CN115667934A - 质谱用试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适合在质谱中使用的化合物以及使用所述化合物对分析物分子进行质谱测定的方法。
Description
技术领域
本发明涉及化合物、包含所述化合物的组合物、包含所述组合物和/或化合物的试剂盒以及适合在质谱中使用的复合物。此外,本发明涉及使用所述化合物对分析物进行质谱测定的方法。
背景技术
质谱分析(MS)是一种广泛使用的技术,用于对从小分子到大分子范围内的化学物质进行定性和定量分析。通常,它是非常灵敏且特异性的方法,甚至允许对复杂的生物样品(例如环境样品或临床样品)进行分析。但是,对于多种分析物,尤其是分析复杂生物基质诸如血清中的分析物时,测量灵敏度仍然是个问题。
MS通常与色谱技术(尤其是气相色谱和液相色谱诸如HPLC)组合使用。这里,将经过分析的目标分子(分析物)进行色谱分离,并且各自进行质谱分析(Higashi等人,(2016)J.of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 130,第181-190页)。
然而,仍需要增加MS分析方法的灵敏度,特别是用于对低丰度分析物进行分析或当仅能获取极少量材料(诸如生物活检组织)时。
在本领域中,已知多种旨在提高这些分析物的测量灵敏度的衍生化试剂(化合物)。其中,试剂包含组合在单个功能性单元中的带电单元和中性丢失单元(例如,WO 2011/091436 A1)。其他包含独立单元的试剂在结构上相对较大,这影响样品制备和MS测量的一般工作流程(Rahimoff等人,(2017)J.Am.Chem.Soc.139(30),第10359-10364页)。已知的衍生化试剂是例如丹磺酰氯、RapiFluor-MS(RFMS)、Cookson型试剂、Amplifex Diene、Amplifex Keto、Girard T、Girard P、吡啶胺(Hong和Wang,Anal Chem.,2007,79(1):322-326;Frey等人,Steroids,2016Dec,116:60-66;Francis等人,Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,2005,39(3-4),411-417;Alley William,28th InternationalCarbohydrate Symposium,New Orleans,LA,United States,July 17-21(2016),ICS-209)。所有这些均存在以下问题:由于标记效率往往不足而导致的缺点、由于偶合化学反应而导致结构异构体的生成、非优化的离子化效率、在偶合后进行色谱分离的缺点、由于碎裂途径众多而导致的非优化的碎裂行为以及需要高碰撞能量。对于极低丰度的分析物,灵敏度和选择性是不够的。
因此,本领域中迫切需要能够灵敏地检测复杂生物基质中的分析物并且表现对MS测量工作流程无不利影响的化学结构的衍生化试剂。这在随机存取的高通量MS设置中尤为重要,其中不得不在短时间内测量表现出不同化学特性的若干种不同分析物。
本发明涉及新颖的试剂(化合物),其允许对生物样品中的分析物分子(诸如类固醇、蛋白质和其他类型的分析物)进行灵敏的测定。该试剂以模块化方式设计,以允许针对某些分析物的测量中出现的具体需求或针对具体工作流程调整进行个别调整。
本发明的目的是提供式I化合物、试剂盒和组合物,它们各自包含用于通过质谱测定有效地检测分析物的所述化合物。此外,本发明的目的是提供用于分析物的质谱测定的复合物和方法。
该目的或这些目的由独立权利要求的主题来解决。从属权利要求中进行了其他实施例。
发明内容
下面,本发明涉及以下项:
在第一方面,本发明涉及一种用于分析物的质谱测定的式I化合物
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且所述偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子,优选地A3为铵,B1或B5为Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。
在第二方面,本发明涉及组合物,该组合物包含本发明的第一项的化合物。
在第三方面,本发明涉及试剂盒,该试剂盒包含本发明的第一项的化合物或本发明的第二项的组合物。
在第四方面,本发明涉及用于使用质谱测定来检测分析物的复合物,其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物,特别是其中复合物是通过分析物和本发明第二项的化合物的化学反应形成的。
在第五方面,本发明涉及本发明的第一项的化合物用于分析物的质谱测定的用途。
在第六方面,本发明涉及用于分析物的质谱测定的方法,其包括以下步骤:
(a)使分析物与如方面1至32中任一项所定义的式I化合物反应,从而形成如方面35至38中任一项所定义的复合物,
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
在第七方面,本发明涉及式V化合物:
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。优选地,A3为铵,B1或B5为偶联基团Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明,本发明的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解,在不脱离本发明的精神的情况下,可对所阐述的程序进行修改。
附图说明
图1示出了峰“分裂”示意图:其描述了色谱系统分离由分析物分子的衍生化反应得到的不同异构体的能力。
图2示出了确定增强因子的工作流程的示意图。
具体实施方式
在下文详细描述本发明之前,应当理解,本发明不限于本文所述的特定实施例和实例,因为这些实施例和实例可以变化。也应理解,本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,并不旨在限制本发明的范畴,本发明的范畴仅由所附权利要求书限制。除非另外指明,否则本文所用的所有科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本说明书文本全文引用了若干文献。本文所引用的文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)中的每一篇,无论上文或下文中引用,均通过引用而以其整体并入本文。在此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导矛盾时,以本说明书文本为准。
下面将描述本发明的元件。这些元件与具体实施例一起列出,然而,应理解,它们可以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施例。各种描述的实例和优选实施例不应解释为仅将本发明限制为明确描述的实施例。此描述应理解为支持并且涵盖将明确描述的实施例与任何数目的所公开和/或优选元件组合的实施例。此外,除非上下文另有指示,否则本申请中所有所描述元件的任何排列和组合均应视为由本申请的说明书公开。
定义
词语“包括”以及变体诸如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组,但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
如在本说明书和所附权利要求中所用,除非内容另外明确规定,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。
百分比、浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应理解,此类范围格式仅为简便起见,并因此应灵活地解释为不仅包括作为范围限值而明确引用的数值,而且包括该范围内所涵盖的所有个体数值或子范围,如同每个数值和子范围被明确引用一样。作为例示,数值范围“4%至20%”应解释为不仅包括明确引用的值4%至20%,而且包括所指示范围内的个体值和子范围。因此,此数值范围中包括个体值诸如4、5、6、7、8、9、10、...18、19、20%和子范围诸如4-10%、5-15%、10-20%等。此相同原则适用于引用最小值或最大值的范围。此外,无论所述范围或特征的广度如何,均适用此类解释。
当与数值相连使用时,术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值,该范围具有比所指示的数值小5%的下限和比所指示的数值大5%的上限。
在本发明的上下文中,术语“化合物”是指具有具体化学结构的化学物质。所述化合物可包含一个或多个反应性基团。每个反应性基团履行不同的功能性,或者两个或更多个反应性基团可履行相同功能。反应性基团包括但不限于反应性单元、带电单元和中性丢失单元。该化合物可以命名为标记物。在本发明的上下文中,术语“结合化合物”是指与分析物键合的所述化合物。原则上,化合物和结合化合物可以相同。化合物和结合化合物可以基本上相同。基本上相同可以表示两种化合物具有相同的化学结构,除了它们在反应性单元K的结构和/或偶联基团Q的结构方面彼此不同。优选地,该化合物能够与分析物形成结合,但尚未与分析物结合。结合化合物与分析物结合。
术语“CA1A2A3取代基的C原子”表示取代基A1、A2和A3连接的C原子。换言之,术语“CA1A2A3取代基”中的“C”表示A1、A2和A3连接的C原子。
术语“在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子”可以表示在A3为铵且B1为偶联基团Q的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第一C原子。偶联基团Q包含通过五个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第二C原子。或者术语“在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子”可以表示在A3为铵且B5为偶联基团Q的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第一C原子。偶联基团Q包含通过五个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第二C原子。术语“第一”或“第二”在此用于区分2个C原子。
术语“在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子”可以表示在A3为铵,然后B1或B5为偶联基团Q所必需的情况下,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第一C原子,并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。优选地,A3为铵,B1或B5为Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。
术语“在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q*的情况下,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子”可以表示在A3为铵且B1为偶联基团Q*的情况下,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第一C原子。偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第二C原子。或者术语“在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q*的情况下,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子”可以表示在A3为铵且B5为偶联基团Q*的情况下,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第一C原子。偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与另一C原子(CA1A2A3取代基的C原子)分隔的第二C原子。术语“第一”或“第二”在此用于区分2个C原子。
术语“质谱”(“Mass Spec”或“MS”)或“质谱测定”涉及通过化合物的质量用于鉴别化合物的分析技术。MS是基于离子的质荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)将化合物离子化以形成带电化合物;以及(2)检测该带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的手段来离子化并检测。“质谱仪”通常包括电离器和离子检测器。通常,将一个或多个目标分子离子化,后续将离子引入质谱仪器中,在该仪器中,由于磁场和电场的组合,离子遵循取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径。术语“离子化”或“电离”是指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子,而正电荷是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。MS方法可以生成并检测负离子的“负离子模式”来执行或以生成并检测正离子的“正离子模式”来执行。
“串联质谱”或“MS/MS”包括多个质谱分析选择步骤,其中分析物的碎裂在各级之间发生。在串联质谱仪中,离子在离子源中形成,并在一级质谱分析(MS1)中按质荷比进行分离。选择特定质荷比的离子(前体离子或母离子),并通过碰撞诱导解离、离子-分子反应或光解离产生碎片离子(或子离子)。然后,在二级质谱分析(MS2)中分离并检测所得离子。
由于质谱仪分离并检测质量略有差异的离子,它容易区分给定元素的不同同位素。因此,质谱分析是对包括但不限于低分子量分析物、肽、多肽或蛋白质的分析物进行精确质量测定和表征的重要方法。其应用包括蛋白质及其翻译后修饰的鉴别;蛋白质复合物、其亚基和功能性相互作用的阐明;以及蛋白质组学中蛋白质的全局测量。通常地,可通过质谱分析执行对肽或蛋白质的从头测序而无需事先知晓氨基酸序列。
MS中大多数样品工作流程进一步包括样品制备和/或富集步骤,其中例如使用例如气相色谱或液相色谱将目标分析物从基质中分离出来。通常地,对于质谱分析测量,执行以下三个步骤:
1.将包含目标分析物的样品离子化,一般通过与阳离子形成复合物来进行,经常通过质子化生成阳离子。离子化源包括但不限于电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)。
2.根据离子的质量和电荷对离子进行分选和分离。高场不对称波形离子迁移谱(FAIMS)可用作离子过滤器。
3.然后,例如以多反应模式(MRM)检测所分离的离子,并将结果展示在图表上。
术语“电喷雾离子化”或“ESI”是指如下方法:在该方法中,溶液沿着短毛细管行进至被施加高正电位或高负电位的末端。到达该管末端的溶液被蒸发(雾化)成在溶剂蒸汽中存在非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。此液滴雾流经蒸发室,将该蒸发室略微加热以防止冷凝并且蒸发溶剂。随着液滴变得更小,表面电荷密度增加,直到同类电荷之间的天然斥力造成离子以及中性分子得以释放。
术语“大气压化学离子化”或“APCI”是指与ESI类似的质谱方法,然而APCI通过在大气压力下于等离子体内发生的离子-分子反应来产生离子。通过喷雾毛细管与对电极之间的放电来维持等离子体。然后,通常使用一组差分泵分级分离器将离子提取至质量分析仪中。可使用干燥且预热的氮气逆流以改善溶剂的移除。对于分析极性较低的实体,APCI中的气相离子化可能比ESI更有效。
“高场不对称波形离子迁移谱(FAIMS)”是一种大气压离子迁移技术,可通过其在强电场和弱电场中的行为来分离气相离子。
“多反应模式”或“MRM”是MS仪器的一种检测模式,在该模式下,选择性地检测前体离子和一种或多种碎片离子。
质谱测定可与另外的分析方法联用,包括色谱方法诸如气相色谱(GC)、液相色谱(LC)特别是HPLC和/或基于离子迁移的分离技术。
在本公开的上下文中,术语“分析物”、“分析物分子”或“目标分析物”可互换使用,其是指待经由质谱的化学物质。适合经由质谱的化学物质,即分析物,可以是活体生物体中存在的任何种类的分子,包括但不限于核酸(例如,DNA、mRNA、miRNA、rRNA等)、氨基酸、肽、蛋白质(例如,细胞表面受体、胞质蛋白等)、代谢物或激素(例如,睾酮、雌激素、雌二醇等)、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物(例如,维生素D)、以另一分子的某一修饰(例如,蛋白质上的糖部分或磷酰残基、基因组DNA上的甲基-残基)为特征的分子或已经由生物体内化的物质(例如,治疗性药物、滥用的药物、毒素等)或此类物质的代谢物。此类分析物可用作生物标志物。在本发明的上下文中,术语“生物标志物”是指生物系统内的物质,其用作所述系统的生物学状态的指标。在本发明的上下文中,术语“结合分析物”是指与化合物键合以形成复合物的所述分析物。原则上,分析物和结合分析物可以相同。分析物和结合分析物可以基本上相同。基本上相同可以表示两种分析物具有相同的化学结构,除了它们在官能团的结构方面彼此不同。优选地,分析物能够与化合物形成结合,但尚未与化合物结合。结合分析物与化合物结合。
术语“带永久正电荷”在本公开的上下文中使用,即吡啶鎓或铵或鏻单元的正电荷不容易可逆,例如经由冲洗、稀释、过滤等。永久正电荷可以是例如共价键合的结果。永久正电荷与可能是例如静电相互作用的结果的可逆正电荷(非永久正电荷)相反。
术语“检测限”或“LOD”是生物分析过程可将分析物与背景噪声轻易区分时的分析物最低浓度。
分析物可以存在于目标样品(例如生物样品和临床样品)中。术语“样品”或“目标样品”在本文中互换使用,其是指组织、器官或个体的一部分或切片,通常小于此类组织、器官或个体,旨在代表整个组织、器官或个体。在分析时,样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的实例包括但不限于:液体样品,诸如血液、血清、血浆、滑液、脊髓液、尿液、唾液和淋巴液;或固体样品,诸如干血斑和组织提取物。样品的其他实例是细胞培养物或组织培养物。
在本公开的上下文中,样品可以衍生自“个体”或“受试者”。通常地,受试者是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物,诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
在经由质谱分析之前,可以以样品和/或分析物特异性的方式预处理样品。在本公开的上下文中,术语“预处理”是指允许经由质谱对所期望的分析物进行后续分析所需的任何措施。预处理措施通常包括但不限于,洗脱固体样品(例如,洗脱干血斑)、将溶血试剂(HR)添加到全血液样品中、以及将酶试剂添加到尿液样品中。而且,添加内标(ISTD)也视为样品的预处理。
术语“溶血试剂”(HR)是指裂解样品中存在的细胞的试剂,在本发明的上下文中,溶血试剂特别是指裂解血液样品中存在的细胞(包括但不限于,全血液样品中存在的红细胞)的试剂。众所周知的溶血试剂是水(H2O)。溶血试剂的其他实例包括但不限于去离子水、高渗透性液体(例如,8M尿素)、离子液体和不同的清洗剂。
通常地,“内标”(ISTD)是已知量的物质,当经历质谱检测工作流程(即,包括任何预处理、富集和实际检测步骤)时,其表现出与目标分析物类似的特性。尽管ISTD表现出与目标分析物类似的特性,它仍可明显地与目标分析物区分开来。举例而言,在色谱分离诸如气相色谱和液相色谱过程中,ISTD具有大致与来自样品中的目标分析物相同的保留时间。因此,分析物和ISTD两者均同时进入质谱仪中。然而,ISTD表现出与来自样品的目标分析物不同的分子质量。这使得在来自ISTD的离子与来自分析物的离子之间能够通过其不同的质荷(m/z)比进行质谱区分。两者均经历碎裂并提供子离子。这些子离子可通过其m/z比而彼此区分并与各自的母离子区分。因此,可对来自ISTD和分析物的信号执行独立测定和定量。由于ISTD的添加的量是已知的,因此来自样品的分析物的信号强度可归因于该分析物的具体定量性的量。因此,ISTD的添加允许对所检测的分析物的量进行相对比较,并且在样品中存在的目标分析物到达质谱仪时,能够对该分析物进行无歧义的鉴别和定量。通常但不一定,ISTD是目标分析物的同位素标记的变体(包含例如2H、13C或15N等标记)。
除了预处理之外,也可对样品进行一个或多个富集步骤。在本公开的上下文中,术语“第一富集过程”或“第一富集工作流程”是指在样品的预处理之后发生的富集过程,并且提供包含相对于初始样品富集的分析物的样品。第一富集工作流程可包括化学沉淀(例如,使用乙腈)或使用固相。合适的固相包括但不限于固相萃取(SPE)盒和珠。珠可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。珠可以经差异性涂覆以具有对于目标分析物的特异性。依据预期的用途,即依据预期的捕获分子,涂层可以不同。哪种涂层适用于哪种分析物是技术人员众所周知的。珠可以由各种不同材料制成。珠可具有各种尺寸并且包含具有或不具有孔的表面。
在本公开的上下文中,术语“第二富集过程”或“第二富集工作流程”是指在样品的预处理和第一富集过程之后发生的富集过程,并且提供包含相对于初始样品和第一富集过程之后的样品富集的分析物的样品。
术语“色谱”是指一种过程,在该过程中,随着由液体或气体携带的化学混合物在液体或固体固定相周围或上方流动,作为化学实体的差异性分布的结果,该化学混合物被分离为多种组分。
术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时,选择性阻滞流体溶液中的一种或多种组分的过程。随着此流体相对于固定相移动,混合物组分在一种或多种固定相与体相流体(即,流动相)之间的分布导致该滞后。固定相的极性高于流动相(例如,甲苯作为流动相,二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(NPLC),而固定相的极性小于流动相(例如,水-甲醇混合物作为流动相,而C18(十八烷基硅烷基)作为固定相)的方法称为反相液相色谱(RPLC)。
“高效液相色谱”或“HPLC”是指一种液相色谱方法,在该方法中,通过迫使流动相在压力下经过固定相,通常为密集填充柱,从而增加分离程度。通常地,使用由不规则形状或球形的颗粒、多孔整体层或多孔膜构成的固定相来填充柱。基于流动相和固定相的极性,HPLC历来分为两个不同的子类。固定相的极性高于流动相(例如,甲苯作为流动相,二氧化硅作为固定相)的方法称为正相液相色谱(NPLC),反之(例如,水-甲醇混合物作为流动相,而C18(十八烷基硅烷基)作为固定相)则称为反相液相色谱(RPLC)。微流LC是指使用具有窄的内柱直径(通常低于1mn,例如约0.5mm)的柱的HPLC方法。“超高效液相色谱”或“UHPLC”是指使用120MPa(17,405lbf/in2)或约1200大气压的HPLC方法。快速LC是指使用具有如上所述的内径且长度短(<2cm,例如1cm)的柱的LC方法,其采用如上所述的流速并使用如上所述的压力(微流LC、UHPLC)。短快速LC方案包括使用单个分析柱的捕捉/洗涤/洗脱步骤,并在<1min的极短时间内实现LC。
其他众所周知的LC模式包括亲水作用色谱(HILIC)、体积排阻LC、离子交换LC和亲和LC。
LC分离可以是单通道LC或包含平行排列的多个LC通道的多通道LC。在LC中,可根据分析物的极性或log P值、尺寸或亲和力来分离该分析物,如技术人员通常所知。
术语“碎裂”是指单个分子解离成两个或更多个独立分子。如本文所用,术语碎裂是指特异性碎裂事件,其中母分子中发生碎裂事件的断裂点得到良好限定,并且其中由碎裂事件导致的两个或更多个子分子得到良好表征。如何确定母分子的断裂点以及两个或多个所得子分子是技术人员众所周知的。所得子分子可以是稳定的,或者可以在后续碎裂事件中解离。例如,正在碎裂的母分子包括一个N-苄基吡啶嗡单元时,技术人员能够根据该分子的整个结构确定该吡啶嗡单元是碎裂释放苄基实体,还是从所述母分子中完全释放出来,即,确定由此产生的子分子是苄基分子或缺少苄基的母分子。碎裂可经由碰撞诱导解离(CID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)、负电子转移解离(NETD)、电子分离解离(EDD)、光解离(特别是红外多光子解离(IRMPD)和黑体红外辐射解离(BIRD))、表面诱导解离(SID)、高能C形阱解离(HCD)、电荷远程碎裂发生。
术语“反应性单元”是指能够与另一分子反应的单元,即该单元能够与另一分子(诸如目标分析物)形成共价键。通常地,此类共价键与其他分子中存在的化学基团而形成。据此,在进行化学反应时,化合物的反应性单元与分析物分子中存在的合适化学基团形成共价键。由于分析物分子中存在的此化学基团履行与化合物的反应性单元反应的功能,分析物分子中存在的化学基团也称为分析物的“官能团”。在每种情况下,共价键的形成均发生在化学反应中,其中新共价键在反应性基团的原子与分析物的官能团的原子之间形成。本领域的技术人员众所周知,在反应性基团与分析物的官能团之间形成共价键时,原子在此化学反应过程中丢失。
在本公开的上下文中,术语“复合物”是指通过化合物与分析物分子的反应产生的产物。此反应导致在化合物与分析物之间形成共价键。据此,术语复合物是指通过化合物与分析物分子的反应形成的共价结合反应产物。
“试剂盒”是包含至少一种本发明试剂的任何制品(例如,包装或容器),该试剂例如用于治疗病症的药品,或用于特异性地检测生物标志物基因或蛋白质的探针。试剂盒优选地作为用于执行本发明方法的单元来推销、分发或贩售。通常,试剂盒可进一步包括被分隔开的载体装置以在紧密的限定空间中接纳一个或多个容器装置,诸如小瓶、管等。特别地,每个容器意味着包含将在第一方面的方法中使用的单独元件之一。试剂盒可进一步包含一种或多种其他试剂,包括但不限于反应催化剂。试剂盒可进一步包含一个或多个包含其他材料的其他容器,该其他材料包括但不限于缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。标签可存在于容器上以指示将组合物用于具体应用,并且也可指示体内或体外使用的指南。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如,光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上。此外,试剂盒可包含如本文别处所述的用于校准目的生物标志物的标准量。
实施方案
在第一方面,本发明涉及化合物或至少一种式I化合物:
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CAlA2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。优选地,A3为铵,B1或B5为Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。
根据本发明的化合物包含在低碰撞能量(例如在10eV至50eV(含边界值)的范围内)下表现出质量碎裂事件的部分。这些化合物具有整体结构紧凑的特点。这可以允许对标记试剂进行简单的模块化设计,以通过修饰含电荷部分(例如,吡啶鎓、季铵、咪唑鎓、三苯基鏻、稳定的金属络合物、磺酸、硼酸根、芳基三氟硼酸根、硫酸根、磷酸根...)来解决多种问题,但是永久电荷为优选的。这可以允许微调试剂的疏水性,以改善纯化过程中样品基质的分离。此外,质量碎裂可以在低能级下发生,有利于主要的碎裂途径。这可以导致在MS/MS模式下的灵敏度的提高。不管上述情况如何,都可以在更高的能量下进行额外的MS实验,以获得额外的碎裂途径。
在本发明的第一方面的实施例中,卤素选自由以下项组成的组:F、Cl、Br和I。
在本发明的第一方面的实施例中,烷基选自由以下项组成的组:甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和环己基。烷基可以包含经修饰的烷基。经修饰的烷基包含结构单元烷基-O-烷基,例如-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH2-CH3。
在本发明的第一方面的实施例中,N-酰基氨基选自由以下项组成的组:甲酰基氨基、乙酰基氨基、丙酰基氨基和苯甲酰基氨基。
在本发明的第一方面的实施例中,N,N-二烷基氨基选自由以下项组成的组:N,N-二甲基氨基、N,N-乙基甲基氨基、N,N-二乙基氨基、N,N-甲基丙基氨基、N,N-乙基丙基氨基、N,N-二丙基氨基、N,N-丁基甲基氨基、N,N-丁基乙基氨基、N,N-丁基丙基氨基、N,N-二丁基氨基、N-氮杂环丁烷基、N-吡咯烷基、N-哌啶基和N-哌嗪基。
在本发明的第一方面的实施例中,烷氧基选自由以下项组成的组:甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、苯氧基和苄氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,硫代烷氧基选自由以下项组成的组:硫代甲基、硫代乙基、硫代丙基、硫代丁基、硫代戊基和硫代己基。
在本发明的第一方面的实施例中,烷氧基羰基选自由以下项组成的组:甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、苯氧基羰基和苄氧基羰基。
在本发明的第一方面的实施例中,烷氧基硫代羰基选自由以下项组成的组:甲氧基硫代羰基、乙氧基硫代羰基、丙氧基硫代羰基、丁氧基硫代羰基、苯氧基硫代羰基和苄氧基硫代羰基。
在本发明的第一方面的实施例中,酰基选自由以下项组成的组:甲酰基、乙酰基和丙酰基。
在本发明的第一方面的实施例中,硫代酰基选自由以下项组成的组:硫甲酰基、硫丙酰基和硫苯甲酰基。
在本发明的第一方面的实施例中,芳酰基选自由以下项组成的组:苯甲酰基、萘甲酰基和蒽醌。
在本发明的第一方面的实施例中,酰氧基选自由以下项组成的组:甲酰氧基、乙酰氧基和丙酰氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,芳酰基氧基选自由以下项组成的组:苯甲酰氧基、萘甲酰氧基和蒽酰氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,环烷基选自由以下项组成的组:环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
在本发明的第一方面的实施例中,芳基选自由以下项组成的组:苯基、苄基、萘基、蒽基和菲基。
在本发明的第一方面的实施例中,杂芳基选自咪唑、吡唑、三唑、四唑、恶唑、异恶唑、噻吩、呋喃、噻唑、吡啶、嘧啶、苯并三唑、苯并呋喃和苯并咪唑。
在本发明的第一方面的实施例中,杂环烷基选自N-氮杂环丁烷基、N-吡咯烷基、N-哌啶基和N-哌嗪基。
在本发明的第一方面的实施例中,经取代的芳香族选自由以下项组成的组:甲氧基苯基、氰基苯基和乙基萘。
在本发明的第一方面的实施例中,铵或其衍生物为-NR1R2R3,其中R1、R2、R3可以独立地为烷基或芳基。烷基可选自由以下项组成的组:甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和环己基。烷基可以包含经修饰的烷基。经修饰的烷基包含结构单元烷基-O-烷基,例如-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH2-CH3。芳基是苯基或经修饰的苯基,尤其是经甲氧基取代的苯基。
在本发明的第一方面的实施例中,吡啶鎓或其衍生物选自由以下项组成的组:溴吡啶、氯吡啶和甲基吡啶。
在本发明的第一方面的实施例中,鏻或其衍生物为-PR1R2R3,其中R1、R2、R3可以独立地为烷基或芳基。烷基可选自由以下项组成的组:甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和环己基。烷基可以包含经修饰的烷基。经修饰的烷基包含结构单元烷基-O-烷基,例如-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH2-CH3。芳基是苯基或经修饰的苯基,尤其是经甲氧基取代的苯基。
在本发明的第一方面的实施例中,式I化合物包含以下结构:在A3为铵且B1或B5为偶联基团Q的情况下,其中偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子和通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子:
其中R1、R2、R3独立地选自烷基或芳基。烷基可选自由以下项组成的组:甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和环己基。烷基可以包含经修饰的烷基。经修饰的烷基包含结构单元烷基-O-烷基,例如-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH2-CH3。芳基是苯基或经修饰的苯基,尤其是经甲氧基取代的苯基。R4为(CH2)n-K,n=0、1或2,其中K选自由以下项组成的组:酰肼、肼、羟胺、Br、F-芳香族、4-取代的1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、活性酯、磺酰氯和反应性羰基。B1、B2、B3、B4具有与如上文或下文所述和/或如权利要求1所述相同的含义。
在本发明的第一方面的实施例中,式I化合物包含偶联基团Q。式I的取代基B1、B2、B3、B4或B5中的至少一者为偶联基团Q。优选地,B2或B3或B4为Q。
在本发明的第一方面的实施例中,A3为铵,B1或B5为Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。术语“Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子”在本公开的上下文中此处是指Q不包含O或N或S或Br或其组合。特别是,Q不含O、N、S和Br。特别是,A3为铵且B1为Q时,Q不含O、N、S和Br。或者,A3为铵且B5为Q时,Q不含O、N、S和Br。
其中K为能够与所述分析物形成共价键的反应性单元,
其中n为0、1、2、3、4或5,并且
其中X为式I的苯基基团的碳原子。
在本发明的第一方面的实施例中,Q在低于引发质量碎裂的能级处没有显示任何碎裂。
在本发明的第一方面的实施例中,Q经由共价键合与X键合。
在本发明的第一方面的实施例中,Q选自由以下项组成的组:甲基酰肼、甲基肼、甲基羟胺、氧胺、4-甲基-氧基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(CH2-O-TAD)、2,4-二硝基-5-氟苯胺衍生物、氯磺酰基和甲磺酰氯。
在本发明的第一方面的实施例中,式I的苯基基团的碳原子X为B1、B2、B3、B4或B5的结合配偶体。
在本发明的第一方面的实施例中,所述化合物选自以下组:I-1、I-2、I-3、I-4和I-5:
其中A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4、B5、Q和X具有如上所述的含义。优选地,该化合物包含式I-2、I-3或I-4。
在本发明的第一方面的实施例中,根据本发明的式I化合物包含能够与分析物或分析物分子反应的反应性单元K。反应性单元K能够与分析物分子反应,使得在式I化合物与分析物分子之间形成共价键。优选地,共价键为单键或双键。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K与式I化合物形成共价键。特别地,在式I化合物的反应性单元K与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。
在本发明的第一方面的实施例中,K能够与所述分析物的羰基基团、酚基团、胺、羟基基团或二烯基团反应。
在本发明的第一方面的实施例中,K选自由以下项组成的组:酰肼、肼、羟胺、Br、F-芳香族、4-取代的1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、活性酯、磺酰氯和反应性羰基。
在本发明的第一方面的实施例中,K直接键合至X(n=0)。
在本发明的第一方面的实施例中,K经由亚甲基基团键合至X(n=1)。
在本发明的第一方面的实施例中,K经由亚乙基基团键合至X(n=2)。
在本发明的第一方面的实施例中,K经由丙二醇基团键合至X(n=3)。
在本发明的第一方面的实施例中,K经由丁二醇基团键合至X(n=4)。
在本发明的第一方面的实施例中,K经由亚戊基基团键合至X(n=5)。
依据待测定的分析物分子中存在的官能团,技术人员将选择适宜的用于式I化合物的反应性单元K。决定哪种反应性单元K将符合与目标分析物的官能团结合是公知常识。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含选自由以下项组成的组中的官能团:羰基基团、二烯基团、羟基基团、胺基团、亚胺基团、酮基基团、醛基基团、硫醇基团、二醇基团、酚基团、环氧化物基团、二硫化物基团、核碱基、甲酸基团、末端半胱氨酸基团、末端丝氨酸基团和叠氮化物基团,这些基团中的每个能够与式I化合物的反应性单元K形成共价键。此外,在本发明的范畴内也预期,分析物分子上存在的官能团将会首先转化为更容易与式I化合物的反应性单元K反应的另一基团。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子选自由以下项组成的组:类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其他生物分子(包括小分子代谢物和辅因子)以及治疗性药物、滥用的药物、毒素或其代谢物。
在本发明第一方面的实施例中,分析物分子包含羰基基团作为官能团,该羰基基团选自由以下项组成的组:羧酸基团、醛基团、酮基团、掩蔽的醛、掩蔽的酮基团、酯基团、酰胺基团和酐基团。醛糖(醛和酮)以缩醛和半缩醛的形式存在,是母体醛/酮的一种掩蔽形式。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团是酰胺基团,技术人员清楚地知道,这样的酰胺基团是稳定的基团,但可将其水解以将酰胺基团转化为甲酸基团和氨基基团。酰胺基团的水解可经由酸/碱催化的反应或酶促过程实现,以上两者中的任何一种均是技术人员众所周知的。在本发明的第一方面的实施例中,其中羰基基团是掩蔽的醛基团或掩蔽的酮基团,各自的基团是半缩醛基团或缩醛基团,特别是环状半缩醛基团或缩醛基团。在本发明的第一方面的实施例中,在与式I化合物反应之前,缩醛基团转化为醛或酮基团。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团是酮基团。在本发明的第一方面的实施例中,可在与式I化合物的反应性单元反应之前,将酮基团转移至中间体亚胺基团中。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个酮基团的分析物分子是酮类固醇。在本发明的第一方面的特定实施例中,酮类固醇选自由以下项组成的组:睾酮、表睾酮、二氢睾酮(DHT)、去氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、醛固酮、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲基醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮(DHEA)、17-羟基孕烯醇酮、17-羟基孕酮、雄酮、表雄酮、Δ4雄烯二酮、11-去氧皮质醇皮质甾酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、别孕烯醇酮和醛固酮。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团为羧基基团。在本发明的第一方面的实施例中,羧基基团直接与式I的化合物反应,或在与式I的化合物反应之前转化为活化的酯基。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个羧基基团的分析物分子选自由以下项组成的组:Δ8-四氢大麻酚酸、苯甲酰芽子碱、水杨酸、2-羟基苯甲酸、加巴喷丁、普瑞巴林、丙戊酸、万古霉素、甲氨蝶呤、霉酚酸、孟鲁司特、瑞格列奈、呋喃苯胺酸、替米沙坦、吉非罗齐、双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、佐美酸、伊索克酸和青霉素。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个羧基基团的分析物分子为选自由以下项组成的组的氨基酸:精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团为醛基。在本发明的第一方面的实施例中,可在与式I化合物的反应性单元反应之前,将醛基团转移至中间体亚胺基团中。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个醛基团的分析物分子选自由以下项组成的组:吡哆醛、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、阿卡他定、链霉素、交沙霉素。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团为羰基酯基团。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个酯基团的分析物分子选自由以下项组成的组:可卡因、海洛因、利他林、醋氯芬酸、乙酰胆碱、安西奈德、阿米洛酯、阿米洛卡因、氨苄哌替啶、阿雷地平、青蒿琥酯和哌替啶。
在本发明的第一方面的实施例中,羰基基团为酸酐基。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个酐基团的分析物分子选自由以下项组成的组:斑蝥素、琥珀酸酐、偏苯三酸酐和马来酸酐。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含一个或多个二烯基团,特别是共轭的二烯基团,作为官能团。在本发明第一方面的实施例中,包含一个或多个二烯基团的分析物分子是开环甾类化合物。在实施例中,开环甾类化合物选自由以下项组成的组:胆钙化醇(维生素D3)、麦角钙化醇(维生素D2)、骨化二醇、骨化三醇、速固醇、光甾醇和他卡西醇。特别地,开环甾类化合物是维生素D,特别是维生素D2或D3或其衍生物。在特定的实施例中,该开环甾类化合物选自由以下项组成的组:维生素D2、维生素D3、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3(骨化二醇)、3-epi-25-羟基维生素D2、3-epi-25-羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3(骨化三醇)、24,25-二羟基维生素D2、24,25-二羟基维生素D3。在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含一个或多个二烯基团,其选自由以下项组成的组:维生素A、维A酸、异维A酸、阿利维A酸、游霉素、西罗莫司、两性霉素B、制霉菌素、依维莫司、坦西罗莫司和非达霉素。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含作为官能团的一个或多个羟基基团。在本发明第一方面的实施例中,分析物分子包含单个羟基基团或两个羟基基团。在其中存在多于一个羟基基团的实施例中,两个羟基基团可以定位成彼此相邻(1,2二醇)或通过1、2或3个C原子分离(分别为1,3-二醇、1,4-二醇、1,5-二醇)。特别地,在第一方面的实施例中,分析物分子包含1,2-二醇基团。在其中仅存在一个羟基基团的实施例中,所述分析物选自由以下项组成的组:伯醇、仲醇和叔醇。在本发明的第一方面的实施例中,其中分析物分子包含一个或多个羟基基团,分析物选自由以下项组成的组:苄醇、薄荷醇、L-肉毒碱、吡哆醇、甲硝哒唑、单硝酸异山梨酯、愈创甘油醚、克拉维酸、米吉妥(Migitol)、扎西他滨、异丙肾上腺素、阿昔洛韦、美索巴莫、曲马多、文拉法辛、阿托品、氯苯达诺、α-羟基阿普唑仑、α-羟基三唑仑、劳拉西泮、去甲羟基安定、替马西泮、乙基葡糖苷酸、乙基吗啡、吗啡、吗啡-3-葡糖苷酸、丁丙诺啡、可待因、二氢可待因、对-羟基丙氧芬、O-去甲基曲马多、去甲基曲马多、双氢奎尼丁和奎尼丁。在本发明的第一方面的实施例中,其中分析物分子包含多于一个羟基基团,分析物选自由以下项组成的组:维生素C、葡萄糖胺、甘露醇、四氢生物蝶呤、阿糖胞苷、阿扎胞苷、利巴韦林、氟尿苷、吉西他滨、链脲佐菌素、腺苷、阿糖腺苷、克拉屈滨、雌三醇、三氟尿苷、氯法拉滨、纳多洛尔、扎那米韦、乳果糖、单磷酸腺苷、碘苷、瑞加德松(regadenoson)、林可霉素、克林霉素、卡格列净(Canaglifozin)、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、替格瑞洛、表柔比星、多柔比星、阿贝卡星、链霉素、哇巴因、阿米卡星、新霉素、弗氏菌丝素(framycetin)、巴龙霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、长春地辛、洋地黄毒苷、地高辛、甲泛葡胺、乙酰洋地黄毒苷、去乙酰毛花苷、氟达拉滨、氯法拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、阿糖腺苷和普卡霉素。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含一个或多个硫醇基团(包括但不限于烷基硫醇和芳基硫醇基团)作为官能团。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个硫醇基团的分析物分子选自由以下项组成的组:硫代扁桃酸、DL-甲巯丙脯酸、DL-塞奥芬、N-乙酰基半胱氨酸、D-青霉胺、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、佐芬普利拉(zofenoprilat)、硫普罗宁、二巯基丙醇和琥巯酸。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含作为官能团的一个或多个二硫化物基团。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个二硫化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组:谷胱甘肽二硫化物、双硫氧吡啶、二硫化硒、双硫仑、硫辛酸、L-胱氨酸、呋喃硫胺、奥曲肽、去氨加压素、伐普肽、特利加压素、利那洛肽、培奈萨肽(peginesatide)。硫化硒可以是二硫化硒SeS2或六硫化硒Se2S6。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含作为官能团的一个或多个环氧化物基团。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个环氧化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组:卡巴西平-10,11环氧化物、卡非佐米、呋喃苯胺酸环氧化物、磷霉素、盐酸司维拉姆、浅蓝菌素、东茛菪碱、噻托溴铵(tiotropium)、噻托溴铵(tiotropiumbromide)、甲溴东茛菪碱、依普利酮、莫匹罗星、纳他霉素和醋竹桃霉素。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含作为官能团的一个或多个酚基。在本发明第一方面的实施例中,包含一个或多个酚基团的分析物分子是类固醇或类固醇样化合物。在本发明第一方面的实施例中,包含一个或多个酚基团的分析物分子是具有sp2杂化的A环以及位于A环3位置的OH基团的类固醇或类固醇样化合物。在本发明的第一方面的特定实施例中,类固醇或类固醇样分析物分子选自由以下项组成的组:雌激素、雌激素样化合物、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17a-雌二醇、17b-雌二醇、雌三醇(E3)、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16,17-表雌三醇和/或其代谢物。在实施例中,代谢物选自由以下项组成的组:雌三醇、16-表雌三醇(16-epiE3)、17-表雌三醇(17-epiE3)、16,17-表雌三醇(16,17-epiE3)、16-酮雌二醇(16-ketoE2)、16a-羟基雌酮(16a-OHEl)、2-甲氧基雌酮(2-MeOEl)、4-甲氧基雌酮(4-MeOEl)、2-羟基雌酮-3-甲基醚(3-MeOEl)、2-甲氧基雌二醇(2-MeOE2)、4-甲氧基雌二醇(4-MeOE2)、2-羟基雌酮(2-OHE1)、4-羟基雌酮(4-OHE1)、2-羟基雌二醇(2-OHE2)、雌酮(El)、硫酸雌酮(Els)、17a-雌二醇(E2a)、17b-雌二醇(E2B)、硫酸雌二醇(E2S)、马烯雌酮(EQ)、17a-二氢马烯雌酮(EQa)、17b-二氢马烯雌酮(EQb)、马萘雌酮(Equilenin)(EN)、17-二氢马萘雌酮(ENa)、17α-二氢马萘雌酮、17β-二氢马萘雌酮(ENb)、Δ8,9-脱氢雌酮(dEl)、Δ8,9-硫酸脱氢雌酮(dEls)、Δ9-四氢大麻酚、霉酚酸。β或b可互换使用。α和a可互换使用。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含作为官能团的胺基。在本发明的第一方面的实施例中,胺基团为烷基胺基或芳基胺基。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个胺基团的分析物选自由以下项组成的组:蛋白质和肽。在本发明的第一方面的实施例中,包含胺基团的分析物分子选自由以下项组成的组:3,4-亚甲二氧安非他明、3,4-亚甲二氧-N-乙基安非他明、3,4-亚甲二氧甲基安非他明、安非他明、甲基安非他明、N-甲基-1,3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、7-氨基氯硝西泮、7-氨基氟硝西泮、3,4-二甲基甲卡西酮、3-氟甲卡西酮、4-甲氧基甲卡西酮、4-甲基乙卡西酮、4-甲基甲卡西酮、安非拉酮、2-甲基氨基-1-(3,4-亚甲二氧基苯基)丁-1-酮(butylone)、乙卡西酮(ethcathinone)、麻黄酮(elephedrone)、甲卡西酮、亚甲基二氧基甲卡西酮(methylone)、亚甲二氧吡咯戊酮、苯甲酰爱康宁、去氢去甲氯胺酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、美沙酮、去甲美沙酮、6-乙酰基吗啡、二乙酰基吗啡、吗啡、去甲氢可酮(norhydrocodone)、氧可酮、羟吗啡酮、苯环己哌啶、去甲丙氧芬、阿米替林、氯米帕明、度琉平、多虑平、丙咪嗪、去甲替林、三甲丙咪嗪、芬太尼、甘氨酰二甲基苯胺(glycylxylidide)、利多卡因、单乙基甘氨酰二甲基苯胺、N-乙酰基普鲁卡因酰胺、普鲁卡因酰胺、普瑞巴林、2-甲基氨基-1-(3,4-亚甲二氧苯基)丁烷、N-甲基-1,3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、2-氨基-1-(3,4-亚甲二氧苯基)丁烷、1,3-苯并二氧杂环戊烯基仲丁胺、去甲哌替啶、O-去甲基曲马多、去甲基曲马多、曲马多、拉莫三嗪、茶碱、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素、甲氨蝶呤、加巴喷丁、西索米星和5-甲基胞嘧啶。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子为碳水化合物或具有碳水化合物部分的物质(例如糖蛋白或核苷)。在本发明第一方面的实施例中,分析物分子是单糖,特别是选自由以下项组成的组:核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、神经氨酸、N-乙酰基神经氨酸等。在实施例中,分析物分子是寡糖,特别是选自由以下项组成的组:二糖、三糖、四糖、多糖。在本发明第一方面的实施例中,二糖选自由以下项组成的组:蔗糖、麦芽糖和乳糖。在本发明第一方面的实施例中,分析物分子是包含上述单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖部分的物质。
在本发明第一方面的实施例中,分析物分子包含叠氮化物基团作为官能团,其选自由以下项组成的组:烷基叠氮化物或芳基叠氮化物。在本发明的第一方面的实施例中,包含一个或多个叠氮化物基团的分析物分子选自由以下项组成的组:齐多夫定和叠氮西林。
此类分析物分子可存在于生物样品或临床样品诸如体液(例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液等)、组织或细胞提取物等中。在本发明第一方面的实施例中,分析物分子存在于选自由以下项组成的组的生物样品或临床样品中:血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液和干血斑。在本发明第一方面的一些实施例中,分析物分子可存在于样品中,该样品是纯化或部分纯化的样品,例如,纯化或部分纯化的蛋白质混合物或提取物。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K选自由以下项组成的组:羰基反应性单元、二烯反应性单元、羟基反应性单元、氨基反应性单元、亚胺反应性单元、硫醇反应性单元、二醇反应性单元、酚反应性单元、环氧化物反应性单元、二硫化物反应性单元和叠氮基反应性单元。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为羰基反应性单元,其能够与具有羰基基团的任何类型的分子反应。在本发明的第一方面的实施例中,羰基反应性单元选自由以下项组成的组:羧基反应性单元、酮基反应性单元、醛反应性单元、酐反应性单元、羰基酯反应性单元和酰亚胺反应性单元。在本发明第一方面的实施例中,羰基反应性单元可以具有通过相邻O或N原子的α-效应强化的超亲核性N原子NH2-N/O或具有二硫醇分子。
在本发明第一方面的实施例中,羰基反应性单元选自由以下项组成的组:
(i)肼单元,例如,H2N-NH-或H2N-NR1-单元,其中R1是芳基、含有一个或多个杂原子的芳基、或C1-4烷基特别是C1或C2烷基,其任选地被例如卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代,
(ii)酰肼单元,特别是碳酰肼或磺酰肼单元,特别是H2N-NH-C(O)-或H2N-NR2-C(O)-单元,
其中R2为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基或C1-4烷基,特别是C1或C2烷基,任选地被例如卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代,
(iii)羟氨基单元,例如,H2N-O-单元,以及
(iv)二硫醇单元,特别是1,2-二硫醇或1,3-二硫醇单元。
在本发明第一方面的实施例中,其中羰基反应性单元是羧基反应性单元,羧基反应性单元与分析物分子上的羧基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中,羧基反应性单元选自由以下项组成的组:重氮单元、烷基卤、胺和肼单元。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物分子包含酮基或醛基并且K为羰基反应性单元,其选自下组:
(i)肼单元,
(ii)酰肼单元,
(iii)羟氨基单元,以及
(iv)二硫醇单元。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为二烯反应性单元,其能够与包含二烯基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中,二烯反应性单元选自由以下项组成的组:Cookson型试剂,例如1,2,4-三唑啉-3,5-二酮,其能够用作亲二烯体。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为羟基反应性单元,其能够与包含羟基基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中,羟基反应性单元选自由以下项组成的组:磺酰氯、活化的羧酸酯(NHS,或咪唑阴离子)和能够进行氟的亲核取代的含氟芳烃/杂芳烃(T.Higashi J Steroid Biochem Mol Biol.2016 Sep;162:57-69)。在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为二醇反应性单元,其与分析物分子中的二醇基反应。在本发明的第一方面的实施例中,其中反应性单元为1,2-二醇反应性单元,该1,2-二醇反应性单元包含有机硼酸。在其他实施例中,二醇可被氧化成相应的酮或醛,并随后与酮/醛反应性单元K反应。
在本发明的第一方面的实施例中,氨基反应性单元与分析物分子上的氨基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中,氨基反应性单元选自由以下项组成的组:活性酯基团诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-NHS酯、五氟苯基酯、羰基咪唑酯、方酸(quadraticacid)酯、羟基苯并三唑(HOBt)酯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)酯和磺酰氯单元。
在本发明的第一方面的实施例中,硫醇反应性单元与分析物分子上的硫醇基团反应。在本发明的第一方面的实施例中,硫醇反应性单元选自由卤代乙酰基基团组成的组,特别是选自由以下项组成的组:Br/I-CH2-C(=O)-单元、丙烯酰胺/丙烯酸酯单元、不饱和酰亚胺单元诸如马来酰亚胺、甲磺酰基苯基噁二唑和磺酰氯单元。
在本发明的第一方面的实施例中,酚反应性单元与分析物分子上的酚基团反应。在本发明第一方面的实施例中,苯酚反应性单元选自由以下项组成的组:活性酯单元诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-NHS酯、五氟苯基酯、羰基咪唑酯、方酸(quadraticacid)酯、羟基苯并三唑(HOBt)酯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)酯和磺酰氯单元。分析物分子上存在的酚基团可经由反应(H.Ban等人J.Am.Chem.Soc.,2010,132(5),第1523-1525页)与亲电子试剂如三唑啉二酮(如TAD)反应,或可替换地通过重氮化或者通过邻位硝基化,之后还原为胺,然后该胺与胺反应性试剂反应。在本发明的第一方面的实施例中,酚反应性单元为氟-1-吡啶鎓。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为环氧化物反应性单元,其能够与包含环氧化物基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中,环氧化物反应性单元选自由以下项组成的组:氨基、硫醇、通过相邻O或N原子的α-效应强化的超亲核性N原子NH2-N/O分子。在本发明的第一方面的实施例中,环氧化物反应性单元选自由以下项组成的组:
(i)肼单元,例如,H2N-NH-或H2N-NR1-单元,其中R1为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基、或C1-4烷基特别是C1或C2烷基,其任选地被例如卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代,
(ii)酰肼单元,特别是碳酰肼或磺酰肼单元,特别是H2N-NH-C(O)-或H2N-NR2-C(O)-单元,
其中R2为芳基、含有一个或多个杂原子的芳基、或C1-4烷基特别是C1或C2烷基,其任选地被例如卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代,以及
(iii)羟氨基单元,例如,H2N-O-单元。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为二硫化物反应性单元,其能够与包含二硫化物基团的分析物反应。在本发明的第一方面的实施例中,二硫化物反应性单元选自由硫醇组成的组。在其他实施例中,二硫化物基团可被还原成相应的硫醇基团,然后与硫醇反应性单元K反应。
在本发明的第一方面的实施例中,反应性单元K为叠氮基反应性单元,其与分析物分子上的叠氮基基团反应。在本发明的第一方面的实施例中,叠氮基反应性单元通过叠氮化物-炔环加成与叠氮基基团反应。在本发明第一方面的实施例中,叠氮基反应性单元选自由以下项组成的组:炔(烷基或芳基)、线性炔或环状炔。叠氮基与炔之间的反应可在使用或不使用催化剂的情况下进行。在本发明的第一方面的其他实施例中,叠氮基基团可被还原成相应的氨基基团,然后与氨基反应性单元K反应。
在本发明的第一方面的实施例中,分析物的官能团选自表1的左栏中提到的选项。分析物的相应官能团的K的反应性基团选自表1的右栏中提到的基团。
表1:分析物的官能团和用于特定标记物的反应性基团
在本发明的第一方面的实施例中,A3为铵,B1或B5为K,并且n为3、4或5。
在本发明的第一方面的实施例中,A3为铵,B1或B5为K,其中K不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。术语“K不含选自O、N、S、Br的至少一个原子”在本公开的上下文中此处是指K不包含O或N或S或Br或其组合。特别是,K不含O、N、S和Br。
在本发明的第一方面的实施例中,A3选自由以下项组成的组:吡啶鎓、三甲基铵、鏻、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、二甲基乙铵、甲基二乙铵和三烷基铵。
在本发明的第一方面的实施例中,A3为NR1R2R3或PR4R5R6,其中R1、R2、R3、R4、R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、丙基、经取代的苯基、未经取代的苯基、烷基、经修饰的烷基、短链烷基。
特别地,短链烷基在烷基链中包含一个、两个、三个、四个、五个或六个C原子。
在本发明的第一方面的实施例中,B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自OR7、NR8R9、H、脂肪族,其中R7、R8、R9各自独立地选自甲基、乙基、丙基、经取代的苯基、未经取代的苯基、烷基、经修饰的烷基、短链烷基。
在本发明的第一方面的实施例中,A1、A2各自独立地选自H、脂肪族基团、芳香族基团。
在本发明的第一方面的实施例中,A1为H或CH3。
在本发明的第一方面的实施例中,A2为H或CH3。
在本发明的第一方面的实施例中,A1为H、A2为H且A3为吡啶鎓。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。
在本发明的第一方面的实施例中,B2为Q。
在本发明的第一方面的实施例中,B4为Q。
在本发明的第一方面的实施例中,B1为H或甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B2为H或甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B4为H或甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B5为H或甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,Q包含F。
在本发明的第一方面的实施例中,n为0。
在本发明的第一方面的实施例中,n为1。
在本发明的第一方面的实施例中,n为0或1且K为酰肼。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓,B1=H,B2=H,B4=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓,B1=H,B2=H,B4=H和B5=甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H、A2=H、A3=甲基吡啶鎓、B1=甲氧基、B2=H、B4=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓,B1=H,B2=甲氧基,B4=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓,B1=甲氧基,B2=H,B4=H和B5=甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓,B1=甲氧基,B2=H,B4=甲氧基和B5=甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=铵,B1=H,B2=H,B4=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=铵,B1=H,B2=H,B4=H和B5=甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B4为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=铵,B1=甲氧基,B2=H,B3=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B4为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=铵,B1=H,B2=甲氧基,B3=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q选自以下组:肼单元、甲基肼单元、乙基肼单元、酰肼单元、甲基酰肼单元、乙基酰肼单元、羟氨基单元。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=铵,B1=甲氧基,B2=H,B4=H和B5=甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,B3为Q。Q为CH2-Br、TAD或SO2Cl。其他不是Q的取代基是:A1=H,A2=H,A3=甲基吡啶鎓或铵,B1=H,B2=H,B4=H和B5=H。
在本发明的第一方面的实施例中,不形成偶联基团Q的其他取代基B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、叔丁基、N,N二甲胺、乙氧基或甲氧基。
在本发明的第一方面的实施例中,化合物为带永久正电荷的。
在本发明的第一方面的实施例中,化合物是带单永久正电荷的。
在本发明的第一方面的实施例中,化合物是带双永久正电荷或三永久正电荷的。
在本发明的第一方面的实施例中,化合物包含用于形成盐的抗衡离子,其中该抗衡离子优选地选自以下组:Cl-、Br-、F-、甲酸盐、三氟乙酸盐、PF6 -、磺酸盐、磷酸盐、乙酸盐。
在本发明的第一方面的实施例中,化合物包含下式:
在本发明的第一方面的实施例中,式I化合物选自以下组(参见表2)。
表2:化合物
标记物5:
标记物17:
标记物22
上述标记物1至25中的每一个可以单独或与抗衡离子组合形成化合物。
在苄基位置的中性丢失碎裂后碳阳离子的稳定化能够在低能量下实现中性丢失,从而提供高度主导的碎裂途径,从而实现高信号增强。在一些实施例中,尤其是在元取代模式(B2或B4为Q)的情况下,可以观察到有利的LC洗脱特性。可在酰肼或肟中形成的两种E/Z立体异构体中的任何一种(例如用于睾酮标记)为主要生成或两种异构体共洗脱。这增加的灵敏度归因于更好的信噪比S/N。供电子取代基B1至B5(例如OMe)能够在较低能量下进行碎裂。A1、A2=H;B1至B5=H,n=1和K=1的酰肼可以实现特别高的信号增强。脂肪族(例如甲基)和芳香族(例如苯基或取代的类似物)修饰A1和A2在碳原子上带有正电荷,在中性丢失碎裂后能够在低能量下进行碎裂(例如1或2:R1,R2=Me、Ph)。
在本发明的第一方面的实施例中,A1、A2中的每一个为彼此独立地H、脂肪族(例如Me)或芳香族(例如苯基),A3为NR3(R例如Me)、吡啶或PR3(R例如Me、Ph),B1、B2、B3、B4、B5中的每一个为彼此独立地OR、NR2、H或脂肪族(例如Me)。K为可共轭基团,例如酰肼、肼、羟胺、溴、PTAD或TAD。
在本发明的第一方面的实施例中,取代基B1、B2、B3、B4、B5中的多于一者为偶联基团Q,例如取代基B1、B2、B3、B4、B5中的2、3或4个为偶联基团Q。换句话说,式I化合物包含多于一个Q,例如第一Q、第二Q或第三Q,其中Q可以是彼此结构不同或结构相同的。第一、第二、第三、第四或第五Q可以相互独立地选自上述针对Q的实施例中。
在第二方面,本发明涉及包含如上文关于本发明的第一方面详细公开的式I化合物的组合物。对于本发明第一方面提及的所有实施例都适用于本发明的第二方面,反之亦然。
在第三方面,本发明涉及包含如上文中关于本发明的第一方面详细公开的式I化合物或如上文中详细公开的本发明的第二方面的组合物的试剂盒。对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面提及的所有实施例都适用于本发明的第三方面,反之亦然。
在第四方面,本发明涉及用于使用质谱来检测分析物的复合物,其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物,特别是其中复合物是通过分析物和本发明第一方面的化合物的化学反应形成的。特别地,分析物选自由以下项组成的组:核酸、氨基酸、肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以另一分子的某种修饰为特征的分子、已被生物体内化的物质、此类物质的代谢物及其组合。对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面提及的所有实施例都适用于本发明的第四方面,反之亦然。
在本发明的第四方面的实施例中,式III的结合复合物由在式I化合物与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键而产生。根据式I化合物的反应性单元K和分析物分子的官能团,本领域技术人员能够很好地确定两者之间共价键的形成。
在本发明的第四方面的实施例中,结合化合物包含式III
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为与分析物形成共价键的偶联基团Q*,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中偶联基团Q*包含式IV,
其中n*为0、1、2、3、4或5,
其中结合分析物经由K*共价键合,其中X*为式III的苯基基团的碳原子,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q*,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
在本发明的第一方面的实施例中,A3为铵,B1或B5为Q*,其中Q*不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。术语“Q*不含选自O、N、S、Br的至少一个原子”在本公开的上下文中此处是指Q*不包含O或N或S或Br或其组合。
在本发明的第四方面的实施例中,式III的A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4、B5中的每一个具有如本发明的第一方面所述(式I的A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4、B5)相同的含义。
在本发明的第四方面的实施例中,X*具有如本发明的第一方面所述的X相同的含义。
在本发明的第四方面的实施例中,K*是由在式I化合物的反应性单元K与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键而产生。根据式I化合物的反应性单元K和分析物分子的官能团,本领域技术人员能够很好地确定两者之间共价键的形成。
此外,在本发明的范围内还预期存在于分析物分子上的官能团可以首先转化为更容易用于与式I化合物的反应性单元K反应的另一个基团。
在本发明的第四方面的实施例中,分析物选自由以下项组成的组:核酸、氨基酸、肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以另一分子的某种修饰为特征的分子、已被生物体内化的物质、此类物质的代谢物及其组合。
在本发明的第四方面的实施例中,分析物分子包含选自由以下项组成的组中的官能团:羰基基团、二烯基团、羟基基团、胺基基团、亚胺基、硫醇基、二醇基、酚基、环氧化物基团、二硫化物基团和叠氮化物基团,其中每个基团均能够与式I的化合物的反应性单元K形成共价键。
在本发明的第四方面的实施例中,分析物分子选自由以下项组成的组:类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其他生物分子(包括小分子代谢物和辅因子)以及治疗性药物、滥用的药物、毒素或其代谢物。
对于本发明第一方面提及的分析物的所有实施例都适用于本发明的第四方面,反之亦然。
在本发明的第四方面的实施例中,结合化合物经由分析物的羰基基团、羟基基团或二烯基团共价连接以形成所述复合物。
在第五方面,本发明涉及式I化合物用于分析物的质谱测定的用途。优选地,质谱测定包括串联质谱测定,特别是三重四极杆质谱测定。对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面提及的所有实施例都适用于本发明的第五方面,反之亦然。
在本发明的第五方面的实施例中,质谱测定包括串联质谱测定,特别是三重四极杆质谱测定。
在本发明的第五方面的实施例中,式I化合物的用途包括用作衍生化试剂。在本发明的第五方面的实施例中,使用式I化合物来增加MS测量的灵敏度。在实施例中,使用式I化合物以较低的检测水平特别是在较低的定量水平检测目标分析物。
在本发明的第五方面的实施例中,根据本发明的式I化合物包含能够与分析物分子反应的反应性单元K。反应性单元K能够与分析物分子反应,使得在式I化合物与分析物分子之间形成共价键。在本发明的第五方面的实施例中,反应性单元K与式I化合物形成共价键。特别地,在式I化合物的反应性单元K与分析物分子中存在的官能团之间形成共价键。
依据待测定的分析物分子中存在的官能团,技术人员将选择适宜的用于式I化合物的反应性单元K。决定哪种反应性单元K将符合与目标分析物的官能团结合是公知常识。
以上针对分析物所述的内容在必要时适用于本发明的第五方面的上下文中的分析物。
分析物分子可存在于生物样品或临床样品诸如体液(例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液等)、组织或细胞提取物等中。在本发明的第五方面的实施例中,分析物分子存在于选自由以下项组成的组的生物样品或临床样品中:血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液和干血斑。在本发明的第五方面的一些实施例中,分析物分子可存在于样品中,该样品为纯化或部分纯化的样品,例如纯化或部分纯化的蛋白质混合物或提取物。
在第六方面,本发明涉及用于分析物的质谱测定的方法,其包括以下步骤:
(a)使分析物与如上文中关于本发明的第一方面公开的式I化合物反应,从而形成如上文中关于本发明的第四方面公开的复合物,
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
在本发明的第五方面的实施例中,质谱分析步骤(b)包括:
(i)使复合物的离子进入质谱分析的第一级,从而根据复合物的离子的质荷(m/z)比对复合物的离子进行表征,
(ii)使复合物离子碎裂,从而释放出第一实体,特别是第一中性实体,特别地低分子量中性实体,并且生成复合物的子离子,其中复合物的子离子在其m/z比上不同于复合物离子,以及(iii)使复合物的子离子进入质谱分析的第二级,从而根据复合物的子离子的m/z比对复合物的子离子进行表征,并且/或者其中(ii)可进一步包括复合物离子的另一种碎裂,从而释放出不同于第一实体的第二实体,特别是第二中性实体,并且生成复合物的第二子离子,并且其中(iii)可进一步包括使复合物的第一子离子和第二子离子进入质谱分析的第二级,从而根据复合物的第一子离子和第二子离子的m/z比对复合物的第一子离子和第二子离子进行表征。
在本发明的第六方面的实施例中,第一实体和/或第二实体选自由以下项组成的组:三甲胺、吡啶、膦、三甲胺、三丙胺、三丁胺二甲基乙胺、甲基二乙胺和三烷基胺。
步骤(a)可在质谱测定之前的样品制备工作流程内的不同阶段发生。包含分析物分子的样品可以进行预处理和/或通过各种方法进行富集。预处理方法取决于样品类型诸如血液(新鲜的或干燥的)、血浆、血清、尿液或唾液,而富集方法取决于目标分析物。哪种预处理样品适用于哪种样品类型是技术人员众所周知的。哪种富集方法适用于哪种目标分析物也是技术人员众所周知的。
在本发明的第六方面的实施例中,用于分析物分子的质谱测定的本发明的方法的步骤(a)发生在i)样品预处理步骤之后、ii)样品首次富集之后或iii)样品二次富集之后。
在本发明的第六方面的实施例中,其中样品为全血样品,将其分配至两种预定义的样品预处理(PT)工作流程之一,这两种工作流程均包括添加内标(ISTD)和溶血试剂(HR)以及随后预定义的孵育期(Inc),其中这两种工作流程之间的区别在于内标(ISTD)和溶血试剂(HR)的添加顺序不同。在添加水作为溶血试剂的实施例中,特别是以0.5∶1至20∶1mL水/mL样品的量,以1∶1至10∶1mL水/mL样品的量,以2∶1至5∶1mL水/mL样品的量添加。
在本发明的第六方面的实施例中,样品是尿液样品,将其分配到其他两个预定义的PT工作流程中的一个,两个工作流程均包括添加内标和酶试剂以及之后的预定义孵育期,两个工作流程之间的差异之处是添加内标和酶试剂的次序。酶试剂通常是用于葡糖苷酸裂解或蛋白质裂解或对分析物或基质进行任何预处理的试剂。在另外的步骤中,添加衍生化试剂诸如上文或下文中所公开的本发明化合物,之后为孵育期。
在本发明第六方面的实施例中,酶试剂选自由以下项组成的组:葡萄糖醛酸酶、(部分的)外切型或内切型去糖基化酶、或外切型或内切型蛋白酶。在实施例中,以0.5至10mg/ml的量,特别是以1至8mg/ml的量,特别是以2至5mg/ml的量,来添加葡萄糖醛酸酶。
在本发明第六方面的实施例中,其中样品是血浆或血清,将其分配到另一预定义PT工作流程,该工作流程仅包括添加内标(ISTD)以及之后的预定义孵育时间。
本领域的技术人员熟知选择用于上文或下文所考虑和指定的样品处理、化学反应或方法步骤的孵育时间和温度。特别地,本领域的技术人员知道孵育时间和温度相互依赖,因为例如高温通常导致孵育时间较短,反之亦然。在本发明的第六方面的实施例中,孵育温度在4-45℃的范围内,特别是在10-40℃的范围内,特别是在20-37℃的范围内。在实施例中,时间在30s至120min的范围内,特别是在30s至1min、30s至5min、30s至10min、1min至10min或1min至20min、10min至30min、30min至60min或60min至120min的范围内。在特定实施例中,孵育时间为36s的倍数。
据此,在本方法的实施例中,步骤a)发生在上文公开的样品预处理步骤之后。
在本发明的第六方面的实施例中,步骤a)中式I化合物与分析物分子的反应发生在任何富集过程之前,将式I化合物添加到经过预处理的目标样品中。据此,分析物分子与式I化合物的复合物在预处理之后并且在第一富集过程之前形成。因此,复合物在经历步骤b)的质谱分析之前经历第一富集过程和第二富集过程。
经过预处理的样品可以进一步经历分析物富集工作流程。分析物富集工作流程可包括一种或多种富集方法。富集方法在本领域中众所周知,包括但不限于化学富集方法(包括但不限于化学沉淀)和使用固相的富集方法(包括但不限于固相萃取方法、珠粒工作流程和色谱方法(例如气相色谱法或液相色谱法))。
在本发明的第六方面的实施例中,第一富集工作流程包括向预处理后的样品中加入固相,特别是携带分析物选择性基团的固相珠粒。在本发明第六方面的实施例中,第一富集工作流程包括添加将分析物选择性基团携带至经过预处理的样品的磁珠或顺磁珠。在本发明第六方面的实施例中,磁珠的添加包括搅拌或混合。之后是用于将目标分析物捕获在珠上的预定义孵育期。在本发明第六方面的实施例中,工作流程包括在与磁珠一起孵育之后的洗涤步骤(W1)。依据分析物,执行一个或多个另外的洗涤步骤(W2)。一个洗涤步骤(W1、W2)包括一系列包括以下项的步骤:通过包含磁体或电磁体的磁珠处置单元来分离磁珠、抽吸液体、添加洗涤缓冲液、将磁珠重新悬浮、另一个磁珠分离步骤和另一次抽吸液体。此外,除了洗涤循环的体积和数量或组合之外,洗涤步骤可以在溶剂类型层面(水/有机物/盐/pH)上有所不同。如何选择相应参数是技术人员众所周知的。在最后一个洗涤步骤(W1、W2)之后,添加洗脱试剂,之后将磁珠重新悬浮,并经历预定义孵育期,以用于从磁珠释放目标分析物。然后分离无结合物的磁珠,并捕获含有经过衍生化的目标分析物的上清液。
在本发明第六方面的实施例中,第一富集工作流程包括添加将基质选择性基团携带至经过预处理的样品的磁珠。在本发明第六方面的实施例中,磁珠的添加包括搅拌或混合。之后是用于将基质捕获在珠上的预定义孵育期。此时,目标分析物并未与磁珠结合,而是保留在上清液中。之后,分离磁珠,并收集含有经过富集的目标分析物的上清液。
在本发明第六方面的实施例中,使上清液经历第二富集工作流程。这里,将上清液转移至LC站,或在通过添加稀释液体进行的稀释步骤之后转移至LC站。通过改变例如溶解类型(水/有机物/盐/pH)和体积,也可以使用不同的洗脱规程/试剂。各种参数是技术人员众所周知并且容易选择的。
在本发明第六方面的实施例中,其中本方法的步骤a)不直接发生在预处理方法之后,步骤a)可发生在如上文中所述使用磁珠进行的第一富集工作流程之后。
在本发明的第六方面的实施例中,其中使用分析物特异性磁珠,在洗涤步骤(W1,W2)完成之后,在洗脱试剂之前、同时或之后,将上文或下文所公开的式I的化合物加入目标样品中,然后经过孵育期(确定的时间和温度)处理。
在本发明的第六方面的实施例中,然后分离无结合物的磁珠,并收集含有步骤a)的复合物的上清液。在本发明的第六方面的实施例中,将含有步骤a)的复合物的上清液转移至第二富集工作流程,特别是直接转移至LC站或在通过添加稀释液体进行的稀释步骤之后转移至LC站。
在本发明的第六方面的实施例中,其中使用了基质特异性磁珠,将如上文或下文中所公开的式I化合物在分离磁珠之前或在分离磁珠之后添加到目标样品中。在本发明的第六方面的实施例中,将含有步骤a)的复合物的上清液转移至第二富集工作流程,特别是直接至LC站或在通过添加稀释液体进行的稀释步骤之后至LC站。
据此,在本发明的第六方面的实施例中,其中步骤a)中式I化合物与分析物分子的反应发生在第一富集过程之后,在第一富集过程特别是使用磁珠进行的第一富集过程结束之后,将式I化合物添加到目标样品中。据此,样品首先如上文所述经过预处理,然后经历第一富集过程特别是使用如上文所述的携带分析物选择基团的磁珠进行的第一富集过程,并且在从磁珠洗脱之前、同时或之后,添加式I化合物。据此,分析物分子与式I化合物的复合物在第一富集过程之后并且在第二富集过程之前形成。因此,复合物在经历步骤b)的质谱分析之前经历第二富集过程。
在本发明的第六方面的另一个实施例中,本方法的步骤(a)发生在第二个分析物富集工作流程之后。在第二个富集工作流程中,使用色谱分离来进一步富集样品中目标分析物。在本发明第六方面的实施例中,色谱分离是气相色谱或液相色谱。两种方法均是技术人员众所周知的。在本发明的第六方面的实施例中,液相色谱选自由以下项组成的组:HPLC、快速LC、微流-LC、流动注射以及捕捉和洗脱。
在本发明的第六方面的实施例中,本方法的步骤a)在色谱分离的同时或之后发生。在本发明的第六方面的实施例中,将式I化合物与洗脱缓冲液一起添加到柱内。在另选的实施例中,式I化合物在柱后添加。
在本发明的第六方面的实施例中,第一富集过程包括使用分析物选择性磁珠。在本发明第六方面的实施例中,第二富集过程包括使用色谱分离,特别是使用液相色谱。
据此,在本发明的第六方面的实施例中,其中步骤a)中式I化合物与分析物分子的反应发生在第二富集过程之后,在使用色谱特别是液相色谱的第二富集过程结束之后,将式I化合物添加到目标样品中。据此,在此情况下,样品首先如上文所述经过预处理,然后经历第一富集过程特别是使用如上文所述的磁珠,之后是色谱分离特别是使用液相色谱,并且在色谱分离之后添加式I化合物。据此,结合分析物分子与式I结合化合物的复合物在第二富集过程之后形成。因此,复合物在经历步骤b)的质谱分析之前不经历富集过程。
在第七方面,本发明涉及式V化合物:
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。优选地,A3为铵,B1或B5为偶联基团Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子。
对于本发明的第一方面和/或本发明的第二方面和/或本发明的第三方面和/或本发明的第四方面和/或本发明的第五方面和/或本发明的第六方面提及的所有实施例都适用于本发明的第七方面,反之亦然。特别地,对于本发明的第一方面提及的所有实施例,例如A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4和B5适用于式V化合物。特别地,式V化合物能够用于质谱测定。替代地或另外地,式V化合物可以用于其他技术领域,例如化学标记和药物递送。
在本发明的实施例中,临床诊断系统包含本发明的第一方面的化合物和/或本发明的第二方面的组合物和/或本发明的第三方面的试剂盒和/或本发明的第四方面的复合物。另外地或任选地,本发明的第一方面的化合物用于分析物的质谱测定,其中临床诊断系统包括质谱测定。另外地或任选地,本发明的第六方面的分析物的质谱测定方法由临床诊断系统执行。
“临床诊断系统”是实验室自动化仪器,专门用来分析用于体外诊断的样品。根据需要和/或根据期望的实验室工作流,临床诊断系统可具有不同的配置。通过将多个仪器和/或模块耦接在一起,可获得附加配置。“模块”是具有专用功能的工作单元,通常比整个临床诊断系统更小。此功能可以是分析功能,但也可以是分析前功能或分析后功能,或者可以是分析前功能、分析功能或分析后功能中的任一个的辅助功能。特别地,模块可配置为与一个或多个其他模块协作以用于例如通过执行一个或多个分析前步骤和/或分析步骤和/或分析后步骤来执行样品处理工作流的专用任务。特别地,临床诊断系统可以包括一个或多个分析设备,设计用于执行针对某些类型的分析优化的相应工作流程,例如,临床化学、免疫化学、凝血、血液学、液相色谱分离、质谱等。因此,临床诊断系统可包括一个分析设备或任何此类分析设备与相应工作流程的组合,其中分析前和/或分析后模块可以耦合到单独的分析设备或由多个分析设备共享。在替代方案中,可通过集成在分析仪器中的单元来执行分析前功能和/或分析后功能。临床诊断系统可包括功能单元,诸如用于吸移和/或泵送和/或混合样品和/或试剂和/或系统流体的液体处理单元,以及用于分类、存储、运输、识别、分离、检测的功能单元。临床诊断系统可以包括用于自动制备包含目标分析物的样品的样品制备站、包括多个LC通道的液相色谱(LC)分离站和/或用于将制备的样品输入到LC通道的任何一个中的样品制备/LC接口。临床诊断系统可进一步包括控制器可编程为将样品分配至预先定义的样品制备工作流,每个工作流包括预先定义的样品制备步骤序列且需要预先定义的完成时间(视目的分析物而定)。临床诊断系统可进一步包括质谱仪(MS)和用于将LC分离站连接到质谱仪的LC/MS接口。如本文所用,术语“自动地”或“自动的”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义,并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体地可指但不限于完全借助于至少一个计算机和/或至少一个计算机网络和/或至少一个机器来执行的过程,特别是,不需要手动操作和/或与用户交互。
“样品制备站”可以是耦接至一个或多个分析设备或分析设备中的单元的预分析模块,其设计为执行一系列样品处理步骤,这些样品处理步骤旨在除去或至少减少样品中的干扰基质成分和/或富集样品中的目的分析物。此类处理步骤可包括对一个样品或多个样品顺序地、并行地或交错地执行的以下处理操作中的任一项或多项:吸移(抽吸和/或分配)流体、泵送流体、与试剂混合、在一定温度下培育、加热或冷却、离心、分离、过滤、筛分、干燥、洗涤、重悬、等分、转移、储存等)。
液相色谱(LC)分离站是分析设备或分析设备中的模块或单元,其设计为使制备的样品经历色谱分离,以便例如将目的分析物与基质成分分离,例如在样品制备后仍可能干扰后续检测例如质谱检测的剩余基质成分,和/或以便将目的分析物相互分离,从而实现对其进行单独检测。根据实施例,LC分离站是中间分析设备或分析设备中的模块或单元,其设计为制备用于质谱分析的样品和/或将制备的样品转移至质谱仪。特别地,LC分离站是包括多个LC通道的多通道LC站。
临床诊断系统,例如样品制备站还可以包括用于在启动新的样品制备起始序列之前接收多个样品的缓冲单元,其中可以单独随机访问样品并且可以根据样品制备起始序列启动单独制备。
该临床诊断系统使LC与质谱联用更方便且更可靠,因此适用于临床诊断。特别是高通量,例如通过随机访问样品制备和LC分离,可以获得高达100个样品/小时或更多样品,同时能够在线与质谱结合。此外,该过程可以完全自动化,增加了自动操作(walk-away)时间并降低了所需的技能水平。
在另一些实施例中,本发明涉及以下方面:
1.一种用于分析物的质谱测定的式I化合物,
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与所述分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
2.根据方面1所述的化合物,其中偶联基团Q根据下式II与X键合:
其中K为能够与所述分析物形成共价键的反应性单元,
其中n为0、1、2、3、4或5,并且
其中X为式I的苯基基团的碳原子。
3.根据方面2所述的化合物,其中K能够与分析物的羰基基团、酚基团、胺、羟基基团或二烯基团反应。
4.根据方面2或3所述的化合物,其中K选自由以下项组成的组:酰肼、肼、羟胺、Br、F-芳香族、4-取代的1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、活性酯、磺酰氯和反应性羰基。
5.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A3为铵、B1或B5为Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子,特别是Q不含O、N、S和Br。
6.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A3为铵,B1或B5为K,并且n为3、4或5。
7.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A3为铵、B1或B5为K,其中K不含选自O、N、S、Br的至少一个原子,特别是K不含O、N、S和Br。
8.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中Q选自由以下项组成的组:甲基酰肼、甲基肼、甲基羟胺、氧胺、4-甲基-氧基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(CH2-O-TAD)、2,4-二硝基-5-氟苯胺衍生物、氯磺酰基和甲磺酰氯。
9.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A3选自由以下项组成的组:吡啶鎓、三甲基铵、鏻、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、二甲基乙铵、甲基二乙铵和三烷基铵。
10.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A3为NR1R2R3或PR4R5R6,
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、丙基、经取代的苯基、未经取代的苯基、烷基、经修饰的烷基、短链烷基。
11.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自OR7、NR8R9、H、脂肪族,
其中R7、R8、R9各自独立地选自甲基、乙基、丙基、经取代的苯基、未经取代的苯基、烷基、经修饰的烷基、短链烷基。
12.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A1、A2各自独立地选自H、脂肪族基团、芳香族基团。
13.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A1为H或CH3。
14.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A2为H或CH3。
15.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中A1为H,A2为H且A3为吡啶鎓。
16.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B3为Q。
17.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B2为Q。
18.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B4为Q。
19.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B1为H或甲氧基。
20.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B2为H或甲氧基。
21.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B4为H或甲氧基。
22.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中B5为H或甲氧基。
23.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中Q包含F。
24.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中n为0。
25.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中n为1。
26.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中n为0或1且K为酰肼。
27.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中不形成偶联基团Q的其他取代基B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、叔丁基、N,N二甲胺、乙氧基或甲氧基。
28.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中化合物为带永久正电荷的。
29.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中化合物为带单永久正电荷的。
30.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中化合物是带双永久正电荷或三永久正电荷的。
31.根据前述方面中任一项所述的化合物,其中化合物包含用于形成盐的抗衡离子,其中该抗衡离子优选地选自以下组:Cl-、Br-、F-、甲酸盐、三氟乙酸盐、PF6 -、磺酸盐、磷酸盐、乙酸盐。
32.根据前述方面中任一项所述的化合物,其包含下式:
33.一种组合物,其包含根据方面1至32中任一项所述的化合物。
34.一种试剂盒,其包含根据方面1至32中任一项所述的化合物或根据方面33所述的组合物。
35.一种用于使用质谱测定来检测分析物的复合物,其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物,特别是其中复合物是通过分析物和方面1至32中任一项的化合物的化学反应形成的。
36.根据方面35所述的复合物,其中结合化合物包含式III
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为与分析物形成共价键的偶联基团Q*,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中偶联基团Q*包含式IV,
其中n*为0、1、2、3、4或5,
其中结合分析物经由K*共价键合,其中X*为式III的苯基基团的碳原子,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q*,偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
37.根据前述方面35至36中任一项所述的复合物,其中分析物选自由以下项组成的组:核酸、氨基酸、肽、蛋白质、代谢物、激素、脂肪酸、脂质、碳水化合物、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、以另一分子的某种修饰为特征的分子、已被生物体内化的物质、此类物质的代谢物及其组合。
38.根据前述方面35至37中任一项所述的复合物,其中结合化合物经由分析物的羰基基团、羟基基团或二烯基团共价连接以形成所述复合物。
39.根据方面1至32中任一项所述的化合物用于分析物的质谱测定的用途。
40.根据方面39所述的化合物的用途,其中质谱测定包括串联质谱测定,特别是三重四极杆质谱测定。
41.一种用于分析物的质谱测定的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使分析物与如方面1至32中任一项所定义的式I化合物反应,从而形成如方面35至38中任一项所定义的复合物,
(b)对来自步骤(a)的复合物进行质谱分析。
42.根据方面41所述的方法,其中质谱分析步骤(b)包括:
(i)使复合物的离子进入质谱分析的第一级,从而根据复合物的离子的质荷(m/z)比对复合物的离子进行表征,
(ii)使复合物离子碎裂,从而释放出第一实体,特别是第一中性实体,特别地低分子量中性实体,并且生成复合物的子离子,其中复合物的子离子在其m/z比上不同于复合物离子,以及
(iii)使复合物的子离子进入质谱分析的第二级,从而根据复合物的子离子的m/z比对复合物的子离子进行表征,并且/或者
其中(ii)可进一步包括所述复合物离子的另一种碎裂,从而释放出不同于所述第一实体的第二实体,特别是第二中性实体,并且生成所述复合物的第二子离子,并且
其中(iii)可进一步包括使复合物的第一子离子和第二子离子进入质谱分析的第二级,从而根据复合物的第一子离子和第二子离子的m/z比对复合物的第一子离子和第二子离子进行表征。
43.根据方面41或42所述的方法,其中第一实体和/或第二实体选自由以下项组成的组:三甲胺、吡啶、膦、三甲胺、三丙胺、三丁胺二甲基乙胺、甲基二乙胺和三烷基胺。
44.一种式V化合物:
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵且B1或B5为偶联基团Q,偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
实例
提供以下实施例以说明本发明,但不限制受权利要求书保护的本发明。
实例1:标记物1至标记物5的合成
标记物1:
步骤1:含吡啶鎓基团的酰肼衍生物的合成
将587mg 4-(溴甲基)苯基乙酸甲酯(2mmol)、10mL乙醇和324mL吡啶(4mmol)合并并回流3小时。将反应混合物真空浓缩以得到油状物。
步骤2:
将来自步骤1的油溶解在8mL水中,加入0.9mL水合肼(80%的H2O溶液)并将反应回流70分钟。将反应混合物真空浓缩并通过制备型RP HPLC(水至乙腈)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为242.3。标记物1的m/z的实验测定值为242.2。RP HPLC(反相HPLC)对于技术人员来说是已知的并且因此不进行详细解释。
标记物2至标记物5的合成根据如标记物1所述。LC-ESI+m/z的计算值和标记物2至标记物5的m/z实验测定值如表3所示。
表3:
实例2:标记物6至标记物13的合成
标记物6:
步骤1:含三甲基铵基团的酰肼衍生物的合成
将587mg 4-(溴甲基)苯乙酸甲酯(2mmol)、10mL乙醇和0.95mL三甲胺(25%的H2O溶液)合并并回流3小时。将反应混合物真空浓缩以得到油状物。
步骤2:
将来自步骤1的油溶解在8mL水中,加入0.9mL水合肼(80%的H2O溶液)并将反应回流70分钟。将反应混合物真空浓缩并通过制备型RP HPLC(水至乙腈)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为222.3。标记物6的m/z的实验测定值为222.3。
标记物7至标记物13的合成根据如标记物6所述。LC-ESI+m/z的计算值和标记物7至标记物13的m/z实验测定值如表4所示。
表4:
实例3:标记物14的合成:含三甲基铵基的羟胺衍生物的合成
步骤1:
将1g 4-溴苄基溴(4mmol)溶解在50mL THF中并加入1.5eq 25%三甲胺水溶液。将混合物搅拌16小时并通过过滤和干燥收集所得沉淀。LC-ESI+m/z的计算值为229.1。m/z的实验测定值为230.2。
步骤2:
将来自步骤1的7.5mg(11mg)烯丙基氯化钯(II)二聚体(20μmol)、40mgtBuBrettPhos(2-(二-叔-丁基膦基)-2′,4′,6′-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1′-联苯,80μmol)、490mg碳酸铯(1.5mmol)、310mg固体(1mmol)在氩气下在干燥微波小瓶中溶解在2mL干燥甲苯中。加入125μl乙酰羟肟酸乙酯(1.25mmol)并将反应混合物在65℃下在密闭小瓶中搅拌。然后将反应混合物倒入25mL甲醇中,过滤并真空浓缩。将所得固体溶解在水/甲醇中并经由RP HPLC(水至乙腈,反相HPLC)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为251.3。m/z的实验测定值为251.3。
步骤3:
将来自步骤2的109mg固体(329μmol)溶解在2mL二噁烷中,加入400μl 6M HCl水溶液(2.35mmol)并将混合物在室温下搅拌80分钟。加入9mL水并通过RP HPLC(水至乙腈)纯化混合物。LC-ESI+m/z的计算值为181.3。m/z的实验测定值为181.3。
实例4:标记15的合成
步骤1:[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑啉-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵的合成
将4-[4-(羟基甲基)苯基]-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(0.39mmol)【如先前报道的(J.Chem.Soc.,Chem.Commun.1990,191,1416-1417)合成】溶解在无水DMF中,然后加入PPh3(0.54mmol)和CBr4(0.58mmol)。在室温(r.t.)搅拌2小时后,加入TMA(1M的THF溶液,0.46mmol)并将溶液在室温搅拌2小时。在真空下去除溶剂,将残余物悬浮在水中并用CH2Cl2萃取。将水相干燥并通过制备型HPLC纯化粗产物。获得纯产物,为白色固体(75mg,54%产率)。
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O0.1%TFA,0%CH3CN 0.1%TFA;
0-40min:80%H2O0.1%TFA;20%CH3CN 0.1%TFA;
40-60min:2%H2O0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
60-74min:2%H2O0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
74-79min:60%H2O0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
79-90min:60%H2O0.1%TFA;40%CH3CN0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 3.12(s,9H)4.56(s,2H)7.65-7.72(m,4H)。
13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δppm 51.68(3C)68.41(1C)126.24(2C)127.23(1C)133.25(2C)134.14(1C)153.66(2C)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值249.13460,实测值249.39。
步骤2:[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵的合成
在氩气下将[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵(0.041mmol)溶解在无水CH3CN(500μL)中。加入DBH(0.041mmol)并将红色溶液在室温下避光搅拌10分钟。然后在真空下去除溶剂,并将残余物悬浮于无水CH2Cl2中。将红色固体再次用CH2Cl2洗涤并干燥。该固体无需进一步纯化即可使用并在-20℃避光储存。
实例5:标记物16的合成:N-[4-[(二甲氨基)甲基]苯基]-5-氟-2,4-二硝基苯胺的合成
将4-[(二甲氨基)甲基]苯胺(0.58mmol)添加到1,5-二氟-2,4-二硝基苯(0.35mmol)的CH3CN(1mL)溶液中。将溶液在室温搅拌过夜。在真空下去除溶剂后,并将粗产物通过色谱法纯化(洗脱液:CH2Cl2/MeOH 100∶0→95∶5)。获得产物,为黄色油状物(97mg,83%产率)。
1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 2.50(s,6H)3.77(s,2H)6.85(d,J=13.30Hz,1H)7.26-7.31(m,2H)7.52(d,J=8.03Hz,2H)9.17(br d,J=7.65Hz,1H)9.94(brs,1H)。
HPLC-MS(m/z)[M+H]+计算值335.11501,实测值335.36。
产生的产物的二甲氨基残基可以被甲基化并形成标记物16。甲基化可以在与分析物形成复合物之前或之后发生。
实例6:标记物17的合成:[4-(溴甲基)苯基]甲磺酰氯的合成
将4-甲基苄基磺酰氯(2.59mmol)、DBH(1.81mmol)和AIBN(0.26mmol)溶解在CH3CN中。将溶液在60小时至18小时搅拌。在真空下去除溶剂并将粗化合物通过色谱法纯化(洗脱液:己烷/EtOAc 100∶0→90∶10)。获得产物,为白色固体(50mg)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 4.49(s,2H)4.85(s,2H)7.38-7.55(m,4H)。
13C NMR(101MHz,氯仿-d)δppm 32.11(1C)70.36(1C)126.15(1C)129.82(2C)131.76(2C)140.09(1C)。
实例7:标记物18的合成:含吡啶鎓基团的溴衍生物的合成
将1.6gα,α′-二溴-对二甲苯溶解在乙醇中,并在回流2小时内加入吡啶。然后将混合物搅拌30分钟并在真空中去除溶剂。将粗物质在乙醚中消化两次并将剩余的固体溶解在水中并通过RP HPLC(水至乙腈)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为263.2。m/z的实验测定值为263.1。
实例8:标记物19的合成:含三甲基铵基团的溴衍生物的合成
将1.6gα,α′-二溴-对二甲苯溶于100mL THF中并加入三甲胺。将混合物在室温下搅拌16小时,过滤所得沉淀并用乙醚洗涤。将粗物质通过RP HPLC(水至乙腈)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为243.1。m/z的实验测定值为244.1。
实例9:标记物20的合成
步骤1:
在氩气气氛下,向N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2.06mmol)的10mL无水THF溶液中加入α,α′-二溴-对二甲苯(2.27mmol)。然后滴加DIPEA(4.54mmol),然后将反应混合物回流24小时。冷却至室温后,将反应混合物用水稀释并用CH2Cl2萃取。收集有机相并在真空下干燥。将粗产物通过色谱法纯化(洗脱液:己烷/EtOAc 100∶0→80∶20)。获得产物,为白色固体(264mg,37%产率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 4.47(s,2H)5.19(s,2H)7.40(d,J=8.03Hz,2H)7.51(d,J=8.16Hz,2H)7.70-7.77(m,2H)7.77-7.84(m,2H)。
13C NMR(101MHz,氯仿-d)δppm 32.85(1C)77.19(1C)79.30(2C)123.53(2C)128.82(1C)129.22(2C)130.17(2C)133.92(2C)134.47(2C)138.86(2C)163.45(2C)。
HPLC-MS(m/z)[M+H]+计算值346.00733,实测值346.19。
步骤2:[4-[(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧甲基]苯基]甲基-三甲基-溴化铵的合成(标记物16)
将N-[[4-(溴甲基)苯基]甲氧基]邻苯二甲酰亚胺(0.37mmol)溶解在无水CH2Cl2(2.5mL)中并加入TMA溶液(1M THF溶液,0.45mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。通过过滤收集白色固体并用CH2Cl2洗涤。获得产物,为白色固体(130mg,85%产率)。
1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm3.08(s,9H)4.59(s,2H)5.24(s,2H)7.56-7.65(m,2H)7.68(br d,J=8.03Hz,2H)7.83(s,4H)。
13C NMR(101MHz,乙腈-d3)δppm 52.29(3C)68.33(2C)78.83(2C)123.15(2C)128.71(2C)128.95(2C)130.28(2C)133.12(2C)134.76(2C)136.96(2C)163.45(2C)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值325.15467,实测值325.35。
步骤3:[4-(氨基氧甲基)苯基]甲基-三甲基-氯化铵的合成(标记物20)
将[4-[(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧甲基]苯基]甲基一三甲基-溴化铵(0.30mmol)溶解在CH3CN(2mL)中。添加KOH的水溶液(0.33mmol,1mL)并将溶液回流4小时。然后加入浓盐酸(200μL),并将溶液在室温下搅拌过夜。在真空下去除溶剂后,并将粗化合物通过制备型HPLC纯化。得到化合物,为白色固体(阴离子交换后的氯化物盐,23mg,34%产率)。
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-20min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
20-24min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
24-34min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
34-40min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
40-50min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 3.11(s,9H)4.55(s,2H)5.09(s,2H)7.57-7.66(m,4H)。
13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δppm 53.27(3C)69.95(1C)77.29(1C)130.42(1C)131.07(2C)134.62(2C)137.33(1C)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值195.14919,实测值195.35。
实例10:标记物21的合成
将二溴-对二甲苯(1mmol)和三苯基膦(0.5mmol)在氩气气氛下在无水甲苯中合并并在80℃搅拌90分钟。冷却至室温后,过滤产物,用甲苯洗涤并经由RP HPLC(乙腈,水,RP=反相)纯化。
LC-ESI+m/z(计算值)=445.1;m/z(实测值)=445.2
实例11:标记物22的合成
将二溴-对二甲苯(1mmol)和500μL 0.1M三甲基膦的THF溶液溶解在3mL甲苯中并在80℃下搅拌60分钟。冷却至室温后,过滤产物,用甲苯洗涤并经由RP HPLC(乙腈,水)纯化。
LC-ESI+m/z(计算值)=259.0;m/z(实测值)=259.1
实例12:标记物25的合成
将二溴-对二甲苯(1mmol)和三苯基膦(0.5mmol)在氩气气氛下在无水甲苯中合并并在80℃搅拌90分钟。冷却至室温后,过滤产物,用甲苯洗涤并经由RP(乙腈,水)纯化。
LC-ESI+m/z(计算值)=535.1;m/z(实测值)=535.1
标记物-分析物衍生物(复合物)的制备和经由MS对其进行分析
本公开中提到的标记物可以与分析物偶联,例如,睾酮、维生素D、雌二醇或其衍生物。这示例如下所示。本发明不限于以下实例:
实例13:标记物-睾酮衍生物(复合物)的制备和经由MS对其进行分析
实例13.1:标记物7-睾酮衍生物的制备
将315mg标记物7溶解在13mL乙酸乙酯和5mL冰醋酸中,加入睾酮并将反应物在40℃搅拌30分钟,然后在40℃真空浓缩。将粗混合物通过RP HPLC(水至乙腈)纯化。LC-ESI+m/z的计算值为478.7。m/z的实验测定值为278.4。
可以相应地制备其他复合物。例如:
实例13.2:标记物3-睾酮衍生物
LC-ESI+m/z(计算值)=498.7;m/z(实测值=实验测定)=498.3
实例13.3:标记物10-睾酮衍生物
LC-ESI+m/z(计算值)=508.7;m/z(实测值)=508.3
实例13.4:使用标记物1至标记物14分析睾酮衍生物的衍生化
在甲醇中制备500ng/mL的睾酮溶液(S1)。加入与溶液(S1)相比,包含稀释在甲醇中的过量衍生化试剂(标记物1、标记物14或标记物20)中任一种(摩尔比>1000)的溶液(S2),并且用冰乙酸(20%v/v)使其酸化。将溶液S1和S2混合后产生溶液S3,在65℃下保温2小时,然后在室温下保温12小时。12小时后,用甲醇稀释溶液S3,根据睾酮的分子质量给出五个独立的浓缩水平,分别为1eq睾酮;1/20eq睾酮;1/40eq睾酮;1/100eq睾酮和1/200eq睾酮。选择仍在检测器的线性范围内的1eq,1/200Eq睾酮在所用仪器的检测限以下。对于更高灵敏度的仪器,调整浓度以适应适当的系统检测限。例如,Waters Quattro Micro系统采用了以下浓度(100ng/ml;5ng/ml;2,5ng/ml;1ng/ml;500pg/ml)。用溶液S2制备0ng/ml的空白溶液。
在分析物分子衍生化后,可能得到衍生物异构体,其往往产生多个峰。需要量化各自的性质来解决这些异构体的色谱行为问题。例如,图1描述了在5%的绝对峰高下应用某种色谱方法的信号随时间的分布。参数“分裂”描述了色谱系统分离衍生化反应产生所述分析物分子异构体的能力。如果使用反相色谱材料进行分离,在异构体峰的重心测量的保留时间可以描述由此所得的衍生物的极性。面积A1和A2以信号计数*min来测量,并分别以各自的比例报告所产生的衍生异构体。如果峰A1和A2的比例为50/50,则生成的异构体数量相同。如果标记物影响该比率,使其不等于50/50,则主要产生一种异构体。因此,信号强度分布不均,并因此提高信号高度以对抗未受到影响的背景噪声。
对于每一种标记物质,经液相色谱分离后,用电喷雾电离质谱分析已测定其各自的睾酮衍生物,并且已执行碰撞能量为15V、20V、25V、30V、35V和40V时的不同碎裂扫描。
分子离子峰和最丰富的碎片离子峰(中性丢失或特定主碎片)的质量信号已用于碎裂优化。如果涉及到中性丢失和或优选的碎裂途径单元带电分子的信号增益,则碎裂能量是最重要的调谐参数之一。碎裂能量至关重要,因为在源和进一步的离子路径条件下,分子需要不裂开。中性丢失碎片的裂开或裂解只应发生在碰撞池(和/或相关设备)中,以形成特定的目标碎片。如果对所述中性丢失碎片的裂解需要很高的碰撞能量,还会出现其他多余的导致中性丢失碎裂路径的信号强度丢失的碎裂路径。因此,要获得最佳的碎裂行为,所述碰撞能量不应过小,也不应过大。由各自的碰撞能量计算的面积中的最大值已用于进一步的检测限量化方法。
对于每一种标记物质,各自的睾酮衍生物经由在液相色谱法下注射到质谱仪质谱中已完成其在三重四极杆质谱仪上的调谐。所述调谐参数为碰撞能量,它可在五次独立碰撞能量实验中生成各色谱峰的最高信号。优化的MS参数已应用于点(C)的一般LC和MS参数。
色谱和MS参数
·极性 ES+
·校准 静态2
·毛细管电压(kV) 3.00 3.00
·锥孔电压(V) 50.00 53.36
·提取器电压(V) 3.00 3.54
·RF透镜电压(V) 0.2 0.2
·源温度(℃) 140 138
·脱溶剂温度(℃) 350 348
·锥孔气流速(L/Hr) 50 49
·脱溶剂气流速(L/Hr) 650 646
·LM1分辨率 5.0
·HM1分辨率 15.0
·离子能量1 1.0
·入口 50 -65
·碰撞 2 -15
·出口 50 -65
·LM 2分辨率 5.0
·HM 2分辨率 15.0
·离子能量2 1.0
·倍增器(V) 650 -647
·注射泵流速(uL/min) 40.0
·气室皮拉尼压力vmbar) 1.87e-4
·仪器参数-功能2:
·极性 ES+
·校准 静态2
·毛细管电压(kV) 3.00 3.00
·锥孔电压(V) 50.00 53.36
·提取器电压(V) 3.00 3.54
·RF透镜电压(V) 0.2 0.2
·源温度(℃) 140 138
·脱溶剂温度(℃) 350 348
·锥孔气流速(L/Hr) 50 49
·脱溶剂气流速(L/Hr) 650 646
·LM 1分辨率 5.0
·HM 1分辨率 15.0
·离子能量1 1.0
·入口 50 -65
·碰撞 2 -15
·出口 50 -65
·LM 2分辨率 5.0
·HM 2分辨率 15.0
·离子能量2 1.0
·倍增器(V) 650 -647
·注射泵流速(uL/min) 40.0
·气室皮拉尼压力(mbar) 1.87e-4
·仪器参数-功能3:
·极性 ES+
·校准 静态2
·毛细管电压(kV) 3.00 3.00
·锥孔电压(V) 50.00 53.36
·提取器电压(V) 3.00 3.54
·RF透镜电压(V) 0.2 0.2
·源温度(℃) 140 138
·脱溶剂温度(℃) 350 348
·锥孔气流速(L/Hr) 50 49
·脱溶剂气流速(L/Hr) 650 646
·LM 1分辨率 5.0
·HM 1分辨率 15.0
·离子能量1 1.0
·入口 50 -65
·碰撞 2 -15
·出口 50 -65
·LM 2分辨率 5.0
·HM 2分辨率 15.0
·离子能量2 1.0
·倍增器(V) 650 -647
·注射泵流速(uL/min) 40.0
·气室皮拉尼压力vmbar) 1.87e-4
·ACE实验记录
·---------------------运行方法参数----------------
·Waters Acquity SDS
·运行时间:10.00min
·注释:
·溶剂选择A:A1=0.1%甲酸的水溶液
·溶剂选择B:B1=0.1%甲酸的甲醇溶液
·低压限:0.000bar
·高压限:1034.200bar
·溶剂名称A:水
·溶剂名称B:乙腈
·开关1:无变化
·开关2:开
·开关3:无变化
·密封垫清洗:5.0min
·出图1:系统压力
·出图2:%B
·系统压力数据通道:是
·流速数据通道:否
·%A数据通道:否
·%B数据通道:否
·初级A压力数据通道:否
·蓄能器A压力数据通道:否
·初级B压力数据通道:否
·蓄能器B压力数据通道:否
·脱气器压力数据通道:否
·【梯度表】
·时间(min)流速%A%B曲线
·1.初始0.400 98.0 2.0
·2.7.00 0.400 20.0 80.0 6
·3.7.10 0.400 0.0 100.0 6
·4.8.00 0.400 0.0 100.0 6
·5.8.10 0.400 98.0 2.0 6
·6.10.00 0.400 98.0 2.0 6
·运行事件:是
·【事件表】
·运行时间(min)事件动作参数
·1.0.10开关2开0.00
·2.3.50开关2关0.00
·3.9.00开关2开0.00
·Waters996 PDA
·开始波长(nm) 210.00
·结束波长(nm) 400.00
·分辨率(nm) 1.2
·采样速率(张谱图/秒) 2.000
·滤波器响应 1
·曝光时间(ms) 自动
·插入656 是
·采集停止时间(min) 10.00
·保存至磁盘: 是
·Waters996 PDA模拟通道1
·输出模式 关
·Waters996 PDA模拟通道2
·输出模式 关
·
·Waters Acquity AutoSampler
·运行时间:10.00min
·注释:
·加载之前:已禁用
·环选项:部分环,针溢出
·环离线:禁用
·弱清洗溶剂名称:甲醇
·弱清洗体积:600uL
·强清洗溶剂名称:甲醇
·强清洗体积:200uL
·目标柱温:40.0C
·柱温报警带:20.0C
·目标样品温度:10.0C
·样品温度报警带:10C
·满环进样溢流系数:自动
·注射器抽出率:自动
·针放置:自动
·吸气前气隙:自动
·吸气后气隙:自动
·柱温数据通道:是
·环境温度数据通道:是
·样品温度数据通道:否
·样品管理器温度数据通道:否
·样品压力数据通道:否
·开关1:无变化
·开关2:开
·开关3:无变化
·开关4:无变化
·出图:样品压力
·样品温度报警:启用
·柱温报警:启用
·运行事件:是
·【事件表】
·运行时间(min)事件动作
·1.0.10开关2开
·2.3.00开关2关
·3.3.10开关2切换
·4.8.00开关2脉冲
·5.8.10开关2关
·6.10.00开关2开
·针溢出冲洗:自动
·样品运行进样参数
·进样体积(ul)-10.00
使用DIN EN ISO 32645中描述的程序,从线性校准曲线中获得各自的检测限。增强因子的计算基于标记的分析物检测限(LOD)(例如标记的睾酮检测限(LOD))与未衍生化的分析物LOD(例如未衍生化的睾酮LOD)的比较。工作流程在图2中示出。结果如下表5所示。
表5:
从表5中可以看出,与未衍生化的分析物相比,所有呈现的衍生物或复合物都表现出信号增强。几乎所有新结构的衍生物(标记物2除外)都优于最先进的衍生剂,例如来自Sciex的Girard T和Amplifex。
实例14:标记物-维生素D衍生物(复合物)的制备和经由MS对其进行分析
实例14.1:TAD(三唑啉二酮)与维生素D的一般反应
将25-羟基维生素D一水合物(0.024mmol)和TAD衍生物(0.036mmol)溶解在CH3CN中。将溶液在室温(r.t.)搅拌10分钟。观察到维生素D完全转化为相应的产物。在真空下去除溶剂后,并将残余物通过制备型HPLC纯化。产品以固体形式获得。
实例14.2:尿唑原位活化为TAD试剂(标记物15)以及与维生素D的反应
将25-羟基维生素D一水合物(0.024mmol)和[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵(0.029mmol)溶解在MeOH(500μL)中。将碘苯二乙酸酯(0.033mmol)的MeOH溶液添加到第一溶液中。将反应混合物在室温搅拌15分钟。观察到维生素D完全转化为相应的产物。在真空下去除溶剂后,并将残余物通过制备型HPLC纯化。获得纯产物,为白色固体。
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-20min:5%H2O 0.1%TFA;95%CH3CN 0.1%TFA;
20-40min:5%H2O 0.1%TFA;95%CH3CN 0.1%TFA;
40_45min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
45-50min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
50-55min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
55-65min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.52(s,3H)0.87-1.01(m,4H)1.15(s,6H)1.19-1.47(m,12H)1.65-1.78(m,4H)1.83-1.92(m,2H)1.95-2.08(m,4H)2.15-2.30(m,2H)2.86-2.94(m,1H)3.12(s,9H)4.06-3.86(m,2H)4.12-4.23(m,1H)4.56(s,2H)5.01-5.11(m,1H)7.62-7.74(m,4H)。
LC-ESI+m/z的计算值为647.45308。m/z的实验测定值为647.49。
实例14.3:使用上文或下文提到的示例性标记物分析维生素D的衍生化
在甲醇中制备500pg/mL的25-OH维生素D3溶液(S1)。以1mL马血清+3mL甲醇的比例使用甲醇(-20℃)去除马血清。混合马血清/甲醇混合物并离心,转移上清液以得到溶液(S2)。将溶液S1和S2以1∶5的比例混合,得到溶液S3。将溶液S3浓缩至干燥。加入与溶液(S3)相比,包含稀释在甲醇中的过量衍生化试剂标记物中的任一种(摩尔比>1000)的溶液(S4),并且将所得溶液混合。加入2mg/mL的碘苯二乙酸的甲醇溶液(S5),并将所得溶液(S6)在40℃搅拌2分钟。溶液S6用甲醇/H2O+0.1%甲酸稀释,以提供合适的浓度水平用于定量。
使用DIN EN ISO 32645中描述的程序,从线性校准曲线中获得各自的检测限。增强因子的计算基于标记的维生素D检测限(LOD)与未衍生化的维生素D的LOD的比较。复合物的结果如下表6所示。
表6:
维生素D的所有衍生物或与维生素D的复合物都表现出显着的信号增强。未检测到衍生物的异构体。因此保留时间和分裂以及峰宽的参数不是必需的,因此在本公开中没有呈现。
在实施例中,复合物可以选自以下组:
实例15:标记物-雌二醇衍生物(复合物)的制备和经由MS对其进行分析
实例15.1:[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵与雌二醇(包含标记物15和雌二醇或其衍生物的复合物)的反应
将[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑-4-基)苯基]甲基-三甲基-三氟乙酸铵(0.05mmol)溶解在CH3CN(200μL)中,并加入DBH(0.05mmol)。溶液迅速变红,在室温下搅拌10分钟。然后将该溶液滴加到β-雌二醇(0.05mmol)的CH3CN/磷酸盐缓冲液1∶1(1.2mL)溶液中。在室温搅拌30分钟后,在真空下去除溶剂。将粗产物通过制备型HPLC纯化并以3:1的比例分离出两种异构体A和B。
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-60min:50%H2O 0.1%TFA;50%CH3CN 0.1%TFA;
60-65min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
65-75min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
75-80min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
80-90min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
异构体A:
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.77(d,J=2.51Hz,3H)1.12-1.58(m,7H)1.65-1.76(m,1H)1.90-2.10(m,3H)2.12-2.26(m,1H)2.34(br d,J=12.92Hz,1H)2.71-2.84(m,1H)2.86-2.96(m,1H)3.13(s,9H)3.61-3.70(m,1H)4.57(s,2H)6.78(d,J=8.53Hz,1H)7.31(d,J=8.66Hz,1H)7.67-7.73(m,2H)7.73-7.79(m,2H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值519.29658,实测值519.45。
异构体B:
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.78(s,3H)1.15-1.58(m,7H)1.65-1.77(m,2H)1.86-2.09(m,2H)2.13-2.22(m,1H)2.25-2.33(m,1H)2.82(br dd,J=8.16,3.76Hz,2H)3.13(s,9H)3.65(br t,J=8.66Hz,1H)4.54-4.61(m,2H)6.68(s,1H)7.34(s,1H)7.66-7.73(m,2H)7.73-7.79(m,2H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值519.29658,实测值519.33。
实例15.2:标记物16-雌二醇衍生物的制备
将β-雌二醇(0.09mmol)、N-[4-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-5-氟-2,4-二硝基苯胺(0.11mmol)和K2CO3(0.18mmol)溶解在无水DMF(1mL)中。在室温搅拌1小时后,加入MeI(0.14mmol)并将溶液在室温搅拌过夜。将溶液用1M HCl酸化并在真空下去除溶剂。将粗化合物通过制备型HPLC纯化,得到黄色固体。制备型HPLC对于技术人员来说是已知的并且因此不进行详细解释。
HPLC方法C-18柱:
0min:80%H2O 0.1%TFA;20%CH3CN 0.1%TFA;
0-60min:30%H2O 0.1%TFA;70%CH3CN 0.1%TFA;
60-64min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
64-74min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
74-80min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
80-90min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.78(s,3H)1.17-1.45(m,6H)1.47-1.58(m,1H)1.63-1.78(m,1H)1.84-1.94(m,1H)1.94-2.11(m,2H)2.11-2.18(m,1H)2.23-2.38(m,1H)2.82(br dd,J=8.41,4.14Hz,2H)3.05-3.12(m,9H)3.67(t,J=8.60Hz,1H)4.47(s,2H)6.56-6.64(m,1H)6.82(d,J=2.64Hz,1H)6.86(dd,J=8.53,2.64Hz,1H)7.31(d,J=8.28Hz,1H)7.35-7.42(m,2H)7.45-7.54(m,2H)9.05(s,1H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值601.30206,实测值601.39。
实例15.3:标记物17-雌二醇衍生物的制备
如WO 2000009498 A1中所报道的合成N-(对氯磺酰基苯基甲基)溴化吡啶鎓。
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-60min:30%H2O 0.1%TFA;70%CH3CN0.1%TFA;
60-64min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
64-74min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
74-80min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
80-90min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.75(s,3H)1.11-1.56(m,7H)1.62-1.75(m,1H)1.80-1.89(m,1H)1.90-2.08(m,2H)2.10-2.20(m,1H)2.23-2.32(m,1H)2.67-2.75(m,2H)3.64(t,J=8.60Hz,1H)5.97(s,2H)6.61-6.75(m,2H)7.19(d,J=8.41Hz,1H)7.66(d,J=8.16Hz,2H)7.90(m,J=8.28Hz,2H)8.17(t,J=7.09Hz,2H)8.59-8.72(m,1H)9.09(d,J=5.77Hz,2H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值504.22030,实测值504.28。
实例15.4:雌二醇与磺酰氯衍生试剂的一般反应(例如标记物23和标记物24)
将β-雌二醇(0.07mmol)和磺酰氯衍生物(0.07mmol)溶解在无水CH3CN(2mL)中。然后加入碱溶液(TMA或TEA,0.21mmol)并将溶液在室温下搅拌过夜。在真空下去除溶剂后,并将粗化合物通过制备型HPLC纯化。纯化产物以固体形式获得。
实例15.4.1:标记物24-雌二醇衍生物的制备
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-60min:20%H2O 0.1%TFA;80%CH3CN 0.1%TFA;
60-64min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
64-74min:2%H2O 0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
74-80min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
80-90min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.75(s,3H)1.11-1.55(m,7H)1.59-1.77(m,1H)1.81-1.90(m,1H)1.90-2.07(m,2H)2.11-2.22(m,1H)2.28(dq,J=13.32,3.59Hz,1H)2.70-2.78(m,2H)3.13(s,9H)3.64(t,J=8.66Hz,1H)4.63(s,2H)6.69-6.74(m,2H)7.22(d,J=9.16Hz,1H)7.80(d,J=8.41Hz,2H)7.98(d,J=8.41Hz,2H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值484.25160,实测值484.31。
实例15.4.2:标记物23-雌二醇衍生物的制备
HPLC方法C-18柱:
0min:100%H2O 0.1%TFA;0%CH3CN 0.1%TFA;
0-60min:30%H2O0.1%TFA;70%CH3CN 0.1%TFA;
60-64min:2%H2O0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
64-74min:2%H2O0.1%TFA;98%CH3CN 0.1%TFA;
74-80min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
80-90min:60%H2O 0.1%TFA;40%CH3CN 0.1%TFA;
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.77(s,3H)1.15-1.58(m,8H)1.64-1.77(m,1H)1.85-2.10(m,4H)2.24(br d,J=11.42Hz,1H)2.34(br dd,J=13.49,3.45Hz,1H)2.85(brdd,J=8.47,3.95Hz,2H)3.11(s,9H)3.66(t,J=8.53Hz,1H)4.54(s,2H)4.77(s,2H)6.92(d,J=2.64Hz,1H)6.97(dd,J=8.47,2.70Hz,1H)7.33(d,J=8.41Hz,1H)7.56-7.63(m,2H)7.63-7.69(m,2H)。
HPLC-MS(m/z)[M]+计算值498.26725,实测值498.42。
实例15.5:使用标记物15、标记物17、标记物23和标记物24分析雌二醇的衍生化
在乙腈中制备500pg/mL的雌二醇溶液(S1)。以1mL马血清+3mL乙腈的比例使用乙腈(-20℃)去除马血清。混合马血清/乙腈混合物并离心,转移上清液以得到溶液(S2)。将溶液S1和S2以1:5的比例混合,得到溶液S3。加入与溶液(S3)相比,包含稀释在甲醇中的过量衍生化试剂(标记物10至标记物12)中的任一种(摩尔比>1000)的溶液(S4)。在乙腈/H2O90/10+0.1%甲酸中制备5μg/mL K2CO3(S5)溶液。将溶液S3、S4和S5混合后产生溶液S6,在50℃下保温1小时,然后在室温下保温12小时。将溶液S6用乙腈/H2O+0.1%甲酸稀释,以提供合适的浓度水平用于定量。
使用DIN EN ISO 32645中描述的程序,从线性校准曲线中获得各自的检测限。增强因子的计算基于标记的雌二醇检测限(LOD)与未衍生化的雌二醇的LOD的比较。结果如下表7所示。
表7:
从表7中可以看出,在这种情况下的雌二醇,与未衍生化的分析物相比,所有呈现的衍生物或复合物都表现出信号增强。
实例16:经由MS分析标记的20种分析物衍生物(复合物)
如上所述合成复合物和标记物20。
使用DIN EN ISO 32645中描述的程序,从线性校准曲线中获得各自的检测限。增强因子的计算基于标记的分析物检测限(LOD)与未衍生化的分析物的LOD的比较。结果如下表8所示。
表8:
从表8中可以看出,与未衍生化的分析物相比,标记物20表现出10倍的信号增强。
上述化合物和示例性标记物可以与每种合适的分析物组合。示例性标记物或示例性分析物不应限制保护范围。技术人员知道如何将其他公开的分析物与公开的化合物组合以形成本发明的复合物。
该专利申请请求欧洲专利申请20175798.6的优先权,其中该欧洲专利申请的内容通过引用并入本文。
Claims (14)
1.一种用于分析物的质谱测定的式I化合物,
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与所述分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵,B1或B5为所述偶联基团Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子,其中所述偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且所述偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
3.根据权利要求2所述的化合物,其中K能够与所述分析物的羰基基团、酚基团、胺、羟基基团或二烯基团反应。
4.根据权利要求2或3所述的化合物,其中K选自由以下项组成的组:酰肼、肼、羟胺、Br、F-芳族、4-取代的1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、活性酯、磺酰氯和反应性羰基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中Q选自由以下项组成的组:甲基酰肼、甲基肼、甲基羟胺、氧胺、4-甲基-氧基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(CH2-O-TAD)、2,4-二硝基-5-氟苯胺衍生物、氯磺酰基和甲磺酰氯。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中A3选自由以下项组成的组:吡啶鎓、三甲基铵、鏻、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、二甲基乙铵、甲基二乙铵和三烷基铵。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中A3为NR1R2R3或PR4R5R6,其中R1、R2、R3、R4、R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、丙基、经取代的苯基、未经取代的苯基、烷基、经修饰的烷基、短链烷基。
9.一种组合物,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
10.一种试剂盒,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9所述的组合物。
11.一种用于使用质谱测定来检测分析物的复合物,其包含彼此共价连接的结合分析物和结合化合物,特别是其中所述结合化合物包含式III,
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为与所述分析物形成共价键的偶联基团Q*,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中所述偶联基团Q*包含式IV,
其中n*为0、1、2、3、4或5,
其中所述结合分析物经由K*共价键合,
其中X*为式III的苯基基团的碳原子,
其中如果A3为铵且B1或B5为所述偶联基团Q*,所述偶联基团Q*包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且所述偶联基团Q*包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物用于所述分析物的质谱测定的用途,特别是其中所述质谱测定包括串联质谱测定,特别是三重四极杆质谱测定。
13.一种用于分析物的质谱测定的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述分析物与如权利要求1至9中任一项中所定义的式I化合物反应,从而形成如权利要求11中所定义的复合物,
(b)对来自步骤(a)的所述复合物进行质谱分析,特别是其中质谱分析步骤(b)包括:
(i)使所述复合物的离子进入质谱分析的第一级,从而根据所述复合物的离子的质荷(m/z)比对所述复合物的离子进行表征,
(ii)使复合物离子碎裂,从而释放出第一实体,特别是第一中性实体,特别地低分子量中性实体,并且生成所述复合物的子离子,其中所述复合物的子离子在其m/z比上不同于所述复合物离子,以及
(iii)使所述复合物的子离子进入质谱分析的第二级,从而根据所述复合物的子离子的m/z比对所述复合物的子离子进行表征,并且/或者
其中(ii)可进一步包括所述复合物离子的另一种碎裂,从而释放出不同于所述第一实体的第二实体,特别是第二中性实体,并且生成所述复合物的第二子离子,并且
其中(iii)可进一步包括使所述复合物的第一子离子和第二子离子进入质谱分析的第二级,从而根据所述复合物的第一子离子和第二子离子的m/z比对所述复合物的第一子离子和第二子离子进行表征。
14.一种式V化合物:
其中取代基B1、B2、B3、B4、B5中的一者为能够与分析物形成共价键的偶联基团Q,
其中其他取代基A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5各自独立地选自氢、卤素、烷基、经修饰的烷基、N-酰基氨基、N,N-二烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、氰基、烷氧基羰基、烷氧基硫代羰基、酰基、硝基、硫代酰基、芳酰基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、氰基甲基、氰基乙基、羟基乙基、甲氧基乙基、硝基乙基、酰氧基、芳酰基氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、硫、其同位素或衍生物,
其中A3包含铵、吡啶鎓、鏻或其衍生物,
其中如果A3为铵,B1或B5为所述偶联基团Q,其中Q不含选自O、N、S、Br的至少一个原子,其中所述偶联基团Q包含通过四个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子并且所述偶联基团Q包含通过五个单键或双键与CA1A2A3取代基的C原子分隔的C原子。
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