JP2023537397A - 標的化された核酸の切断方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、例えばエピゲノム及びエピトランスクリプトームマッピング並びに治療に使用するための、標的核酸の非酵素切断法を提供する。本方法は、標的核酸分子を、切断基及び共有結合基を含む二機能性プローブと接触させて、それにより二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させ、そこに結合した５標的核酸分子を切断するステップを含む。細胞内の標的核酸を選択的に切断する方法、細胞内の核酸修飾酵素による核酸分子の修飾を決定する方法、及びこれらの方法に使用するための二機能性プローブも提供される。

Description

本発明は、例えばエピゲノム(epigenomic)及びエピトランスクリプトーム(epitranscriptomic)マッピング並びに治療に使用するための、標的核酸の非酵素切断法に関する。
核酸操作及び編集技術の進歩が、生物学的研究が行われる方法を根本的に改革してきた。ＲＮＡ干渉及びｓｈＲＮＡ発現系は、ターゲットバリデーション（target validation）並びに特定の遺伝子が分子疾患で果たす役割の解明にとって貴重であることが判明している（Zamore, Phillip D., et al. Cell 101.1 (2000): 25-33）。最近、ＣＲＩＳＰＲベースの技術が、ＤＮＡ（Gasiunas, Giedrius, et al. PNAS USA 109.39 (2012): E2579-E2586；Jinek, Martin, et al. Science 337.6096 (2012): 816-821）及びＲＮＡ（Cox, David BT, et al. Science 358.6366 (2017): 1019-1027）を操作する能力をなおさらに増強し、より単純な系、例えば遺伝子ノックアウト細胞を可能にし、大規模で精巧なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの遺伝子スクリーニングアプローチを可能にしている（Tzelepis, Konstantinos, et al. Cell Reports 17.4 (2016): 1193-1205）。しかしながら、ほとんどの一般的に使用されている核酸操作技術は遺伝的であり、それらをより複雑な生物系、例えば希少集団、動物モデル及び全組織に適用することは完全に不可能ではないが困難であり、これらの技術に基づく治療を開発することはなおさらに困難である（Bobbin, Maggie L.et al Annual Review of Pharmacology and Toxicology 56 (2016): 103-122）。したがって、まだ未開拓の状況で核酸の操作を可能にするような新たな低分子ベースの技術を開発する差し迫った必要性が存在する。
逆に、ヒト細胞は、低分子－補因子(cofactors)を伴う機序を含む、核酸を操作するためのいくつかの機序を進化させてきた。例えば、ＲＮＡメチラーゼＭＥＴＴＬ３（Bokar, J. A., et al. RNA 3.11 (1997): 1233-1247）及びＭＥＴＴＬ１６（Pendleton, Kathryn E., et al. Cell 169.5 (2017): 824-835）は、補因子ＳＡＭを利用して、多くの異なるＲＮＡ種にわたる選択したアデノシンのＮ６位にメチル基を堆積(deposit)させる。得られたＮ６－メチルアデノシンマークは、この官能基性を生物機能に変えるライター、イレイサー及びリーダー酵素のセットにより、ＲＮＡライフサイクル及び活性の多くの側面を調整する。この官能基性への関心が複数のｍ６Ａマッピング法の開発につながり、ｍ６Ａ－ｓｅｑ（Dominissini, Dan, et al. Nature 485.7397 (2012): 201-206）、ＭｅＲＩＰ－ｓｅｑ（Meyer, Kate D., et al. Cell 149.7 (2012): 1635-1646.）及びｍｉＣＬＩＰ（Linder, Bastian, et al. Nature methods 12.8 (2015): 767-772）が最も一般的である。これらのマッピング法の全てが抗体ベースであり、よって、複数の固有の警告に悩まされる；高いインプット要件、抗体結合バイアス並びにバッチ間変動及び酵素活性をマッピングできないことが、これらの方法の重要な制約であった。さらに、これらの技術は、ｍ６Ａ抗体に依拠し、よって、抗体が利用可能でない場合、他のＲＮＡ修飾による使用に置き換えることはできない。
Zamore, Phillip D., et al. Cell 101.1 (2000): 25-33 Gasiunas, Giedrius, et al. PNAS USA 109.39 (2012): E2579-E2586 Jinek, Martin, et al. Science 337.6096 (2012): 816-821 Cox, David BT, et al. Science 358.6366 (2017): 1019-1027 Tzelepis, Konstantinos, et al. Cell Reports 17.4 (2016): 1193-1205 Bobbin, Maggie L.et al Annual Review of Pharmacology and Toxicology 56 (2016): 103-122 Bokar, J. A., et al. RNA 3.11 (1997): 1233-1247） Pendleton, Kathryn E., et al. Cell 169.5 (2017): 824-835 Dominissini, Dan, et al. Nature 485.7397 (2012): 201-206 Meyer, Kate D., et al. Cell 149.7 (2012): 1635-1646. Linder, Bastian, et al. Nature methods 12.8 (2015): 767-772
本発明者らは、二機能性プローブを使用して核酸を非酵素的に切断することができることを発見した。これは、エピゲノム及びエピトランスクリプトームマッピング並びに治療を含む様々な用途に有用であり得る。
本発明の態様は、標的核酸分子を切断する方法であって、
標的核酸を、式：
Ｃ－Ｌ－Ｂ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは結合部分である）
を有する二機能性プローブと接触させて、それにより前記二機能性プローブを前記標的核酸分子に共有結合させるステップと；
前記二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含む、前記方法を提供する。
好ましくは、切断部分が置換又は非置換イミダゾールである。
好ましくは、標的核酸分子を細胞内で二機能性プローブと接触させる。
二機能性プローブは標的核酸分子に共有結合する。例えば、標的核酸分子は、二機能性プローブとの共有結合を促進するためのパートナー部分（Ｐ）でタグ付けされ得る。例えば、パートナー部分でタグ付けされた標的核酸分子を、式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブと接触させることができる。二機能性プローブがそこに共有結合した核酸分子を切断することを可能にすることができる。
好ましい実施形態では、切断部分が置換又は非置換イミダゾールである。したがって、二機能性プローブが、式（２）：
Ｉ－Ｌ－ＢＣ （２）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、Ｂｃはパートナー部分と反応して二機能性プローブが標的核酸分子に共有結合する反応性基を含む結合部分である）
を有する。
標的核酸分子は、核酸修飾酵素によってパートナー部分でタグ付けされ得る。方法は、標的核酸分子を、核酸修飾酵素、及びパートナー部分を含む補因子アナログと接触させて、それにより、標的核酸が核酸修飾酵素によってパートナー部分でタグ付けされるステップを含み得る。
一部の実施形態では、補因子アナログを、標的核酸分子及び核酸修飾酵素を含む細胞内に導入することができる。
他の実施形態では、補因子アナログが細胞内部で補因子アナログ前駆体から生成され得る。例えば、方法は、補因子アナログ前駆体を、標的核酸分子及び核酸修飾酵素を含む細胞内に導入し、それにより、補因子アナログ前駆体が細胞内で補因子アナログに変換されるステップを含み得る。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素が、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）依存性ＲＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を切断する方法は、
パートナー部分を含むメチオニンアナログを細胞内に導入し、
それにより、メチオニンアナログが細胞内でアデノシル化されてＳ－アデノシルメチオニンアナログを生成し；
Ｓ－アデノシルメチオニンアナログが、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼと組み合わせて作用して標的ＲＮＡ分子をパートナー部分でタグ付けするステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂｃはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
前記二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、メチオニンアナログがＰｒｏｐＳｅＭｅｔであり、Ｓ－アデノシルメチオニンアナログがＳｅＡｄｏＹｎであり、パートナー部分がプロパルギルタグであり、二機能性プローブが式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素が、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、好ましくはアセチル補酵素Ａ依存性ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼであり得る。例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を切断する方法は、
パートナー部分を含むアセテートアナログを細胞内に導入し、それにより、
アセテートアナログが、細胞内で、補酵素Ａでチオエステル化されてアセチルＣｏＡアナログを生成し；
アセチルＣｏＡアナログが、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼと組み合わせて作用して標的ＲＮＡ分子をパートナー部分でタグ付けするステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
前記二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、アセテートアナログが、Ｃ１－６アルキル３－ブチノエートエステル、例えばエチル－３－ブチノエートであり、アセチル補酵素Ａアナログが３－ブチノイル補酵素Ａであり、パートナー部分がアルキニルタグであり、二機能性プローブが式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、アセテートアナログがＣ１－６アルキル４－ペンチノエートエステル、例えばエチル－４－ペンチノエートであり、アセチル補酵素Ａアナログが４－ペンチノイル補酵素Ａであり、パートナー部分がアルキニルタグであり、二機能性プローブが式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼであり得る。例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を切断する方法は、
パートナー部分を含むアセチル化単糖アナログを細胞内に導入し、それにより、
アセチル化単糖アナログが、細胞内で、脱アセチル化されて単糖アナログを生成し、単糖アナログがグリカンに組み込まれてもよく；
前記単糖アナログ、又は単糖アナログを含む前記グリカンが、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせて作用して標的ＲＮＡ分子をパートナー部分でタグ付けするステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、アセチル化単糖アナログが、アシル化マンノースアナログ、例えばＮ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアセチル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ，N-azidoacetylmannosamine-tetraacetylated）であり、単糖アナログが、ノイラミン酸アナログ、例えばＮ－アジドアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｚ，N-azidoacetylneuraminic acid）、又はノイラミン酸アナログを含むグリカンであり、パートナー部分がアジドタグであり、二機能性プローブが式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるアルキン基を含む結合部分である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、アセチル化単糖アナログが、アセチル化グルコースアナログ、例えば１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－アジドアセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ，1,3,4,6-tetra-O-acetyl-azidoacetylglucosamine）であり、単糖アナログが、グルコースアナログ、例えばアジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ，azidoacetylglucosamine）、又はグルコースアナログを含むグリカンであり、パートナー部分がアジドタグであり、二機能性プローブが式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるアルキン基を含む結合部分である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、アセチル化単糖アナログが、アセチル化フコースアナログ、例えば６－アジドフコース－テトラアセチル化（Ａｃ４ＦｕｃＡｚ，6-azidofucose-tetraacetylated）であり、単糖アナログが、フコースアナログ、例えば６－アジドフコース（ＦｕｃＡｚ，6-azidofucose）、又はフコースアナログを含むグリカンであり、パートナー部分がアジドタグであり、二機能性プローブが式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはパートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるアルキン基を含む結合部分である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（３Ｂ）：
Ｃ－Ｌ－ＤＢＣＯ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５Ａ）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
本発明の他の態様及び実施形態を以下でさらに詳細に説明する。
メチル化ＲＮＡ編集プラットフォーム（代理クリック分解配列決定（Surrogate-Click-Degradation-Sequencing）又はＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑと呼ばれる）の概略図である。（ａ）Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑの提案される作用機序。（ｂ）ＰｒｏｐＳｅＭｅｔのＳｅＡｄｏＹｎへの変換、及びその後のプロパルギル基のＲＮＡへの導入。（ｃ）クリック分解剤（click-degrader）によるプロパルギル化ＲＮＡの官能基化。（ｄ）一般塩基ＲＮＡ分解経路の提案される機序。（ｅ）銅媒介ＲＮＡ分解経路。 クリック分解剤の化学機序の研究を示す図である。（ａ）３７℃を使用したクリック分解剤１官能基化ＲＮＡ １１－ｍｅｒの時間依存的分解、ｎ＝２。（ｂ）３７℃、ｐＨ７．５で１４時間のＲＮＡ分解の程度、ｎ＝２。（ｃ）３７℃、ｐＨ３．０で１４時間のＲＮＡ分解の程度、ｎ＝２。（ｄ）中性及び酸性条件でのＲＮＡ分解の程度、ｎ＝２。（ｅ）異なる長さのＰＥＧリンカーを使用した３７℃、ｐＨ７．５で１４時間のＲＮＡ分解の程度。クリック分解剤１、２及び３は、それぞれ、６個、４個及び２個のＰＥＧサブユニットを有するリンカーを有する、ｎ＝２。エラーバーはＳＤを表す。 ～ Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを使用したｍ６ＡライターとｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡにおけるメチル化との間の関係の解明を示す図である。（ａ）Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑワークフロー。（ｂ）ウエスタンブロットは、ＰｒｏｐＳｅＭｅｔで処理したコンディショナルノックダウンＭＯＬＭ－１３細胞においてＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６枯渇の程度を実証する。クリック分解剤の適用は、これらのＭＴアーゼのレベルを有意には変化させない。（ｃ）クリッキングでのメチル化ｍＲＮＡレベルの低下及びＭＥＴＴＬ３枯渇でのＭＥＴＴＬ３依存性転写産物の救済を示すヒートマップ。（ｄ）ｍ６Ａ ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ含有ｍＲＮＡとＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３ ｍＲＮＡ基質の重複。（ｅ）遺伝子パネルのＲＴ－ｑＰＣＲベースのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑ検証、ｎ＝３。（ｆ）ＭＥＴＴＬ３枯渇細胞における遺伝子パネルのＲＴ－ｑＰＣＲベースのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑ検証、ｎ＝３。（ｇ）ＮＥＡＴ１のゲノムブラウザスナップショット。クリック機構の適用は、ＷＴレベルを低下させるが、ＭＥＴＴＬ３レベルもＭＥＴＴＬ１６レベルも低下させない。ｐ値を片側ｔ検定で決定した。ｎｓ＝有意でない。エラーバーはＳＥを表す。 ～ Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑによって明らかになったイントロン及び遺伝子間領域における広範なｍ６Ａマークを示す図である。（ａ）ＦＬＩ１の最初のイントロンにおけるイントロンピーク。（ｂ）３つのアイソジェニック細胞モデルにおけるＣＡＤＭ１の最初のイントロンのイントロンピーク。イントロンピークは、ＭＥＴＴＬ１６－ＫＤ細胞で特異的に消失する。（ｃ）ＭＥＴＴＬ３依存性イントロンピークとＭＥＴＴＬ１６依存性イントロンピークとの間の重複。（ｄ）イントロン及び遺伝子間領域におけるＭＥＴＴＬ３依存性ピークの分布。（ｅ）イントロン及び遺伝子間領域におけるＭＥＴＴＬ１６依存性ピークの分布。（ｆ）ＲＮＡメチラーゼＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６へのイントロンピークの依存性の検証、ｎ＝３。（ｇ）パネルイントロンピークのＲＴ－ｑＰＣＲベースの検証、ｎ＝３。（ｈ）二重ｇＲＮＡ系を介してメチル化イントロンを除去した細胞におけるｍ６Ａ－ＲＩＰの結果、ｎ＝３。（ｉ）枯渇ＭＥＴＴＬ３を有する細胞におけるｍ６Ａ－ＲＩＰの結果、ｎ＝３。（ｊ）枯渇ＭＥＴＴＬ１６を有する細胞におけるｍ６Ａ－ＲＩＰの結果。ＲＡＳＡ３ピーク２はノックダウンによって影響されず、観察される効果が酵素特異的であることを例示している、ｎ＝３。ｎｓ＝有意でない（ｐ≧０．０５）。エラーバーはＳＤを表す。 クリック分解剤１によるＲＮＡの官能基化及びインキュベーションでの官能基化ＲＮＡの分解を裏付けるＬＣＭＳトレースを示す図である。（ａ）クリック分解剤１による官能基化（中央）及び３７℃で１４時間のインキュベーション（下）後の、プロパルギル化ＲＮＡオリゴ（上）のクロマトグラム。（ｂ）クリック分解剤１による官能基化（中央）及び３７℃で１４時間のインキュベーション（下）後の、非プロパルギル化ＲＮＡオリゴ（上）のクロマトグラム。（ｃ）細胞ＣｕＡＡＣ条件と等価な、温和なＣｕＡＡＣ条件（１００μＭ ＣｕＳＯ４、３００μＭ ＴＨＰＴＡ、４００μＭクリック分解剤、５ｍＭ ＮａＡｓｃ、１０分間）による処理を介したクリック分解剤１による官能基化後の、プロパルギル化ＲＮＡオリゴ（上）のクロマトグラム。（ｄ）時間依存的ＲＮＡ分解の対数（一次）フィット。ｎ＝２。（ｅ）クリック分解剤１官能基化ＲＮＡオリゴマー（iii）の検量線。（ｆ）非官能基化ＲＮＡ（ｉ）の検量線。（ｇ）クリック分解剤２官能基化ＲＮＡオリゴマー（iv）の検量線。（ｈ）クリック分解剤３官能基化ＲＮＡオリゴマー（ｖ）の検量線。エラーバーはＳＤを表す。 ～ Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを使用したｍ６ＡライターとｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡにおけるメチル化との間の関係を示す図である。（ａ）ＭＥＴＴＬ１６枯渇でのメチル化ｍＲＮＡの下方制御及びＭＥＴＴＬ１６依存性転写産物の救済を示すヒートマップ。（ｂ）ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ含有ｍＲＮＡとＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ１６ ｍＲＮＡ基質の重複。（ｃ）ＭＥＴＴＬ１６欠損細胞における遺伝子パネルのＲＴ－ｑＰＣＲベースのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑ検証、ｎ＝３。（ｄ）Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３ ｍＲＮＡ基質とＭＥＴＴＬ１６ ｍＲＮＡ基質との間の重複。（ｅ）ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ含有ｌｎｃＲＮＡとＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３ ｌｎｃＲＮＡ基質の重複。（ｆ）ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ含有ｌｎｃＲＮＡとＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ１６ ｌｎｃＲＮＡ基質の重複。（ｇ）Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３ ｌｎｃＲＮＡ基質とＭＥＴＴＬ１６ ｌｎｃＲＮＡ基質との間の重複。（ｈ）３つのアイソジェニック細胞株におけるｌｎｃＲＮＡパネルのＲＴ－ｑＰＣＲベースのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑ検証、カラム順（左から右に）：スクランブル対照、スクランブルクリック、ｓｈＭＥＴＴ３対照、ｓｈＭＥＴＴＬ３クリック、ｓｈＭＥＴＴＬ１６対照、ｓｈＭＥＴＴＬ１６クリック（右）、ｎ＝３。エラーバーはＳＤを表す。 ～ イントロンピークスナップショットの例を示す図である。（ａ）ＦＬＩ１、ＭＥＴＴＬ１６依存性におけるイントロンピーク。（ｂ）ＲＡＳＡ３、ＭＥＴＴＬ１６依存性におけるイントロンピーク。（ｃ）ＤＣＰ１Ｂ、ＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６依存性におけるイントロンピーク。（ｄ）４番染色体の遺伝子間領域、ＭＥＴＴＬ１６依存性におけるイントロンピーク。 ＤＲＡＣＨ及びＴＡＣＡＧモチーフのバリエーションについてのモチーフ分析を示す図である。（ａ）ＭＥＴＴＬ３依存性ピークに見られるコンセンサス配列。（ｂ）ＭＥＴＴＬ１６依存性ピークに見られるコンセンサス配列。（ｃ）２０００～５０００塩基対だけ両方向に伸長した、正確なｍｉＣＬＩＰピークを考慮することによる、ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ部位とＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３依存性イントロンピークとの間の重複。右の垂直線は実験的に決定した重複を示し、左の曲線はランダムに生成したｍ６Ａ部位の１００回のシミュレーションの分布を示す。（ｄ）（ｃ）と同様の、ｍｉＣＬＩＰを介して決定したｍ６Ａ部位とＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ１６依存性イントロンピークとの間の重複。（ｅ）ｍｉＣＬＩＰを介して見出されるｍ６Ａ部位の周りのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑによって決定されたＭＥＴＴＬ３依存性ピークの分布。（ｆ）ｍｉＣＬＩＰを介して見出されるｍ６Ａ部位の周りのＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑによって決定されたＭＥＴＴＬ１６依存性ピークの分布。 ＭＥＴＴＬ１６とイントロンポリアデニル化部位との間の接続を示す図である。（ａ）初代ＣＬＬ細胞において３’－ｓｅｑを介して決定したイントロンポリアデニル化（ＩＰＡ）部位とＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ１６依存性イントロンピークの重複。赤線は実験的に決定した重複を示し、黒色曲線はランダムに生成したＩＰＡ部位の１００回のシミュレーションの分布を示す。（ｂ）初代ＣＬＬ細胞において３’－ｓｅｑを介して決定したＩＰＡ部位とＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを介して決定したＭＥＴＴＬ３依存性イントロンピークの重複。（ｃ）ＩＰＡ部位とＭＥＴＴＬ１６又はＭＥＴＴＬ３依存性イントロンピークとの間の距離の分布。 ＰｒｏｐＳｅＭｅｔ（２）、クリック分解剤（７、８及び９）及び直交保護(orthogonally-protected)されたＮ６－プロパルギルアデノシン（１６）の化学合成の概略図である。 ～ （ａ）クロマトグラムは分解をプロパルギル化ＲＮＡオリゴと非プロパルギル化ＲＮＡオリゴの混合物で行った場合のプロパルギル化ＲＮＡの特異的ＲＮＡ分解を示す。（ｂ）図１１Ａの下のクロマトグラムの定量化。（ｃ）１４時間にわたるクリック分解剤１の活性に対する１ｍＭ Ｃｕ（II）、Ｆｅ（II）及びＺｎ（II）の効果を示す図である。 エチル－３－ブチノエート（１７）、クリック分解剤（７）、クリック分解剤（２０）及びＡｃ４ＦｕｃＡｚ（２１）の化学合成の概略図である。 アセチル化ＲＮＡ編集プラットフォーム（アセチル化クリック配列決定（acetylated Click-Sequencing）又はａｃＣＬＩＣＫ－ｓｅｑと呼ばれる）の概略図である。（ａ）エチル－３－ブチノエートによるアセチル化ＲＮＡの酵素標識、引き続いてクリック分解作用の提案される機序。（ｂ）アルキン基をＲＮＡ上に導入するためのＲＮＡアセチルトランスフェラーゼのその後の乗っ取りのためのエチル－３－ブチノエートの３－ブチノイル－ＣｏＡへの変換。その後、アジド保有クリック分解剤による銅媒介クリック反応（ＣｕＡＡＣ）が、即座のＲＮＡ分解を促進するだろう。（ｃ）一般塩基２－Ｏ’プロトン引き抜きアプローチ（上）及び銅媒介Ｃｕ（Ｉ）複合体形成アプローチ（下）を介したＲＮＡ分解の提案される機序。 ａｃＣＬＩＣＫ－ｓｅｑを使用して実施した修飾ＲＮＡ転写産物についての検証試験を示す図である。（ａ）細胞におけるａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑのワークフロー。（ｂ）ＷＴ細胞における１８Ｓ及びＢＲＤ４遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲベースのａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ検証；処理した「クリック」細胞における相対的発現を対照（エチル－３－ブチノエートプローブ及び非クリック）細胞と比較する、ｎ＝３；＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＊＝ｐ≦０．００１、ｎｓ＝有意でない（ｐ≧０．０５）。エラーバーはＳＤを表す。（ｃ）ＮＡＴ１０ノックアウト細胞における１８Ｓ及びＢＲＤ４遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲベースのａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ検証；処理した「クリック」細胞における相対的発現を対照（エチル－３－ブチノエートプローブ及び非クリック）と比較する、ｎ＝３。エラーバーはＳＤを表す。 グリコシル化ＲＮＡ編集プラットフォーム（グリコシル化クリック配列決定（glycosylated Click-Sequencing）又はグリコＣＬＩＣＫ－ｓｅｑと呼ばれる）の概略図である。（ａ）アジド標識糖アナログによるグリコＲＮＡの酵素標識、引き続いてクリック分解作用の提案される機序。（ｂ）Ａｃ４ＭａｎＡｚのＮｅｕ５Ａｚ（Ｎ－アセチルノイラミン酸アジド，N-Acetylneuraminic acid azide）への変換、及びその後のグリカンへの導入、次いで、ＲＮＡへの結合。その後、ＤＢＣＯベースのクリック分解剤による銅フリークリック反応（ＳＰＡＡＣ）が即座の塩基促進ＲＮＡ分解を促進するだろう。 （ａ）クリック生成物を形成するためのＭａｎＮＡｚ又はＭａｎＮＡｃとクリック分解剤との間の反応の概略図、及び（ｂ）ＤＢＣＯベースのクリック分解剤のみ（上）及び３０分間３７℃でのＤＭＥＭ細胞培地＋４％ＤＭＳＯ下でのＭａｎＮＡｚによるクリック官能基化後（下）のＨＰＬＣクロマトグラム。（ｃ）ＤＢＣＯベースのクリック分解剤のみ（上）及び３０分間３７℃でのＤＭＥＭ細胞培地＋４％ＤＭＳＯ下での対照ＭａｎＮＡｃによるクリック官能基化後（下）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 グリコＣＬＩＣＫ－ｓｅｑを使用して実施した報告されるグリコＲＮＡ転写産物についての検証試験を示す図である。（ａ）グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑワークフロー（上）。プローブ用の糖アナログ及びグリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑを促進するためのクリック分解剤の選択（下）。（ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲベースの検証；Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ（左上）、Ａｃ４ＦｕｃＡｚ（右上）、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ（中央下）を使用したグリコＣＬＩＣＫ－ＳｅｑプラットフォームからのパネルグリコＲＮＡ転写産物にわたって、処理した「クリック」細胞における相対的発現を対照非処理細胞と比較する ｎ＝３、＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１、ｎｓ＝有意でない（ｐ≧０．０５）。エラーバーはＳＤを表す。
本発明は、二機能性プローブを触媒剤として使用して標的核酸分子を非酵素的に切断することができるという発見に関する。本明細書に記載される二機能性プローブを使用した標的核酸分子の選択的切断は、エピジェネティック及びエピトランスクリプトーム分析二機能性マッピング、並びに治療、例えば抗ウイルス治療において有用であり得る。
本発明は、標的核酸分子を切断する方法を提供する。本方法は、標的核酸分子を二機能性プローブと接触させて、それにより、二機能性プローブが標的核酸分子に共有結合するステップと、二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップとを含む。
二機能性プローブの標的核酸への結合は、中間体種を介して進行し得る。すなわち、標的核酸分子を二機能性プローブに結合させて式（６）：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ～ＮＡ （６）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡは標的核酸に結合している結合部分であり、～は共有結合であり、ＮＡは標的核酸である）
を有する中間体を生成するステップと；
二機能性プローブが標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含む方法によって、標的核酸分子を本明細書に記載されるように切断することができる。
一部の実施形態では、標的核酸分子を溶液中で二機能性プローブと接触させることができる。
より好ましくは、標的核酸分子を細胞内で（すなわち、細胞内部で）二機能性プローブと接触させることができる。細胞はインビトロであり得、単離細胞、例えば単離細胞株又は個体（組織試料、例えば生検）から単離した細胞であり得る。
適切な細胞には、哺乳動物、好ましくはヒト細胞が含まれ得る。細胞には体細胞及び生殖系列細胞が含まれ、幹細胞、例えば成体若しくは体性幹細胞、胎生幹細胞又は胚性幹細胞を含む、完全若しくは部分分化細胞又は非分化若しくは多能性細胞を含む任意の発達段階であり得る。例えば、細胞には、ニューロン及びグリア細胞を含む神経細胞、収縮筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、ホルモン合成細胞、脂腺細胞、膵島細胞、副腎皮質細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮及び尿路上皮細胞、骨細胞、並びに軟骨細胞が含まれ得る。一部の実施形態では、細胞が疾患状態に関連し得る、例えばがん細胞、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、芽腫又は生殖系列腫瘍細胞、及び遺伝性障害の遺伝子型を有する細胞、例えばハンチントン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、フェニルケトン尿症、ダウン症候群又はマルファン症候群。
標的核酸分子は、細胞内に存在する内因性核酸であり得る。二機能性プローブは外因性分子であり得る。方法は、二機能性プローブを細胞内に導入するステップと、これを標的核酸分子に共有結合させることを可能にするステップとを含み得る。
標的核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。適切な標的ＲＮＡ分子には、ｍＲＮＡ及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が含まれ得る。ＲＮＡ分子は、イントロン及び遺伝子間領域を含み得る。
二機能性プローブは、式：
Ｃ－Ｌ－Ｂ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは結合部分である）
を有する。
二機能性プローブの切断部分は、標的核酸分子と反応して標的核酸分子を切断することができる反応性基を含む。典型的には、切断部分が、リボース糖の２’位でヒドロキシル基からプロトンを抜き取ることができる。切断部分が、銅と結合して銅媒介ＲＮＡ分解を誘導することができてもよい（Li, Zhong-Rui, et al. Nat Chem 11.10 (2019): 880-889；Wong, K, et al. Can J Biochem 52.11 (1974): 950-958；Subramaniam, Siddharth, et al. F1000Research 4 (2015)）。
切断部分は、塩基性基を含み得る。すなわち、切断部分は、水素カチオン（Ｈ＋）を受容することができる基を含み得る。典型的には、塩基性基が電子対を供与することができ得る。
基の塩基度は、関連する共役酸のｐＫａを使用して定量的に評価され得る。すなわち、塩基性基［Ｂ］の塩基度は、共役酸［ＢＨ］＋のｐＫａを使用して評価され得る。共役酸のｐＫａは公知であり得るか、又は標準的な技術、例えば酸－塩基滴定を使用して決定され得る。切断部分は、６．０以上、例えば６．５以上又は７．０以上のｐＫａを有する共役酸を有する塩基性基を含み得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、この閾値より上のｐＫａ値を有する塩基性残基が、標的核酸内のホスホジエステル骨格の切断を可能にするために、リボース糖の２’位でヒドロキシル基を脱プロトン化することができると考えている。
好ましくは、切断部分が、孤立電子対を有する窒素原子を含み得る。孤立電子対を有する窒素原子を含む切断基は、典型的には銅を配位することができる。
切断部分は、孤立電子対を有する窒素原子を含むヘテロアリール基であり得るか、又はこれを含み得る。ヘテロアリール基は、１又は２以上の環原子がヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳである芳香環を含むアリール基である。ヘテロアリール基はＣ５－１５ヘテロアリール基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ５－１５）は、炭素原子であれヘテロ原子であれ、環原子の数又は範囲を表す。ヘテロアリール基は単環式であり得るか、又は２若しくは３以上の環を含み得る。
適切な窒素原子を含む単環式Ｃ５－１５ヘテロアリール基の例としては、イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、テトラゾール、ピリジン（アジン）、及びピラジン（１，４－ジアジン）に由来するものが挙げられる。
ヘテロアリール基は、縮合環系の一部であり得る。縮合環系において、ヘテロアリール基は、環の少なくとも１つが、１又は２以上の環原子がヘテロ原子である芳香環であり、各環が各隣接（縮合）環と２個の隣接環原子を共有する、２又は３以上の環を含む。よって、橋頭原子は直接結合している。
適切な窒素原子及び縮合環を含むＣ５－１５ヘテロアリール基の例としては、（Ｃ９）インドール、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンゾイミダゾール、アザインドール、ベンゾトリアゾール；（Ｃ１０）キノリン、イソキノリン、キノキサリン、フタラジン、キナゾリン、ナフチリジン、ピリドピリミジン、ピリドピラジン、プテリジン；（Ｃ１１）ベンゾジアゼピン；（Ｃ１３）ペリミジン、ピリドインドール；及び（Ｃ１４）フェナントロリンに由来するものが挙げられる。
ヘテロアリール基は非置換であり得るか、又は同じであっても異なっていてもよい置換された１つ、２つ若しくは３つのＣ１－６アルキル基であり得る。
アルキル基は一価飽和炭化水素基である。アルキル基は、Ｃ１－６アルキル基、例えばＣ１－４アルキル基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ１－６）は、炭化水素骨格中の炭素原子の数を表す。アルキル基は直鎖状又は分岐状であり得る。
Ｃ１－６直鎖状アルキル基の例としては、メチル（－Ｍｅ）、エチル（－Ｅｔ）、ｎ－プロピル（－ｎＰｒ）、ｎ－ブチル（－ｎＢｕ）、ｎ－ペンチル（－アミル）及びｎ－ヘキシルが挙げられる。Ｃ１－６分岐状アルキル基の例としては、イソ－プロピル（－ｉＰｒ）、イソ－ブチル（－ｉＢｕ）、ｓｅｃ－ブチル（－ｓＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチル（－ｔＢｕ）、イソ－ペンチル、ネオ－ペンチル、イソ－ヘキシル及びネオ－ヘキシルが挙げられる。
好ましくは、切断部分が、置換又は非置換イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、ベンゾイミダゾール及びアザインドールから選択される。
より好ましくは、切断部分が、置換又は非置換イミダゾール（１，３－ジアゾール）から選択される。このような場合、二機能性プローブがイミダゾールプローブと呼ばれ得る。このようなイミダゾールプローブは式：
Ｉ－Ｌ－Ｂ
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは結合部分である）
によって表され得る。
イミダゾールは７に近いｐＫａを有する。イミダゾールは、ヒスチジンの形態で、多くのリボヌクレアーゼ中の活性基である。イミダゾールは銅をキレート化することが知られている。一部の核酸切断天然産物、例えばブレオマイシンＡ５は、遷移金属結合のためのイミダゾール基を有する。
一部の好ましい実施形態では、切断部分が、式（Ｉ）～（III）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
＊は、プローブの残り（典型的には、リンカー単位Ｌ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される。
このような場合、二機能性プローブはイミダゾールプローブと呼ばれ得る。
好ましくは、切断部分が式（Ｉ）によって表される基である。
より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲＮが、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－４アルキル基を表す。
さらにより好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲＮが、それぞれ独立して、水素原子を表す。このような場合、切断部分が非置換イミダゾール基である。すなわち、切断部分が、式（IV）：
（式中、＊は、プローブの残り（典型的には、リンカー単位Ｌ）との結合位置を表す）
によって表される。
リンカー及び結合部分を通して標的核酸分子に共有結合する場合、イミダゾール基は、標的核酸分子と反応して１又は２以上のホスホジエステル結合を切断し、それによって、標的核酸分子の分解を引き起こす。例えば、結合プローブのイミダゾール基は、核酸分子上の２’Ｏ位からプロトンを抜き取って、標的核酸分子中のホスホジエステル結合の切断をもたらすことができる。考えられる機序を図１ｄに示す。さらに、イミダゾール基は、標的核酸分子中のホスホジエステル結合を切断する銅錯体を形成し得る。考えられる機序を図１ｅに示す。
二機能性プローブのリンカーＬは、切断部分（Ｃ）を結合部分（Ｂ）に接続（すなわち、共有結合接続）するための基を含む。適切なリンカーは当技術分野で周知である。
典型的には、リンカーが、自由原子価の１つが切断部分（Ｃ）との単結合の一部を形成し、残りの自由原子価が結合部分（Ｂ）との単結合の一部を形成する二価基を含む。
好ましくは、リンカーが安定なリンカーである。すなわち、リンカーが、インビボで実質的に切断も分解もされない基を含む。安定なリンカーは、典型的には生理的ｐＨで非反応性であり、インビボで酵素作用によって実質的に分解されない。
典型的には、リンカーがフレキシブルリンカーである。すなわち、リンカーが、切断部分（Ｃ）及び結合部分（Ｂ）が高い自由度で互いに移動することを許す。
典型的なリンカーは、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン及びヘテロアリーレンから選択される基を含む。共有結合接続に異なる基、例えばアルキレン－アリーレン（アラルキレン）及びヘテロアルキレン－アリーレンを含む混合リンカーが許され得る。
アルキレン（アルカンジイル）基は、２個の自由原子価がそれぞれ隣接原子との単結合の一部を形成する二価飽和炭化水素基である。アルキレン基は、Ｃ１－６アルキレン基、例えばＣ１－４、Ｃ１－３又はＣ１－２アルキレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ１－６）は、炭化水素骨格中の原子の数を表す。アルキレン基は直鎖状又は分岐状であり得る。直鎖状アルキレン基の例としては、メタンジイル（メチレン架橋）、エタン－１，２－ジイル（エチレン架橋）、プロパン－１，３－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル及びヘキサン－１，６－ジイルが挙げられる。分岐状アルキレン基の例としては、エタン－１，１－ジイル及びプロパン－１，２－ジイルが挙げられる。
ヘテロアルキレン基は、１又は２以上の炭素原子がヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳで置き換えられているアルキレン基である。ヘテロアルキレン基は、Ｃ１－６ヘテロアルキレン基、例えば、Ｃ１－４、Ｃ１－３又はＣ１－２ヘテロアルキレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ１－６）は、炭素原子であれヘテロ原子であれ、ヘテロアルキレン骨格中の原子の数を表す。ヘテロアルキレン基は直鎖状又は分岐状であり得る。直鎖状ヘテロアルキレン基の例としては、オキシメチレン（例えば、ポリオキシメチレン（polyoxymethylene）、ＰＯＭ）、エチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ＰＥＧ）、エチレンイミン（例えば、直鎖状ポリエチレンイミン（polyethylenimine）、ＰＥＩ；ポリアジリジン）及びテトラメチレングリコール（例えば、ポリテトラメチレングリコール（polytetramethylene glycol）、ＰＴＭＥＧ；ポリテトラヒドロフラン）に由来するものが挙げられる。分岐状ヘテロアルキレン基の例としては、プロピレングリコール（例えば、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol）ＰＰＧ）に由来するものが挙げられる。窒素原子がヘテロアルキレン基中に存在する場合、その窒素原子は非置換（ＮＨ）であり得るか、又はアルキル基で置換されていてもよい。硫黄原子がヘテロアルキル基中に存在する場合、その硫黄原子はＳ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ）２であり得る。
シクロアルキレン基は、環原子の全てが炭素原子である環を含み、２個の自由原子価がそれぞれ隣接原子との単結合の一部を形成する二価飽和炭化水素基である。シクロアルキレン基はＣ５－６シクロアルキレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ５－６）は、環原子の数又は範囲を表す。シクロアルキレン基は単環式であり得る。単環式シクロアルキレン基の例としては、１，３－シクロペンチレン及び１，４－シクロへキシレンが挙げられる。
ヘテロシクロアルキレン（ヘテロシクレン）基は、１又は２以上の炭素原子がヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳで置き換えられており、１又は２以上の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有するシクロアルキレン基である。ヘテロシクロアルキレン基はＣ５－６ヘテロシクロアルキレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ５－６）は、炭素原子であれヘテロ原子であれ、環原子の数又は範囲を表す。ヘテロシクロアルキレン基は単環式であり得る。窒素原子がヘテロアルキレン基中に存在する場合、その窒素原子は非置換（ＮＨ）であり得るか、又はアルキル基で置換されていてもよい。硫黄原子がヘテロアルキル基中に存在する場合、その硫黄原子はＳ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ）２であり得る。
アリーレン基は、環原子の全てが炭素原子である芳香環を含み、２個の自由原子価がそれぞれ隣接原子との単結合の一部を形成する二価炭化水素基である。アリーレン基はＣ６－１０アリーレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ６－１０）は、環原子の数又は範囲を表す。アリーレン基は単環式であり得るか、又は２若しくは３以上の環を含み得る。単環式アリーレン基の例としては、１，４－フェニレンが挙げられる。二環式アリーレン基の例としては、２，６－ナフチレンが挙げられる。
ヘテロアリーレン基は、１若しくは２以上の環原子がヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳであるか、又は１若しくは２以上の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有する芳香環を含むアリーレン基である。ヘテロアリーレン基はＣ６－１０ヘテロアリーレン基であり得る。この文脈において、接頭辞（例えば、Ｃ６－１０）は、炭素であれヘテロ原子であれ、環原子の数又は範囲を表す。ヘテロアリーレン基は単環式であり得るか、又は２若しくは３以上の環を含み得る。単環式ヘテロアリーレン基の例としては、ピロリレン及びピリジレンが挙げられる。
好ましいリンカーは、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択される基を含む。より好ましいリンカーはヘテロアルキレン基を含む。さらにより好ましいリンカーはポリアルキレングリコール基を含む。最も好ましいリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）基を含む。
リンカーは長さが異なり得る。典型的には、リンカーは２又は３以上の繰り返し単位を含有する。典型的には、リンカーは最大で１０個の繰り返し単位を含有する。すなわち、リンカーは、
－Ｌｎ－
（式中、ｎは２～１０である）
として表され得る。
好ましくは、ｎが２～８である。より好ましくは、ｎが４～８である。さらにより好ましくは、ｎが６である。
特に好ましいリンカー（Ｌ）は、エチレンオキシド単位（－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）を含むポリエチレングリコール基［ＰＥＧ］に由来する。ＰＥＧリンカーの結合基（又は切断基）への結合は、典型的には末端酸素原子を置換して、末端エチレン基（－ＣＨ２ＣＨ２－）を残す。
特に好ましいリンカーは、６個のエチレンオキシド単位を含むポリエチレングリコール［ＰＥＧ］６に由来する。［ＰＥＧ］６に由来するリンカーは、式－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５－ＣＨ２ＣＨ２－を有する。
二機能性プローブの結合部分は、標的核酸分子に共有結合することができる基を含む。
二機能性プローブは標的核酸に共有結合する。例えば、本明細書に記載される標的核酸分子を切断する方法は、標的核酸分子を二機能性プローブと反応させて式（６）：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ （６）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡは標的核酸に共有結合している結合部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を有する中間体を生成するステップと；
二機能性プローブが標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、標的核酸がパートナー部分Ｐでタグ付けされ得る。標的核酸のパートナー部分は、二機能性プローブの結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合し得る。例えば、方法は、パートナー部分でタグ付けされた標的核酸分子を、式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブと接触させるステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
典型的には、結合部分ＢＣがパートナー部分Ｐと反応して、プローブを標的核酸に共有結合する基ＢＡを形成する。共有結合部分（ＢＣ）は、パートナー部分と共有結合を形成することができる任意の反応性基を含み得る。
結合部分のパートナー部分への共有結合は、任意の簡便な化学的カップリング手順を通して達成され得る。好ましくは、生体直交型化学反応が使用される。すなわち、生体系（例えば、細胞）内の天然の生化学的プロセスを妨害することなく、系の内部で起こり得る化学反応である。好ましくは、クリックケミストリーが使用される。このような場合、結合部分及びパートナー部分は、クリック反応で反応することができる任意の２つの基を表す。
共有結合部分は、アジド（－Ｎ３）、ニトロン（Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）若しくはテトラジンから選択される基であり得るか、又はこれを含み得る。
好ましくは、共有結合部分がアジド基（－Ｎ３）であるか、又はこれを含む。
パートナー部分は、結合部分と共有結合を形成することができる任意の反応性基を含み得る。
パートナー部分は、アルキニル、アルケニル若しくはイソシアニド（－Ｎ＋≡Ｃ－）から選択される基であり得るか、又はこれを含み得る。
あるいは、結合部分及びパートナー部分を逆にしてもよい。ここでは、共有結合部分が、アルキニル、アルケニル若しくはイソシアニド（－Ｎ＋≡Ｃ－）から選択される基であり得るか、又はこれを含み得；パートナー部分が、アジド（－Ｎ３）、ニトロン（Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）若しくはテトラジンから選択される基であり得るか、又はこれを含み得る。
一部の実施形態では、共有結合部分がアルキンであるか、又はこれを含み、パートナー部分がアジド（－Ｎ３）基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、共有結合部分がニトロン（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））であるか、又はこれを含み、パートナー部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、共有結合部分がニトロン（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））であるか、又はこれを含み、パートナー部分がアルケニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、共有結合部分がテトラジンであるか、又はこれを含み、パートナー部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、共有結合部分がテトラジンであるか、又はこれを含み、パートナー部分がイソシアニド（－Ｎ＋≡Ｃ－）基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、共有結合部分がニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）であるか、又はこれを含み、パートナー部分がアルケニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がアルキンであるか、又はこれを含み、共有結合部分がアジド（－Ｎ３）基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がニトロン（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））であるか、又はこれを含み、共有結合部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がニトロン（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））であるか、又はこれを含み、共有結合部分がアルケニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がテトラジンであるか、又はこれを含み、共有結合部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がテトラジンであるか、又はこれを含み、共有結合部分がイソシアニド（－Ｎ＋≡Ｃ－）基であるか、又はこれを含む。
一部の実施形態では、パートナー部分がニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）であるか、又はこれを含み、共有結合部分がアルケニル基であるか、又はこれを含む。
アルキニル（アルキン）基は、１又は２以上の炭素－炭素三重結合を含有する一価不飽和炭化水素基である。アルケニル基はＣ２－２０アルケニル基、例えばＣ２－１０、Ｃ２－６又はＣ２－４アルケニル基であり得る。アルケニル基は直鎖状又は分岐状であり得る。アルケニル基は環系に組み込まれ得る。環系への組み込みにより、銅フリー、歪み促進型クリック反応の使用が可能になる。
直鎖状アルキニル基の例としては、エチニル及び２－プロピニル（プロパルギル）が挙げられる。環系に組み込まれたアルキニル基の例としては、シクロオクチン（ＯＣＴ，cyclooctyne）、アリールレスオクチン（ＡＬＯ，aryl-less octyne）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ，monofluorinated cyclooctyne）、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ，difluorocyclooctyne）、ジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ，dimethoxyazacyclooctyne）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ，dibenzocyclooctyne）、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ，dibenzoazacyclooctyne）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ，biarylazacyclooctynone）、ビシクロノニン（ＢＣＮ，bicyclononyne）、２，３，６，７－テトラメトキシジベンゾシクロオクチン（ＴＭＤＩＢＯ，2,3,6,7-tetramethoxydibenzocyclooctyne）、スルホニル化ジベンゾシクロオクチン（Ｓ－ＤＩＢＯ，sulfonylated dibenzocyclooctyne）、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン（ＣＯＭＢＯ，carboxymethylmonobenzocyclooctyne）及びピロロシクロオクチン（ＰＹＲＲＯＣ，pyrrolocyclooctyne）が挙げられる。
環系に組み込まれたアルキニル基の例としては、歪み(strained)アルキニル基、例えばジベンゾシクロオクチニル（ＤＢＣＯ，dibenzocyclooctynyl）基、ビアリールアザシクロオクチノニル（ＢＡＲＡＣ，biarylazacyclooctynonyl）基、又はジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ，difluorocyclooctyne）基が挙げられる。これらの基の誘導体を使用してもよい。適切な誘導体の例は、ジベンゾシクロオクチン－アミノ基（ＤＢＣＯ－アミン）又はジベンゾシクロオクチン－カルバメート基（ＤＢＣＯ－カルバメート）である：

アルケニル基は、１又は２以上の炭素－炭素二重結合を含有する一価不飽和炭化水素基である。アルケニル基は、Ｃ２－２０アルケニル基、例えばＣ２－１０、Ｃ２－６又はＣ２－４アルケニル基であり得る。アルケニル基は環系に組み込まれ得る。環系への組み込みにより、銅フリー、歪み促進型クリック反応の使用が可能になる。
環系に組み込まれたアルケニル基の例としては、ノルボルネン、オキサノルボランジエン及びトランス－シクロオクテンが挙げられる。
好ましくは、パートナー部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む。より好ましくは、パートナー部分がプロパルギル基であるか、又はこれを含む。
共有結合部分がアジド基（－Ｎ３）を含む場合、結合部分は、アジド－アルキン環化付加（ＡＡＣ，azide-alkyne cycloaddition）、例えば銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ，copper (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition）又は歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ，strain-promoted azide-alkyne cycloaddition）を通して、アルキン（Ｃ≡Ｃ）を含むパートナー部分と反応し得る。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物が１，２，３－トリアゾール部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡは１，２，３－トリアゾール部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
共有結合部分がニトロン基（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない、例えばＲ’はＨ又はＣ１－４アルキルであり、Ｒ’’はＣ１－４アルキルである））を含む場合、結合部分は、１，３－双極子環化付加を通してアルキンを含むパートナー部分と反応し得る。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物がイソオキサゾリン部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡはイソオキサゾリン部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
共有結合部分がニトリルオキシド基（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）である場合、結合部分は、１，３－双極子環化付加を通してアルケン（Ｃ＝Ｃ）、例えばノルボルネンを含むパートナー部分と反応し得る。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物がイソオキサゾール部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡはイソオキサゾール部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
共有結合部分がテトラジン基である場合、結合部分は、逆電子要請型(an inverse-electron demand)ディールスアルダー反応、引き続いてレトロディールスアルダー反応を通して、アルケン（Ｃ＝Ｃ）、例えばトランス－シクロオクテンを含むパートナー部分と反応し得る。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物がジヒドロピリダジン部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡはジヒドロピリダジン部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
あるいは、テトラジン共有結合部分は、［４＋１］環化付加、引き続いてレトロディールスアルダー反応を通して、イソシアニド部分（－Ｎ＋≡Ｃ－－）を含むパートナー部分と反応し得る。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物がピラゾール部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡはピラゾール部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
共有結合部分がアルキニル基を含む場合、結合部分は、アジド－アルキン環化付加（ＡＡＣ）、例えば銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）又は歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）を通して、アジド基（－Ｎ３）を含むパートナー部分と反応し得る。好ましくは、結合部分がアルキニル基を含む場合、結合部分は、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）を通して、パートナー部分と反応する。このような場合、結合部分とパートナー部分との間の反応の生成物が１，２，３－トリアゾール部分である。すなわち、反応が、中間体：
Ｃ－Ｌ－ＢＡ－ＮＡ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＡは１，２，３－トリアゾール部分であり、ＮＡは標的核酸である）
を通して進行し得る。
好ましい実施形態では、パートナー部分がアルキニル基、例えばプロパルギル基であり、共有結合部分がアジド基である。このような場合、方法が、アルキニル基でタグ付けされた標的核酸分子を、式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブと反応させて、アジド基がアルキニル基と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
さらに好ましい実施形態では、方法が、アルキニル基でタグ付けされた標的核酸分子を、式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する二機能性プローブと反応させて、アジド基がアルキニル基と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
他の好ましい実施形態では、パートナー部分がアジド（－Ｎ３）基であり得るか、又はこれを含み得、共有結合部分がアルキニル基（－Ｃ≡Ｃ－）であるか、又はこれを含む。このような場合、方法が、アジド基でタグ付けされた標的核酸分子を、式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはアルキン基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブと反応させて、アルキン基がアジド基と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるステップと；
二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
別の好ましい実施形態では、方法が、アジド基でタグ付けされた標的核酸分子を、式（３Ｂ）：
Ｃ－Ｌ－ＤＢＣＯ （３Ｂ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基、又はジベンゾシクロオクチン誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する二機能性プローブと反応させて、ジベンゾシクロオクチン基又は誘導体がアジド基と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるステップと；
二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
別の好ましい実施形態では、方法が、アジド基でタグ付けされた標的核酸分子を、式（５Ａ）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基、又はジベンゾシクロオクチン誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する二機能性プローブと反応させて、ジベンゾシクロオクチン基又は誘導体がアジド基と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させるステップと；
二機能性プローブがそこに結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
方法が、標的核酸を二機能性プローブ及び銅、例えば銅（Ｉ）塩と反応させるステップを含んでもよい。適切な銅（Ｉ）塩は直接使用され得る。直接使用され得る銅（Ｉ）塩の例としては、臭化第一銅（ＣｕＢｒ）及びヨウ化第一銅（ＣｕＩ）が挙げられる。あるいは、適切な銅（Ｉ）塩は、銅（II）塩の還元によってその場で生成され得る。銅（II）塩の例としては、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）又は酢酸銅（Ｃｕ（ＯＡｃ）２）が挙げられる。還元剤の例としては、アスコルビン酸ナトリウムが挙げられる。最適には、銅結合配位子、例えばＴＨＰＴＡ（トリス（（１－ヒドロキシ－プロピル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミン，Tris((1-hydroxy-propyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)amine）が使用され得る。
銅の使用は、銅媒介ＲＮＡ分解を促進することによって切断反応にさらに役立ち得る。
方法が、標的核酸を二機能性プローブ及び亜鉛、例えば亜鉛（II）塩と反応させるステップを含んでもよい。使用され得る亜鉛（II）塩の例としては、臭化亜鉛（ＺｎＢｒ２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）及びヨウ化亜鉛（ＺｎＩ２）が挙げられる。
亜鉛の使用は、ＲＮＡ分解を促進することによって切断反応にさらに役立ち得る。
標的核酸分子は、核酸修飾酵素によってパートナー部分でタグ付けされ得る。適切な核酸修飾酵素には、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えばＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＭＥＴＴＬ４及びＮ６ＡＭＴ１；ＤＮＡヒドロキシル－メチル化酵素、例えばＴＥＴ１及びＴＥＴ２；ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、例えばＮ－アセチルトランスフェラーゼ１０（ＮＡＴ１０）；並びにＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、例えばオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）が含まれる。
標的核酸は、核酸修飾酵素によって修飾される部位（すなわち、核酸修飾の部位）を含み得る。例えば、この部位は、核酸修飾酵素によって、化学修飾基、例えばメチル、アセチル又はグリコシル基でタグ付けされ得る。核酸修飾酵素は、核酸修飾の部位で、パートナー部分で標的核酸をタグ付けし得る。例えば、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼは、核酸のアデノシン残基のＮ６位をメチル化し得る。本明細書に記載される方法では、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼが、標的核酸のアデノシン残基のＮ６位で、パートナー部分で標的核酸をタグ付けし得る。
細胞内の標的核酸を選択的に切断する方法は、
細胞内で、標的核酸分子、核酸修飾酵素、及びパートナー部分を含む補因子アナログを接触させて、修飾酵素がパートナー部分で標的核酸をタグ付けするステップと；
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合した標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
補因子(a cofactor)は、核酸修飾酵素が触媒活性になるために要求される非タンパク質化合物である。補因子は、化学修飾基、例えばメチル、アセチル又はグリコシル基を含み得る。補因子が化学修飾基を供与して、核酸修飾酵素が修飾の部位で化学修飾基を標的核酸に結合して、例えば標的核酸をメチル化、アセチル化又はグリコシル化し得る。
補因子アナログは、核酸修飾酵素の補因子として作用する非タンパク質化合物である、すなわち、核酸修飾酵素は補因子アナログの存在下で触媒活性である。一部の実施形態では、補因子アナログがパートナー部分を含み得る。補因子アナログがパートナー部分を供与して、核酸修飾酵素が修飾の部位でパートナー部分を標的核酸に結合し得る。
好ましくは、標的核酸分子を、細胞内で核酸修飾酵素及び補因子アナログと接触させる。核酸修飾酵素及び標的核酸分子は細胞にとって内因性であり得る、すなわち、核酸修飾酵素及び標的核酸分子は細胞内に天然に存在し得る。
本発明の好ましい態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。ＲＮＡメチルトランスフェラーゼで使用するのに適した補因子アナログには、Ｓ－アデノシルメチオニンアナログ、例えばプロパルギルＳｅＡｄｏＹｎ（プロパルギルＳｅ－アデノシル－Ｌ－セレノメチオニン）及びプロパルギルＳＡｄｏＹｎ（プロパルギルＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン）が含まれ得る：

（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合する反応性基を含むパートナー部分である）。
一部の好ましい実施形態では、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、及びパートナー部分を含むＲＮＡメチルトランスフェラーゼ補因子アナログを接触させて、それにより、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼがパートナー部分で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
適切な補因子アナログには、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ，S-adenosylmethionine）アナログ、例えばＳｅＡｄｏＹｎが含まれ得る。例えば、適切な方法は、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、及びアルキニル基を含むＳＡＭアナログ、例えばＳｅＡｄｏＹｎを接触させて、それにより、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼがアルキニル基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、二機能性プローブがアルキニル基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
好ましい実施形態では、方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、及びアルキニル基を含むＳＡＭアナログ、例えばＳｅＡｄｏＹｎを接触させて、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼがアルキニル基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、それにより、二機能性プローブがアルキニル基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の実施形態では、補因子アナログが外因性であり得、細胞に導入され得る。例えば、方法が、補因子アナログを細胞に導入するステップを含み得る。
他の実施形態では、補因子アナログが、細胞内で外因性補因子アナログ前駆体から生成され得る。例えば、方法が、補因子アナログ前駆体を細胞内に導入して、補因子アナログ前駆体が細胞内で補因子アナログに変換されるステップを含み得る。外因性補因子アナログ前駆体から補因子アナログを生成することは、前駆体がより長い半減期を有し得る（より安定な化合物であり得る）ので、有利であり得る。
補因子アナログ前駆体は、細胞によって代謝されて補因子アナログを産生する分子である。例えば、補因子アナログ前駆体、例えばメチオニンアナログは、細胞内で内因性アデノシルトランスフェラーゼ、例えばメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ，methionine adenosyltransferase）によってアデノシル化されて、補因子アナログ、例えばＳ－アデノシルメチオニンアナログを生成し得る。
本発明の一部の態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。適切な補因子アナログには、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）アナログ、例えばＳｅＡｄｏＹｎが含まれ得る。細胞内でＳＡＭアナログを生成するのに適した補因子アナログ前駆体には、メチオニンアナログ、例えばＰｒｏｐＳｅＭｅｔ（プロパルギル－セレノメチオニン）及びＰｒｏｐＳＭｅｔ（プロパルギルメチオニン）が含まれ得る：


（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含むパートナー部分である）。
したがって、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
パートナー部分を含むメチオニンアナログを細胞内に導入し、
細胞がメチオニンアナログをアデノシル化してＳ－アデノシルメチオニンアナログを生成し；
Ｓ－アデノシルメチオニンアナログが、パートナー部分で標的ＲＮＡ分子をタグ付けするＲＮＡメチルトランスフェラーゼの補因子を形成するステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
ＰｒｏｐＳｅＭｅｔを細胞内に導入し
それにより、細胞がＰｒｏｐＳｅＭｅｔをアデノシル化してＳｅＡｄｏＹｎを生成し；
ＳｅＡｄｏＹｎがＲＮＡメチルトランスフェラーゼと反応して、プロパルギル基で標的ＲＮＡ分子のアデノシンの６位をタグ付けするステップと、
式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、二機能性プローブがプロパルギルタグと反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する。
本発明の他の態様では、標的核酸がＤＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＳＡＭ依存性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼで使用するのに適した補因子アナログ及び補因子アナログ前駆体は上に記載される。
本発明の他の態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡアセチルトランスフェラーゼであり得る。適切な補因子アナログには、アセチル－ＣｏＡアナログ、例えばプロパルギルアセチル－ＣｏＡ及び１－ブチニルアセチル－ＣｏＡが含まれ得る：

（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含むパートナー部分である）。
これらの態様では、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、及びパートナー部分を含むＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ補因子アナログを接触させて、それにより、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼがパートナー部分で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
適切なＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ補因子アナログには、アセチル補酵素Ａ（アセチル－ＣｏＡ）アナログ、例えば３－ブチノイル補酵素Ａ（３－ブチノイル－ＣｏＡ）が含まれ得る。例えば、適切な方法は、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、及びアルキニル基を含むアセチル－ＣｏＡアナログ、例えば３－ブチノイル－ＣｏＡを接触させて、それにより、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼがアルキニル基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、二機能性プローブがアルキニル基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
好ましい実施形態では、方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、及びアルキニル基を含むアセチル－ＣｏＡアナログ、例えば３－ブチノイル－ＣｏＡを接触させて、それにより、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼがアルキニル基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、二機能性プローブがアルキニル基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
補因子アナログは外因性であり得、細胞に導入され得るか、又は補因子アナログは、細胞内で外因性補因子アナログ前駆体から生成され得る。補因子アナログ前駆体は、チオール基を含む内因性酵素、例えば補酵素Ａにより細胞内でチオエステル化されて、補因子アナログ、例えばアセチル－ＣｏＡアナログを生成し得るアセテートアナログであり得る。
本発明の一部の態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡアセチルトランスフェラーゼであり得る。細胞内でアセチル－ＣｏＡアナログを生成するのに適した補因子アナログ前駆体には、アセテートアナログ、例えばカルボン酸及びピルビン酸、並びにカルボン酸エステル及びピルビン酸エステル、例えば以下が含まれ得る：

（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含むパートナー部分である）。
Ｃ１－６アルキルブチノエートエステル、Ｃ１－６アルキルペンチノエートエステル、ピルビン酸アナログ及びピルビン酸エステルアナログが好ましい。
Ｃ１－６アルキルブチノエートエステル、例えばエチル－３－ブチノエート、及びＣ１－６アルキルペンチノエートエステル、例えばエチル－４－ペンチノエートが特に好ましい。
したがって、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
パートナー部分を含むアセテートアナログを細胞内に導入し、
それにより、細胞がアセテートアナログをチオエステル化してアセチル－ＣｏＡアナログを生成し；
アセチル－ＣｏＡアナログが、パートナー部分で標的ＲＮＡ分子をタグ付けするＲＮＡアセチルトランスフェラーゼの補因子を形成するステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
エチル－３－ブチノエートを細胞内に導入し、
それにより、細胞がエチル－３－ブチノエートをチオエステル化して３－ブチノイル－ＣｏＡを生成し；
３－ブチノイル－ＣｏＡがＲＮＡアセチルトランスフェラーゼと反応して、アルキニル基、例えば３－ブチノイル基で標的ＲＮＡ分子のシチジンの４位をタグ付けするステップと、
式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、二機能性プローブがアルキニルタグと反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
他の実施形態では、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法が、
エチル－４－ペンチノエートを細胞内に導入し、
それにより、細胞がエチル－４－ペンチノエートをチオエステル化して４－ペンチノイル－ＣｏＡを生成し；
４－ペンチノイル－ＣｏＡがＲＮＡアセチルトランスフェラーゼと反応して、アルキニル基、例えば４－ペンチノイル基で標的ＲＮＡ分子のシチジンの４位をタグ付けするステップと、
式（３）：
Ｃ－Ｌ－Ｎ３ （３）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーである）
を有する二機能性プローブを細胞に導入して、二機能性プローブがアルキニルタグと反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する。
本発明の他の態様では、標的核酸がＤＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＤＮＡアセチルトランスフェラーゼであり得る。ＤＮＡアセチルトランスフェラーゼはアセチル－ＣｏＡ依存性ＤＮＡアセチルトランスフェラーゼであり得る。ＤＮＡアセチルトランスフェラーゼとの使用に適した補因子アナログ及び補因子アナログ前駆体は上に記載される。
本発明の他の態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡグルコシルトランスフェラーゼであり得る。ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼとの使用に適した補因子アナログには、単糖アナログ、例えばアジド（Ｎ３）基を含むＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、マンノース、グルコース又はフコースのアナログ、及びこれらの単糖アナログに由来し得るモノマー単位を含むグリカンが含まれ得る。適切な単糖アナログの例としては、Ｎ－アジドアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｚ，N-azidoacetylneuraminic acid）、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｚ，N-azidoacetylmannosamine）、Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ，N-azidoacetylglucosamine）、及び６－アジドフコース（ＦｕｃＡｚ，6-azidofucose）が挙げられる：


（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合する反応性基を含むパートナー部分である）。
Ｎ－アジドアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｚ）、及びＮｅｕ５Ａｚを含むグリカンが特に好ましい。
したがって、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、及びパートナー部分を含むＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ補因子アナログを接触させて、それにより、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼがパートナー部分で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
適切なＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ補因子アナログには、単糖アナログ、例えばアジド（Ｎ３）基を含むＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、マンノース、グルコース又はフコースのアナログ、及びこれらの単糖アナログに由来し得るモノマー単位を含むグリカンが含まれ得る。例えば、適切な方法は、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、及びアジド基を含む単糖アナログ、例えばＮｅｕ５Ａｚ、又は単糖アナログを含むグリカンを接触させて、それにより、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼがアジド基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはアルキニル基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、それにより、二機能性プローブがアジド基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
好ましい実施形態では、前記方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、及びアジド基を含む単糖アナログ、例えばＮｅｕ５Ａｚ、又は単糖アナログを含むグリカンを接触させて、それにより、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼがアジド基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（３Ｂ）：
Ｃ－Ｌ－ＤＢＣＯ （３Ｂ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、それにより、二機能性プローブがアジド基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
好ましい実施形態では、前記方法が、
細胞内で、標的ＲＮＡ分子、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、及びアジド基を含む単糖アナログ、例えばＮｅｕ５Ａｚ、又は単糖アナログを含むグリカンを接触させて、それにより、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼがアジド基で標的ＲＮＡ分子を共有結合的にタグ付けするステップと；
式（５Ａ）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、それにより、二機能性プローブがアジド基と反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
補因子アナログは外因性であり得、細胞に導入され得る、又は補因子アナログは、細胞内で外因性補因子アナログ前駆体から生成され得る。補因子アナログ前駆体は、細胞内で内因性酵素によって修飾されて補因子アナログを生成し得る単糖アナログであり得る。
細胞内での補因子アナログ前駆体の修飾は、単糖アナログからＮ－アセチルノイラミン酸アナログを生成し、引き続いてＮ－アセチルノイラミン酸アナログをグリカンに組み込むことを含み得る。例えば、補因子前駆体は、代謝されてＮ－アセチルノイラミン酸アナログを生成し、次いで、グリカンに組み込まれ得るマンノースアナログであり得る。
細胞内での補因子アナログ前駆体の修飾は、単糖アナログを修飾し、引き続いて代謝された単糖アナログをグリカンに組み込むことを含み得る。例えば、補因子前駆体は、細胞内で脱アセチル化されて単糖アナログを生成し得るアセチル化フコースアナログ又はアセチル化グルコースアナログであり得る。次いで、単糖アナログがグリカンに組み込まれ得る。
本発明の一部の態様では、標的核酸がＲＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼであり得る。適切な補因子アナログには、単糖アナログ、例えばアジド（Ｎ３）基を含むＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、マンノース、グルコース又はフコースのアナログ、及びこれらの単糖アナログに由来し得るモノマー単位を含むグリカンが含まれ得る。細胞内で単糖アナログ、又は単糖アナログを含むグリカンを生成するのに適した補因子アナログ前駆体には、アセチル化単糖アナログ、例えばＮ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアセチル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）、Ｎ－アジドアセチルグルコサミン－テトラセチル化（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）、又は６－アジドフコース－テトラアセチル化（Ａｃ４ＦｕｃＡｚ）が含まれ得る：

（式中、Ｐは、結合部分と反応して二機能性プローブを標的核酸分子に共有結合する反応性基を含むパートナー部分である）。
したがって、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
パートナー部分を含むアセチル化単糖アナログを細胞内に導入し、
それにより、細胞がアセチル化単糖アナログを脱アセチル化して単糖アナログを生成し；単糖アナログをグリカンに組み込んでもよく；
単糖アナログ又は単糖アナログを含むグリカンが、パートナー部分で標的ＲＮＡ分子をタグ付けするＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼの補因子を形成するステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブを標的ＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
例えば、細胞内の標的ＲＮＡ分子を選択的に切断する方法は、
Ａｃ４ＭａｎＮＡｚを細胞内に導入し、
それにより、細胞がＡｃ４ＭａｎＮＡｚを脱アセチル化してＮｅｕ５Ａｚを形成し；Ｎｅｕ５Ａｚをグリカンに組み込んでもよく；
Ｎｅｕ５Ａｚ又はグリカンがＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼと反応してアジド基で標的ＲＮＡ分子の核酸塩基をタグ付けするステップと、
式（３Ａ）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ≡Ｃ （３Ａ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣ≡Ｃはアルキニル基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入して、それにより、二機能性プローブがアジドタグと反応して標的ＲＮＡ分子に共有結合するステップと；
二機能性プローブがそこに共有結合したＲＮＡ分子を切断することを可能にするステップと
を含み得る。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（３Ｂ）：
Ｃ－Ｌ－ＤＢＣＯ （３Ｂ）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
一部のさらに好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５Ａ）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
本発明の他の態様では、標的核酸がＤＮＡ分子であり得、核酸修飾酵素がＤＮＡグリコシルトランスフェラーゼであり得る。ＤＮＡグリコシルトランスフェラーゼで使用するのに適した補因子アナログ及び補因子アナログ前駆体は上に記載される。
上記の二機能性プローブによる標的核酸分子の選択的切断後、方法は、標的核酸分子を特定するステップを含み得る。これは、例えば、核酸修飾酵素によって修飾されている部位のマッピングにおいて有用であり得る。
例えば、方法は、細胞内の１又は２以上の核酸分子の豊富な存在量（abundance）又は量を決定するステップを含み得る。対照細胞と比較した細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量の減少は、核酸分子が、二機能性プローブによって選択的に切断されている標的核酸分子であることを示し得る。
方法は、細胞から全核酸、例えば全ＤＮＡ又は全ＲＮＡを抽出するステップを含み得る。核酸をさらに分析して、例えば１又は２以上の核酸分子の豊富な存在量又は量を決定することができる。例えば、抽出された全核酸を配列決定し、配列読み取りを分析することができる。
細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量を決定する適切な方法は当技術分野で周知であり、これにはＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－シーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ，RNA-sequencing）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ，next generation sequencing）及び他のシーケンシング技術、例えばサンガーシーケンシング、ＴＩＤＥ（Tracking Indels by Composition）（Brinkman et al Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16; 42(22): e168）並びにＰＣＲ分析が含まれる。一部の実施形態では、方法が、細胞から核酸分子を抽出するステップと、抽出された核酸分子を配列決定するステップと、各抽出された核酸分子について配列読み取りの数（すなわち、リードカウント）を決定して、細胞内の各核酸分子の豊富な存在量又は量を決定するステップとを含み得る。一部の実施形態では、生のリードカウントを、ＲＰＫＭ（１００万リード当たりのエクソンモデルのキロベース当たりの読み取り，reads per kilobase of exon model per million reads）又はＦＰＫＭ（マッピングされた１００万リード当たりのエクソンモデルのキロベース当たりのフラグメント，fragments per kilobase of exon model per million reads mapped）で正規化し、表すことができる。配列決定及び配列分析の適切な方法は当技術分野で十分に確立されている。
本明細書に記載される補因子アナログ前駆体を使用してパートナー部分で標識された核酸分子の豊富な存在量又は量は、任意の簡便な技術、例えばナノポアセンシングによって決定され得る（例えば、Shi et al Anal Chem. 2017 Jan 3; 89(1): 157-188参照）。
一部の実施形態では、細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量を、上記の選択的切断に供されていない対照細胞と比較して決定することができる。例えば、適切な対照細胞には、（ｉ）二機能性プローブで処理されているが、補因子アナログでもその前駆体でも処理されていない細胞、（ii）上記の補因子アナログ若しくはその前駆体で処理されているが、二機能性プローブで処理されていない細胞、及び／又は（iii）上記の補因子アナログでもその前駆体でも二機能性プローブでも処理されていない細胞が含まれる。対照細胞と比較した細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量の減少は、核酸分子が細胞内で修飾酵素によって修飾されていることを示し得る。
一部の実施形態では、細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量を、選択された核酸修飾酵素が不活性化されている対照細胞と比較して決定することができる。対照細胞と比較した細胞内の核酸分子の豊富な存在量又は量の減少は、核酸分子が選択された核酸修飾酵素によって修飾されていることを示し得る。
これは、例えば、核酸修飾酵素による細胞内の核酸の修飾をマッピングするのに有用であり得る。
細胞内の核酸修飾酵素による核酸分子の修飾を決定する方法は、
第２の細胞が、第１の細胞と比較して核酸修飾酵素の発現又は活性の低下又は消失している、第１の細胞及び第２の細胞を用意するステップと、
パートナー部分を含む補因子アナログ前駆体を第１及び第２の細胞に導入し、
それにより、補因子アナログ前駆体が第１及び第２の細胞内で補因子アナログに変換され、
前記補因子アナログが核酸修飾酵素の補因子であり、それにより、修飾部位を含有する細胞内の核酸分子が、核酸修飾酵素の存在下で、パートナー部分でタグ付けされるステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブをパートナー部分でタグ付けされた核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと、
二機能性プローブが二機能性プローブに共有結合した第１及び第２の細胞内の核酸分子を切断することを可能にするステップと、
第２の細胞と比較して減少した量で第１の細胞に存在する核酸分子を特定し、
前記特定された１又は２以上の核酸分子が、核酸修飾酵素による修飾部位を含有するステップと
を含み得る。
核酸修飾酵素は、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えばＳＡＭ依存性Ｎ６－アデノシンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡグルコシルトランスフェラーゼ、ＲＮＡアセチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼ、ＤＮＡグリコシルトランスフェラーゼ及びＤＮＡアセチルトランスフェラーゼを含み得る。
例えば、細胞内のＲＮＡメチルトランスフェラーゼによるＲＮＡ分子のメチル化を決定する方法は、
第２の細胞が、第１の細胞と比較してＲＮＡメチルトランスフェラーゼの発現又は活性の低下又は消失している、第１の細胞及び第２の細胞を用意するステップと、
パートナー部分を含むメチオニンアナログを第１及び第２の細胞に導入し、
それにより、メチオニンアナログが第１及び第２の細胞内でＳ－アデノシルメチオニンアナログにアデノシル化され、
前記Ｓ－アデノシルメチオニンアナログがＲＮＡメチルトランスフェラーゼの補因子であり、それにより、メチル化部位を含有する細胞内のＲＮＡ分子が、細胞内でＲＮＡメチルトランスフェラーゼの存在下で、パートナー部分でタグ付けされるステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブをパートナー部分でタグ付けされたＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと、
二機能性プローブが二機能性プローブに共有結合した第１及び第２の細胞内の核酸分子を切断することを可能にするステップと、
第２の細胞と比較して減少した量で第１の細胞に存在するＲＮＡ分子を特定し、
前記特定されたＲＮＡ分子が、核酸修飾酵素によるメチル化部位を含有するステップと
を含み得る。
メチオニンアナログ、Ｓ－アデノシルメチオニンアナログ、及び二機能性プローブの好ましい実施形態は上に示される。
例えば、細胞内のＲＮＡアセチルトランスフェラーゼによるＲＮＡ分子のアセチル化を決定する方法は、
第２の細胞が、第１の細胞と比較してＲＮＡアセチルトランスフェラーゼの発現又は活性の低下又は消失している、第１の細胞及び第２の細胞を用意するステップと、
パートナー部分を含むアセテートアナログを第１及び第２の細胞に導入し、
それにより、アセテートアナログが第１及び第２の細胞内でアセチル－ＣｏＡアナログにチオエステル化され、
前記アセチル－ＣｏＡアナログがＲＮＡアセチルトランスフェラーゼの補因子であり、それにより、アセチル化部位を含有する細胞内のＲＮＡ分子が、細胞内でＲＮＡアセチルトランスフェラーゼの存在下で、パートナー部分でタグ付けされるステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブをパートナー部分でタグ付けされたＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと、
二機能性プローブが二機能性プローブに共有結合した第１及び第２の細胞内の核酸分子を切断することを可能にするステップと、
第２の細胞と比較して減少した量で第１の細胞に存在するＲＮＡ分子を特定し、
前記特定されたＲＮＡ分子が、核酸修飾酵素によるアセチル化部位を含有するステップと
を含み得る。
アセテートアナログ、アセチル－ＣｏＡアナログ、及び二機能性プローブの好ましい実施形態は上に示される。
例えば、細胞内のＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼによるＲＮＡ分子のグリコシル化を決定する方法は、
第２の細胞が、第１の細胞と比較してＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼの発現又は活性の低下又は消失している、第１の細胞及び第２の細胞を用意するステップと、
パートナー部分を含むアセチル化単糖アナログを第１及び第２の細胞に導入し、
それにより、アセチル化単糖アナログが第１及び第２の細胞内で単糖アナログに脱アセチル化され、単糖アナログがグリカンに組み込まれてもよく、
前記単糖アナログ、又は単糖アナログを含むグリカンがＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼの補因子であり、それにより、グリコシル化部位を含有する細胞内のＲＮＡ分子が、細胞内でＲＮＡグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、パートナー部分でタグ付けされるステップと、
式（１）：
Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、パートナー部分と反応して二機能性プローブをパートナー部分でタグ付けされたＲＮＡ分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
を有する二機能性プローブを細胞内に導入するステップと、
二機能性プローブが二機能性プローブに共有結合した第１及び第２の細胞内の核酸分子を切断することを可能にするステップと、
第２の細胞と比較して減少した量で第１の細胞に存在するＲＮＡ分子を特定し、
前記特定されたＲＮＡ分子が、核酸修飾酵素によるグリコシル化部位を含有するステップと
を含み得る。
単糖アナログ、アセチル化単糖アナログ、及び二機能性プローブの好ましい実施形態は上に示される。
本発明のさらなる態様は、式：
Ｉ－Ｌ－Ｂ
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、Ｂは核酸分子に共有結合する結合部分である）
を有する二機能性プローブを提供する。
好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（４）：
Ｉ－Ｌ－Ｎ３ （４）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、Ｎ３はアジド基である）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０である）
を有する。
別の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（４Ａ）：
Ｉ－Ｌ－ＤＢＣＯ （４Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
一部の好ましい実施形態では、二機能性プローブが式（５Ａ）：
Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
（式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾール基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
を有する。
別の好ましい実施形態では、二機能性プローブが、以下に示される化合物Ｄｅｇ－１～Ｄｅｇ－３から選択される：
ＲＮＡ分子は、第１及び第２の細胞内のＲＮＡ分子を配列決定し、第１及び第２の細胞内のＲＮＡ分子の配列読み取りの数を決定することによって特定され得る。例えば、細胞内の全ＲＮＡが配列であり得る。適切な技術は十分に確立されており、ナノポアセンシングを含む。
本発明の他の態様は、本明細書に記載される核酸を切断する方法に使用するためのキットを提供する。キットは、式：
Ｃ－Ｌ－Ｂ
（式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは核酸分子に共有結合する結合部分である）
を有する二機能性プローブを含み得る。
適切な二機能性プローブは上に記載される。
キットは、亜鉛又は銅、例えば銅（Ｉ）塩又は銅（II）塩をさらに含み、還元剤をさらに含んでもよい。適切な銅塩及び還元剤は上に記載される。
一部の実施形態では、キットが、細胞内の核酸の修飾を決定する方法に有用であり得る。キットは、補因子アナログ前駆体又は補因子アナログをさらに含み得る。適切な補因子アナログ前駆体及び補因子アナログは上に記載される。
キットは、例えば対照として使用するための、１又は２以上の細胞、例えば哺乳動物、好ましくはヒト細胞をさらに含み得る。適切な細胞には、核酸修飾酵素が不活性化されている細胞が含まれ得る。一部の実施形態では、キットが、核酸修飾酵素が不活性化されている第１の細胞と核酸修飾酵素が不活性化されていない第２の細胞のアイソジェニック細胞のペアを含み得る。
キットは、ＤＮＡｓｅ及び／又はＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含み得る。適切な阻害剤は商業的供給源から入手可能である。
キットは、対照核酸をさらに含み得る。例えば、キットは、本明細書に記載される修飾及び切断に供されている陽性対照並びに／又は本明細書に記載される修飾及び切断に供されていない陰性対照を含み得る。
キットは、本明細書に記載される修飾について分析される検証された遺伝子座の増幅用の核酸プライマーをさらに含み得る。適切なプライマーは、標準的な技術によって生成され得るか、又は商業的供給業者から入手され得る。
キットは、構成要素、例えば試料回収用の装置、試料チューブ、ホルダー、トレイ、ラック、皿、プレート、及び他の試料取り扱い容器（このような構成要素は一般に無菌である）、キット使用者のための使用説明書、溶液又は他の化学試薬、例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡの単離及び精製試薬、並びに方法に必要とされる他の試薬、例えば緩衝液、配列決定試薬及び他の試薬、並びに標準化、正規化に使用される試料、並びに／又は対照試料をさらに含み得る。
本発明の他の態様は、核酸分子を切断する方法における本明細書に記載される二機能性プローブの使用を提供する。核酸分子を切断する適切な方法は上に記載される。
本発明の他の態様及び実施形態は、「含む」という用語が「からなる」という用語によって置き換えられた上記の態様及び実施形態並びに「含む」という用語が「から本質的になる」という用語によって置き換えられた上記の態様及び実施形態を提供する。
文脈上別段の解釈が必要でない限り、本出願が、上記の態様及び上記の実施形態のいずれかの互いの全ての組合せを開示することが理解されるべきである。同様に、文脈上別段の解釈が必要でない限り、本出願は、単独で又は他の態様のいずれかと合わせた好ましい及び／又は任意の特徴の全ての組合せを開示する。
上記実施形態の修正、さらなる実施形態及びその修正は、本開示を読めば当業者に明らかであり、よって、これらは本発明の範囲内にある。
本明細書で言及される全ての文献及び配列データベース入力は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの指定された特徴又は成分の各々の他方を含む又は含まない具体的な開示とみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、あたかも各々が本明細書に個別に示されているように、（ｉ）Ａ、（ii）Ｂ並びに（iii）Ａ及びＢの各々の具体的な開示とみなされるべきである。
一般的な実験プロトコル
インビトロクリック分解剤官能基化反応(in vitro Click-Degrader functionalisation reactions)
標準反応では、ＣｕＳＯ４（最終濃度１．０ｍＭ）、ＴＨＰＴＡ（３．０ｍＭ）、クリック分解剤（２．０ｍＭ）及びＲＮＡオリゴ（２００μＭ）を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１００ｍＭ ＫＣｌを補充したｐＨ７．５又はｐＨ３ ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）緩衝液に添加した。ＮａＡｓｃ（５０ｍＭ）を添加することによって、ＣｕＡＡＣを開始した。次いで、反応混合物を３７℃でインキュベートした。ＮａＡｓｃを添加してＲＮＡオリゴの完全な官能基化を可能にした２０分後に、検量線を作成するための反応をＥＤＴＡ（１２ｍＭ）でクエンチした。ＮａＡｓｃを添加した２０分後に、プレクエンチングを伴う反応をＥＤＴＡ（１２ｍＭ）又はバソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ，bathocuproinedisulfonic acid）（３ｍＭ）でクエンチした。クエンチ後、ＬＣＭＳを使用して反応混合物を分析した。存在するＲＮＡ種の素性を質量によって決定した（表１）。非標準反応については、条件を本文中で特定する。
インビトロ銅フリークリック分解剤官能基化反応
標準反応では、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｚ、Sigma社製）（５００μＭ）又はＮ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を、ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ細胞培地（最終４％ＤＭＳＯ）中ＤＢＣＯクリック分解剤（５００μＭ）に添加した。次いで、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応物をトリフェニルホスフィン（２ｍＭ）の添加によってクエンチし、ＨＰＬＣ－ＬＣＭＳを使用して分析して、クロマトグラムを作成したところ、反応完了を示した。非標準反応については、条件を本文中で特定する。
クリック反応のＬＣＭＳ分析
Acquity UPLC BEH C18 １．７μｍカラムを使用したAcquity UPLCシステムに連結したXevo G2-S TOF質量分析計を使用して、低分子を分析した。システムはエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオン化を利用する。２つの移動相を使用した－Ｈ２Ｏ中０．１％ＦＡ及びＭｅＣＮ中０．１％ＦＡ、流量０．２００ｍＬ／分。低分子についての検量線はＡ２６０シグナルに基づいた。製造業者の使用説明書に従って、MassLynxソフトウェア（Waters社製のv.4.1）にプレインストールされたMaxEntアルゴリズムを使用してトータルマススペクトルをイオン系列から再構築した。
オリゴヌクレオチドのＬＣＭＳ分析
Acquity UPLC BEH Ｃ１８ １．７μｍカラムを使用したAcquity UPLCシステムに連結したXevo G2-S TOF質量分析計を使用してオリゴマーを分析した。システムはエレクトロスプレー（ＥＳＩ，electrospray ionisation）イオン化を利用する。２つの移動相を使用した－Ｈ２Ｏ中１６．３ｍＭ ＴＥＡ、４００ｍＭ ＨＦＩＰ及び８０：２０ｖ／ｖ ＭｅＣＮとＨ２Ｏ中１６．３ｍＭ ＴＥＡ、４００ｍＭ ＨＦＩＰ、流量０．２００ｍＬ／分。ＲＮＡ種についての検量線はＡ２６０又は指定された負のｍ／ｚシグナルの強度のいずれかに基づいた（図５ｅ～図５ｈ）。KNIMEソフトウェアプラットフォームのネイティブモジュールを使用して積分ピークの強度を計算した（Freitas, A. A., Comprehensible classification models: a position paper. SIGKDD Explor. Newsl. 2014, 15 (1), 1-10）。製造業者の使用説明書に従って、MassLynxソフトウェア（Waters社製のv.4.1）にプレインストールされたMaxEntアルゴリズムを使用してトータルマススペクトルをイオン系列から再構築した。記載される陰イオン系列を得るために、積分及びさらなる分析のためにクロマトグラムのオリゴマーピークを選択した。
細胞培養
１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Gibco社製）中でＭＯＬＭ１３細胞を培養した。１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ（Gibco社製）中で２９３Ｔ細胞を培養した。
細胞培養（ａｃＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ用）
１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Gibco社製）中でＭＯＬＭ１３細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ２で、標準スクリューキャップレッドを備えたＴ７５又はＴ１７５ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）標準培養フラスコ中で全ての細胞を増殖させた。細胞を、８５％を超える生存率で維持し、３日毎に（又は必要に応じて）継代した。ショートタンデムリピート（ＳＴＲ，short tandem repeat）プロファイリングを使用して全ての細胞を認証した。全ての細胞がマイコプラズマ汚染陰性であることを試験した。８０％を超える生存率での実験のためにのみ細胞を播種した。
細胞培養（グリコＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ用）
１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Gibco社製）中でＨｅＬａ細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ２で、標準スクリューキャップレッドを備えたＴ７５又はＴ１７５ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）標準培養フラスコ中で全ての細胞を増殖させた。細胞を、８５％を超える生存率で維持し、３日毎に（又は必要に応じて）継代した。ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングを使用して全ての細胞を認証した。全ての細胞がマイコプラズマ汚染陰性であることを試験した。８０％を超える生存率での実験のためにのみ細胞を播種した。
レンチウイルスベクター産生、感染及びトランスフェクション
ウイルス産生のために、２９３Ｔ細胞にレンチウイルスベクターｐＬＫＯ．１をパッケージングプラスミドＰＡＸ２及びＶＳＶｇと合わせて１：１．５：０．５の比でトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後及び７２時間後に上清を採取した。１×１０６個の細胞及びウイルス上清を、８μｇ／ｍｌ－１ポリブレン（Millipore社製）を補充した２ｍＬ細胞培地で混合し、引き続いてスピンフェクション（spinfection）（６０分間、９００ｇ、３２℃）し、３７℃で一晩さらにインキュベートした。翌日に培地を新たにし、形質導入細胞をさらに培養した。
コンディショナルノックダウン及びイントロン欠失含有細胞の作製
ヒトＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１６又はスクランブル対照のコード配列に対するｓｈＲＮＡを発現するpLKO-TETon-Puroレンチウイルスベクターを使用して、製造業者の使用説明書に従って、Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen社製）を使用してＭＯＬＭ－１３細胞をトランスフェクトした。スピンフェクションの２４時間後、細胞を、１μｇ／ｍｌ－１のピューロマイシンを含有する新たな培地に再度蒔き、選択培地中で７日間維持した。細胞を２００ｎｇ／ｍＬ－１のテトラサイクリンで３日間処理することによって、抗ＭＥＴＴＬ３及びスクランブルｓｈＲＮＡを誘導し、２日間の同一の処理によって、抗ＭＥＴＴＬ１６を誘導した。
以前報告されたように（Tzelepis, K., CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Rep. 2016, 17 (4), 1193-1205）、二重ｇＲＮＡベクターを使用して、ｇＲＮＡアッセイを実施した。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を回収した。全てのトランスフェクション及びウイルス回収を１５ｃｍプレートで、以下に言及されるように実施した。ウイルス産生のために、４７．５μＬのTransIT LT1（Mirus社製）及び６００μＬのOpti-MEM（Invitrogen社製）を使用して、２９３Ｔ細胞に５μｇの上記プラスミド及び５μｇのpsi-Ecoパッケージングベクターを液滴トランスフェクトした。得られたウイルス上清を採取し、６ウェルプレートで細胞の形質導入を実施した。形質導入後、形質導入細胞をＢＦＰ（ｇＲＮＡ）について選別した。ｇＲＮＡ配列を表３に列挙する。
細胞ＲＮＡ分解反応（Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑ）
ＭＯＬＭ１３細胞を、１，０００，０００細胞／ｍＬ－１の密度で、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したメチオニンフリーＲＰＭＩ－１６４０培地（Gibco社製）に懸濁した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてＰｒｏｐＳｅＭｅｔを最終濃度１５０μＭで添加した。処理細胞を３７℃でさらに１６時間インキュベートした。予備混合したＣｕＳＯ４及びＴＨＰＴＡの水溶液を、それぞれ最終濃度１００μＭ及び３００μＭで添加し、引き続いて４００μＭのクリック分解剤１及び５ｍＭのＮａＡｓｃを添加した。処理細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。その後、細胞を再び３７℃でインキュベートし、ＲＮＡ抽出のために５時間後に採取した。
細胞ＲＮＡ分解反応（ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ）
ＭＯＬＭ１３細胞を、１，０００，０００細胞／ｍＬ－１の密度で、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Gibco社製）に懸濁した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてエチル－３－ブチノエートを最終濃度２００μＭで添加した。処理細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。予備混合したＣｕＳＯ４及びＴＨＰＴＡの水溶液を、それぞれ最終濃度１００μＭ及び３００μＭで添加し、引き続いて４００μＭのクリック分解剤１及び５ｍＭのＮａＡｓｃを添加した。処理細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。その後、細胞を再び３７℃でインキュベートし、ＲＮＡ抽出のために３０分後に採取した。
細胞ＲＮＡ分解反応（グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ）
ＨｅＬａ細胞を、１，０００，０００細胞／ｍＬ－１の密度で、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Gibco社製）に懸濁した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いてアジド糖Ｎ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアセチル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ、Sigma社製）、又は１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、Carbosynth社製）、又は６－アジドフコース－テトラアセチル化（Ａｃ４ＦｕｃＡｚ、図１３ｄで合成される）を最終濃度１００μＭで添加した。処理細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。細胞を、最終濃度２５０μＭでＤＢＣＯ－ｄｅｇを含む培地に再懸濁した。処理細胞を３７℃で１時間インキュベートし、０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡの添加によって切断し、完全ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、ＲＮＡ抽出のために採取した。
ｍ６Ａ ＲＮＡ免疫沈降
RNAeasy midiキット（Qiagen社製）を使用して、ドキシサイクリン投与の８日後に、ＭＯＬＭ－１３対照、Δイントロン、ＭＥＴＴＬ３－ＫＤ又はＭＥＴＴＬ１６－ＫＤ細胞（各ｓｈＲＮＡについて２つの独立した生物学的反復）から全ＲＮＡを単離した。続いて、NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（New England Biolabs社製）を使用して、３００μｇの全ＲＮＡからポリＡ濃縮ＲＮＡを精製した。５００ｎｇのポリＡ＋精製ＲＮＡを各免疫沈降反応に使用した。製造業者の使用説明書に従って、Magna MeRIP m6Aキット（Millipore社製）を使用してｍ６Ａ ＲＮＡ免疫沈降を実施した。ＲＴ－ｑＰＣＲを介して、免疫沈降したＲＮＡを分析した。
ＲＮＡ抽出、逆転写及びＲＴ－ｑＰＣＲ
製造業者の使用説明書に従って、RNAeasy Mini Kit（Qiagen社製）を使用して、ペレット化細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造業者の使用説明書に従って、Dynabeads mRNA精製キット（Invitrogen社製）を使用して、２０μｇの全ＲＮＡをポリＡ含有配列について濃縮した。製造業者の使用説明書に従って、SuperScript Vilo Master Mix（Invitrogen社製）を使用して、１μｇの全ＲＮＡ及び前のステップからのポリＡ濃縮ＲＮＡの全てをレトロ転写した（retrotranscribed）。製造業者の使用説明書に従って、StepOnePlus Real-Time PCR Systemのファストモード（Applied Biosystems社製）及びFast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems社製）を使用して、特定のＲＮＡレベルを測定した。全ＲＮＡを使用した反応については、ＲＮＡレベルをリボソームの１８Ｓサブユニットに正規化した。ポリＡ濃縮ＲＮＡを使用した反応については、ＲＮＡレベルをＲＰＬ３２ ｍＲＮＡに正規化した。試験した様々な条件下でレベルの変動が最も少なかったので、これらのハウスキーピング遺伝子を選択した。プライマー配列を表２に列挙する。
ＲＮＡ抽出、逆転写及びＲＴ－ｑＰＣＲ（ａｃＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ及びグリコＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ用）
製造業者の使用説明書に従って、Qiazol（Qiagen社製）を使用して、ペレット化細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造業者の使用説明書に従って、SuperScript Vilo Master Mix（Invitrogen社製）を使用して、１μｇのQiazol抽出ステップからの全ＲＮＡをレトロ転写した。製造業者の使用説明書に従って、QuantStudio 3 Real-Time PCR Systemのファストモード（Applied Biosystems社製）及びPowerUp（商標）SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems社製）を使用して、特定のＲＮＡのレベルを測定した。ｑＰＣＲ分析においては、ＲＮＡレベルを５Ｓ遺伝子（ａｃＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ）又はＧＡＰＤＨ遺伝子（グリコＣＬＩＣＫ－ｓｅｑ）に正規化した。試験した様々な条件下でレベルの変動が最も少なかったので、これらのハウスキーピング遺伝子を選択した。プライマー配列を表２に列挙する。
統計分析
９５％の信頼区間で片側（処理群のシグナルの減少のみに興味がある場合）又は両側スチューデントのｔ検定を使用して、一般統計分析を行った。
タンパク質抽出及び免疫ブロット
細胞を、１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Sigma社製）及びホスファターゼ阻害剤（Sigma社製）を補充した全細胞溶解バッファー（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮＰ－４０及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad社製）でタンパク質量を推定した。タンパク質試料にＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料バッファーを補充し、ＤＴＴを各試料に添加した。同じ量のタンパク質をゲルの各トラックに添加し、ポリ二フッ化ビニリデン膜（Millipore社製）にブロットして、１０～４０μｇのタンパク質を４～１２％ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Invitrogen社製）で分離した。LumiGLO Chemiluminescent Substrate（KPL社製、５４－６１－００）及びＸ線フィルム（GE Healthcare社製）を使用して可視化を実施した。以下の抗体を使用した：Bethyl Laboratories社製の抗ＭＥＴＴＬ３（Ａ３０１－５６８Ａ）、Abcam社製の抗ＭＥＴＴＬ１６（ａｂ１８５９９０）、Abcam社製の抗ベータアクチン（ａｂ８２２７）、Abcam社製のヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（ａｂ２０５７１８）。
バイオインフォマティクス分析
製造業者の使用説明書に従って、RNAeasy Mini Kit（Qiagen社製）を使用して、ペレット化細胞から全ＲＮＡを抽出した。７５ｂｐペアエンドIllumina社製リードからなる全ての実験からのＲＮＡｓｅｑデータを、引数「--outSAMunmapped Within KeepPairs --outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated --chimSegmentMin 0 --chimJunctionOverhangMin 20」を使用して、STAR 2.7.1bによりヒトゲノムアッセンブリGRCh38にマッピングした。ＲＰＫＭ正規化を使用してdeepTools 3.3.2 bamCoverageによってＢｉｇＷｉｇファイルを作成した。Bedtools v2.29.0のインターセクト関数及びEnsembl GRCh38 Version 93から得られたエクソン領域を使用してエクソンリードを除去した。「view -f 128 -F 16」及び「-f 80」でSamtools 1.9を使用してフォワード鎖のリードを抽出し４６、１つのファイルに併合した。「view -f 144」及び「-f 64 -F 16」を使用してリバース鎖のリードを抽出し、併合した。引数「callpeak --broad --extsize=300 --keep-dup 20 --nomodel -g hs --broad-cutoff 0.9 --max-gap 500」を用いて、処理としてのＷＴ及び対照としてのＭＥＴＴＬ１６／ＭＥＴＴＬ３を使用して、MACS2 2.1.4によってブロードなピークを呼び出した。２回の反復間のピークの交点をとった。ＷＴと比較して減少したＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑのシグナルを示すピークを最終セットとして選択した。
モチーフを探すために、ピークのＤＮＡ配列をＧＲＣｈ３８ゲノムＦＡＳＴＡファイルから抽出した。パラメータ「-meme-nmotifs 30」を使用して、MEME-チップ5.0.5によってモチーフを発見した。遺伝子定量化のために、エクソン領域をEnsembl GRCh38バージョン93から入手した。各エクソンのリード数をカスタマイズコードによって計算し、ＲＰＫＭによって正規化した。３’バイアスを無効にするために、最も３’のエクソンのレベルを遺伝子の発現として使用した。
引数「--outFilterMismatchNoverReadLmax 0.05 --alignIntronMax 0」を用いてSTAR 2.7.1aを使用して、ｍｉＣＬＩＰ実験からのリードをGRCh38アセンブリに最初にマッピングすることによって、ｍ６Ａ部位を分析した。その後、それぞれ、引数「--normalizeUsing None -filterRNAstrand forward」及び「--normalizeUsing None -filterRNAstrand reverse」を用いてdeepTools 3.3.2のbamCoverage関数によって、フォワード及びリバースゲノムカバレッジトラックを作成した。非ゼロカバレッジの領域をカスタマイズコードによって抽出した。４回のｍｉＣＬＩＰ実行から呼び出された部位をユニオンセットに併合し、インプットデータ中にも存在するものを除去した。
ワンポット混合ＲＮＡ実験
ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を補充したＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４バッファー中プロパルギル化及び非プロパルギル化ＲＮＡ（それぞれ１００μＭ）を、クリック分解剤１（５ｍＭ）、ＴＨＰＴＡで錯化されたＣｕＳＯ４（３．６μＭ及び１ｍＭ）で処理し、ＮａＡｓｃ（５０ｍＭ）を添加することによって、クリック反応を誘因した。１４時間後、反応物をＥＤＴＡ（１２ｍＭ）でクエンチした。ｔ＝０及び１４時間で、ＬＣＭＳを介して、ＲＮＡに対する効果を分析した。
他の二価金属イオン実験の評価
ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を補充したＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４バッファー中ＲＮＡオリゴマー（２００μＭ）を、クリック分解剤１（４００μＭ）、ＴＨＰＴＡで錯化されたＣｕＳＯ４（７２０μＭ及び２００μＭ）で処理し、ＮａＡｓｃ（５ｍＭ）を添加することによって、クリック反応を誘因した。２０分後、銅をバソクプロインジスルホン酸（３００μＭ）でクエンチし、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４又はＺｎＣｌ２（１ｍＭ）を添加した。ＲＮＡを１４時間インキュベートし、反応物をＥＤＴＡ（１２ｍＭ）でクエンチした。ｔ＝０及び１４時間で、ＬＣＭＳを介して、ＲＮＡに対する効果を分析した。
化学合成
一般論
化学物質は、Fisher Chemicals社、Sigma-Aldrich社、Alfa-Aesar社、Fluorochem社又はBioSynth社から購入し、さらに精製することなく使用した。全ての溶媒は商業的に入手可能なグレードであった。全ての非水性反応は、特に明記しない限り、窒素雰囲気下、オーブン乾燥させたガラス器具で実施した。窒素ガスは、塩化カルシウムを通過させることにより予備乾燥させた。反応容器は、フラスコの液体レベルを加熱ブロックの液体レベルより下にして、砂を充填したサーモスタット制御ＤｒｙＳｙｎブロックを使用して加熱した。反応温度はサーモスタット設定点を指す。反応温度０℃は、外部氷／水スラリー冷却浴を指す。全ての試薬は商業的供給源から購入し、特に明記しない限り、さらに精製することなく使用した。ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＭｅＣＮは水素化カルシウムから蒸留した。ＴＨＦ及びＥｔ２Ｏは、ナトリウム線上で予備乾燥させ、次いで、水素化カルシウム及び水素化アルミニウムリチウムから蒸留した。石油エーテル、ｎ－ヘキサン及びＥｔＯＡｃはその場で蒸留した。「石油エーテル」は、４０～６０℃で回収された石油エーテルの蒸留物を指す。実験で使用される水は脱イオン化し、その場で調製した。
フラッシュカラムクロマトグラフィーはMerck社製のシリカゲル６０を使用して実施した。分析薄層クロマトグラフィーは、Merck社製のシリカゲル６０ Ｆ２５４を使用して実施し、ＵＶ（２５４ｎｍ）によって、ＫＭｎＯ４又は（ＮＨ４）４Ｃｅ（ＳＯ４）４溶液で染色することによって可視化した。ＮＭＲスペクトルは、400MHz AVIII HD Smart Probe Spectrometer又は600MHz Avance 600 BBI Spectrometerで記録した。ＨＰＬＣ分析及び精製は、NUCLEOSIL 100-5 C18セミ分取カラムを使用して、ThermoFisher Scientific社製のUltimate 3000 HPLCシステムで行った。０．１％ギ酸を含むｍｑＨ２Ｏ（Ａ）及びＨＰＬＣグレードＭｅＣＮ（Ｂ）を、流量３ｍＬ／分で、移動相として使用した。
化合物１７～２１については、特に明記しない限り、全ての非水性反応を、アルゴン雰囲気下、オーブン乾燥させたガラス器具で実施した。アルゴンガスは、塩化カルシウムを通過させることにより予備乾燥させた。反応容器は、フラスコの液体レベルを加熱ブロックの液体レベルより下にして、砂を充填したサーモスタット制御ＤｒｙＳｙｎブロックを使用して加熱した。
一般化学物質は、商業的供給源から購入し、特に明記しない限り、さらなる精製プロセスなしに使用した。ＤＣＭ、ＴＨＦ及びＥｔ２Ｏは、Grubbs及びPangbornの方法に従って、又は不活性雰囲気下での蒸留によって精製した（ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＭｅＣＮは水素化カルシウムから蒸留した。ＴＨＦ及びＥｔ２Ｏはナトリウム線上で予備乾燥させ、次いで、水素化カルシウム及び水素化アルミニウムリチウムから蒸留した）。ＥｔＯＡｃはその場で蒸留した。実験で使用される水は脱イオン化し、その場で調製した。
Material Harvest社製のシリカゲル６０Å（４０～６３μｍ）を使用して、フラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。分析薄層クロマトグラフィーは、Merck社製のシリカゲル６０ Ｆ２５４ １ｍｍガラスプレートを使用して実施し、ＵＶ（２５４ｎｍ）によって、又は既知の手順によって調製された示される溶液で染色することによって可視化した。
ＮＭＲスペクトルは、Bruker 400-Avance III HD、600MHz Avance 600 BBI分光計、400MHz Neo Prodigy、400-QNP Cryoprobe又は500-DCH Cryoprobe分光計で記録した。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ，parts per million）で報告し、スペクトルは残留溶媒ピークに較正する（１Ｈ ＮＭＲ：ＣＤＣｌ３δ７．２６ｐｐｍ、４４ ＤＭＳＯδ２．５０ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：ＣＤＣｌ３δ７７．１６ｐｐｍ、ＤＭＳＯδ３９．５２ｐｐｍ）。多重度は、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｍ（多重項）、ｄｄ（二重二重項）等として記載する。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で報告する。TopSpinソフトウェアバージョン3.5をシグナル処理に使用した。ｐｐｍ値の範囲が与えられる多重項シグナルを除いて、各ピークの中心を報告する。構造割り当ては、ケンブリッジ大学のNMR Spectrometry Serviceによって実施される、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ実験を用いて行う。
高分解能質量スペクトルは、Waters社製のLCT Premierを使用したケンブリッジ大学化学科のMass Spectrometry Service又はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法を使用したWaters社製のXevo G2-Spectrometerによって実施した。
合成の概要
ＰｒｏｐＳｅＭｅｔ（２）、クリック分解剤（７、８、及び９）及び直交保護されたＮ６－プロパルギルアデノシン（１６）の化学合成の概略的概要を図１０に示す。
セレノホモシステイン（１）
１００メッシュセレン粉（１．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）を絶対エタノール３５ｍＬに懸濁し、０℃に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（０．８７ｇ、２３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２時間還流した（溶液は深海老茶色になった）。反応容器に、α－アミノ－４－ブロモブタン酸臭化水素酸塩（３．００ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加すると、不透明な黄色混合物が急速に形成した。反応物を還流下で１８時間攪拌し、次いで、２Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬでクエンチした。回転蒸発によってバルク溶媒を除去した後、得られた残渣を５％ＨＣｌ １５ｍＬと混合した。次いで、この水溶液をＥｔ２Ｏ ４０ｍＬで３回洗浄し、真空濾過に供して不溶性物質を除去した。真空中で水性溶媒を除去した後、黄色固体が得られた。次いで、この半粗生成物を１Ｍ ＨＣｌ ８ｍＬに溶解し、Dowex（登録商標）50WX8イオン交換樹脂上で精製した。活性樹脂（１５ｍｌ）をＨ２Ｏ １００ｍＬで洗浄し、引き続いて半粗生成物を充填した。次いで、樹脂をＨ２Ｏさらに１００ｍＬで洗浄して未結合不純物を除去した。５％水酸化アンモニウム溶液を使用して、生成物を樹脂から溶出した。所望の生成物を含有する画分（山吹色溶液）を合わせた。バルク溶媒を除去した後、得られた黄色固体を真空中で乾燥させると、黄色粉末（１．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ、６０％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ ０．１％ＴＦＡ含有）δ４．０１（ｔ，２Ｈ）、２．９５（ｔｄ，４Ｈ）、２．２１～２．４３（ｍ，４Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ８Ｈ１７Ｎ２Ｏ４Ｓｅ２ ３６４．９５１３；実測値３６４．９５１４。
ＰｒｏｐＳｅＭｅｔ（プロパルギル－Ｌ－セレノメチオニン）（２）
１（１１９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＥｔＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、ＮａＢＨ４（１２４ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で１５分間攪拌した。ＮａＨＣＯ３（１５０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）及びトルエン中８０％臭化プロパルギル（２４５ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温でさらに２０時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、１％ＴＦＡを補充したｍｑＨ２Ｏ ５ｍＬに溶解した。ＨＣｌを使用して溶液をｐＨ＝３に調整し、ＨＰＬＣを介して生成物を精製し、生成物を含有する画分を凍結乾燥すると、白色粉末（４５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、３１％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ３．７８（ｔ，１Ｈ）、３．２５（ｄ，２Ｈ）、２．７９（ｔ，２Ｈ）、２．６０（ｔ，１Ｈ）、２．１７～２．３７（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δＣ １７３．１、８１．５、７２．４、５４．２、３１．３、１９．１、６．４。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ７Ｈ１２ＮＯ２Ｓｅ ２２２．００２４；実測値２２２．００２８。
ヘキサエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（３）
ヘキサエチレングリコール（２．０ｇ、７．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶解し、０℃に冷却し、引き続いてｐ－トルエンスルホニルクロリド（３．０ｇ、１４ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（３．２ｇ、５７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃で３時間及び室温で３０分間攪拌し、Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）でクエンチした。生成物をＤＣＭ（３ｘ２０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。有機溶媒を真空中で除去すると、生成物が無色油（３．９ｇ、６．５ｍｍｏｌ、９２％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７８（ｄ，４Ｈ）、７．３３（ｄ，４Ｈ）、４．１４（ｔ，４Ｈ）、３．６７（ｂｒ ｔｒ，４Ｈ，３．６０（ｂｒ ｓ，８Ｈ）、３．５７（ｂｒ ｓ，８Ｈ）、２．４３（ｂｒ ｓ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δＣ １４４．８、１３３．０、１２９．８、１２８．０、７０．５～７０．７（多重ＰＥＧピーク）、６９．３、６８．７、２１．７。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ２６Ｈ３９Ｏ１１Ｓ２の計算値ｍ／ｚ ５９１．１９３４；実測値５９１．１９３１。
ヘキサエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（４）
３（２．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。アジ化ナトリウム（２４２ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２下に置き、５５℃で１８時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配１：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ～ＡｃＯＥｔ）を介して生成物を精製した。生成物が淡黄色油（４４０ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、２８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８２（ｄ，２Ｈ）、７．３６（ｄ，２Ｈ）、４．１８（ｔ，２Ｈ）、３．５９～３．７３（２０Ｈ，ＰＥＧ）、３．４１（ｔ，２Ｈ）、２．４７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １４４．８、１３３．０、１２９．３、１２８．０、７０．５～７０．８（多重ＰＥＧピーク）、７０．０、６９．３、６８．７、５０．７、２１．７。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１９Ｈ３１Ｎ３ＮａＯ８Ｓの計算値ｍ／ｚ ４８４．１７３０；実測値４８４．１７２３。
テトラエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（５）
テトラエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（２．７ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。アジ化ナトリウム（３５５ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２下に置き、５５℃で１８時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ～１：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ）を介して生成物を精製した。生成物が無色油（７９８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、３９％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８２（ｄ，２Ｈ）、７．３７（ｄ，２Ｈ）、４．１９（ｔ，１Ｈ）、３．６０～３．７３（１２Ｈ，ＰＥＧ）、３．４０（ｔ，２Ｈ）、２．４７（ｓ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１５Ｈ２３Ｎ３ＮａＯ６Ｓの計算値ｍ／ｚ ３９６．１２０５；実測値３９６．１２０７。
ジエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（６）
ジエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（２．３ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。アジ化ナトリウム（３５３ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２下に置き、５５℃で１８時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ～１：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ）を介して生成物を精製した。生成物が無色油（６８１ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、４４％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８０（ｄ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，２Ｈ）、４．１７（ｔ，２）、３．７０（ｔ，２Ｈ）、３．６１（ｔ，２Ｈ）、３．３２（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｓ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ３ＮａＯ４Ｓの計算値ｍ／ｚ ３０８．０６８１；実測値３０８．０６７０。
クリック分解剤１（ヘキサエチレングリコールイミダゾレートアジド）（７）
イミダゾール（４４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中６０％分散体、２６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を０℃で無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に懸濁した。混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温に加温させ、３０分間攪拌した。４（２５０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を最初の混合物に添加した。次いで、これを５５℃で２０時間攪拌した。次いで、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（乾式充填、勾配ＥｔＯＡＣ～９：１ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）を介して、得られた残渣を精製した。生成物が無色油（１５４ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、８０％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＨ ７．５２（ｓ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、６．９８（ｓ，１Ｈ）、４．０９（ｔ，２Ｈ）、３．７２（ｔ，２Ｈ）、３．５５～３．７８（１８Ｈ，ＰＥＧ）、３．３６（ｔ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １３７．６、１２９．３、１１９．４、７０．６～７０．７（多重ＰＥＧピーク）、７０．０、５０．７、４７．０。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１５Ｈ２８Ｎ５Ｏ５の計算値ｍ／ｚ ３５８．２０９０；実測値３５８．２０８４。
クリック分解剤２（テトラエチレングリコールイミダゾレートアジド）（８）
イミダゾール（１８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中６０％分散体、１２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を０℃で無水ＤＭＦ（１ｍｌ）に懸濁した。混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温に加温させ、３０分間攪拌した。５（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を最初の混合物に添加した。次いで、これを５５℃で２０時間攪拌した。次いで、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（乾式充填、勾配ＥｔＯＡＣ～９：１ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）を介して、得られた残渣を精製した。生成物が無色油（５４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、７４％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｓ，１Ｈ）、４．１２（ｔ，２Ｈ）、３．７５（ｔ，２Ｈ）、３．６０～３．７１（１０Ｈ，ＰＥＧ）、３．３９（ｔ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １３７．６、１２９．２、１１９．４、７０．５～７０．７（多重ＰＥＧピーク）、７０．０、５０．７、４７．１。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１１Ｈ１９Ｎ５Ｏ３の計算値ｍ／ｚ ２７０．１５６６；実測値２７０．１５８２。
クリック分解剤３（ジエチレングリコールイミダゾレートアジド）（９）
イミダゾール（９３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中６０％分散体、５５．０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を０℃で無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に懸濁した。混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温に加温させ、３０分間攪拌した。６（３００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を最初の混合物に添加した。次いで、これを５５℃で２０時間攪拌した。次いで、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（乾式充填、勾配ＥｔＯＡＣ～９：１ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）を介して、得られた残渣を精製した。生成物が無色油（１３９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、７７％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５３（ｓ，１Ｈ）、７．０６（ｓ，１Ｈ）、６．９９（ｓ，１Ｈ）、４．１４（ｔ，２Ｈ）、３．７５（ｔ，２Ｈ）、３．６０（ｔ，２Ｈ）、３．３６（ｔ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １３７．５、１２９．４、１１９．４、７０．６、７０．１、５０．７、４７．１。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１１Ｈ１９Ｎ５Ｏ３の計算値ｍ／ｚ １８２．１０４２；実測値１８２．１０４１。
Ｎ６－アセチル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルアデノシン（１０）
アデノシン（２．０ｇ、７．５ｍｍｏｌ）に、ピリジン（１５ｍＬ）、及びＡｃ２Ｏ（７．０ｍＬ、７４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた白く濁った混合物を室温で一晩攪拌した。得られた溶液を５５℃で一晩加熱した。反応物を冷却させ、過剰のＥｔＯＨの添加によってクエンチした。溶媒を真空中で蒸発させた。微量のピリジンを除去するために、残渣を数回のＥｔＯＨと連続的に共蒸発させた。結果として生じた泡をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解した；イミダゾール（０．３ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩攪拌した。溶液をＤＣＭ（１５０ｍＬ）で希釈し、ブライン（４×４０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空中で除去すると、生成物が白色泡（３．１ｇ、７．１ｍｍｏｌ、９５％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ９．７９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、８．６６（ｓ，１Ｈ，）、８．３３（ｓ，１Ｈ）、６．２２（ｄ，１Ｈ）、５．９５（ｄｄ，１Ｈ）、５．６５（ｄｄ，１Ｈ）、４．４５～４．５２（ｍ，２Ｈ）、４．３３（ｄｄ，１Ｈ）、２．５９（ｓ，３Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、２．０４（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １７１．３、１７０．４、１６９．６、１６９．４、１５２．５、１５１．２、１４９．６、１４１．９、１２２．３、８６．３ ８０．３、７３．１、７０．６、６３．１、２５．７、２０．７、２０．５、２０．４。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ８の計算値ｍ／ｚ ４３６．１４６８；実測値４３６．１４５９。
Ｎ６－アセチル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチル－Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１１）
Ａｒ－雰囲気下、１０（３．１ｇ、７．１ｍｍｏｌ）の無水ＭｅＣＮ中攪拌溶液に、ＤＢＵ（３．２ｍＬ、２１．４ｍｍｏｌ）及びトルエン中８０％臭化プロパルギル（２．０ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた褐色混合物を室温で８時間攪拌した。混合物をＤＣＭ １５０ｍＬで希釈し、０．５Ｍ ＨＣｌ ５０ｍＬ、及びブライン１００ｍＬで３回抽出した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去すると、生成物が褐色泡（２．７ｇ、５．７ｍｍｏｌ、８０．４％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ８．８４（ｓ，１Ｈ）、８．２４（ｓ，１Ｈ）、６．２７（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）、５．９９（ｄｄ，１Ｈ）、５．７０（ｄｄ，１Ｈ）、５，１１（ｄｄ，２Ｈ）、４．４５～４．５４（ｍ，２Ｈ）、４．３７～４．４５（ｍ，１Ｈ）２．４０（ｓ，３Ｈ）、２．１８（ｓ，３Ｈ）、２．１５（ｓ，３Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｓ，Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １７０．９、１７０．３、１６９．６、１６９．４、１５２．６、１５２．５、１５２．２、１４２．３、１２６．９、８６．８、８０．４、７９．２、７３．１、７１．６、７０．５、６３．１、３６．４、２４．４、２０．８、２０．５、２０．４。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１９Ｈ２４Ｎ５Ｏ８の計算値ｍ／ｚ ４５０．１６１９；実測値４５０．１６２６。
Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１２）
１１（２．７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、ＥｔＯＨ中８Ｍ ＭｅＮＨ２ ２５ｍＬに溶解した。溶液を室温で３時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＡｃ １８０ｍＬ及びＥｔＯＨ ２０ｍｌに溶解した。有機層をブライン１８０ｍＬで抽出し、水層をＥｔＯＡｃ １０×１００ｍＬで洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去すると、黄色固体が得られた。ＥｔＯＡｃ １００ｍＬ及びＥｔ２Ｏ １００ｍＬを残渣に添加し、混合物を４℃で１６時間維持した。白色沈殿を濾過によって回収し、Ｅｔ２Ｏで洗浄すると、生成物が白色粉末（１．４ｇ、４．６ｍｍｏｌ、８１％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４０（ｓ，１Ｈ）、８．２９（ｓ，１Ｈ）、８．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．９１（ｄ，１Ｈ）、５．４９（ｄ，１Ｈ）、５．４０（ｄｄ，１Ｈ）、５．２３（ｄ，１Ｈ）、４．６１（ｄｄ，１Ｈ）、４．２８（ｄｄ，１Ｈ）、３．９８（ｄｄ，１Ｈ）、３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．０３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δＣ １５４．４、１５２．７、１４９．３、１４０．７、１２０．４、８８．４、８６．３、８２．３、７４．０、７２．９、７１．０、６２．１、２９．６。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１３Ｈ１５Ｎ５Ｏ４の計算値ｍ／ｚ ３０６．１２０２；実測値３０６．１２４６。
２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－３’，５’－Ｏ－（ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリレン）－Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１３）
１２（１．１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、引き続いてジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルビス（トリフルオロメタンスルホネート）（１．４ｍｌ、４．１ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を０℃で３０分間、次いで、室温で１５分間攪拌した。次いで、イミダゾール（１．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＢＤＭＳＣｌ（１．１ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間、次いで、６０℃で３時間攪拌した。次いで、溶媒の大部分を真空中で除去し、Ｅｔ２Ｏ ２００ｍＬに溶解し、Ｈ２Ｏ ４０ｍＬで３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した；溶媒を真空中で除去した。フラッシュクロマトグラフィー（３：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ）を介して粗生成物を精製した。収率８０％に相当する、白色粉末の生成物１．７ｇ（３．０ｍｍｏｌ）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４０（ｓ，１Ｈ）、７．８６（ｓ，１Ｈ）、６．７９（ｔ，１Ｈ）、５．９２（ｓ，１Ｈ）、４．６０（ｓ，１Ｈ）、４．４０～４．５５（ｍ，４Ｈ）、４．２１（ｄｔ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、２．２４（ｔ，１Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．０７（ｓ，９Ｈ）、１．０３（ｓ，９Ｈ）、０．９２（ｓ，９Ｈ）、０．１６（ｓ，３Ｈ）、０．１４（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １５４．１、１５３．２、１４８．７、１３８．５、１２０．６、９２．４、８０．３、７５．８、７５．５、７４．７、７１．３、６７．８、２７．５、２７．０、２５．９、２２．７、２０．３、１８．３、－４．３、－５．０。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ２７Ｈ４６Ｎ５Ｏ４Ｓｉ２の計算値ｍ／ｚ ５６０．３０８８；実測値５６０．３０９９。
２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１４）
１３（１．２３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＨＦ－ピリジン（１．２ｍＬ）をピリジン（１．２ｍＬ）で希釈し、反応混合物に添加し、室温に加温させ、引き続いて３０分間攪拌した。次いで、反応物をピリジン（２ｍＬ）及びＤＣＭ（６０ｍＬ）でクエンチした。次いで、これを飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４０ｍＬ）及びブライン（２ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（乾式充填、溶離液勾配５：１石油エーテル：ＡｃＯＥｔ～ＡｃＯＥｔ）を介して粗生成物を精製した。生成物が白色粉末（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、４８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４１（ｓ，１Ｈ）、７．７７（ｓ，１Ｈ）、６．６２（ｄ，１Ｈ）、６．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５，７５（ｄ，１Ｈ）、５．１４（ｄｄ，１Ｈ）、４．４９（ｓ，１Ｈ）、４．３４～４．３７（ｍ，２Ｈ）、３．９５（ｄ，１Ｈ）、３．７４（ｔ，１Ｈ）、２．８２（ｓ，１Ｈ）、２．３０（ｔ，１Ｈ）、０．８０（ｓ，９Ｈ）、－０．１５，（ｓ，３Ｈ）、－０．３６（ｓ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ１９Ｈ３０Ｎ５Ｏ４Ｓｉの計算値ｍ／ｚ ４２０．２０６７；実測値４２０．２０８２。
２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１５）
１４（４１０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴＣｌ（３９０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温で一晩１８時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣をカラム（勾配、ＤＣＭ＋１％ＮＥｔ３～４：１ＤＣＭ：ＡｃＯＥｔ＋１％ＮＥｔ３）で精製した。生成物が白色粉末（４９７ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、７０％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３５（ｓ，１Ｈ）、７．９９（ｓ，１Ｈ）、７．４５（ｄ，２Ｈ）、７．３４（ｄ，４Ｈ）、７．１８～７．３１（ｍ，３Ｈ）、６．８１（ｄ，４Ｈ） ６．０２（ｄ，１Ｈ）、５．８６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．９９（ｔ，１Ｈ）、４．４８（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、４．３４（ｍ，１Ｈ）、４．２５（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｄｄ，１Ｈ）、３．３８（ｄｄ，１Ｈ）、２．７０（ｄ，１Ｈ）、２．２８（ｔ，１Ｈ）、０．８４（ｓ，９Ｈ）、－０．０１，（ｓ，３Ｈ）、－０．１３（ｓ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ４０Ｈ４７Ｎ５ＮａＯ６Ｓｉの計算値ｍ／ｚ ７４４．３１９３；実測値７４４．３１９１。
２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスフィノ）－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ６－プロパルギルアデノシン（１６）
１５（３２５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍＬ）に溶解し、脱気し、ＤＩＰＥＡ（１４０ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）及びＣＥＰＣｌ（１４０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、室温で２４時間攪拌した。カラム（８：１ＤＣＭ：アセトン＋１％ＮＥｔ３）を介して粗混合物を直接精製した。生成物が白色生成物（２８４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、６８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２種のジアステレオマーの主要なものについて報告）δ８．３１（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｓ，１Ｈ）、７．４６（ｄ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，４Ｈ）、７．１９～７．２９（ｍ，３Ｈ）、６．８１（ｄ，４Ｈ） ６．０１（ｄ，１Ｈ）、５．８４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．０７（ｍ，１Ｈ）、４．４７（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、４．２４～４．３２（ｍ，３Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ）、３．５２～３．６８（ｄｄ，５Ｈ）、３．３１（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｍ，２Ｈ）、２．２９（ｍ，２Ｈ）、１．１５～１．２１（ｍ，１２Ｈ）、０．７６（ｓ，９Ｈ）、－０．０５，（ｓ，３Ｈ）、－０．２１（ｓ，３Ｈ）。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４９．０、１５０．９。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：Ｃ４９Ｈ６４Ｎ７ＮａＯ７ＰＳｉの計算値ｍ／ｚ ９４４．４２７１；実測値９４４．４２５８。
エチル－３－ブチノエート（１７）
ブタ－３－イン酸（１８２ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）のエタノール（１．５ｍＬ）中溶液に、硫酸（５７μＬ）を添加し、反応混合物を室温で１０日間放置した。粗生成物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３（飽和溶液、１０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、１７が黄色油（５６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ、２３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝４．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、３．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）、２．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）、１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１６７．８、７５．８、７１．７、６１．７、２５．８、１４．１。ＨＲＭＳ－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ６Ｈ９Ｏ２の計算値、１１３．０５９７；実測値１１３．０６１０。
ヘキサエチレングリコールモノ（ｐ－トルエンスルホネート）（１８）
ヘキサエチレングリコール（１．２５ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８．９ｍＬ）中溶液に、ＴｓＣｌ（０．８５ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃に冷却させた。無水ピリジン（０．７０ｍＬ、８．８６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（充填用の微量のＤＣＭを含むＥｔＯＡｃ、次いで、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝２０：１→１５：１→１０：１→６：１）によって精製すると、２が透明油（６７６ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、３５％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、４．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）、３．６９～３．５８（２２Ｈ，ｍ）、２．４６（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１４４．７７、１３３．００、１２９．８１、１２７．９７、７２．５２、７０．７１、７０．５９、７０．５５、７０．５３、７０．５１、７０．５０、７０．２９、６９．２５、６８．６７、６１．７２、２１．６３。ＨＲＭＳ－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ３３Ｏ９Ｓの計算値、４３７．１８４０；実測値４３７．１８４３
ヘキサエチレングリコールモノイミダゾール（１９）
ヘキサエチレングリコールモノ（ｐ－トルエンスルホネート）１８（１５３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に、イミダゾール（２３９ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１１０℃で２０時間攪拌した。反応混合物をＭｅＯＨに溶解し、溶媒を真空中で除去し、残りのイミダゾールを、クーゲルロール装置を使用することによって昇華させた。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭのみ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１→１０：１→５：１）を介した残渣の精製により、１９が無色油（１０９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、９３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝７．５４（１Ｈ，ｓ）、７．０２（２Ｈ，ｄ）、４．１１（２Ｈ，ｔ）、３．７５～３．７１（４Ｈ，ｍ）、３．６６～３．５９（１８Ｈ，ｍ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１３７．５６、１２９．１８、１１９．４２、７２．６９、７０．６６、７０．６２、７０．６１、７０．５７、７０．５５、７０．５３、７０．５１、７０．３１、６１．６３、４７．０３。ＨＲＭＳ－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２９Ｈ４０Ｎ９ＯＳの計算値、３３３．２０２０；実測値３３３．２０２１
クリック分解剤４（ヘキサエチレングリコールイミダゾレートジベンゾシクロオクチン）（２０）
無水ＴＨＦ（１．１ｍＬ）に溶解した１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４９ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、１９（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２１時間攪拌した。次いで、３－（５Ｈ，６Ｈ－１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５－イル）－３－オキソプロピル）アミン（４６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によって精製すると、２０（８０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、９０％）が黄色油として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝７．６８～７．６７（１Ｈ，ｍ）、７．５６（１Ｈ，ｓ）、７．４３～７．３０（７Ｈ，ｍ）、７．０６～７．０５（１Ｈ，ｍ）、７．０２～７．００（１Ｈ，ｍ）、５．３６（１Ｈ，ｂｒ）、５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ）、４．１６～４．１４（２Ｈｍ）、４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５０４Ｈｚ）、３．７５（２Ｈ，五重線，Ｊ＝５．４Ｈｚ）、３．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ）、３．６７～３．５８（１Ｈ，ｍ）、３．３０～３．１７（２Ｈ，ｍ）、２．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，６．６Ｈｚ，３．２Ｈｚ）、１．９５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，６．６Ｈｚ，３．２Ｈｚ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１７１．９、１５６．３、１５１．１、１４８．０、１３７．５ １３２．０、１２９．１、１２９．０、１２８．５、１２８．３、１２７．８、１２７．２、１２５．６、２２．９、１２２．７、１１９．５、１０７．５、７０．７、７０．６、７０．６、７０．５、７０．５、７０．５、６９．６、６３．８、５５．５、５３．４、５０．６、４７．１、３６．９、３４．９。ＨＲＭＳ－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ３４Ｈ４３Ｎ４Ｏ８の計算値、６３５．３０７５；実測値６３５．３０７７
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－６－アジド－６－デオキシ－α－Ｌ－ガラクトピラノシド（２１）（Srivastava, G., Kaur, K. J., Hindsgaul, O. & Palcic, M. M. Enzymatic transfer of a preassembled trisaccharide antigen to cell surfaces using a fucosyltransferase. J. Biol. Chem. 267, 22356-22361 (1992)）
Ｎ２雰囲気下の、６－アジド－１，２，３，４－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－６－デオキシ－α－Ｌガラクトピラノシド（２５０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ（３：１、４ｍＬ）を添加した。室温で３時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。得られた残渣をピリジン（３ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（１ｍＬ）を添加した。溶液を２４時間攪拌し、メタノール（４ｍＬ）でクエンチし、真空中で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（石油：酢酸エチル＝４：１→３：１→２：１）による精製により、無色油（１１２ｍｇ、３４％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝６．３９（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、５．４８（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、５．３３（２Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．２４～４．２３（１Ｈ，ｄｄｄ）、３．４７～３．４２（１Ｈ，ｄｄ）、３．２４～３．１９（１Ｈ，ｄｄ）、２．１８（６Ｈ，ｄ）、２．０１（６Ｈ，ｄ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．０７、１７０．０５、１６９．８７、１６８．８６、８９．６０、７０．１１、６８．１０、６７．３４、６６．３２、５０．２９、２０．８７、２０．６１、２０．６０、２０．５２。ＨＲＭＳ－ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１４Ｈ１９Ｎ３Ｏ９の計算値、３７３．１１２１；実測値３７３．１１２０。
Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑ ＲＮＡ分解の検討
抗体ベースのＲＮＡメチル化法に関連した多数の制限を克服するために、本発明者らは、内因性ＲＮＡメチル化経路（M. Tomkuviene, B. Clouet-d'Orval, I. Cerniauskas, E. Weinhold, S. Klimasauskas, Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012)）を乗っ取り、メチル化ＲＮＡの特定の分解をもたらす低分子ベースのトランスクリプトーム編集プラットフォームであるＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを開発した（図１ａ）。これらの効果は、もっぱらＲＮＡの複雑なプロセシングを回避する、低分子による培養細胞の直接処理を通して達成される。Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑの第１のステップでは、メチオニン代用物ＰｒｏｐＳｅＭｅｔが培地に導入される。細胞はメチオニン代用物を取り込み、これを補因子Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の代用物であるＳｅＡｄｏＹｎに酵素的に変換する。ＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６を含むＲＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）は、ＳＡＭの代わりにＳｅＡｄｏＹｎを補因子として使用して、天然メチルの代わりに、プロパルギル基のＲＮＡへの導入をもたらす（図１ｂ）（K. Hartstock et al., Enzymatic or In Vivo Installation of Propargyl Groups in Combination with Click Chemistry for the Enrichment and Detection of Methyltransferase Target Sites in RNA. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 6342-6346 (2018)）。次いで、Ｃｕ（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応が培養細胞上で直接行われて、ＲＮＡを、ＲＮＡの切断を触媒するクリック分解剤で官能基化してその分解をもたらす（図１ｃ）。理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、イミダゾールベースのクリック分解剤が二重機序を通して作用すると考えている。第１に、これは、リボヌクレアーゼと同様に、一般塩基として作用してＲＮＡの２’Ｏ位からプロトンを抜き取り、切断をもたらす（図１ｄ）（R. T. Raines, Ribonuclease A. Chem. Rev. 98, 1045-1066 (1998)）。第２に、これは、いくつかの核酸切断天然産物を模倣して、銅依存的にＲＮＡを切断する（図１ｅ）（Z.-R. Li et al., Macrocyclic colibactin induces DNA double-strand breaks via copper-mediated oxidative cleavage. Nat. Chem. 11, 880-889 (2019)）。結果として、この切断は、直接定量化することができるメチル化基質の減少をもたらし、よって、任意のＲＮＡ転写産物のメチル化状態についての情報をリアルタイムで提供する。
Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは二重化学機序を通してＲＮＡを分解する
ＲＮＡ分解戦略の有効性を実証し、その機序を調べるために、本発明者らは、非修飾１１－ｍｅｒを対照として使用しながら、その６Ａ位の１つにおいてプロパルギル部分で官能基化されたＲＮＡ １１－ｅｒでインビトロ実験を行った。本発明者らは、ＲＮＡ安定性に対してどのような効果を有するかを観察するために、クリック分解剤をアルキニル化ＲＮＡに取り付けることに進んだ。最適な条件下では、ＣｕＡＡＣ ＲＮＡ官能基化がほぼ１０分で完全であった（図５ａ～図５ｃ）。さらに、本発明者らは、３７℃でインキュベートすると、官能基化ＲＮＡが徐々に分解することを見出した（図２ａ）。ＲＮＡ分解の動態学的プロファイルは複雑であり得るが、一次半減期がＲＮＡ安定性の推定として頻繁に使用される（J. R. Peterson et al., Genome-wide gene expression and RNA half-life measurements allow predictions of regulation and metabolic behavior in Methanosarcina acetivorans. BMC Genomics 17, 924-924 (2016)）。一次近似を使用して、本発明者らは、官能基化ＲＮＡ １１－ｅｒが２．６時間の半減期を有すると計算した（図５ｄ）。この結果は短ＲＮＡオリゴマーを使用して観察されたが、本発明者らは、より長いＲＮＡが分解を受けやすいより多くの部位を有し、より迅速に分解されると予想している。クリック分解剤官能基化ＲＮＡの９％しか１４時間のインキュベーション後に残らなかった一方、プロパルギルハンドル及びクリック官能基化される能力を欠く対照ＲＮＡオリゴマーを使用した場合には分解がほとんど観察されなかった（図２ｂ）。このことは、共有結合的にイミダゾール官能基化されたＲＮＡのみが分解され、よって、観察される効果が修飾ＲＮＡに特異的であり、反応の個別の成分の結果ではないことを実証している。
クリック分解剤の機序への洞察を得るために、本発明者らは、一定の機序を抑制する条件下でインビトロ分解反応を行った。銅が役割を果たすかどうかを調査するために、本発明者らは、銅キレート剤バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ）又は一般金属キレート剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ethylenediaminetetraacetic acid）のいずれかによってクエンチされる反応を実行した。これらの反応添加剤を用いると、それぞれ、ＲＮＡの６８％及び７９％がインタクトなままであり（図２ｂ）、銅が実際に分解機序において重要な役割を果たすことを示唆している。一般塩基としてのクリック分解剤の役割を調査するために、本発明者らは、クリック分解剤のイミダゾールがプロトン化され、非塩基性であるが、固有のＲＮＡ安定性が中性条件に匹敵する酸性条件（ｐＨ３）下での反応を行った（M. Oivanen, S. Kuusela, H. Lonnberg, Kinetics and Mechanisms for the Cleavage and Isomerization of the Phosphodiester Bonds of RNA by Bronsted Acids and Bases. Chem. Rev. 98, 961-990 (1998)）。この場合、官能基化ＲＮＡの１５％が保持された（ｐＨ７．５下でのほぼ２倍）が、非プロパルギル化オリゴマーは有意には影響を受けなかった（図２ｃ、図２ｄ）。重要なことに、反応をｐＨ３で銅キレート剤バソクプロインジスルホン酸（ＢＣＳ）を用いて行った場合、有意なＲＮＡ分解は観察されず、銅と一般塩基の両方の機序が遮断された（図２ｃ）。これらの所見は、銅依存性機序と一般塩基機序の両方が関連し、クリック分解剤の化学機序を説明するのに十分であることを示している。さらに、本発明者らはまた、クリック分解剤リンカーの長さが分解の効率にどのように影響を及ぼすかを調査した。本発明者らは、３つの異なるリンカー長（２、４及び６個のＰＥＧサブユニット）を試験し、最長リンカーが、おそらくはより優れたリーチのために、最も有能な分解を示すことを見出した（図２ｅ）。しかしながら、より長いリンカーを有するクリック分解剤の単離は困難であり、よって、本発明者らは下流実験のためにクリック分解剤１（６個のＰＥＧサブユニット）を使用した。
ｍ６ＡライターのｍＲＮＡ基質の解明
ＲＮＡメチル化の上方制御は、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）を含むがんの維持において中心的な役割を果たすことに関与していた（I. Barbieri et al., Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m(6)A-dependent translation control. Nature 552, 126-131 (2017)、L. P. Vu et al., The N(6)-methyladenosine (m(6)A)-forming enzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic and leukemia cells. Nat. Med. 23, 1369-1376 (2017)）。したがって、このプラットフォームを使用してがんモデルにおけるＲＮＡメチル化ランドスケープを解明することができることを実証するために、本発明者らは、ヒトＡＭＬ細胞株であるＭＯＬＭ－１３を使用してＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを適用することに進んだ（図３ａ）。この目的のために、本発明者らは、共にｍ６Ａライター（K. E. Pendleton et al., The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell 169, 824-835.e814 (2017)、J. A. Bokar, M. E. Shambaugh, D. Polayes, A. G. Matera, F. M. Rottman, Purification and cDNA cloning of the AdoMet-binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. RNA 3, 1233-1247 (1997)）、又は対照としてのスクランブルｓｈＲＮＡ（図３ｂ）（D. Wiederschain et al., Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle 8, 498-504 (2009)）であることが知られている、ＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６に対するコンディショナルｓｈＲＮＡを安定的に形質導入したアイソジェニックＭＯＬＭ－１３細胞を使用した。プラットフォームが純粋に触媒依存性であるので、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼの喪失又は下方制御は、そのＲＮＡ基質のクリックベースのＲＮＡ分解の非存在をもたらす。最初に、本発明者らは、多くのｍＲＮＡの豊富な存在量がクリック細胞で減少するが、対照細胞では減少しないことを観察し、メチル化転写産物の細胞内分解の成功を示唆している（図３ｃ、図６ａ）。際立ったことに、これらの転写産物の多くは、ＭＥＴＴＬ３又はＭＥＴＴ１６下方制御により細胞内で影響を受けないままであり、これらの基質に対する修飾が対応するＭＴアーゼの触媒活性の結果であることを示唆している。本プラットフォームを使用して、本発明者らは、５４１１個のＭＥＴＴＬ３－及び７６５６個のＭＥＴＴＬ１６－依存性ｍＲＮＡ基質を特定した。本発明者らは、これらの所見を、ＭＯＬＭ－１３細胞で行われた報告されたｍ６Ａ ｍｉＣＬＩＰ配列決定実験の結果と相互比較した（A. Leger et al., RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. bioRxiv, 843136 (2019)）。本発明者らは、両酵素についての一貫した重複を観察した－Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを通して特定されたＭＥＴＴＬ３ ｍＲＮＡ基質の６９％及びＭＥＴＴＬ１６ ｍＲＮＡ基質の６７％が、ｍｉＣＬＩＰを介してｍ６Ａ部位を含有することが分かった（図３ｄ、図６ｂ）。さらに、本発明者らは、５１５９個のｍＲＮＡのｍ６Ａメチル化が両ＭＴアーゼに依存し、特定されたメチル化基質の大半がＭＥＴＴＬ１６に依存していることを見出し、これはＭＥＴＴＬ１６が細胞補因子ＳＡＭ及びそのレベルのモジュレーターであるという事実と一致する（図６ｃ）（K. E. Pendleton et al., The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell 169, 824-835.e814 (2017)、K. A. Doxtader et al., Structural Basis for Regulation of METTL16, an S-Adenosylmethionine Homeostasis Factor. Mol. Cell 71, 1001-1011.e1004 (2018)）。独立した方法を介してこれらの結果を観察することができるかどうかを確かめるために、本発明者らはＲＴ－ｑＰＣＲを使用してｍ６Ａ含有転写産物のパネルを検証した（図３ｅ、図３ｆ、図６ｄ）。注目すべきことに、検証は、本発明者らのプラットフォームの特異性を強調するＲＮＡ－ｓｅｑの結果を反映した。よって、本発明者らは、Ｓｌｉｃｋ－ＳｅｑがＲＮＡメチラーゼｍＲＮＡ基質を特異的に特定し、抗体ベースのアプローチの結果を再現することができることを実証した。
多くのｌｎｃＲＮＡはＭＥＴＴＬ３及び／又はＭＥＴＴＬ１６基質である
重度にメチル化されることが報告されたＲＮＡの別の群は、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。したがって、本発明者らは、本発明者らのＳｌｉｃｋ－ＳｅｑプラットフォームがそのＲＮＡサブグループのメチル化変化を効率的に特定して、ＭＥＴＴＬ３－及び／又はＭＥＴＴＬ１６－依存性ｍ６Ａに再び焦点を当てることができるかどうかを調査した（D. Yang et al., N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential. Nucleic Acids Res. 46, 3906-3920 (2018)）。例えば、ＮＥＡＴ１はｍ６ＡデメチラーゼＡＬＫＢＨ５の標的であることが示されたが、修飾を堆積させるＭＴアーゼは特定されなかった（J. Zhang et al., ALKBH5 promotes invasion and metastasis of gastric cancer by decreasing methylation of the lncRNA NEAT1. J. Physiol. Biochem. 75, 379-389 (2019)）。Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを通して、本発明者らは、ＮＥＡＴ１のメチル化がＭＥＴＴＬ３とＭＥＴＴＬ１６の両方に依存することを実証した（図３ｇ）。全体で、本発明者らは、ｍｉＣＬＩＰ配列決定を介して、６８９個のＭＥＴＴＬ３－依存性ｌｎｃＲＮＡ及び８８９個のＭＥＴＴＬ１６－依存性ｌｎｃＲＮＡを特定し、そのうちの７７個及び１０４個が、ｍ６Ａ部位を含有するｌｎｃＲＮＡ基質と有意に重複していた（図６ｅ、図６ｆ）。興味深いことに、本発明者らは、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑとｍ６Ａ ｍｉＣＬＩＰとの間の重複が、有意ではあるが、ｍＲＮＡよりもｌｎｃＲＮＡではるかに小さいことを観察した。さらに、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは、ｍ６Ａ ｍｉＣＬＩＰよりも多数のｌｎｃＲＮＡ基質を特定することができ、ｍＲＮＡについて観察されたものと反対であり、本プラットフォームが抗体バイアスなしにｌｎｃＲＮＡメチル化を効率的に調べることを示唆している。５６２個のｌｎｃＲＮＡ（特定された全体の５６％）のメチル化がＭＥＴＴＬ３とＭＥＴＴＬ１６の両方に依存しているように見えるので、ｍＲＮＡと同様に、ｌｎｃＲＮＡの大部分は乱雑なｍ６Ａ基質である（図６ｇ）。本発明者らはまた、ＲＴ－ｑＰＣＲを介してこれらの所見のいくつかを再現することもできた（図６ｈ）。よって、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑにより、本発明者らは、ｌｎｃＲＮＡの以前は認識されていなかったｍ６Ａメチル化をＭＴアーゼ依存的に明らかにした。
Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑはｍ６Ａがイントロン及び遺伝子間領域に広まっていることを明らかにする
かなり予想外なことに、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑプラットフォームを使用したＲＮＡｓｅｑデータのさらなる照合は、イントロン及び遺伝子間領域のピークを明らかにした。これらのピークの大部分は、クリック分解剤による官能基化に高度に感受性であり、これらの領域が実際にＭＴアーゼによって修飾されたことを示している（図４ａ）。別の興味深い観察は、ＭＥＴＴＬ３又はＭＥＴＴＬ１６のいずれかが枯渇した細胞における多くの特定されたピークの豊富な存在量の明白な喪失であり、これらのＭＴアーゼが対応するピークでメチル化を制御することを暗に示している（図４ｂ、図７ａ～図７ｄ）。全体で、本発明者らは、１３４５個のＭＥＴＴＬ３－及び９６１８個のＭＥＴＴＬ１６－依存性イントロンピーク並びに遺伝子間ピークを見出し（図４ｃ）、これらのピークの分布は２つのＭＴアーゼについて異なるように見えた。最近の文献（I. Barbieri et al., Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m(6)A-dependent translation control. Nature 552, 126-131 (2017)、H. Huang et al., Histone H3 trimethylation at lysine 36 guides m(6)A RNA modification co-transcriptionally. Nature 567, 414-419 (2019)、J. Liu et al., N (6)-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription. Science 367, 580-586 (2020)）と一致して、ＭＥＴＴＬ３－依存性ピークの５０％が遺伝子間領域に見られ（ＭＥＴＴＬ１６についての２３％と比較して）、ＭＥＴＴＬ３のクロマチン関連又は共転写経路へのＭＥＴＴＬ３の関与をさらに強調している（図４ｄ、図４ｅ）。さらに、ＭＥＴＴＬ１６－依存性ピークの７７％超がイントロン領域に属しており、これらの３６％が、３’バイアス法では予想外の、最初のイントロンに見られた。このことは、これらのＭＴアーゼがｍＲＮＡ修飾において果たす異なる役割を強調しており、ＭＥＴＴＬ１６は、ＭＥＴＴＬ３よりもより多くのイントロン領域の修飾を調節する。これは、ｍ６Ａをイントロンに堆積するＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６の共転写役割についての以前の報告と一致する（K. E. Pendleton et al., The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell 169, 824-835.e814 (2017)、A. Louloupi, E. Ntini, T. Conrad, U. A. V. Orom, Transient N-6-Methyladenosine Transcriptome Sequencing Reveals a Regulatory Role of m6A in Splicing Efficiency. Cell Rep. 23, 3429-3437 (2018)）。よって、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは、低存在量トランスクリプトーム領域における広範なメチル化を発見する最初の方法である。抗体ベースのイントロン分析とは異なり、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは、イントロンメチル化を観察するために新生ＲＮＡの濃縮を要さない。
本発明者らが見出したピークが本物のｍ６Ａ部位を含有することをさらに実証するために、本発明者らはモチーフ分析を実施した。本発明者らは、それぞれＭＥＴＴＬ３－及びＭＥＴＴＬ１６－依存性ピークで大きな比率を占める、ＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６の報告されるコンセンサス配列である、ＤＲＡＣＨモチーフ及びＴＡＣＡＧのバリエーションを見出した（図８ａ、図８ｂ）（K. A. Doxtader et al., Structural Basis for Regulation of METTL16, an S-Adenosylmethionine Homeostasis Factor. Mol. Cell 71, 1001-1011.e1004 (2018)、M. Mendel et al., Methylation of Structured RNA by the m(6)A Writer METTL16 Is Essential for Mouse Embryonic Development. Mol. Cell 71, 986-1000.e1011 (2018)、H. Shima et al., S-Adenosylmethionine Synthesis Is Regulated by Selective N(6)-Adenosine Methylation and mRNA Degradation Involving METTL16 and YTHDC1. Cell Rep. 21, 3354-3363 (2017)）。本発明者らはまた、これらのピークとｍ６Ａ ｍｉＣＬＩＰを通してイントロン及びエクソンに見出されたｍ６Ａ部位との間の重複を比較した。ＭＥＴＴＬ３－依存性ピークとＭＥＴＴＬ１６－依存性ピークの両方で有意な重複が観察され、観察されたピークが実際にｍ６Ａ部位を有するさらなる証拠が得られた（図８ｃ、図８ｄ）。さらに、ｍｉＣＬＩＰ部位とＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークとの間の距離の中心分布を観察した（図８ｅ、図８ｆ）。本発明者らは、ＲＴ－ｑＰＣＲを介してこれらのピークの一部を検証し、それらの酵素依存性がＲＮＡ－ｓｅｑ結果で観察されたものを反映することを見出した（図４ｆ）。さらに、本発明者らは、クリック反応に感受性であるいくつかのピークを検証した（図４ｇ）。追加の独立した方法でイントロン結果を検証するために、本発明者らは、ＭＥＴＴＬ３－又はＭＥＴＴＬ１６－依存性Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークに対応するイントロン領域の欠失を有する細胞株を得た。これは、選択されたＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークの側面を標的化する二重ｇＲＮＡを用いて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して行った。ｍ６Ａ－ＲＩＰを介してＲＮＡ含有量を分析したところ、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲを介してイントロンが除去された細胞が、空のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターを含有する細胞と比較して有意に少ないｍ６Ａを有することを見出した（図４ｈ）。さらに、ＭＥＴＴＬ３又はＭＥＴＴＬ１６ノックダウンを有するＭＯＬＭ－１３細胞では、ｍ６Ａ－ＲＩＰシグナルが、各ＲＮＡ修飾酵素に依存してピークが選択的に減少し、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑの結果をさらに検証した（図４ｉ、図４ｊ）。まとめると、このことは、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークが実際にｍ６Ａ部位を含有し、メチラーゼ特異性についての情報を保持することを示している。
ＭＥＴＴＬ１６はイントロンポリアデニル化部位と関連がある。
分析におけるイントロンピークの存在をより良く理解するために、本発明者らは、ポリＡ濃縮ＲＮＡがＲＮＡ－ｓｅｑ分析に使用されたという事実を考慮して、イントロンポリアデニル化（ＩＰＡ，intronic polyadenylation）との関係を調査することを決定した。ＩＰＡは、がんに広がっており、白血病において腫瘍抑制因子を不活性化することが近年報告されている（S.-H. Lee et al., Widespread intronic polyadenylation inactivates tumour suppressor genes in leukaemia. Nature 561, 127-131 (2018)、I. Singh et al., Widespread intronic polyadenylation diversifies immune cell transcriptomes. Nat. Commun. 9, 1716 (2018)）。ＩＰＡがｍ６Ａの存在に関連しているかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークの位置を、３’－Ｓｅｑを使用した公開された研究で特定された白血病細胞のＩＰＡ部位と比較した（S.-H. Lee et al., Widespread intronic polyadenylation inactivates tumour suppressor genes in leukaemia. Nature 561, 127-131 (2018)）。さらなる自信のために、本発明者らは、非常に厳格なパラメータを適用し、正確なＩＰＡ部位に位置するＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑピークのみを検討した。際立ったことに、ＭＥＴＴＬ１６－依存性ピークとＩＰＡ部位との間に有意な重複が見られたが、ＭＥＴＴＬ３については見られなかった（図９ａ、図９ｂ）。さらに、ＩＰＡ部位の周りのＭＥＴＴＬ１６ピークの分布は、２つの間の関連を示唆し、多数のピークがＩＰＡ部位と重複しているか、又はＩＰＡ部位に近い（図９ｃ）。これらのデータは、ＭＴアーゼＭＥＴＴＬ１６がＩＰＡ及びスプライシングにおいて考えられる役割を有することを示唆するだけでなく、どのようにＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを利用して低存在量トランスクリプトーム領域のメチル化の機能を調べることができるかを実証する。
ワンポット混合ＲＮＡ
プロパルギル化ＲＮＡオリゴヌクレオチドと非プロパルギル化ＲＮＡオリゴヌクレオチドの混合物で分解を行うと、プロパルギル化ＲＮＡの特異的ＲＮＡ分解が観察された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
他の二価金属イオンの評価
遊離銅及び亜鉛は、共にクリックケミストリーに使用される銅－ＴＨＰＴＡ錯体よりも完全な分解をもたらすことが分かった（図１１Ｃ）。しかしながら、遊離Ｃｕ（II）は、非プロパルギル化ＲＮＡの非特異的分解ももたらす。鉄（II）は、ＲＮＡ分解の程度に最小限の影響しか及ぼさない－いかなる金属も用いない場合とほぼ同じ結果が観察される（それぞれ、ＲＮＡの６７％対６８％がインタクト）。ｎ＝２、エラーバーはＳＤに対応する。
本発明者らは、イントロン及び遺伝子間領域のメチル化の高信頼度マッピングを含む、細胞内のＲＮＡメチル化ランドスケープの複数の側面を解明するための強力な低分子ベースの方法である、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを開発した。多くのＲＮＡメチル化配列決定法とは異なり、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは偏りがなく、ＲＮＡメチラーゼの触媒活性に厳密に依存し、それらの基質特異性を決定することができる。Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは低分子ベースの方法に特徴的な再現性を提供し、行うのが非常に容易であり、低いＲＮＡインプット要件を有し、異なる細胞型、希少な精製集団及び組織の並行特性評価に理想的なものとなる。抗体ベースの方法は所与の時間でのメチル化の偏った描写を提供するが、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは細胞内のメチル化の動的状態を報告する。
本発明者らは、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑを利用して、ｍ６ＡライターＭＥＴＴＬ３及びＭＥＴＴＬ１６の基質並びにそれらの重複を決定した。本発明者らはまた、ｍ６ＡがｌｎｃＲＮＡ並びにイントロン及び遺伝子間領域に広がっており、大部分はＭＥＴＴＬ１６によって堆積されていることも実証した。さらに、本発明者らは、初めて、がんにおける発癌寄与を有する、ポリアデニル化イントロンにおいてｍ６Ａ修飾が広くいきわたっていることを実証している（S.-H. Lee et al., Widespread intronic polyadenylation inactivates tumour suppressor genes in leukaemia. Nature 561, 127-131 (2018)、I. Singh et al., Widespread intronic polyadenylation diversifies immune cell transcriptomes. Nat. Commun. 9, 1716 (2018)）。
Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑは高度にモジュール式であり、適切なアイソジェニックモデルにより、他のＲＮＡメチラーゼ及びデメチラーゼ、並びに他のＲＮＡ修飾の研究に適合させることができる。ＲＮＡメチル化についての研究の大部分は高存在量ＲＮＡ種に焦点を当てているが、低存在量種におけるメチル化の役割は、分子ツールの欠如によりほとんど特徴付けられていない。よって、本発明者らは、以前は到達できなかったトランスクリプトームの領域におけるＲＮＡ修飾の研究を可能にするＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑを予見する。イントロン関連機序の欠損は、広範囲の病態に関係しており（H. Jung et al., Intron retention is a widespread mechanism of tumor-suppressor inactivation. Nat. Genet. 47, 1242-1248 (2015)）、疾患におけるノンコーティングＲＮＡの役割についてはまだ多くを学ぶ必要がある（F. Kopp, J. T. Mendell, Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell 172, 393-407 (2018)）。よって、本発明者らは、Ｓｌｉｃｋ－Ｓｅｑが、トランスクリプトームを通じてＲＮＡ修飾についての基本的発見と翻訳的発見の両方を促進すると予想している。
ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ ＲＮＡ分解の検討
本発明者らは、天然アセチル部分の代わりにアルキン基をシチジンのＮ４位でＲＮＡに堆積させるために、内因性ＲＮＡアセチル化経路、例えばＮＡＴ１０酵素経路を利用する低分子ベースのトランスクリプトーム編集プラットフォームである、ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑを開発した。このアルキン基は、二機能性プローブとの銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加反応のための足場として作用する（図１３ａ）。細胞を、エチル－３－ブチノエートを含有する培地で培養して、アルキン部分を細胞ＲＮＡに組み込むことによって、酵素標識を実施する（図１３ｂ）。その後、得られた細胞を、アルキン官能基化ＲＮＡとの共有結合のための生体直交型ハンドルとしてのアジド基及びイミダゾール基を含むクリック分解剤、例えばＳｌｉｃｋ－Ｓｅｑについて記載されるもので処理する（図１３ｃ）（Mikutis, S. et al. meCLICK-Seq, a Substrate-Hijacking and RNA Degradation Strategy for the Study of RNA Methylation. ACS Cent. Sci. 6, 2196-2208 (2020)）。
次いで、全クリック分解剤処理ＲＮＡを配列決定する；「非クリック」ＲＮＡと比較した二機能性プローブの組み込みによるシグナル減少の観察は、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ，N4-acetylcytidine）修飾転写産物を特定する方法を提供する。ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑは、典型的な抗体－及び低分子－ベースの方法で通常見られる非標準ＲＮＡ及び冗長なインビトロプロセシング手順を必要としないので、修飾部位の確実性の維持及び検出バイアスの最小化において有利である。このプラットフォームはまた、プルダウン濃縮法を回避することによって、血液がんに関連する細胞株にわたる低存在量ＲＮＡ種、例えばポリ（Ａ）転写産物のａｃ４Ｃ修飾がいきわたること（又はその逆）を研究するためのより高い感度を潜在的に提供する。
アセチルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ基質の解明
細胞標識プローブであるエチル－３－ブチノエート（図１２ａ）及びＰＥＧリンカーを介してイミダゾールにコンジュゲートしたアジドを保有するクリック分解剤（図１２ｂ）を合成し、次いで、ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑを細胞内で直接実施した。ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑの第１のステップは、エチル－３－ブチノエートを含有する培地中で細胞（ＭＯＬＭ１３）を２４時間培養して、アルキンタグによる細胞ＲＮＡの酵素標識を可能にすることを伴う。次いで、得られた細胞を、アジド保有クリック分解剤、及び銅触媒クリック反応、引き続いて即座のＲＮＡ分解を促進する他のクリック成分で処理した（図１４ａ）。このようにして、ａｃ４Ｃ部位をマークし、ｑＰＣＲ測定を介して分解シグナルを観察することができる（図１４ｂ）。本方法の熟練度を実証するために、本発明者らは、最初に、ｑＰＣＲ標的として１８Ｓ及びＢＲＤ４遺伝子を見た。１８Ｓ転写産物は最も豊富で、よく報告されるａｃ４Ｃ部位であるので特異的に選択したが、ＢＲＤ４遺伝子は報告される低存在量ｍＲＮＡ転写産物のうちの１つである（Sharma, S. et al. Yeast Kre33 and human NAT10 are conserved 18S rRNA cytosine acetyltransferases that modify tRNAs assisted by the adaptor Tan1/THUMPD1. Nucleic Acids Res. 43, 2242-2258 (2015)、Arango, D. et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell 175, 1872-1886.e24 (2018)）。
クリック細胞では２つの標的転写産物の相対的な発現レベルで低下が観察されたが、対照（エチル－３－ブチノエート供給、但し、非クリック）細胞では観察されず、ａｃ４Ｃ修飾転写産物の細胞内分解の成功を示している。さらに、ＮＡＴ１０ノックアウトを有する細胞において、１８Ｓ転写産物とＢＲＤ４転写産物の両方の発現レベルが救済され（図１４ｃ）、これらのＲＮＡのアセチル化がＮＡＴ１０の酵素活性によって媒介され、ａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑプラットフォームが、関連するＮＡＴ１０依存性ａｃ４Ｃ修飾を部位特異的にタグ付け及び分解し得ることを暗に示している。これらの予備的結果は、ａｃ４Ｃ修飾の包括的特定及び研究のためのａｃＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑの適格性を認識する。
グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ ＲＮＡ分解の検討
本発明者らは、ＲＮＡグリコシル化部位をマッピングするために使用することができる低分子ベースのトランスクリプトーム編集プラットフォームである、グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑを開発した。グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑでは、クリック分解剤を、マンノースの非天然アジド含有アナログ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ（Ｎ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアシル化）であり得る、グリコシル化プローブと並行して使用する（Saxon, E. Cell Surface Engineering by a Modified Staudinger Reaction. Science 287, 2007-2010 (2000)）（図１５）。典型的なグリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ手順では、細胞を、単糖アナログ、例えばＡｃ４ＭａｎＮＡｚを含有する培地で培養して、アジド標識を細胞ＲＮＡに組み込む。次いで、得られた細胞を、アジド官能基化ＲＮＡとの共有結合のための生体直交型ハンドル及びリボヌクレアーゼと同様の機序でＲＮＡを分解することができるイミダゾール基を含む「クリック分解剤」で処理する。次いで、全クリック分解剤処理ＲＮＡを配列決定する；「非クリック」ＲＮＡと比較した「クリック分解剤」の組み込みによるシグナル減少の観察は、グリコシル化ＲＮＡを特定する方法を提供する。本方法を使用して血液がんに関連する細胞株にわたるグリコＲＮＡがいきわたっていること（又はその逆）を研究することができる。抗体－及び低分子－ベースの方法とは異なり、グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑは非標準ＲＮＡプロセシング手順を必要とせず、したがって、グリコＲＮＡ種の誕生を維持し、最小限の検出バイアスを有する（Mikutis, S. et al. meCLICK-Seq, a Substrate-Hijacking and RNA Degradation Strategy for the Study of RNA Methylation. ACS Cent. Sci. 6, 2196-2208 (2020)）。このプラットフォームはまた、プルダウン濃縮法を回避することによって、低存在量ＲＮＡ種のグリコシル化をマッピングするための潜在的により高い感度を提供する。
グリコＣＬＩＣＫ－ＳｅｑはＲＮＡを分解する
本発明者らは、ＰＥＧリンカーを介してイミダゾールにコンジュゲートしたジベンジル－シクロオクチン（ＤＢＣＯ）を保有するクリック分解剤を合成した（図１２ｃ）。次いで、グリコシル化プローブであるＭａｎＮＡｚを用いてインビトロクリック反応を実施した。反応を細胞培養培地下３７℃で実施して細胞生理条件を模倣し、ＨＰＬＣ－ＬＣＭＳ測定によって分析した。３０分後に、新たなクリック生成物（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ－分解剤）の形成と共に、クリック分解剤の完全な枯渇が観察された（図１６ａ及び図１６ｂ）。非アジド糖プローブＭａｎＮＡｃを対照として使用した場合、クリック生成物の形成は観察されなかった（図１６ｃ）。
グリコシル化酵素のｍＲＮＡ基質の解明
グリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑのワークフローは、アジド標識を細胞ＲＮＡに酵素的に組み込むために、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚを含有する培地で細胞（ＨｅＬａ）を２４時間培養することを必要とする。得られた細胞を、即座のＲＮＡ分解を促進するクリック分解剤で処理する（図１７ａ）。このようにして、グリコＲＮＡ部位をマークし、ｑＰＣＲ及びハイスループットシーケンシングを介して分解シグナルを観察することができる。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚに加えて、Ａｃ４ＦｕｃＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚの２つの他のアジド糖プローブを使用して機能的糖アナログの範囲及び異なる糖アナログによるグリコＲＮＡプロービングの有効性を実証した（図１２ｄ及び図１７ａ）。
ｑＰＣＲ結果からの分析は、全３種の糖プローブについて報告されるグリコＲＮＡ転写産物のパネルにわたるＲＮＡ発現レベルの低下（Flynn, R. A. et al. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell 184, 3109-3124.e22 (2021)）（５．８Ｓ、ＳＮＯＲＤ３６、ＳＣＡＲＮＡ１２、Ｕ１、及びＵ８）を示すが、対照ＲＮＡでは示さない（１８Ｓ及びＴＭＥＭ１０７）（図１７ｂ）。全ての非対照転写産物は、グリコＲＮＡの合理的で豊富な検出、及びｑｐＣＲプライマーを設計する実行可能性のために選択された。観察された全ての転写産物の中でも、対照と比較した５．８Ｓ発現の減衰が顕著であり、使用した３種の糖プローブの全てにわたって適しており、卓越したグリコＲＮＡ転写産物としての５．８Ｓの可能性を示している。これらの結果は、第１の報告された所見と独立してグリコＲＮＡの存在を明らかにするためのグリコＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑの可能性及び特異性の洞察を直接的な信頼できる方法で確立した。
表
（参考文献）
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Claims (61)

  1. 標的核酸分子を切断する方法であって、
    前記標的核酸を、式：
    Ｃ－Ｌ－Ｂ
    （式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは結合部分である）
    を有する二機能性プローブと接触させて、それにより前記二機能性プローブを前記標的核酸分子に共有結合させるステップと；
    前記二機能性プローブがそこに結合した前記標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
    を含む、前記方法。
  2. 切断部分が、置換又は非置換イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、ベンゾイミダゾール及びアザインドールから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 切断部分が、式（Ｉ）～（III）：
    （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＲＮは、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＊は、プローブの残り（典型的には、リンカー単位Ｌ）との結合位置を表す）
    によって表される基から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 切断部分が式（Ｉ）によって表される基である、請求項３に記載の方法。
  5. リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 標的核酸分子が、二機能性プローブとの共有結合を促進するためのパートナー部分（Ｐ）を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 結合部分（Ｂ）が、パートナー部分（Ｐ）と共有結合を形成することができる反応性基を含む共有結合部分（Ｂｃ）である、請求項６に記載の方法。
  8. 共有結合部分が、アジド（－Ｎ３）、ニトロン（Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）若しくはテトラジンから選択される基であるか、又はこれを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 共有結合部分がアジド（－Ｎ３）基であるか、又はこれを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 共有結合部分がアルキニル（－Ｃ≡Ｃ－）基であるか、又はこれを含む、請求項７に記載の方法。
  11. パートナー部分が、アルキニル、アルケニル、イソシアニド（－Ｎ＋≡Ｃ－）から選択される基であるか、又はこれを含む、請求項６～９のいずれかに記載の方法。
  12. パートナー部分がアルキニル基であるか、又はこれを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. パートナー部分がプロパルギル基であるか、又はこれを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. パートナー部分がアジド基を含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 標的核酸分子がＲＮＡ分子である、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 標的核酸分子を細胞内で二機能性プローブと接触させる、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 細胞内の標的核酸を選択的に切断する方法であって、
    前記細胞内で、標的核酸分子、核酸修飾酵素、及びパートナー部分を含む補因子アナログを接触させて、それにより前記核酸修飾酵素が前記パートナー部分で前記標的核酸をタグ付けするステップと；
    式（１）：
    Ｃ－Ｌ－ＢＣ （１）
    （式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、前記パートナー部分と反応して二機能性プローブを前記標的核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
    を有する二機能性プローブを前記細胞内に導入するステップと；
    前記二機能性プローブがそこに共有結合した前記標的核酸分子を切断することを可能にするステップと
    を含む、前記方法。
  18. 切断部分が、置換又は非置換イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、ベンゾイミダゾール及びアザインドールから選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 切断部分が、式（Ｉ）～（III）：
    （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＲＮは、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＊は、プローブの残り（典型的には、リンカー単位Ｌ）との結合位置を表す）
    によって表される基から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 切断部分が式（Ｉ）によって表される基である、請求項１９に記載の方法。
  21. リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項１７～２０のいずれかに記載の方法。
  22. 共有結合部分が、アジド（－Ｎ３）、ニトロン（－Ｒ１Ｃ＝ＮＲ２ ＋Ｏ－（式中、Ｒ２はＨではない））、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）若しくはテトラジンから選択される基であるか、又はこれを含む、請求項１７～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 共有結合部分がアジド（－Ｎ３）基であるか、又はこれを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. パートナー部分がアルキニル（－Ｃ≡Ｃ－）基であるか、又はこれを含む、請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 核酸修飾酵素が、核酸メチルトランスフェラーゼ、核酸アセチルトランスフェラーゼ、及び核酸グリコシルトランスフェラーゼから選択される、請求項１７～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 補因子アナログが、Ｓ－アデノシルメチオニンアナログ、アセチル補酵素Ａアナログ、及び単糖アナログ又は前記単糖アナログを含むグリカンから選択される、請求項１７～２５のいずれかに記載の方法。
  27. 補因子アナログが、プロパルギルＳｅ－アデノシル－Ｌ－セレノメチオニン（ＳｅＡｄｏＹｎ）及びプロパルギルＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡｄｏＹｎ）から選択されるＳ－アデノシルメチオニンアナログである、請求項２６に記載の方法。
  28. 補因子アナログが、３－ブチノイル補酵素Ａ及び４－ペンタノイル補酵素Ａから選択されるアセチル補酵素Ａアナログである、請求項２６に記載の方法。
  29. 補因子アナログが、Ｎ－アジドアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｚ）、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｚ）、１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ）、及び６－アジドフコース（ＦｕｃＡｚ）から選択される単糖アナログ、又は前記単糖アナログを含むグリカンである、請求項２６に記載の方法。
  30. 補因子アナログが細胞内で外因性補因子アナログ前駆体から生成される、請求項１７～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 補因子アナログ前駆体が、メチオニンアナログ、アセテートアナログ及びアセチル化単糖アナログから選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 補因子アナログ前駆体が、プロパルギル－セレノメチオニン（ＰｒｏｐＳｅＭｅｔ）及びプロパルギルメチオニン（ＰｒｏｐＳＭｅｔ）から選択されるメチオニンアナログである、請求項３１に記載の方法。
  33. 補因子アナログ前駆体が、エチル－３－ブチノエートであるアセテートアナログである、請求項３１に記載の方法。
  34. 補因子アナログ前駆体が、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアセチル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）、１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）及び６－アジドフコース－テトラアセチル化（Ａｃ４ＦｕｃＡｚ）から選択されるアセチル化単糖アナログである、請求項３１に記載の方法。
  35. 細胞内の核酸修飾酵素による核酸分子の修飾を決定する方法であって、
    第１の細胞及び第２の細胞を用意し、前記第２の細胞が、前記第１の細胞と比較して前記核酸修飾酵素の発現又は活性の低下又は消失を有するステップと、
    パートナー部分を含む補因子アナログ前駆体を前記第１及び第２の細胞に導入し、それにより、
    前記補因子アナログ前駆体が前記第１及び第２の細胞内で補因子アナログに変換され、
    前記補因子アナログが前記核酸修飾酵素の補因子であり、それにより、修飾部位を含有する前記細胞内の核酸分子が、前記核酸修飾酵素の存在下で、前記パートナー部分でタグ付けされるステップと、
    式：
    Ｃ－Ｌ－ＢＣ
    （式中、Ｃは切断部分であり、Ｌはリンカーであり、ＢＣは、前記パートナー部分と反応して二機能性プローブを前記パートナー部分でタグ付けされた核酸分子に共有結合させる反応性基を含む結合部分である）
    を有する二機能性プローブを前記細胞内に導入するステップと、
    前記二機能性プローブが前記二機能性プローブに共有結合した前記第１及び第２の細胞内の核酸分子を切断することを可能にするステップと、
    前記第２の細胞と比較して減少した量で前記第１の細胞に存在する核酸分子を特定し、
    前記特定された１又は２以上の核酸分子が、前記核酸修飾酵素による修飾部位を含有するステップと
    を含む、前記方法。
  36. 切断部分が、置換又は非置換イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、ベンゾイミダゾール及びアザインドールから選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 切断部分が、式（Ｉ）～（III）：
    （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＲＮは、水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
    ＊は、プローブの残り（典型的には、リンカー単位Ｌ）との結合位置を表す）
    によって表される基から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 切断部分が式（Ｉ）によって表される基である、請求項３７に記載の方法。
  39. リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項３５～３８のいずれかに記載の方法。
  40. 共有結合部分が、アジド（－Ｎ３）、ニトロン（－Ｒ’Ｃ＝Ｎ＋Ｒ’’Ｏ－（式中、Ｒ’’はＨではない））、ニトリルオキシド（－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－）若しくはテトラジンから選択される基であるか、又はこれを含む、請求項３５～３９のいずれかに記載の方法。
  41. 共有結合部分がアジド（－Ｎ３）基であるか、又はこれを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. パートナー部分がアルキニル（－Ｃ≡Ｃ－）基であるか、又はこれを含む、請求項３５～４１のいずれかに記載の方法。
  43. 核酸修飾酵素が、核酸メチルトランスフェラーゼ、核酸アセチルトランスフェラーゼ、及び核酸グリコシルトランスフェラーゼから選択される、請求項３５～４２のいずれかに記載の方法。
  44. 補因子アナログが、Ｓ－アデノシルメチオニンアナログ、アセチル補酵素Ａアナログ、及び単糖アナログ又は前記単糖アナログを含むグリカンから選択される、請求項３５～４３のいずれかに記載の方法。
  45. 補因子アナログが、プロパルギルＳｅ－アデノシル－Ｌ－セレノメチオニン（ＳｅＡｄｏＹｎ）及びプロパルギルＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡｄｏＹｎ）から選択されるＳ－アデノシルメチオニンアナログである、請求項４４に記載の方法。
  46. 補因子アナログが、３－ブチノイル補酵素Ａであるアセチル補酵素Ａアナログである、請求項４４に記載の方法。
  47. 補因子アナログが、Ｎ－アジドアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｚ）、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｚ）、１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ）、及び６－アジドフコース（ＦｕｃＡｚ）から選択される単糖アナログ、又は前記単糖アナログを含むグリカンである、請求項４４に記載の方法。
  48. 補因子アナログが細胞内で外因性補因子アナログ前駆体から生成される、請求項３５～４７のいずれかに記載の方法。
  49. 補因子アナログ前駆体が、メチオニンアナログ、アセテートアナログ及びアセチル化単糖アナログから選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 補因子アナログ前駆体が、プロパルギル－セレノメチオニン（ＰｒｏｐＳｅＭｅｔ）及びプロパルギルメチオニン（ＰｒｏｐＳＭｅｔ）から選択されるメチオニンアナログである、請求項４９に記載の方法。
  51. 補因子アナログ前駆体が、エチル－３－ブチノエート及びエチル－４－ペンチノエートから選択されるアセテートアナログである、請求項４９に記載の方法。
  52. 補因子アナログ前駆体が、Ｎ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアセチル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）、１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｎ－アジドアセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）及び６－アジドフコース－テトラアセチル化（Ａｃ４ＦｕｃＡｚ）から選択されるアセチル化単糖アナログである、請求項４９に記載の方法。
  53. 式：
    Ｉ－Ｌ－Ｂ
    （式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、Ｂは核酸分子に共有結合する結合部分である）
    を有する二機能性プローブ。
  54. 式（４）：
    Ｉ－Ｌ－Ｎ３ （４）
    （式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、Ｎ３はアジド基である）
    を有する、請求項５３に記載の二機能性プローブ。
  55. 式（５）：
    Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－Ｎ３ （５）
    （式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、Ｎ３はアジド基である）
    を有する、請求項５４に記載の二機能性プローブ。
  56. ｎが４～８である、請求項５５に記載の二機能性プローブ。
  57. 式（４Ａ）：
    Ｉ－Ｌ－ＤＢＣＯ （４Ａ）
    （式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、Ｌはリンカーであり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
    を有する、請求項５３に記載の二機能性プローブ。
  58. 式（５Ａ）：
    Ｉ－［ＰＥＧ］ｎ－ＤＢＣＯ （５Ａ）
    （式中、Ｉは置換又は非置換イミダゾールであり、ＰＥＧはポリエチレングリコール単位であり、ｎは２～１０であり、ＤＢＣＯはジベンゾシクロオクチン基又はＤＢＣＯ誘導体、例えばＤＢＣＯ－アミン若しくはＤＢＣＯ－カルバメートである）
    を有する、請求項５７に記載の二機能性プローブ。
  59. ｎが４～８である、請求項５８に記載の二機能性プローブ。
  60. 式Ｄｅｇ－１～Ｄｅｇ－３の化合物：


    から選択される、請求項５３に記載の二機能性プローブ。
  61. 核酸分子を切断するための、請求項５３～６０のいずれかに記載の二機能性プローブの使用。
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