得
た。この結果を図８〜１０に示す。
【００２５】図８〜１０より、分子量対数−保持容量比
プロットは、いずれも非常に優れた直線性を示した。前
述したように、カラム充填剤と溶質分子との吸着が生じ
ていない系では分子量対数−保持容量比プロットは理論
的に直線となるため、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤で
は、シリカゲルと蛋白質との吸着が殆ど生じていないも
のであると考えられる。このことから、本発明のＳＥＣ
用カラム充填剤を用いることにより、ＳＥＣにおいて蛋
白質の分離・分析を高い精度で行うことが可能となるこ
とが示された。
プロットは、いずれも非常に優れた直線性を示した。前
述したように、カラム充填剤と溶質分子との吸着が生じ
ていない系では分子量対数−保持容量比プロットは理論
的に直線となるため、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤で
は、シリカゲルと蛋白質との吸着が殆ど生じていないも
のであると考えられる。このことから、本発明のＳＥＣ
用カラム充填剤を用いることにより、ＳＥＣにおいて蛋
白質の分離・分析を高い精度で行うことが可能となるこ
とが示された。
【００２６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のＳＥＣ用
カラム充填剤は、シリカゲル表面上にＮ-(３-トリエト
キシシリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を
結合させることにより、シリカゲルと蛋白質との吸着を
低減することができ、ＳＥＣにおいて蛋白質の分離・分
析を高い精度で行うことが可能となる。
カラム充填剤は、シリカゲル表面上にＮ-(３-トリエト
キシシリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を
結合させることにより、シリカゲルと蛋白質との吸着を
低減することができ、ＳＥＣにおいて蛋白質の分離・分
析を高い精度で行うことが可能となる。
【図１】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤の構造
図である。
図である。
【図２】 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の
原理の説明図である。
原理の説明図である。
【図３】 分子量対数−保持容量校正曲線及び溶出量検
出曲線のそれぞれの相互関係を示した説明図である。
出曲線のそれぞれの相互関係を示した説明図である。
【図４】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるブルー
デキストランのクロマトグラムである。
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるブルー
デキストランのクロマトグラムである。
【図５】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるアルブ
ミンのクロマトグラムである。
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるアルブ
ミンのクロマトグラムである。
【図６】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるカルボ
アンヒドロゲナーゼのクロマトグラムである。
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるカルボ
アンヒドロゲナーゼのクロマトグラムである。
【図７】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるインシ
ュリンのクロマトグラムである。
た、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるインシ
ュリンのクロマトグラムである。
【図８】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量３μｌの条件での実施例における分子量
対数−保持容量比プロットである。
た、試料注入量３μｌの条件での実施例における分子量
対数−保持容量比プロットである。
【図９】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用い
た、試料注入量５μｌの条件での実施例における分子量
対数−保持容量比プロットである。
た、試料注入量５μｌの条件での実施例における分子量
対数−保持容量比プロットである。
【図１０】 本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用
いた、試料注入量１０μｌの条件での実施例における分
子量対数−保持容量比プロットである。
いた、試料注入量１０μｌの条件での実施例における分
子量対数−保持容量比プロットである。
１０ カラム充填剤粒子
１２ 溶質分子ａ
１４ 溶質分子ｂ
１６ 溶質分子ｃ
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/32 Ｇ０１Ｎ 30/32 Ｚ
30/56 30/56 Ａ
30/74 30/74 Ｅ
30/86 30/86 Ｍ
(72)発明者 梁木 利男
神奈川県横浜市都筑区早渕２丁目２番１号
株式会社資生堂リサーチセンター（新横
浜）内
(72)発明者 大津 裕
神奈川県横浜市都筑区早渕２丁目２番１号
株式会社資生堂リサーチセンター（新横
浜）内
Ｆターム(参考） 4G066 AA22C AB06B AB13B AB18B
CA54 EA01
Claims (2)
- 【請求項１】 シリカゲルの表面に下記一般式（I）で
表される化合物が結合していることを特徴とするＳＥＣ
用カラム充填剤。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載のＳＥＣ用カラム充填剤に
おいて、蛋白質の分離に用いることを特徴とするＳＥＣ
用カラム充填剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083769A JP3949987B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Ｓｅｃ用カラム充填剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083769A JP3949987B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Ｓｅｃ用カラム充填剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003279553A true JP2003279553A (ja) | 2003-10-02 |
| JP3949987B2 JP3949987B2 (ja) | 2007-07-25 |
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ID=29231401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002083769A Expired - Fee Related JP3949987B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Ｓｅｃ用カラム充填剤 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3949987B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005079975A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-09-01 | Varian, Inc. | Polar-modified bonded phase materials for chromatographic separations |
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| JP2018021929A (ja) * | 2009-12-15 | 2018-02-08 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法 |
-
2002
- 2002-03-25 JP JP2002083769A patent/JP3949987B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
| JP3949987B2 (ja) | 2007-07-25 |
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