CN110383071B - 用于质谱的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适用于质谱测定分析物分子如碳水化合物的试剂,以及这种试剂和分析物分子的加合物以及所述试剂和加合物的应用。此外,本发明涉及用于质谱测定分析物分子的方法。
Description
描述
本发明涉及适于质谱测定分析物分子如碳水化合物的试剂以及这种试剂和分析物分子的加合物和所述试剂和加合物的应用。此外,本发明涉及用于质谱测定分析物分子的方法。
在过去十年中,生物学和医学研究的重点是碳水化合物在活细胞或生物体中的作用和功能。碳水化合物可以附着于蛋白质、脂质或其他有机分子,由此提供特征性复杂糖基化模式。最近,已经观察到某些病症与糖基化模式的改变相关,伴随糖基化模式的改变或由糖基化模式的改变引起。特别是肿瘤病症通常与各种蛋白质的糖基化改变有关。
可以使用多种技术分析碳水化合物,包括色谱分离技术,如高效液相色谱(HPLC)或毛细管电泳或质谱(MS)。
MS是一种广泛使用的技术,用于定性和定量分析范围从小分子到大分子的化学物质。一般来说,它是一种非常敏感和特异的方法,甚至允许分析复杂的生物学(例如环境或临床)样品。
对于单糖、寡糖或多糖的分析,MS已与色谱技术相结合,特别是气相和液相色谱,如HPLC。由此,将碳水化合物分子通过色谱程序分离,然后单独进行质谱分析。由于碳水化合物经常以同重(区域和/或立体异构)结构存在,因此并不总是可以进行色谱分离。因此,MS还已经与离子迁移单元结合使用,该单元允许分离同重碳水化合物。
然而,仍然需要增加MS分析方法的灵敏度,特别是对于通过MS分析具有低丰度的碳水化合物,或者当仅有少量材料(例如活检组织)可用时。
MS不是定量的,因为信号强度反映了电离特性,并且因称为离子抑制的过程而强烈地受到污染物的影响。因此,需要使MS分析成为定量分析。
本发明涉及用于MS的新型试剂,其允许极其灵敏地测定生物样品中的分析物分子如碳水化合物。此外,使用试剂的同位素修饰版本允许获得准确的定量MS数据以用于比较研究。该试剂已成功用于基因组中糖结构的直接、超灵敏和定量分析。通过碱基切除修复产生的稀有无碱基位点(AP位点)和β-消除产物(βE位点)被确定为靶分子。发现该试剂具有极高的灵敏度。
发明概述
因此,本发明的第一方面是通式(I)的化合物
X – L1– Y (– L2– Z)r (I)
或包含至少一种化合物(I)的组合物或试剂盒用于质谱测定分析物分子的用途
其中,
X是能够与分析物分子反应的反应基团,由此形成与分析物分子的共价键,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个带电荷的部分,特别是永久带电荷的部分,
r是0或1,
包括其任何盐。
在一个具体方面,化合物(I)可以作为同位素体(isotopologue)存在,即其中一种或多种主要同位素(本文也称为化合物的同位素中性原子,例如1H、12C、14N和/或16O原子)已被次要稳定同位素(即稳定同位素,例如D、13C、15N和18O)替代的化合物。
本发明的另一方面是用于质谱测定样品中分析物分子的方法,包括以下步骤:
(a) 使分析物分子与如本文所定义的式(I)的化合物共价反应,由此形成分析物分子和化合物(I)的共价加合物,和
(b) 对来自步骤(a)的加合物进行质谱分析。
本发明的又一方面是通式(Ia)的化合物:
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
或包含至少一种化合物(Ia)的组合物或试剂盒,
其中
X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团,条件是X不是丙烯酸酯,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个永久带正电荷的部分的电荷单元,
包括其任何盐。
在另一方面,本发明涉及式(Ia)的化合物,
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
或包含至少一种化合物(Ia)的组合物或试剂盒,
其中,
X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团或羟基反应基团,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个带负电荷的部分的电荷单元,
包括其任何盐。
本发明还涉及试剂的组合物或试剂的试剂盒,其包含至少一种化合物(Ia),特别是多种化合物(Ia)的同位素不同物质。
根据本发明的另一方面,式(I)的化合物和分析物分子(特别是包含碳水化合物部分的分析物分子)的共价加合物可用于质谱测定。加合物可以通过使样品中存在的分析物分子与化合物(I)反应来产生。然而,加合物也可以作为纯物质提供以用作校准物和/或标准物。
本发明的又一方面是通过化合物(I)和分析物分子的反应形成的共价加合物。加合物可以是通式(II)的化合物:
T – X' – L1– Y( – L2– Z)r (II)
其中,
T是分析物分子,
X'是由化合物(I)上的反应基团X与分析物分子的反应得到的部分
X是能够与分析物分子反应的反应基团,由此形成与分析物分子的共价键,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个带电荷部分的电荷单元,
r是0或1,
包括其任何盐。
具体实施方案是通过化合物(Ia)和分析物分子的反应形成的共价加合物,由式(IIa)表示:
T – X' – L1– Y – L2– Z (IIa)
其中,
T是分析物分子,
X'是由化合物(Ia)上的反应基团X与分析物分子的反应得到的部分
X是能够与分析物分子反应的反应基团,由此形成与分析物分子的共价键,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,和
Z是包含至少一个带电荷部分的电荷单元,
包括其任何盐。
实施方案
本发明涉及通过MS测定分析物分子。分析物分子可以是能够与本发明化合物(I)上的反应基团X形成共价键的任何物质。例如,分析物可以是生物分子,其选自碳水化合物(包括改性碳水化合物,例如具有氨基、N-乙酰基、硫酸酯和/或羧酸酯基团的碳水化合物以及脱氧或甲基改性的碳水化合物)、氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、脂质、类固醇、酮类固醇、开环甾类化合物、核苷、核苷酸、核酸和其他生物分子(包括小分子代谢物和辅因子)以及药物、农药、毒素或其代谢物。这种分析物分子可以存在于生物、临床或环境样品中,例如体液(如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脊髓液等)、组织或细胞提取物等。在一些实施方案中,分析物分子可以存在于样品中,所述样品是纯化的或部分纯化的样品,例如纯化或部分纯化的蛋白质混合物或提取物。
根据本发明,选自碳水化合物和含有酚基和酮基的化合物(例如类固醇如睾酮和雌二醇、酮类固醇和开环甾类化合物如维生素D)的分析物分子是特别有意义的并且可以使用本文所述的试剂来测定。
分析物分子可以在样品制备工作流内的不同阶段被衍生化。在本公开的上下文中,术语“衍生化”或“衍生”是指分析物与化学化合物如本发明的式(I)的化合物的反应。因此,术语“衍生试剂”是指用于衍生分析物的化合物。分析物分子可以在样品的预处理之后,在样品的第一次富集之后,或在样品的第二次富集之后被衍生化。
包含分析物分子的样品可以通过各种方法预处理和/或富集。预处理方法取决于样品的类型,例如血液(新鲜的或干燥的)、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)、组织、尿液或唾液。
特别是,如果样品是全血样品,则将其分配到两个预先确定的样品预处理(PT)工作流中的一个,两个工作流均包括添加内标(IS)和溶血试剂(HR),然后是预先确定的孵育期(Inc),其中两个工作流之间的差异是添加内标(IS)和溶血试剂(HR)的顺序。在另外的步骤中,加入衍生试剂,例如上文或下文公开的本发明化合物,然后是孵育期。内标(IS)通常是已知量的相同的目标分析物(一种或多种),其可以是例如同位素标记的。当分析物(一种或多种)到达质谱仪时,这允许相对比较并且可以实现样品中存在的目标分析物(一种或多种)的明确识别和定量。
如果样品是尿液样品,则将其分配到其他两个预先确定的样品PT工作流中的一个,两个工作流均包括添加内标(IS)和酶试剂(E),然后是预先确定的孵育期 (Inc),其中两个工作流之间的差异是添加内标(IS)和酶试剂(HR)的顺序。酶试剂通常是用于葡糖苷酸切割或蛋白质切割或分析物或基质的任何预处理的试剂。在另外的步骤中,加入衍生试剂,例如上文或下文公开的本发明化合物,然后是孵育期。
如果样品是血浆或血清,则将其分配到另一个预先确定的PT工作流,该工作流包括仅添加内标(IS),然后是预先确定的孵育时间(Inc)。在另外的步骤中,加入衍生试剂,例如上文或下文公开的本发明化合物,然后是孵育期。
可以对这种预处理的样品进一步进行分析物富集工作流。
特别地,分析物富集工作流可以包括向预处理的样品中添加携带分析物选择性基团的磁珠(MB)和任选的珠子粘合剂,然后是预先确定的孵育期(Inc)以捕获目标分析物(一种或多种),其中添加磁珠(MB)可包括搅拌或混合。在与磁珠(MB)一起孵育后,工作流可包括洗涤步骤(W1),并且根据分析物(一种或多种),可能包括一个或多个另外的洗涤步骤(W2)。洗涤步骤(W1,W2)包括一系列步骤,包括通过包含磁体或电磁体的磁珠处理单元进行的磁珠分离(B sep),液体抽吸(Asp.),添加洗涤缓冲液(W.缓冲液),重新悬浮磁珠(Res.),另一磁珠分离步骤(B Sep)和另一液体抽吸(Asp.)。此外,除了体积和数量或洗涤循环的组合之外,洗涤步骤可以在溶剂类型(水/有机物/盐/pH)方面不同。
在最后的洗涤步骤(W1,W2)之后是添加洗脱试剂(ER),然后重新悬浮(Res.)磁珠和预先确定的孵育期(Inc.)以从磁珠释放目标分析物(一种或多种)。然后分离未结合的磁珠(B Sep.),并将含有目标衍生分析物(一种或多种)的上清液直接转移到LC站,或在稀释步骤后通过添加稀释液(Dil.)转移到LC站。通过改变例如溶剂的类型(水/有机物/盐/ pH)和体积也可以使用不同的洗脱程序/试剂。
如果在预处理方法之后没有发生目标分析物的衍生化,则样品中分析物的衍生化可以在使用磁珠的第一富集工作流之后发生。在本文中,在进行洗涤步骤(W1,W2)之后,在洗脱试剂之前、同时或之后,将衍生试剂如上文或下文公开的本发明化合物加入到目标样品中,然后是孵育期(确定的时间和温度)。然后分离未结合的磁珠(B Sep.),并将含有目标衍生分析物(一种或多种)的上清液直接转移到LC站或在稀释步骤后通过加入稀释液(Dil.)转移到LC站。通过改变例如溶剂的类型(水/有机物/盐/ pH)和体积也可以使用不同的洗脱程序/试剂。
另一选择包括在第二分析物富集工作流之后使用衍生试剂如上文或下文公开的本发明化合物的柱后灌注衍生分析物,所述第二分析物富集工作流包括色谱分离(包括但不限于液相色谱或气相色谱),特别是液相色谱。
在特定实施方案中,分析物分子是碳水化合物或具有碳水化合物部分的物质,例如糖蛋白或核苷。例如,分析物分子可以是单糖,例如核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、神经氨酸、N-乙酰神经氨酸等,或者寡糖,例如二糖如蔗糖、麦芽糖或乳糖,或三糖或四糖以及多糖,或包含这种单糖、寡糖或多糖部分的物质。
优选地,分析物分子包含羰基,例如醛或酮基,或掩蔽的醛或酮基,例如半缩醛基团,特别是环状半缩醛基团,其能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键。分析物分子还可包含缩醛基团,其可在与化合物(I)反应之前转化为醛、酮或半缩醛基团。
在其他实施方案中,分析物分子可包含选自氨基、硫醇、羟基、邻二醇、共轭二烯、酚、核碱基、羧基、末端半胱氨酸和末端丝氨酸的基团,其能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键。此外,还预期在本发明的范围内,存在于分析物分子上的基团将首先转化为更容易与化合物(I)的反应基团X反应的另一基团。
含有一个或多个酚基的分析物是特别令人感兴趣的。举例来说,分析物可选自类固醇、类固醇样化合物、雌激素、雌激素样化合物、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇(E3)、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16,17-表雌三醇,和/或其代谢物。在各种实施方案中,代谢物可以是,例如,雌三醇、16-表雌三醇(16-epiE3)、17-表雌三醇(17-epiE3)、16,17-表雌三醇(16,17-epiE3)、16-酮雌二醇(16-ketoE2)、16α-羟基雌酮(16α-OHE1)、2-甲氧基雌酮(2-MeOE1)、4-甲氧基雌酮(4-MeOE1)、2-羟基雌酮-3-甲基醚(3-MeOE1)、2-甲氧基雌二醇(2-MeOE2)、4-甲氧基雌二醇(4-MeOE2)、2-羟基雌酮(20HE1)、4-羟基雌酮(4-OHE1)、2-羟基雌二醇(2-OHE2)、雌酮(E1)、硫酸雌酮(E1s)、17α-雌二醇(E2α)、17β-雌二醇(E2β)、硫酸雌二醇(E2s)、马烯雌酮(EQ)、17α-二氢马烯雌酮(EQα)、17β-二氢马烯雌酮(EQβ)、马萘雌甾酮(EN)、17α-二氢马萘雌甾酮(ENα)、17β-二氢马萘雌甾酮(ENβ)、A8,9-脱氢雌酮(dE1)、A8,9-脱氢雌酮硫酸盐(dE1s)。在一些实施方案中,酚类分析物可以是类固醇或类固醇样化合物,其具有sp2杂化的A环和在A环3-位的OH基团。
含有一个或多个酮基的分析物是进一步令人感兴趣的。优选的实例是酮类固醇,包括但不限于DHT、睾酮、表睾酮、脱氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、醛固酮、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲基醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(脱氢表雄酮)、17-OH孕烯醇酮、17-OH孕酮、17-OH孕酮、雄酮、表雄酮和δ4雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、别孕烯醇酮和醛固酮。
为了促进和改善分析物的MS测量,本发明在第一方面涉及通式(I)的化合物:
X – L1– Y (– L2– Z)r (I)
或包含至少一种化合物(I)的组合物或试剂盒用于质谱测定分析物分子的用途,
其中
X是能够与分析物分子反应的反应基团,由此形成与分析物分子的共价键,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个带电荷的部分,特别是永久带电荷的部分,
r是0或1,
包括其任何盐。
根据本发明的用于MS的化合物(I)包含能够与分析物分子反应的反应基团X,由此形成与分析物分子的共价键。
在实施方案中,可以选择化合物(I)的反应基团X以与分析物分子上的不同官能团反应。决定哪些反应基团X有资格结合目标分析物的官能团是公知常识。分析物分子上的官能团是邻二醇、酚基团、核碱基、氨基、巯基、羟基、1-羟基-2-氨基烷基、1-氨基-2-巯基烷基、酮、1,3-二烯基、烯基、烯丙基、甲酰基和羧酸酯基团。反应基团总结在标准教科书“Bioconjugate Techniques”第3版:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-382239-0.00025-X;和“The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies”,第11版,ed Iain D.Johnson, Life TechnologiesCorporation, 2010;以及综述文章(例如,X. Chen等人, Org. Biomol. Chem., 2016,14,5417-5439;和T. Higashi J Steroid Biochem Mol Biol. 2016Sep;162:57-69)中。
特别地,反应基团X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团。特别地,反应基团X选自胺反应基团、硫醇反应基团、羰基反应基团、亲二烯基团、1,2-二醇反应基团、羧酸酯反应基团、羟基反应基团、1-氨基-2-羟基烷基反应基团、1-氨基-2-巯基反应基团,和在酚的邻位反应的基团。
在一个优选的实施方案中,基团X是羰基反应基团,其能够与任何类型的分子反应,例如,具有羰基的碳水化合物分子。特别地,化合物(I)的碳水化合物反应基团X能够与所有类型的糖反应,包括醛糖,例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖或岩藻糖,和酮糖,例如核酮糖或果糖,以及寡糖,例如二-、三-或四糖,和多糖,其具有可接近的醛或酮基或半缩醛掩蔽的醛或酮基。羰基反应基团可以具有经由相邻的O或N原子通过α-效应强化的超亲核N原子,即NH2-N/O或二硫醇分子。它可以选自:
(i) 肼基团,例如H2N-NH-或H2N-NR1-基团,
其中R1为任选例如被卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代的芳基或C1-4烷基,特别是C1或C2烷基,
(ii) 腙基团,例如H2N-NH-C(O)-或H2N-NR2-C(O)-基团,
其中R2为任选例如被卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代的芳基或C1-4烷基,特别是C1或C2烷基,
(iii) 羟基氨基基团,例如H2N-O-基团,和
(iv) 二硫醇基团,特别是1,2-二硫醇或1,3-二硫醇基团。
在一个优选的实施方案中,反应基团X是酮反应基团,其能够与包含酮基的分析物反应,所述分析物例如酮类固醇,如DHT、睾酮、表睾酮、脱氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、醛固酮、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲基醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(脱氢表雄酮)、17-OH孕烯醇酮、17-OH孕酮、17-OH孕酮、雄酮、表雄酮和δ4雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、别孕烯醇酮和醛固酮。
例如,作为Br/I-CH2-C(O)-的反应性卤代乙酰基、丙烯酰胺/酯基、酰亚胺如马来酰亚胺或甲磺酰基苯基噁二唑可与分析物分子上的亲核基团如硫醇基团反应。氨基反应基团,例如活性酯基,如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-NHS酯,五氟苯酯,方酸酯,羟基苯并三唑(HOBt)酯,或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)酯,或磺酰氯基团可与分析物分子上的氨基反应。如上所述的肼或羟基氨基也可用于与分析物分子上存在的其他亲电子基团反应。
为了与二醇结合,反应基团X可以包含硼酸。或者,可以将二醇氧化成各自的酮或醛,然后与酮/醛反应基团X反应。可以选择作为三唑二酮的亲二烯体作为结合二烯的反应基团X。存在于分析物分子上的酚基团可以通过烯反应与三唑二酮反应(H. Ban等人,J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), pp 1523–1525)或被重氮化或者可替代地被邻位硝化,接着还原成胺,然后胺可以与胺反应试剂反应。
核碱基可以与作为反应基团X的2-氯乙酰基或Pt配合物反应。末端半胱氨酸可以与作为反应基团X的杂芳基/芳基氰化物反应。末端丝氨酸可以被氧化以产生醛基并与已知的醛反应基团X反应。
取决于待测定的分析物分子上存在的官能团,技术人员将为化合物(I)选择合适的反应基团X。
在进一步的实施方案中,反应基团是羧酸酯反应基团,例如,重氮化合物(Chromatographia 2012, 75, 875–881),其可用于前列腺素的衍生。其他众所周知的羧酸酯反应基团是烷基卤化物。众所周知的还是羧酸的活化,然后与亲核试剂如胺或肼反应(A.Kretschmner等人,Journal of Chromatography B,第879卷, 17–18, 2011年5月, 第1393-1401页)。
羟基反应基团是(T. Higashi J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 Sep;162:57-69)磺酰氯、活化的羧酸酯(NHS或咪唑化物)和氟代芳族化合物/杂芳族化合物(能够亲核取代氟)。
在一个优选的实施方案中,反应基团X是酚反应基团,其能够与任何类型的具有酚基团的分子反应,例如类固醇、类固醇样化合物、雌激素、雌激素样化合物、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇(E3)、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16,17-表雌三醇,和/或其代谢物。举例来说,酚反应基团可以是1,2,4-三唑啉-3,5-二酮基团,1,2,4-三唑啉-3,5-二酮也能够充当亲二烯体并且因此可用于检测维生素D、1α,25(OH)2VitD3、1α,25(OH)2VitD2、25(OH)VitD2、25(OH)VitD3和24R,25(OH)2VitD3。
化合物(I)还包含中性离子丢失单元Y。在本申请的上下文中,术语“中性离子丢失单元”是指能够丢失不带电荷的部分的单元。所述部分包括但不限于离子、原子和多个原子。单元Y是中性的,即它不带正电荷或负电荷,并且它通过如下文定义的连接基L1与反应基团X连接。中性单元Y在MS条件下,例如当进行碰撞诱导解离(CID)时,例如在三重四极杆MS中,能够裂解,由此释放中性物质。释放出第一中性物质后,单元Y的其余部分仍保持中性。通常但不是必须地释放一种中性物质,即释放第一中性物质。在特定的实施方案中,释放两种中性物质。
第一中性物质可以是低分子量中性物质,例如,分子量为100或更小,更特别地为80或更小的中性分子。此外,第一中性物质可以是无机分子,例如SO、SO2、CO、CO2、NO、NO2或N2。特别地,中性物质是N2或SO2。更特别地,第一中性物质是N2。导致中性分子丢失的反应可以优选是裂环反应,特别是1,3-偶极裂环反应。在本公开的上下文中,术语“裂环反应”是指任何环加成反应的逆转。
在特定实施方案中,中性离子丢失单元Y包含以下物质或由以下物质组成:环状部分(例如环状酮如双环[2.2.1]庚二烯-7-酮已知丢失CO),特别是杂环部分,更特别是6-、5-或4-元杂环部分,其能够裂解,由此释放如上所述的第一中性物质。这种(杂)环状基团通过逆(杂)环加成反应容易地显示出裂解,由此释放中性物质。
优选地,中性离子丢失单元Y包含以下物质或由以下物质组成:5-或6-元杂环部分,所述杂环部分具有至少两个彼此相邻的例如在1,2-位的杂原子,例如N、O和/或S原子,特别是N原子,例如环状偶氮化合物和5-元环,其选自三唑(特别是1,2,3-三唑)、四唑、四嗪、1,2,3-氧杂-或硫杂-二唑,或其氢化衍生物。可以向上述杂环中并入另外的环,例如,苯并噻二唑或苯并三唑。杂环可以部分氢化,例如 2,5-二氢吡咯和2,5-二氢噻吩1,1-二氧化物。
在一个尤其优选的实施方案中,5-元杂环部分是三唑部分,其可以通过炔烃和叠氮化物的环加成或点击反应(可能但不必须在作为催化剂的Cu(I)的存在下)合成。在MS条件下,三唑部分的裂解通过1,3偶极裂环反应引起N2的释放,导致质谱仪中质/荷比(m/z)降低28。
本领域技术人员清楚地知道,中性离子丢失单元可以使用市售软件来识别,例如,ACD/MS Fragmenter (ACD Labs)。以下参考文献中描述了导致中性丢失的其他反应和物质:
Carey, Sundberg: Organische Chemie, Ein weiterführendes LehrbuchKorrigierter Nachdruck VCH 1995;ISBN: 3-527-29217-9;和
Fred W. McLafferty, Frantisek Turecek, Interpretation vonMassenspektren Springer Spektrum 1995,Softcover: ISBN978-3-642-39848-3。
在特定实施方案中,化合物(I)具有(但不必须具有)包含至少一个带电荷部分的电荷单元Z,即在基本中性条件下主要以带电状态存在的部分。例如,电荷单元Z包含
(i)至少一个带正电荷的部分,例如伯、仲、叔或季铵基团或鏻基团,特别地其pKa为10或更高,更特别地其pKa为12或更高,或者
(ii)至少一个带负电荷的部分,例如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基团,特别地其pKb为10或更高,更特别地其pKb为12或更高。
在本申请的上下文中,术语“pKa为”是指以下事实:带电荷的部分为整个分子提供某个pKa值,该pKa值不同于没有带电荷的部分的分子的pKa值。举例来说,术语“至少一个pKa为10或更高的带正电荷的部分”指定包含所述至少一个带正电荷的部分的整个分子表现出10或更高的pKa。这类似地适用于pKb值。
电荷单元Z最优选由一个带电荷的部分组成。
如果存在电荷单元Z,则其通过如本文所定义的连接基L2与中性离子丢失单元Y连接。因此,由不同单元提供电荷和承受中性丢失的能力。即使在中性离子丢失单元Y被裂解导致(低分子量)中性物质释放的条件下,电荷单元Z也保持不变。这意味着剩余残留物的电荷状态不会改变。如果化合物由于电荷单元Z中的正电荷而预先带正电荷,则即使在释放低分子量中性物质后它仍保持带正电荷。
优选地,化合物(I)具有包含至少一个带正电荷的部分的电荷单元Z。最优选地,电荷单元Z由一个带正电荷的部分组成,并且缺少任何能够承受替代裂解的基团。
试剂化合物(I)可具有由电荷单元Z的存在产生的带电荷部分。电荷可以是永久性的,例如当使用季铵基团时,或者可以通过质子化(正电荷)或去质子化(负电荷)产生。根据本发明,永久电荷是优选的。然而,化合物(I)中带电荷部分的存在是优选的,但不是必然需要的。优选的永久正电荷单元是四烷基铵、1-烷基吡啶鎓和1,3-二烷基咪唑鎓单元。
除了第一中性物质的释放之外,化合物(I)可以在质谱条件下(例如通过CID)进行替代裂解。由此释放出与第一中性物质不同的第二中性物质。例如,第二中性物质可包含芳基-基团,例如苯基-或取代的苯基-基团或卤素基团(Cl、Br、I)。导致释放第二中性物质的替代裂解优选仅在比从中性离子丢失单元Y释放第一中性物质所需的能量更高的能量的条件下发生。
在特定实施方案中,该化合物显示通式(Ia)
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
其中
X为羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团,并且其中X不是丙烯酸酯,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个永久带正电荷的部分的电荷单元,
包括其任何盐。
在特定实施方案中,该化合物显示通式(Ia)
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
其中,
X为羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团或羟基反应基团,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个带负电荷的部分的电荷单元,
包括其任何盐,或包含至少一种化合物(Ia)的组合物或试剂盒。
在优选的实施方案中,式(I)的化合物适合作为测定碳水化合物和酮类固醇的试剂,并且可以是通式(Ib)的化合物:
X1– L1– Y1(– L2– Z)r
其中,
X1是如上所述的羰基反应基团,
Y1是中性离子丢失单元,包含
(i)杂环部分,其在质谱条件下能够裂解,由此释放出第一中性物质,和
(ii)任选的在质谱条件下能够进行替代裂解的部分,由此释放出与第一中性物质不同的第二中性物质,
L1是键或间隔基,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个带电荷的部分,特别是永久带电荷的部分,和
r为0或1。
通式(I)、(Ia)或(Ib)中的基团L1和L2独立地表示键,即共价键,或间隔基,即链长为1直至通常为4、6、8或10个原子或甚至更多的直链或支链间隔基,所述原子例如为C原子,任选包括至少一个杂原子。优选地,基团L1和L2是短间隔基,具有1、2或3个原子的长度,并且最优选地缺少可能进行替代裂解的任何部分。此外,优选基团L1和L2不包括任何立体中心。如果存在立体异构体,则仅存在一种立体异构体物质,但不存在两种或更多种立体异构体物质的混合物。为了在MS中使用,化合物(I)优选以立体异构纯的形式提供。
在特定实施方案中,L1或L2彼此独立地为C1-C4烷基间隔基,任选地包含至少一个杂原子。在进一步的实施方案中,L1和L2之一包括芳基,例如苯基,其可以进行如上所述的替代裂解。
在特定实施方案中,通过本发明化合物与给定分析物的反应形成的加合物在进行质谱测量时仅表现出一个质量跃迁(mass transition)。
根据本发明的化合物的具体实例是式(Ic)的化合物:
其中R在每种情况下独立地为H或C1-4烷基,特别是甲基,A是阴离子,例如甲酸根。
本发明的另一个实施方案涉及作为同位素体的式(I)的化合物。术语“同位素体”涉及化合物(I),其中至少一个主要同位素被相应元素的稳定次要同位素替代,该稳定次要同位素具有不同于相应主要同位素的分子量的分子量。因此,所得的(I)的同位素体的分子量不同于由这里称为同位素中性的主要同位素组成的相应化合物的分子量。这种分子量的差异允许同位素中性化合物及其同位素体的质谱差异。在一个优选的实施方案中,同位素体包含至少一个选自D(代替H)、13C(代替12C)、15N(代替14N)和18O(代替16O)的同位素。
在同位素体中,一个或多个并且直至所有相应同位素中性原子都可以被同位素替代。从而可以提供单一化合物的大量不同同位素体。
例如,在如上所示的式(Ic)的化合物中,芳族单元或甘氨酸单元中的一个或多个或所有H、14N和12C原子可以被D、15N或13C替代。三唑环的2位和3位的N原子不会被15N替代,因为它们将作为中性物质N2切割掉。
在其中R =甲基的式(Ic)的化合物的一个具体实施方案中,所有三个CH3基团都被CD3基团替代。该同位素体重量增加9个质量单位,因此可与具有三个CH3基团的相应同位素中性化合物MS区分。
化合物(I)可以作为同位素中性化合物提供,或者作为可以与相应的同位素中性化合物MS区分的同位素体提供,或者作为包含相同化合物的多种不同的MS可区分的同位素体的组合物或作为包含分开形式的相同化合物的多种不同的MS可区分的同位素体的试剂盒提供。包含试剂的多种不同的MS可区分的同位素体的组合物或试剂盒特别适用于如下所述的多路复用应用。
优选的式(I)的化合物(包括其同位素体)的合成在下面的实施例部分中描述。
本发明的又进一步方面涉及式(I)的化合物用于质谱测定分析物分子的用途,特别是用于测定如上所述的碳水化合物分析物分子的用途。该用途涉及通过与化合物(I)的反应衍生分析物分子,由此形成共价加合物,随后通过MS进行分析。
涉及使用化合物(I)作为通过MS测定分析物分子的试剂的一般方案包括以下步骤:
(i) 衍生分析物
试剂化合物(I) + 分析物→加合物
(ii) MS分析
从加合物离子裂解中性物质,即中性离子丢失不会改变总电荷。因此,子离子具有与分子离子相同的电荷。
如果加合物包含正电荷,则MS检测在正离子模式下发生。如果加合物具有负电荷,则将在负MS模式下执行检测。
质谱测定可以与另外的分析方法组合,包括色谱方法,例如气相色谱(GC)、液相色谱(LC)(特别是HPLC、快速LC或微量LC(μLC))和/或基于离子迁移率的分离技术。
本发明的另一方面是通过如上所述的通式(I)的化合物与分析物分子反应形成的加合物用于质谱测定分析物分子的用途。通过该反应,形成化合物(I)和分析物分子之间的共价键。在一个特别优选的实施方案中,质谱测定包括串联质谱测定,更特别是在三重四极杆装置中,其中对分析物加合物的分子离子进行裂解,例如通过碰撞诱导解离(CID)进行裂解,并从分子离子产生子离子。通过并行检测加合物分子离子和子离子,可以高度灵敏地测定分析物。
在优选的实施方案中,用于MS测定的加合物是通式(II)的化合物:
T – X' – L1– Y (– L2– Z)r (II)
其中,
T是分析物分子,
X'是由化合物(I)上的反应基团X与分析物分子的反应得到的部分,并且L1、Y、L2、Z和r如上所定义。
式(II)的加合物化合物带有正电荷或负电荷,其允许质谱检测。该电荷可以由化合物(I)的电荷单元Z提供。化合物(I)中存在电荷单元是优选的,但是,这不是必须的,因为可以通过其他方式提供电荷,例如当分析物分子本身带电荷时和/或当加合物可以通过质子化或去质子化带电荷时。
在一个实施方案中,加合物化合物(II)可以通过待分析样品中存在的分析物分子与已添加到样品中的化合物(I)反应而产生。
本发明的又进一步方面是加合物化合物(IIa)
T – X' – L1– Y – L2– Z (IIa)
其中
T、X'、L1、Y、L2和Z如上文所定义,包括其任何盐,
或包含至少一种式(IIa)的加合物的组合物或试剂盒。
特别地,加合物是式(IIa)的化合物
T – X' – L1– Y – L2– Z (IIa)
其中,
X'是由化合物(I)上的反应基团X的反应得到的部分,X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团,条件是X不是丙烯酸酯,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个如上定义的永久带正电荷的部分,优选四烷基铵,1-烷基吡啶鎓或1,3-二烷基咪唑鎓单元,
包括其任何盐,或包含至少一种式(IIa)的加合物的组合物或试剂盒。
特别地,加合物是式(IIa)的化合物
T – X' – L1– Y – L2– Z (IIa)
其中
X'是由化合物(I)上的反应基团X的反应得到的部分,X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团或羟基反应基团,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个带负电荷的部分,
包括其任何盐,或包含至少一种式(IIa)的加合物的组合物或试剂盒。
加合物化合物也可以作为纯物质提供,用作校准物和/或标准物。使用加合物化合物(II)或(IIa)作为校准物可以涉及产生具体分析物分子的校准曲线,其中对不同已知量的加合物化合物(II)或(IIa)进行MS分析并测量相应的信号强度以便准确定量测定样品中存在的未知量的分析物分子。
使用加合物化合物(II)作为标准物可以涉及将已知量的试剂-分析物加合物(例如以同位素体形式)加至样品的单个部分(例如等分试样),和这些单个样品部分的单独质谱分析。所得到的这些样品部分中分析物-试剂加合物的不同信号强度允许精确定量测定样品中存在的未知量的分析物分子。
此外,可以提供已知的分析物作为标准物,其可以以已知量(例如以同位素体形式)加至样品或样品的单个部分(例如等分试样)。然后,用式(I)或(Ia)的试剂处理样品得到标准物加合物和由式(I)或(Ia)的试剂和待测定的分析物形成的加合物的混合物。
根据优选的实施方案,已知标准分析物、式(I)或(Ia)的试剂或两者均可以同位素体形式使用。
然后可以使用质谱分析标准物加合物和通过待测定的分析物与式(I)的试剂的反应形成的加合物的混合物。在一些实施方案中,可以获得分析物的相对浓度。在其他实施方案中,可以通过使用已知浓度的标准物来获得分析物的绝对定量。
可以在样品中的分析物分子与试剂化合物(I)之间的加合物形成之前、期间或之后将标准物添加到样品中。优选地,在样品中的分析物分子与试剂化合物(I)或(Ia)之间的加合物形成之前加入内标。
优选地,标准物加合物与通过试剂化合物(I)或(Ia)与样品中存在的分析物分子的反应产生的加合物的MS可区分。为此目的,标准物加合物可以由试剂化合物(I)或(Ia)的同位素体产生,而样品中分析物分子的加合物可以通过使用同位素中性的,即未标记的试剂化合物(I)或(Ia)或与标准物不同的同位素体产生。或者或另外,标准分析物可以是同位素体。
在色谱分离(例如气相色谱或液相色谱)期间,同位素体标准物加合物具有与来自样品的分析物加合物相同的保留时间。因此,分析物加合物和同位素体标准物加合物同时进入质谱仪。
然而,同位素体标准物加合物表现出与来自样品的分析物加合物不同的分子量。这允许通过其不同的质/荷(m/z)比来质谱区分来自添加的标准物加合物的离子和来自分析物加合物的离子。通过释放如上所述的第一中性物质,对两种加合物进行裂解,并提供子离子。这些子离子可以通过它们的m/z比彼此区分并与各自的加合物离子区分。因此,可以进行来自同位素体标准物加合物和分析物加合物的信号的单独测定和定量。由于已经以已知量添加同位素体标准物加合物,因此来自样品的分析物加合物的信号强度可归因于分析物的具体量化含量。
本发明的又进一步方面涉及用于质谱测定分析物分子的方法,包括以下步骤:
(a)使分析物分子与如上所述的式(I)的试剂化合物共价反应,由此形成分析物分子和试剂化合物的加合物,和
(b)对来自步骤(a)的加合物进行质谱分析。
在特定实施方案中,式(I)的化合物与步骤a)的分析物分子的反应在分析物分子的任何富集过程之前发生,在第一富集过程之后发生,或在第二富集过程之后发生。在本公开的上下文中,术语“第一富集过程”或“第一富集工作流”是指在样品的预处理之后发生,并提供相对于初始样品包含富集分析物的样品的富集过程。在本公开的上下文中,术语“第二富集过程”或“第二富集工作流”是指在样品的预处理和第一富集过程之后发生,并提供相对于初始样品和第一富集过程后的样品包含富集分析物的样品的富集过程。在特定实施方案中,第一富集过程包括使用分析物选择性磁珠。在特定的实施方案中,第二富集过程包括使用色谱分离,特别是使用液相色谱。
在其中式(I)的化合物与步骤a)的分析物分子的反应在任何富集过程之前发生的特定实施方案中,将式(I)的化合物加入到预处理的目标样品中。术语“预处理样品”是指用内标(IS)和溶血试剂(HR)处理血液样品(如上所详述的),或用内标(IS)和酶试剂(E)处理尿液样品(如上所详述的)。因此,在预处理之后和第一富集过程之前形成分析物分子和式(I)的试剂化合物的加合物。因此,使加合物在进行步骤b)的质谱分析之前进行第一富集过程和第二富集过程。
在其中式(I)的化合物与步骤a)的分析物分子的反应在第一富集过程之后发生的特定实施方案中,在使用磁珠的第一富集过程结束后将式(I)的化合物加入目标样品中。因此,在这种情况下,首先如上文所述对样品进行预处理,然后如上文所述使其经历带有分析物选择性基团的磁珠,并且在从珠洗脱之前、同时或之后,加入式(I)的化合物。因此,在第一富集过程之后和第二富集过程之前形成分析物分子和式(I)的试剂化合物的加合物。因此,使加合物在进行步骤b)的质谱分析之前进行第二富集过程。
在其中式(I)的化合物与步骤a)的分析物分子的反应在第二富集过程之后发生的特定实施方案中,在使用色谱、特别是液相色谱的第二富集过程结束之后将式(I)的化合物加入目标样品中。因此,在这种情况下,首先如上文所述对样品进行预处理,然后如上文所述使其经历磁珠工作流,接着进行色谱分离,特别是使用液相色谱,特别是HPLC、快速LC或微量 LC(μLC),并在色谱分离后加入式(I)的化合物。因此,在第二富集过程之后形成分析物分子和式(I)的试剂化合物的加合物。因此,使加合物在进行步骤b)的质谱分析之前不进行富集过程。
优选地,质谱分析步骤(b)包括:
(i) 使加合物的离子进行质谱分析的第一阶段,由此加合物的离子根据其质/荷(m/z)比表征,
(ii) 引起加合物离子裂解,由此释放出第一中性物质,特别是低分子量中性物质,并产生加合物的子离子,其中加合物的子离子的m/z比不同于加合物,和
(iii) 使加合物的子离子进行质谱分析的第二阶段,由此加合物的子离子根据其m/z比表征。
任选地,对加合物离子进行替代裂解,由此释放不同于第一中性物质的第二中性物质,并产生加合物的第二替代子离子。在这种情况下,加合物的第一和第二子离子都可以进行质谱分析的第二阶段,由此加合物的第一和第二子离子都根据它们的m/z比表征。允许第二替代的中性离子丢失(例如通过释放芳基或卤素基团)的试剂化合物(I)的使用,提供了关于样品中分析物分子的存在和/或量的额外信息。这对于复杂生物样品的分析特别有意义。
本发明允许测定样品中的单个分析物或多个不同的分析物分子。然而,本发明还允许多路复用,即测定多个样品中的多个不同分析物分子。
当用于质谱时,认为特定的化合物是有利的。因此,在其他方面,本发明涉及下面公开的化合物:
在另一方面,本发明提供用于质谱的试剂,其为式(Ia)的化合物
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
其中X、Y、Z、L1和L2如上所定义。
特别地,本发明涉及试剂,其为式(Ia)的化合物
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
其中
X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团,条件是X不是丙烯酸酯,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个如上定义的永久带正电荷的部分,优选四烷基铵、1-烷基吡啶鎓或1,3-二烷基咪唑鎓单元,
包括其任何盐,
或包含至少一种化合物(Ia)的组合物或试剂盒。
特别地,本发明涉及试剂,其为式(Ia)的化合物,
X – L1– Y – L2– Z (Ia)
其中
X为羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团或羟基反应基团,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,特别是低分子量中性物质,
L2是键或间隔基,
Z是包含至少一个带负电荷的部分的电荷单元,
包括其任何盐,
或包含至少一种化合物(Ia)的组合物或试剂盒。
在实施方案中,可以选择如上指定的化合物(Ia)的反应基团X以与如上文所公开的分析物分子上的不同官能团反应。决定哪些反应基团X有资格结合目标分析物的官能团是公知常识。分析物分子上的官能团是邻二醇、酚基团、核碱基、氨基、巯基、羟基、1-羟基-2-氨基烷基、1-氨基-2-巯基烷基、酮、1,3-二烯基、烯基、烯丙基、甲酰基和羧酸酯基团。反应基团总结在标准教科书“BioconjugateTechniques”第3版:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-382239-0.00025-X;和“The Molecular Probes Handbook: A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies”,第11版,ed Iain D.Johnson,LifeTechnologies Corporation,2010;和综述文章(例如X. Chen等人,Org. Biomol. Chem.,2016,14, 5417-5439;和T. Higashi J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 Sep;162:57-69)中。
特别地,反应基团X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团。特别地,反应基团X选自胺反应基团、硫醇反应基团、羰基反应基团、亲二烯基团、1,2-二醇反应基团、羧酸酯反应基团、羟基反应基团、1-氨基-2-羟基烷基反应基团、1-氨基-2-巯基反应基团,和在酚的邻位反应的基团。
在一个优选的实施方案中,基团X是羰基反应基团,其能够与任何类型的分子反应,例如,具有羰基的碳水化合物分子。特别地,化合物的碳水化合物反应基团X能够与所有类型的糖反应,包括醛糖,例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖或岩藻糖,和酮糖,例如核酮糖或果糖,以及寡糖,例如二-、三-或四糖,和多糖,其具有可接近的醛或酮基或半缩醛掩蔽的醛或酮基。羰基反应基团可以具有经由相邻的O或N原子通过α-效应强化的超亲核N原子,即NH2-N/O或二硫醇分子。它可以选自:
(i) 肼基团,例如H2N-NH-或H2N-NR1-基团,
其中R1为任选例如被卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代的芳基或C1-4烷基,特别是C1或C2烷基,
(ii) 腙基团,例如H2N-NH-C(O)-或H2N-NR2-C(O)-基团,
其中R2为任选例如被卤素、羟基和/或C1-3烷氧基取代的芳基或C1-4烷基,特别是C1或C2烷基,
(iii) 羟基氨基基团,例如H2N-O-基团,和
(iv) 二硫醇基团,特别是1,2-二硫醇或1,3-二硫醇基团。
在一个优选的实施方案中,反应基团X是酮反应基团,其能够与包含酮基的每个分析物反应,所述分析物例如酮类固醇,如DHT、睾酮、表睾酮、脱氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、醛固酮、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲基醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(脱氢表雄酮)、17-OH孕烯醇酮、17-OH孕酮、17-OH孕酮、雄酮、表雄酮和δ4雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、别孕烯醇酮和醛固酮。
例如,作为Br/I-CH2-C(O)-的反应性卤代乙酰基、丙烯酰胺/酯基、酰亚胺如马来酰亚胺或甲磺酰基苯基噁二唑(N. Toda等人, Angew. Chem. Int Ed Engl. 2013 Nov25; 52(48))可与分析物分子上的亲核基团如硫醇基团反应。氨基反应基团,例如活性酯基,如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS酯,五氟苯酯,方酸酯,羟基苯并三唑(HOBt)酯,或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)酯基,磺酰氯或异硫氰酸根合或异氰酸根合基团可与分析物分子上的氨基反应。如上所述的肼或羟基氨基也可用于与分析物分子上存在的其他亲电子基团反应。
为了与邻二醇结合,反应基团X可以包含硼酸。或者,可以将二醇氧化成各自的酮或醛,然后与酮/醛反应基团X反应。可以选择作为三唑二酮的亲二烯体作为结合二烯的反应基团X。存在于分析物分子上的酚基团可以通过烯反应与三唑二酮反应(H. Ban等人,J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), pp 1523–1525)或被重氮化或者可替代地被邻位硝化,接着还原成胺,然后胺可以与胺反应试剂反应。核碱基可以与作为反应基团X的氯乙酰基或Pt配合物反应。末端半胱氨酸可以与作为反应基团X的杂芳基/芳基氰化物反应。末端丝氨酸可以被氧化以产生醛基,然后与已知的醛反应基团X反应。取决于待测定的分析物分子上存在的官能团,技术人员将为化合物(Ia)选择合适的反应基团X。
在进一步的实施方案中,反应基团是羧酸酯反应基团,例如,重氮化合物(Chromatographia 2012, 75, 875–881),其可用于前列腺素的衍生。其他众所周知的羧酸酯反应基团是烷基卤化物。众所周知的还是羧酸的活化,然后与亲核试剂如胺或肼反应(A.Kretschmner等人,Journal of Chromatography B,第879卷, 17–18, 2011年5月, 第1393-1401页)。
羟基反应基团是(T. Higashi J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 Sep;162:57-69)磺酰氯、活化的羧酸酯(NHS或咪唑化物)和氟代芳族化合物/杂芳族化合物(能够亲核取代氟)。
在一个优选的实施方案中,反应基团X是酚反应基团,其能够与任何类型的具有酚基团的分子反应,例如类固醇、类固醇样化合物、雌激素、雌激素样化合物、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇(E3)、16-表雌三醇、17-表雌三醇和16,17-表雌三醇,和/或其代谢物。举例来说,酚反应基团可以是1,2,4-三唑啉-3,5-二酮基团。1,2,4-三唑啉-3,5-二酮也能够充当亲二烯体并且因此可用于检测维生素D、1α,25(OH)2VitD3、1α,25(OH)2VitD2、25(OH)VitD2、25(OH)VitD3和24R,25(OH)2VitD3。
化合物(Ia)还包含中性离子丢失单元Y。在本申请的上下文中,术语“中性离子丢失单元”是指能够丢失不带电荷的部分的单元。所述部分包括但不限于离子、原子和多个原子。单元Y是中性的,即它不带正电荷或负电荷,并且它通过如下文定义的连接基L1与反应基团X连接。中性单元Y在MS条件下,例如,当进行碰撞诱导解离(CID)时,例如在三重四极杆MS中,能够裂解,由此释放中性物质。释放出第一中性物质后,单元Y的其余部分仍保持中性。通常但不是必须地释放一种中性物质,即释放第一中性物质。在特定的实施方案中,释放两种中性物质。
第一中性物质可以是低分子量中性物质,例如,分子量为100或更小,更特别是80或更小的中性分子。此外,第一中性物质可以是无机分子,例如SO、SO2、CO、CO2、NO、NO2或N2。特别地,中性物质是N2或SO2。更特别地,第一中性物质是N2。导致中性分子丢失的反应可以优选是裂环反应,特别是1,3-偶极裂环反应。在本公开的上下文中,术语“裂环反应”是指任何环加成反应的逆转。
在特定实施方案中,中性离子丢失单元Y包含以下物质或由以下物质组成:环状部分(例如环状酮如双环[2.2.1]庚二烯-7-酮已知丢失CO),特别是杂环部分,更特别是6-、5-或4-元杂环部分,其能够裂解,由此释放如上所述的第一中性物质。这种(杂)环状基团通过逆(杂)环加成反应容易地显示出裂解,由此释放中性物质。
优选地,中性离子丢失单元Y包含以下物质或由以下物质组成:5-或6-元杂环部分,所述杂环部分具有至少两个彼此相邻的例如在1,2-位的杂原子,例如N、O和/或S原子,特别是N原子,例如环状偶氮化合物和5-元环,其选自三唑(特别是1,2,3-三唑)、四唑、四嗪、1,2,3-氧杂-或硫杂-二唑,或其氢化衍生物。可以向上述杂环中并入另外的环,例如,苯并噻二唑或苯并三唑。杂环可以部分氢化,例如 2,5-二氢吡咯、2,5-二氢噻吩-1,1二氧化物。
在一个尤其优选的实施方案中,5-元杂环部分是三唑部分,其可以通过炔烃和叠氮化物的环加成或点击反应(可能但不必须在作为催化剂的Cu(I)的存在下)合成。在MS条件下,三唑部分的裂解通过1,3-偶极裂环反应引起N2的释放,导致质谱仪中质/荷比(m/z)降低28。
本领域技术人员清楚地知道,中性离子丢失单元可以使用市售软件来识别,例如,ACD/MS Fragmenter(ACD Labs)。以下参考文献中描述了导致中性丢失的其他反应和物质:
Carey, Sundberg: Organische Chemie, Ein weiterführendes LehrbuchKorrigierter Nachdruck VCH 1995;ISBN: 3-527-29217-9;
Fred W. McLafferty, Frantisek Turecek, Interpretation vonMassenspektren Springer Spektrum 1995,Softcover: ISBN978-3-642-39848-3。
在特定实施方案中,式(Ia)的化合物具有包含至少一个带电荷部分的电荷单元Z,即在基本中性条件下主要以带电状态存在的部分。例如,电荷单元Z包含
(i)至少一个永久带正电荷的部分,例如伯、仲、叔或季铵基团或鏻基团,特别地其pKa为10或更高,更特别地其pKa为12或更高,或者
(ii)至少一个带负电荷的部分,例如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基团,特别地其pKb为10或更高,更特别地其pKb为12或更高。
在本申请的上下文中,术语“pKa为”是指以下事实:带电荷的部分为整个分子提供某个pKa值,该pKa值不同于没有带电荷的部分的分子的pKa值。举例来说,术语“至少一个pKa为10或更高的带正电荷的部分”指定包含所述至少一个带正电荷的部分的整个分子表现出10或更高的pKa。这也类似地适用于pKb值。
电荷单元Z通过如本文所定义的连接基L2与中性离子丢失单元Y连接。因此,由不同单元提供电荷和承受中性丢失的能力。即使在中性离子丢失单元Y被裂解导致(低分子量)中性物质释放的条件下,电荷单元Z也保持不变。这意味着剩余残留物的电荷状态不会改变。如果化合物由于电荷单元Z中的正电荷而预先带正电,则即使在释放低分子量中性物质后它仍保持带正电荷。
优选地,化合物(I)具有包含至少一个带正电荷的部分的电荷单元Z。最优选地,电荷单元Z由一个带正电荷的部分组成,并且缺少任何能够承受替代裂解的基团。
电荷是永久性的,例如当使用季铵基团时,或者可以通过质子化(正电荷)或去质子化(负电荷)产生。优选的永久正电荷单元是四烷基铵、1-烷基吡啶鎓和1,3-二烷基咪唑鎓单元。
除了第一中性物质的释放之外,化合物(Ia)能够在质谱条件下(例如通过CID)进行替代裂解。由此释放出与第一中性物质不同的第二中性物质。例如,第二中性物质可包含芳基-基团,例如苯基-或取代的苯基-基团或卤素基团(Cl、Br、I)。导致释放第二中性物质的替代裂解优选仅在比从中性离子丢失单元Y释放第一中性物质所需的能量更高的能量的条件下发生。
通式(Ia)中的基团L1和L2独立地表示键,即共价键或间隔基,即链长为1直至通常为4、6、8或10个原子或甚至更多的直链或支链间隔基,所述原子例如为C原子,任选包括至少一个杂原子。优选地,基团L1和L2是短间隔基,具有1、2或3个原子的长度,并且最优选地缺少可能进行替代裂解的任何部分。此外,优选基团L1和L2不包括任何立体中心。如果存在立体异构体,则仅存在一种立体异构体物质,但不存在两种或更多种立体异构体物质的混合物。为了在MS中使用,化合物(I)优选以立体异构纯的形式提供。在特定实施方案中,L1和L2彼此独立地为C1-C4烷基间隔基,任选地包含至少一个杂原子。在进一步的实施方案中,L1或L2之一包括芳基,例如苯基,其可以进行如上所述的替代裂解。
有利地设计式(Ia)的试剂,使得在质谱条件下,仅在所得加合物(II)中的一个位置,即中性离子丢失单元Y,发生一个单一的中性丢失。如果加合物包括可能进行替代裂解的任何其他基团,例如,在间隔基L1和/或L2中,所述替代裂解优选在比从中性离子丢失单元Y释放第一中性物质所需的能量更高的能量的条件下发生。替代裂解的实例包括释放不同于第一中性物质的第二中性物质,例如芳基或卤素基团。
在式(Ia)的第一实施方案中,电荷单元Z包含带正电荷的部分或由带正电荷的部分组成,例如伯、仲、叔或季铵基或鏻基。虽然电荷原则上可以是永久的或可以通过质子化产生,但优选永久电荷,特别是其中整个化合物的pKa为10或更高,更特别是pKa为12或更高的那些。根据该实施方案的特别优选的试剂由式(Ic)表示:
其中R在每种情况下独立地为H或C1-4烷基,特别是甲基,并且A是阴离子,例如甲酸根。
在另一个实施方案中,电荷单元Z包含带负电荷的部分或由带负电荷的部分组成,例如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基团。特别优选pKb为10或更高,更特别是pKb为12或更高的单元Z。
图1显示了用于定量测定样品中单个分析物分子的示例性方案,所述样品包含六种不同的分析物分子。使样品中的分析物分子与试剂化合物(R)反应,由此获得六种不同的分析物-试剂加合物。为了定量测定样品中的一种分析物分子,加入标准物,该标准物是通过相应的分析物分子与试剂同位素体化合物(R*)的反应制备的。色谱分离样品后,例如通过液相色谱(LC)分离样品后,目标分析物与未标记试剂(R)的加合物以及与其同位素体(R*)的加合物是不可区分的。因此,在色谱后观察到源自各不同分析物的六个信号。然而,由于两种试剂之间的质量差异,质谱分析提供来自未标记试剂(R)和同位素体(R*)的不同信号。由于中性物质(此处为N2)的丢失,产生两个子离子,其也提供不同的信号。由于添加的同位素体加合物的量是已知的,因此可以通过校准从未标记试剂的信号强度精确定量分析物。相应地,可以准确定量测定样品中的其他分析物。
使用多种不同的同位素体能够实现多路复用。因此,可以直接比较多个不同样品或不同量的分析物。各自的示例性方案显示在图2中。每个样品包含六种不同的分析物分子。为了比较三个不同样品中六种分析物分子的量化含量,将不同的同位素体试剂化合物(R、R*和R**)加入每个样品中。由此,获得三组不同的分析物-试剂加合物(R、R*和R**)。然后,加入标准物,例如相应分析物和另一同位素可区分的试剂R***的加合物。色谱分离后,例如通过LC分离后,获得六种信号,即每种分析物一个信号。在MS分析后,获得6x4个信号。由于分析物和试剂R***的加合物的确切量是已知的,因此可以定量测定所有信号。
本发明尤其优选的实施方案包括分析物分子(优选包含至少一个反应性醛-、酮-或半缩醛基团的碳水化合物)与试剂或试剂的同位素体的反应,以及通过与MS结合的GC或LC,特别是通过HPLC-三重四极杆质谱分析形成的加合物。
与普通程序相比,本发明的程序具有两个主要优点。由于质谱仪中的中性离子丢失,可以以前所未有的灵敏度检测分析物分子,其允许使用最少的样品材料进行诊断。在添加合成的同位素修饰的加合物作为内标时,可以获得关于分析物分子的定量信息。这允许直接比较两个和更多个样品,例如组织样品,和多路复用。
本发明适用于临床应用,例如提供关于对象,特别是人类对象的诊断和/或预后信息。具体应用是诊断涉及生物分子特别是糖蛋白的糖结构改变、伴随该糖结构改变或由该糖结构改变引起的疾病,例如诊断过度增殖性疾病,例如癌症,如测定肿瘤的攻击性和侵袭性,表征血小板以及测量肝纤维化水平,研究抗体特征和免疫细胞如T细胞的特征。通常,试剂(I)及其同位素体可用于获得关于糖医学领域中具体糖生物标记物的存在和水平的定量信息。
图例
图1:本发明实施方案的示意性描绘。
用于定量测定分析物分子的方案包括使样品中的分析物分子与试剂(R)反应,由此形成共价分析物加合物。添加包含同位素体试剂(R*)的标准加合物允许通过LC和随后的MS定量测定分析物分子。
图2:本发明另一实施方案的示意性描绘。
用于平行定量测定多种分析物的方案包括使多个样品中的分析物分子与各样品中的同位素不同的试剂(R、R*、R**)反应,由此形成共价分析物加合物。添加包含另外的同位素体试剂(R***)的标准加合物允许通过LC和随后的MS平行定量测定各样品中的各分析物分子。
图3:碱基切除修复过程的机制。
a碱基切除修复(BER)化学,其中形成AP-和βE位点。
b 概述dC的表观遗传修饰以及通过BER可能去除fdC和cadC。
c描绘试剂1和当1与AP-和βE-位点反应时形成的反应产物。
图4:轻(a)和重(b)形式的试剂1和内标9a/b和10a/b的合成。
(i) TBTU, DIPEA, DMF, rt, 16 h, 90%;
(ii) Trt-Cl, NEt3, 吡啶, rt, 22 h, 74%;
(iii) 炔丙胺, TBTU, DIPEA, DCM, rt, 15 h, 92%;
(iv) 7 + 4a/b, CuBr·SMe2, H2O/DCM (1:1), rt, 16h, 77%;
(v) 6M HCl, DCM/H2O (1:1), rt, 1 h, quant.;
(vi) H2O, 30 ℃, 16 h, HPLC, 15%;
(vii) 1) DIBAL-H, DCM, -78 ℃至rt, (2) DMP, DCM, 0 ℃至rt, o/n, 47%,经两步;
(viii) (1) 1a/b, CHCl3/H2O (1:1), rt, 16 h, 68%, (2)pTSA·H2O, H2O, 25℃, o/n, HPLC (2x), 14%。
图5:用于量化AP-和βE-位点的基于MS/MS的方法。
AP (9)-和βE-位点(10)标准物在MS/MS实验中的裂解模式,产生了高度敏感的信号。
图6:量化BER中间体和同位素示踪研究。
a 用于AP-和βE-位点衍生和分析的一般工作流。
b用标记的核苷给予mESC培养物导致形成核糖标记的AP-和βE-位点产物9和10,其比未标记的产物重5个质量单位。
c不同标记加合物和DNA修饰的定量数据。
图7:
a AP- (9)和b βE -位点(10)的校准曲线。
图8:具有确定的无碱基位点的寡脱氧核苷酸(ODN)的反应动力学。
a获得用1a衍生之前(黑线)和之后的具有无碱基位点的ODN和负链的UV信号。
b具体时间点后ODN + 1的归一化UV信号。
图9:
用1衍生gDNA表明衍生反应迅速并且不会人为产生无碱基位点。
图10:
丙烯酰胺试剂与硫醇如谷胱甘肽(GSH)的反应和MS分析中的N2丢失的方案。
图11:具有丙烯酰胺探针的GSH加合物的MS分析。
a 带单电荷的物质的Mol峰用♦表示。在N2丢失后形成的碎片是不可检测的。
b前体离子扫描显示丢失N2。
c带双电荷的物质直接显示丢失N2。
图12:羟胺试剂与睾酮的反应方案。
图13:具有羟胺探针的睾酮加合物的MS分析
MS实验显示在632.5处的分子峰和丢失N2后在604.4处的碎片以及在192.1处的第二碎片。
图14:显示通过丢失N2裂解睾酮加合物的MRM扫描。
图15:使用羟胺试剂进行的睾酮的质谱分析
显示以下峰:
a睾酮(110 amol)
b睾酮(22 amol)
c加合物N2丢失(0.12 amol)
d加合物苯基丢失定性离子(0.12 amol)
e加合物N2丢失(3.6 amol)
f加合物苯基丢失定性离子(3.6 amol)
g睾酮(11 fmol)。
图16:使用反应性酯试剂进行的多巴胺的MS分析
多巴胺加合物的UHPLC-三重/四极杆MS谱。清楚可见的是m/z= 553处的分子峰和m/z= 525处的N2丢失信号。
此外,通过以下实施例更详细地描述本发明:
实施例
1. 引言
碱基切除修复(BER)是一种主要的DNA维持过程,其允许细胞从基因组中去除受损的碱基(1,2)。该过程需要特定DNA糖基化酶的作用,其识别非规范碱基(图3a)(3)。已知两种不同类型的DNA糖基化酶。它们都催化糖苷键的切割以得到最初的无碱基(AP)-位点中间体(步骤a,图3a)。单功能糖基化酶随后需要核酸内切酶如APE-1(步骤b,图3a)来水解磷酸二酯键以产生单链断裂。相反,双功能糖基化酶催化β-消除(βE)反应(步骤c,图3a),得到确定的βE-中间体。然后可以通过随后的β-消除反应将该βE-中间体转化为单核苷酸空隙(gap)(步骤d,图3a)(2,3)。因此BER与形成单链断裂有关,并且如果修复的碱基在相反链上,则也与形成双链断裂有关。
目前测量BER中间体的方法,例如市售的醛反应性探针,是含有羟胺的化学探针,其与AP位点的开链醛形式反应(图3a),并且主要使用亲和基团进行富集和检测。这些方法的主要缺点是探针原则上与每个醛和酮非选择性地反应,并且衍生化产物的特性保持未表征,妨碍了AP-和βE位点之间的区分。
最近发现BER不仅从基因组中去除受损的碱基,而且可通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶(Tdg)切割表观遗传相关的碱基5-甲酰基-胞嘧啶(fdC)(4)和5-羧基-胞嘧啶(cadC)(5)。两者均由氧化5-甲基-胞嘧啶(mdC)经由5-羟甲基-胞嘧啶(hmdC)在β-酮戊二酸依赖性Tet加氧酶的帮助下形成(图3b)(5,6)。尽管新碱基的确切功能尚不清楚,但fdC和cadC的去除似乎是长期寻找的主动去甲基化反应的一部分(图3b)。
在这里,我们报告开发了一种与高灵敏度的UHPLC-三重四极杆质谱和同位素供给相结合的新试剂,其允许精确定量AP-和βE-位点,检测限延续至每个基因组100个中间体。这项新技术使我们发现两种类型的中间体都不会在嘧啶处积累,这表明表观遗传位点的BER不是干细胞基因组中预期的有害事件。
2. 结果和讨论
新技术的基础是试剂1(图3c),其含有反应性羟胺单元,能够与AP位点和βE中间体都形成稳定且确定的反应产物(7)。我们证明了形成的加合物(图3c)不会干扰水解酶的作用(参见下文),因此可以从基因组中切除反应产物以进行灵敏的质谱检测和定量。重要地,试剂1含有三唑单元,其通过碰撞诱导解离(CID)容易在三重四极杆MS中裂解,以通过丢失N2产生密集的子离子。这允许快速和可靠的检测。此外,1的季铵中心处的永久正电荷确保了最高可能的灵敏度和确定的带电状态。它还加速了与带负电荷的DNA双链体中嵌入的AP-和βE-位点的反应。
该试剂的合成如图4所示。它以对叠氮基苯胺2开始,使用TBTU(N,N,N’,N’-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸酯)作为偶联剂与三甲基氨基甘氨酸3反应,得到叠氮基-酰胺4。试剂1的稳定同位素体(预期的基于MS的精确定量所需的(参见下文))在此步骤通过允许引入9个D-原子的(CD3)3-甘氨酸衍生物获得。
与此同时,将O-(羧甲基)羟胺5经Trt(三苯甲基)-保护为68,并且再次使用TBTU作为偶联剂使6与炔丙胺反应,得到炔烃7。通过Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃点击反应使4与7反应,得到三唑8。在苛刻的酸性条件下切割Trt-基团,得到轻(CH3, a)和重型(CD3, b)的试剂1,Δm/z= 9,仅5个步骤,总产率为47%。通过反相HPLC将试剂纯化两次,以确保研究所需的>99.9%的纯度。
对于计划的精确质谱定量,将预期的AP-和βE-位点反应产物制备为正常(a)和重同位素(b)标记的化合物,用于产生校准曲线和作为内标。因此,我们使试剂1a/b与核糖反应,以获得预期的AP位点反应产物9a/b。为了制备所需的β-消除产物10a/b,我们用DIBAL-H将缩丙酮保护的甲酯11还原为烯丙醇,使用Dess-Martin试剂将其选择性氧化成醛12。使12与试剂1a/b反应并最终切割乙缩醛保护基团分别提供了又为轻和重形式的所需化合物10a/b。最后通过反相HPLC纯化化合物9a/b和10a/b至纯度>99.9%。
接下来,我们开发了使用UHPLC-ESI-三重四极杆(QQQ)机器的基于质谱的AP-和βE-位点检测程序(图5)。AP-位点反应产物9a的分析显示由预期的丢失N2后形成的两个分子碎片和在芳基形成下的第二次裂解引起的MS跃迁m/z= 478.2→450.2(定量离子)和m/z=478.2→192.1(定性离子)的清晰对称信号(在t = 9.5min,对于梯度参见SI)。第一次MS跃迁(定量离子)用于加合物的精确定量,第二次MS跃迁(定性离子)用于结构验证。同位素体9b在相同的保留时间下显示出预期的质量转移跃迁m/z= 487.3→459.2和m/z= 487.3→201.2。类似地,获得了βE-反应产物10a及其同位素体10b的高质量数据(图5)。
接下来,我们用合成的AP位点反应产物9a进行稀释实验,并监测MS信号。我们能够检测到渺摩尔(AP位点的LOD = 110 amol)范围内的AP位点9a/b。对于全局AP和βE水平的定量,我们每个样品仅需要5μg基因组DNA,这提供了比先前公开的方法(9)高三个数量级的灵敏度。用试剂1获得的灵敏度也能够检测由双功能糖基化酶形成的βE-中间体。同样地,在这里可检测性延伸到渺摩尔范围(βE-位点的LOD = 110amol)。
然后我们开始量化BER的中间体。在胚胎发育期间,据报道BER与单功能DNA糖基化酶Tdg去除fdC和cadC的组合是一个主要过程(4,5,10,11)。对于该研究,使小鼠胚胎干细胞(mESC)的原始态(naïve)培养物在始发态(priming)条件(FBS/LIF)条件下生长5天。我们随后使用标准方案(参见下文)分离基因组DNA并将其与试剂1a一起孵育。
为了证明基因组DNA与1a的衍生反应没有人为引入无碱基位点并且定量水平是内源性的,我们将1a添加到干细胞DNA中并使用我们建立的方案(参见下文)在几个时间点停止反应。在混合物中获得的AP位点的定量显示,反应在仅一分钟后已经完成,甚至长达60分钟的延长孵育时间显示无碱基位点的量没有增加。随后,使试剂在37℃下反应40分钟以进行进一步研究,从而确保无碱基位点的完全衍生。然后用核酸酶S1、热敏磷酸酶(antarcticphosphatase)和蛇毒磷酸二酯酶的混合物将DNA消化至单核苷水平(参见下文)。为了确保酶能够完全切割出(carve out)反应产物,我们用单个dU碱制备DNA,将dU-切割糖基化酶Udg加入到DNA中以引入确定的无碱基位点,然后与试剂1a一起孵育并定量产生的AP-位点的量(参见下文)。我们准确测量了AP-位点的预期水平,表明我们的试剂在温和条件下定量反应,并且反应产物通过酶消化方案完全分离。
为了精确定量干细胞DNA中的BER中间体,我们在DNA消化后再添加9b和10b作为内标,并将获得的混合物注入UHPLC-QQQ系统。在来自规范碱基的预期信号旁边,我们看到来自天然AP-和βE-位点反应产物9a和10a的另外两个信号。这表明所述试剂和MS方法能够直接在基因组DNA中检测和定量这些关键的BER中间体。
在同位素标准物9b和10b的帮助下精确定量允许我们测定AP-和βE-位点的全局稳态水平分别至8.8x10-7和1.7x10-6/dN。这是一个非常低的水平,但由于该方法的高灵敏度,它完全在定量限内(参见下文)。
为了研究,如果这些BER加合物确实是以稳态水平内源性存在,或者如果加合物例如在DNA分离和样品制备期间形成(对于βE加合物几乎不可能),我们系统地增加了与试剂的孵育时间直至一小时。然而,确切的定量表明没有增加反对这种可能性的值(参见下文)。我们还用含有dU的DNA重复了这项研究,并增加了与Udg的孵育时间和之后的处理时间。我们没有观察到AP水平的增加,表明DNA分离和处理不会增加BER中间体的水平。
因此,用基因组DNA获得的精确定量数据显示,βE-位点和AP-位点均以低稳态水平存在(图6c)。这证实了单功能和双功能糖基化酶对基因组的不断修复。有趣的是,我们看到更高水平的βE-位点,其显示双功能糖基化酶的主要修复或这些中间体具有较低的更新(turnover)并因此累积至较高的稳态水平。
我们接下来想破译各个DNA碱基的修复过程。为此,我们制备了三种不同的mESC培养物,并添加了同位素标记的dC*、dG*或dT*核苷,其中核糖的所有C原子被13C替换,环内N原子被15N替换,如图6b所示。这些掺入的碱基及其衍生物的BER必须提供比未标记的AP-或βE-位点形成的反应产物9a和10a重5个质量单位,比内标9b和10b轻4个质量单位的AP-和βE-反应产物9*和10*。首先,我们监控了掺入的效率。我们看到对于13C10-dG (dG*),掺入量为93%。将13C9-dC (dC*)掺入至40%并且13C10-dT (dT*)几乎完全替代dT(掺入量为97%)。同位素标记的dA不能以用于进行后续研究的足够高的水平掺入。我们接下来对在dC*、dG*和dT*产生的AP-和βE-位点进行精确定量,并将获得的值标准化为100%掺入量以获得可比较的数据。已知dG碱基易于氧化损伤,已知形成的损伤通过BER修复(12,13)。在dG*实验中,我们确实看到AP-和βE-位点(~2.7x10-7)处于大致相同的水平,表明dG衍生的碱基损伤确实通过BER修复。重要地,我们现在看到与全局数据相比更多的AP-位点,完全符合主要DNA糖基化酶Ogg1是双功能糖基化酶的想法,然而它仅具有缓慢的β-消除效率,因此它在体内主要以与APE1结合的方式起作用(14,15)。
在dT(已知是较稳定的碱基)处,AP-和βE-位点的水平均低于10-8/dN,这相当于每个基因组少于100个BER中间体。该水平略低于最低定量限(LLOQ)(图6c)。
接下来,我们研究了dC和表观遗传dC衍生碱基的BER过程。已知dC碱基在基因组中有一定程度的脱氨基,这得到dU:dG错配(16)。此外,dC通过DNA甲基转移酶(Dnmts)甲基化为mdC,其也脱氨基以产生dT:dG错配(17)。已知这两种错配都是由单功能糖基化酶Ung2、Smug1、Tdg和Mbd4修复的,它们应该提供可检测的AP-位点(18,19)。此外,发现dC衍生物fdC和cadC被单功能糖基化酶Tdg切割(4,5)。为了研究所有这些BER事件,我们供给mESCs,在FBS/LIF条件下与100 µM dC*一起生长5天。在DNA分离后,我们添加试剂1a,消化DNA并再次测量标记的AP-和βE-位点的水平。与dT实验相反,我们确实检测到了中间体,但与dC碱基因脱氨作用稳定性差的想法一致。然而,令人惊讶的是,我们只能测量由双功能修复糖基化酶产生的标记的βE-中间体,而标记的AP-位点的形成低于LLOQ(图6c)。
这一结果与最近一项研究数据完全一致,该研究显示Tdg可能以与酶Neil1-2的紧密复合物的形式起作用(20)。Neil蛋白质被认为与产生的AP-位点结合以催化快速的β-和δ-消除反应,以便保持AP-位点的稳态水平低并因此可忍受。
进一步定量显示dC*的βE-位点水平为1.3x10-7/dN。为了将数量与原则上可修复的fdC和cadC的水平联系起来,我们也量化了这些碱基。对于fdC,我们测量到了2.1x10-6的水平,并且对于cadC检测到了1.0x10-7。稳态fdC水平因此比βE-位点水平高1个数量级,表明高水平的fdC不会转化为显著量的BER-中间体,这与报道的fdC稳定性一致。
为了进一步得到表观遗传dC位点修复的深刻理解,我们研究了缺乏Tdg或Neil1和Neil2蛋白二者的mESCs,并将dC*供给两种细胞系。获得的数据如图6c所描绘的。去除Tdg提供了明显增加的fdC和cadC水平,这与蛋白质参与基于BER的去除的想法一致。fdC水平增加10倍。cadC水平升高5倍。fdC和cadC的这种增加不会导致标记的βE-位点或标记的AP-位点的显著变化。令人惊讶的是,即使在缺乏Neil1/2蛋白的mESC的实验中,也没有观察到BER中间体的增加,表明在这种情况下,Neil蛋白不会有助于β/δ-消除。我们最终研究了缺乏所有具有催化活性的Dnmt蛋白的mESC,因此mESC缺乏mdC、hmdC、fdC和cadC。这也没有影响标记的βE位点的水平,并且没有检测到标记的AP-位点的出现,表明用dC*观察到的定量βE-位点全部直接由dC衍生的损伤形成。数据表明或者xdC位点的BER比目前预期的重要性低,或者细胞有多条路径来控制BER中间体的量,使它们保持在非常低的稳态水平,以保证有害的BER中间体不会累积到显著量。
3. 结论
总之,试剂1与新的基于质谱的技术(UHPLC-MS)和同位素供给的组合允许在不同的规范碱基上定量主要BER中间体,其具有前所未有的精密度和灵敏度,即每个基因组100个BER中间体。无法获得在主动去甲基化途径框架内BER去除fdC和cadC的证据。在dG位点检测到大多数BER修复过程,可能是因为dG处的氧化损伤。
4. 方法
4.1 化学合成程序
除非另有说明,否则所有反应均使用烘箱干燥的玻璃器皿在氮气氛下进行。使用来自Sigma Aldrich的Molsieve干燥的溶剂,化学品购自Sigma Aldrich、TCI、Carbolution 和Carbosynth。从Eurisotop获得同位素标记的三甲基氨基甘氨酸。为了提取和色谱目的,在其使用之前蒸馏工业级溶剂。使用来自Merck的TLC-板(Merck 60 F254)进行反应控制,在MerckGeduran Si 60 (40-63 µM)上进行快速柱色谱纯化。通过UV吸收或通过Hanessian染色剂染色实现TLC板的可视化。在Varian VXR400S、Varian Inova 400、Bruker AMX 600、Bruker Ascend 400和Bruker Avance III HD上在氘代溶剂中记录NMR谱。HR-ESI-MS谱从Thermo FinniganLTQ FT-ICR获得。在具有金刚石-ATR(衰减全反射)单元的Perkin Elmer SpectrumBX FT-IR光谱仪上进行IR测量。使用来自Macherey Nagel的Nucleosil VP 250/10 C18柱,在Waters Breeze系统(2487双阵列检测器,1525二元HPLC泵)上进行HPLC纯化,HPLC级MeCN购自VWR。对于化合物1a/b、9a/b和10a/b的HPLC纯化,使用0.25 mM甲酸铵/H2O(称为缓冲液A)和0.25 mM甲酸铵/80%MeCN/H2O(称为缓冲液B)的缓冲系统。
4.2 羟胺1以及内标9a/b和10a/b的合成
4.2.1 (N-三苯甲基氨基氧基)乙酸 (6)
根据Kojima等人(8)合成(N-三苯甲基氨基氧基)乙酸。
4.2.2N-(丙-2-烯-1-基)-2-((三苯甲基氨基)氧基)乙酰胺 (7)
将N-三苯甲基保护的氨基氧基乙酸6 (2.50 g, 7.50 mmol, 1.0 eq)悬浮在DCM(40 mL)中,随后装入TBTU (2.89 g,9.00 mmol, 1.2 eq)、DIPEA (1.60 mL, 9.00 mmol,1.2 eq)和炔丙胺(1.40 mL, 22.6 mmol, 3.0 eq)。将该悬浮液在rt(室温)下搅拌,而在15小时后,形成澄清的淡黄色溶液。将混合物用EtOAc (300 mL)稀释,将有机相用NH4Cl (300mL)和NaHCO3(300 mL)洗涤,然后经Na2SO4干燥。最后在真空中除去挥发物,并通过柱色谱(10% EtOAc -->40% EtOAc/iHex)纯化粗混合物。得到7 (2.57g, 6.93 mmol, 92%),为无色固体。
4.2.3 2-((4-叠氮基苯基)氨基-N,N,N-三甲基-2-氧代乙胺鎓氯化物 (4a)
首先将甜菜碱3a (0.30 g, 2.56 mmol, 1.0 eq)在高真空下在180℃下干燥20分钟。冷却至室温后,将无色固体悬浮在DMF (25 mL)中。加入4-叠氮基苯胺盐酸盐2 (0.54g,3.17mmol, 1.2 eq)、TBTU (0.99 g, 3.07 mmol, 1.2 eq)和DIPEA (1.10 mL, 6.32mmol, 2.4 eq),而逐渐形成黄褐色溶液。在室温下搅拌1小时后,将所有固体溶解并将反应在室温下进一步搅拌过夜。然后真空除去DMF,通过柱色谱(DCM/MeOH/H2O/7N NH3(于甲醇中) = 90:10:0.6:0.6)纯化粗混合物,得到4a,为相应的三唑盐。然后将盐重新溶解在H2O(50 mL)中并酸化至pH = 1。然后用Et2O萃取水相,直至有机相级分的TLC分析显示不再有UV吸收。然后用浓NH3中和水层,并得到4a的氯化物盐(0.62 g, 2.30 mmol, 90%),为褐色粉末。
4.2.4N,N,N-三甲基-2-氧代-2-((4-(4-((2-((三苯甲基氨基)氧基)乙酰胺基)
甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)氨基)乙胺鎓氯化物/溴化物 (8a)
首先,将DCM和H2O的混合物(à 5 mL)冷冻-泵-解冻脱气(3x),然后加入叠氮化物4a (0.18 g, 0.65 mmol, 1.0 eq)、炔烃7 (0.24 g, 0.65 mmol, 1.0 eq)和CuBr•SMe2(40 mg, 0.20 mmol, 0.3 eq)。在室温下剧烈搅拌悬浮液过夜,而形成无色乳液。然后将混合物在减压下浓缩,并使用短的二氧化硅塞通过柱色谱(DCM/MeOH/H2O/7N NH3(于甲醇中)=80:20:0.6:0.6)纯化。得到8a,为浅黄褐色固体(0.32 g, 0.50 mmol, 77%)。
4.2.5 2-((4-(4-((2-(氨基氧基)乙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基-氨基)-N,N,N-三甲基-2-氧代乙胺鎓甲酸盐 (1a)
将三苯甲基保护的化合物8a (0.24g, 0.38 mmol)溶解在DCM (6 mL)中并加入6MHCl (6 mL)。将混合物在室温下剧烈搅拌1小时,直到可见相分离。然后用DCM (5 x 5mL)萃取水相,直到有机相级分的TLC分析显示不再有UV吸收。使用2M NH3将pH调节至9-10并真空除去水相。然后通过制备型HPLC (0% -->20%缓冲液B)进一步纯化75 mg的1a,得到23 mg(0.05 mmol, 26%)的X,为无色甲酸盐。
4.2.6N,N,N-三甲基-2-氧代-2-((4-(4-((2-((((3S,4R)-3,4,5-三羟基-亚戊基)氨基)氧基)乙酰胺基)-甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-氨基)乙胺鎓甲酸盐 (9a)
将1a (50.0 mg, 0.12 mmol, 1-0 eq)和2'-脱氧核糖(182 mg, 1.36mmol, 11.8eq)溶解在H2O (2.7 mL)中并在30℃和1400 rpm下在Eppendorf舒适型恒温混匀仪中孵育过夜。将混合物用0.2 μm注射器式过滤器过滤,随后通过HPLC纯化两次(0 -->15%缓冲液B)。得到纯产物9a (9.1 mg, 17 µmol, 15%),为无色泡沫。该化合物作为未归属的E/Z异构体的混合物存在于水溶液中。
4.2.7 (S,E)-3-(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)丙烯醛 (12)
将(2E)-3-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]丙-2-烯酸甲酯 11(0.20 g,1.08 mmol, 1.0 eq)溶于DCM (2.0 mL)中并冷却至-78℃。加入DIBAL-H(二异丁基氢化铝)(2.20 mL,2M,于甲苯中,2.1 eq),并将淡黄色混合物缓慢温热至室温。90分钟后,加入DCM (5.0 mL)和H2O (4.0 mL)和NaOH (2M, 2.0 mL)。在室温下再搅拌1小时后,将有机相与水相分离并经Na2SO4干燥。减压除去挥发物,以定量产率得到烯丙醇,不经进一步纯化即可使用。
将烯丙醇溶解在DCM (2.0 mL)中并冷却至0℃并向其中加入Dess-Martin-过碘烷(0.45 g, 1.08 mmol, 1.0 eq)。将乳状悬浮液缓慢温热至室温并搅拌过夜。加入饱和Na2SO4(10 mL)和Na2S2O3溶液(171 mg, 溶于10 mL H2O)后,用DCM (3 x 15 mL)萃取混合物,并经Na2SO4干燥。在真空中除去有机溶剂,并通过柱色谱(2.5% MeOH/DCM)纯化粗混合物。分离出醛12 (80 mg, 0.51 mmol, 47%),为无色油状物。
4.2.8 2-((4-(4-((2-((((1E,2E)-3-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-亚烯丙基)-氨基)氧基)乙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-氨基)-N ,N , N-三甲基-2-氧代乙烷-1-胺鎓甲酸盐 (10a)
将醛12 (20 mg, 0.13 mmol, 9.0 eq)与羟胺1a一起溶解在1:1的H2O和CHCl3的混合物(à 2.5 mL)中,并在室温下搅拌。通过HPLC (0 -->30%缓冲液B)监测反应过程,而确定在1小时后反应完成。然后用DCM (3 x 10 mL)洗涤水相并真空浓缩。得到13a (5.10 mg,9.50 µmol, 68%),为褐色粘性油状物,其不经进一步纯化即可使用。
将脱保护的丙酮化合物13a (4.00 mg, 7.50 µmol, 1.0 eq)溶解在MeOH中,并加入PTSA • H2O (1.40 mg,7.50 µmol, 1.0 eq)。将混合物在Eppendorf舒适型恒温混匀仪(1300 rpm, 25 ℃)中孵育过夜,并通过冻干在真空中除去溶剂。最后通过制备型HPLC (0-->35%缓冲液B,在45分钟内)纯化粗产物,得到纯的10a,为无色泡沫。
4.2.9 2-((4-叠氮基苯基)氨基-N,N,N-三(甲基-d3)-2-氧代乙胺鎓氯化物 (4b)
类似于4a合成4b,而[d11]-甜菜碱(98%氘, Euriso-TopGmbH)用于引入同位素标记。来自亚甲基基团的氘标记在反应条件下不稳定,并且观察到完全的D/H交换。因此,获得[d9]-标记的产物。
4.2.10 2-((4-(4-((2-(氨基氧基)乙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基-氨基)-N,N,N-三(甲基- d3)-2-氧代乙胺鎓甲酸盐 (1b)
根据1a合成同位素体1b,其中略作修改,即未分离三苯甲基保护的中间体8b并且不经进一步纯化就脱保护。
4.2.11N,N,N-三(甲基-d3)-2-氧代-2-((4-(4-((2-((((3S,4R)-3,4,5-三羟基-亚戊基)氨基)氧基)乙酰胺基)-甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-氨基)乙胺鎓甲酸盐(9b)
类似于9a合成内标9b,而获得(E)/(Z)-异构体的混合物(描绘为A和B)。
4.2.12 2-((4-(4-((2-((((1E,2E)-3-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-亚烯丙基)-氨基)氧基)乙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-氨基)-N ,N , N-三(甲基-d3)-2-氧代乙烷-1-胺鎓甲酸盐 (10b)
根据10a合成10b。
4.3 细胞培养
使用含有10%FBS (PAN Biotech)、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1x MEM非必需氨基酸溶液和0.1 mM β-巯基乙醇(Sigma Aldrich)的DMEM高葡萄糖作为mESC(小鼠胚胎干细胞)培养物的基础培养基。通过用1000 U/mL LIF (ORF Genetics)、3.0 µMGSK3抑制剂CHIR99021和1.0 µM Mek抑制剂PD0325901 (2i;Selleckchem)补充基础培养基,在明胶包被板上将mESC细胞系保持在原始状态。使用同位素标记的核苷的代谢标记实验通过在始发态条件下铺板mESC来进行,所述始发态条件由补充有1000 U/mL LIF的基础mESC培养基组成。将标记的核苷(B.A.C.H. UG)以下列浓度添加到培养基中:dG [15N5;13C10],100 µM,持续3天,然后用200 μM标记的dG处理2天;dC [15N3;13C9]和dT [15N2;13C10]均以100 μM的浓度使用总共5天。Dnmt TKO J1mESCs描述于Tsumura等人(21),并且J1野生型mESCs获自129S4/SvJae株系(22)。使用Cortazar等人(11)报道的Tdg+/-和Tdg-/-细胞系。
4.4 细胞裂解和DNA分离
使用来自Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit实现基因组DNA的分离。用PBS (Sigma)洗涤所有mESC样品,并通过加入含有400 μM 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和甲磺酸去铁胺(DM)的G2缓冲液直接在板中裂解。通过在微量离心管中每管使用一个5 mm直径的不锈钢珠和MM400珠磨机(Retsch)以30 Hz进行珠磨1分钟来剪切DNA,然后以15000 rpm离心10分钟。根据待分离的基因组DNA的量,用蛋白酶K(对于genomic tips 20G为25 μL,对于genomic tips 100G为100 μL)和RNase A (2.0 μL/20G, 10 μL/100G)在50℃下处理细胞裂解物1小时。30分钟后,向混合物中加入另外的RNase A(分别为2.0 μL或10 μL)。然后用上样缓冲液QBT(1.0 mL/20G或4.0 mL/100G)平衡Genomic tip柱,并将涡旋1分钟的裂解物施加到柱上。在全部液体已进入柱后,用缓冲液QC(2.0 mL/20G或2x7.5 mL/100G)进行洗涤步骤,最后用补充有400 µM BHT (丁羟甲苯)的QF缓冲液(2.0 mL/20G或5.0 mL/100G)洗脱基因组DNA。然后通过加入i-PrOH (1.4 mL/20G或3.5 mL/100G, 70% Vol)实现沉淀,并将得到的基因组DNA沉淀离心(15分钟,6000 g,4℃)。弃去上清液,洗涤步骤使用70% EtOH进行(5.0 mL, 15分钟, 6000 g, 4 ℃)。最后,将纯DNA沉淀重悬于1.0 mL 70%EtOH中并离心(10分钟,15000 rpm,4℃)。接下来,除去上清液,将沉淀重新溶解在含20 μM BHT的ddH2O(50 - 100 μL)中。用NanoDrop (ND 1000, Peqlab)测定浓度。
4.5 用1a衍生基因组DNA
用1在20 μL总体积中进行无碱基位点(未标记的gDNA为5.0 μg,标记的gDNA为20μg)的衍生,而溶液用HEPES (20 mM, pH = 7.5)和Na2EDTA (0.1 mM)缓冲。向缓冲溶液中加入1在H2O中的原液(23.8 mM)(1的终浓度 = 1.5 mM),并通过将混合物涡旋5秒开始反应。将gDNA在Eppendorf舒适型恒温混匀仪中在37 ℃/1400 rpm下孵育40分钟。通过加入1-萘甲醛(66.7 μL, 2M,于i-PrOH中)猝灭过量的1来停止反应并在37 ℃/1400 rpm下再次孵育10分钟。然后通过加入NaOAc (3.3 μL, 3M)使衍生的DNA沉淀,涡旋并孵育(在37 ℃/1400 rpm下)另外5分钟。加入纯i-PrOH (66.7 μL),将管倒置数次,然后离心(60分钟,10℃,15000 rpm)。除去上清液并进行洗涤步骤(1x75%i-PrOH, 10 ℃, 15000 rpm, 30分钟;2x75%冷EtOH, 4 ℃, 15000 rpm,30分钟),而在每个洗涤步骤后小心除去上清液。最终将得到的DNA沉淀重新溶解在35 μL的ddH2O中,然后酶促消化至核苷水平。
4.6 衍生的基因组DNA的酶促消化
对于酶促消化基因组DNA(未标记的gDNA为5.0 μg或标记的gDNA为20 μg,于35 µLH2O中),我们使用480 µM ZnSO4的水溶液并将混合物在37℃孵育3小时。该溶液由以下组成:5U热敏磷酸酶(New England BioLabs)、42 U核酸酶S1 (米曲霉(Aspergillius oryzae),Sigma-Aldrich)和特定量的标记内标,其用于精确定量DNA修饰和衍生的无碱基位点。在第二轮消化中,我们加入于7.5 μl的520 μM [Na]2-EDTA中的0.2 U蛇毒磷酸二酯酶I (东部菱背响尾蛇(Crotalus adamanteus),USB corporation),并将混合物在37℃下再孵育3小时或过夜。消化后,将样品储存在-20℃并使用AcroPrep Advance96过滤板0.2 μm (0.20 μmSupor,Pall Life Sciences)过滤,然后进行LC-MS/MS分析(进样量为39 μg,4℃)。
4.7 DNA样品的LC-ESI-MS/MS分析
对于LC-MS/MS研究,我们使用三重四极杆质谱仪Agilent 6490和Agilent 1290UHPLC系统(具有紫外检测器)。基于早期公开的工作(23-27),我们开发了一种新方法,并将其与同位素稀释技术相结合,这允许我们在一个单次分析运行中精确定量衍生的无碱基位点、所有规范核苷和胞嘧啶修饰。
色谱分离在Poroshell 120 SB-C8柱(Agilent, 2.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)上进行。洗脱缓冲液是水和MeCN,各自含有0.0085% (v/v)甲酸,流速为0.35 ml/min,在30℃。梯度为:0 → 5 min;0 → 3.5% (v/v) MeCN;5 → 6.9 min;3.5 → 5% MeCN;6.9 →13.2 min;5 → 80% MeCN;13.2 → 14.8 min;80% MeCN;14.8 → 15.3 min;80 → 0%MeCN;15.3 → 17 min;0% MeCN。直到1.5 min和12.2 min后的洗脱液被Valco阀转移到废物中。
通过直接注入合成的内标,我们优化了依赖来源的参数,如下:气体温度50℃,气体流量15 l/min (N2),雾化器30 psi,鞘气加热器275℃,鞘气流量11 l/min (N2),毛细管电压2500 V(正模式)和-2250 V(负离子模式),喷嘴电压500 V,碎片电压380 V,ΔEMV 500(正模式)和800(负模式)。在方法开发期间给出最高强度的化合物依赖性参数总结在表1中。
表1:
用于分析基因组DNA的化合物依赖性LC-MS/MS-参数。CE:碰撞能量,CAV:碰撞池加速器电压,EMV:电子倍增器电压。在正([M+H)]+物质)以及负([M-H]-物质)离子选择反应监测模式(SRM)中分析核苷。
4.8 方法验证和数据处理
如先前已公开的工作(24)中所述进行方法验证和数据处理。为了获得校准曲线,以三个技术重复分析各标准物(5-8个标准浓度),并使用Origin® 6.0 (Microcal™)进行线性回归。因此,分别将未标记的衍生化无碱基位点9a和10a与内标(*)的曲线下面积的比(A/A*)相对于未标记的衍生化无碱基位点9a和10a与内标(*)的物质的量的比(n/n*)作图(见图7)。无需加权即可计算校准函数。获得了可接受的精密度(<20%相对标准偏差)和准确度(80-124%)。当各校准标准物的以三个技术重复测量的A/A*比具有<20%的标准偏差时,获得精密度。准确度是以百分比计的各浓度的使用的与计算的物质的量的比例。为了证明准确度,我们使用相应的校准函数来从各校准标准物的A/A*比计算物质的量n。
最低检出限(LOD)定义为在空白时获得的相应化合物的MS信号响应的三倍。最低定量限(LLOQ)被定义为满足准确度和精密度要求并且实现高于LOD的响应的最低浓度。LLOQ和LOD的汇编如表2所示。
表2:
根据消化的DNA量,汇编绝对最低定量限 [fmol](LLOQ)和相对LLOQs [每dN]。相
对LLOQs通过产生绝对LLOQ [fmol]与相应DNA量[μg]中核苷的总量(N; [fmol])的比例来
计算。通过考虑mESC中的G-含量(21%G),使用单体DNA实体的平均摩尔质量(308.91 g
mol-1)得到核苷总量。
绝对LOD [fmol] | 绝对LLOQ [fmol] | 相对LLOQ [每dN] | 相对LLOQ [每dN] | |
DNA量 | 5 µg | 20 µg | ||
9a | 0.11 | 1.02 | 6.3E-08 | 1.57E-8 |
10a | 0.11 | 1.01 | 6.3E-08 | 1.56E-8 |
4.9 制备具有确定无碱基位点的合成13-mer寡核苷酸
在95℃下在UDG-缓冲液(150 μL, 20 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 1 mM DTT, 1.0mM EDTA,New England Biolabs)中孵育寡核苷酸(5'-GTA ATG UGC TAG G-3'和3'-CATTAC ACG ATC C-5', à 15 nmol,Metabion) 5分钟,然后缓慢冷却至室温。加入UDG(5.0 μL, 25单位,New England Biolabs),小心混合,并将混合物在37℃下孵育2小时。然后如下段所述通过氯仿/苯酚提取分离寡核苷酸。加入CHCl3/苯酚溶液(200 μL,Roti Phenol),涡旋30秒并在室温和13400 rpm下离心3分钟。小心除去水相,并重复CHCl3/苯酚处理两次。加入NaOAc (20 μL, 3M)后,用i-PrOH (600 μL)沉淀寡核苷酸。将得到的DNA沉淀在室温下离心30 (15000 rpm),用冷EtOH (300 μL)洗涤,并在4℃和15000 rpm下再离心30分钟。再次重复洗涤步骤,除去上清液,将沉淀在空气中干燥5分钟,然后将寡核苷酸重新溶解在ddH2O(150 μL)中。最终通过MALDI-TOF分析证实了身份。
4.10 具有确定无碱基位点的合成寡核苷酸的反应动力学
在20 μL的总反应体积中,用HEPES缓冲液(20 mM, pH = 7.5)和Na2EDTA (0.1mM)缓冲寡核苷酸(300 pmol),并加入1 (1.26 μL的23.8 mM原液)。在将混合物涡旋5秒之后开始反应(37℃,800rpm,Eppendorf舒适型恒温混匀仪),并且在特定时间点(t = 15 s、30 s、45 s、90 s、120 s、150 s、180 s、4 min、6 min、8 min、15 min、20 min)之后通过加入丙酮(200 μL)停止,并在液氮中冷冻等分试样。在speed vac (RVC-2-33 IR,Christ)上除去过量的丙酮,并在AcroPrep Advance 96孔滤板(0.20 μmSupor,Pall Life Sciences)上过滤。随后将75 pmol DNA注入Dionex micro HPLC系统中,并使用Zorbax SB-C 18 柱(0.55 x250 mm, 5.0 μm孔径)以350 μL/min的流速分离反应产物。分析在60℃的柱温和45分钟内0% ->20%缓冲液B的梯度(而缓冲液A = 10 mM TEAB, pH = 7.5,于H2O中,缓冲液B = 10mM TEAB, pH = 7.5,于80% MeCN/H2O中)下进行。所获得的UV信号的整合(图8)最终显示,1与ODN上的无碱基位点的反应在20分钟后完成,并且在生理条件下没有产生其他碎片。
4.11 酶促消化的效率
为了验证庞大的衍生化无碱基位点是否可以被上述酶混合物切除,我们量化了用上面部分中提到的寡核苷酸形成的无碱基位点的量。将与试剂1a反应40分钟的寡核苷酸的等分试样稀释1/4000,加入一定量的标记内标,并将混合物消化至核苷水平。我们测定136pmol的无碱基位点总量。通过其UV迹线定量相同寡核苷酸的dG的量,并且计为762 pmol。由于在双链构建体中存在六个dG碱基,因此可以预期将构成dG量的1/6(127 pmol)的无碱基位点的量,表明消化完全且水解酶不受无碱基位点加合物阻碍。
4.12基因组DNA中无碱基位点的反应动力学
使用与上述(用1衍生基因组DNA)相同的条件,通过用1衍生5 μg的gDNA进行反应。在特定时间点(t = 1 min、2.5 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min)通过加入1-萘甲醛(66.7 μL, 2M,于i-PrOH中)停止反应。最后将反应等分试样消化至核苷水平并定量(图9)。在5分钟的反应时间后,所有无碱基位点被衍生化,并且延长孵育直至60分钟表明在使用条件下没有人为产生无碱基位点。
5. 合成硫醇反应性探针并用于谷胱甘肽(GSH)的MS分析
作为能够与分析物分子上的硫醇官能团反应的探针的实例,合成丙烯酰胺试剂并在谷胱甘肽(GSH)的MS分析中进行测试。反应方案如图10所示。
5.1 丙烯酰胺探针的合成
首先,将羟胺探针(20 mg, 0.044 mmol, 1.0 eq)溶解在EtOAc/H2O (2:1, 3.0mL)的混合物中,加入Na2CO3(19 mg, 0.176 mmol, 4.0 eq)并冷却至0℃。在剧烈搅拌下加入丙烯酰氯(120 μL, 1.47 mmol, 33 eq),并将反应混合物在0℃保持30分钟。通过冻干除去挥发物,并通过半制备HPLC (0%-->40% 缓冲液B,在40分钟内,缓冲液A: 25 mMNH4HCOO, pH = 4.3,于H2O中, 缓冲液 B: 20%缓冲液A,于MeCN中),使用来自Machery&Nagel的Nucleodur C18ec柱纯化粗混合物。最后将含有所需化合物的级分冻干,得到产物(6.0 mg, 0.013mmol, 30%),为褐色油状物。
5.2 GSH加合物的合成
将丙烯酰胺探针(3.0 mg, 0.007 mmol, 1.0 eq)溶解在NaHCO3/Na2CO3缓冲液(2.0 mL, 60 mM, pH = 10)中。加入谷胱甘肽(2.0 mg, 0.007 mmol, 1.0 eq),并将混合物在50℃下孵育3小时。通过冻干除去挥发物,并通过半制备HPLC (0%-->30% 缓冲液B,在40分钟内,缓冲液A: 25 mM NH4HCOO, pH = 4.3,于H2O中, 缓冲液 B: 20%缓冲液A,于MeCN中),使用来自Machery&Nagel的Nucleodur C18ec柱纯化粗残余物。得到GSH-加合物,为无色固体(4 mg, 0.005mmol, 74%)。
5.3 GSH加合物的MS分析
MS分析显示在前体离子扫描下在质谱仪中带单电荷的物质的N2丢失。带双电荷的物质直接显示N2丢失。结果如图11所示。
6. 酮反应性探针在睾酮的MS分析中的用途
作为能够与分析物分子上的酮官能团反应的探针,使用羟胺试剂并在睾酮的MS分析中进行测试。反应方案如图12所示。
6.1合成程序
将睾酮(20 mg, 0.069 mmol, 1.0 eq)溶于H2O/MeCN/MeOH (1:1:1, 1.0 mL,含0.05%甲酸)的混合物中。加入羟胺试剂(28 mg, 0.069 mmol, 1.0 eq),并将混合物在40℃下孵育过夜。在真空中除去挥发物,最后通过半制备HPLC(50% MeCN至80% MeCN,于H2O中 +0.05%甲酸,在40分钟内, 0.5 mL/min)纯化粗产物。得到加合物,为无色固体(5 mg, 0.009mmol, 13%)。
注:加合物是作为未归属的E/Z异构体的53/46混合物产生的。
6.2质谱细节
将睾酮加合物溶于水/乙腈(1:1)中,原液浓度为2.1 mM。用相同的溶剂混合物进行连续稀释,最终得到浓度为0.12 pM的溶液。对加合物进行UHPLC-QQQ-MS,使用0.35 mL/min的流速,梯度从50%缓冲液B(含有0.0075%甲酸的乙腈)开始,而注入1.0 μL该溶液等于0.12 amol。该量在质谱仪中仍然可以检测到,质量跃迁为632.4 → 604.4,定性离子跃迁为632.4 → 192.1。
相比之下,将纯睾酮溶于EtOH/乙腈(1:1)中,原液浓度为11.04 mM。用相同的溶剂混合物进行连续稀释,并得到11 pM的最终浓度。对该溶液再次进行UHPLC-QQQ-MS,流速为0.35 mL/min,使用从50%缓冲液B(含有0.0075%甲酸的乙腈)开始的梯度,而该原液的2.0μL进样量等于 22 amol。该量在质谱仪中仍然可以检测到,质量跃迁为289.2 → 109.2。仅注入1.0 μL未显示高于背景噪音的信号。
总之,可以比未衍生化的睾酮高185倍的灵敏度检测加合物。
结果显示在图13-15中。
7. 反应性酯探针在多巴胺的MS分析中的用途
制备以下多巴胺和反应性酯化合物的加合物
并通过HR-MS和UHPLC-MS/MS表征。
HR-MS: C26H33N8O6 +的计算值: 553.2518, 实测值: 553.2518.
将加合物溶解并稀释在MeOH/乙腈(1:1)中,并进行UHPLC-MS/MS。进行产物离子扫描鉴定了氮丢失,峰为525.2,这是由于裂解m/z为553.4的分子离子产生的。
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Claims (19)
1.通式(I)的化合物或包含至少一种化合物(I)的组合物或试剂盒用于质谱测定分析物分子的用途
X–L1–Y(–L2–Z)r(I)
其中,
X是能够与分析物分子反应的反应基团,由此形成与分析物分子的共价键,其中所述反应基团X是羰基反应基团、亲二烯基团、羧酸酯反应基团、酚反应基团、氨基反应基团、羟基反应基团或硫醇反应基团,
L1是键或间隔基,
Y是中性离子丢失单元,其本身是中性的并在质谱条件下能够裂解,由此释放中性物质,
其中中性离子丢失单元Y能够通过逆环加成反应裂解,并且其中中性离子丢失单元Y由环状偶氮化合物或5-元杂环部分组成,其具有至少2个杂原子,
L2是键或间隔基,
Z是电荷单元,其包含至少一个带电荷的部分,
r是1,
包括通式(I)的化合物的任何盐。
2.权利要求1的用途,其中所述反应基团X是羰基反应基团,其中X选自
(i)肼基团,选自H2N-NH-和H2N-NR1-基团,
其中R1为任选取代的芳基或C1-4烷基,
(ii)腙基团,选自H2N-NH-C(O)-和H2N-NR2-C(O)-基团,
其中R2为任选取代的芳基或C1-4烷基,
(iii)羟基氨基基团,和
(iv)二硫醇基团。
3.权利要求1的用途,其中所述反应基团X是硫醇反应基团,选自反应性卤代乙酰基基团。
4.权利要求1的用途,其中所述反应基团X是氨基反应基团,选自活性酯基。
5.权利要求1或2的用途,其中所述中性物质是无机分子。
6.权利要求1或2的用途,其中所述电荷单元Z包含以下物质或由以下物质组成:
(i)至少一个带正电荷的部分,或者
(ii)至少一个带负电荷的部分。
7.权利要求1或2的用途,其中所述电荷单元Z包含一个永久带正电荷的部分或由一个永久带正电荷的部分组成。
8.权利要求1或2的用途,其中所述化合物(I)在质谱条件下还能够进行替代裂解,由此释放出与所述中性物质不同的第二中性物质。
9.权利要求1或2的用途,其中所述化合物(I)具有通式(Ib):
X1–L1–Y1(–L2–Z)r(Ib)
其中
L1、L2、Z和r如权利要求1或2中所定义,
X1是羰基反应基团,和
Y1是中性离子丢失单元,包含
(i)环状偶氮化合物或5-元杂环部分,其具有至少2个杂原子,其在质谱条件下能够裂解,由此释放第一中性物质,其中中性离子丢失单元Y能够通过逆环加成反应裂解,
和
(ii)在质谱条件下能够进行替代裂解的部分,由此释放出与所述第一中性物质不同的第二中性物质。
10.权利要求1或2的用途,其中所述化合物(I)具有通式(Ic):
其中R在每种情况下独立地为H或C1-4烷基,并且A是阴离子。
11.权利要求1或2的用途,其中化合物(I)是同位素体。
12.用于质谱测定分析物分子的方法,包括以下步骤:
(a)使分析物分子与权利要求1-11中任一项所定义的通式(I)的化合物共价反应,由此形成分析物分子和试剂的加合物,和
(b)对来自步骤(a)的加合物进行质谱分析,
其中所述质谱分析步骤(b)包括:
(i)使所述加合物的离子进行质谱分析的第一阶段,由此所述加合物的离子根据其质/荷(m/z)比表征,
(ii)引起所述加合物离子裂解,由此释放出第一中性物质,并产生加合物的子离子,其中所
述加合物的子离子的质/荷(m/z)比与所述加合物离子的质/荷(m/z)比不同,和
(iii)使所述加合物的子离子进行质谱分析的第二阶段,由此所述加合物的子离子根据其质/荷(m/z)比表征。
13.根据权利要求12的方法,其中(ii)进一步包括所述加合物离子的替代裂解,由此释放出不同于第一中性物质的第二中性物质,并产生加合物的第二子离子。
14.根据权利要求12或13的方法,其中(iii)进一步包括使加合物的第一和第二子离子进行质谱分析的第二阶段,由此所述加合物的第一和第二子离子根据它们的质/荷(m/z)比表征。
15.通过权利要求1-11中任一项所定义的通式(I)的化合物与分析物分子的反应形成的共价加合物用于质谱测定分析物分子的用途,其中所述共价加合物为通式(II)的化合物:
T–X'–L1–Y–(L2–Z)r(II)
其中
T是分析物分子,
X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子的反应得到的部分,并且L1、Y、L2、Z和r如权利要求1-11中任一项所定义。
16.权利要求15的用途,其作为校准物和/或作为标准物。
17.权利要求15的用途,其中所述共价加合物是通式(II)的化合物:
T–X'–L1–Y(–L2–Z)r(II)
其中
T是分析物分子,
X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子的反应得到的部分,并且L1、Y、L2、Z和r如权利要求1-11中任一项所定义,
其中所述加合物带有正电荷或负电荷。
18.权利要求17的用途,其中所述分析物分子T是具有碳水化合物部分的分子。
19.权利要求15的用途,其中所述共价加合物为通式(IIa)的化合物
T–X'–L1–Y–L2–Z(IIa)
其中
T是分析物分子,
X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子的反应得到的部分,和
T、X’、L1、Y、L2和Z如权利要求15所定义,
包括通式(IIa)的化合物的任何盐。
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