JP4468806B2 - フェロセン化合物およびその用途 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフェロセン化合物、その化合物を含有する試薬、その試薬を用いるビタミンＤ化合物の高感度測定法、およびそのフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬品としてのビタミンＤ化合物（ＶＤ化合物）として、カルシトリオール（商品名 ロカルトロール（登録商標））、アルファカルシドール（商品名 アルファロール（登録商標））、マキサカルシトール（商品名 オキサロール（登録商標））、タカルシトール（商品名 ボンアルファ（登録商標））、カルシポトリオール（商品名 ドボネックス（登録商標））、ファレカルシトリオール（商品名 ホーネル（登録商標）；商品名 フルスタン（登録商標））、２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（ＥＤ−７１（開発コード名）、中外製薬株式会社）等、各種の化合物が上市或いは臨床開発段階にある。ＶＤ化合物はごく微量で薬効を発揮し、副作用であるＣａ上昇作用も発現することから、高感度測定法が必須である。近年、質量分析法の発展に伴い、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）およびタンデム型の液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）が薬物の高感度分析、代謝研究に広く用いられる。なかでも、エレクトスプレーイオン化法（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）が最も繁用されており、ＶＤ化合物についてもＬＣ／ＭＳ法がよく用いられている。しかし、マキサカルシトールやＥＤ−７１等の分子内にエステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有するＶＤ化合物は高感度測定が可能であるのに対して、アルファカルシドールやコレカルシフェロール（ＶＤ₃）等の分子内にエステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有しないＶＤ化合物では、ヘテロ原子を有するＶＤ化合物の１／５〜１／１００程度の感度しか得られていない。このことから、あらゆるＶＤ化合物に適用可能な高感度測定法の開発が求められている。
【０００３】
マススペクトロメトリー測定におけるＶＤ化合物の高感度化には誘導体化法が有用であると考えられる。ＶＤ化合物の誘導体化にはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応でトリエン構造に選択的に反応するトリアゾリン誘導体（Ｃｏｏｋｓｏｎ型試薬）がよく用いられ〔（１）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２；１９４：７７−８１、（２）薬学雑誌 １９９８；１１８（６）：２０６−２１５、（３）薬学雑誌 １９９９；１１９（１２）：８９８−９２０、（４）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １９９３；２２：６２１−６３２、（５）Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １９９３；６４５：１１５−１２３、（６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６；２４３：２８−４０、等〕、ＬＣ／ＭＳにおいて共鳴電子捕獲を利用したＰＴＡＤ（４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）〔前掲の（４）、（５）〕やＰＦＢＴＡＤ（４−ペンタフルオロベンジル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）〔前掲の（５）〕等がある。ＰＴＡＤはポストカラム誘導体化により７〜７０倍感度が向上するとされているが、生体試料に適用された例はない〔前掲の（４）〕。ＰＦＢＴＡＤは定量下限２５ｐｇ／ｍＬ（ヒト血漿１ｍＬ）を達成しているが〔前掲の（６）〕、この感度では不十分である。我々の検討によると、ＰＦＢＴＡＤの類似物であるＰＦＰＴＡＤ（４−ペンタフルオロフェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）を利用した方法では、誘導体化により５倍程度の感度しか得られなく、また、生体試料に適用すると誘導体化率が悪い等から十分な感度が得られなかった。従って、ＬＣ／ＭＳに対してより高感度に応答する原子団を有する試薬（誘導体化剤）の開発が求められている。
【０００４】
ＢｅｒｋｅｌらはＥＳＩに対してフェロセン化合物が高感度に応答し、水酸基を有する化合物に対してフェロセニルアジドを誘導体化剤として用いる時、高感度測定が可能であることを報告している〔（７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８；７０：１５４４−１５５４〕。ＥＳＩはイオン性の化合物に対して高感度測定が可能であり、本誘導体化法はイオン化（正イオンモード）の際にフェロセンが容易に酸化され、安定なイオンを効率よく生成することを利用したものである。しかしながら、これをＶＤ化合物の測定方法に応用した例は報告されていない。また、フェロセニルアジドを誘導体化剤として用いる場合、その反応条件に加熱を要するばかりかフェロセニルアジド自身も爆発性を有するため、取り扱いが困難であるという問題もあった。
【０００５】
上述した如く、あらゆるビタミンＤ化合物に適用可能であり且つ利用しやすい高感度のビタミンＤ化合物の測定法、それに用いる誘導体化剤、およびその誘導体化剤とビタミンＤ化合物とが結合した化合物は現在のところ存在していない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、下記式（１）
【化６】
（式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されるフェロセン化合物をビタミンＤ化合物（ＶＤ化合物）に結合させ、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）、特に液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）により測定することにより、あらゆるＶＤ化合物に適用可能であり且つ利用しやすく、なおかつ従来にない高感度でＶＤ化合物の測定が可能となることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるフェロセン化合物に関する。
【化７】
（式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
本発明においては、前記式（１）で表される化合物中、ＲおよびＲ'が水素原子であるフェロセン化合物にも関する。また、本発明は、前記式（１）で表される化合物中、Ｑが直接結合またはアルキレンを表すフェロセン化合物にも関する。さらにＱがメチレンである前記フェロセン化合物、およびＱが直接結合であるフェロセン化合物にも関する。
本発明のフェロセン化合物としては、具体的には、４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）、４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＴＡＤ）等が挙げられる。
また、本発明は、上記フェロセン化合物を含有する、トリエン構造を有する化合物を測定するための試薬にも関する。このような試薬は、さらにフェロセン化合物を溶解し得る溶媒を含有することができる。
【０００８】
また、本発明は、下記式（１）
【化８】
（式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物に関する。
また、本発明は、前記化合物において、前記フェロセン化合物と前記ビタミンＤ化合物との結合が共有結合であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物にも関する。
【０００９】
さらに本発明は前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、下記式（２）
【化９】
（式中、Ａ₁およびＡ₃はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アルキレン、置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイニレンを表し；Ａ₂は直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または−ＯＲ₉（Ｒ₉は水素原子または保護基を表す。）を表し；Ｒ₂は水素原子、水酸基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級アシル基を表し；Ｒ₃は水素原子または保護基を表し；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し；Ｒ₇およびＲ₈はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、或いは、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成し；Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
で表される化合物であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物にも関する。
本発明は、前記式（２）で表される化合物中、Ａ₁−Ａ₂−Ａ₃は−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または水酸基を表し；Ｒ₂は水素原子またはヒドロキシプロポキシ基を表し；Ｒ₃は水素原子であり；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し；Ｒ₇およびＲ₈は水素原子であるか、または、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成する化合物にも関する。また、前記式（２）で表される化合物中、ＲおよびＲ'が水素原子である化合物にも関する。
さらに、本発明は、前記式（２）で表される化合物中、Ｑが直接結合またはアルキレンを表すフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物にも関する。さらにＱがメチレンである前記フェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物、およびＱが直接結合であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物にも関する。また、本発明は、前記フェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物のうち、ビタミンＤ化合物がビタミンＤ₃化合物であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物にも関する。
【００１０】
また、さらに本発明は、試料中に含まれるビタミンＤ化合物の測定方法であって、下記式（１）
【化１０】
（式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されるフェロセン化合物と、試料中のビタミンＤ化合物とを反応させ、得られたフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物を液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）により測定することを特徴とするビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
また、本発明は、前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、前記フェロセン化合物と前記ビタミンＤ化合物とが共有結合により結合した化合物である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
【００１１】
さらに本発明は前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、下記式（２）
【化１１】
（式中、Ａ₁およびＡ₃はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アルキレン、置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイニレンを表し；Ａ₂は直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または−ＯＲ₉（Ｒ₉は水素原子または保護基を表す。）を表し；Ｒ₂は水素原子、水酸基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級アシル基を表し；Ｒ₃は水素原子または保護基を表し；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し；Ｒ₇およびＲ₈はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、或いは、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成し；Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
で表される化合物である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
【００１２】
本発明は、前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、Ａ₁−Ａ₂−Ａ₃は−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または水酸基を表し；Ｒ₂は水素原子またはヒドロキシプロポキシ基を表し；Ｒ₃は水素原子であり；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し；Ｒ₇およびＲ_aは水素原子であるか、または、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成する、ビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。また、本発明は、前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、ＲおよびＲ'が水素原子であるビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。また本発明は、前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、前記式で表される化合物中、Ｑが直接結合またはアルキレンを表すフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物であるビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。さらにＱがメチレンである前記フェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物である前記のビタミンＤ化合物の測定方法、およびＱが直接結合であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
また、本発明は、前記フェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物のうち、ビタミンＤ化合物がビタミンＤ₃化合物であるフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
また、さらに本発明は、前記試料（測定対象の試料）が生体由来の試料である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
また、さらに本発明は、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）である前記のビタミンＤ化合物の測定方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
下記式（１）
【化１２】
で表される本発明のフェロセン化合物において、「Ｑ」は直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）、好ましくは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はメチレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はメチレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ₃）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（ＣＨ₃）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−を表す。）、より好ましくは直接結合またはアルキレンであり、更に好ましくはアルキレンであり、更により好ましくはメチレンである。また、「Ｒ_a」における「低級アルキル基」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基を指す。
上記のＱ、「Ｗ₁およびＷ₂におけるアルキレン」とは、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキレン鎖を指す。また、Ｗ₁における「フェニレン」とは、ｏ−フェニレン、ｍ−フェニレンまたはｐ−フェニレンを指す。
【００１４】
また、上記の「Ｒ」および「Ｒ'」は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基であり、好ましくは水素原子、水酸基、ハロゲンまたは低級アルキル基であり、より好ましくは水素原子である。ここで、「ハロゲン」とは塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等を指し；「低級アルキル基」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基を指し；「低級アルケニル基」とは、エテニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基を指し；「低級アルキニル基」とは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基を指し；「低級アルコキシ基」とは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、フェノキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基を指し；「低級アシル基」とは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル等の炭素数１〜６のアシル基を指す。
【００１５】
また上記置換基における「置換基を有していてもよい」とは、所望により１または複数（例えば１〜３個）の水酸基；ニトロ基；シアノ基；塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等のハロゲン；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；エテニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、フェノキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル等の炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基等の置換基を有していてもよいことを意味する。
【００１６】
本発明のフェロセン化合物（下記製造スキーム中の化合物６）は、下記の製造スキームに従って製造することができる。
【化１３】
（式中、Ｑ、Ｒ、Ｒ'、ｍおよびｎは前述の式（１）における定義と同一である。）
【００１７】
工程１において、化合物２は化合物１からジフェニルホスホリルアジドおよび塩基を作用させる方法、カルボン酸を酸塩化物、酸無水物に変換後ナトリウムアジドを作用させる方法、カルボン酸をエステルに変換後、ヒドラジンを作用させ、ヒドラジンとのアミドに変換させた後、亜硝酸または亜硝酸エステルを作用させる方法などにより、合成することができ、好ましくは、ジフェニルホスホリルアジドおよび塩基を作用させる方法により合成することができる。なお、出発物質である化合物１は公知であるか、或いは公知の化合物から公知の合成法によって容易に合成できる。また、化合物１は市販もされており、例えば東京化成株式会社より購入することもできる。ジフェニルホスホリルアジドおよび塩基を作用させる方法に用いられる塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられ、好ましくはトリエチルアミンが挙げられる。ジフェニルホスホリルアジドおよび塩基を作用させる方法に用いられる溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはジクロロメタンが挙げられる。ジフェニルホスホリルアジドおよび塩基を作用させる方法の反応温度は、進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、−７８〜５０℃で行い、好ましくは−１０〜１０℃で行う。
【００１８】
工程２において、化合物３は化合物２を加熱することにより、合成することができる。上記工程２に用いられる溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはトルエンが挙げられる。反応温度は、反応が進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、２０℃〜２００℃で行い、好ましくは５０〜１５０℃で行う。
【００１９】
工程３において、化合物４は化合物３にカルバジン酸エステルを作用させることにより行うことができる。上記工程３に用いられる溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはトルエンが挙げられる。反応温度は、反応が進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、０〜２００℃で行い、好ましくは２０〜１２０℃で行う。
【００２０】
工程４において、化合物５は化合物４に塩基を作用させることにより行うことができる。上記工程４に用いられる塩基としてはナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウム ｔｅｒｔ−ブトキラート、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド、ｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、水素化ナトリウム、水素化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸セシウムなどが挙げられ、好ましくは炭酸カリウムが挙げられる。上記工程４に用いられる溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。反応温度は、反応が進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、０〜２００℃で行い、好ましくは２０〜１２０℃で行う。
【００２１】
工程５において、化合物６は化合物５にヨードベンゼンジアセテートを作用させることにより行うことができる。上記工程４に用いられる溶媒としては、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサンが挙げられる。反応温度は、反応が進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、−７８〜１００℃で行い、好ましくは−１０〜５０℃で行う。
【００２２】
また、本発明のフェロセン化合物（化合物６において、Ｑ＝Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂の化合物）は、下記の製造スキームに従って製造することもできる。
【化１４】
（式中、Ｑ、Ｒ、Ｒ'、Ｗ₁、Ｘ、Ｗ₂、ｍおよびｎは前述の式（１）における定義と同一である。）
【００２３】
工程６において、化合物９は化合物７（Ｙは水酸基、カルボン酸酸塩化物残基、カルボン酸酸無水物残基、カルボン酸エステル基、イソシアネート基、スルホニルクロリド残基、ハロゲン原子、アルキルスルホニルオキシ基またはアリールスルホニルオキシ基を示す）と化合物８（Ｚは水酸基、置換基を有していても良いアミノ基、ハロゲン原子、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基を示す）を反応させることにより合成することもできる（工程６）。この際、反応は塩基存在下にて行うことが好ましい。ＹおよびＺの組み合わせとしては、Ｙがカルボン酸酸塩化物残基、カルボン酸酸無水物残基、カルボン酸エステル基、イソシアネート基またはスルホニルクロリド残基である化合物７と、Ｚが水酸基、置換基を有していても良いアミノ基である化合物８の組み合わせ；Ｙが水酸基である化合物７と、Ｚがハロゲン原子、アルキルスルホニルオキシ基またはアリールスルホニルオキシ基である化合物８の組み合わせ；或いはＹがハロゲン原子、アルキルスルホニルオキシ基またはアリールスルホニルオキシ基である化合物７と、Ｚが水酸基である化合物８の組み合わせが挙げられる。なお、出発物質である化合物７および化合物８は公知であるか、或いは公知の化合物から公知の合成法によって容易に合成できる。また、化合物７は市販もされており、例えば東京化成株式会社より購入することもできる。上記工程６に用いられる塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸セシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどが挙げられる。上記工程６に用いられる溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられる。反応温度は、進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、−７８〜２００℃で行い、好ましくは−１０〜１５０℃で行う。なお、工程５の反応条件などについては前述の通りである。
【００２４】
このようにして得られた本発明のフェロセン化合物は、必要に応じ公知の方法に従って精製・乾燥等の操作を行い単離することができる。なお、得られたフェロセン化合物が不安定である場合もあり、その場合は、その化合物が安定して存在することのできる溶媒中（例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサンなど）で保存するとよい。
【００２５】
本発明のフェロセン化合物は、ビタミンＤ化合物（ＶＤ化合物）などのトリエン構造を有する化合物を液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）、特に液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）にて測定する際の試薬（誘導体化剤）として有用である。
本発明の試薬は、上記フェロセン化合物単体、および上記フェロセン化合物を含有する溶液の両方を意味する。本発明の試薬において用いることができる溶媒としては、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタンなどが挙げられ、好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサンが挙げられる。この溶液中のフェロセン化合物の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．００５〜５０重量％、さらに好ましくは０．０１〜１０重量％の範囲から適宜選択される。本発明の試薬を用いて対象化合物を測定する場合、具体的には、その試薬中のフェロセン化合物とＶＤ化合物とを反応させ、これらを結合した化合物をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ等に供することにより、ＶＤ化合物を測定する。測定の詳細については後述する。
【００２６】
ここで、本発明のフェロセン化合物と結合させるＶＤ化合物（即ち、測定対象となるＶＤ化合物）としては、ビタミンＤ₃化合物（ＶＤ₃化合物）が好ましい。ここでＶＤ₃化合物とは、９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物であり、好ましくは（５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物であり、より好ましくは（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１−オール構造を有する化合物、（３β，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−３−オール構造を有する化合物、または（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３−ジオール構造を有する化合物である。これらＶＤ₃化合物の具体的な化合物としては、コレカルシフェロール（ＶＤ₃）、カルシトリオール（１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃；商品名 ロカルトロール（登録商標）、カプセル／製造・販売元 中外製薬株式会社、販売元 杏林製薬株式会社、注／輸入先 中外製薬株式会社、販売先 麒麟麦酒株式会社）、アルファカルシドール（ＡＬＦ；商品名 アルファロール（登録商標）、中外製薬株式会社；特開昭４８−６２７５０号公報およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７３，２３３９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３０，２７０１（１９７４）等）、マキサカルシトール（ＯＣＴ；商品名 オキサロール（登録商標）、軟膏／販売先 マルホ株式会社、製造元 中外製薬株式会社、注／製造販売元中外製薬株式会社；特開昭６１−２６７５５０号公報等）、タカルシトール（商品名 ボンアルファ（登録商標）、帝人株式会社）、カルシポトリオール（商品名 ドボネックス（登録商標）、輸入元 帝国製薬株式会社、販売 藤沢薬品株式会社、テイコクメディックス株式会社）、ファレカルシトリオール（商品名ホーネル（登録商標）、大正製薬株式会社；商品名 フルスタン（登録商標）、製造元 住友製薬株式会社、販売元 キッセイ薬品株式会社）、２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（ＥＤ−７１（開発コード名）、中外製薬株式会社；特開昭６１−２６７５４８号公報等）、ＥＢ１０８９（開発コード名、Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社；Ｊ．ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，７４０，１１７−１２８（２０００）等）、国際公開ＷＯ９５／２７６９７号公報、同ＷＯ９８／２８２６６号公報、同ＷＯ００／４９４０３号公報、同ＷＯ００／６１７７６号公報、同ＷＯ００／６４８７０号公報、同ＷＯ００／６６５４８号公報、同ＷＯ０１／１６０９９号公報、同ＷＯ０１／６２７２３号公報、同ＷＯ０１／７９１６６号公報、同ＷＯ０１／９００６１号公報、同ＷＯ０１／９６２９３号公報、同ＷＯ０２／１３８３２号公報等に記載の化合物が挙げられる。尚ここで、ＶＤ₃、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、ＡＬＦ等は市販されており、例えば、Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、ＣＡＬＢＩＯ社、ＦＬＵＫＡ社、ＦＯＲＭＯＳＡ社、ＷＡＫＯ社等から購入することができる。これら化合物の代表的な構造を以下に示す。
【００２７】
・コレカルシフェロール（ＶＤ₃）
【化１５】
【００２８】
・アルファカルシドール（ＡＬＦ）
【化１６】
【００２９】
・２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（ＥＤ−７１）
【化１７】
【００３０】
・国際公開ＷＯ０２／１３８３２号公報の実施例６に記載の化合物（以下、化合物Ａと称する）
【化１８】
【００３１】
上述した本発明のフェロセン化合物と結合させるＶＤ化合物（即ち、測定対象となるＶＤ化合物）のうち、特に好ましくは、分子内にエステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有しないＶＤ化合物（具体的には、前掲のＶＤ₃、カルシポトリオール、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、ＡＬＦ、ファレカルシトリオール、ＥＢ１０８９、化合物Ａ等）である。
本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物を結合させるには、本発明のフェロセン化合物のトリアゾリン骨格をＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応でＶＤ化合物のトリエン構造に選択的に反応させればよい。具体的には、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタン（好ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサン）などの適当な溶媒中で、本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物を５分間〜５時間（好ましくは１５分間〜３時間）反応させればよい。反応温度は、進行する温度であれば特に制限はないが、一般に、−７８〜１００℃で行い、好ましくは−１０〜５０℃で行う。尚、必要により反応を停止するために、水またはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール溶媒を加えてもよい。このようにして得られた本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体は、必要に応じ公知の方法に従って精製・乾燥等の操作を行い単離することができる。
このようにして得られた本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体は、前記フェロセン化合物と前記ＶＤ化合物とが共有結合している化合物である。
【００３２】
また、本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体は、好ましくは、下記式（２）
【化１９】
で表される化合物である。ここで、前記式中、「Ｑ、Ｒ、Ｒ'、ｍおよびｎ」は前掲の式（１）と同一の定義である。「Ａ₁およびＡ₃」はそれぞれ独立して、置換基を有していてもよい低級アルキレン、置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイニレンを表す。「Ａ₂」は直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、好ましくは直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−である。Ａ₁−Ａ₂−Ａ₃は、好ましくは、−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−であり、最も好ましくは−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−である。「Ｒ₁」は水素原子または−ＯＲ₉（Ｒ₉は水素原子または保護基を表す。）を表し、好ましくは水素原子または水酸基である。「Ｒ₂」は水素原子、水酸基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級アシル基を表し、好ましくは水素原子またはヒドロキシプロポキシ基である。「Ｒ₃」は水素原子または保護基を表し、好ましくは水素原子である。「Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆」はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して水素原子、水酸基ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基である。「Ｒ₇およびＲ₈」はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、或いは、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成し、好ましくは水素原子またはＲ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成する。
【００３３】
前述のＡ₁およびＡ₃における「低級アルキレン」とは、炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキレン鎖を指し、「低級アルケニレン」とは炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニレン鎖を指し、「低級アルカイニレン」とは炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルカイニレン鎖を指す。また「置換基を有していてもよい」とは、所望により１または複数（例えば１〜３個）の水酸基；ニトロ基；シアノ基；塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等のハロゲン；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；エテニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、フェノキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル等の炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基等の置換基を有していてもよいことを意味する。
【００３４】
前述のＲ₂、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆における「ハロゲン」とは、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等を指し；「低級アルキル」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基を指し；「低級アルケニル」とは、エテニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基を指し；「低級アルキニル」とは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基を指し；「低級アルコキシ基」とは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、フェノキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基を指し；「低級アシル基」とは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル等の炭素数１〜６のアシル基を指す。また、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆の「シクロアルキル基」とは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロアクチル等の炭素数３〜８のシクロアルキル基を指す。
【００３５】
また上記置換基における「置換基を有していてもよい」とは、所望により１または複数（例えば１〜３個）の水酸基；ニトロ基；シアノ基；塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等のハロゲン；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；エテニル、１−プロペニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、フェノキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル等の炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基等の置換基を有していてもよいことを意味する。また、前述のＲ₁およびＲ₃における「保護基」とは、水酸基の保護基として適切なものであれば特に限定はなく、例えば、低級アシル基、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル基、置換シリル基等が挙げられる。「低級アシル基」、「低級アルキル基」、「低級アルコキシ基」、可能な「置換基」などについては、前段において説明した通りである。
【００３６】
上述の本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物とを反応させることにより得られたフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体は、ＶＤ化合物をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ等にて測定する際の標品等として有用である。
【００３７】
尚、試料中に存在するＶＤ化合物を測定するに際しても、前述の方法に従って本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物を結合させればよい。ここで、前記試料は生体由来の試料であることが好ましい。生体由来の試料とは、体液（血液、リンパ液、髄液）や尿などを指し、好ましくは血漿、血清、尿である。さらに、生体由来とは好ましくは哺乳類由来を意味し、より好ましくはヒト、サル、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス由来である。生体由来の試料中に存在するＶＤ化合物を測定する場合、エタノール除蛋白等の公知の方法により除蛋白を行うなどの必要な前処理を行った後、前述した方法と同様にして本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を結合させ、得られた本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体を後の測定に用いればよい。
ここで、試料の前処理として、試料の除蛋白を行った後、本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を反応させる前に、試料の固相抽出を行うことが好ましい。また、本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を反応させた後、試料の固相抽出を行うことが好ましい。特に好ましくは、試料の除蛋白を行い、試料の固相抽出を行った後、本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を反応させ、その後再度試料の固相抽出を行う。試料の除蛋白を行った後、本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を反応させる前の固相抽出は、好ましくは順相系の固相抽出カートリッジを用いて行い、特に好ましくはシリカゲル系の固相抽出カートリッジを用いて行う。本発明のフェロセン化合物と試料中に存在するＶＤ化合物を反応させた後の固相抽出は、好ましくは逆相系の固相抽出カートリッジを用いて行う。
【００３８】
このようにして得られた本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体を、ＬＣ／ＭＳに供して測定する。ここで、ＬＣ／ＭＳとは、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー）による測定原理を利用または応用した測定法或いは測定機器を指し、具体的には液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）およびタンデム型の液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、並びにそれらにエレクトスプレーイオン化法（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を組み合わせた測定法或いは測定機器である。このうち、本発明の測定法を実施するにあたって、特に好ましくは液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を用いる。
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる測定は、具体的には、前述のようにして得られた本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体を含む残渣を移動相に溶解し、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入し測定する。ここで、各測定におけるＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定条件の設定等の具体的な操作については、公知の方法に従って、測定対象となる試料の量や種類、試料中に存在するＶＤ化合物の量や種類、必要とされる測定感度、誘導体化剤として用いる本発明フェロセン化合物の種類、測定に使用するＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ機器の構成等に合わせて適宜調整・設定すればよい。具体的には、本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体のＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）条件を精査して各種条件を適宜設定するとともに、効率的なイオン化が可能なＬＣ条件も設定する。生体試料中濃度測定に際しては、ブランク試料に濃度勾配をつけた既知濃度の測定対象物を添加し、内部標準物質（Ｉ．Ｓ．、好ましくは測定対象物質の安定同位元素標識体）を加え、それぞれ測定する。Ｉ．Ｓ．に対する測定対象物のピーク面積比（またはピーク高さ比）を求め、添加濃度との関係から、検量線を作成し、検量線と測定試料のピーク面積比（またはピーク高さ比）から、生体試料中濃度を算出する。これらの詳細については、最新のマススペクトロメトリー（第１版、発行：化学同人、編集：丹羽利充、１９９５年）、バイオロジカルマススペクトロメトリー（発行：東京化学同人、編集：上野民夫、平山和雄、原田健一、１９９７年）、ＬＣ／ＭＳの実際（第１版、発行：講談社サイエンティフィック、編集：原田健一、岡尚男、１９９６年）等を参照することができる。
【００３９】
このようにして行う本発明のＶＤ化合物の測定方法は、従来方法よりも高感度の測定法である。さらに本発明の測定方法は、今までの測定方法では感度が不十分であった分子内にエステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有しないＶＤ化合物（具体的には、前掲のＶＤ₃、カルシポトリオール、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、ＡＬＦ、ファレカルシトリオール、ＥＢ１０８９、化合物Ａ等）の測定においては、従来法に比べて数百倍もの高感度化を達成可能な測定方法である。従って、エステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有するＶＤ化合物（具体的には、前掲のＯＣＴ、ＥＤ−７１等）のみならず、それらヘテロ原子を有さないＶＤ化合物に至るまで、あらゆるＶＤ化合物に適用可能な高感度測定法である。
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例においては、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）はＥＸ−２７０（ＪＥＯＬ社製）を用いて測定した。また、エレクトロスプレーイオン化ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）として、高速液体クロマトグラフ Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．社製）および四重極型質量分析計 Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）を用いた。また、データ解析には、Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖｅｒ３．３（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＵＫ社製）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を使用した。
【００４１】
実施例１ 誘導体化剤の合成
〔実施例１−１〕 ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）の合成
（１）３−（フェロセニルメチル）カルバモイルカルバジン酸エチルエステルの合成
フェロセン酢酸（東京化成株式会社製）０．５ｇ（２ｍｍｏｌ）、ジフェニルホスホリルアジド０．４４ｍＬ（２ｍｍｏｌ）およびトルエン４ｍＬの混合物に氷冷下トリエチルアミン０．５７ｍＬ（４ｍｍｏｌ）を加え、室温で、３０分間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下濃縮し、４ｍＬトルエン溶液として得た。得られたトルエン溶液に２ｍＬのトルエンを加え、室温攪拌下カルバジン酸エチルエステル０．３２ｇ（３ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、３−（フェロセニルメチル）カルバモイルカルバジン酸エチルエステル０．５５ｇ（７８％）を黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．２７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．０−４．３（１３Ｈ，ｍ），５．５９（１Ｈ，ｍ），６．５９（１Ｈ，ｓ），６．６６（１Ｈ，ｓ）
【００４２】
（２）４−（フェロセニルメチル）ウラゾールの合成
上記（１）で得られた３−（フェロセニルメチル）カルバモイルカルバジン酸エチルエステル０．５５ｇ（１．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム４６０ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）およびエタノール１６ｍＬの混合物を１４時間加熱還流した。反応混合物を濾過後、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、４−（フェロセニルメチル）ウラゾール３７６ｍｇ（７８％）を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＴＨＦ−ｄ₈）δ：３．８６（２Ｈ，ｍ），３．９６（５Ｈ，ｓ），４．１０（２Ｈ，ｍ），４．１３（２Ｈ，ｓ），８．３８（２Ｈ，ｂｒｓ）
【００４３】
（３）４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンの合成
上記（２）で得られた４−（フェロセニルメチル）ウラゾール１０ｍｇ（０．０３３ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン−ｄ₈ ０．５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート１１ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で加え、２時間攪拌し、４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＴＨＦ−ｄ₈）δ：３．９８（２Ｈ，ｍ），４．０４（５Ｈ，ｓ），４．１６（２Ｈ，ｍ），４．３８（２Ｈ，ｓ）
【００４４】
〔実施例１−２〕 ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＴＡＤ）の合成
（１）３−フェロセニルカルバモイルカルバジン酸エチルエステルの合成
フェロセンカルボン酸（東京化成株式会社製）０．５ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、ジフェニルホスホリルアジド０．４７ｍＬ（２．１７ｍｍｏｌ）およびトルエン４ｍＬの混合物に氷冷下トリエチルアミン０．６ｍＬ（４．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で、３０分間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下濃縮し、４ｍＬトルエン溶液として得た。得られたトルエン溶液に２ｍＬのトルエンを加え、室温攪拌下カルバジン酸エチルエステル０．３４ｇ（３．２７ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下濃縮した。得られた残渣をヘキサン−ジクロロメタン（１：１）混合液で洗浄し、３−フェロセニルカルバモイルカルバジン酸エチルエステル０．５２ｇ（７２％）を黄色粉末として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｓ），４．２０（５Ｈ，ｓ），４．２５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．４７（２Ｈ，ｓ），６．２４（１Ｈ，ｂｒｓ），６．４０（１Ｈ，ｂｒｓ），６．５５（１Ｈ，ｂｒｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ３３２（Ｍ⁺＋１），３３１（Ｍ⁺）
【００４５】
（２）４−フェロセニルウラゾールの合成
上記（１）で得られた３−フェロセニルカルバモイルカルバジン酸エチルエステル０．５２ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム４３４ｍｇ（３．１４ｍｍｏｌ）およびエタノール１６ｍＬの混合物を１３時間加熱還流した。減圧下濃縮後、２Ｎ塩酸で酸性にした後、ジクロロメタン−メタノール（１０：１）の混合溶媒で抽出し、水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）で精製し、４−フェロセニルウラゾール３２０ｍｇ（７１％）を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＴＨＦ−ｄ₈）δ：３．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），３．９６（５Ｈ，ｓ），４．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），８．６４（２Ｈ，ｂｒｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ２８６（Ｍ⁺＋１），２８５（Ｍ⁺）
【００４６】
（３）４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンの合成
上記（２）で得られた４−フェロセニルウラゾール１０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン−ｄ₈ ０．５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート１１ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で加え、１時間攪拌し、４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＴＨＦ−ｄ₈）δ：４．０−４．１（７Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）
【００４７】
（４）４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンの合成（その２）
上記（２）で得られた４−フェロセニルウラゾール１０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン−ｄ₈ ０．５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート１１ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で加え、２時間攪拌し、４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンの１，４−ジオキサン溶液を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（１，４−ジオキサン−ｄ₈）δ：４．２−４．３（７Ｈ，ｍ），４．８７（２Ｈ，ｍ）
【００４８】
実施例２ 誘導体化剤とビタミンＤ化合物との結合体の合成
〔実施例２−１〕 アルファカルシドール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ）の合成
実施例１−１を参考にして、４−（フェロセニルメチル）ウラゾール５ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン０．２５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）を室温で加え、２時間攪拌し、４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。得られた溶液に、特開昭４８−６２７５０号公報およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７３，２３３９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３０，２７０１（１９７４）に記載の方法に従って製造したアルファカルシドール１ｍｇ（０．００２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（０．２５ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間攪拌した。得られた混合物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、標題のアルファカルシドール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ）１ｍｇ（５７％）を黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．４−０．６（３Ｈ，ｍ），３．６−３．８（１Ｈ，ｍ），４．０−４．６（１６Ｈ，ｍ），４．６−４．８（１Ｈ，ｍ），４．８−４．９（１Ｈ，ｍ）
【００４９】
〔実施例２−２〕 アルファカルシドール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＴＡＤ）の合成
実施例１−２を参考にして、４−フェロセニルウラゾール５ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン０．２５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート４．５ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）を室温で加え、１時間攪拌し、４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。得られた溶液に、特開昭４８−６２７５０号公報およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７３，２３３９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３０，２７０１（１９７４）に記載の方法に従って製造したアルファカルシドール１ｍｇ（０．００２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（０．２５ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間攪拌した。得られた混合物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、標題のアルファカルシドール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＴＡＤ）１ｍｇ（５７％）を黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．５４（３Ｈ，ｓ），０．８５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），３．７９（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ），４．０−４．４（１１Ｈ，ｍ），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ），４．９−５．１（３Ｈ，ｍ）
【００５０】
〔実施例２−３〕 コレカルシフェロール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＭＴＡＤ）の合成
実施例１−１を参考にして、４−（フェロセニルメチル）ウラゾール１０ｍｇ（０．０３３ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン−ｄ₈ ０．５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート１１ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で加え、２時間攪拌し、４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。得られた溶液にコレカルシフェロール（ＶＤ₃、Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）５ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間攪拌した。得られた混合物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、標題のコレカルシフェロール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＭＴＡＤ）８ｍｇ（９０％）を黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．４７（３Ｈ，ｓ），０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．７１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），４．０−４．５（１５Ｈ，ｍ），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），４．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）
【００５１】
〔実施例２−４〕 コレカルシフェロール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＴＡＤ）の合成
実施例１−２を参考にして、４−フェロセニルウラゾール１０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン０．５ｍＬの混合物にヨードベンゼンジアセテート１１ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で加え、１時間攪拌し、４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンのテトラヒドロフラン溶液を得た。得られた溶液にコレカルシフェロール（ＶＤ₃、Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）１０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間攪拌した。得られた混合物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、標題のコレカルシフェロール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＴＡＤ）１１ｍｇ（６３％）を黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．６０（３Ｈ，ｓ），０．８５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ），４．０−４．３（１１Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），４．９−５．０（２Ｈ，ｍ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）
【００５２】
〔比較例２−１〕 ３−（フェロセニルカルバモイルオキシ）コレカルシフェロールの合成（ＶＤ₃−フェロセンカルバメート）の合成
フェロセンカルボン酸１０ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）、ジフェニルホスホリルアジド０．０１ｍＬ（０．０４６ｍｍｏｌ）およびトルエン０．５ｍＬの混合物に氷冷下トリエチルアミン０．０１５ｍＬ（０．１０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈後、１％塩酸、飽和重曹水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、減圧下ジクロロメタンを留去し、未精製のトルエン溶液を得た。得られたトルエン溶液にコレカルシフェロール（ＶＤ₃、Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）１０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）を室温で加え、１００℃で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、３−（フェロセニルカルバモイルオキシ）コレカルシフェロール（ＶＤ₃−フェロセンカルバメート）６ｍｇを黄色油状物として得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：０．５５（３Ｈ，ｓ），０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．９９（２Ｈ，ｂｒｓ），４．１７（７Ｈ，ｂｒｓ），４．４８（２Ｈ，ｂｒｓ），４．８６（１Ｈ，ｓ），４．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），５．０８（１Ｈ，ｓ），５．７−５．９（１Ｈ，ｍ），６．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ）
【００５３】
実施例３ 誘導体化剤とビタミンＤ化合物との結合体の測定
〔実施例３−１〕 アルファカルシドール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ）およびアルファカルシドール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＴＡＤ）の測定
実施例２−１を参考に合成したアルファカルシドール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ）および実施例２−２を参考に合成したアルファカルシドール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＡＬＦ−ＦＴＡＤ）それぞれを移動相（１０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸アンモニウム／アセトニトリル（１：９、ｖ／ｖ））５０μＬに溶解し、２０μＬをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入した。ＨＰＬＣカラムにＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ、１５０×２．０ｍｍ ｉ．ｄ．：株式会社資生堂製）を用い正イオンモードでＡＬＦ−ＦＭＴＡＤおよびＡＬＦ−ＦＴＡＤのＥＳＩマススペクトルを測定したところ、それぞれｍ／ｚ ６９７、ｍ／ｚ ６８３に分子イオン〔Ｍ〕⁺をベースピークとして与えた。測定結果の一例を図１に示す。また、コーン電圧をそれぞれ７０Ｖ、６６Ｖに設定する時、強度が最大となった。
これら分子イオンをプリカーサイオンとしてプロダクトイオンスペクトルを測定したところ、フェロセン骨格を有する強いフラグメントイオンをそれぞれｍ／ｚ １９９、ｍ／ｚ ２２７に与えた。測定結果の一例を図２に示す。
そこで、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤおよびＡＬＦ−ＦＴＡＤのＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）条件を精査した結果、モニタリングチャンネルにそれぞれｍ／ｚ ６９７〔Ｍ〕⁺＞１９９〔Ｍ−Ｃ₂₉Ｈ₄₄Ｏ₄Ｎ₃〕⁺、ｍ／ｚ ６８３〔Ｍ〕⁺＞２２７〔Ｍ−Ｃ₂₈Ｈ₄₄Ｏ₃Ｎ₂〕⁺を用い、コリジョンエネルギーを４４ｅＶに設定する時、超高感度測定が可能で、いずれも２５０ｆｇ（３５９ａｍｏｌ、３６６ａｍｏｌ）／ｉｎｊ（Ｓ／Ｎ比が約６〜８）という感度を得た。一方、同様にして測定したアルファカルシドール（ＡＬＦ）の直接測定時における感度は７５ｐｇ（１８８ｆｍｏｌ）／ｉｎｊ（Ｓ／Ｎ比が約６）であり、本発明の測定法は直接測定時に比べ約３００倍高感度であった。これら測定結果の一例を図３に示す。
【００５４】
〔実施例３−２〕 コレカルシフェロール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＭＴＡＤ）およびコレカルシフェロール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＴＡＤ）の測定
実施例２−３を参考に合成したコレカルシフェロール ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＭＴＡＤ）および実施例２−４を参考に合成したコレカルシフェロール ４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＶＤ₃−ＦＴＡＤ）を用い、実施例３−１と同様に測定条件を最適化した結果、いずれも２５０ｆｇ（３６７ａｍｏｌ、３７５ａｍｏｌ）／ｉｎｊ（Ｓ／Ｎ比が約８〜１１）という感度を得た。一方、同様にして測定したコレカルシフェロール（ＶＤ₃）の直接測定時、および３−（フェロセニルカルバモイルオキシ）コレカルシフェロール（ＶＤ₃−フェロセンカルバメート）（比較例２−１参照）における感度は５０ｐｇ（１３０ｆｍｏｌ）／ｉｎｊ（Ｓ／Ｎ比が約８）、１ｐｇ（１．６４ｆｍｏｌ）／ｉｎｊ（Ｓ／Ｎ比が約５）であり、本発明の測定法は直接測定時に比べ約２００倍、フェロセンカルバメート誘導体化による測定時に比べても４倍以上高感度であった。これら測定結果の一例を図４に示す。
【００５５】
〔実施例３−３〕 ＥＤ−７１の４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＥＤ−７１−ＦＭＴＡＤ）および国際公開ＷＯ０２／１３８３２号公報の実施例６に記載の化合物（化合物Ａ）の４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（化合物Ａ−ＦＭＴＡＤ）の測定
実施例２を参考に合成したＥＤ−７１の４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（ＥＤ−７１−ＦＭＴＡＤ）および国際公開ＷＯ０２／１３８３２号公報の実施例６に記載の化合物（化合物Ａ）の４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（化合物Ａ−ＦＭＴＡＤ）を用い、実施例３−１と同様に測定条件を最適化した結果、それぞれ３００ｆｇ（３８１ａｍｏｌ）／ｉｎｊ、５００ｆｇ（６６８ａｍｏｌ）／ｉｎｊという感度を得た。一方、同様にして測定したＥＤ−７１および化合物Ａの直接測定時における感度は、それぞれ１０ｐｇ（２０ｆｍｏｌ）／ｉｎｊ、５０ｐｇ（１１１ｆｍｏｌ）／ｉｎｊであった。
上記の実施例３−１、３−２および３−３の結果のまとめを表１に示す。
【表１】
【００５６】
実施例４ 生体試料中のビタミンＤ化合物の測定
〔実施例４−１〕 ラット血漿中のアルファカルシドール（ＡＬＦ）のＦＭＴＡＤ誘導体化による測定
（１）ラットブランク血漿の調製
ＳＤ系無処置ラット（ＳＰＦグレード、Ｓｌｃ社より購入）よりヘパリンナトリウムを抗凝固剤として採血し、遠心分離して得られた数個体分の血漿を混合した血漿を使用した。プール血漿は−２０℃以下で保存した。
（２）アルファカルシドール（ＡＬＦ）の検量線下限検討（ＦＭＴＡＤ誘導体化）
ラットブランク血漿１００μＬに特開昭４８−６２７５０号公報およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７３，２３３９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３０，２７０１（１９７４）に記載の方法に従って製造したアルファカルシドール（ＡＬＦ）のエタノール溶液を添加し、０、０．０８、０．２５、０．８、２．５、８および２５ｎｇ／ｍＬの検量線作成用試料を調製した。各濃度１００μＬに、内部標準物質（Ｉ．Ｓ．）としてＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４８，２１５（２０００）に記載の方法に従って製造した４０ｎｇ／ｍＬのｄ₄−ＡＬＦ ２０μＬを加え、エタノール除蛋白、固相抽出カートリッジ（Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ＳＩ、３ｃｃ、５００ｍｇ：Ｖｒｉａｎ Ｉｎｃ．社製）による固相抽出を行った後、ＦＭＴＡＤにより誘導体化した。誘導体化後、再び固相抽出カートリッジ（Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ、１ｃｃ、３０ｍｇ：Ｗａｔｅｒｓ社製）により固相抽出を行い、窒素乾固後、残渣を移動相４０μＬに溶解し、１０μＬをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入した。試料の前処理の具体的な処理スキームを図５に示す。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は表２に示す。
【表２】
Ｓ／Ｎ比が約３〜５で検量線下限値を求めた結果、本発明の測定法における検量線下限値は０．０８ｎｇ／ｍＬであり、比較例４−１に示される直接測定時（１０ｎｇ／ｍＬ）に比べて１２５倍、比較例４−２に示されるＰＴＡＤ誘導体化による測定時（１ｎｇ／ｍＬ）に比べて１２．５倍、高感度であった。また、ラット血漿１ｍＬを用いて、上記と同様に検量線下限値を求めた結果、本発明の測定法における検量線下限値は０．０１ｎｇ／ｍＬであった。検量線下限におけるクロマトグラムの一例を図６に示す。
【００５７】
（３）特異性検討
前記（２）の前段で用いた検量線ブランク（０ｎｇ／ｍＬ）および検量線下限（０．０８ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムとを比較した。その結果、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤおよびｄ₄−ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの測定を妨害するピークは認められず、検量線ブランク試料にも、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの溶出時間に妨害ピークは認められなかった。
（４）検量線の範囲と直線性の検討
前記（２）の前段で用いた試料をそれぞれ３日間測定し、Ｉ．Ｓ．に対する測定対象物のピーク面積比を求め、添加濃度との関係から最小二乗法により検量線を作成し、（１／ｙ²重みづけ）、相関係数（ｒ）および各濃度における逆算値の真度を求めた。検量線と各試料のピーク面積比から実測値をｎｇ／ｍＬ単位で有効数字３桁で求めた。尚、ＦＭＴＡＤによる誘導体化反応において２種類の異性体（６Ｒ／６Ｓ）が生成するが、Ｓ／Ｎ比の大きいピークを選択し（保持時間（Ｒ．Ｔ．）約８．８分）、定量を行った。
検量線を３日間作成した結果を表３に、またその典型的なグラフを図７に示す。
【表３】
検量線の相関係数（ｒ）は０．０８〜２５ｎｇ／ｍＬの範囲で０．９９１２７７〜０．９９９７４１（１／ｙ²重みづけ）、各濃度の逆算値の真度は−７．６〜９．９％と、良好な直線性を示した。
【００５８】
（５）同時再現性の検討
前記（２）の前段と同様に、ラットブランク血漿（１００μＬ）にＡＬＦを添加することにより、０．０８、０．２５、２．５および２５ｎｇ／ｍＬの同時再現性用試料を調製してそれぞれ処理し測定した。各濃度ｎ＝５で３日間測定し、１日単位で変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、以下ＣＶ値）および真度を求めた。尚、ＣＶ値および真度は、次式により算出した。
ＣＶ値＝（実測値標準偏差／実測値平均値）×１００（％）
真度＝｛（実測値平均値−理論値）／理論値｝×１００（％）
結果の一例を表４に示す。
【表４】
各濃度におけるＣＶ値は１５％以下（定量下限では２０％以下）、真度は±１５％以内（定量下限では±２０％以内）で、良好な精度、真度であった。
【００５９】
（６）日差再現性の検討
前記（５）の測定結果をもとに、３日間全体のＣＶ値および真度を同様に求めた。
結果の一例を表５に示す。
【表５】
各濃度におけるＣＶ値は１５％以下（定量下限では２０％以下）、真度は±１５％以内（定量下限では±２０％以内）で、良好な精度、真度であった。
【００６０】
（７）回収率の検討
前記（５）で用いた同時再現性試料を回収率用試料として利用した。回収率算出の対照となる試料（リファレンス試料）として、ラットブランク血漿を前処理した試料に０．１４５、０．４３６、４．３６および４３．６ｎｇ／ｍＬのＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ１００μＬを２本ずつ分注した。それぞれ測定し、リファレンス試料のピーク面積の平均値を１００％とし、測定試料のピーク面積との比較によりＡＬＦの回収率を求めた。
回収率＝（回収率用試料のピーク面積／リファレンス試料のピーク面積の平均値）×１００（％）
結果の一例を表６に示す。いずれも実用に耐えうる回収率であった。
【表６】
【００６１】
（７）誘導体化率の検討
前記（５）で用いた同時再現性試料を誘導体化率用試料として利用した。誘導体化率算出の対照となる試料（リファレンス試料）として、ラットブランク血漿をエタノール除蛋白、固相抽出カートリッジ（Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ＳＩ、３ｃｃ、５００ｍｇ：Ｖａｒｉａｎ ＳＰＰ社製）による固相抽出を行った後、ＦＭＴＡＤを加えた試料にＡＬＦ−ＦＭＴＡＤを添加した試料を２本調製した。それぞれ測定し、リファレンス試料のピーク面積の平均値を１００％とし、測定試料のピーク面積との比較によりＡＬＦの誘導体化率を求めた。
誘導体化率＝（誘導体化率用試料のピーク面積／リファレンス試料のピーク面積の平均値）×１００（％）
結果の一例を表７に示す。いずれも実用に耐えうる誘導体化率であった。
【表７】
【００６２】
（８）サンプルクーラー中での安定性の検討
前記（２）の前段と同様に、ラットブランク血漿（１００μＬ）にＡＬＦを添加することにより、０．０８、０．２５、２．５および２５ｎｇ／ｍＬの安定性検討用試料を調製してそれぞれ処理し測定した。各濃度ｎ＝３で、試料調製日の実測値（Ｉｎｉｔｉａｌ値）と、サンプルクーラー中で５℃・２４時間保存後の実測値（Ｐｏｓｔ値）から、次式を用いて変動率を算出した。
変動率＝｛Ｐｏｓｔ値の平均値／Ｉｎｉｔｉａｌ値の平均値｝×１００（％）
変動率を調べた結果、いずれの濃度においても大きな変動は認められず、安定性に問題は認められなかった
【００６３】
〔実施例４−２〕 ラット血漿中のＥＤ−７１のＦＭＴＡＤ誘導体化による測定
ビタミンＤ化合物としてＥＤ−７１を用いた他は実施例４−１（２）の前段と同様にして、ラット血漿中のＥＤ−７１をＦＭＴＡＤ誘導体化によりＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。測定条件は表８に示す。
【表８】
Ｓ／Ｎ比が約３で検量線下限値を求めた結果、本発明の測定法では０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【００６４】
〔実施例４−３〕 ラット血漿中の国際公開ＷＯ０２／１３８３２号公報の実施例６に記載の化合物（化合物Ａ）のＦＭＴＡＤ誘導体化による測定
ＥＤ−７１の代わりに国際公開ＷＯ０２／１３８３２号公報の実施例６に記載の化合物（化合物Ａ）を用いた他は実施例３−２と同様にして、ラット血漿中の化合物ＡをＦＭＴＡＤ誘導体化によりＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。測定条件は表９に示す。
【表９】
Ｓ／Ｎ比が約３で検量線下限値を求めた結果、本発明の測定法では０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【００６５】
〔比較例４−１〕 誘導体化を行わないラット血漿中のアルファカルシドール（ＡＬＦ）の直接測定
実施例４−１（２）と同様に、ラットブランク血漿にアルファカルシドール（ＡＬＦ）を添加し０、１、３、１０、３０、１００、３００および１０００ｎｇ／ｍＬの検量線作成用試料を調製した。各濃度１００μＬに、内部標準物質（Ｉ．Ｓ．）として４００ｎｇ／ｍＬのｄ₄−ＡＬＦ ２０μＬを加えた後、エタノール除蛋白、固相抽出カートリッジ（Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ＳＩ、３ｃｃ、５００ｍｇ：Ｖａｒｉａｎ ＳＰＰ社製）による固相抽出を行った。窒素乾固後、残渣を移動相４０μＬに溶解し、１０μＬをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入した。測定条件は表１０に示す。
【表１０】
Ｓ／Ｎ比が約３で検量線下限値を求めた結果、直接測定における検量線下限値は１０ｎｇ／ｍＬであった。検量線下限におけるクロマトグラムの一例は、実施例４−１（２）の結果および後述の比較例４−２の結果とともに図６に示す。
【００６６】
〔比較例４−２〕 ラット血漿中のアルファカルシドール（ＡＬＦ）のＰＴＡＤ（４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）誘導体化による測定
実施例４−１（２）と同様に、ラットブランク血漿にアルファカルシドール（ＡＬＦ）を添加し０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００および３００ｎｇ／ｍＬの検量線作成用試料を調製した。各濃度１００μＬに、内部標準物質（Ｉ．Ｓ．）として４０ｎｇ／ｍＬのｄ₄−ＡＬＦ ２０μＬを加えた後、エタノール除蛋白、固相抽出カートリッジ（Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ＳＩ、３ｃｃ、５００ｍｇ：Ｖａｒｉａｎ ＳＰＰ社製）による固相抽出を行った後、論文記載の方法（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １９９３；２２：６２１−６３２、Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １９９３；６４５：１１５−１２３等）に従って４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ：ＳＩＧＭＡ社製）により誘導体化した。誘導体化後、窒素乾固し残渣を移動相４０μＬに溶解し、１０μＬをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入した。測定条件は表１１に示す。
【表１１】
Ｓ／Ｎ比が約２で検量線下限値を求めた結果、ＰＴＡＤ誘導体化による測定時における検量線下限値は１ｎｇ／ｍＬであった。検量線下限におけるクロマトグラムの一例は、実施例４−１（２）の結果および比較例４−１の結果とともに図６に示す。
【００６７】
［実施例４−４］ 生体試料中ビタミンＤ誘導体の測定の前処理法簡便化
（１）前処理条件簡便化
図５に示す試料の前処理方法を以下のごとく、簡便化した。アルファカルシドール（ＡＬＦ）を添加したラットブランク血漿（１００μＬ）に４０ｎｇ／ｍＬのｄ４−ＡＬＦ（Ｉ．Ｓ．）２０μＬを加え、アセトニトリルによる除蛋白処理後、９６ウェル固相抽出カートリッジ（Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ，１ｃｃ，１０ｍｇ：Ｗａｔｅｒｓ社製）により、固相抽出を行った。ＦＭＴＡＤによる誘導体化を行い、窒素乾固後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／アセトニトリル（２３：７７，ｖ／ｖ）１００μＬに溶解し、３０μＬをカラムスイッチングを用いるＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに注入した。試料の具体的な処理スキームを図８に示す。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は表１２に示す。
【表１２】
また、カラムスイッチングについては図９に示す。尚、ＦＭＴＡＤによる誘導体化反応において２種類の異性体（６Ｒ／６Ｓ）が生成するが、ＨＰＬＣ上、はじめに溶出する異性体のＳ／Ｎ比が高かったことから、トラッピングカラムから分析カラムには、このＳ／Ｎ比の高い異性体の溶出画分のみを通導するカラムスイッチング条件を設定した。
【００６８】
（２）検量線の範囲と直線性の検討
１００ｎｇ／ｍＬ ＡＬＦエタノール溶液をラットブランク血漿で希釈し、０，０．０５，０．１５，０．５，１．５，５および１５ｎｇ／ｍＬの検量線作成用試料を調製した。検量線作成用試料１００μＬを前記（１）に示した条件にて処理し、測定した。本試料は３日間測定した。Ｉ．Ｓ．に対する測定対象物のピーク面積比を求め、添加濃度との関係から最小二乗法により検量線を作成し（１／ｘ重みづけ）、相関係数（ｒ）および各濃度における逆算値の真度を求めた。
検量線を３日間作成した結果を表１３に、その典型的なグラフを図１０に示す。
【表１３】
検量線の相関係数（ｒ）は０．０５〜１５ｎｇ／ｍＬの範囲で０．９９６５５２〜０．９９９９５０、各濃度の逆算値の真度は−１７．６〜９．８％と良好な直線性を示した。
【００６９】
（３）同時再現性の検討
前記（２）の前段と同様に、１００ｎｇ／ｍＬ ＡＬＦエタノール溶液をラットブランク血漿で希釈し、０．０５，０．１５，１．５および１５ｎｇ／ｍＬの同時再現性用試料を調製してそれぞれ処理し測定した。各濃度ｎ＝５で３日間測定し、各測定日ごとにＣＶ値および真度を求めた。結果を表１４に示す。
【表１４】
いずれの測定日も、各濃度におけるＣＶ値は１５％以下（定量下限では２０％以下）、真度は±１５％以内（定量下限では±２０％以内）で、良好な精度、真度であった。
【００７０】
（４）日差再現性の検討
前記（３）の結果をもとに、３日間全体のＣＶ値および真度を求めた。結果を表１５に示す。
【表１５】
各濃度におけるＣＶ値は１５％以下（定量下限では２０％以下）、真度は±１５％以内（定量下限では±２０％以内）で、良好な精度、真度であった。
【００７１】
（５）回収率の検討
前記（３）で用いた同時再現性試料を回収率用試料として利用した。回収率算出の対照となる試料（リファレンス試料１）として、ラットブランク血漿を前処理した試料に前記（３）で調製した０．０５，０．１５，１．５および１５ｎｇ／ｍＬ ＡＬＦエタノール溶液各１００μＬを３本ずつ分注し、誘導体化後、測定した。リファレンス試料１のピーク面積の平均値を１００％とし、測定試料のピーク面積の比較によりＡＬＦの回収率を求めた。結果を表１６に示す。いずれも実用に耐えうる回収率であった。
【表１６】
【００７２】
（６）誘導体化率の検討
前記（５）で調製したリファレンス試料（１）を誘導体化率用試料として利用した。誘導体化率算出の対照となる試料（リファレンス試料２）として、ラットブランク血漿を前処理し、誘導体化した試料に０．０４３６，０．０８７１，１．３９および１３．９ｎｇ／ｍＬ ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤエタノール溶液各１００μＬを３本ずつ分注し、測定した。リファレンス試料２のピーク面積の平均値を１００％とし、測定試料のピーク面積の比較によりＡＬＦの抽出効率を求めた。表１６に示す。いずれも実用に耐えうる誘導体化率であった。
【００７３】
（７）特異性の検討
ラットブランク血漿、前記（２）で用いた検量線ブランク（０ｎｇ／ｍＬ）および検量線下限（０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを比較した。ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤのクロマトグラムを図１１に、ｄ４−ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤのクロマトグラムを図１２に示す。
ラットブランク血漿にＡＬＦ−ＦＭＴＡＤおよびｄ４−ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの測定を妨害するピークは認められなかった。また、検量線ブランク（０ｎｇ／ｍＬ）にＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの測定を妨害するピークは認められなかった。
【００７４】
（まとめ）
以上の実施例に示されたように、ビタミンＤ誘導体のＦＭＴＡＤを用いた誘導体化法について前処理方法を簡便化するとともに、カラムスイッチングを用いるＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を採用したことにより回収率が向上し、定量下限０．０５ｎｇ／ｍＬとさらに高感度化を達成することができた。本法は、感度、特異性、直線性および精度に優れる定量法であり、多検体の分析にも十分適用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上述べたように、本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物とを反応させ、これらを結合した化合物をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに供することにより、従来方法よりも高感度でＶＤ化合物を測定することが可能となった。さらに本発明の測定方法は、今までの測定方法では感度が不十分であった分子内にエステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有しないＶＤ化合物（具体的には、前掲のＶＤ₃、カルシポトリオール、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、ＡＬＦ、ファレカルシトリオール、ＥＢ１０８９、化合物Ａ等）の測定においては、従来法に比べて数百倍もの高感度化を達成可能な測定方法である。従って、エステル結合・エーテル結合・チオエーテル結合・アミド結合等のヘテロ原子を有するＶＤ化合物（具体的には、前掲のＯＣＴ、ＥＤ−７１等）のみならず、それらヘテロ原子を有しないＶＤ化合物に至るまで、あらゆるＶＤ化合物に適用可能な高感度測定法である。また、フェロセニルアジドを誘導体化剤として用いる場合のように、反応条件に加熱を要する必要等もなく、取り扱いの容易なＶＤ化合物の測定方法である。
また、上述のとおり、本発明のフェロセン化合物は、ＶＤ化合物をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定する際の誘導体化剤として非常に有用である。
さらに、本発明のフェロセン化合物とＶＤ化合物とを反応させることにより得られたフェロセン化合物とＶＤ化合物の結合体は、ＶＤ化合物をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定する際の標品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤおよびＡＬＦ−ＦＴＡＤのＥＳＩマススペクトルを測定した結果の一例を示す。
【図２】図２は、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの分子イオン〔Ｍ〕⁺およびＡＬＦ−ＦＴＡＤの分子イオン〔Ｍ〕⁺をプリカーサイオンとしてプロダクトイオンスペクトルを測定した結果の一例を示す。
【図３】図３は、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定条件を最適化した際の、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤ、ＡＬＦ−ＦＴＡＤおよびＡＬＦ直接測定時（対照）の測定結果の一例を示す。
【図４】図４は、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定条件を最適化した際の、ＶＤ₃−ＦＭＴＡＤ、ＶＤ₃−ＦＴＡＤ、ＶＤ₃直接測定時（対照）およびＶＤ₃−フェロセンカルバメート（対照）の測定結果の一例を示す。
【図５】図５は、ラット血漿を試料として用いた場合の、本発明測定法における前処理の具体的な処理スキームの一例を示す。
【図６】図６は、本発明測定法および従来法の検量線下限におけるクロマトグラムの一例を示す。Ａ）はラット血漿１ｍＬを用いた場合の本発明測定法の検量線下限におけるクロマトグラム、Ｂ）はラット血漿１００μＬを用いた場合の本発明測定法の検量線下限におけるクロマトグラム、Ｃ）はＰＴＡＤ誘導体化による測定時の検量線下限におけるクロマトグラム（対照）、Ｄ）は直接測定時の検量線下限におけるクロマトグラムである。
【図７】図７は、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤによる本発明測定法の検量線を示す典型的なグラフの一例を示す。
【図８】図８は、ラット血漿を試料として用いた場合の、本発明測定法における前処理の具体的な処理スキームの一例で、図５の処理法を簡便化したものである。
【図９】図９は、本発明測定法におけるカラムスイッチングの図を示す。
【図１０】図１０は、本発明測定方法において図８、図９および表１２の条件下で測定した時の、典型的な検量線のグラフの一例を示す。
【図１１】図１１は、本発明測定方法において図８、図９および表１２の条件下で測定した時の、ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの特異性のクロマトグラムを示す。Ａ）はラットブランク血漿のクロマトグラム、Ｂ）は検量線ブランク（ＡＬＦ：０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラム、Ｃ）は検量線下限（ＡＬＦ：０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、本発明測定方法において図８、図９および表１２の条件下で測定した時の、ｄ₄−ＡＬＦ−ＦＭＴＡＤの特異性のクロマトグラムを示す。Ａ）はラットブランク血漿のクロマトグラム、Ｂ）検量線下限（ＡＬＦ：０．０５ｎｇ／ｍＬ、ｄ₄−ＡＬＦ：８ｎｇ／ｍＬ相当）のクロマトグラムである。

Claims (26)

1. 下記式（１）で表されるフェロセン化合物。
   （式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し（ここで、置換基を有していてもよいとは、１〜３個の水酸基；ニトロ基；シアノ基；ハロゲン；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；炭素数１〜６のアルコキシ基；炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基を有していてもよいことを意味する。）；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
2. ＲおよびＲ'が水素原子である請求項１記載のフェロセン化合物。
3. Ｑが直接結合またはアルキレンを表す請求項１または２に記載のフェロセン化合物。
4. Ｑがメチレンである請求項１または２に記載のフェロセン化合物。
5. Ｑが直接結合である請求項１または２に記載のフェロセン化合物。
6. ４−（フェロセニルメチル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンまたは４−フェロセニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンである請求項１に記載のフェロセン化合物。
7. 請求項１に記載のフェロセン化合物を含有する、トリエン構造を有する化合物を測定する
   ための試薬。
8. さらに前記フェロセン化合物を溶解し得る溶媒を含有する請求項７に記載の試薬。
9. 下記式（２）
   （式中、Ａ₁およびＡ₃はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アルキレン、置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイニレンを表し；Ａ₂は直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または−ＯＲ₉（Ｒ₉は水素原子または保護基を表す。）を表し；Ｒ₂は水素原子、水酸基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級アシル基を表し；Ｒ₃は水素原子または保護基を表し；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し；Ｒ₇およびＲ₈はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、或いは、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成し；Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基または置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。ここで、Ａ ₁ 、Ａ ₃ 、Ｒ ₂ 、Ｒ ₄ 、Ｒ ₅ 、Ｒ ₆ 、ＲおよびＲ'における、置換基を有していてもよいとは、１〜３個の水酸基；ニトロ基；シアノ基；ハロゲン；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；炭素数１〜６のアルコキシ基；炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基を有していてもよいことを意味する。）
   で表される前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物。
10. Ａ₁−Ａ₂−Ａ₃は−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または水酸基を表し；Ｒ₂は水素原子またはヒドロキシプロポキシ基を表し；Ｒ₃は水素原子であり；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し；Ｒ₇およびＲ₈は水素原子であるか、または、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成する請求項９に記載の化合物。
11. ＲおよびＲ'が水素原子である請求項９または１０に記載の化合物。
12. Ｑが直接結合またはアルキレンを表す請求項９または１０に記載の化合物。
13. Ｑがメチレンである請求項９〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
14. Ｑが直接結合である請求項９〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
15. 前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ₃化合物である請求項９〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
16. 試料中に含まれるビタミンＤ化合物の測定方法であって、下記式（１）
    （式中、Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し（ここで、置換基を有していてもよいとは、１〜３個の水酸基；ニトロ基；シアノ基；ハロゲン；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；炭素数１〜６のアルコキシ基；炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基を有していてもよいことを意味する。）；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。）
    で表されるフェロセン化合物と、試料中のビタミンＤ化合物とを反応させ、得られたフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物を、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）により測定することを特徴とするビタミンＤ化合物の測定方法。
17. 前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、前記フェロセン化合物と前記ビタミンＤ化合物とが共有結合により結合した化合物である請求項１６に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
18. 前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物が、下記式（２）
    （式中、Ａ₁およびＡ₃はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アルキレン、置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイニレンを表し；Ａ₂は直接結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または−ＯＲ₉（Ｒ₉は水素原子または保護基を表す。）を表し；Ｒ₂は水素原子、水酸基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級アシル基を表し；Ｒ₃は水素原子または保護基を表し；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基、置換基を有していてもよいカルバモイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し；Ｒ₇およびＲ₈はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、或いは、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成し；Ｑは直接結合、アルキレンまたは−Ｗ₁−Ｘ−Ｗ₂−を表し（ここで、Ｗ₁はアルキレンまたはフェニレンを表し；Ｗ₂はアルキレンを表し；Ｘは−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ_a）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−または−Ｎ（Ｒ_a）ＯＳ（＝Ｏ）−を表し、Ｒ_aは低級アルキル基を表す。）；ＲおよびＲ'はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよい低級アシル基、置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよいカルバモイル基を表し；ｍは１〜３の整数を表し；ｎは１〜４の整数を表す。ここで、Ａ ₁ 、Ａ ₃ 、Ｒ ₂ 、Ｒ ₄ 、Ｒ ₅ 、Ｒ ₆ 、ＲおよびＲ'における、置換基を有していてもよいとは、１〜３個の水酸基；ニトロ基；シアノ基；ハロゲン；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルケニル基；炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキニル基；炭素数１〜６のアルコキシ基；炭素数１〜６のアシル基；カルボキシ基；カルバモイル基；および／またはアミノ基を有していてもよいことを意味する。）
    で表される化合物である請求項１６に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
19. 前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、Ａ₁−Ａ₂−Ａ₃は−ＣＨ（ＣＨ₃）−（ＣＨ₂）₃−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を表し；Ｒ₁は水素原子または水酸基を表し；Ｒ₂は水素原子またはヒドロキシプロポキシ基を表し；Ｒ₃は水素原子であり；Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し；Ｒ₇およびＲ₈は水素原子であるか、または、Ｒ₇およびＲ₈が一緒になって二重結合を形成する請求項１６、１７または１８に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
20. 前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、ＲおよびＲ'が水素原子である請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
21. 前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、Ｑが直接結合またはアルキレンを表す、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
22. 前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物において、Ｑがメチレンである請求項１６〜２０項のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
23. 前記のフェロセン化合物および前記のフェロセン化合物とビタミンＤ化合物とが結合した化合物においてＱが直接結合である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
24. 前記の試料中のビタミンＤ化合物がビタミンＤ₃化合物である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
25. 前記試料が生体由来の試料である請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。
26. 液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）である請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のビタミンＤ化合物の測定方法。