CN108463728A - 同量异位质量标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记包括下式：X‑L‑M‑Re，其中X是具有确切质量的报道部分，L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，M是质量改性剂，并且Re是a)用于将质量标记附接至分析物的反应性官能团或者b)分析物，其中所述组中的每个质量标记具有整数质量，其中所述组中的每个质量标记具有相同的整数质量，并且其中所述组包括质量标记的两个或更多个亚组，每个亚组包括一个、两个或更多个质量标记，并且其中当所述亚组包含两个或更多个质量标记时，所述亚组中的每个质量标记的报道部分X的确切质量与同一亚组和所有其他亚组中质量标记的报道部分X的确切质量不同，并且其中每个质量标记通过质谱可区分。

Description

同量异位质量标记
发明领域
本发明涉及用于标记肽的有用的反应性标记和涉及使用这些反应性标记的方法，以鉴定和定量肽，特别是来源于复杂蛋白质混合物的肽。这些反应性标记对于通过高分辨率和高质量准确度的质量分析仪例如轨道离子阱(orbitrap)、飞行时间和离子回旋共振质量分析仪来分析肽特别有用。
发明背景
生物系统的研究，特别是对人类疾病的理解，取决于检测由疾病引起或应答于疾病的生物系统变化的能力。这些变化提供了诊断手段，并为治疗性化合物如疫苗和药物的靶标提供了见解。需要定量测量多种生物分子以了解疾病过程，包括核酸、蛋白质、甾体、糖和脂质。在这种情况下，使用质谱仪定量检测这些生物分子的能力已经在其研究和应用于人类以及兽医疾病方面提供了相当大的进步。环境分析和监测以及食品和饮料制造业也取得了同样的进展。特别是使用稳定同位素来提供合成的定量参考已经在同位素稀释质谱中用于监测所有类别的生物分子。然而，这些方法传统上需要可用的合成标准，但这并不总是可行的。
最近，一系列带有重同位素替换的化学质量标签已经被开发出来，以进一步改进通过质谱对生物分子的定量分析。取决于标签设计，标签组的成员是具有相同化学结构但不同绝对质量，或同量异位和同位异构的同位素，具有相同的结构和绝对质量。同位素标签通常用于MS模式下的定量分析，而同量异位标签必须在MS/MS模式下进行破碎以释放独特质量的报告碎片。
同位素质量标签的早期例子是同位素编码亲和标签(ICAT)(Gygi,S.P.等,(1999)Nat Biotechnol,17,994-999)。ICAT试剂是一对质量标签，在一个(重)标签中带有重同位素的差异掺入，而在另一个(轻)标签中没有取代。两个样品用重或轻标签标记，然后混合，然后通过LC-MS分析。两种样品中存在的肽将产生质量与重同位素原子取代数量成比例不同的一对前体离子。
ICAT方法还说明了“取样”方法，这种方法可以协调处理少量多肽的需要，以减少生成的质谱的复杂性，同时保留关于原始样品的足够信息以确定其组分。在ICAT方法中使用的“同位素编码的亲和标签”包括一对生物素接头同位素，其对巯基具有反应性，用于捕获包括半胱氨酸的肽。典型地，蛋白质组中90-95％的蛋白质将具有至少一个含半胱氨酸的肽，并且通常含半胱氨酸的肽代表总共约1/10的肽，因此含半胱氨酸肽的分析大大降低了样品的复杂性，而不会丢失关于样品的重要信息。因此，在ICAT方法中，来自一个来源的蛋白质样品与“轻”同位素生物素接头反应，而来自第二来源的蛋白质样品与“重”同位素生物素接头反应，其通常为比轻同位素重4至8道尔顿。然后合并两个样品并用内肽酶进行裂解。然后可以将生物素化的含半胱氨酸的肽在经抗生物素蛋白化的珠子上进行分离，用于随后的质谱分析。两个样品可以进行定量比较：相应的肽对作为相互的标准，可以对其比值进行定量。ICAT取样方法产生的肽混合物仍然准确代表了来源样品，虽然不如MudPIT复杂，但仍然分离出大量的肽，并且它们通过LC-MS/MS分析产生复杂的谱。用2个ICAT标签，与无标记分析相比，质谱中的肽离子数增加了一倍。
同位素标记的其他实例包括提供多达四种不同试剂的ICPL试剂，并且采用ICPL，质谱中肽离子的数量是无标记分析的四倍。出于这个原因，用简单的重同位素标签设计开发非常高水平的多重检测是不可行的。
虽然同位素标签允许在蛋白质组学研究中进行定量分析，并有助于实验重复性，但这是以增加质谱复杂度为代价来实现的。为了克服这个限制，并且利用串联质谱的更大特异性，开发了同量异位质量标签。自从2000年它们被引入(WO01/68664)以来，通过在混合和同时分析多个样品之前通过在蛋白质和肽中通用标记胺和其他反应性官能团，同量异位质量标签已经提供了改进的蛋白质组表达谱分析方法。由于标签是同量异位的，具有相同的质量，因此它们确实不会增加质谱的复杂性，因为相同肽的所有前体将出现在色谱分离中完全相同的点并具有相同的聚集体质量。只有当分子在进行串联质谱法之前被破碎时才释放独特的质量报道分子，从而可以确定每个原始样品中存在的肽的相对或绝对量。
WO01/68664提出了同量异位质量标签的基本原理，并提供了合适标签的具体实例，其中分子内的不同特定原子分别被包括13C和15N的重同位素形式取代。WO01/68664进一步描述了使用偏移质量来制作多个同量异位组以增加可用的总体多重检测速率，而不会过度增加各个标签的大小。
WO2007/012849描述了另外一组同量异位质量标签，其包括3-[2-(2,6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酰氨基]-丙酸-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)-酯(DMPip-βAla-OSu)。
最近，通过诸如Orbitrap(Hu,Q.等,(2005)J Mass Spectrom,40,430-443&Makarov,A.(2000)Anal Chem,72,1156-1162)、傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪(Marshall,A.G.等,(1998)Mass Spectrom Rev,17,1-35)和高分辨率飞行时间(TOF)质谱仪(Andrews,G.L.et al.,(2011)Anal Chem,83,5442-5446)的高质量分辨质谱仪显著改善质量准确度和质量分辨率，已经有可能解析离子质荷比之间的毫道尔顿(millidalton)差异。已经利用该高分辨率能力来增加同量异位串联质谱标签的多重检测,其使用13C的重核子取代报道区的15N，这导致在通过MS/MS分析时各自报道碎片之间6.32毫道尔顿差异(McAlister,G.C.等,(2012)Anal Chem,84,7469-7478&Werner,T.等,(2012)Anal Chem,84,7188-7194)。类似地，已经表明，用包括毫道尔顿质量差异的赖氨酸同位素进行的代谢标记可以通过高分辨率质谱法解析，从而能够在酵母中对样品进行多重检测和相对定量(Hebert,A.S.et al.,(2013)Nat Methods,10,332-334)。
尽管之前公开的同量异位质量标签具有显著的优点，但是到目前为止，市售试剂中的多重检测率已被限制为10-plex。此外，包括非常小的质量差异的标签将是有用的，因为标记的离子彼此相关，例如，来自不同样品的相应肽将紧密地聚集在相同的离子包络(envelope)中，具有非常独特和非天然的同位素模式，这些同位素模式将容易识别，并且将不太可能干扰鉴定其他不同的肽。
因此，仍然需要标签组，其中每个标签与其他标签的差异为毫道尔顿质量差异，用于标记多肽多重检测率大大超过10倍的肽和生物分子。
发明内容
在第一个方面,本发明涉及两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记包括下式：
X-L-M-Re
其中：
-X是具有确切质量的报道部分，
-L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，
-M是质量改性剂，并且
-Re是a)用于将质量标记附接至分析物的反应性官能团，或者b)分析物其中所述组中的每个质量标记具有相同的整数质量，其中所述组包括质量标记的两个或更多个亚组，每个亚组包括一个、两个或更多个质量标记，其中当所述亚组包括两个或更多个质量标记时，所述亚组中的每个质量标记的报道部分X的确切质量与同一亚组和所有其他亚组中质量标记的报道部分X的确切质量不同，其中每个质量标记通过质谱可区分，其中每个质量标签具有包括以下通式的报道部分X：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基或正丙基、异丙基、丁基或正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或正戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基中的结构。
在另一个方面,本发明涉及两个或更多个质量标记的组，其中每个标记包括下式：
X-L-M-Re
其中X是具有确切质量的报道部分，L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，M是质量改性剂，并且Re是用于将质量标记附接至分析物上的反应性官能团或者分析物，并且X包括以下通式：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基或正丙基、异丙基、丁基或正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或正戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基中的结构。
在另一个方面，本发明涉及质量标记的阵列，其包括两个或更多个根据本发明的质量标记的组。
在另一个方面，本发明涉及质谱分析方法，所述方法包括通过由质谱鉴定可与分析物相关的质量标记或质量标记的组合来检测该分析物，其中质量标记是来自根据本发明的质量标记的组或阵列的质量标记。
附图说明
图1：根据本发明的取代的哌嗪-2-羧酸质量标记报道子的预测碎片化途径的示意图(描绘的结构是假设的并且仅用于预测预期报道离子的质荷比的目的)。还显示了根据本发明的合适的质量改性剂接头的第一个实例。
图2：根据本发明的取代的哌嗪-2-羧酸质量标记报道子的预测碎片化途径的示意图(描绘的结构是假设的并且仅用于预测预期报道离子的质荷比的目的)。还显示了根据本发明的合适的质量改性剂接头的第二个实例。
图3：根据本发明公开的N’,N’-二甲基哌嗪-2-羧酸报道部分合成方法的示意图。
图4：本发明用于产生环取代的N’,N’-二甲基哌嗪-2-羧酸报道部分的第二个新合成方法的示意图。
图5：将重氮同位素掺杂容易获得的α-氨基酸转化成可用于图4所示合成方法的α-氨基醇的合成路线的示意图。
图6：可用于合成本发明质量标签的市售重同位素掺杂前体的实例。甘氨酸、溴乙酸和烷基胺如甲胺可用于合成N-烷基哌嗪。图6a显示了丝氨酸、乙醇胺、甲醛和苏氨酸的重同位素的实例，而图6b显示了丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的重同位素的实例。
图7：由两个连续的β-丙氨酸残基组成的质量改性剂接头与本发明的报道结构的合成和偶联的示意图。
图8：由1,4-二氨基丁烷组成的质量改性剂接头与本发明的报道结构的合成和偶联的示意图。
发明详述
质量标记的组
本发明提供了用于标记肽和其他生物分子的多重检测率大大超过10-Plex的同位素体(isotopomeric)反应性标签的组。同位素体反应性标签的共同可选择性同位素体阵列具有一系列毫道尔顿质量差异，这支持甚至更高水平的多重检测。
本发明还提供使用同位素体反应性标签的共同可选择性同位素体阵列的方法，所述阵列使得能够进行标记的肽、蛋白质或其他生物分子的新型分析，特别是用于发现生物样品的组之间的显著生物差异。
在第一个方面,本发明涉及两个或更多个质量标记的组(本文下文称为“本发明的 第一质量标记的组”)，其中每个质量标记包括下式：
X-L-M-Re
其中：
-X是具有确切质量的报道部分，
-L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，
-M是质量改性剂，并且
-Re是a)用于将质量标记附接至分析物的反应性官能团，或者b)分析物其中所述组中的每个质量标记具有相同的整数质量，其中所述组包括质量标记的两个或更多个亚组，每个亚组包括一个、两个或更多个质量标记，其中当所述亚组包括两个或更多个质量标记时，所述亚组中的每个质量标记的报道部分X的确切质量与同一亚组和所有其他亚组中质量标记的报道部分X的确切质量不同，其中每个质量标记通过质谱可区分，其中每个质量标签具有包括以下通式的报道部分X：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基或正丙基、异丙基、丁基或正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或正戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基中的结构。
术语“确切质量”是指质量标记或报道部分的理论质量并且是整个质量标记或报道部分的个体同位素的确切质量之和，例如12C＝12.000000,13C＝13.003355H1＝1.007825,16O＝15.994915。“确切质量”考虑质量缺陷。
术语“整数质量”是包括该分子的每个核的每个同位素的整数质量之和，例如12C＝12,13C＝13,1H＝1,16O＝16。同位素的整数质量是构成同位素核的质子和中子的总和，即12C包括6个质子和6个中子，而13C包括6个质子和7个中子。这通常也称为标称质量，或同位素的原子质量数或核子数。
在文献中，术语“同量异位素”通常是指具有相同整数质量并且对于MS/MS共同可选择性的物质，但是在本发明的上下文中，我们将使用术语“同量异位素”指具有相同精确质量的物质，并且我们将使用术语“假同量异位素”指对于具有相同整数质量但可能具有稍微不同确切质量的物质。
亚组中至少两个质量标签之间的精确质量差异通常小于100毫道尔顿，优选小于50毫道尔顿，最优选小于20毫道尔顿(mDa)。优选地，由于共同的同位素取代，一组中至少两个质量标记之间的精确质量差异为2.5mDa、2.9mDa、6.3mDa、8.3mDa、9.3mDa或10.2mDa。例如，如果第一个标记包括13C同位素，并且在第二个标记中，该13C同位素被12C替换，但14N同位素被15N同位素替换，两个标记之间的精确质量差将是6.3mDa。
在本说明书中，术语标记与术语标签是同义的。
术语“报道部分X”用于指通过质谱分析典型地在裂解之后被独立检测的质量标记的部分，然而，将理解的是，作为陪补离子的附着于分析物的质量标记的其余部分也可以在本发明的方法中检测到。质量改性剂X是其并入质量标记以确保质量标记具有期望的整数质量的部分。每个质量标记的报道部分X可以在一些实施方案中不包括重同位素。
根据本发明的报道部分的组分优选耐受碎片，使得报道部分的碎片化位点可以通过引入可裂解键L来进行控制，所述可裂解键L很容易被碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)或快速原子轰击破坏。在最优选的实施方案中，该键很容易被CID破坏。
本领域技术人员将理解的是，为了实现期望的整数质量，部分X和M中的一个或两个、反应性官能团Re或分析物可以用重同位素改性。典型地，重同位素选自2H、13C、15N或18O。
优选地，亚组中的每个质量标记的报道部分是该亚组中所有其他质量标记的报道部分的同位素体。同位素体是仅其分子的同位素组成不同的化学物质。例如，水有三个与氢有关的同位素体：HOH、HOD和DOD，其中D代表氘(2H)。同位素体与同位素异构体(同位素性异构体)不同，同位素异构体是同位素性异构体，其具有相同的每个同位素的数量，但位置不同。更优选地,两个或更多个质量标记的组包括：包括两个或更多个质量标记的至少一个亚组。
通常，不同数量或类型的重同位素取代提供确切质量的差异。
在一个实施方案中，质量标记是如在WO01/68664中定义的串联质量标签的同位素体。
在优选的实施方案中，质量标记的聚集体分子量是600道尔顿或更低，更优选为500道尔顿或更低，更优选400道尔顿或更低，最优选为300至500道尔顿。
在另一优选的实施方案中，报道部分的分子量是400道尔顿或更低，优选为250道尔顿或更低，更优选100道尔顿或更低，最优选为100至220道尔顿。小尺寸的报道部分是特别有利的，因为它在质谱的沉默区域中产生峰，这使得容易从质谱鉴定报道部分并且还允许灵敏的定量。
术语本文中使用的质谱的沉默区域意在表示由与由标记的肽的碎片化产生的碎片的存在相关的峰引起的低背景“噪音”的质谱区域。因此，术语沉默区域旨在指具有由与待检测的肽相关的峰引起的低“噪音”的质谱的区域。对于肽或蛋白质，质谱的沉默区域小于220、优选小于200道尔顿。
根据本发明的质量标记被设计成与生物分子例如蛋白质反应以形成标记的生物分子例如标记的蛋白质。
在一个实施方案中，R1和R4是甲基。
在另一实施方案中，R2是H。
在另一实施方案中，R3选自由H、甲基、异丙基、异丁基组成的组。
在另一实施方案中，R5是H或甲基。
在优选的实施方案中，报道部分X选自：
在更优选的实施方案中，报道部分X选自：
其中*是同位素质量调节剂部分，并且表示碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
在另一实施方案中，可裂解键L包括但不限于酰胺键、脲键、酯键或醚键。在优选的实施方案中，可裂解键L包括酰胺键。在另一个优选的实施方案中，可裂解键L包括脲键。在另一个优选的实施方案中，可裂解键L包括酯键。在另一个优选的实施方案中，可裂解键L包括醚键。
本文所用的术语“质量改性剂M”是指确保组中每个质量标记具有期望的整数质量的部分。质量改性剂M不一定要通过质谱检测。但是，质量改性剂M可以作为陪补离子的一部分被检测(见下文)。质量改性剂M并不特别限于结构，而仅用于改变质量标记的总体质量。
在另一实施方案中，质量改性剂M选自：
其中：
-每个R10独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链，
-每个R11独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链,
-b是1-10的整数，
-c是0-10的整数，
-d是1-10的整数，并且
-e是1-10的整数。
在优选的实施方案中，质量改性剂M选自：
其中*是同位素质量调节剂部分，并且表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
在另一实施方案中，每个质量标记另外包括至少一个质量系列改性基团，其中质量系列改性基团是报道部分X的一部分和/或质量改性剂M的一部分。
优选地,每个质量标记包括质量系列改性基团，其中至少一个质量系列改性基团是报道部分X或质量改性剂M或二者的一部分。更优选地，质量系列改性基团是报道部分X的一部分。
优选地，质量系列改性基团可选自：
a)重同位素2H、13C、15N或18O；
b)取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，其任选包括一个或多个重同位素取代；
c)或a)和b)的组合。
在一个实施方案中，质量系列改性基团是–CH3、–13CH3、–CHD2、–13CHD2、–13CD3或–CD3。
在另一优选实施方案中，每个质量标记包括至少一个质量系列改性基团,其具有以下结构:
其中：
-每个R12独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链；
-f是1-10的整数；
-g是1-10的整数；并且
-h是1-10的整数。
在根据本发明的质量标记中,Re可以是用于将质量标记附着至分析物的反应性官能团或者是分析物。
优选地，质量标签另外包括反应性官能团以允许质量标记缀合至分析物。用于将质量标记附着至分析物的反应性官能团没有特别限制，并且可以包括任何合适的反应性基团。
反应性官能团可与生物分子上的氨基例如赖氨酸残基的ε-氨基反应。在最简单的实施方案中，这可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯。本文考虑了其它反应性官能团，例如与生物分子中的巯基反应的那些。具体而言，这些反应性官能团被设计为与半胱氨酸残基的巯基反应。能够与半胱氨酸残基反应的本发明的反应性基团的实例是马来酰亚胺基、卤代乙酰基和2-二硫代吡啶基。半胱氨酸的巯基在马来酰亚胺基团的双键上发生亲核加成，并经历与卤代乙酰基或2-二硫代吡啶基的亲核取代。
本文还考虑了能够与生物分子中的羰基或羟基反应的反应性官能团。具体而言，这些反应性官能团被设计为与甾体激素的羰基或羟基反应。能够与生物分子中的羰基或羟基反应的本发明的反应性基团是酰肼或–CONH-(CH2)n-ONH2,其中n是1至6，并且优选n是3，即氨基丙基酰胺。这些基团与羰基反应分别形成腙或O-烷基肟。反应性官能团的实例示于WO2011/036059中，其通过引用并入本文。
优选地，反应性官能团N-羟基琥珀酰亚胺酯、2,3,5,6-四氟苯基酯或磺基二氯苯基酯。
当Re是分析物时，该分析物优选包括氨基酸、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、脂质、磷脂或其组合。
改进多重检测是同量异位质量标记非常受欢迎的特征，因为它允许标记大量样品并分析是一个单独的实验，因此可以缩短分析时间，降低成本，并且可以使更多样品的分析条件标准化。为了根据本发明公开的一般结构在质量标记中仅使用15N和13C取代产生用于等量质量标记的质量标记，有必要考虑可用包括2种不同元素的重同位素质量系列改性基团取代的位置(P位置)和可取代第一个元素的位置(A位置)以及与第一个元素不同的可取代第二个元素的位置(B位置)。A位置的数量应大于或等于B位置的数量。假定存在质量标记的(P+1)个亚组并且第X个质量标记的亚组包括C个质量标记，C应当小于或等于(B+1)。每个报道部分包括(x-1)个位置，其被重同位素取代第一或第二元素，并且其中每个质量标记的亚组中第w个质量标记包括y个第一重同位素元素的原子和z个不同于第一元素的第二重同位素元素的原子，x将具有1至(P+1)的值。P＝(A+B)并且质量标记的总数将是(A+1)乘以(B+1)。
在优选实施方案中，B大于或等于2。
例如其中在报道部分中和质量改性剂中有7个可掺杂碳和2个可掺杂氮原子的质量标记将支持至多24-plex同量异位组即(7+1)乘以(2+1)。以单个道尔顿分辨率，这些报道子将支持10-plaex(P＝7+2得到(9+1)个具有不同整数报道质量的质量标记的亚组。显然，由于报道部分基团可被不同的R基团取代，所以可能存在质量标记的不同异构体，这为不同的碎片化行为提供选择。
下文在优选实施方案1至6中详细描述了根据本发明的最优选的质量标记以及包括重同位素质量系列改性基团的两个或更多个质量标记的组的实例。质量标记由组号、亲本组大小和报道离子质量确定，例如，在实施方案或组1或以下，每个质量标记被命名为TMT-1-21-“报道质量”，其中TMT代表串联质量标签，即用于串联质谱的标签，数字1指的是组号，21指的是该组中的质量标记的数量，并且报道质量是碰撞诱导解离条件下预期报道离子的质荷比。不同的报道离子可以通过电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)获得。
实施方案1：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
实例组1中标签的预期的碎片化示于图1中。报道结构的合成显示在图3中，图7显示了双β-丙氨酸接头的添加。本发明的标签的合成将在本文后面更详细地讨论。
在根据本发明的同量异位质量标签组的特定优选实施方案中，质量调节剂部分*为13C或15N，并且该组包括n＝21个具有以下结构的质量标记：
TMT-1-21-113.10732(亚组1)
TMT-1-21-114.10436(亚组2)
TMT-1-21-114.11068(亚组2)
TMT-1-21-115.10139(亚组3)
TMT-1-21-115.10771(亚组3)
TMT-1-21-115.11403(亚组3)
TMT-1-21-116.10475(亚组4)
TMT-1-21-116.11107(亚组4)
TMT-1-21-116.11739(亚组4)
TMT-1-21-117.1081(亚组5)
TMT-1-21-117.11442(亚组5)
TMT-1-21-117.12074(亚组5)
TMT-1-21-118.11146(亚组6)
TMT-1-21-118.11778(亚组6)
TMT-1-21-118.1241(亚组6)
TMT-1-21-119.11481(亚组7)
TMT-1-21-119.12113(亚组7)
TMT-1-21-119.12745(亚组7)
TMT-1-21-120.11817(亚组8)
TMT-1-21-120.12449(亚组8)
TMT-1-21-121.12152(亚组9)
采用上述优选实施方案中提出的术语，m(如上所定义)是21并且n＝8。由于可被13C取代的碳原子多于可被15N取代的氮原子，因此存在a＝6个可取代的碳原子核和b＝2个可取代的氮原子核。因此，第一个重同位素质量调节剂有6个原子，它是13C，并入每个标签，第二个重同位素质量调节剂有2个原子，它是15N，并且整个质量标签的组是通过在上面结构中用虚线标出的可裂解键的两侧的质量调节剂进行所有可能的组合而产生的。在上面的列表中可以看到，基于报道离子的整数质量存在(n+1)＝9个标签的亚组，即亚组2中的报道离子比亚组1中的报道离子重约1道尔顿。类似的，亚组3中的报道离子比亚组2中的报道离子重约1道尔顿，等等。在每个标签的亚组中，从计算得到的确切质量可以看出，每个标签与下一个标签的差值为6.32毫尔顿。在亚组1中，报道离子中不存在重同位素质量调节剂，并且只有一种方法可以构建该报道子，因此亚组1中只有1个标签。在亚组2中，报道离子重有一个重同位素质量调节剂，将报道子的质量相对于亚组1移动大约1道尔顿。有两种方法引入质量调节剂，通过引入单个15N核或引入单个13C核，因此亚组2中有两个标签，其质量彼此相差6.3毫道尔顿。在亚组3中，报道离子重有两个重同位素质量调节剂，将报道子的质量相对于亚组2移动大约1道尔顿。有三种方法将2个质量调节剂引入亚组3中，通过引入两个15N核或通过引入单个15N核和单个13C核或通过引入两个13C核，因此亚组3中有3个标签。在亚组4中，报道离子重有三个重同位素质量调节剂，将报道子的质量相对于亚组3移动大约1道尔顿。再次只有三种方法将3个质量调节剂引入亚组3中，通过引入两个15N核和单个13C核或通过引入单个15N核和两个13C核或通过引入三个13C核，因此亚组4中有3个标签。一般而言，每个亚组中标签的数量受结构中哪个质量调节剂核出现频率较低的限制。在实例组1中，在报道子中和在质量标准化剂仅存在两个氮原子核，因此如上所定义，b＝2，每个标签的组中标签的数量低于或等于(b+1)，其为最大每个亚组3个标签。在第8个亚组中，有7个重同位素质量改性剂，仅有两个方式来用8个重同位素构建报道离子而保留总体同量异位标签结构，因此在第9个亚组中仅有两个标签，并且类似地，在第9个亚组中，所有8个重同位素质量调节剂存在于报道子中，并且仅有一种方法用所有的质量改性剂构建报道子，因此在亚组9中只有1个标签。
本领域普通技术人员应该清楚，在该标签中包括两个β-丙氨酸残基的质量标准化剂基团可以显著变化。明显的取代包括用其他氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或用更长的氨基酸例如γ-氨基丁酸、氨基戊酸或氨基己氨酸取代。聚乙二醇接头也可能适用于氨基和羧酸末端。所有这些替代物的苄基酯的制备和这些酯的使用将基本上与图7中所示的β-丙氨酸相同。
通过提供多个组，每个组携带独特的附加质量，能够克服诸如上述实施方案组1的单个同量异位质量标签组的多重检测率的限制。附加质量由根据本发明第二方面的质量系列改性基团提供。将质量系列改性剂引入质量标准化接头的概念描述于US 7,294,456中，其并入本文，和描述于WO2011036059中，其并入本文。在WO2011036059中，发明人发现有可能通过将附加的β-丙氨酸部分添加到市售可得的6-plex串联质量标签二甲基哌嗪-β-丙氨酸标签结构的接头区域来开发同量异位质量标签组的阵列。这种一元化方法提供了一种快速且便宜的方法，将多重检测率从6个增加到12个、18个、24个或更多个样本。本发明的同量异位质量标签组也可以通过将附加接头引入到质量标准化剂中进行改性，如先前所公开的。
例如，实施方案组1可以如下所示通过将进一步未掺杂的GABA接头引入实施方案组1的每个标签中来进行改性，以得到不同的21个标签的组，其与实施方案组1的标签通过GABA接头的质量区分开。
显然，可以通过向实施方案组1中的每个标签添加未掺杂的β-丙氨酸接头来创建进一步的21个标签组，如下所示：
此外，可以通过向实施方式组1中的每个标签添加掺杂的β-丙氨酸接头来创建进一步的21个标签组，其中附加的β-丙氨酸接头包括三个13C核和15N核的固定取代，如下所示：
本领域技术人员将理解的是，向本专利中公开的标签结构的质量标准化接头引入附加质量的具体手段不是特别限制的，并且替代方式被认为是在本发明的范围内。
本发明公开了将质量系列改性剂引入本发明标签中的另一种方法。本发明人已经发现，报道基团的质量连续改性是非常有利的，如将在以下实施方案组2至4中讨论的那样：
实施方案2：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
在上述结构中,被取代进入哌嗪环的1’N-甲基具有两个氘原子的固定报道质量系列改性剂取代。该实例中的该固定取代意味着实例组2的报道离子具有相对于实施方案组1的报道离子的最小质量偏移，因此实施方案组2中最重的报道子将比实施方案组1中最重的报道子重约5.9毫道尔顿。实施方案组3中的氘取代还意味着实施方案组2中的所有报道子将具有与实施方案组1中的每个报道子不同的质量。
报道结构的合成显示在图3中，图7显示了双β-丙氨酸接头的添加。本发明的标签的合成将在本文的实施例中更详细地讨论。
包括质量系列改性基团2H(即D)13C或15N的n＝7质量标记的组的实例显示如下：
TMT-2-7-115.11988(亚组3)
TMT-2-7-1-116.12323(亚组4)
TMT-2-7-1-117.12659(亚组5)
TMT-2-7-1-118.12994(亚组6)
TMT-2-7-119.1333(亚组7)
TMT-2-7-120.13665(亚组8)
TMT-2-7-121.14001(亚组9)
对于本领域技术人员来说显而易见的是，实施方案组2中的标签是具有与实施方案组1中的标签(实施方案组1中的标签1的亲本标签质量是：405.21033道尔顿)具有大致同量异位的实施方案组2中的标签(实施方案组2中的标签1的亲本标签质量是：405.21618道尔顿)的实施方案组1中的标签的所有同位素。这意味着当选择这些肽用于在质谱仪中进行测序时，来自实施方案组2的标签标记的肽可与用来自实施方案组1的标签标记的肽共同可选择。更重要的是，实施方案组1中报道部分X均不同于实施方案组2中报道部分X。这意味着实施方案组1能够被用于与实施方案组2一起来标记至多28个样品用于多重检测。用实施方案组2的标签标记的肽将大部分与用实施方案组1的标签标记的肽共同洗脱，尽管由于在实施方案组2的标签中存在氘而具有小的迁移率漂移的可能性。因为这些标签是彼此的同位素并且将大部分共同洗脱，并且这些标签是共同可选择性的，因此，用实施方案组2标记的肽将与实施方案组1的肽同时分析，标签的行为就好像它们是单个假同量异位标签的组。这些两个标签的组包括质量系列改性报道离子，其均给出不同的报道离子，使得当用实施方案组1和2的标签标记的肽能够仍然被分配至它们正确的肽是因为这些报道子均为不同的。注意，组1的报道子和组2的报道子之间的最小质量差异几乎为5.9毫道尔顿，但Orbitrap仪器和傅立叶变换离子回旋共振仪器已经可以提供足够的质量分辨率，以便强有力地区分实施方案组1和2所示的所有标签的报道离子。
本领域技术人员将立即认识到，尽管在上面示出的示例中在特定位置中示出了2H、13C和15N的固定替换，但是这是为了解释的目的而方便进行的，并且在实施方案组2中这些固定替换如果在其他地方定位它们更方便或成本有效，可以位于报道离子内的任何合适位置。
实施方案3：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
在上述结构中,被取代进入哌嗪环的两个1’N-甲基具有2个氘原子的固定报道质量系列改性剂取代。该实方案中的这些固定取代意味着实施方案组3的报道离子具有相对于实施方案组2的报道离子的最小质量偏移，因此实施方案组3中最重的报道子将比实施方案组2中最重的报道子重约5.9毫道尔顿。实施方案组3中的氘取代还意味着实施方案组3中的所有报道子将具有与实施方案组2中的每个报道子不同的质量。
报道结构的合成显示在图3中，图7显示了双β-丙氨酸接头的添加。本发明的标签的合成将在本文的实验部分中更详细地讨论。
包括质量系列改性基团13C或15N的n＝5质量标记的组的实例显示如下：
TMT-3-5-1-117.13243(亚组5)
TMT-3-5-118.13579(亚组6)
TMT-3-5-119.13914(亚组7)
TMT-3-5-120.13618(亚组8)
TMT-3-5-121.14585(亚组9)
如实施方案组2，实施方案组3中的标签也全都是实施方案组2中的标签在实施方案组1中的标签的同位素(实施方案组1中的标签1的亲本标签质量是：405.21033道尔顿)具有大致同量异位的实施方案组2中的标签(实施方案组3中的标签1的亲本标签质量是：405.22834道尔顿)的实施方案组1中的标签的所有同位素。这意味着实施方案组1能够被用于与实施方案组2和3一起来标记至多33个样品用于多重检测。再一次，组2的报道子和组3的报道子之间的最小质量差异几乎为5.9毫道尔顿，但Orbitrap仪器和傅立叶变换离子回旋共振仪器已经可以提供足够的质量分辨率，以便强有力地区分实施方案组1、2和3所示的所有标签的报道离子。
实施方案4：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
注意在上述结构中,被取代进入哌嗪环的两个1’N-甲基具有3个氘原子的固定报道质量系列改性剂。该实方案中的这些固定取代意味着实施方案组4的报道离子具有相对于实施方案组3的报道离子的最小质量偏移，因此实施方案组4中最重的报道子将比实施方案组3中最重的报道子重约5.9毫道尔顿。实施方案组4中的氘取代还意味着实施方案组4中的所有报道子将具有与实施方案组4中的每个报道子不同的质量。
包括质量系列改性基团13C或15N的n＝3质量标记的组的实例显示如下：
TMT-4-3-119.14499(亚组7)
TMT-4-3-120.14834(亚组8)
TMT-4-3-121.15169(亚组9)
也可以如下所述用氢、氘、12C或14N的附加固定取代引入替代的重同位素取代：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
实施方案5：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
使用苏氨酸的报道结构的合成显示在图4中，图7显示了双β-丙氨酸接头的添加。本发明的标签的合成将在本文后面更详细地讨论。
包括质量系列改性基团13C或15N的n＝24质量标记的组的实例显示如下：
TMT-5-24-127.12297(亚组1)
TMT-5-24-128.12001(亚组2)
TMT-5-24-128.12633(亚组2)
TMT-5-24-129.11704(亚组3)
TMT-5-24-129.12336(亚组3)
TMT-5-24-129.12968(亚组3)
TMT-5-24-130.1204(亚组4)
TMT-5-24-130.12672(亚组4)
TMT-5-24-130.13304(亚组4)
TMT-5-24-131.12375(亚组5)
TMT-5-24-131.13007(亚组5)
TMT-5-24-131.13639(亚组5)
TMT-5-24-132.12711(亚组6)
TMT-5-24-132.13343(亚组6)
TMT-5-24-132.13975(亚组6)
TMT-5-24-133.13046(亚组7)
TMT-5-24-133.13678(亚组7)
TMT-5-24-133.1431(亚组7)
TMT-5-24-134.13382(亚组8)
TMT-5-24-134.14014(亚组8)
TMT-5-24-134.1523(亚组8)
TMT-5-24-135.13717(亚组9)
TMT-5-24-135.14349(亚组9)
TMT-5-24-136.14053(亚组10)
也可以如下所述用氢、氘、12C或14N的附加固定取代引入替代的重同位素取代：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
实施方案6：
质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
实施方案6的报道部分的合成显示在图4中，图8显示了丁二胺接头的添加。本发明的标签的合成将在本文的实验部分中更详细地讨论。
包括质量系列改性基团13C或15N的n＝27质量标记的组的实例显示如下：
TMT-6-27-141.13862(亚组1)
TMT-6-27-142.13566(亚组2)
TMT-6-27-142.14198(亚组2)
TMT-6-27-143.13269(亚组3)
TMT-6-27-143.13901(亚组3)
TMT-6-27-143.14533(亚组3)
TMT-6-27-144.13605(亚组4)
TMT-6-27-144.14237(亚组4)
TMT-6-27-144.14869(亚组4)
TMT-6-27-145.1394(亚组5)
TMT-6-27-145.14572(亚组5)
TMT-6-27-145.15204(亚组5)
TMT-6-27-146.14276(亚组6)
TMT-6-27-146.14908(亚组6)
TMT-6-27-146.1554(亚组6)
TMT-6-27-147.14611(亚组7)
TMT-6-27-147.15243(亚组7)
TMT-6-27-147.15875(亚组7)
TMT-6-27-148.14947(亚组8)
TMT-6-27-148.15579(亚组8)
TMT-6-27-148.16211(亚组8)
TMT-6-27-149.15282(亚组9)
TMT-6-27-149.15914(亚组9)
TMT-6-27-149.16546(亚组9)
TMT-6-27-150.15618(亚组10)
TMT-6-27-150.1625(亚组10)
TMT-6-27-151.15953(亚组11)
也可以如下所述用氢、氘、12C或14N的附加固定取代引入替代的重同位素取代：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
可以立即理解的是，所示的附加氘化标签组是实施方案组6中标签的所有同位素，并且可以选择所有可能的氘化标签的亚组以给出与实施方案组6中的标签近似同量异位的标签组。这意味着用实施方案组6的标签标记的肽会与用任何相关氘化标签标记的肽共同可选择。
在另一个方面,本发明涉及两个或更多个质量标记的组(本文下文称为“本发明的 第二质量标记的组”)，其中每个标记包括下式：
X-L-M-Re
其中X是具有确切质量的报道部分，L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，M是质量改性剂，并且Re是用于将质量标记附接至分析物的反应性官能团或者分析物，并且X包括以下通式：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基或正丙基、异丙基、丁基或正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或正戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基的结构。
本发明的第一质量标记的组的定义和特定和优选实施方案同样适用于本发明的第二质量标记的组。
先前在本发明的第一和第二质量标记的组的上下文中描述的各个质量标记构成了本发明的另外的方面。
质量标记的阵列
本发明还提供质量标记的阵列，下文称为“本发明的质量标记的阵列”，其包括两个或更多个根据本发明的第一和第二质量标记组的质量标记的组。
在本发明的第一质量标记的组的上下文中所述的定义和特定和优选实施方案同样适用于本发明的质量标记的阵列。
在实施方案中，该阵列中任一组的质量标记中的每一者的整数质量不同于该组中每个其他组的每个质量标记的整数质量。
在优选的实施方案中，组中的每个质量标记包括:
a)质量系列改性基团，其具有与该组中每个其他质量标记相同的整数质量，并且
b)与该阵列中所有其它组的质量标记不同的整数质量。
在特别优选的实施方案中，报道部分X包括质量系列改性基团。
在一个实施方案中，组中的每个质量标记包括相同的质量系列改性基团。
在另一个实施方案中，组中的每个质量标记包括质量系列改性基团，其为：
a)相同的；或
b)该阵列的所有其它质量标记的质量系列改性基团的同位素体。
在优选的实施方案中，组中的每个质量标记包括质量系列改性基团，其为该阵列中所有其他质量标记的质量系列改性基团的同位素体。
质谱分析方法
本发明还提供了一种质谱分析方法，以下称为“本发明的质谱分析方法”，所述方法包括通过质谱鉴定质量标记或质量标记组合来检测分析物，所述质量标记或质量标记组合可与分析物相关，其中质量标记是来自本发明的第一或第二质量标记的组或本发明的质量标记的阵列的质量标记，如本发明的前述方面中所定义。
在一个实施方案中，本发明的质谱分析方法包括：
a)提供多个样品，其中每个样品用质量标记或质量标记的组合差异地标记，其中质量标记是来自本发明的第一或第二质量标记的组或本发明的质量标记的阵列的质量标记；
b)混合多个标记的样品以形成包括标记的分析物的分析混合物；
c)任选在质谱仪中检测标记的分析物；
d)在质谱仪中解离标记的分析物以形成质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片；
e)检测质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片；
f)任选在质谱仪中解离质量标记以释放报道部分，并检测报道部分；
g)任选解离在步骤f)中形成的报道部分以形成碎片，并检测碎片；
h)基于标记的分析物的质谱；和/或质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片的质谱；和/或报道部分或报道部分的碎片的质谱鉴定该分析物
在具体实施方案中，解离优选质谱仪中的碰撞诱导解离。
在另一个具体实施方案中，在步骤d)中通过一氧化碳从接头L中性丢失形成陪补离子。
优选本文所述的方法可以在质谱仪中进行，其中在400的质荷比下大于60,000的分辨率，优选在400的质荷比下大于100,000的分辨率，最优选在400的质荷比下大于250,000的分辨率。
基于i)标记的分析物的质谱；或ii)质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片的质谱；或iii)报道部分或报道部分的碎片的质谱可以鉴定该分析物。当根据ii)进行鉴定时，优选包括完整质量标记的分析物碎片是包括完整质量标记的b系列离子，优选b1离子。可基于报道部分X或报道部分X的碎片的质谱鉴定该分析物。
因此，在一个实施方案中，可基于标记的分析物的质谱鉴定该分析物。
在另一实施方案中，可基于质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片的质谱鉴定该分析物。在优选的实施方案中，包括完整质量标记的分析物碎片是包括完整质量标记的b系列离子，优选b1离子。
在另一个实施方案中，本发明的质谱分析方法包括：
a)提供多个样品，其中每个样品用质量标记或质量标记的组合差异地标记，其中质量标记是来自本发明的第一或第二质量标记的组或本发明的质量标记的阵列的质量标记；
b)混合多个标记的样品以形成包括标记的分析物的分析混合物；
c)在质谱仪中检测标记的分析物；
d)在质谱仪中解离标记的分析物以释放报道部分，并检测包括附着至分析物或分析物碎片的剩下的质量标记的陪补离子；
e)任选一个或多个以下的进一步的步骤：解离在步骤d中形成的陪补离子以形成碎片，并检测碎片；
f)基于标记的分析物的质谱和/或陪补离子和/或其碎片的质谱鉴定该分析物。
在具体实施方案中，解离优选质谱仪中的碰撞诱导解离。
在另一个具体实施方案中，在步骤d)中通过一氧化碳从接头L中性丢失形成陪补离子。
优选本文所述的方法可以在质谱仪中进行，该质谱仪在400的质荷比下具有大于60,000的分辨率，优选在400的质荷比下具有大于100,000的分辨率，最优选在400的质荷比下具有大于250,000的分辨率。
本发明的许多质量标记通过非常小的质量差异而彼此不同，有时仅为1毫道尔顿左右。目前已经证实，目前的Orbitrap仪器可以解析6.3毫道尔顿质量差异的报告离子(Marshall等,1998,在前引用)。然而，对于通过最小质量差异彼此区分的质量标记，可能需要更高的分辨率，并且这通常可以在市售的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪上常规地实现。
飞行时间(TOF)质谱仪是一种质谱仪的另一个例子，根据飞行管的长度，可以从中获得高分辨率、高质量数据。市售可得的Multi-turn(Okumura,D.等,(2005)Eur J MassSpectrom(Chichester,Eng),11,261-266)和Spiral TOF(Shimma,S.等,(2012)PLoS One,7,e37107)几何结构可以达到类似于Orbitraps的质量分辨率。
Orbitrap质谱仪由一个外筒状电极和一个同轴内心轴状电极组成，形成一个具有四对数电势分布的静电场(Hu,Q.等,(2005)J Mass Spectrom,40,430-443&Makarov,A.(2000)Anal Chem,72,1156-1162)。检测来自动态俘获离子的图像电流、数字化并使用傅里叶变换将其转换为频域数据，然后转换为质谱图。离子被注入Orbitrap，在那里它们进入内电极周围的轨道。内电极周围的轨道振荡的频率被记录为图像电流，傅立叶变换算法可以应用该图像电流将频域信号转换为具有非常高分辨率的质谱。
在傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱中，离子样品被保留在类似空腔和离子阱中，但在FTICR MS中，离子被交叉的电场和磁场捕获在高真空室中(Marshall,A.G.等,(1998)Mass Spectrom Rev,17,1-35&Marshall,A.G.and Hendrickson,C.L.(2008)AnnuRev Anal Chem(Palo Alto Calif),1,579-599)。电场由形成盒子两侧的一对平板电极产生。该盒包括在超导磁体的场中，该磁体与两个板(俘获板)一起将注入的离子限制在垂直于所施加的磁场的俘获板之间的圆形轨道中。通过将射频脉冲施加到两个“发射板”上，离子被激发到更大的轨道，这两个“发射板”形成箱的另外两个相对侧。离子的摆线运动在包括“接收器板”的盒子的剩余两个相对侧中产生相应的电场。激发脉冲激发离子到较大的轨道，这些轨道随着离子的相干运动通过碰撞而损失而衰减。通过傅立叶变换(FT)分析将接收器板检测到的相应信号转换为质谱。FTICR仪器的质量分辨率随着施加磁场的强度而增加，并且可以实现非常高的分辨率(>1,000,000)分析(Schaub,T.M.等,(2008)Anal Chem,80,3985-3990)。
对于诱导性碎片化实验，FTICR仪器可以以类似于离子阱的方式进行-除了单个目标物质之外的所有离子都可以从FTICR腔中射出。可以将碰撞气体引入FTICR腔中并引起碎片化。碎片离子可以随后进行分析。如果通过对“接收板”检测到的信号进行FT分析进行分析，通常碎裂产物和浴液结合得到的分辨率很差，然而碎片离子可以从腔中排出并且在串联配置有四极或例如飞行时间仪器中进行分析。
在飞行时间质谱仪中，动能分布窄的离子脉冲进入无场漂移区。在仪器的漂移区中，每个脉冲中具有不同质荷比的离子以不同的速度传播，因此在不同时间到达位于漂移区末端的离子检测器。漂移区域的长度决定了TOF仪器的质量分辨率，并且这可很容易地增加。由检测器响应到达离子而产生的模拟信号立即由时间-数字转换器数字化。离子飞行时间的测量决定了每个到达离子的质荷比。飞行时间仪器有许多不同的设计。该设计在某种程度上由离子源的性质决定。在基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI TOF)质谱中，离子脉冲是通过激光激发结晶在金属靶上的样品材料产生的。这些脉冲形成在加速它们的飞行管的一端。
为了从电喷雾离子源获取质谱，使用正交轴TOF(oaTOF)几何结构。在电喷雾离子源中产生的离子脉冲通过“推动器”板从连续流中取样。推动器板通过使用瞬态电位差将离子加速到飞行时间质量分析器中，该电位差将来自源的离子加速到正交定位的飞行管中。记录从推动器板到检测器的飞行时间，以产生相对于质荷比的离子到达数的直方图。这些数据使用时间数字转换器进行数字记录。
为了解析本发明的所有可能的标签，需要具有高分辨率的质谱仪，但是仪器的性质对于本发明的实践并不特别重要。此外，只要使用由单道尔顿质量差异分开的可能标签的亚组，本应用中描述的许多标签仍然可以在仅具有单道尔顿分辨率的仪器上解析。
下面通过以下实施例详细说明本发明，这些实施例仅仅是说明性的，决不限制本发明的范围。
实施例
质量标记的合成
实施例1:N,N-二甲基哌嗪-2-羧酸环同位素的合成
先前在文献(Warshawsky等,1997,J Org Chem 62:6439-40)中已经描述了N，N'-正交保护的哌嗪-2-羧酸的合成。在图3中，直到产物5的示意性步骤说明了此前公开的路线，其中使用修改的Mitsunobu条件(Arnold等,1985,J Am Chem Soc 107:7105-9)，将BOC-保护的丝氨酸转化成相应保护的丝氨酸β-内酯得到产物1，然后通过与烯丙胺反应开环得到产物2。开环反应可以产生酰胺或胺，并且该反应的选择性对溶剂和亲核试剂敏感(Ratemi&Vederas,1994,Tetrahedron Letters 35:7605-8)。使用标准Schotten-Baumann条件，用CBz基团将所得仲胺保护，得到产物3。然后通过臭氧分解烯烃并且用二甲基硫化物诱导产物3进行闭环反应，得到醛，然后醛自发地闭环以形成产物4，环半胺合物。使用溶于CH2Cl2的三乙基硅烷和三氟化硼乙醚化物进行半缩醛胺的化学选择性还原(Pedregal etal.,1994,Tetrahedron Letters 35:2053-6)，得到产物5。双保护环的1'位置上的BOC基团可以用二氟甲烷(DCM)中的三氟乙酸(TFA)选择性除去，得到产物6。除去BOC后，用三乙酰氧基硼氢化物用甲醛进行还原性甲基化，得到产物7。然后通过用甲醇中的钯/炭催化剂用氢气还原从4'位置除去CBz基团，得到产物8。最后，随后在4'氮上进一步进行还原性甲基化，得到N,N'-二甲基-哌嗪-2-羧酸(产物9)。有许多市售的丝氨酸和甲醛同位素(见图6，尽管这不是一份完整的清单)，但烯丙胺的重同位素不是目录项目。然而，烯丙胺的重同位素很容易制成。氘化形式的甲醛是可商购的，并且通过使用三乙酰氧基氘氘化物进行还原性甲基化步骤，可将额外的氘引入环中。以这种方式可以制备哌嗪-2-羧酸环的多个重同位素形式以产生本发明的标签。同样有利的是，环中氮中心处的甲基取代可以独立进行以允许独立控制氘原子的数量。这种合成方法可以制备含有1、2、3、4、5或6个氘原子的环。
由于烯丙胺同位素不容易从市场上买到，但乙醇胺的重同位素很容易得到，图4显示了图3所示的路线的变化。在图4中，使用Dess Martin Periodinane(DMP)(Dess&Martin,1983,J Org Chem 48:4155-6)将BOC-保护的丝氨酸(即R5为氢)转化为相应的保护的醛，得到产物1，然后通过与乙醇胺反应进行还原烷基化(其中R3是氢在图4中)和三乙酰氧基硼氢化物反应，得到产物2。使用标准Schotten-Baumann条件，用CBz保护基团将所得仲胺保护，得到产物3。然后通过具有DMP的醇转换成醛诱导产物3进行闭环反应，得到醛，然后醛自发地闭环以形成产物4，环半胺合物。使用溶于CH2Cl2的三乙基硅烷和三氟化硼乙醚化物进行缩醛胺的化学选择性还原(Pedregal等,1994,在前引用)，得到产物5。双保护环的1'位置上的BOC基团可以用二氟甲烷(DCM)中的三氟乙酸(TFA)选择性除去，得到产物6。除去BOC后，用三乙酰氧基硼氢化物用甲醛进行还原性甲基化，得到产物7。然后通过用甲醇中的钯/炭催化剂用氢气还原从4'位置除去CBz基团，得到产物8。最后，随后在4'氮上进行还原性甲基化，得到N,N'-二甲基-哌嗪-2-羧酸(产物9)。
具有更多取代基的哌嗪环可以使用与图4所示相同的合成路线但用不同的起始组分来合成。例如，丝氨酸可以取代苏氨酸(即R5是CH3)，得到N,N'-二甲基-5-甲基-哌嗪-2-羧酸。类似地，乙醇胺可以取代L-丙氨醇(其中R3是CH3)，其可以来源于丙氨酸，如图5所示。或者，乙醇胺可以取代L-缬氨醇(其中R3是异丙基)，其可以来源于缬氨酸，如图5所示。另外，乙醇胺可以取代L-亮氨醇(其中R3是异丁基)，其可以来源于亮氨酸，如图5所示。苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的各种重稳定同位素形式可以商业获得(参见图6，其中列出了可用的重同位素的非综合列表)，使得能够合成根据本发明的多个标签。本领域普通技术人员应该明白，可以将大量可选的α-氨基酸转化为相应的α-氨基醇以合成本发明的质量标签。
实施例2:取代的哌嗪-2-羧酸环与接头的偶联
如图1和2所示，构成本发明基础的取代的哌嗪-2-羧酸环用作同量异位质量标签中的报告离子。如前所述，报道分子X与质量标准化剂组M连接以产生同量异位和假同量异位标签和质量系列移位标签。
图7说明双β-丙氨酸接头与取代的哌嗪-2-羧酸环的偶联。用BOC保护基在氨基上保护的β-丙氨酸(产物10)与用苄基保护基在羧基上保护的β-丙氨酸(产物11)偶联，得到受保护的双-β丙氨酸接头(产物12)。去除BOC基团，得到带有游离胺的接头(产物13)，其又与取代的哌嗪-2-羧酸环(9)偶联。然后除去苄基保护基得到游离酸，然后可以将其转化为活性酯以与氨基反应，或者可以使用羧酸基引入其他反应性基团，如下所讨论。β-丙氨酸的多种同位素是可商购的，使得能够产生本文中描述的任何双β-丙氨酸接头。
图8说明1,4-丁二胺接头与取代的哌嗪-2-羧酸环的偶联。用一个BOC保护基在一个氨基上保护的1,4-丁二胺(产物10)直接与取代的哌嗪-2-羧酸环(9)偶联，得到BOC保护的产物(11)。单-BOC保护的对称二胺的制备在文献中是众所周知的(Lee等,2007,Synthetic Communications:Communications:An International Journal for RapidCommunication of Synthetic Organic Chemistry 37:737-42)。然后除去BOC保护基得到游离胺(产物12)，然后通过与二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)反应将其转化为NHS氨基甲酸酯(产物13)。NHS氨基甲酸酯对游离氨基具有反应性。或者，游离氨基可用于引入图8中所示的其它反应性基团。游离胺12可以与碘乙酸酐反应，得到碘乙酰胺产物(14)。或者，可将游离胺产物12偶联至(BOC-氨氧基)乙酸(SigmaAldrich)。可以用TCA/DCM除去BOC基团，得到氨氧基衍生的标签(15)。
实施例3:反应性基团
显示图7中所示的示例标签用游离羧酸进行官能化。羧酸标签可以用合适的偶联剂如碳二亚胺如N,N’-二环己基碳化二亚胺与氨基偶联。更优选地，游离羧酸被改性以形成所谓的活性酯，其是稳定的试剂，其将容易与游离氨基反应而不需要额外的偶联剂。优选地，具有游离羧酸的质量标签可通过使游离酸与N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在合适的有机溶剂如二氯甲烷中接触而活化为N-羟基琥珀酰亚胺酯。
其他优选的活性酯可以通过使用碳化二亚胺将合适的醇与游离羧酸偶联至本发明的质量标签来制备。或者，游离羧酸可以在与醇反应之前用亚硫酰氯从酰氯中活化。因此，通过将质量标签与五氟苯酚偶联来制备五氟苯酚活性酯，类似地通过将质量标签与硝基苯酚偶联来制备硝基苯酚酯。磺基二氯苯酚(SDP)酯可以通过使质量标签的酰氯与3,5-二氯-4-羟基苯磺酸反应来制备。类似地，1-羟基-7-氮杂苯并三唑酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、2,3,5,6-四氟苯酚酯、4-磺基-2,3,5,6-四氟苯酚酯和3,4-脱氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪基(DHBT)酯都可以由相应的醇制备。DHBT酯通常不被制备成可以储存或分配的试剂。它通常在使用前立即就地制备。
本发明的质量标签的氨氧基活化形式可以通过将Boc-保护的氨基氧基丙胺与本发明的两种质量标签的NHS酯活化形式偶联来制备。然后在酸性条件下除去BOC保护基团以提供氨氧基试剂。
氨氧基与羰基官能团反应形成肟键，非常稳定。羰基官能团出现在氧化碳水化合物和类固醇中，并且本领域已知用于制备含类固醇样品，含碳水化合物样品或含氨基样品的氨基氧官能化标记试剂标记的各种方法。
类似地，酰肼活化的试剂与羰基反应形成腙键。腙中度稳定，可以直接分析这种方式标记的化合物或避免偶联反应被逆转的任何可能性，腙可以被还原成仲胺。本发明的质量标签的酰肼活化形式的合成可以通过将肼与本发明的两种质量标签的NHS酯活化形式偶联来实现。
本发明的质量标记的吡啶基二硫激活形式可以通过将硫代吡啶保护的半胱胺与质量标签的活性酯形式偶联来制备。硫代吡啶保护的半胱胺通过使半胱胺与二硫代吡啶反应以产生保护的硫醇并留下游离氨基来制备：
然后将该胺中间体与本发明的两个质量标签的NHS酯活化形式偶联，得到本发明的质量标记的吡啶基二硫化物活化形式。
本发明的质量标签的吡啶基二硫化物活化形式可用于将本发明的质量标记与巯基官能团偶联，例如蛋白质或肽中减少的半胱氨酸残基。2-二硫吡啶基团具有以下几个优点：即使在pH值升高的情况下，它也表现出很高的标记半胱氨酸残基的选择性(如在用于蛋白质组学研究的缓冲溶液中经常使用的那样)(例如三乙基碳酸氢铵TEAB)，并且它不易暴露于水。此外，如果需要，通过用任何二硫化物还原剂处理，该基团可以容易地从肽中重新裂解。
质量标记的氨基官能化形式也可以由羧酸衍生的标签制备。在该反应方案中，使BOC-保护的乙二胺与本发明的两种质量标记的NHS-酯活化形式反应，然后除去BOC基团以产生本发明的质量标记的氨基官能化形式。氨基官能化的质量标记本身是有用的，并且可以用于将本发明的质量标记偶联到羰基上，同时还原所得到的亚胺。
本发明的质量标记的氨基官能化形式可进一步反应以通过将卤代乙酸酐如碘乙酸酐偶联到氨基官能化的标签来产生本发明的质量标签的卤代乙酰形式。得到的本发明的质量标签的碘乙酰胺活化形式可用于将本发明的质量标记与巯基官能团偶联，例如蛋白质或肽中减少的半胱氨酸残基。
马来酰亚胺化合物也是用于巯基标记的优异试剂，并且可容易地通过胺改性标签与马来酸酐在惰性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)中反应，接着用五氧化二磷脱水以实现闭环引入根据本发明的标签。
以下显示了本发明质量标签的炔烃活化形式的合成。
在该反应方案中，炔丙胺与本发明的两种质量标记的NHS-酯活化形式反应，产生本发明的质量标记的炔官能化形式。或者，可以将本发明的胺衍生的标签偶联到丙炔酸上以产生炔官能化的标签：
炔官能化的质量标签可以通过铜催化的叠氮炔环加成(CuAAC)反应与叠氮官能团反应以形成三唑键。这有时被称为“Sharpless反应”(Rostovtsev等,2002,Angew Chem IntEd 41:2596-9)。用于代谢标记活细胞的各种基于叠氮化物的试剂可商购获得，并且允许用本发明的质量标记来标记来源于这些细胞的叠氮化物标记的分子。
本发明的质量标记的氨基官能化形式可以进一步反应以通过偶联市售的NHS-叠氮化物试剂(Thermo Scientific's Pierce Biotechnology division，Rockford，Illinois，USA)来产生本发明的质量标签的叠氮化物官能化形式的质量标记。或者，可以通过与叠氮化试剂咪唑-1-磺酰基叠氮化物反应将氨基官能化的质量标记直接转化成叠氮化物。通过在乙腈中用叠氮化钠处理磺酰氯，接着加入过量的咪唑来制备咪唑-1-磺酰基叠氮化物(Goddard-Borger&Stick,2007,Org Lett 9:3797-800)。
叠氮官能化的标签可以通过“Sharpless反应”或铜催化的叠氮炔环加成(CuAAC)反应与炔官能团反应以形成三唑键。用于代谢标记活细胞的各种基于炔烃的试剂可商购获得，并且允许用本发明的标签来标记来源于这些细胞的炔烃标记的分子。
本文描述的实施例提供了用于产生先前在本发明的第一质量标记组的上下文中描述的实施方案1至6中所述的质量标记和质量标记的组的手段。

Claims (46)

1.两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记包括下式：
X-L-M-Re
其中：
-X是具有确切质量的报道部分，
-L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，
-M是质量改性剂，并且
-Re是a)用于将所述质量标记附接至分析物上的反应性官能团，或者b)所述分析物，
其中所述组中的每个质量标记具有整数质量，
其中所述组中的每个质量标记具有相同的整数质量，
其中所述组包括质量标记的两个或更多个亚组，每个亚组包括一个、两个或更多个质量标记，
其中当所述亚组包括两个或更多个质量标记时，所述亚组中的每个质量标记的所述报道部分X的确切质量与同一亚组和所有其他亚组中的所述质量标记的所述报道部分X的确切质量不同，
其中每个质量标记通过质谱可区分，
其中每个质量标记具有报道部分X，其包括以下通式：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基中的结构。
2.两个或更多个质量标记的组，其中每个标记包括下式：
X-L-M-Re
其中X是具有确切质量的报道部分，L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，M是质量改性剂，并且Re是用于将所述质量标记附接至分析物的反应性官能团或者所述分析物，并且X包括以下通式：
其中R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，或选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、叔戊基、异戊基、仲戊基和3-戊基中的结构。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中R1和R4是甲基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中R2是H。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中R3选自由H、甲基、异丙基、异丁基组成的群组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中R5是H或甲基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述报道部分X选自：
a)或者
b)或者
c)或者
d)或者
e)或者
f)或者
g)或者
h)
8.根据权利要求7所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述报道部分X选自：
a)或者
b)或者
c)或者
d)或者
e)或者
f)或者
g)或者
h)
其中*是同位素质量调节剂部分，并且表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述质量改性剂M选自：
a)
b)
和
c)
其中：
-每个R10独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链；
-每个R11独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链,
-b是1-10的整数，
-c是0-10的整数，
-d是1-10的整数，并且
-e是1-10的整数。
10.根据权利要求9所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述质量改性剂M选自：
a)
b)
和
c)
其中*是同位素质量调节剂部分，并且表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记另外包括至少一个质量系列改性基团，其中所述质量系列改性基团是所述报道部分X的一部分和/或所述质量改性剂M的一部分。
12.根据权利要求11所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述至少一个质量系列改性基团是所述报道部分X和所述质量改性剂M的一部分。
13.根据权利要求11或12所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述至少一个质量系列改性基团选自：
d)重同位素2H、13C、15N或18O；或者
e)取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，其任选包括一个或多个重同位素取代；或者
f)或a)和b)的组合。
14.根据权利要求13所述的两个或更多个质量标记的组，其中所述质量系列改性基团是–CH3、–13CH3、–CHD2、–13CHD2、–13CD3或–CD3。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的组，其中所述质量标记中的每一者包括至少一个具有以下结构的质量系列改性基团：
其中：
-每个R12独立地是H、取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的脂族环基团、取代或未取代的芳族基团或者取代或未取代的杂环基团或氨基酸侧链；
-f是1-10的整数；
-g是1-10的整数；并且
-h是1-10的整数。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的两个或多个质量标记的组，其中当Re是所述分析物时，其中所述分析物包括选自氨基酸、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、脂质、磷脂或其组合的群组中的一个或多个分析物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构之一：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且其中可以存在一个或多个*。
18.根据权利要求17所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝21个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-1-21-113.10732(亚组1)
TMT-1-21-114.10436(亚组2)
TMT-1-21-114.11068(亚组2)
TMT-1-21-115.10139(亚组3)
TMT-1-21-115.10771(亚组3)
TMT-1-21-115.11403(亚组3)
TMT-1-21-116.10475(亚组4)
TMT-1-21-116.11107(亚组4)
TMT-1-21-116.11739(亚组4)
TMT-1-21-117.1081(亚组5)
TMT-1-21-117.11442(亚组5)
TMT-1-21-117.12074(亚组5)
TMT-1-21-118.11146(亚组6)
TMT-1-21-118.11778(亚组6)
TMT-1-21-118.1241(亚组6)
TMT-1-21-119.11481(亚组7)
TMT-1-21-119.12113(亚组7)
TMT-1-21-119.12745(亚组7)
TMT-1-21-120.11817(亚组8)
TMT-1-21-120.12449(亚组8)
TMT-1-21-121.12152(亚组9)
19.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
20.根据权利要求19所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝7个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-2-7-115.11988(亚组3)
TMT-2-7-1-116.12323(亚组4)
TMT-2-7-1-117.12659(亚组5)
TMT-2-7-1-118.12994(亚组6)
TMT-2-7-119.1333(亚组7)
TMT-2-7-120.13665(亚组8)
TMT-2-7-121.14001(亚组9)
21.根据权利要求1至15中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
22.根据权利要求20所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝5个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-3-5-1-117.13243(亚组5)
TMT-3-5-118.13579(亚组6)
TMT-3-5-119.13914(亚组7)
TMT-3-5-120.13618(亚组8)
TMT-3-5-121.14585(亚组9)
23.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
24.根据权利要求23所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝3个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-4-3-119.14499(亚组7)
TMT-4-3-120.14834(亚组8)
TMT-4-3-121.15169(亚组9)
25.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构之一：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
26.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
27.根据权利要求26所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝24个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-5-24-127.12297(亚组1)
TMT-5-24-128.12001(亚组2)
TMT-5-24-128.12633(亚组2)
TMT-5-24-129.11704(亚组3)
TMT-5-24-129.12336(亚组3)
TMT-5-24-129.12968(亚组3)
TMT-5-24-130.1204(亚组4)
TMT-5-24-130.12672(亚组4)
TMT-5-24-130.13304(亚组4)
TMT-5-24-131.12375(亚组5)
TMT-5-24-131.13007(亚组5)
TMT-5-24-131.13639(亚组5)
TMT-5-24-132.12711(亚组6)
TMT-5-24-132.13343(亚组6)
TMT-5-24-132.13975(亚组6)
TMT-5-24-133.13046(亚组7)
TMT-5-24-133.13678(亚组7)
TMT-5-24-133.1431(亚组7)
TMT-5-24-134.13382(亚组8)
TMT-5-24-134.14014(亚组8)
TMT-5-24-134.1523(亚组8)
TMT-5-24-135.13717(亚组9)
TMT-5-24-135.14349(亚组9)
TMT-5-24-136.14053(亚组10)
28.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构之一：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
29.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
30.根据权利要求29所述的两个或更多个质量标记的组，其中*是13C或15N并且所述组包括n＝27个质量标记，所述质量标记具有以下结构：
TMT-6-27-141.13862(亚组1)
TMT-6-27-142.13566(亚组2)
TMT-6-27-142.14198(亚组2)
TMT-6-27-143.13269(亚组3)
TMT-6-27-143.13901(亚组3)
TMT-6-27-143.14533(亚组3)
TMT-6-27-144.13605(亚组4)
TMT-6-27-144.14237(亚组4)
TMT-6-27-144.14869(亚组4)
TMT-6-27-145.1394(亚组5)
TMT-6-27-145.14572(亚组5)
TMT-6-27-145.15204(亚组5)
TMT-6-27-146.14276(亚组6)
TMT-6-27-146.14908(亚组6)
TMT-6-27-146.1554(亚组6)
TMT-6-27-147.14611(亚组7)
TMT-6-27-147.15243(亚组7)
TMT-6-27-147.15875(亚组7)
TMT-6-27-148.14947(亚组8)
TMT-6-27-148.15579(亚组8)
TMT-6-27-148.16211(亚组8)
TMT-6-27-149.15282(亚组9)
TMT-6-27-149.15914(亚组9)
TMT-6-27-149.16546(亚组9)
TMT-6-27-150.15618(亚组10)
TMT-6-27-150.1625(亚组10)
TMT-6-27-151.15953(亚组11)
31.根据权利要求1至16中任一项所述的两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记具有以下结构之一：
其中*表示氧为18O，碳为13C，氮为15N或氢为2H，并且可以存在一个或多个*。
32.质量标记的阵列，其包括两个或更多个的如权利要求1至31中任一项定义的质量标记的组。
33.根据权利要求32所述的质量标记的阵列，其中所述阵列中任一组的质量标记中的每一者的整数质量不同于所述阵列中每个其他组的质量标记中的每者的整数质量。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的质量标记的阵列，其中组中的每个质量标记包括：
a)质量系列改性基团，其具有与所述组中每个其他质量标记相同的整数质量，和
b)与所述阵列中所有其它组的所述质量标记不同的整数质量。
35.根据权利要求32或权利要求33所述的阵列，其中组中的每个质量标记包括相同的质量系列改性基团。
36.根据权利要求32至33中任一项所述的阵列，其中组中的每个质量标记包括质量系列改性基团，其为所述阵列中所有其他质量标记的质量系列改性基团的同位素体。
37.一种质谱分析方法，所述方法包括：通过由质谱鉴定可与分析物相关的质量标记或质量标记的组合来检测所述分析物，其中所述质量标记是来自如权利要求1至36中任一项定义的质量标记的组或阵列的质量标记。
38.根据权利要求37所述的质谱分析方法，所述方法包括：
a)提供多个样品，每个样品包括一个或多个分析物，其中每个样品用质量标记或质量标记的组合而差异地标记，获得一个或多个标记的分析物；其中所述质量标记来自如权利要求1至36中任一项定义的质量标记的组或阵列；
b)混合所述多个差异标记的样品以形成包括标记的分析物的分析混合物；
c)任选在质谱仪中检测所述标记的分析物；
d)在所述质谱仪中解离所述标记的分析物以形成质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片；
e)检测所述质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片；
f)任选在所述质谱仪中解离所述质量标记以释放所述报道部分，并检测所述报道部分；
g)任选地解离在步骤f)中形成的所述报道部分以形成碎片，并检测所述碎片；
h)基于所述标记的分析物的质谱，和/或质量标记和/或包括完整质量标记的分析物碎片的质谱，和/或报道部分的质谱或报道部分的碎片的质谱来鉴定所述分析物。
39.根据权利要求38所述的质谱分析方法，其中基于所述标记的分析物的质谱来鉴定所述分析物。
40.根据权利要求38所述的质谱分析方法，其中基于所述质量标记的质谱和/或包括完整质量标记的分析物碎片的质谱来鉴定所述分析物。
41.根据权利要求40所述的质谱分析方法，其中所述包括完整质量标记的分析物碎片是包括完整质量标记的b系列离子，优选b1离子。
42.根据权利要求37所述的质谱分析方法，其中基于所述报道部分的质谱或报道部分的碎片的质谱来鉴定所述分析物。
43.根据权利要求37所述的质谱分析方法，所述方法包括：
a)提供多个样品，每个样品包括一个或多个分析物，其中每个样品用质量标记或质量标记的组合而差异地标记，获得一个或多个标记的分析物；其中所述质量标记来自如权利要求1至36中任一项定义的质量标记的组或阵列；
b)混合多个差异标记的样品以形成包括标记的分析物的分析混合物；
c)在质谱仪中检测所述标记的分析物；
d)在所述质谱仪中解离所述标记的分析物以释放所述报道部分，并检测包括附接至所述分析物或分析物碎片的剩下的质量标记的陪补离子；
e)任选地，一个或多个以下的其它步骤：解离在步骤d中形成的陪补离子以形成碎片，并检测所述碎片；
f)基于所述标记的分析物的质谱和/或陪补离子和/或其碎片的质谱来鉴定所述分析物。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述解离是质谱仪中碰撞诱导的解离。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，所述方法在质谱仪中进行，所述质谱仪在400的质荷比下具有大于60,000的分辨率，优选在400的质荷比下具有大于100,000的分辨率，最优选在400的质荷比下具有大于250,000的分辨率。
46.根据权利要求38至45中任一项所述的方法，其中在步骤d)中通过一氧化碳从键L的中性丢失而形成所述陪补离子。
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