CN101511844A - 利用包含非编码可检测标记的质量标签试剂进行的分析物测定 - Google Patents

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CN101511844A CN200780032436.7A CN200780032436A CN101511844A CN 101511844 A CN101511844 A CN 101511844A CN 200780032436 A CN200780032436 A CN 200780032436A CN 101511844 A CN101511844 A CN 101511844A
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Abstract

本发明涉及与使用包含报告物部分和非编码可检测标记的化合物通过质谱法进行分析物测定和/或定量有关的方法、混合物、试剂盒和组合物。所述化合物可成组用于分析被标记分析物的混合物。

Description

利用包含非编码可检测标记的质量标签试剂进行的分析物测定
本文中使用的段落标题仅用于组织目的，不应理解为以任何方式限制本文所述的主题。
技术领域
本发明涉及与使用质谱技术进行分析物测定相关的方法、混合物、试剂盒和组合物。
背景技术
本发明涉及通过质谱分析来测定分析物。在多个实施方案中，所述质谱分析可以与电泳分离技术联用。分析物可以是任何目的分子。(天然和/或合成)分析物的非限制性实例包括但不仅限于蛋白质、肽、核酸、糖、脂质、氨基酸、维生素、类固醇、前列腺素类和/或其它质量小于1500道尔顿(Da)的小分子。可使用独特的标记试剂来测定分析物，所述标记试剂使得能够对复杂混合物中的分析物进行相对和/或绝对定量。所述标记试剂可在同分异构和/或同量异位(isobaric)组中使用以分析复杂的样品混合物，其中所述标记试剂可以是同分异构的和/或同量异位的。
下述同分异构和/或同量异位标记试剂是已知的，其包含报告物部分、平衡物(或连接物)部分和反应基团，其中在该组成物的与分析物反应后的形式中所述反应基团可被该分析物取代。包含这三种要素的标记试剂和被标记分析物的实例例如已经公开于以下文献中：已公开的共同未决并且共同拥有的美国专利申请序列号US 2004-0219685 A1、US 2005-0114042A1、US 2005-0147982 A1、US 2005-0147985 A1、US 2005-0147987 A1、US 2005-0148771 A1、US 2005-0148773 A1和US 2005-0148774 A1。同分异构和/或同量异位标记试剂组可用于标记例如两种或更多种不同样品的分析物，其中组中的不同标记试剂均具有相同的粗略质量(gross mass)，但可以独特地编码每种报告物部分，使得该组中的每种报告物部分具有独特的粗略质量并产生具有独特粗略质量的相应特征离子(signature ion)。由于该组中所有的试剂均具有相同的粗略质量但包含独特粗略质量的报告物部分，因此所述平衡物(或连接物)部分一般(但不一定)也包含一个或多个重原子同位素，由此来“平衡”每种独特报告物的质量，使得该组中每种报告物/连接物组合具有相同的粗略质量。
本文描述了可在同分异构和/或同量异位组中使用的新标记试剂，其中所述标记试剂包含非编码的可检测标记。图1a展示了本发明示例性标记试剂(和被标记分析物)的要素以及关于该分子在质谱仪中可能的断裂特征的一些信息。如图所示，连接物部分可以线性或分支模式与标记试剂(或被标记分析物)的要素连接。在同分异构和/或同量异位组中使用时，组中标记试剂的多种非编码可检测标记可以全部均具有以下特征：1)可独立检测；2)包含相同的粗略质量；和3)包含相同的净电荷。因此，本文公开的标记试剂可同时包含可通过非质谱方法独立检测的部分以及可在质谱仪中独立检测的不同部分。特别地，本文所述的新标记试剂可用于例如与质谱分析联用的电泳分离方法中，其中所述非编码可检测标记的特性可用于在电泳分离时和/或电泳分离后定位和/或定量被标记分析物的混合物，并且其中质谱法可用于鉴定和/或定量样品中的目的分析物或其片段。
在一些实施方案中，所述标记试剂和/或被标记分析物可以是与支持物结合的。图1b展示了本发明示例性的与支持物结合的标记试剂(和与支持物结合的被标记分析物)的要素以及关于该分子在质谱仪中断裂特征的一些信息。如图所示，连接物部分可以线性或分支模式与支持物上结合的标记试剂(或与支持物结合的被标记分析物)的要素连接。
本发明的实施方案特别适用于复杂样品混合物的多重分析。例如，本发明的一些实施方案可用于蛋白质组分析和/或基因组分析以及用于与基因组和/或蛋白质组分析相关的关联性研究。本发明的一些实施方案可用于小分子分析，例如脂质、类固醇、维生素、前列腺素和/或氨基酸分析。可以使用同分异构和/或同量异位试剂的实验分析包括但不仅限于时程研究、生物标记研究、多重蛋白质组分析、多维蛋白质鉴定技术实验(mudpitexperiment)、亲和捕获测定(affinity pull-down)、翻译后修饰(post-translational modification，PTM)测定(参阅如已公开的美国专利申请No.US 2005-0208550 A1)和多重对照实验。
附图说明
本领域技术人员会理解，下文描述的附图仅用于说明目的。这些附图并不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。
图1a是以其要素形式表示的示例性标记试剂的多种断裂特征的图示。
图1b是以其要素形式表示的示例性的与支持物结合的标记试剂的特定断裂特征的图示。
图2a是以通式表示的多种标记试剂的特定断裂特征的图示。
图2b是多种标记试剂的特定断裂特征的图示。
图2c是多种标记试剂的特定断裂特征的图示。
图3a是以通式表示的多种被标记分析物的特定断裂特征的图示。
图3b是多种被标记分析物的特定断裂特征的图示。
图3c是多种与支持物结合的被标记分析物的特定断裂特征的图示。
图3d是已从固相支持物上释放的多种被标记分析物的特定断裂特征的图示。
图4a是示例性同量异位化合物的图示。
图4b是示例性同分异构同量异位化合物的图示。
图5是可由某些基于N-甲基哌嗪的报告物部分产生的多种可能的报告物离子(特征离子)的图示。
图6是使用与支持物结合的标记试剂来制备与支持物结合的被标记分析物、随后从该固相支持物上释放所示被标记分析物的方法的图示。
图7是合成多种活性酯的方案的图示。
图8a是用于式II和III标记试剂的可能的同位素编码策略的图示。
图8b是用于式IIss和IIIss标记试剂的可能的同位素编码策略的图示。
图9a展示了代表性标记试剂的预计合成途径的一部分。
图9b展示了代表性标记试剂的预计合成途径的其余部分(相对于图9a)。
图10a至1od展示了合成编码的N-Fmoc、N’-甲基乙基二胺的多个步骤。
图11展示了合成经编码的报告物/连接物部分的一部分。
图12展示了合成经编码的报告物/连接物部分的一部分。
图13a展示了代表性标记试剂的预计合成途径的一部分。
图13b展示了代表性标记试剂的预计合成途径的其余部分(相对于图13a)。
图14展示了所提出的非编码可检测标记的合成途径。
本申请中引用的所有文献和类似材料(包括但不仅限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和网页)无论其形式如何均明确地通过参考整体并入本文用于任何和所有目的。
定义
出于解释本说明书的目的，将使用下述定义；只要适当时，以单数应用的术语也将包括其复数形式，反之亦然。出于解释本说明书及其相关权利要求书的目的，在任何下述定义与任何其它文件(包括为所有目的的任何通过参考并入本文的文件)中该词语用法相抵触的情况下，将总是以下述定义为准，除非明确指出相反的含义(例如在解释最初使用该术语的文件时)。本文中“或”的用法意指“和/或”，除非另外说明或者在使用“和/或”明显不合适的情况下。本文中不用数量限定或者使用“一”(“a”)时意指“一个或多个”，除非另外说明或者在使用“一个或多个”明显不合适的情况下。“包括”、“包含”、“含有”可互换使用，并非意在限制。此外，在一个或多个实施方案的描述中使用了术语“包含”的情况下，本领域技术人员将会理解，在一些具体情况下，作为替代，所述实施方案可使用语言“基本上由...组成”和/或“由...组成”来描述。还应当理解，在一些实施方案中，步骤的次序或进行某些动作的次序并不重要，只要本发明的教导仍可实施就行。而且，在一些实施方案中，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
a)本文使用的“分析物”指可以测定的任何目的分子。分析物的非限制性实例包括但不仅限于蛋白质、肽、核酸(例如DNA或RNA)、氨基酸、糖、脂质、类固醇、维生素(例如维生素D2(有时称为麦角钙化醇)、维生素D3(有时称为胆钙化醇)、维生素B2、维生素B6、维生素A、维生素A2、维生素E、维生素K及其代谢物)、前列腺素和其它分子量低于1500道尔顿(Da)的小分子。分析物的来源或含有分析物的样品并无限制，因为它可来自任何来源。所述分析物可以是天然或合成的。分析物的来源或含有分析物的样品的非限制性实例包括但不仅限于细胞或组织或者其培养物(或其继代培养物)。分析物来源的非限制性实例包括但不仅限于粗制或经处理的细胞裂解物、体液、组织提取物、细胞提取物或者分离处理(例如色谱分离、1D电泳分离、2D电泳分离或毛细管电泳分离)的级分(或部分)。体液包括但不仅限于血、尿、排泄物、脊髓液、脑液、羊水、淋巴液或来自腺体分泌物的流体。我们用“经处理的细胞裂解物”来表示除了裂解细胞所需的处理以外，该细胞裂解物还经过处理以对收集的材料进行其它处理。例如，所述样品可以是包含一种或多种分析物的细胞裂解物，所述分析物是用一种或多种蛋白水解酶处理所述细胞裂解物以消化前体肽和/或蛋白质而形成的。
b)除了在其使用语境中明确表示并非如此以外(例如提到其它的特定结构时)，“酯”表示酯和/或硫酯。
c)本文使用的“可切割连接物”指与固相支持物共价连接的部分，它将标记试剂或被标记分析物与支持物可切割地连接起来，其中所述可切割连接物中的至少一个键可通过光、热或化学试剂(为消除疑义，“化学试剂”旨在包括酶)处理进行切割，从而从该支持物上释放该标记或被标记分析物或者其片段。
d)本文使用的“断裂”指共价键的断开。
e)本文使用的“片段”指断裂产物，或“断裂”指导致断裂的操作。
f)本文使用的“水合物形式”指化合物的任何水合状态或者化合物的多于一种水合状态的混合物。例如，本文所述标记试剂可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，例如，本文所述标记试剂的样品可以同时包含一水合物、二水合物和半水合物的形式。
g)本文使用的卤素基团或卤素指-F(氟)、-Cl(氯)、-Br(溴)或-I(碘)。
h)本文中涉及化合物使用时，“同位素富集的”指富集了一种或多种重原子同位素(例如稳定同位素，例如氘(即2H)、13C、15N、18O、34S、37Cl或81Br)的化合物(例如标记试剂)。同位素富集的化合物可以是以合成方式富集的。在一些实施方案中，也可以使用不稳定的同位素(例如14C或3H)。“富集的”指重原子同位素的量超过了天然同位素丰度。在多个实施方案中，同位素富集的化合物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个同位素富集位点。
由于同位素富集不是100％有效，因此化合物样品中可能有富集程度较低并具有较低质量的杂质。类似地，由于过富集(例如不想要的富集)和天然同位素丰度，化合物样品中可能有质量较大的杂质。在一些实施方案中，每种掺入的重原子同位素在同位素富集位点可以至少80％的同位素纯度存在。在一些实施方案中，每种掺入的重原子同位素在同位素富集位点可以至少93％的同位素纯度存在。在一些实施方案中，每种掺入的重原子同位素在同位素富集位点可以至少96％的同位素纯度存在。在一些实施方案中，每种掺入的重原子同位素在同位素富集位点可以至少98％的同位素纯度存在。
i)本文使用的“同位素富集位点”指化合物中重原子同位素替代轻形式原子(例如13C替代12C、18O替代16O、15N替代14N或者氘替代氢)的位置。
j)本文中涉及化合物时使用的“轻”指该化合物未富集重原子同位素。本文中涉及原子时使用的“轻”指该原子的最低质量同位素。本文中涉及化合物时使用的“重”指该化合物富集了至少一种重原子同位素。本文中涉及原子时使用的“重”指该原子的重质量同位素。
k)本文使用的“标记试剂”指适于标记分析物以用于测定的部分。术语“标记”与术语“标签”和“标志”以及其它等同术语及短语意义相同。例如，被标记分析物也可以称为有标签的分析物或有标志的分析物。因此，术语“标记”、“标签”、“质量标签”、“标志”和这些术语的衍生形式是等同的并可互换，指适于对分析物进行标记或标志以用于测定的部分。有时，标记试剂可称为标签试剂或质量标签试剂。
l)本文使用的“天然同位素丰度”指基于同位素在自然界中的天然出现率而可见于化合物中的一种或多种重同位素的水平(或分布)。例如，得自活植物材料的天然化合物可含有约1.08％的13C(相对于12C)。
m)本文使用的同量异位物是具有相同标称粗略质量而在结构上不可区分(除了同位素含量和/或重原子同位素分布以外)的化合物。为消除任何疑义，图4a的化合物1-4就本文所述定义而言是同量异位的。相比之下，本文使用的同分异构体是具有相同标称粗略质量而在结构上可区分的化合物。示例性异构的同量异位物示于图4b。
n)本文使用的“支持物”、“固相支持物”、“固相载体”或“树脂”指任何固相材料。固相支持物涵盖诸如“支持物”、“合成支持物”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“支持物”的术语。固相支持物可由有机聚合物构成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯醚和聚丙烯酰胺以及它们的共聚物和接枝物。固相支持物还可以是无机的，例如玻璃、二氧化硅、可控孔径玻璃(controlled-pore-glass，CPG)或者反相二氧化硅。固相支持物的构造可以为珠、球、微粒、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平的、基本平的或者是不平的。固相支持物可以是多孔的或者不是多孔的，并可具有膨胀或非膨胀的特征。固相支持物可以构建为孔、凹坑或其它容器、管、图案或单元的形式。多个固相支持物可以设置为不同位置上的阵列，其对试剂的自动递送是可寻址的，或者通过检测方法和/或设备而寻址。
o)本文使用的“与支持物结合”指以共价方式固定在固相支持物上的化合物。
p)本文使用的“样品或其级分”或“样品级分”可用于表示样品的级分。该样品的级分可通过简单地取出样品的级分来产生，或者可通过实施使样品分成两个或更多个级分的分离方法来产生。除非说明书的内容表明为其它含义，否则这些短语均为等同的并可互换，指以任一类型方法来产生样品的级分(或部分)。
q)本文使用的“特征离子”和“报告物离子”可互换，均指在质谱仪中通过断裂标记试剂或被标记分析物而由报告物部分产生的具有独特质量的特征离子。特征离子或报告物离子可用于鉴定用于标记分析物的独特标记试剂，并可将其在MS/MS分析中的峰强度与所分析样品(或其级分)中所存在的被标记分析物的量相关联。本文使用的特征离子或报告物离子有时仅称为报告物。本文所使用的报告物部分有时也仅仅指报告物。应该理解，报告物部分指连接在标记试剂、被标记分析物或其片段上的基团，而报告物离子指在连接该报告物部分与所述标记试剂、被标记分析物或其片段的键断裂后所产生的片段离子。因此，使用“报告物”的情况表示其暗含的含义。还应该理解，短语“独特的报告物部分”与“独特质量的报告物部分”是等同的并可互换，而“独特的报告物离子”或“独特的特征离子”则与“独特质量的报告物离子”或“独特质量的特征离子”是等同的并可互换。
r)本文使用的术语“盐形式”包括化合物的盐或化合物盐的混合物。此外，化合物的两性形式也包括在术语“盐形式”中。具有胺或其它碱性基团的化合物的盐可通过例如与合适的有机酸或无机酸(比如盐酸、氢溴酸、醋酸、高氯酸等，包括其任意组合)反应得到。具有季铵基团的化合物还可含有反阴离子，比如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、高氯酸根等(包括其任意组合)。具有羧酸或其它酸性官能团的化合物的盐可通过使所述化合物与合适的碱(例如氢氧化物碱)进行反应而制得。因此，酸性官能团的盐可具有反阳离子，例如钠、钾、镁、钙等(包括其任意组合)。
s)本文使用的术语“类固醇”旨在包括但不仅限于皮质醇、11-去氧皮质醇(化合物S)、皮质酮、睾酮、表睾酮、去氧甲基睾酮、四氢孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮基雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、去氢表雄酮(DHEA)、17OH孕烯醇酮、17OH孕酮、17OH孕酮、雄酮、表雄酮、Δ4雄烯二酮(D4A)、豆甾醇、以及胆固醇。
t)本文使用的“合成化合物”指通过对过程进行操作(包括操作天然存在的途径)而产生的化合物。因此，可使用合成化学技术产生合成化合物。然而，本文使用的“合成化合物”还旨在包括通过例如酶促方法产生的化合物，所述方法包括如向生物(如细菌或酵母)中添加同位素富集的化合物，所述同位素富集的化合物可改变它们从而产生本文所述同位素富集的标记试剂或该标记试剂的中间体。
u)本文使用的“以合成方式富集”或“合成富集”指操作合成或天然方法来产生合成化合物，例如本文所述同位素富集的标记试剂或所述标记试剂的中间体。
v)公认的是，原子或分子的质量可以取近似，常近似到最接近的整数原子质量单位或最接近的原子质量单位的十分之一或百分之一。本文中所用的“粗略质量”指在一定范围内的绝对质量和近似质量，在所述范围内使用质量接近的不同原子类型的同位素，使得对于平衡所述报告物和/或连接物部分的质量的目的(使得在同分异构和/或同量异位的标记试剂的组和试剂盒中所述报告物/连接物组合的粗略质量是相同的)它们在功能上是等价的，而不论所用的不同同位素类型在质量上的极小差异是否能被检测到。
例如，常见的硫同位素的粗略质量为32(实际质量31.9720)和34(实际质量33.9678)，常见的氧同位素的粗略质量是16.0(实际质量15.9949)和18.0(实际质量17.9992)，常见的碳同位素的粗略质量是12.0(实际质量12.00000)和13.0(实际质量13.00336)，最常见的氮同位素的粗略质量是14.0(实际质量14.0031)和15.0(实际质量15.0001)。虽然这些值是近似的，但本领域技术人员将会理解，如果在组中一种标记的同位素富集位点使用18O同位素(或34S同位素)，则(比粗略质量16.0的氧同位素)多出的两个质量单位可在例如含有16O(或32S同位素)的不同标记中以如下方式进行补偿，即在该标记中的其它位点掺入两个碳13C原子来代替两个12C原子、掺入两个15N原子来代替两个14N原子，或者甚至掺入一个13C原子和一个15N原子来代替一个12C和一个14N，来补偿所述18O(或34S同位素)。这样，该组中两种不同的标记可具有相同的粗略质量，因为使用两个碳13C原子(代替两个12C原子)、两个15N原子(代替两个14N原子)、一个13C原子和一个15N原子(代替12C和14N)或者使用一个18O原子(代替一个16O原子，或者用一个34S代替一个32S)的实际差异极小，这样在该组或试剂盒的所有标记中实现2道尔顿的质量增加，而不损害该分析的性质。
这可参考图4a来说明。在图4a中，化合物3(图4a；分子式：C5 13CH11 15N2O)的报告物/连接物组合含有两个15N原子和一个13C原子，总理论质量为130.085。相比之下，同量异位物1(图4a；分子式C5 13CH11N2 18O)含有一个18O和一个13C，总理论质量为130.095。尽管报告物/连接物部分可存在轻微的绝对质量差异(质量分别为130.095和130.085)，但化合物1和3可以是仅有重原子同位素含量不同而在结构上不可区分的同量异位物。然而，化合物1和3的报告物/连接物部分就本发明目的而言的粗略质量均为130.1，因为无论质谱仪的灵敏度是否足以测量同量异位物1和3所产生报告物离子之间绝对质量的微小差异，这都不损害分析。
参考图4b类似地说明了两种同分异构试剂，其中化合物5和6中报告物/连接物部分的质量分别为144.111和144.100。对于本发明目的，这些化合物的报告物/连接物部分的粗略质量均为144.1，因为无论质谱仪的灵敏度是否足以测量化合物5和6所产生报告物离子之间绝对质量的微小差异，这都不损害分析。
从图4a和图4b中可明显看出，结构中相同重原子同位素的分布不是产生同分异构和/或同量异位标记试剂组时的惟一考量因素。有可能混合重原子同位素的类型来实现期望粗略质量的同分异构体和/或同量异位物。这样，重原子同位素的选择(组合)及其分布在产生可用于本发明实施方案的同分异构和/或同量异位标记试剂时都可以考虑。
w)本文使用的术语“烷基”指完全饱和的直链或支链的C2-C8烃或环状C3-C8烃(即环烷基例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环己基亚甲基(cyclohexylmethylene group))。本文使用的术语“烷基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“烷基”还旨在表示烷基链中一个或多个亚甲基被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。在一些实施方案中，烷基可以是完全饱和的直链或支链的C2-C6烃或环状C3-C6烃。
x)本文使用的术语“亚烷基”指包含连接至少两个部分的至少两个连接点的直链或支链的烷基链或环状烷基(例如-{CH2}-(亚甲基)、-{CH2CH2}-(亚乙基)、
Figure A200780032436D00291
等，其中大括号表示连接点。在本文中使用时，术语“亚烷基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“亚烷基”还旨在表示亚烷基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。在一些实施方案中，亚烷基可以是C1-C10烃。在一些实施方案中，亚烷基可以是C2-C6烃。
y)本文使用的术语“烯基”指包含一个或多个双键的直链或支链的C2-C8烃或环状C3-C8烃。在本文中使用时，术语“烯基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“烯基”还旨在表示烯基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。在一些实施方案中，烯基可以是包含一个或多个双键的直链或支链的C2-C6烃或环状C3-C6烃。
z)本文使用的术语“亚烯基”指包含连接至少两个部分的两个连接点的烯基。在本文中使用时，术语“亚烯基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“亚烯基”还旨在表示亚烯基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。
aa)本文使用的术语“炔基”指包含一个或多个三键的直链或支链的C2-C8烃或环状C3-C8烃。在本文中使用时，术语“炔基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“炔基”还旨在表示炔基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。在一些实施方案中，炔基可以是包含一个或多个三键的直链或支链的C2-C6烃或环状C3-C6烃。
ab)本文使用的术语“亚炔基”指包含连接至少两个部分的两个连接点的炔基。在本文中使用时，术语“亚炔基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“亚炔基”还旨在表示亚炔基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。
ac)本文使用的术语“脂肪族”指如上文定义的任何直链、支链或环状的烷基、烯基和炔基部分。在本文中使用时，术语“脂肪族”指可以被取代或未取代的基团。
ad)本文使用的术语“芳基”(单独的或作为其它部分的一部分(例如芳基烷基等))指碳环芳族基团，例如苯基。芳基还包括稠环多环芳环系，其中碳环芳环与另一碳环芳环稠合(例如1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)，或者碳环芳环与一个或多个碳环非芳环稠合(例如四氢亚萘基、茚满基等)。本文使用的术语“芳基”指可以被取代或未取代的基团。
ae)本文使用的术语“杂芳基”指包含1、2、3或4个杂原子的芳族杂环，所述杂原子各自独立地选自氮、硫和氧。本文使用的术语“杂芳基”指可以被取代或未取代的基团。杂芳基可以与一个或两个环(如环烷基、芳基或杂芳基环)稠合。杂芳基与分子连接的点可以在杂芳基、环烷基、杂环烷基或芳基环上，所述杂芳基可通过碳或杂原子连接。杂芳基的实例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡啶基、吡唑基、三唑基、噁唑基、四唑基、苯并咪唑基、苯丙异噻唑基、苯并噻二唑基、苯丙噁二唑基、吲哚基、四氢吲哚基、氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2，3]嘧啶基、吡唑并[3，4]嘧啶基或苯并(b)噻吩基，它们均任选地可被取代。
af)本文使用的术语“亚芳基”指包含连接至少两个部分的至少两个连接点的芳基或杂芳基(例如亚苯基等)。亚芳基与碳环非芳环稠合的连接点可以在芳环或非芳环上。本文使用的术语“亚芳基”指可以被取代或未取代的基团。
ag)本文使用的术语“芳基烷基”指通过亚烷基连接物连接至另一部分的芳基或杂芳基。本文使用的术语“芳基烷基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“芳基烷基”还旨在表示芳基烷基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。
ah)本文使用的术语“芳基亚烷基”指具有连接至少两个部分的至少两个连接点的芳烷基。第二个连接点可以在芳环或亚烷基上。本文使用的术语“芳基亚烷基”指可以被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，术语“芳基亚烷基”还旨在表示芳基亚烷基的烷基链中一个或多个亚甲基(如果有的话)被杂原子(如-O-、-Si-或-S-)替换的化合物。当芳基亚烷基发生取代时，取代基可以在该芳基亚烷基的芳环或亚烷基部分中的一个或两个上。
ai)本文使用的术语“任选取代的”以及“取代或未取代的”是等同的并可互换。任何烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基、芳基烷基、亚芳基、杂芳基或芳基亚烷基的合适取代基包括在本发明实施方案所用反应条件下稳定的任何取代基。合适取代基的非限制性实例可包括烷基(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环己基等)、卤代烷基(如三氟甲基、2，2，2-三氟乙基等)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基等)、芳基(如苯基)、芳基烷基(如苄基)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、季铵氮原子或卤素基(如氟、氯、溴和/或碘)。
此外，烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基、芳基烷基、亚芳基、杂芳基或芳基亚烷基的一部分可任选地被＝O或＝S取代。
aj)本文使用的术语“活性酯”指在碱性条件下易于与胺、醇和某些硫醇反应以分别提供酰胺、酯和硫酯的化合物。还可参考Leo APaquette，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，第2卷，JohnWiley and Sons，New York，1995作为活性酯是有机化学领域的公认术语的证据。
ak)本文使用的术语“杂环”指在环中包含至少两种不同元素的任何环状分子结构。还可参考Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Oxford University Press，Oxford，1997作为杂环是有机化学领域的公认术语的证据。
al)本文使用的术语“离去基团”指在取代或置换反应中从被认为是反应底物的残基或主要部分上离去的任何带电或不带电的原子或基团。还可参考Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford University Press，Oxford，1997作为离去基团是有机化学领域的公认术语的证据。
am)本文使用的术语“保护基团”指与分子中的官能团反应并结合从而防止该官能团参与该分子的后续反应的化学基团，所述基团随后可被除去，从而重新产生非保护的官能团。还可参考Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology，Oxford University Press，Oxford，1997作为保护基团是有机化学领域的公认术语的证据。
多个实施方案描述
应该理解，下文“概述”章节中的讨论可涉及本发明的多种实施方案中的一些或全部。
I.概述
标记试剂
如上文所述，使用质谱法对分析物进行分析时可使用的标记试剂可包括报告物部分、平衡物部分(或连接物部分)和反应基团。本文所述的新标记试剂还可包含至少一个非编码可检测标记，例如生色团、荧光团、自旋标记(spin label)、酶或化学发光化合物，在一些实施方案中可由式I表示，
包括其盐形式和/或水合物形式。RG是下文更详细描述的反应基团。RP是下文更详细描述的报告物部分。DL是非编码可检测标记。LK是下文更详细描述的连接物部分。X是下文更详细描述的共价键。Y和W各自独立地是下文更详细描述的共价键或连接基团，m和n各为0或1，条件是m+n＝1。
在一些实施方案中，所述标记试剂可以是与支持物结合的。因此，在一些实施方案中，所述标记试剂可由通式Iss表示，
Figure A200780032436D00332
包括其盐形式和/或水合物形式。RG是下文更详细描述的反应基团。RP是下文更详细描述的报告物部分。DL是非编码可检测标记。LK是下文更详细描述的连接物部分。SS是通过下文更详细描述的可切割连接物与该标记试剂的报告物部分“RP”共价连接的固相支持物。X是下文更详细描述的共价键。Y和W各自独立地是下文更详细描述的共价键或连接基团，m和n各为0或1，条件是m+n＝1。
反应基团
多个实施方案中所使用标记试剂的反应基团(有时以缩写“RG”代表)可包含能与样品中一种或多种反应性分析物的一个或多个官能团反应的任何亲电或亲核基团。反应基团与分析物的官能团反应，从而将该分析物与标记试剂共价连接。因此，每种标记试剂能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种来自该样品的被标记分析物。
应该理解，在一些实施方案中，反应基团应认为是包括与连接物部分(即平衡物部分)相连的原子或基团。例如，如果反应基团是活性酯或羧酰卤化物基团(carboxylic acid halide)，则在一些实施方案中，该活性酯或羧酰卤化物的羰基也可以考虑与所述连接物部分相连，这是为了在标记试剂和被标记分析物中均存在羰基碳的一组同分异构和/或同量异位标记试剂中平衡报告物部分的质量。这在一组同分异构和/或同量异位标记试剂中一些或全部标记试剂中所包含的羰基中含有重原子同位素时通常是显而易见的。因此，在一些实施方案中，反应基团可理解成仅代表反应基团的离去基团；而在另一些实施方案中，反应基团可包含与连接物部分相连的其它原子或部分。因此，应该理解，当反应基团表示为一些下文所述具体部分时，分析物可以通过一个或多个其它原子或基团与连接物部分(即平衡物部分)连接，所述其它原子或基团可被认为或不可被认为是该连接物部分的一部分均可。
反应基团可以是预先存在的，或者可以原位制备。可在不存在反应性分析物的情况下进行或者可以在反应性分析物存在下进行反应基团的原位制备。例如，可以用水溶性碳二亚胺(如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；EDC)原位修饰羧酸基，由此制备可与亲核体(如分析物的烷基或芳基氨基)反应的亲电基团。在一些实施方案中，可在存在含有胺(或其它亲核体)的分析物的情况下用EDC对标记试剂中羧酸基进行活化。在一些实施方案中，还可以在用EDC进行起始反应后加入含有胺(或其它亲核体)的分析物。在另一些实施方案中，可以通过原位除去保护基团在原位产生反应基团。因此，可通过亲核和/或亲电反应实现分析物衍生化的任何现有或新产生的试剂均在本发明方法、混合物、试剂盒和/或组合物实施方案的范围之内。
当标记试剂的反应基团包含亲电体时，它可与分析物中合适的亲核基团反应。当标记试剂的反应基团包含亲核体时，它可以与分析物中合适的亲电基团反应。大量合适的亲核基团与亲电基团对是已知的，并常在化学及生物化学领域中使用。包含可与分析物(例如蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇、维生素、前列腺素或质量小于1500道尔顿的其它小分子)偶联以实现其衍生化的适当亲核基团或亲电基团的试剂的非限制性实例描述于Pierce Life Science & Analytical ResearchProducts Catalog & Handbook(a Perstorp Biotec Company)，Rockford，IL61105，USA。其它合适的试剂为本领域所熟知，并以商品形式由其它供应商(例如Sigma-Aldrich)提供。
标记试剂的反应基团可包含胺反应基团。例如，所述胺反应基团可以是活性酯。活性酯在肽合成中是熟知的，指在肽合成中常用条件下易于与氨基酸的N-α-氨基反应的某些酯(参阅Leo A Paquette，EncyclopediaofReagents for Organic Synthesis，第2卷，John Wiley and Sons，New York，1995)。所述胺反应活性酯基团可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯(2-NP)、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯(2，4-NP)、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羟基-1，2，3-苯并三唑-4(3H)一酯(Dhbt)、羟基吡咯烷酮(NHP)、2，4-二卤苯基酯、2，2，2-三氟乙烷基酯(2，2，2-trifluoroethanyl ester)或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯。例如，活性酯(本文的一些实施方案中一般称为Z’，使得可变的RG仅与反应基团的离去基团部分同义)可由下式表示：
Figure A200780032436D00351
其中X’是-O-或-S-，各个X”彼此独立地是-F、-Cl、-Br-或-I(N-甲基哌嗪化合物活性酯的合成参阅美国已公开专利申请No.US2005-0148771 A1，所述活性酯的多种合成途径参阅图7)。前述均为活性酯的醇或硫醇离去基团，其中所述醇或硫醇基团可通过氨基酸N-α-氨基与该活性酯基团羰基碳的反应进行置换。因此，对本领域普通技术人员而言显而易见的是，本文所述任何合适的标记/标签试剂的活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)均可使用熟知的方法与本文公开内容结合来制备(还可参阅如Greg T.Hermanson(1996).″The Chemistry ofReactive Groups″in″Bioconjugate Techniques″，第2章，137-165页，Academic Press，(New York)；还参阅：″Innovation And Perspectives InSolid Phase Synthesis″，Roger Epton编辑，SPCC(UK)Ltd，Birmingham，1990)。
在一些实施方案中，标记试剂的反应基团可包含混合酸酐，因为已知混合酸酐与氨基高效反应，从而产生酰胺键。混合酸酐是熟知的，并可使用有机化学和/或肽化学领域经常应用的熟知方法来制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应基团可以是羧酰卤化物基团，例如酰氟基团(参阅Carpino等，J.Am.Chem.Soc，112：9651(1990))或酰氯基团。酸卤化物基团与分析物中胺的反应会形成酰胺。酸卤化物基团与分析物中羟基或硫醇基(thiol group)的反应会分别产生酯或硫酯。
在一些实施方案中，反应基团可以是磺酰卤或磺酸基。如果是磺酸，则可被活化而与分析物反应。如果是磺酰卤，则可直接与分析物反应，因为这就是活化形式。
在一些实施方案中，反应基团可以是异氰酸盐/酯(isocyanate)或异硫氰酸盐/酯(isothiocyanate)基团。
在一些实施方案中，标记试剂的反应基团可包含硫醇反应基团。例如，所述硫醇反应基团可以是马来酰亚胺(malemide)基、烷基卤化物基、α-卤代-酰基、α-卤代-硫酮基(α-halo thione group)或α-卤代亚胺基。我们用“卤化物基团”或“卤代”或“卤素基团”来表示氟、氯、溴或碘。所述硫醇反应基团是熟知的，并可使用肽化学领域常用的方法来制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应基团可包含羟基反应基团。例如，所述羟基反应基团可以是三苯甲基卤化物或甲硅烷基卤化物反应基团。三苯甲基卤化物反应部分可以被取代(例如X”’-甲氧基三苯甲基、X”’-二甲氧基三苯甲基、X”’-三甲氧基三苯甲基等)，或者是未取代的，其中X”’是将反应基团与连接物(即平衡物)连接的键。所述甲硅烷基反应部分可以是烷基取代的甲硅烷基卤化物，例如X”’-二甲基甲硅烷基、X”’-二三乙基甲硅烷基、X”’-二丙基甲硅烷基、X”’-二异丙基甲硅烷基等)，其中X”’是将该反应基团与连接物(即平衡物)连接的键。所述反应基团是熟知的，并可使用核酸化学领域常用的方法来制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应基团可包含亲核体，例如氨基、羟基、硫醇基或酰肼基。在一些实施方案中，所述亲核反应基团可以是氨基烷基、羟基烷基或硫代烷基。所述反应基团是熟知的，并可使用有机化学领域经常应用的方法来制备。
报告物部分
本发明实施方案中所用标记试剂的报告物部分(有时以缩写“RP”代表)是具有可测量的独特质量(或者质谱仪中的质荷比)的基团。因此，在一些实施方案中，一组同分异构和/或同量异位标记试剂中的每种报告物部分及其相应的特征离子均具有独特的粗略质量，并且对组中每种标记试剂而言彼此不同。
不同的报告物部分可包含一个或多个重原子同位素，以实现其独特的粗略质量。例如，碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)、硫(32S和34S)和/或氢(氢、氘和氚)的现有重原子同位素可用于制备报告物部分的不同基团。它们不是限制性的，因为在报告物部分中还可使用其它轻原子和重原子。包含轻原子和重原子同位素的适于制备报告物部分的基本起始材料可得自多个商业来源，例如Cambridge Isotope Laboratories，Andover，MA(参阅www.isotope.com的“基本起始材料”列表)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支机构)。Cambridge Isotope Laboratories和Isotec还根据定制合成协议制备需要的化合物。
报告物部分可以包含固定的电荷，或者可以在分析过程中离子化。由于报告物部分可以包含固定电荷或者可被离子化，因此所述标记试剂可以盐(或盐的混合物)或两性离子的形式分离或用于标记反应性分析物。报告物部分(或报告物离子)的离子化有助于在质谱仪中对其进行测定。因此，被标记分析物中报告物部分的存在状况可作为片段离子(有时称为特征离子(或报告物离子))而被测定。N-甲基哌嗪报告物部分的多种报告物离子示于图5。所述离子的分子式为13CC5H13N2 +、13CC5H13 15NN+、13C2C4H13 15NN+和13C3C3H13 15NN+。
离子化后，特征离子(即报告物离子)可包含一个或多个正或负的净电荷。因此，报告物离子可包含一个或多个酸性基团和/或碱性基团，因为这些基团易于在质谱仪中离子化。例如，报告物部分可包含一个或多个碱性氮原子(带正电)和/或一个或多个离子化的酸性基团，例如羧酸基、磺酸基或磷酸基(带负电)，条件是在平衡时酸性基团或碱性基团之一较多以使该报告物部分产生包含正或负的净电荷的报告物离子。包含至少一个碱性氮的报告物部分的非限制性实例包括含有取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪的化合物。
独特的报告物部分可以与目的样品相关联，从而用所述独特的报告物部分标记该样品中的一种或多种分析物。这样，可将关于独特报告物部分的信息(一般在质谱仪中通过特征离子(即报告物离子)来检测)与关于所述样品中一种或全部分析物的信息相关联。
然而，在测定特征离子时，独特的报告物部分不需要与分析物物理连接。相反，可在断裂被标记分析物以产生子片段离子和特征离子之后在串联分析仪中的第二质量分析中测定特征离子的独特粗略质量。
测定的特征离子可用于鉴定所测定分析物所来源的样品。此外，独特特征离子相对于其它特征离子或相对于校正标准品(例如预期存在于所述样品中且用特异性报告物部分标记的分析物)的该特征离子的量(经常表达为浓度和/或量)可用于测定样品(例如用于形成样品混合物的样品)中分析物的相对量和/或绝对量(经常表达为浓度和/或量)。在一些实施方案中，不使用内校正标准品，而是可基于将多种特征离子的峰强度与校正曲线进行比较而进行绝对定量。因此，可将信息(例如特定样品中一种或多种分析物的量)与用于标记每种特定样品的报告物部分相关联。当也确定分析物的身份时，该信息可与关于不同特征离子的信息相关联，从而辅助确定一种或多种样品中每种被标记分析物的身份和量。
在一些实施方案中，报告物部分可包含与取代或未取代的N-烷基化乙酸部分中亚甲基碳共价连接的氮原子，其中所述取代或未取代的亚甲基碳(而不是该乙酸部分中羧酸(或硫代羧酸)基团的羰基)是该报告物的一部分。因此，在一些实施方案中，羧酸(或硫代羧酸)基可用于连接报告物与连接物，但不认为是报告物的一部分。所述氮原子可以被一、二或三个基团烷基化。例如，包含氮原子的部分可以是取代的伯胺，例如甲基、乙基或丙基基团，或者是取代的仲胺，例如二甲基胺、二乙基胺、二正丙基胺或二异丙基胺。因此，例如，报告物部分“RP”可由以下的式X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8或X9来表示，其中“RP”以括号为界：
Figure A200780032436D00391
报告物部分可以是5元、6元或7元杂环，其包含与取代或未取代的N-烷基化乙酸部分的亚甲基碳共价连接的环氮原子，所述取代或未取代的N-烷基化乙酸部分通过其羰基碳与分析物(直接或间接)相连，其中所述取代或未取代的亚甲基碳(而不是羧酸基的羰基碳)是该报告物的一部分。所述杂环可以是芳香的或非芳香的。因此，所述报告物部分可由式Y-J表示，其中Y基团可代表5元、6元或7元杂环，J基团可代表所述取代或未取代的乙酸部分中取代或未取代的亚甲基。所述杂环可以是取代或未取代的。例如，该杂环部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包含适于将分析物与支持物连接的保护或未保护的基团，例如氨基、羟基或硫醇基(见图6)。所述杂环可包含额外的杂原子，例如一个或多个硅、氮、氧和/或硫原子。因此，例如，报告物部分“RP”可以以下式X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25或X26来代表，其中报告物部分“RP”以括号为界：
Figure A200780032436D00401
可对报告物部分进行选择，以使其在对分析物进行分析的典型条件下不发生亚断裂(sub-fragment)。为了消除任何疑义，这是任选(而非必需)的特征。例如，可对报告物进行选择，以使其在质谱仪中使被标记分析物断裂的解离能条件下不发生显著的亚断裂。我们用“不发生显著的亚断裂”来表示在成功测定被标记分析物时，难于或不可能检测到高于背景噪声的报告物片段。
在一些实施方案中，可将报告物离子的粗略质量选择成与不同于意图测定的分析物或该分析物的任何预计片段的质量(即“静区(quietzone)”)。例如，当分析物为蛋白质或肽时，报告物离子的粗略质量可选择成不同于与任何天然存在的氨基酸或肽或其预计断裂离子。这可有助于分析物测定，因为取决于分析物，不存在任何样品中具有相同质量的组分可提高任何分析结果的置信度。对于肽而言可预计背景极低的质量范围实例可见于表1。
表1：选择与肽分析相关的标记片段离子m/z的可能的“静区”
 
M/z起点-终点
10-14
19-22
24-26
31-38
40-40
46-50
52-52
58-58
61-69
71-71
74-83
89-97
103-109
113-119
121-125
128-128
131-135
137-147
149-154
156-156
160-174
177-182
184-184
188-189
191-191
202-207
210-210
216-222
224-226
所述报告物部分可以是非聚合的。可将报告物部分选择成产生具有表明其质量小于250原子质量单位(amu)的m/z的报告物部分。可将报告物部分选择成产生m/z小于200原子质量单位(amu)的报告物部分。可将报告物部分选择成产生m/z小于150原子质量单位(amu)的报告物部分。这些小分子可轻易地在第二质量分析中测定，所述第二质量分析中不含样品中与第一质量分析具有同样一致质量(coincidentmass)的其它组分。在这种情况下，可以对第一质量分析中测定的选定离子进行第二质量分析，一般在串联质谱仪中(或者，例如在单阶段仪器中通过源后衰变)来进行。由于可以从第一质量分析中具体选出具有特定质荷比的离子用于可能的断裂和进一步质量分析，因此第一质量分析中未选择的离子不进行第二质量分析，从而不污染第二质量分析的谱。而且，质谱仪的灵敏度和检测器(用于定量)的线性程度在这一低质量范围内可以相当高。此外，质谱仪技术的当前水平可允许在这一质量范围内获得小于1道尔顿的极限质量分辨率。由于以上的所有原因，使用本文所述方法，具有上述特征的报告物可为复杂混合物中所测定的分析物提供相当准确的定量。
连接物(或平衡物)部分
标记试剂的连接物(或平衡物)部分(有时用缩写“LK”表示)可用于本发明的实施方案，以将报告物部分(RP)和非编码可检测标记(DL)与分析物或反应基团连接，这取决于是否与分析物发生反应。连接物部分可以是分支的或者是无分支的。例如，如果报告物和非编码可检测标记各自独立地与该连接物连接，连接物可以是分支的；但如果非编码可检测标记和报告物部分依次与该连接物部分连接，则连接物也可以是线性的(参见图1a和1b)。所述非编码可检测标记可与连接物直接或间接连接。
可将连接物选择成产生中性物质(即在质谱仪中发生中性丢失)，其中连接连接物与报告物部分的键(即键X)以及连接连接物与分析物的键(在一些实施方案中为Y)在质谱仪中都断裂。在一些实施方案中，连接物部分可设计成在经受解离能时亚断裂，包括仅产生连接物的中性片段的亚断裂。在一些实施方案中，可将连接物设计成产生一种或多种可检测片段。
在包含一组同分异构和/或同量异位标记试剂的组和/或试剂盒中使用时，所述连接物部分可包含一种或多种重原子同位素，使得该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿针对该组中不同标记试剂在报告物部分之间的粗略质量差异，使得报告物部分与连接物部分的组合的合计粗略质量对于该组的每种标记试剂均相同。因此，报告物/连接物组合(即报告物/连接物部分)的合计粗略质量(即作为整体的粗略质量)对于混合物中每种被标记分析物都是相同的(大致相同)，或者对于组和/或试剂盒中的标记试剂是相同的。更具体地，所述连接物部分可补偿来自不同样品的被标记分析物的报告物部分之间的粗略质量差异，其中报告物部分的独特粗略质量与被标记分析物所来源的样品相关，报告物/连接物组合的合计粗略质量对于样品混合物中的每种被标记分析物都是相同的，无论样品的来源如何。这样，两种或更多种不同样品中相同分析物在标记及随之混合之后可具有相同的粗略质量，以产生样品混合物。
例如，被标记分析物或者用于标记该分析物的组和/或试剂盒中的标记试剂可以是同分异构体和/或同量异位物。因此，如果在质谱仪中从样品混合物的第一质量分析中选择具有特定质荷比(取自样品混合物)的离子(即选定的离子)，来自组成样品混合物的不同样品中的相同分析物可由所述选定离子来按比例地代表其在样品混合物中的相应浓度和/或量，因为无论与分析物连接的标记为何，它们都具有相同的粗略质量。因此，连接物不仅将报告物与非编码可检测标记和分析物连接，它还用于补偿独特报告物部分的质量差异，从而使多种样品中被标记分析物的报告物/连接物部分的粗略质量一致。
由于连接物可作为标记试剂中报告物部分的质量平衡物，因此连接物中的原子数越多，组和/或试剂盒中不同同分异构/同量异位标记试剂的可能数目就越多。换言之，连接物所包含的原子数越多，一般来说可能的报告物/连接物组合的数目就越多，因为同位素最多可在连接物中的任何位置被替换而产生同分异构体和/或同量异位物，其中连接物部分用于补偿报告物部分的质量差异，从而产生一组独特的同分异构和/或同量异位标记试剂。这些不同组的标记试剂特别适用于相同和/或不同样品中分析物的多重分析。
组和/或试剂盒中标记试剂的总数可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。基于质量平衡的考虑，组或试剂盒中标记试剂的多样性仅受限于报告物和连接物部分中的原子数、可用于取代轻同位素的重原子同位素以及可以合成方式安置同位素的多种合成设置。然而，如上文所指出，多种同位素富集的基本起始材料可便利地从制造商获得，例如Cambridge IsotopeLaboratories和Isotec。普通技术人员可将这些同位素富集的基本起始材料用于生产同量异位和/或同分异构标记试剂组的方法中，或者用于生产同位素富集的起始材料(即以合成方式富集的化合物)的方法中，所述同位素富集的起始材料可用于生产同量异位和/或同分异构标记试剂组的合成方法中。
报告物/连接物的组合(即报告物/连接物部分)
标记试剂可包含报告物部分和连接物部分，它们通过键X彼此直接连接。如上文所述，报告物/连接物部分对于标记试剂组和/或试剂盒中的每个成员而言可以是相同的，或者对于被标记分析物的化合物中每种被标记分析物而言都是相同的。而且，(直接或间接地)连接报告物部分与连接物部分的键(即键X)可设计成在经受解离能时至少在一部分选定的离子中断裂，从而从连接物部分、连接物/分析物和/或连接物/分析物/非编码可检测标记部分中释放特征离子(即报告物离子)。因此，可以在MS/MS分析中直接观察该特征离子(通过质谱仪中的质荷比(m/z)来观察)及其强度(即其峰强度)。
报告物/连接物部分可包含一组或试剂盒中的多种标记试剂中相同或不同的重原子同位素的多种组合。在科技文献中，这有时称为“编码”、“同位素编码”或“代码”。例如Abersold等公开了同位素编码的亲和标签(ICAT；参阅WO00/11208)。在一个方面中，Abersold等的试剂与本文所述标记试剂不同，Abersold未教导两种或更多种相同质量的标记试剂，例如同分异构和/或同量异位标记试剂。相反，Abersold等教导了其标记试剂的“轻”形式和“重”形式。包含非编码可检测标记的ICAT试剂形式(有时称为VICAT)描述于WO 2004/019000；Lu等，Anal.Chem.，76：4104-4111(2004)以及Bottari等，BioconjugateChemistry，15(2)：380-388(2004)。
在一些实施方案中，报告物和/或连接物部分可包含可用于将标记试剂或被标记分析物固定在支持物上的原子或基团。固定可以是直接的或间接的。例如，如果与报告物相关联的原子或基团(例如报告物的烷基氨基取代基)与支持物的反应基团(例如可切割连接物的反应基团)直接相互作用以实现固定，则可发生直接固定。相比之下，间接固定在以下情况下发生，例如报告物的取代基(例如报告物和/或连接物的烷基氨基取代基)被修饰(例如生物素化)，且该修饰基团与支持物的反应基团(例如亲和素或链霉亲和素)相互作用以实现固定。因此，本发明涵盖这样的实施方案：分析物能与结合在支持物上的标记试剂反应，其中每种支持物包含独特的标记试剂，从而不同的样品与不同的支持物反应；还涵盖这样的实施方案：每种不同样品与不同的标记试剂反应，反应产物其后固定在相同或不同的支持物上。在任何一种情况下，一般地通过从支持物上切下被标记分析物来获得用于质谱分析的样品混合物(参见图6)。所释放的每种样品的被标记分析物可任选地分开收集，或者可以在切割过程中混合以形成样品混合物。如果进行收集，则所释放的被标记分析物可在其后混合以形成样品混合物。
非编码可检测标记：
本文所述标记试剂包含非编码的可检测标记(有时使用缩写“DL”来表示)。可与本文所述标记试剂一起使用的非编码可检测标记(部分)的非限制性实例包括但不仅限于生色团、荧光团、自旋标记、酶或化学发光化合物。我们使用“非编码”来表示该可检测标记没有以合成方式富集一种或多种重原子同位素。因此，所述非编码可检测标记不产生报告物离子(特征离子)，并且不代表连接物(平衡物)部分的一部分。
荧光团的非限制性实例包括5(6)-羧基荧光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰基)氨基)己酸(Cou)、5(和6)-羧基-X-罗丹明(Rox)、花青2(Cyanine2，Cy2)染料、花青3(Cy3)染料、花青3.5(Cy3.5)染料、花青5(Cy5)染料、花青5.5(Cy5.5)染料、花青7(Cy7)染料、花青9(Cy9)染料、(花青染料2、3、3.5、5和5.5作为NHS酯可得自Amersham，Arlington Heights，IL)或者Alexa染料系列(MolecularProbes，Eugene，OR)。
酶的非限制性实例包括聚合酶(例如Taq聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、测序酶、DNA聚合酶1和φ29聚合酶)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SBP)、核糖核酸酶和蛋白酶。
对于成组的同分异构和/或同量异位标记试剂而言，每种非编码可检测标记在相似条件下均与该标记试剂组中的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷。每种不同的非编码可检测标记均可独立于该组中其它标记而进行检测。例如，相信图8a和8b所述标记试剂的荧光团(即非编码可检测标记)具有可区分的荧光谱、在生理pH下具有相同的净电荷并具有相同的名义粗略质量。
由于每种非编码可检测标记均可在组中独立检测，因此在一些实施方案中，所述非编码可检测标记可用于在下文所述的电泳分离中在特定的被标记分析物显出相对浓度差异时(或其它目的条件)进行测定。因此，在一些实施方案中，可以基于MS分析及定量之前的(电泳分离和)分析来审慎地选择用于MS分析(以及在一定程度上进行定量)的目的分析物。这样，可以跳过相对于预期量来说好像没有量改变或者好像没有相对定量差异的分析物进行的MSn分析，从而可以更有效地利用时间和资源。
键X
X是报告物原子与连接物部分或非编码可检测标记的原子之间的键。本文所述多种标记试剂的键X在经受解离能时可在至少一部分选定的离子中断裂。因此，可在质谱仪中调整解离能的水平，以使键X可在被标记分析物的至少一部分选定离子中断裂。键X的断裂从分析物中释放报告物，使得报告物(即特征离子)可独立于分析物离子而进行测定。
键或连接基团Y
Y是连接所述连接物部分(“LK”)与反应基团(“RG”)的键或连接基团。无论是键还是连接基团，Y均任选地是可通过在质谱仪中施加解离能而断裂的。如果Y是连接基团，则它可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或芳基亚烷基。如果Y是连接基团，它可任选地包含一个或多个重原子同位素。如果Y是连接基团，并且在同分异构和/或同量异位标记试剂组中使用该标记试剂，则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都相同。
如果Y可断裂，则Y的断裂从分析物或其片段中释放报告物/连接物/非编码可检测标记部分，这取决于键X是否已断裂。如果是键，则键Y可能比键X更不稳定。键X可以比键Y更不稳定。键X和Y可具有相同的相对不稳定性。
如果目的分析物是蛋白质或肽，则可根据酰胺(肽)键来调整键X和Y的相对不稳定性。键X、键Y或其二者可以比典型酰胺(肽)键的不稳定性更高、相同或更低。例如，在解离能条件下，键X和/或键Y与Z”’-pro二聚体或者Z”’-asp二聚体中的肽键相比可以更不易于断裂，其中Z”’是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些实施方案中，键X和Y将与典型酰胺键在大致相同的解离能水平下断裂。在一些实施方案中，键X和Y将在比典型酰胺键更高的解离能水平下断裂。
还可存在这样的键X和Y，使得键Y的断裂引起键X的断裂，反之亦然。这样，键X和Y可基本同时断裂，使得没有显著量的分析物(或其子片段)在第二质量分析中具有部分标记。我们用“显著量的分析物”来表示在MS/MS谱中可检测到小于25％、优选小于10％的部分标记分析物。
由于在一些实施方案中分析物的标记片段与未标记片段在第二质量分析(MS/MS)中存在明确的界限，因此这一特征可使从子片段离子谱的计算机辅助分析中鉴定分析物得以简化。而且，由于在一些实施方案中分析物的片段离子可以用报告物/连接物/可检测部分完全标记或者不标记(但不是部分标记)，因此在子片段离子的质量中可能不存在或几乎不存在由于断裂键之间的同位素分布所导致的离散，例如第二质量分析中常规测定的部分标记分析物中单个不稳定键的每一侧都存在同位素的情况。
键或连接基团W：
W是连接所述连接物部分(“LK”)与非编码可检测标记(“DL”)的键或连接基团。W任选地可通过施加光、热或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂(即可切割)。如果W是连接基团，则它可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或芳基亚烷基。如果W是连接基团，它可任选地包含一个或多个重原子同位素。如果W是连接基团，并且在同分异构和/或同量异位标记试剂组中使用该标记试剂，则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都相同。在W是连接基团的一些实施方案中，W可包括例如可切割部分，如XAL、PAL或HMPB，更详细地描述于Kates等，Solid Phase Synthesis：A Practical Guide，Marcel Dekker，Inc.，New York，2000。
与支持物结合的包含可切割连接物的标记试剂
根据一些实施方案，来自样品的分析物可与包含标记试剂的固相支持物反应(每种样品与不同的固相支持物反应，以使每种样品的每种被标记分析物包含不同的报告物部分)，并可任选地洗去样品中不与该反应基团反应的组分。接着可以通过在切割可切割连接物并由此从支持物上释放报告物-连接物-非编码可检测标记/分析物复合体的条件下处理支持物，以从每个固相支持物上除去被标记分析物。每个支持物均可在切割可切割连接物的条件下相似地进行处理由此获得两种或更多种不同样品，每种样品包含一种或多种被标记分析物，其中与特定样品相关的被标记分析物可通过与其连接的独特报告物部分来鉴定和/或定量。接着可混合所收集的样品以形成样品混合物，如下文所述。
有多种市售的支持物可用于通过可切割连接物将标记试剂连接到支持物上。在一些实施方案中，标记试剂可通过报告物部分连接到支持物上。一般而言，标记试剂会包含亲核或亲电基团，它们能与可切割连接物的官能团反应，从而将所述标记试剂与所述支持物可切割地连接在一起。在一些实施方案中，标记试剂可在带有所述可切割连接物的支持物上合成。在另一些实施方案中，所述标记试剂包含可切割连接物，所述可切割连接物可与支持物反应，并由此形成包含该可切割连接物的与支持物结合的标记试剂。
例如，标记试剂的报告物部分中的氨基、羟基或硫醇基可与适当支持物的可切割连接物反应。所述可切割连接物可以是“空间受阻的(sterically hindered)可切割连接物”。切割所述可切割连接物会从支持物上释放标记或被标记分析物。空间受阻的固相支持物的非限制性实例包括三苯甲基氯树脂(trityl-Cl，Novabiochem，P/N 01-64-0074)、2-氯三苯甲基氯树脂(Novabiochem，P/N 01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/NQ-1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N 400377)、4-甲基三苯甲基氯树脂(Novabiochem，P/N 01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯树脂(Novabiochem，P/N 01-64-0076)、羟基-(2-氯苯基)甲基-PS(Novabiochem，P/N01-64-0345)、Rink酸树脂(Novabiochem P/N0 1-64-0380，01-64-0202)、NovaSyn TGT醇树脂(Novabiochem，P/N 01-64-0074)。多种其它可切割连接物为本领域已知的，并可用于仅使用市售材料、常规实验和本文的教导来制备合适的支持物。
例如，所述报告物部分可以是5元、6元或7元杂环，其包含有助于将其与适当支持物可切割连接的原子或基团。例如，所述基团可以是包含氨基、羟基或硫醇基的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或烷基亚芳基。在一些实施方案中，所述杂环不需要其它的官能团。例如，与该可切割连接物结合的原子可以是哌嗪环的仲氮。关于示例性哌嗪化合物及其制备方法的讨论可见于已公开的美国专利申请：US2004-0219685 A1。报告物部分中氨基、羟基或硫醇基与包含该连接物部分的支持物之间的反应可形成包含该标记试剂的支持物。支持物与支持物上所结合的标记试剂的反应可产生与支持物结合的被标记分析物。由于所述可切割连接物可选择成通过光、热或化学试剂进行切割，因此适当的处理会释放可用于产生下文所述样品混合物的被标记分析物。
参考图6，展示了与支持物可切割地连接的示例性标记试剂。如图所示，与珠状支持物连接的三苯甲基是可切割连接物(例如三苯甲基氯树脂(trityl-Cl，Novabiochem，P/N 01-64-0074)。如图所示，标记试剂中烷基化哌嗪报告物部分的相连官能团Q与支持物上结合的三苯甲基可切割地连接，反应基团的离去基团Z’可被分析物的官能团置换，从而形成与支持物结合的被标记分析物。例如，标记试剂的反应基团可以是羧酸，它可原位活化以与分析物(例如肽)的氨基官能团反应，从而形成与支持物结合的被标记分析物。如图所示，用酸处理该支持物通过再生标记试剂报告物部分的官能团Q’而从支持物上释放被标记分析物。
质谱仪/质谱法(MS)：
可使用能选择和断裂分子离子的串联质谱仪和其它质谱仪实施本发明的方法。串联质谱仪能根据其质荷比(m/z)来选择和断裂分子离子(单级质谱仪也有此能力，但程度较低)，其后记录所得到的片段(子片段)离子谱。更特别地，可通过对选定的离子施加解离能(例如碰撞诱导解离，CID))产生子片段离子谱。例如，可以在第一质量分析中选择对应于具有特定m/z比的被标记肽的离子，使其断裂并在第二质量分析中进行再分析。可进行这样的串联质量分析的代表性仪器包括但不仅限于磁性四扇区(magnetic four-sector)、串联飞行时间、三重四极杆、离子阱和串联四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪。
这些类型的质谱仪可以与多种离子源联用，所述离子源包括但不仅限于电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。离子源可用于产生离子化物质，其用于在分析物还不具有固定电荷时进行第一质量分析。其它质谱仪器和断裂方法包括MALDI-MS仪器中的源后衰变和使用MALDI-TOF(飞行时间)-TOF MS进行的高能CID。关于串联质谱最近的综述可参阅R.Aebersold和D.Goodlett，MassSpectrometry in Proteomics.Chem.Rev.101：269-295(2001)。
通过解离能进行断裂：
公认的是，键可因质谱仪中发生的过程而发生断裂。此外，可以在质谱仪中通过对离子施加解离能来诱发断裂。例如，可以通过碰撞诱导解离(CID)在质谱仪中产生解离能。可用于在质谱仪中断裂离子的解离能的其它非限制性实例包括碰撞激活解离(CAD)、光诱导解离(PID)、表面诱导解离(SID)、电子诱导解离(EID)、电子俘获解离(ECD)、热/黑体红外辐射解离(BIRD)、源后衰变或其组合。质谱领域的技术人员会理解，施加引起断裂的解离能的其它示例性技术包括但不仅限于光解离、电子俘获和表面诱导解离。
通过碰撞诱导解离断裂键的方法包括通过与惰性气体碰撞而将选定离子的动能状态提高到发生键断裂的点。例如，可以通过在碰撞室中与惰性气体(例如氮、氦或氩)碰撞来传递动能。可以传递至该离子的动能的量与允许进入碰撞室的气体分子数成比例。当存在较多的气体分子时，可以对选定的离子传递较大量的动能，当存在的气体分子较少时，可以传递较少的动能。
因此，很明显，可以控制质谱仪中所施加的解离能。还公认的是，某些键比其它键更不稳定。分析物或报告物/连接物/非编码可检测标记物部分中键的不稳定性取决于该分析物的性质和该报告物/连接物/非编码可检测标记物部分的性质。因此，可以调节解离能，从而以可测定的方式使分析物和/或标记试剂(例如报告物/连接物的组合)断裂。本领域技术人员会理解如何对质谱仪的组分进行这样的常规调整并由此获得适当的解离能水平，从而使被标记分析物的至少一部分离子断裂成特征离子(即报告物离子)和子片段离子。
例如，可以对在第一质量分析中选择/分离的离子施加解离能。在串联质谱仪中，可使提取的离子经受解离能，从而导致断裂，接着转移至第二质量分析器中。所选定的离子可具有选定的质荷比。所述质荷比可以在一定的质荷比范围内，这取决于质谱仪的特性。当使用碰撞诱导解离时，可通过使离子穿过碰撞室而将其从第一质量分析器转移至第二质量分析器，在所述碰撞室中可以施加解离能以产生片段离子。例如，送至第二质量分析器进行分析的离子可包括一些或一部分残留的(未断裂的)选定离子(如果有的话)以及被标记分析物的报告物离子(特征离子)和子片段离子。
通过计算机辅助数据库分析来确定分析物：
在一些实施方案中，可以基于子离子断裂模式来确定分析物，所述模式通过与已知或“理论”分析物的谱图进行计算机辅助的比较来分析。例如，在低能CID条件下断裂的肽离子的子片段离子谱可以认为是许多离散断裂事件的总和。常用的命名原则根据所断裂的酰胺键和键断裂后保持带电的肽片段来区分子片段离子(Reopstorff等，Biomed.Mass Spectrom.，11：601(1988))。电荷保留在断裂酰胺键的N端侧导致形成b-型离子。如果电荷保留在断裂酰胺键的C端侧，则片段离子称为y-型离子。除了b-和y-型离子以外，CID质谱还可含有其它诊断性片段离子(它们包括由于谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸发生氨中性丢失(-17amu)或者含有羟基的氨基酸(如丝氨酸和苏氨酸)发生水丢失(-18amu)而产生的离子)；所述诊断性片段离子以及b-和y-型离子都是子片段离子。已经观察到某些氨基酸在低能CID条件下比其它氨基酸更易于断裂。这对于含有脯氨酸或天冬氨酸残基的肽而言特别明显，在天冬氨酰-脯氨酸键处更为明显(Mak，M.等，Rapid Commun.MassSpectrom.，12：837-842(1998))。因此，Z”’-pro二聚体或Z”’-asp二聚体(其中Z”’是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸)的肽键与其它氨基酸二聚体组合中的肽键相比通常更不稳定。
因此，就肽和蛋白质样品而言，低能CID谱含有冗余的b-和y-系列离子、来自同一肽的内部片段离子以及铵和其它中性丢失离子方面的冗余的序列特异性信息。解释这些CID谱来从头组装亲本肽氨基酸序列是很艰巨且费时的，但仍可行。用于测序的计算机辅助的从头方法的最新进展描述于Huang，Y.，Ross，P，Smirnov，I，Martin，S.和Pappin，D.2003，Proceedings of 6th International Symposium on MS in Healthand Life Sciences，2003年8月24日-28日，San Francisco CA。肽序列鉴定中最重要的进步是开发了将肽CID谱与现存于蛋白质和DNA序列数据库中的肽序列相关联的计算机算法。这样的方法例如以下程序：SEQUEST(Eng，J.等J.Am.Soc.Mass Spectrom.，5：976-989(1994))和MASCOT(Perkins，D.等Electrophoresis，20：3551-3567(1999))。
简言之，将实验性肽CID谱(MS/MS谱)与从得自蛋白质或基因组序列数据库的肽序列中通过计算机产生的“理论”子片段离子谱进行匹配或关联。这种匹配或关联是基于预计质量与MS/MS模式中子片段离子的观测质量之间的相似性。根据实验与“理论”片段谱之间的一致程度来对可能的匹配或关联评分。对给定肽氨基酸序列进行检索的参数非常具有区分力，以至于单个肽CID谱就足以鉴定全基因组或表达序列标签(EST)数据库中的任何给定蛋白质。其它综述可参阅Yates，J.R.Trends，Genetics，16：5-8(2000)和Yates，J.R.，Electrophoresis 19：893-900(1998)。
因此，MS/MS谱的子片段离子分析不仅可用于确定被标记分析物的分析物，它还可用于确定作为所测定分析物之来源的分析物。例如，在MS/MS分析中鉴定肽可用于确定该肽从哪种蛋白质中由于蛋白质的酶消化而切下。我们认为这样的分析可应用于其它分析物，例如核酸、脂质、类固醇和/或前列腺素。
X键和Y键：
报告物部分的原子与连接物部分的原子之间的键是X键。如果是被标记分析物中的键，则连接物部分的原子与该分析物的原子之间的键是Y键。在一些实施方案中，至少在一部分选定离子中的X键和Y键在经受解离能时可断裂。因此，在一些实施方案中，可以调整质谱仪中的解离能，以使被标记分析物的至少一部分选定离子中的X键和Y键都断裂。
X键的断裂从分析物中释放报告物部分，使得报告物离子可以独立于分析物而进行测定。Y键的断裂从分析物中释放报告物/连接物/非编码可检测标记，或者从分析物中释放连接物，这取决于Y键是否已经断裂。在一些实施方案中，X键可比Y键更不稳定。在一些实施方案中，Y键可比X键更不稳定。在一些实施方案中，X键和Y键具有相同的相对不稳定性。简言之，在本发明的多个实施方案中，将X键设计成断裂以释放报告物离子，而Y键可以断裂或不断裂。如果标记试剂不包含可断裂的Y键，则可调整子离子分析，使得标记试剂对分析物的任何修饰的质量可以在相关分析中得到补偿。
在一些实施方案中，当目的分析物是蛋白质或肽时，可以相对于酰胺(肽)键来调整X键和Y键的相对不稳定性。键X、键Y或其二者可以比典型酰胺(肽)键的不稳定性更高、相同或更低。例如，在解离能条件下，与Z”’-pro二聚体或Z”’-asp二聚体中的肽键相比键X和/或键Y可以更不易于断裂，其中Z”’是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些实施方案中，键X和Y将在与典型酰胺键大致相同的解离能水平下断裂。在一些实施方案中，键X和Y将在比典型酰胺键更高的解离能水平下断裂。
在一些实施方案中，还可存在这样的键X和Y，使得键X的断裂引起键Y的断裂，反之亦然。这样，键X和Y可基本同时断裂，使得没有显著量的分析物(或其子片段)包含部分标记。我们用“显著量的分析物”来表示在质谱仪(例如MS/MS或MSn’分析，其中n’是大于1的整数)可检测到小于25％、优选小于10％的部分标记分析物。
由于在一些实施方案中分析物的标记片段与未标记片段在质谱(例如MS/MS分析)中存在明确的界限，因此这一特征可使通过计算机辅助分析从子片段离子谱中鉴定分析物得以简化，因为在用于对分析物子片段离子进行分析的质量计算中不需要对残留的标记进行补偿。而且，由于在一些实施方案中分析物的片段离子可以用报告物/连接物/可检测部分完全标记或者不标记(并且不是部分标记)，因此可以很少有或者没有由于跨过断裂键之间的同位素分布所导致的子片段离子在质量上的散布，就像由施加解离能水平所引起的被标记分析物的断裂所导致的部分标记分析物中单个不稳定键的每一侧都存在同位素的情况那样。
对分析物进行标记
如上文所述，可通过使分析物的官能团与标记试剂的反应基团进行反应来标记分析物。分析物上的官能团可以是亲电基团或亲核基团之一，而标记试剂的官能团可以是亲电基团或亲核基团中的另一种。亲电体与亲核体可发生反应，以在分析物与标记试剂之间形成共价连接。
标记反应可在溶液中发生。在一些实施方案中，分析物或标记试剂之一可与支持物结合。有时标记反应可在水性条件下进行。对于生物分子例如蛋白质、肽和/或核酸的标记可以选择水性条件。有时标记反应可在有机溶剂或有机溶剂的混合物中进行。对于小分子分析物可以选择有机溶剂。水与有机溶剂的混合物可广泛使用。例如，可以制备水与约5％至约95％有机溶剂(体积/体积)的溶液，并用于标记分析物。在一些实施方案中，可以制备水与约50％至约95％有机溶剂(体积/体积)，并用于标记分析物。在一些实施方案中，可以制备水与约65％至约80％有机溶剂(体积/体积)，并用于标记分析物。有机溶剂的非限制性实例包括N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本领域技术人员能够利用本领域的知识和本文的公开内容并结合常规实验，根据标记试剂的性质和分析物的性质来确定合适的溶剂条件，以便于对分析物进行标记。
进行标记反应时，可调节pH。pH可以为4-10。pH也可在此范围之外。通常，可以通过加入非亲核有机碱来调节非水反应的碱度。合适的碱的非限制性实例包括N-甲基吗啉、三乙胺和N，N-二异丙基乙胺。或者，可以使用生物缓冲剂(例如N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-吗啉乙磺酸(MES))或无机缓冲剂(例如碳酸钠和/或碳酸氢钠)来调节含水溶剂的pH。因为反应基团至少之一可以是亲电的，所以需要选择不含有任何亲核基团的缓冲剂。本领域技术人员通过应用常规实验能够确定可用于调节标记反应pH的其它缓冲剂，以有助于用标记试剂对分析物进行标记。因此，本领域技术人员能够根据标记试剂的性质和分析物的性质，使用本文的公开内容结合常规实验来确定有助于分析物标记的合适的溶剂条件和pH。
样品处理：
在本发明的一些实施方案中，可以在标记分析物之前和之后处理样品。处理可有助于分析物的标记。处理可有助于分析样品组分。处理可简化对样品的操作。处理可有助于上述的两项或更多。
例如，可以用酶或化学品处理样品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和肽)、核酸酶(以降解核酸)或其它一些酶。可以选择具有高度可预测的降解模式的酶。还可以将两种或更多种蛋白酶和/或两种或更多种核酸酶一起使用或与其它酶一起使用，以降解样品组分。
例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其切割赖氨酸或精氨酸与非特定氨基酸之间的肽键，从而产生包含氨基端(N端)以及赖氨酸或精氨酸为羧基端氨基酸(C端)的肽。这样，蛋白质切割所产生的肽是可以预测的，其在胰蛋白酶消化产物样品中的存在情况和/或量可指示其来源蛋白的存在情况和/或量。此外，肽的游离胺末端可以是有助于其标记的优良亲核体。其它示例性蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。
例如，理论上讲蛋白G在用诸如胰蛋白酶的蛋白酶进行消化时可产生三种肽(例如肽B、C和D)。因此，用蛋白水解酶(如胰蛋白酶)消化过并在分析中证实含有肽B、C和D的样品可以说最初包含蛋白G。肽B、C和D的量也会与所消化样品中蛋白G的量相关。这样，对鉴定和/或定量样品(或其片段)中肽B、C和D中一种或多种的任何测定均可用于对原始样品(或其级分)中蛋白G进行鉴定和/或定量。
由于酶的活性是可预测的，因此从序列已知的蛋白质的降解中产生的肽序列是可以预测的(参阅上文在“通过计算机辅助数据库分析来确定分析物”标题下的讨论)。使用这一信息可以产生“理论”肽信息。因此，在对实际样品质谱分析的子片段离子进行的计算机辅助分析(如上所述)中确定“理论”肽片段可用于确定一种或多种未知样品中的一种或多种肽或蛋白质(同上)。
在一些实施方案中，样品处理可包括处理待标记分析物的前体。例如，如果待标记分析物是来自经消化蛋白质的肽，且标记试剂(在这个例子中)选择成与该肽或肽分析物的氨基(如赖氨酸的N-α-氨基和N-ε-氨基)反应，则可以以有助于标记反应的方式加工样品中的蛋白质(分析物前体分子)。在这个例子中，可以用还原剂(例如三[2-羧乙基]磷(TCEP))还原蛋白质，接着通过与封闭试剂(例如甲基硫代磺酸甲酯(methyl methanethiosulfonate，MMTS))反应以封闭硫醇基团。这样，蛋白质的硫醇基被封闭，从而不干扰分析物的氨基与标记试剂之间的标记反应。
本领域技术人员会理解，对某些其它前体分子的处理可使用易于获得的试剂和可借助常规实验进行修改的方案来进行。试剂和条件的确切选择可根据待标记的分析物和标记试剂的性质来选择。
在一些实施方案中，样品加工可包括将分析物或分析物前体固定到固相支持物上，该固相支持物用或未用标记试剂进行了标记。固定可包括共价固定以及吸附和其它非共价固定手段(例如静电固定)。在一些实施方案中，固定可促进降低样品复杂度。在一些实施方案中，固定可有助于分析物的标记。在一些实施方案中，固定可有助于分析物前体的标记。在一些实施方案中，固定可有助于对样品组分中包含某些特性(例如包含或缺少半胱氨酸部分)的级分进行选择性标记。在一些实施方案中，固定可有助于纯化。固定可有助于以上两项或更多。
分离，包括分离样品混合物：
在一些实施方案中，对被标记分析物的样品或样品混合物的加工可包括分离。可对标记和/或未标记的分析物、标记和/或未标记的分析物前体或者其级分进行一次或多次分离。可对得自固相俘获的一种或多种级分和/或分离过程的其它产物进行一次或多次分离。可以对两种或更多种前述样品类型进行分离，并可在质量分析之前进行不同类型的分离。
例如，可以制备包含来自不同样品的差异性标记分析物的样品混合物。我们用“差异性标记”来表示每种标记包含可鉴定的独特特性。本文所述标记可包含两种独立的可检测特性。特别地，它们可包含非编码可检测标记以及在MS/MS(或MSn’分析)中产生独特“特征离子”的独特报告物部分。例如，为了分析样品混合物，可以分离该样品混合物的组分，并仅对该样品混合物的一种级分进行质量分析。这样，可以显著降低分析的复杂度，因为可以分别分析分离的分析物的质量，从而提高了分析方法的灵敏度。当然，可以对样品混合物的一种或多种其它级分重复进行一次或多次分析，从而允许对样品混合物的所有级分进行分析，因此允许对样品混合物的组分进行更完整的分析。
如果加入样品混合物中每种样品的量已知，则可以使用一定的分离条件来测定样品混合物所包含每种样品中的每种被标记分析物的量，其中在所述条件下经差异性标记的相同分析物以与其在样品混合物中的丰度成比例的浓度或量共洗脱。因此，在一些实施方案中，对样品混合物的分离可简化分析，同时仍保持质量分析(如MS/MS分析)中所测定信号与样品混合物中差异性标记分析物之间的相关性。
在一些实施方案中，分离可通过色谱进行。例如，可使用液相色谱/质谱法(LC/MS)来实现样品分离和质量分析。此外，任何适于分离目的分析物的色谱分离方法均可使用。例如，所述色谱分离可以是正相色谱、反相色谱、离子交换色谱(即阴离子交换色谱或阳离子交换色谱)、体积排阻色谱或亲和色谱。
在分析包含用本文所述同分异构和/或同量异位标记试剂标记的分析物的样品混合物时，电泳分离可能特别有用。可以使用的电泳分离技术的非限制性实例包括但不仅限于1D电泳分离、2D电泳分离和/或毛细管电泳分离(参阅Westermeier，R.，Electrophoresis in Practice：AGuide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations，Wiley-VCH Verlan GmbH，Weinheim，Germany，2005以及M.Khaledi，M.，High-Performance Capillary Electrophoresis：Theory，Techniques，and Applications，John Wiley and Sons，Inc.New York，1998)。在分离时或分离后，可以使用非编码可检测标记来定位共洗脱的被标记分析物混合物，其中该混合物可包含用不同的同分异构和/或同量异位标记进行标记的目的分析物，其中每种不同的标记表示该分析物来自哪种样品。此外，由于可独立进行检测非编码可检测标记，因此在一些实施方案中，可以测定被标记分析物的相对量，并将此信息用于慎重选择某些共迁移的被标记分析物(基于某些标准)用于进一步的质谱分析，从而不需要分析电泳分离中所存在的所有可能的被标记分析物。
例如，就某些分析物而言，电泳过程可产生包含一定量的各种同量异位标记分析物的混合物，其中所述同量异位标记的分析物与该被标记分析物在样品混合物中的量成比例。此外，从对该样品混合物如何制备的了解(样品的部分与其它任选组分(例如加入样品混合物中的校正标准品))中有可能反过来将样品混合物中被标记分析物的量与该被标记分析物在其来源样品中的量相关联。基于观察到的相对量，有可能仅选择符合某些所关注标准(例如相对强度的差异大于10％)的被标记分析物用于进一步分析。例如，还可在质谱仪中对某些分离的共迁移分析物进行分析，包括提供定量信息的分析。
分析物的相对和绝对定量：
在一些实施方案中，有可能对样品混合物中被差异性标记的相同分析物进行相对定量。例如，有可能通过比较质量分析(例如对第一质量分析中观察到的选定被标记分析物进行的第二质量分析)中测定的报告物离子(即特征离子)的相对量(例如所报告的峰面积和/或高度)来对被差异性标记的相同分析物进行相对定量。换言之，当每种报告物离子能与用于产生样品混合物的每种特定样品的信息相关联时，则该报告物离子相对于质量分析中所观察到的其它报告物离子的相对量就是该分析物在样品混合物中的相对量。当组成样品混合物的组分已知(例如组成样品混合物的每种样品的量已知)时，则可以基于对具有选定质荷比的被标记分析物观察到的报告物离子的相对量反过来计算该分析物在用于制备该样品混合物的每种样品中的相对量。可以对第一质量分析中观察到的所有不同的被标记分析物重复这一过程。这样，可以测定用于产生样品混合物的每种不同样品中每种反应性分析物的相对量(常以浓度和/或量表示)。
在另一些实施方案中，可以确定分析物的绝对量。就这些实施方案而言，可以向样品混合物中加入已知量的一种或多种差异性标记分析物(校正标准品)，或者可将报告物离子的强度与标准曲线相关联。
校正标准品可以是由用于标记样品混合物中分析物的所述标记组中的同分异构和/或同量异位标记进行了标记的预期分析物，条件是该校正标准品的报告物部分与形成该样品混合物任何样品相比都是独特的。一旦确定了校正标准品的报告物离子相对于样品混合物中差异性标记分析物的报告物离子的相对量，就有可能参考加入该样品混合物中的校正标准品的量来计算该样品混合物中所有差异性标记分析物的绝对量(常以浓度和/或量表示)。这样，还可以基于对该样品混合物如何制得的了解来确定每种差异性标记分析物(在该分析物来源的样品中存在校正标准品)的绝对量。
或者，可以通过分析被标记分析物的代表性样品来产生标准曲线，其中每种样品包含不同已知量的所述被标记分析物。可以将所分析被标记分析物的报告物离子的峰强度对已知量的每种被标记分析物作图，从而产生标准曲线。产生标准曲线以后，就可以将未知样品中报告物离子的强度与标准曲线进行比较，从而确定测试样品中该分析物的量。
除上述以外，适当时可以就报告物部分中任何天然存在或人工产生的同位素丰度对报告物离子(特征离子)的强度进行校正。有多种方式来校正报告物部分的特征离子中杂质的同位素丰度。这种校正的一个实例可见于已公开的共同未决共有美国临时专利申请No.US2005-0114042A1，其名称为＂Method and Apparatus For De-ConvolutingA Convoluted Spectrum＂，2004年8月12日提交。基本说来，可以使用数学公式和计算，通过对标记试剂的重叠同位素簇之卷积谱进行去卷积来测定与单个标记试剂中同位素簇相关的上限质量(up mass)和下限质量(down mass)峰的强度。无论值是如何测得的，越准确地定量每种报告物离子(即特征离子)的强度，原始样品中分析物的相对和绝对定量就会越准确。
蛋白质组分析：
本发明的实施方案可用于复杂分析，因为可以使用质量分析技术以快速和重复的方式将样品复合、分析和再分析。例如，可以分析一种或多种样品中一种或多种分析物的量。可以分析组成样品混合物的样品中分析物的量(常以浓度和/或量表示)。由于样品加工和质量分析可以快速进行，因此这些方法可以重复多次，使得样品混合物中许多差异性标记分析物的量都可以就其在该分析物的来源样品中的相对和/或绝对量进行测定。
可以使用这种快速多重分析的一项应用是蛋白质组分析领域。蛋白质组学可以看成是在结构、功能和生物过程调节方面描述基因组序列所编码信息的实验性方法。这可通过对细胞或组织所表达的全部蛋白质组分进行系统性分析来实现。与本发明的方法、混合物、试剂盒和/或组合物实施方案联用的质谱法是这种全局蛋白质分析的一种可能的工具。因此，可以使用这些标记试剂的实验性分析包括但不仅限于时程实验、生物标记分析、多重蛋白质组分析、多维蛋白质鉴定技术实验(mudpit experiment)、亲和捕获测定、翻译后修饰(PTM)和多重对照实验。
II.组合物
在一些实施方案中，本发明涉及由式I表示的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00591
其中m和n各为0或1，条件是m+n＝1，其中该化合物可在报告物部分和/或连接物部分中用一种或多种重原子同位素进行同位素编码。如上文的详细描述，反应基团“RG”可包含亲核体或亲电体，其中所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物。如上文的详细描述，报告物部分“RP”可包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在键X断裂后在质谱仪中产生特征离子。如上文的详细描述，“DL”可以是非编码可检测标记。如上文的详细描述，连接物部分“LK”可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分及所述非编码可检测标记连接在一起。如上文的详细描述，共价键X将报告物部分与连接物部分或非编码可检测标记连接在一起，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。如上文的详细描述，Y可以是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。如上文的详细描述，W可以是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。在一些实施方案中，该化合物任选地通过可切割连接物与固相支持物连接。在一些实施方案中，该化合物通过报告物部分与固相支持物连接。式I的标记试剂的某些断裂特性示于图2a。
例如，该组合物可以是式II或III所表示的化合物
其中RG是反应基团，其中该化合物可经同位素编码(参见图8a)。式I、II或III的组成物可用于标记分析物，以在本文详细讨论的利用电泳分离技术与质谱法(如串联质谱法)联用的方法中对其进行分析。式II和III的标记试剂的要素和某些断裂特性示于图2b。
该组合物可包含同位素富集(即编码)的报告物部分和/或同位素富集的连接物部分。例如，报告物部分和/或连接物部分可以各自经过同位素富集以包含一种或多种重原子同位素。在一些实施方案中，报告物部分和/或连接物部分可以各自经过同位素富集以包含两种或更多种重原子同位素。在一些实施方案中，报告物部分和/或连接物部分可以各自经过同位素富集以包含三种或更多种重原子同位素。在一些实施方案中，报告物部分和/或连接物部分可以各自经过同位素富集以包含四种或更多种重原子同位素。
在一些实施方案中，报告物部分可以与支持物可切割连接。我们用“可切割连接”来表示可以基于所选择可切割连接物的性质，通过用适当的因素(例如光、热和/或化学试剂)进行处理来从支持物上释放该报告物部分以及与其共价连接的任何部分。多种包含可切割连接物的支持物为本领域所熟知。例如，包含三苯甲基部分的多种支持物是市售的，或者也可以制得(例如三苯甲基氯支持物(Trityl-Cl)或2-氯三苯甲基氯支持物)。参考图6，展示了与支持物结合的标记试剂的实施方案，其中该标记试剂的报告物部分包含双-N-烷基化哌嗪环，其中该N-烷基化哌嗪环的取代基之一是以官能团Q结尾的烷基，其中Q是可以在用酸处理该支持物后释放以产生被标记分析物的官能团。
因此，在一些实施方案中，本发明涉及包含由式Iss表示的标记试剂组合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00611
其中m和n各为0或1，条件是m+n＝1，其中该化合物可在报告物部分和/或连接物部分中用一种或多种重原子同位素进行同位素编码。如上文的详细描述，反应基团“RG”可包含亲核体或亲电体，其中所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物。如上文的详细描述，报告物部分“RP”可包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在键X断裂后在质谱仪中产生特征离子。如上文的详细描述，“DL”可以是非编码可检测标记。如上文的详细描述，连接物部分“LK”可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分及所述非编码可检测标记连接在一起(参见图1a和1b)。如上文的详细描述，共价键X将报告物部分与连接物部分或与非编码可检测标记连接在一起，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。如上文的详细描述，Y可以是连接所述反应基团与连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。如上文的详细描述，W可以是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。如上文的详细描述，SS是通过可切割连接物与该组合物的报告物部分共价连接的固相支持物。式Iss的标记试剂的某些断裂特性示于图2a。
例如，该组合物可以是由式IIss或IIIss表示的化合物，
Figure A200780032436D00631
其中RG是反应基团，SS是固相支持物，CL是可切割连接物，其中该化合物可在报告物部分和/或连接物部分中用一种或多种重原子同位素进行同位素编码。式IIss和IIIss的标记试剂的要素和某些断裂特性示于图2c。
在一些实施方案中，上述式I、II、III、Iss、IIss或IIIss的化合物的基团RG可以是羧酸、磺酸、羧酰卤化物、磺酰卤化物、活性酯、混合酸酐、异氰酸盐/酯或异硫氰酸盐/酯基团。在一些实施方案中，基团RG可以是马来酰亚胺基、烷基卤化物基团、α-卤代酰基、α-卤代硫酮基或α-卤代亚胺基。在一些实施方案中，基团RG可以是三苯甲基卤化物或甲硅烷基卤化物。在一些实施方案中，基团RG可以是氨基、羟基或硫醇基。
如上述，上文所述组合物可以盐形式和/或水合物形式存在。该组合物是否以盐形式存在通常取决于取代基的性质和数目以及其存在和/或进行分离的条件。人们熟知，可以通过用酸处理使碱性基团(如胺)质子化，从而形成该胺的盐。例如，含有标记试剂的哌嗪可作为单TFA盐、单HCl盐、二TFA盐或二HCl盐得到(参阅如美国专利公布号US 2005-0148771 A1)。本领域普通技术人员十分了解如何使用常规实验和本文的公开内容对本文所述组合物盐形式的任何平衡离子的电荷态和性质进行操作。
组合物是否以水合物形式存在还将取决于其存在或进行分离的条件。水合物只是包含一个或多个络合的水分子。本发明涵盖任何可能的水合物形式。
在一些实施方案中，本发明还涉及用本文公开的标记试剂组合物进行标记的分析物。因此，在一些实施方案中，本发明涉及由式IA表示的被标记分析物组合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00641
其中m和n各为0或1，条件是m+n＝1，其中RP、X、W和DL如上文式I的组合物所述，其中该化合物可在报告物部分和/或连接物部分中用一种或多种重原子同位素进行同位素编码。如上文的详细描述，连接物部分“LK”可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记两者(直接或间接)连接在一起。如上文的详细描述，Y可以是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可在质谱仪中通过施加解离能而断裂。
在一些实施方案中，本发明还涉及由式IssA表示的与支持物结合的被标记分析物组合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00642
其中m和n各为0或1，条件是m+n＝1，其中SS、RP、X、W和DL如上文式Iss的组合物所述，其中该化合物可在报告物部分和/或连接物部分中用一种或多种重原子同位素进行同位素编码。如上文的详细描述，连接物部分“LK”可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记两者(直接或间接)连接在一起。如上文的详细描述，Y可以是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可在质谱仪中通过施加解离能而断裂。与支持物结合的分析物IssA的某些断裂特性示于图3a。
例如，与支持物结合的被标记分析物可由式IIssA或IIIssA表示，
Figure A200780032436D00651
其中SS是固相支持物，CL是可切割连接物。被标记分析物IIssA和IIIssA的要素和某些断裂特性示于图3c。
分析物已在本文中有所描述。在一些实施方案中，被标记分析物可以是经标记的校正标准品。如本文所述，可以以已知量向混合物中加入校正标准品，有助于对目的分析物进行绝对定量分析。因此，在一些实施方案中，本发明涉及为作为校正标准品而用上述标记试剂组合物进行了标记的目的分析物，例如肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇、脂质、氨基酸、维生素或前列腺素。因此，所述经标记的校正标准品可以是用本文所述标记试剂标记的任何分析物。通常，标记试剂选自一组同分异构和/或同量异位标记试剂，使其与用于标记一种或多种目的测试样品的标记试剂相比包含独特的报告物部分，其中以对所述测试样品中所述分析物的定量为目的。
III.标记和分析的方法
根据本发明的一些实施方案，可以用上文所述标记试剂来标记分析物，随后进行测定。可以通过质量分析测定被标记分析物、分析物本身、分析物的一个或多个片段和/或标记的片段。在一些实施方案中，本发明的方法可用于分析同一样品中的不同分析物，以及用于对两种或更多种不同样品中相同和/或不同的分析物进行多重分析。可以混合两种或更多种不同样品以形成样品混合物。在多重分析中，可以使用标记试剂来确定分析物来源于样品混合物中的哪种样品。可以测定该分析物在合并形成样品混合物的所述两种或更多种样品的每种中的绝对和/或相对(相对于不同样品中的同一分析物)量(常以浓度或量表示)。此外，可以使用分析物片段(例如子片段离子)的质量分析来鉴定该分析物和/或该分析物的前体，例如在该分析物由前体分子降解而成的情况下。
该分析中使用的样品可以是包含可用标记试剂的多种同位素编码形式进行标记的分析物的任何样品。例如，样品可以是粗制或经处理的细胞裂解物、体液、组织提取物或细胞提取物。在一些实施方案中，可以在标记之前处理样品，以制备用于标记反应的分析物或其它样品组分。样品可以是分离过程的一个级分。样品中的分析物可以是可用标记试剂进行标记的任何分析物。例如，分析物可以是肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇、氨基酸、维生素、前列腺素或分子量小于1500道尔顿(Da)的其它小分子。其它可能的分析物类型已在本文中公开。
因此，在一些实施方案中，本发明还涉及包括以下步骤的方法：使两种或更多种样品(每种样品包含一种或更多种反应性分析物)与标记试剂组中的不同标记试剂反应，从而产生两种或更多种差异性标记样品，所述样品每个包含一种或多种被标记分析物。所述标记试剂可选自一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂，其中不同的标记试剂各包含具有独特质量的报告物部分。所述报告物部分可以是具有本文所述特性的任何报告物部分。例如，所述报告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌嗪或吗啉基团。其它报告物部分的实例也已在上文描述。
在一些实施方案中，本发明涉及使两种或更多种样品(每种样品包含一种或多种反应性分析物)与一组同位素富集的同分异构和/或同量异位标记试剂的不同标记试剂反应，从而形成两种或更多种差异性标记样品，所述样品各包含一种或多种被标记分析物，其中该组中的不同标记试剂由式I表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00671
其中m和n各为0或1，条件是m+n＝1。根据该方法，RG(如上文的详细描述)是包含亲核体或亲电体的反应基团，所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物。报告物部分RP(如上文的详细描述)包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在键X断裂后在质谱仪中产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言是不同的。对于该组中的每种试剂而言，非编码可检测标记“DL”(如上文的详细描述)是不同的可独立检测的非编码可检测标记，其中每种非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的非编码可检测标记具有相同的粗略质量和净电荷。连接物部分“LK”(如上文的详细描述)可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记都(直接或间接)连接在一起，其中该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿针对该组中不同标记试剂在报告物部分之间的粗略质量差异，从而对于该组中的每种标记试剂而言，所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量都是相同的。共价键X(如上文的详细描述)将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。Y(如上文的详细描述)是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都相同。W(如上文的详细描述)是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都相同。
在一些实施方案中，用式II或III的标记试剂标记每种差异性标记样品，
Figure A200780032436D00681
其中RG是反应基团。在一些实施方案中，化合物II和III可以如图8a所示进行同位素编码。
所述标记方法可产生两种或更多种差异性标记样品，每种样品包含一种或多种被标记分析物。一旦利用对于该样品而言独特的标记试剂将每种样品中的分析物进行标记，则可将两种或更多种差异性标记样品或其部分混合而形成样品混合物。所述样品混合物可任选地包含一种或多种上述的校正标准品。
可记录组合以形成样品混合物的被标记分析物的每种样品的体积和/或量。相对于样品混合物的总样品体积和/或量而言，每种样品的体积和/或量可用来测定来自样品混合物分析的每种样品中所鉴定分析物的量(常以浓度和/或量来表示)。因此，样品混合物可包含复杂的混合物，其中通过对两种或更多种样品中的每种中的分析物的量进行相对定量，或者通过绝对定量(其中还将校正标准品加入样品混合物中)或在可获得特征离子的校正曲线的情况下的绝对定量，可将相同和/或不同分析物的相对量进行鉴定和/或定量。
在一些实施方案中，该方法还可包括通过电泳分离所述样品混合物或其部分。例如，所述电泳分离可以是1D电泳分离、2D电泳分离和/或毛细管电泳分离。
所述两种或更多种可检测标记可以是可独立检测的。由于标记可独立检测，因此有可能在电泳分离中定位、检测和/或定量被标记分析物。例如，所述可独立检测的非编码可检测标记可用于在分离中和/或分离后定位1D或2D凝胶中的被标记分析物。在一些实施方案中，所述标记可用于在分离后定位凝胶中的被标记分析物，从而可将其从凝胶上切下并进一步分析，例如通过下文所述的质谱法进行分析。
例如，所述方法还可包括从电泳分离中收集共迁移的差异性标记分析物的一种或多种子样品，并在m为0，n为1，W是可通过施加光、热或化学试剂而切割的共价键或连接基团时，任选地在适当条件下处理所述一种或多种子样品，以从所述子样品的差异性标记分析物上切下非编码的可检测标记。一旦从分析物上切下了非编码的可检测标记，就可对其进行进一步分析，例如通过质谱法进行分析，其中如下文所述可以使用报告物部分的分析来测定和/或确认与用于形成该样品混合物的每种样品相关的分析物的相对和/或绝对量。
在一些实施方案中，可在毛细管电泳中使用所述非编码的可检测标记来检测和/或定量被标记分析物，因为它们存在于毛细管中。可以基于分析适当的检测器中由该非编码可检测标记产生的信号强度来进行定量。优选地(但不必须)，将组中的非编码可检测标记选择成在电泳分离中具有相似的迁移特性(即，它们共迁移)。在一些实施方案中，可以基于非编码可检测标记的可独立检测的特性，任选地根据目的条件来分析共迁移的差异性标记分析物，并慎重地选择满足条件的用于进一步分析，不满足条件的则弃去。例如，如果共迁移的差异性标记分析物满足目的条件(例如两种可独立检测的标记的相对量差异不超过10％)，则所述共迁移的差异性标记分析物可通过质谱法进行后续的分析和定量，如果不满足，则将其弃去。这样，有可能实现更高效和经济地使用质谱设备。
在一些实施方案中，所述方法还可包括使用第一质量分析仪对子样品之一或其级分进行第一质谱分析。接着可以选择在第一质量分析中具有特定质荷比的离子。可对选定的离子施加一定水平的解离能(例如碰撞诱发解离(CID))，以诱发断裂。例如，键X的断裂可从被标记分析物上释放离子化的报告物部分(即报告物离子或特征离子)。通过解离能断裂选定的离子还可产生该分析物的子片段离子，接着可以分析所述子片段离子，以测定该分析物和/或该分析物的一种或多种前体。因此，可在第二质量分析器中对所述离子(剩余的选定离子、子片段离子和离子化的报告物部分(即特征离子))或其级分进行分析。
在第二质量分析中，可对选定的离子、特征离子以及子片段离子或其级分进行第二质量分析。所述第二质量分析可测定以选定的质荷比存在的每种独特报告物离子的粗略质量(或m/z)和相对量，以及该样品混合物中至少一种被标记分析物的子片段离子中一些或全部的质量(粗略质量和/或绝对质量)。就每种以选定的质荷比存在的分析物而言，可以使用子片段离子来鉴定以选定的质荷比存在的分析物。例如，这种分析可以如上文标题为“通过计算机辅助的数据库分析来确定分析物”的章节中所述进行。因此，在一些实施方案中，该方法还包括在第二质量分析中测定每种特征离子的粗略质量和相对量，以及在第二质量分析中测定一些或全部子片段离子的粗略质量和/或绝对质量。在一些实施方案中，该方法还包括通过对子片段离子的分析来测定与选定的质荷比相关的被标记分析物(和/或其前体)。
在一些实施方案中，该方法的一个或多个步骤可以重复一次或多次。例如，在一些实施方案中，可以如前述对在第一质谱分析中具有选定质荷比的离子(不同于任何之前选定的质荷比)进行解离能处理，从而形成离子化的报告物部分(即特征离子)和选定离子中至少一些的子片段离子。可以对选定的离子、报告物离子和/或子片段离子或其级分进行第二质量分析。还可以测定第二质量分析中每种独特的特征离子的粗略质量和相对量以及子片段离子的质量(粗略质量或绝对质量)。任选地，可以通过对子片段离子的分析来确定与选定的质荷比相关的被标记分析物(或前体分子)。这样，所述信息可用于鉴定和/或定量来自第一质量分析的一种或多种其它分析物。
在一些实施方案中，在样品混合物已分级(例如通过电泳分离)时，对不同的所收集子样品重复该方法(或该方法的某些步骤)一次或多次可能是有用的。通过对该样品的一种或多种其它级分重复该方法，有可能更完整地分析该样品混合物。因此，该方法可包括选择不同的子样品并对该子样品进行第一质量分析，接着重复一次或多次前述的后续步骤。
在一些实施方案中，在样品混合物已分级时，通过收集来自电泳分离的共迁移差异性标记分析物的一种或多种不同子样品将该方法重复一次或多次可能是有用的。通过重复该方法以收集一种或多种其它子样品，有可能更完整地分析该样品混合物。因此，该方法可包括从电泳分离中收集共迁移的差异性标记分析物的一种或多种不同的子样品，接着将前述后续步骤重复一次或多次
还考虑到在一些实施方案中，将整个方法重复一次或多次，在每次重复时，某些步骤也可以如上述重复一次或多次。这样，可以在可能的最大程度上分析和确定样品混合物的内容。在一些实施方案中，还可以对一组新的两种或更多种样品重复整个方法。
如前述，在一些实施方案中，同分异构和/或同量异位物标记试剂组中的标记试剂可与支持物结合。因此，除了从支持物上重俘获被标记分析物以外，上述方法还可以使用与支持物结合的试剂来进行。因此，在一些实施方案中，本发明涉及实施任何上述方法，其中该组中每种不同的标记试剂都是与支持物结合的，并通过可切割连接物与支持物连接，使得每种不同样品与带有该组中不同标记试剂的支持物反应，并且其中该方法在进行样品标记的步骤之后和进行混合经标记样品以制备样品混合物之前还包括：i)任选地清洗每种支持物，以除去每种样品中不与支持物上所结合标记试剂的反应基团反应的组分；ii)切割所述可切割连接物，以从每种支持物上释放被标记分析物，每种不同标记的样品包含一种或多种被标记分析物，其中与特定样品相关的被标记分析物可通过与其相连的独特质量的报告物部分来鉴定和/或定量；和iii)任选地收集每种样品的被标记分析物，之后根据步骤(b)将其混合。
例如，可以使用一组同位素标记试剂来实施该方法，其中该组中每种不同的标记试剂以式Iss表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00721
其中：m和n各为0或1，条件是m+n＝1。根据该方法RG(如上文的详细描述)为包含亲核体或亲电体的反应基团，其中所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物。报告物部分“RP”(如上文的详细描述)包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分在质谱仪中能在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言是不同的。非编码的可检测标记“DL”(如上文的详细描述)是对该组中的每种标记试剂而言不同的可独立检测的非编码可检测标记，其中每种非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷。连接物部分“LK”(如上文的详细描述)可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者(直接或间接地)连接在一起，其中该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿针对该组中所述不同标记试剂在报告物部分之间的粗略质量差异，使得报告物部分与连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的。共价键X(如上文的详细描述)将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。Y(如上文的详细描述)是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。W(如上文的详细描述)是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。SS(如上文的详细描述)是通过可切割连接物与标记试剂的报告物部分共价连接的固相支持物。
在一些实施方案中，标记试剂之一可由式IIss或IIIss表示，
Figure A200780032436D00731
其中RG是反应基团，SS是固相支持物，CL是可切割连接物。在一些实施方案中，化合物IIss或IIIss可以如图8b所示进行同位素编码。
质谱领域的普通技术人员会理解，上述方法中的第一和第二质量分析可在串联质谱仪中进行。适于进行串联质量分析的仪器已在上文描述。尽管串联质谱仪是优选的，但单级质谱仪也可以使用。例如，可以通过锥电压断裂来诱发分析物断裂，接着使用单级四极杆或飞行时间质谱仪对得到的片段进行质量分析。在另一个例子中，可以使用激光源对分析物施加解离能，接着使用飞行时间的源后衰变或串联飞行时间(TOF-TOF)质谱仪来记录得到的片段。
在一些实施方案中，本发明的方法还可包括在对样品中的分析物进行标记之前用至少一种酶消化每种样品和/或样品混合物，以部分或全部降解该样品和/或样品混合物的组分(还可参见上文标题为“样品处理”的章节)。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。还可以一起使用两种或更多种酶，以进一步降解样品组分。例如，所述酶可以是蛋白水解酶例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶(例如A、B、C等)。
在一些实施方案中，该方法还可包括在进行第一质量分析之前通过应用除电泳以外的其它分离方法来分离样品混合物(还可参阅上文标题为“分离，包括分离样品混合物”的章节)。例如，可以使用液相色谱/质谱(LC/MS)在质量分析之前实现这样的样品分离。
在一些实施方案中，所述方法可以与消化和额外的分离步骤一起实施。虽然这些步骤是任选的，但可将它们一起实施，例如，当进行蛋白质组分析从而测定细胞中蛋白质的上调和下调时。在一些实施方案中，可将方法的各步骤(无论有或没有消化和/或额外的分离步骤)重复一次或多次，从而鉴定和/或定量样品中的一种或多种其它的分析物或者两种或更多种样品(包括利用与支持物结合的标记试剂标记的样品)中的每种样品中的一种或多种分析物。根据样品混合物中是否存在校正标准品或者是否可获得特征离子的校正曲线，特定分析物的定量可以相对于其它的被标记分析物，或者特定分析物的定量可以是绝对的。
如前所述，可通过对子片段离子的质量(粗略质量或绝对质量)的分析而测定与所选离子相关的分析物。一种这样的方法描述于标题为“通过计算机辅助数据库分析进行的分析物测定”的部分中。一旦已对分析物进行了测定，则关于第二质量分析中每种独特报告物离子的粗略质量和相对量的信息以及子片段离子质量的信息可为确定有关样品混合物的其它信息提供基础。
特征离子(报告物离子)的相对量可通过质谱中的峰强度来测定。在一些实施方案中，可以通过分析使用质谱仪得到的报告物离子(特征离子)峰高或峰宽(或峰面积)来测定每种独特特征离子的量。由于每种样品可以使用不同的标记试剂来标记，并且每种标记试剂可包含产生独特的特征离子的独特的报告物部分，所述独特的特征离子可与用于制备该样品混合物的特定的差异性标记样品相关联，因此在第二质量分析中对不同报告物离子的测定可用于鉴定所选分析物的特征离子所来源的差异性标记样品。当发现多种特征离子时(例如根据本发明的多重方法)，可以相对于其它特征离子来测定每种独特特征离子的相对量。由于第二质量分析中测定的每种独特特征离子的相对量可与样品混合物中分析物的相对量相关，因此可以测定合并成该样品混合物的每种差异性标记样品中分析物的相对量(常以浓度和/或量表示)。此外，当所测定的分析物是来自另一种目的化合物的副产物时(例如，分析物是降解反应的副产物，例如分析物是蛋白质消化产生的肽)，有可能将分析物的定量信息与原始的差异性标记样品相关联。
如上所述，可针对具有不同质荷比的所选离子重复该分析一次或多次，从而获得组合而形成样品混合物的每种样品中的一种或多种其它被测分析物的相对量。此外，根据需要，可对与每种独特特征离子相关的峰强度进行天然或人工产生的同位素丰度的校正，如前面在标题为“分析物的相对和绝对定量”的部分中所述的。
例如，分析物可以是样品或样品混合物中的肽。对样品或样品混合物中肽的分析可用来测定样品或样品混合物中可鉴定蛋白质的量(常表示为浓度和/或量)，其中一种或多种样品中的蛋白质可在第一质量分析之前被降解，并且其中样品中蛋白质的量是基于两种或更多种差异性标记样品(其混合而形成所述样品混合物)之每种中的一种或多种肽的身份和相对量而测定的。此外，可为了测定的目的而将来自不同样品的信息进行比较，比如为比较与不同浓度的基质(其可影响细胞生长、发育、分化和/或死亡)一起孵育对细胞中蛋白质的量的作用。其它非限定性的实例可包括对患病或健康组织或细胞培养物中所表达的蛋白质成分的比较。这可涵盖在传染性物质(比如细菌或病毒或其它疾病状态比如癌症)感染后对细胞、组织或生物流体中所表达的蛋白质水平的比较。在另一些实例中，可进行蛋白质浓度随时间变化(时间-过程)的研究以检验药物治疗对细胞或组织中所表达蛋白质成分的作用。在另一些实例中，来自随时间不同所取的不同样品的信息可用于检查或监测作为疾病(例如癌症)或感染之结果的特定蛋白质在组织、器官或生物流体中的浓度。这些实验可包括一个或多个对照样品。在一些实施方案中，所述实验可用于测定两个或更多个上述所关注的性质。
在已向样品混合物中加入已知量(常表示为浓度和/或量)的校正标准品(包含与具有所选质荷比的分析物相连的独特报告物部分)用于所测分析物的情况下，可利用所述与校正标准品相关的独特特征离子的量来测定每种样品(其组合而形成样品混合物)中分析物的绝对量(常表示为浓度和/或量)。这是可能的，因为与样品混合物中校正标准品的独特特征离子相关的分析物的量是已知的，并且对于与所选离子相关的被标记分析物而言，相对于所述校正标准品的特征离子的强度，可以测定所有独特特征离子的相对量。因为对于每种独特的报告物部分(包括所述校正标准品的报告物部分)而言，所测的每种独特特征离子的相对量与和每种差异性标记样品(其组合而形成样品混合物)相关的分析物的量成比例，参考基于一定比例(参考用于制备产品混合物的配方而计算的)的独特质量的每种不同的特征离子的量，可确定每种样品中分析物的绝对量(常表示为浓度和/或量)。根据需要，可对与每种独特的特征离子相关的峰强度针对天然或人工产生的同位素丰度进行校正。这样的分析方法尤其可用于具有复杂性质的多重样品的蛋白质组分析，特别是在第一质量分析之前进行被标记分析物预分离(例如液相色谱分离或电泳分离)的情况下。
例如，如果样品混合物包含100fmol/mL的校正标准品，并且与所述校正标准品相关的独特的特征离子的相对强度是1，而与第一样品相关的第一其它独特特征离子的相对强度是二分之一并且与第二样品相关的第二其它独特特征离子的相对强度是2，则所述第一差异性标记样品(其混合而形成样品混合物)中分析物的量(假定等量的样品1和样品2混合而形成所述样品混合物)是50fmol/mL(0.5×100fmol/mL)，所述第二差异性标记样品(其混合而形成样品混合物)中分析物的量是200fmol/mL(2×100fmol/mL)。另外，如果例如所述分析物是与特定蛋白质相关的肽，那么可推出样品1中蛋白质的量是50fmol/ml，样品2中蛋白质的量是200fmol/ml。因此，校正标准品的存在使得可进行每种差异性标记样品(其混合而形成样品混合物)中被标记分析物(以及在某些情况下其前体)的绝对定量。
由于所述分析物可以是前体分子，因此在一些实施方案中，所述分析物可以是肽，可以基于混合形成该样品混合物的两种或更多种差异性标记样品之每种中一种或多种肽的身份和绝对量来测定混合形成该样品混合物的两种或更多种差异性标记样品之每种中一种或多种蛋白质的身份和绝对量。
如前所述，可针对具有不同质荷比的所选离子重复该分析一次或多次，从而获得每种样品(其组合而形成样品混合物)中一种或多种其它被测分析物的绝对量。此外，需要时，可如前述对与每种独特报告物离子相关的峰强度针对天然或人工产生的同位素丰度进行校正。
在一些实施方案中，可以使用与支持物结合的标记试剂来实施本文所述的方法，其中该组中每种不同的标记试剂都是与支持物结合的，并通过可切割连接物与支持物连接，使得每种不同样品与带有该组中不同标记试剂的支持物反应。示例性支持物已在上文标题为“组合物”的章节中讨论(还可参见图6)。根据该方法，可以任选地在使分析物与支持物上结合的标记试剂反应之后而在混合样品之前清洗所述支持物，以除去不与经标记试剂的反应基团反应的组分。一旦使分析物与标记试剂反应以形成被标记分析物并任选地进行了清洗步骤之后，可以通过在切割可切割连接物的条件下处理支持物来从支持物上释放被标记分析物。切割后，可以任选地收集两种或更多种差异性标记样品，每种样品包含一种或多种被标记分析物，其中与特定样品相关的被标记分析物可通过与其相连的独特报告物部分来鉴定和/或定量。无论是否单独收集，都可以混合切割产物以形成样品混合物。
IV.混合物
在一些实施方案中，本发明涉及混合物(即样品混合物)。例如，所述混合物可包含含有同位素编码的同分异构和/或同量异位标记物的被标记分析物。被标记分析物的示例性混合物及其制备方法和/或分析方法已经在上述标题为“用于标记和分析的方法”的部分中进行了描述。
可通过将两种或更多种标记反应产物的全部或部分混合而形成混合物，其中利用标记试剂组中的不同标记试剂将每种样品进行标记，其中每种标记试剂包含具有独特(大致)质量的报告物部分以及非编码的可检测标记物。可以由两种或更多种被标记分析物中的每种所得自(即来源)的标记反应鉴定所述每种不同标记试剂的独特的报告物部分。非编码的可检测标记物可用来在电泳分离期间定位被标记分析物。与这些方法相关的标记试剂和被标记分析物的性质已在前面论述过。
混合物的一种或多种分析物可以是肽。混合物的一种或多种分析物可以是蛋白质。混合物的一种或多种分析物可以是肽和蛋白质。混合物的一种或多种分析物可以是核酸分子。混合物的一种或多种分析物可以是碳水化合物。混合物的一种或多种分析物可以是脂质。混合物的一种或多种分析物可以是胆固醇。混合物的一种或多种分析物可以是维生素。混合物的一种或多种分析物可以是前列腺素。混合物的一种或多种分析物可以是氨基酸。混合物的一种或多种分析物可以是质量小于1500道尔顿的小分子。在一些情况下，分析物可以是多种分析物类型的混合物。例如，混合物中的分析物包括脂质和胆固醇；或者2)蛋白质、肽、氨基酸、脂质、胆固醇和碳水化合物。混合物可包含利用本文中所公开的新型标记试剂标记的任何类型的差异性标记分析物，包括含有两种或更多种不同分析物类型的混合物。
例如，所述混合物可包含至少两种差异性标记分析物，其中所述混合物通过将至少两种不同样品的标记反应产物混合在一起而形成，每种样品使用来自一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂的不同标记试剂进行标记，其中该混合物中每种差异性标记分析物由式IA表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00781
其中：m和n各为0或1，条件是m+n＝1。报告物部分“RP”(如上文的详细描述)包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于每种不同样品而言是不同的，这取决于使用该组中哪种标记试剂来标记样品。非编码的可检测标记“DL”(如上文的详细描述)对该组中的每种不同标记试剂而言是不同的，其中每种不同非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷。连接物部分“LK”(如上文的详细描述)可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者(直接或间接地)连接在一起，其中该组中每种不同标记试剂的连接物部分的质量补偿针对该组中所述不同标记试剂在报告物部分之间的粗略质量差异，使得报告物部分与连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的。X(如上文的详细描述)是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。Y(如上文的详细描述)是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。W(如上文的详细描述)是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。被标记分析物IA的某些断裂特征示于图3a。
例如，该混合物可包含至少一种由式IIA或IIIA表示的被标记分析物，
Figure A200780032436D00791
分析物IIA和IIIA的要素和某些断裂特征示于图3b。
在一些实施方案中，所述混合物通过使用与支持物结合的标记试剂来制备，并从支持物上切下被标记分析物以形成混合物。因此，在某些实施方案中，本发明涉及含有至少两种差异性标记分析物的混合物，其中通过混合至少两种不同样品的标记反应产物形成所述混合物，每种样品使用选自一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂的不同标记试剂进行标记，其中该混合物中每种差异性标记分析物由式IssAx表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436D00801
其中：m和n各为0或1，条件是m+n＝1。报告物部分“RP”(如上文的详细描述)包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于每种不同样品而言是不同的，这取决于使用该组中哪种标记试剂来标记样品。非编码的可检测标记“DL”(如上文的详细描述)对该组中的每种不同标记试剂而言是不同的，其中每种不同的非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷。连接物部分“LK”(如上文的详细描述)可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者(直接或间接地)连接在一起，其中该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿针对该组中所述不同标记试剂在报告物部分之间的质量差异，使得所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言是相同的。X(如上文的详细描述)是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂。Y(如上文的详细描述)是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。W(如上文的详细描述)是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热、化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的。Q’是同从固相支持物上切割所述差异性标记分析物而形成的官能团。例如，Q’可以是烷基氨基、烷基羟基或烷基硫醇基。
例如，所述混合物可包含至少一种由式IIssAx或IIIssAx表示的被标记分析物，
Figure A200780032436D00811
其中Q’是通过从固相支持物上切割所述差异性标记分析物而形成的官能团。被标记分析物IIssAx和IIIssAx的要素和某些断裂特征示于图3d。
V.试剂盒
在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒。所述试剂盒可包含一种或多种如上所述的标记试剂以及一种或多种其它试剂、容器、酶、缓冲液和/或说明书。例如，该试剂盒的试剂可选择成用于测定或定量两种或更多种样品中的一种或多种分析物。该试剂盒可包含一组两种或更多种标记试剂以及一种或多种其它试剂、容器、酶、缓冲液和/或说明书。试剂盒中标记试剂的两种或更多种可以是同分异构和/或同量异位的。所述标记试剂可以是经同位素编码的。
该试剂盒的标记试剂可以是本文所述的任何标记试剂。例如，该试剂盒的一种或多种标记试剂可以是上文所述式I、II、III、Iss、IIss和/或IIIss的化合物(包括化合物组)，包括其同位素编码的形式。
在一些实施方案中，该试剂盒可包含前述式IA、IIA、IIIA、IssAx、IIssAx和/或IIIssAx的被标记分析物，包括其同位素编码的形式。该试剂盒中标记试剂的其它特性已经公开。在一些实施方案中，该试剂盒中的至少一种其它试剂是包含报告物部分的经标记校正标准品。在一些实施方案中，所述报告物可与该试剂盒中任何化合物(即标记试剂)相比具有独特的质量。例如，该试剂盒可用于对同一样品或者两种或更多种不同样品中的一种或多种分析物进行多重分析。
实施例
可以参考以下实施例进一步理解本发明教导的方面，所述实施例不应理解为以任何方式限制本发明教导的范围。
实施例1：标记试剂的建议合成途径：
参考图9a和9b，展示了示例性标记试剂III的建议合成途径。应该理解，可以通过简单替换适当的荧光染料而使用相同的方法来制备示例性标记试剂II。还应该理解，可以用适当编码的起始材料制备具有同位素富集位点的组合物。
参考图9a，在氢化钠(NaH)存在下使化合物10与化合物11反应，以生成产物化合物12。用乙酸酐(Ac2O)处理化合物12，形成化合物13。用化合物14(包括其同位素编码的形式，例如参见下文实施例2)处理化合物13，生成化合物15。
参考图9b，接着用甲醇(MeOH)和二环己基碳二亚胺(DCC)处理化合物15，生成化合物16。接着在二噁烷中用盐酸(HCl)处理化合物16，生成化合物17。接着在碱性条件下用非亲核碱(例如三乙胺(Et3N)和活化(例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)活化)的非编码可检测标记(例如化合物18)处理化合物17，生成化合物19。化合物18是一种可能的非编码可检测标记，该标记由本文所述式III表示。还可以使用非编码可检测标记的活化形式(例如由式II化合物表示的形式)来形成同分异构和/或同量异位标记试剂组的伴侣标记。接着用强碱(例如氢氧化钠(NaOH))处理化合物19，以使该甲基酯皂化，并通过用N-羟基琥珀酰亚胺-三氟乙酸(NHS-TFA)处理转化成N-羟基琥珀酰亚胺酯，生成标记试剂20，NHS-TFA是公知适于将羧酸基转化成N-琥珀酰亚胺酯的试剂(见图7)。
实施例2：编码的报告物分子的建议合成路线：
(i)合成BocNH13CH2 13CH2OH(31)
参考图10a，将BocNH13CH2 13COOH(30，P/N：Aldrich 604992；10g，56.44mmol)转移至装有隔板、磁力搅拌棒和氩气输入线的500mL双颈圆底瓶中。用氩气冲洗该系统后，使用压力差通过插管转移干燥的四氢呋喃(THF，P/N：Aldrich，186562；100mL)，并在室温下搅拌直至获得澄清溶液。接着将反应混合物冷却至0℃，经历10分钟通过插管将甲硼烷-THF复合物(BH3·THF，P/N：Aldrich 176192，1M，197mL)溶液加入到反应混合物中。接着在0℃下使反应继续进行90分钟。
用甲醇(MeOH)猝灭反应混合物的小等分试样，并通过薄层色谱(TLC)进行分析，该分析显示完全消耗了起始材料30并形成了产物31(Rf 30＝0.00，Rf 31＝0.20；1:1己烷-乙酸乙酯(EtOAc)；通过用乙醇(EtOH)中3％(重量/体积)的水合茚三酮溶液加热来使TLC显色)。
通过缓慢加入甲醇(100mL，经历20分钟)来猝灭(在0℃下)反应。减压除去挥发物。将这样获得的油从额外的甲醇(50mL)中共蒸发，并通过柱色谱纯化(进行两次，120g SiO2柱Isco.；85mL/分钟，0-10分钟己烷中的40％EtOAc，10-25分钟己烷中的90％EtOAc。收集18mL级分，39-55级分含有纯产物)，得到BocNH13CH2 13CH2OH(31)的无色油(7.40g，81％)。
(ii)合成BocNHCH2CH2OMs(32)
参考图10b，历经1分钟一边搅拌一边向31(1.15g，7.13mmol)、Et3N(2.5mL，17.82mmol)的二氯甲烷(DCM，100mL)冰冷溶液中加入甲磺酰氯(MsCI，P/N：Fluka64260，0.664mL，8.55mmol)。在0℃再经过15分钟后，通过TLC分析反应混合物，其显示形成了新产物(Rf 31＝0.20，Rf 32＝0.42；1:1己烷-EtOAc；通过用乙醇(EtOH)中3％(重量/体积)的水合茚三酮溶液加热来使TLC显色)。
使DCM蒸发，将黄色固体溶于乙醇(300mL)中。用HCl(1M，100mL)洗涤乙醇层，其后用盐水洗涤(50mL×2)，用Na2SO4干燥并浓缩得到黄色油，无需纯化即可用于下一步反应。
(iii)合成BocNHCH2CH2NHMe(33)
参考图10c，使用最低量的THF将BocNHCH2CH2OMs(32)(1.42g，5.94mmol)转移至Chem-Glass压力管，并加入60mL甲胺(MeNH2，P/N：Aldrich395056，THF中2.0M，120mmol)溶液，加盖并在40-45℃加热(同时搅拌)3小时，接着在RT下过夜(使用防护罩)。TLC分析(1:1EtOAc-己烷)显示，完全消耗了32并形成了新产物(Rf 33＝0.38；1:1DCM-MeOH+1％(体积/体积)Et3N；TLC板首先加热5分钟以除去Et3N，接着通过用EtOH中3％(重量/体积)的水合茚三酮溶液加热来显色。接着将反应混合物浓缩成油，并通过柱色谱纯化(40g SiO2柱Isco.；40mL/分钟，柱用EtOAc平衡，用1:1的MeOH-DCM+1％ Et3N(体积/体积)洗脱。收集18mL级分，级分13-19中含有纯产物)，得到BocNH13CH2 13CH2NHMe 33的无色油(0.79g，76％)。ES-MS(在MeOH中直接浸出)计算值MH+[13C2C6H18N2O2+H]+＝177.14，观察值MH+＝177.14。
(iv)合成NH2CH2CH2NH(Me)Fmoc(34)
参考图10d，向充分搅拌的BocNH13CH2 13CH2NHMe(33，1.78g，10.2mmol)的丙酮溶液(125mL)中加入Fmoc-OSu(P/N：AdvanceChemTech RC8015，3.46g，125mL丙酮中10.2mmol)溶液。在室温下将该混合物搅拌10分钟。在此时向反应混合物中加入NaHCO3(饱和的，25mL)溶液，以将pH调节至8-9，再剧烈搅拌30分钟(两相反应)。丙酮蒸发后，使产物在乙醇(500mL)与稀(水)盐酸(HCI，30mL，1M)+30mL盐水之间分层。接着用HCl(30mL，1M)+30mL盐水洗涤乙醇层，其后用NaHCO3(10mL)+盐水(60mL)以及盐水(50mL×2)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩得到粘稠的无色油。
接着将该油溶于DCM(50mL)中，加入HCl的二噁烷溶液(4M，50mL)并在室温下将反应混合物搅拌30分钟。减压除去挥发物，得到白色干燥固体，用7:3的EtOAc-己烷清洗，得到NH2 13CH2 13CH2N(Fmoc)Me34的固体。
(v)合成部分编码的报告物/连接物部分(35)
参考图11，向34(3份)和N，N′-二异丙基乙胺(DIEA，6份)的DCM溶液中加入固体三苯甲基氯树脂(Advance ChemTech，P/N SC5028，1份)并混合30分钟。接着过滤树脂并用DMF清洗。接着用20％哌啶的N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理该树脂5分钟，并用DMF清洗。
向N-甲基哌嗪乙酸(Chess GmbH，P/N 2022，3份)和O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯HATU(3份)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液中加入DIEA(9份)。将其混合1分钟然后加入到树脂中。偶联30分钟后，用NMP清洗树脂，其后用乙腈清洗。
使用DCM中的15％TFA从树脂上切下产物(35)，得到TFA盐的化合物。
应该理解，编码的N-甲基哌嗪乙酸(编码的N-甲基哌嗪乙酸的示例性合成可参阅如美国公开专利申请US 2005-0148774 A1和US2005-01448773 A1)和非编码的NH2CH2CH2N(Fmoc)Me 34′(图12)可在合成反应中被取代，由此生成相应形式的化合物35(在图12中标为35′)，其中该报告物包含同位素富集的位点(参阅如图12所示的替代性合成)。通过仔细选择起始材料，可以使用所示方法制备基本上所有预期的化合物35的编码形式。
在一些实施方案中，所述编码的N-甲基哌嗪乙酸部分可选自由下式表示的化合物36或37，
其中*表示用13C替代12C。
实施例3：标记试剂的替代性建议合成途径：
参考图13和14，展示了标记试剂的替代性合成途径，其中将非编码可检测标记与标记试剂其余部分可切割地连接的连接物与上文实施例1的描述相比是倒置的。参考图13a，将荧光染料40(应该理解，可选择产生本文所述式II化合物的荧光染料)与化合物41在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下反应，生成化合物42。接着通过用三氟乙酸(TFA)处理来除去化合物42中的叔丁基羰基(t-boc或Boc)，生成以其TFA盐形式存在的化合物43。参考图13a，同图14中使用的化合物43’一样，化合物43还以简略方式显示。
参考图13b，将化合物44(可根据Fadeev，Evgeny A.；Luo，Minkui；Groves，John T.Synthesis and structural modeling of the amphiphilicsiderophore rhizobactin-1021 and its analogs.Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(2005)，15(16)，3771-3774来制备)与化合物35(应该理解，根据所期望的试剂，可以使用化合物35的多种编码或非编码的形式)在非亲核有机碱(例如三乙胺(Et3N)或N，N′-二异丙基乙胺(DIEA))存在下反应，生成化合物45。将化合物45与苄基溴(BnBr)在无机碱(碳酸铯(CsCO3))存在下反应，形成化合物46。接着通过用TFA处理来除去化合物46的t-boc基团，生成化合物47。接着将化合物47与HATU在非亲核有机碱(例如DIEA)存在下反应，接着与化合物43′反应生成化合物48。接着用氢(H2)和钯(Pd)催化剂处理化合物48，从而将该苄基酯转化成羧酸基，再将所述羧酸基与N-羟基琥珀酰亚胺-三氟乙酸(NHS-TFA，化合物50)反应，形成标记试剂49的NHS酯。
实施例4：非编码可检测标记的建议合成途径：
作为非编码可检测标记的荧光染料可以是可用的染料和/或市售染料的修饰形式。例如，参考图14，具有通式III的本文所述化合物包含TAMRA部分，其中TAMRA是来自多种来源的市售染料。
为了制备包含与TAMRA相同的质量和电荷的荧光染料，图14也展示了对于通式II的化合物所使用染料的建议合成途径。该建议合成遵循熟知的合成途径，其中用酚类化合物的N-甲基衍生物60取代其N-乙基形式，生成以其二TFA盐形式存在的预期染料65。
参考图14，可通过在高温下用聚磷酸长时间处理化合物60与化合物61的混合物来制备染料65。荧光染料生产领域的技术人员会了解如何进行这种混合。该反应生成化合物62和63，其中分离化合物63并转化成盐形式64。接着可用三氟乙酸/三乙胺处理化合物64，生成双三氟乙酸酯65。
尽管结合多个实施方案描述了本发明，但本发明并不旨在受限于这些实施方案。相反，本领域技术人员会理解，本发明涵盖多种替代方案、改变和等同方案。

Claims (52)

1.由式I表示的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00021
其中：
i)RG为包含亲核体或亲电体的反应基团，其中所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物；
ii)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子；
iii)DL是非编码的可检测标记；
iv)LK是连接物部分，其可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起；
v)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vi)Y是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vii)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；和
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；
其中所述化合物任选地通过可切割连接物与固相支持物连接。
2.权利要求1的化合物，由式II表示：
Figure A200780032436C00031
其中RG是所述反应基团。
3.权利要求1的化合物，由式III表示：
Figure A200780032436C00032
其中RG是所述反应基团。
4.权利要求1的化合物，由式Iss表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00033
其中：
i)RG为包含亲核体或亲电体的反应基团，其中所述反应基团能与样品中一种或多种反应性分析物反应，从而形成一种或多种被标记分析物；
ii)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子；
iii)DL是非编码的可检测标记；
iv)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起；
v)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vi)Y是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vii)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；和
xi)SS是通过可切割连接物与所述标记试剂的所述报告物部分共价连接的固相支持物。
5.权利要求4的化合物，由式IIss表示：
Figure A200780032436C00041
其中RG是所述反应基团，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割连接物。
6.权利要求4的化合物，由式IIIss表示：
其中RG是所述反应基团，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割连接物。
7.权利要求1至6中任一项的化合物，其中RG为羧酸、磺酸、羧酰卤化物、磺酰基卤化物、活性酯、混合酸酐、异氰酸酯或异硫氰酸酯基团。
8.权利要求1至6中任一项的化合物，其中RG为马来酰亚胺基、烷基卤化物基、α-卤代酰基、α-卤代硫酮基或α-卤代亚胺基。
9.权利要求1至6中任一项的化合物，其中RG为三苯甲基卤化物或甲硅烷基卤化物基团。
10.权利要求1至6中任一项的化合物，其中RG为胺基、羟基或硫醇基。
11.一种方法，其包括以下步骤：
a)使各包含一种或多种反应性分析物的两个或更多个样品与一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂中的不同标记试剂反应，从而形成各包含一种或多种被标记分析物的两个或更多个差异性标记样品，其中该组中的不同标记试剂由式I表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00052
其中：
i)RG为包含亲核体或亲电体的反应基团，其中所述反应基团能与样品中所述一种或多种反应性分析物反应，从而在每个样品中形成所述一种或多种被标记分析物；
ii)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言是不同的；
iii)DL是非编码的可检测标记，其中该组中的每种标记试剂包含不同的可独立检测的非编码可检测标记，其中每种所述非编码可检测标记与该组中标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷；
iv)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起，其中该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿该组中所述不同标记试剂的报告物部分之间的粗略质量差异，使得所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的；
v)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vi)Y是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；
vii)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；和
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；以及
b)将所述两种或更多种差异性标记样品或其部分以及任选地一种或多种校正标准品混合在一起，以产生样品混合物。
12.权利要求11的方法，其还包括：
c)电泳分离该样品混合物或其级分。
13.权利要求12的方法，其中所述电泳分离是1D电泳分离、2D电泳分离和/或毛细管电泳分离。
14.权利要求12的方法，其还包括：
d)从电泳分离物中收集共迁移的差异性标记分析物的一种或多种子样品；和
e)当m为0、n为1、W是可通过施加光、热或化学试剂而切割的共价键或连接基团时，任选地在适当条件下处理所述一种或多种子样品，由此从所述一种或多种子样品的差异性标记分析物中切下所述非编码可检测标记。
15.权利要求14的方法，其还包括：
f)对所述子样品之一或其级分进行第一质谱分析；
g)对从第一质谱分析得到的具有选定质荷比的差异性标记分析物的离子施加解离能，由此形成至少一些所述选定离子的特征离子和子片段离子；和
h)对所述选定离子、所述特征离子和/或所述子片段离子或其级分进行第二质量分析。
16.权利要求15的方法，其还包括：
i)测定第二质量分析中每种特征离子的粗略质量和相对量以及一些或全部所述子片段离子的粗略质量和/或绝对质量。
17.权利要求16的方法，其还包括：
j)通过分析所述子片段离子来确定与所选质荷比相关的被标记分析物。
18.权利要求17的方法，其还包括：
k)在不同的选定质荷比下对所述差异性标记分析物的所选离子重复步骤(g)到(i)或(g)到(j)一次或多次。
19.权利要求18的方法，其还包括：
I)重复步骤(f)到(i)、(f)到(j)或(f)到(k)一次或多次，每次使用不同的子样品。
20.权利要求17-19中任一项的方法，其还包括
重复步骤(d)到(i)一次或多次。
21.权利要求11至20中任一项的方法，其中该组中每种不同标记试剂是与支持物结合的，并通过可切割连接物与所述支持物连接，使得每种不同样品与带有该组中不同标记试剂的支持物反应，其中该方法还包括，在进行步骤(a)之后和进行步骤(b)之前：
i)任选地清洗每种支持物，以除去每种样品中不与支持物上所结合标记试剂的反应基团反应的组分；
ii)切割所述可切割连接物，以从每种支持物上释放被标记分析物，每种差异性标记样品包含一种或多种被标记分析物，其中与特定样品相关的被标记分析物可通过与其相连的具有独特质量的报告物部分来鉴定和/或定量；和
iii)任选地收集每个样品的被标记分析物，之后根据步骤(b)将其混合。
22.权利要求21的方法，其中该组中每种与支持物结合的不同的同位素编码标记试剂由式Iss表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00081
其中：
i)RG为包含亲核体或亲电体的反应基团，其中所述反应基团能与样品中所述一种或多种反应性分析物反应，从而形成所述一种或多种被标记分析物；
ii)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言是不同的；
iii)DL是非编码的可检测标记，其中该组中的每种标记试剂包含不同的可独立检测的非编码可检测标记，其中每种非编码可检测标记与该组中标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷；
iv)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述反应基团与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起，其中该组中每种不同试剂的连接物部分的质量补偿该组中所述不同标记试剂的报告物部分之间的粗略质量差异，使得所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的；
v)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vi)Y是连接所述反应基团与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；
vii)W是连接非编码可检测标记与连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；和
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；以及
ix)SS是通过可切割连接物与所述标记试剂的所述报告物部分共价连接的固相支持物。
23.权利要求22的方法，其中所述标记试剂之一由式IIss表示：
Figure A200780032436C00101
其中RG是所述反应基团，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割连接物。
24.权利要求22的方法，其中所述标记试剂之一由式IIIss表示：
Figure A200780032436C00102
其中RG是所述反应基团，SS是所述固相支持物，CL是所述可切割连接物。
25.权利要求11至24中任一项的方法，其还包括：
用至少一种酶消化每种样品和/或样品混合物，以部分或完全降解该样品和/或样品混合物中的组分。
26.权利要求17至20中任一项的方法，其中测定第二质量分析中具有独特质量的每种特征离子相对于其它特征离子的相对量。
27.权利要求26的方法，其中将与所测定分析物相关的具有独特质量的每种特征离子的相对量与混合形成该样品混合物的每种差异性标记样品的量相关联，从而确定所测定分析物在所述两种或更多种差异性标记样品每种中的相对量。
28.权利要求27的方法，其中：
i)所述样品混合物包含已知量的用于所测定分析物的校正标准品，其中所述校正标准品包含用于所测定分析物的具有独特质量的报告物部分，并参考与该校正标准品相关的独特特征离子的量来测定与每种独特报告物部分对应的每种独特特征离子的绝对量；
ii)参考具有独特质量的每种不同特征离子的绝对量来测定所述样品混合物的每种不同样品中所测定分析物的绝对量。
29.权利要求27的方法，其中：
i)参考校正曲线来测定与每种独特报告物部分对应的每种独特特征离子的绝对量；
ii)参考具有独特质量的每种不同特征离子的绝对量来测定所述样品混合物的每种不同样品中所测定分析物的绝对量。
30.权利要求27的方法，其还包括以不同的选定质荷比对被标记分析物的选定离子重复步骤(g)至(j)一次或多次，从而鉴定和/或测定混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种其它所测定分析物的相对量。
31.权利要求28或29的方法，其还包括以不同的选定质荷比对被标记分析物的选定离子重复步骤(g)至(j)一次或多次，从而鉴定和/或测定混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种其它所测定分析物的绝对量。
32.权利要求30的方法，其中所述分析物是肽，并且基于混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种肽的身份和相对量来确定混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种蛋白质的身份和相对量。
33.权利要求31的方法，其中所述分析物是肽，并且基于混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种肽的身份和绝对量来确定混合形成所述样品混合物的所述两种或更多种差异性标记样品每种中一种或多种蛋白质的身份和绝对量。
34.权利要求11至31中任一项的方法，其中所述分析物是肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇、维生素、前列腺素或分子量小于1500道尔顿(Da)的其它小分子。
35.权利要求11至34中任一项的方法，其中至少一种差异性标记样品用式II或式III的同位素编码标记试剂进行标记：
Figure A200780032436C00121
其中RG是所述反应基团。
36.包含至少两种差异性标记分析物的混合物，其中所述混合物通过将至少两种不同样品的标记反应产物混合在一起而形成，其中每种样品使用一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂中的不同标记试剂进行标记，其中该混合物中每种差异性标记分析物由式IA表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00122
其中：
i)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于每种不同样品而言是不同的，这取决于使用该组中的哪种标记试剂来标记该样品；
ii)DL是非编码的可检测标记，其对于该组中的每种不同标记试剂而言是不同的，其中每种不同的非编码可检测标记可独立于该组中其它可检测标记而进行检测，并且其中每种不同的非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷；
iii)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起，其中该组中每种不同标记试剂的连接物部分的质量补偿该组中所述不同标记试剂的报告物部分之间的粗略质量差异，使得所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的；
iv)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
v)Y是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；
vi)W是连接非编码可检测标记与连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；和
vii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1。
37.权利要求36的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是肽和/或蛋白质。
38.权利要求36的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是核酸。
39.权利要求36的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是碳水化合物、氨基酸、脂质、类固醇、维生素和/或前列腺素。
40.权利要求36的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是质量小于1500道尔顿的小分子。
41.权利要求36的混合物，其中所述分析物中的两种或更多种是不同的分析物类型。
42.权利要求36至41中任一项的混合物，其中至少一种被标记分析物由式IIA表示：
Figure A200780032436C00141
43.权利要求36至41中任一项的混合物，其中至少一种被标记分析物由式IIIA表示：
Figure A200780032436C00142
44.包含至少两种差异性标记分析物的混合物，其中所述混合物通过将至少两种不同样品的标记反应产物混合在一起而形成，其中每种样品使用来自一组同位素编码的同分异构和/或同量异位标记试剂的不同标记试剂进行标记，其中该混合物中每种差异性标记分析物由式IssAx表示，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00151
其中：
i)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子，并且其中每种报告物部分及其相应特征离子的粗略质量对于每种不同样品而言是不同的，这取决于使用该组中的哪种标记试剂来标记该样品；
ii)DL是非编码的可检测标记，其对于该组中的每种不同标记试剂而言是不同的，其中每种不同的非编码可检测标记可独立于该组中其它可检测标记而进行检测，并且其中每种不同的非编码可检测标记与该组中其它标记试剂的其它非编码可检测标记具有相同的粗略质量和相同的净电荷；
iii)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起，其中该组中每种不同标记试剂的连接物部分的质量补偿该组中所述不同标记试剂的报告物部分之间的粗略质量差异，使得所述报告物部分与所述连接物部分的合计粗略质量对于该组中的每种标记试剂而言都是相同的；
iv)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中键X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
v)Y是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果Y是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；
vi)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂，条件是如果W是连接基团则其粗略质量对于该组中每种标记试剂而言都是相同的；
vii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；和
viii)Q’是通过从固相支持物上切割所述差异性标记分析物而形成的官能团。
45.权利要求44的混合物，其中至少一种被标记分析物由式IIssAx表示：
其中Q’是通过从固相支持物上切割所述差异性标记分析物而形成的官能团。
46.权利要求44的混合物，其中至少一种被标记分析物由式IIIssAx表示：
Figure A200780032436C00162
其中Q’是通过从固相支持物上切割所述差异性标记分析物而形成的官能团。
47.包含至少一种权利要求1至10中任一项所述化合物的试剂盒。
48.权利要求47的试剂盒，其还包含至少一种其它试剂，所述其它试剂被选择用于实施对两种或更多种不同样品中的一种或多种分析物的定量测定。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述至少一种其它试剂是经标记的校正标准品。
50.由式IA表示的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
Figure A200780032436C00171
其中：
i)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子；
ii)DL是非编码的可检测标记；
iii)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起；
iv)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
v)Y是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vii)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；和
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；
其中所述化合物任选地与支持物相结合。
51.由式IssA表示的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式：
其中：
i)RP是报告物部分，其包含固定电荷或者可在质谱仪中离子化，其中所述报告物部分能在质谱仪中在键X断裂后产生特征离子；
ii)DL是非编码的可检测标记；
iii)LK是连接物部分，它可以是线性或分支的，其中LK将所述分析物与所述报告物部分和所述非编码可检测标记二者连接在一起；
iv)X是将所述报告物部分与所述连接物部分或所述非编码可检测标记连接在一起的共价键，其中X可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
v)Y是连接所述分析物与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中Y任选地可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；
vii)W是连接所述非编码可检测标记与所述连接物部分的共价键或连接基团，其中W任选地可通过施加光、热和/或化学试剂而切割和/或可通过在质谱仪中施加解离能而断裂；和
viii)m和n各为0或1，条件是m+n＝1；
ix)SS是通过可切割连接物与所述标记试剂的所述报告物部分共价连接的固相支持物。
52.权利要求1至10、50或51中任一项的化合物，其中所述化合物是被同位素编码的。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463728A (zh) * 2015-12-11 2018-08-28 电泳有限公司 同量异位质量标记
CN110383071A (zh) * 2017-01-31 2019-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 用于质谱的试剂
CN110573478A (zh) * 2017-04-20 2019-12-13 梅塔博隆股份有限公司 检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011088423A2 (en) * 2010-01-15 2011-07-21 California Institute Of Technology Isobaric tags for analyte detection and quantification
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
EP2588144B1 (en) 2010-07-02 2018-05-09 Ventana Medical Systems, Inc. Detecting targets using mass tags and mass spectrometry
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2909337B1 (en) 2012-10-17 2019-01-09 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US9366678B2 (en) 2012-10-25 2016-06-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Neutron encoded mass tags for analyte quantification
GB201308765D0 (en) * 2013-05-15 2013-06-26 Electrophoretics Ltd Mass Tag Reagents
LT3013983T (lt) 2013-06-25 2023-05-10 Prognosys Biosciences, Inc. Erdviniai koduoti biologiniai tyrimai, naudojant mikrofluidinį įrenginį
EP4321627A3 (en) 2015-04-10 2024-04-17 10x Genomics Sweden AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2017093898A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Isomeric reagent tags for differential mobility spectrometry
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20220064630A1 (en) 2018-12-10 2022-03-03 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays using deconvolution
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
ES2982420T3 (es) 2019-12-23 2024-10-16 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial mediante el uso de la ligazón con plantilla de ARN
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
CN115916999A (zh) 2020-04-22 2023-04-04 10X基因组学有限公司 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法
EP4153775B1 (en) 2020-05-22 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4421186A3 (en) 2020-06-08 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4446430A2 (en) 2020-06-10 2024-10-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4421491A2 (en) 2021-02-19 2024-08-28 10X Genomics, Inc. Method of using a modular assay support device
WO2022198068A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5252296A (en) 1990-05-15 1993-10-12 Chiron Corporation Method and apparatus for biopolymer synthesis
US6027890A (en) 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
DE69727466T2 (de) 1996-04-08 2004-12-16 Glaxo Group Ltd., Greenford Auf masse basierte kodierung und qualitative analyse von kombinatorischen bibliotheken
JP3884087B2 (ja) 1997-01-15 2007-02-21 イクスツィリオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 質量標識結合ハイブリダイゼーションプローブ
GB9823646D0 (en) 1997-12-19 1998-12-23 Brax Genomics Ltd Compounds for mass spectrometry
US6270976B1 (en) 1998-09-15 2001-08-07 Brax Group Limited Characterizing nucleic acid by mass spectrometry
US7473535B2 (en) 2002-08-20 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Chemical reagents and methods for detection and quantification of proteins in complex mixtures
AU2004209401A1 (en) 2003-01-30 2004-08-19 Applied Biosystems, Llc. Methods, mixtures, kits and compositions pertaining to analyte determination
US7307169B2 (en) 2004-01-05 2007-12-11 Applera Corporation Isotopically enriched N-substituted piperazines and methods for the preparation thereof
EP1828180A4 (en) * 2004-12-08 2010-09-15 Glaxosmithkline Llc 1H-pyrrolo [2,3-BETA] PYRIDINE

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463728A (zh) * 2015-12-11 2018-08-28 电泳有限公司 同量异位质量标记
CN110383071A (zh) * 2017-01-31 2019-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 用于质谱的试剂
CN110383071B (zh) * 2017-01-31 2023-10-03 豪夫迈·罗氏有限公司 用于质谱的试剂
CN110573478A (zh) * 2017-04-20 2019-12-13 梅塔博隆股份有限公司 检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法
CN110573478B (zh) * 2017-04-20 2023-02-28 梅塔博隆股份有限公司 检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法

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JP2009543067A (ja) 2009-12-03
US8853133B2 (en) 2014-10-07

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