WO2004002996A1 - フェロセン化合物およびその用途 - Google Patents

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WO2004002996A1
WO2004002996A1 PCT/JP2003/008166 JP0308166W WO2004002996A1 WO 2004002996 A1 WO2004002996 A1 WO 2004002996A1 JP 0308166 W JP0308166 W JP 0308166W WO 2004002996 A1 WO2004002996 A1 WO 2004002996A1
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WO
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group
compound
substituent
vitamin
hydrogen atom
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PCT/JP2003/008166
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English (en)
French (fr)
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Masaki Ishigai
Naoaki Murao
Nobuo Sekiguchi
Tadakatsu Takahashi
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisya
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C401/00—Irradiation products of cholesterol or its derivatives; Vitamin D derivatives, 9,10-seco cyclopenta[a]phenanthrene or analogues obtained by chemical preparation without irradiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F17/00—Metallocenes
    • C07F17/02—Metallocenes of metals of Groups 8, 9 or 10 of the Periodic System
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmacocene compound, a reagent containing the compound, a highly sensitive method for measuring a vitamin D compound using the reagent, and a compound in which the fluorescein compound and a vitamin D compound are bound.
  • calcitriol (trade name: oral cartrol (registered trademark)), alfacalcidol (trade name: alphalol (registered trademark)), maxacalcitol (trade name) as vitamin D compounds (VD compounds) as pharmaceuticals Oxarol (registered trademark)), tacalcitol (trade name Bonalpha (registered trademark)), calcipotriol (trade name Dovonex (registered trademark)), farecalcitrol (trade name Hornel (registered trademark); trade name Fulstan (registered trademark) (Trademark))), 2 ⁇ - (3-hydroxypropyloxy) 1-1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D 3 (ED-71 (development code name), Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) Is in the upper or clinical development stage.
  • VD compounds exert their medicinal properties in very small amounts and also exhibit the side effect of increasing Ca, so a high-sensitivity measurement method is essential.
  • LCZMS liquid chromatography mass spectrometry
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • VD compounds having a heteroatom such as an ester bond, an ether bond, a thioate ⁇ / bond, or an amide bond in the molecule such as maxacalcitol or ED-71 can be measured with high sensitivity.
  • the derivatization method is considered to be useful for increasing the sensitivity of VD compounds in mass spectrometry.
  • triazoline derivatives Cookson-type reagents
  • a 1 der reaction are often used [1 An a 1 ytica 1 Bioch em istry 1 992; 194: 77—81 1, 2 Pharmaceutical Journal 1 998; 118 (6): 206— 215, 3 Pharmaceutical Journal 1999; 119 (12): 898—920, 4 Biological Mass Spectr ome try 1993;
  • the Hue Sen compound represented by) is bound to a vitamin D compound (VD compound)
  • LCZMS liquid chromatography-mass spectrometry
  • LC ES I-MS / MS liquid chromatography electrospray ionization-mass spectrometry-mass spectrometry
  • the present invention relates to a Felucene compound represented by the following formula (1).
  • the present invention also relates to a compound of the formula (1), wherein Q represents a direct bond or alkylene.
  • the present invention relates to the aforementioned Fehsen compound wherein Q is methylene, and to a Ferrocene compound wherein Q is a direct bond.
  • the present invention also relates to a reagent for measuring a compound having a triene structure, which contains the above-mentioned Felucene compound.
  • a reagent may further contain a solvent capable of dissolving the Feuehsen compound.
  • Lower alkenyl group which may be substituted, lower alkynyl group which may have a substituent, lower alkoxy group which may have a substituent, lower acyl group which may have a substituent Represents a carboxy group which may have a substituent or a carbamoyl group which may have a substituent; m represents an integer of 1 to 3; n is an integer of 1 to 4 Represents. Relates to compounds and Fuwerosen compound and vitamin D compound represented bound by). Further, the present invention also relates to the compound, wherein the compound of the invention is a compound in which the bond between the fluorene compound and the vitamin D compound is a covalent bond.
  • the compound in which the ferrocene compound and the vitamin D compound are bonded is represented by the following formula (2)
  • a i and A 3 are each independently a lower alkylene which may have a substituent, a lower alkenylene which may have a substituent or a lower alkylene which may have a substituent
  • a 2 represents a direct bond
  • a 2 represents a direct bond
  • —CH CH—, — C ⁇ C —1, —O—, — S— or —NH—
  • R 9 represents a hydrogen atom
  • R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen, a lower alkyl group which may have a substituent, a lower alkenyl group which may have a substituent, or a substituent.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a protecting group
  • R 3 represents a lower alkynyl group which may be substituted, a lower alkoxy group which may be substituted or a lower acyl group which may be substituted
  • 4, R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a nitro group, Xia Group, halogen, lower alkyl group optionally having substituent (s), cycloalkyl group optionally having substituent (s), lower alkenyl group optionally having substituent (s), having substituent (s)
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, or R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • the present invention relates to a compound in which a humic acid compound, which is a compound represented by, and a vitamin D compound are bonded.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxycarboxylic propoxy group;
  • R 3 is a hydrogen atom;
  • R 4, R 5 and R 6 are independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a lower alkyl group or a lower cycloalkyl group optionally substituted by halogen; or
  • R 7 and R 8 are hydrogen atoms, or, R 7 And compounds in which R 8 is linked to form a double bond.
  • the present invention relates to a compound represented by the formula (2), wherein R and R ′ are hydrogen atoms.
  • the present invention also relates to a compound represented by the formula (2), wherein Q is a direct bond or a fluorene compound representing alkylene and a vitamin D compound. Furthermore, the present invention relates to a compound in which the above-mentioned Fe-mouthen compound in which Q is methylene and a vitamin D compound are bonded, and a compound in which a ferrocene compound in which Q is a direct bond and a vitamin D compound are bonded. In addition, the present invention provides a compound in which a vitamin D compound is a vitamin D 3 conjugate, wherein the vitamin D compound is a vitamin D 3 conjugated compound, among the compounds in which the vitamin c compound and the vitamin D compound are bound. Further, the present invention relates to a method for measuring a vitamin D compound contained in a sample, comprising the following formula (1)
  • the reaction of the fluorene compound represented by) with the vitamin D compound in the sample is carried out, and the compound obtained by combining the obtained fluorene compound and the vitamin D compound is subjected to liquid chromatography mass spectrometry.
  • the present invention also relates to a method for measuring a vitamin D compound, which is characterized in that the measurement is performed by chromatography (LC / MS).
  • the present invention provides a method for measuring the vitamin D compound, wherein the compound in which the ferrocene compound and the vitamin D compound are bound is a compound in which the fermented oxa compound and the vitamin D compound are bound by a covalent bond. Also about the method.
  • the compound in which the ferrocene compound and the vitamin D compound are bonded is represented by the following formula (2)
  • a and A 3 each independently represent a lower alkylene optionally having a substituent, a lower alkenylene optionally having a substituent or a lower alkylene optionally having a substituent.
  • a 2 represents a direct bond, —CH 2 CH—, — C ⁇ C—, 1 ⁇ 1, 1 S— or 1NH—; 1 ⁇ is a hydrogen atom or 1 OR 9 (R 9 is hydrogen R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen, a lower alkyl group optionally having substituent (s), a lower anorecenyl group optionally having substituent (s), or a substituent A lower alkynyl group which may have a substituent, a lower alkoxy group which may have a substituent or a lower acyl group which may have a substituent; R 3 represents a hydrogen atom or a protecting group; R 4 , R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a nitro
  • the present invention also relates to a method for measuring the aforementioned vitamin D compound, which is a compound represented by the formula:
  • the present invention also relates to a method for measuring a vitamin D compound in which R and R ′ are hydrogen atoms in the above-mentioned fluorene compound and the compound in which the above-mentioned fluorene compound and a vitamin D compound are bonded.
  • the present invention provides a compound in which the above-mentioned fluorene sensu compound and a vitamin D compound are bonded, wherein, in the compound represented by the above formula, a hue lipocene compound in which Q represents a direct bond or alkylene, and a vitamin D compound. It also relates to the method for measuring bound vitamin D compounds.
  • the method for measuring the vitamin D compound which is a compound in which the phlocene compound in which Q is methylene and a vitamin D compound, and the method in which the phlocene compound in which Q is a direct bond and the vitamin D compound,
  • the present invention also relates to the method for measuring a vitamin D compound which is a bound compound.
  • the present invention among the Hue spout compound and vitamin D compounds and is bound compound is the compound vitamin D compound is bonded and the Hue port Sen compound and vitamin D compound is a vitamin 13 3 Compound
  • the present invention also relates to a method for measuring a vitamin D compound.
  • the present invention also relates to the method for measuring a vitamin D compound, wherein the sample (sample to be measured) is a sample derived from a living body.
  • the present invention relates to a liquid chromatography / noise spectrometry (LC / MS) force liquid chromatography / electrospray ionization-one mass spectrometry Z mass spectrometry (LC / ES I-MS /
  • the present invention also relates to a method for measuring the above-mentioned vitamin D compound which is MS).
  • FIG. 1 shows an example of the results of measuring the ESI mass spectrum of ALF-FMTAD and ALF-FTAD.
  • FIG. 2 shows an example of the results of measurement of the product ion spectrum using the molecular ion [M] + of ALF-FMTAD and the molecular ion [M] + of ALF-FTAD as a precursor ion.
  • Figure 3 shows an example of the results of ALF-FM TAD, ALF-FTAD, and ALF direct measurement (control) when the LCZE S I-MSZMS measurement conditions were optimized.
  • VD 3 - FM TAD, VD 3 - FTAD, VD 3 when measured directly (control) and VD 3 - Hue port Sen force Rubameto (control) An example of a measurement result is shown.
  • FIG. 5 shows an example of a specific treatment scheme of pretreatment in the measurement method of the present invention when rat plasma is used as a sample.
  • FIG. 6 shows an example of the chromatogram at the lower limit of the calibration curve of the measurement method of the present invention and the conventional method.
  • A) is the chromatogram at the lower limit of the calibration curve of the assay of the present invention using lmL of rat plasma
  • B) is the chromatogram at the lower limit of the calibration curve of the assay of the present invention using 100 ⁇ L of rat plasma.
  • D) is the chromatogram at the lower limit of the calibration curve at the time of direct measurement.
  • FIG. 7 shows an example of a typical Daraf showing a calibration curve of the measurement method of the present invention using ALF-FMTAD.
  • FIG. 8 is an example of a specific treatment scheme of the pretreatment in the measurement method of the present invention when rat plasma is used as a sample, and is a simplified version of the treatment method of FIG.
  • FIG. 9 shows a diagram of column switching in the measurement method of the present invention.
  • FIG. 10 shows an example of a graph of a typical calibration curve when measured under the conditions of FIGS. 8 and 9 and Table 12 in the measurement method of the present invention.
  • FIG. 11 shows a chromatogram of ALF-FMTAD specificity measured under the conditions of FIGS. 8, 9 and Table 12 in the measurement method of the present invention.
  • A) is the chromatogram of rat blank plasma
  • B) is the chromatogram of the calibration blank (ALF: 0 ng / mL)
  • C) is the chromatogram of the lower calibration curve (ALF: 0.05 ng / mL).
  • FIG. 12 shows a chromatogram of d 4 -ALF-FMTAD specificity measured under the conditions of FIGS. 8 and 9 and Table 12 in the measurement method of the present invention.
  • A) is the chromatogram of rat blank plasma
  • B) is the chromatogram of the lower limit of the calibration curve (ALF: 0.05 ng / mL, also-ALF: 8 ng / mL).
  • the “lower alkyl group” in “R a ” refers to a straight-chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s-butynole, t-butynole, pentynole, isopentyl, neopentynole, and hexinole. Refers to a chain or branched alkyl group.
  • Alkylene at W i and W 2 refers methylene, ethylene, propylene, isopropylene, straight-chain or branched alkylene chain of from 1 to 6 carbon butylene and the like.
  • phenylene in the above refers to o-phenylene, m-phenylene or p-phenylene.
  • R and R ′ each independently have a hydrogen atom, a hydroxyl group, a nitro group, a cyano group, a halogen, a lower alkyl group which may have a substituent, and a substituent.
  • halogen refers to chlorine, fluorine, bromine, iodine, etc .
  • lower alkyl group refers to methyl, ethynole, propynole, isopropynole, butyl, isobutynole, s-butynole, t-butyl, Refers to a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, etc .
  • lower alkenyl group means etul, 1-propeninole, aryl, 1-buteninole, 2 —Butyl, 3-buteninole, pentenyl, hexenyl, etc., refers to a straight-chain or branched alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • lower alkynyl group means ethur, propynyl,
  • "lower alkoxy group” means methoxy, ethoxy, A C1-C6 alkoxy group such as ropoxy, isopropoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy, phenoxy, etc .
  • "lower acetyl group” means formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl , Vivaloyl, Hexanoyl, etc. Refers to the acyl group of 6.
  • substituents in the above substituents means, if desired, one or more (eg, 1 to 3) hydroxyl groups; a nitro group; a cyano group; chlorine, fluorine, bromine, and iodine.
  • a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutynole, s-butynole, t-butynole, pentynole, isopentynole, neopentynole, hexyl, etc .; ethenyl A linear or branched alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as 1-propeninole, arinole, 1-buteninole, 2-buteninole, 3-buteninole, pentene-nore, and hexenyl; ethur, provinyl, C1-C6 linear or branched alkynyl groups such as buter, pentynyl and hexyl; methoxy, ethoxy, propoxy, i C 1-6 alkoxy groups such as sopropoxy,
  • the Felucene compound of the present invention (compound 6 in the following production scheme) can be produced according to the following production scheme.
  • Step 1 Compound 2 is obtained by converting diphenyl phosphoryl azide and Compound 1 from Compound 1.
  • a method of reacting a base a method of converting a carboxylic acid into an acid chloride or an acid anhydride and then reacting with sodium azide, a method of converting a carboxylic acid into an ester, a method of reacting with hydrazine, and converting the compound into an amide with hydrazine It can be synthesized by a method of reacting with nitrite or nitrite, and preferably by a method of reacting diphenylphosphoryl azide and a base.
  • the compound 1 as a starting material is known or can be easily synthesized from a known compound by a known synthesis method.
  • Compound 1 is also commercially available, and can be purchased, for example, from Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • Examples of the base used in the method for reacting diphenylphosphoryl azide and a base include triethylamine, diisopropylethylamine and the like, and preferably triethylamine.
  • Examples of the solvent used in the method for reacting diphenylphosphoryl azide and a base include dichloromethane, chlorophonolem, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, dioxane, and dimethoxetane, and preferably dichloromethane. No.
  • the reaction temperature of the method of reacting diphenylphosphoryl azide and a base is not particularly limited as long as it proceeds, but it is generally carried out at a temperature of from 180 to 50 ° C, preferably from 10 to 10 ° C. Perform in C.
  • step 2 compound 3 can be synthesized by heating compound 2.
  • the solvent used in the above step 2 include dichloromethane, chloroform, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, tetrahydrofuran, ethyl ether, dioxane, and dimethoxetane, and preferably toluene.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is generally performed at 20 ° C. to 200 ° C., preferably at 50 ° C. to 150 ° C.
  • step 3 compound 4 can be obtained by reacting compound 3 with carbazate ester.
  • the solvent used in the above step 3 include dichloromethane, chlorohonolem, dichloroethane, benzene, tonoleene, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, dioxane, and dimethoxetane, and preferably toluene.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is generally carried out at 0 to 200 ° C, preferably at 20 to 120 ° C.
  • compound 5 can be obtained by reacting compound 4 with a base.
  • Examples of the solvent used in the above step 4 include methanol, ethanol, isopropanol, dichloromethane, chlorophonolem, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, dioxane, and dimethoxetane, and are preferable. Ethanol is mentioned.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is generally performed at 0 to 200 ° C, preferably at 20 to 120 ° C.
  • step 5 compound 6 can be produced by reacting compound 5 with iodobenzene diacetate.
  • the solvent used in the above step 4 include ethyl acetate / ethylene acetate, dichloromethane, chlorophonorem, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, tetrahydrofuran (THF), getyl ether, dioxane, and dimethoxetane, and the like. Examples include tetrahydrofuran (THF) or dioxane.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds.
  • the reaction is carried out at ⁇ 78 to 100 ° C., preferably at ⁇ 10 to 50 ° C.
  • step 6 compound 9 is compound 7 (Y is hydroxyl group, carboxylic acid chloride residue, carboxylic acid anhydride residue, carboxylic ester group, isocyanate group, sulfonyl chloride residue, halogen atom, alkylsulfonyl Reacts with a compound 8 (Z represents a hydroxyl group, an optionally substituted amino group, a halogen atom, an alkylsulfonyloxy group, or an arylsulfonyloxy group) Can be synthesized (step 6).
  • the reaction is preferably performed in the presence of a base.
  • compound 7 in which Y is a carboxylic acid chloride residue, a carboxylic acid anhydride residue, a carboxylic ester group, an isocyanate group or a sulfonyl chloride residue, and Z is a hydroxyl group Combination of compound 8 which is an amino group which may have a substituent; compound 7 where Y is a hydroxyl group and compound 8 where Z is a halogen atom, an alkylsulfonyloxy group or an arylsulfonyloxy group
  • Z is a halogen atom, an alkylsulfonyloxy group or an arylsulfonyloxy group
  • Z is a hydroxyl group
  • Compounds 7 and 8 as starting materials are known or can be easily synthesized from known compounds by a known synthesis method.
  • Compound 7 is also commercially available, and can be purchased from, for example, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Examples of the base used in the above step 6 include sodium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydrogencarbonate, sodium hydrogencarbonate, sodium hydride, hydrogenate, lithium carbonate, sodium carbonate, calcium carbonate, cesium carbonate, and triethylamine. , Diisopropylethylamine, pyridine, 2,6-dimethinolepyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, 4- (dimethylamino) pyridine and the like.
  • the solution used in step 6 above examples include water, methanol, ethanol, isopropanol, dichloromethane, chlorophonolem, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, dioxane, and dimethoxetane.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the reaction proceeds. Generally, the reaction is carried out at ⁇ 78 to 200 ° C., preferably at 110 to 150 ° C.
  • the reaction conditions and the like in Step 5 are as described above.
  • the thus obtained phloem sen compound of the present invention can be isolated by performing operations such as purification and drying according to a known method, if necessary.
  • the obtained fluorene compound may be unstable.
  • the compound may be stored in a solvent in which the compound can stably exist (for example, tetrahydrofuran, dioxane, or the like).
  • the compound of the present invention comprises a compound having a triene structure, such as a vitamin D compound (VD compound), which is obtained by liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS), particularly liquid chromatography / electrospray ionization.
  • LC / MS liquid chromatography / mass spectrometry
  • One mass spectrometry It is useful as a reagent (derivatizing agent) for measurement by Z mass spectrometry (LCZES I-MS / MS).
  • the reagent of the present invention means both the above-mentioned humic acid compound alone and a solution containing the above-mentioned humic acid compound.
  • the solvent that can be used in the reagent of the present invention include ethynole acetate, dichloromethane, chlorohonolem, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, tetrahydrofuran (THF), ethynoleatenole, dioxane, and dimethoxetane.
  • THF tetrahydrofuran
  • dioxane is used.
  • the content of the ferrous compound in the solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.001 to 99% by weight, preferably 0.005 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 10% by weight. It is appropriately selected from the range.
  • the target compound is measured using the reagent of the present invention, specifically, the ferrocene compound in the reagent is reacted with the VD compound, and the compound obtained by binding these compounds is subjected to LC / ES I-MS / MS, etc. This measures the VD compound. Details of the measurement will be described later.
  • the VD compound to be bound with the Fe-mouth compound of the present invention (that is, As a VD compound, a vitamin D 3 compound (VD 3 compound) is preferred.
  • the VD 3 compound is a compound having a 9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene structure, preferably (5Z, 7E)-9,10- Seco-cholester 5, 7, 10 (19) — A compound having a trifluoroene structure, more preferably (let, 5 Z, 7 E) — 9, 10 — Seco-cholester 5, 7, 10 (1 9) —trien—Compound having a mono-ol structure, (3 ⁇ , 5 ⁇ , 7 ⁇ ) -19,10-secocholester 5,7,10 (1 9) —Trien-13-ol structure Or a compound having the structure (1 ⁇ , 5 ⁇ , 7 ⁇ ) —9,10—secocholesta-5,7,10 (19) —triene-1,3-diol.
  • VD 3 compounds include cholecalciferol (VD 3 ), calcitriol (1 ⁇ , 25 (OH) 2 D 3 ; trade name Mouth cartrol (registered trademark), capsule / manufacturing ⁇ Distributors Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd., Note / Importer Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kirin Brewery Co., Ltd., Alfacalcidol (ALF; trade name: Alfarol (registered trademark), Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) Company; Japanese Patent Publication No.
  • VD 3, 1 ⁇ , 2 5 (OH) 2 D 3, ALF , etc. are commercially available, for example, S o 1 vay P harmaceutical Co., CALBIO Inc., F LUKA Company, F Ormo SA Inc., WAKO It can be purchased from companies. Representative structures of these compounds are shown below.
  • VD compounds to be bound to the Fe-acene compound of the present invention namely, VD compounds to be measured
  • the molecule has an ester bond, an ether bond, a thioether bond, or a hetero bond such as an amide bond.
  • a hetero bond such as an amide bond.
  • the triazoline skeleton of the ferrocene compound of the present invention is selectively reacted with the benzene structure of the VD compound by a Die 1 s -A 1 der reaction.
  • Die 1 s -A 1 der reaction Just fine. Specific examples include ethyl acetate, dichloromethane, chlorophonolem, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, tetrahydrofuran (THF), getyl ether, dioxane, and dimethoxetane (preferably tetrahydrofuran (THF) or dioxane).
  • the fluorene compound of the present invention and the VD compound may be reacted for 5 minutes to 5 hours (preferably, 15 minutes to 3 hours) in an appropriate solvent.
  • the reaction temperature is particularly limited as long as it proceeds Although not, generally, it is carried out at _78 to 100 ° C, preferably _10 to 50 ° C.
  • water or an alcohol solvent such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol may be added to stop the reaction.
  • the thus obtained conjugate of the fullerene compound of the present invention and the VD compound can be isolated, if necessary, by performing operations such as purification and drying according to known methods.
  • conjugate of the Felucene compound of the present invention and the VD compound is a compound in which the Felucene compound and the VD compound are covalently bonded. Further, the conjugate of the Felucene compound and the VD compound of the present invention preferably has the following formula (2)
  • RJ represents a hydrogen atom or one OR 9 (R 9 represents a hydrogen atom or a protecting group), preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen, a substituent
  • a lower alkyl group which may have a substituent, a lower alkenyl group which may have a substituent, and a substituent represents a lower alkynyl group which may have a substituent, a lower alkoxy group which may have a substituent or a lower acyl group which may have a substituent, and is preferably a hydrogen atom or a hydroxypropoxy group.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a protecting group, and is preferably a hydrogen atom.
  • R 4 , 15 and scale 6 each independently have a hydrogen atom, a hydroxyl group, a nitro group, a cyano group, a halogen, a lower alkyl group which may have a substituent, and a substituent.
  • “R 7 and R 8 ” each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, or R 7 and R 8 are linked to form a double bond, preferably a hydrogen atom or R 7 and R 8 is linked to form a double bond.
  • lower alkylene in A i and A 3, and refers to a straight-chain or branched alkylene chain of from 1 to 6 carbon atoms, "lower alkenylene” linear or branched 1 to 6 carbon atoms "Alkylene chain”, “lower alkynylene” refers to a linear or branched alkynylene chain having from! To 6 carbon atoms.
  • substituent means, if desired, one or more (eg, 1 to 3) hydroxyl groups; a nitro group; a cyano group; a halogen such as chlorine, fluorine, bromine, or iodine;
  • a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as ethenyl, propynole, isopropynole, butynole, isobutynole, s-butyl, t-butyl / pentyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, etc .;
  • ethenyl Linear or branched alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as, 1-propenyl, aryl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, pentenyl, hexenyl; Linear or branched alkynyl groups having 1
  • Halogen in the above R 2 , R 4 , R 5 and R 6 refers to chlorine, fluorine, bromine, iodine, etc .
  • “Lower alkyl” means methyl, ethyl, propyl, isopropynole, butynole, isobutynole S-butynole, t-butynole, pentynole, isopentyl, neopentyl, hexyl, etc., refers to a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • “lower alkenyl” means A linear or branched alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as benzyl, aryl, 1-buteninole, 2_buteninole, 3-buteninole, penteninole, hexenyl, etc .
  • “lower alkynyl” Refers to a straight-chain or
  • the “cycloalkyl group” of R 4 , R 5 and R 6 is a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms such as cyclopropyl, cyclobutynole, cyclopentynole, cyclohexynole, cycloheptinole, and cycloactinole. Refers to the group.
  • substituents may have a substituent (s) means, if desired, one or more (eg, 1 to 3) hydroxyl groups; nitro groups; cyano groups; chlorine, fluorine, bromine, and iodine.
  • a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, isopentinole, neopentyl, hexyl, etc .; 1-buteninole, 2-buteninole, 3-pteninole, penteninole, hexenyl, etc., linear or branched alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms; Carbon number of butul, pentynyl, hexul etc .; Straight-chain or branched alkynyl group having up to 6 carbon atoms; methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy, phenoxy, etc.
  • a xy group having 1 to 6 carbon atoms such as formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, bivaloyl, and hexanoyl; a carboxy group; a carbamoyl group; and / or a substituent such as an amino group. It means that you may have it.
  • the “protecting group” in the above and R 3 is not particularly limited as long as it is appropriate as a protecting group for a hydroxyl group.
  • Examples thereof include a lower acryl group, a lower alkyl group which may have a substituent, Examples thereof include a lower alkylsulfonyl group which may have a substituent, a lower alkoxycarbonyl group which may have a substituent, and a substituted silyl group.
  • the “lower acyl group”, “lower alkyl group”, “lower alkoxy group”, possible “substituent” and the like are as described in the preceding paragraph.
  • the conjugate of the fullerene compound and the VD compound obtained by reacting the above-mentioned ferrocene compound of the present invention with the VD compound can be used when measuring the VD compound by LC / ESI-MS / MS or the like. It is useful as a standard.
  • the Fe-acene compound of the present invention may be bound to the VD compound according to the method described above.
  • the sample is preferably a biological sample.
  • the biological sample refers to a body fluid (blood, lysate, cerebrospinal fluid), urine, and the like, and is preferably plasma, serum, or urine.
  • the term “derived from a living organism” preferably means a term derived from a mammal, and more preferably a term derived from a human, monkey, dog, rabbit, guinea pig, rat, or mouse.
  • ferrocene compound and the VD compound present in the sample may be combined, and the obtained conjugate of the ferrocene compound and the VD compound of the present invention may be used for subsequent measurement.
  • the sample is subjected to solid-phase extraction after the reaction of the Felucene compound of the present invention with the VD compound present in the sample.
  • the Fe-acetone compound of the present invention is allowed to react with the VD compound present in the sample, and then the solid-phase extraction of the sample is performed again.
  • the solid phase extraction before the reaction of the Hue sen compound of the present invention with the VD compound present in the sample after deproteinization of the present invention is preferably performed using a normal phase solid phase extraction cartridge, and particularly preferably. Is performed using a silica gel-based solid phase extraction cartridge.
  • the solid-phase extraction after reacting the ferrocene compound of the present invention with the VD compound present in the sample is preferably performed using a reversed-phase solid-phase extraction cartridge.
  • LC / MS refers to a measuring method or a measuring instrument utilizing or applying the principle of measurement by LC / MS (liquid chromatography mass spectrometry), and specifically, liquid chromatography mass spectrometry.
  • LC / MS liquid chromatography mass spectrometry
  • tandem liquid chromatography Z mass spectrometry // mass spectrometry LC / MSZMS
  • electrospray ionization ES I
  • atmospheric pressure chemical ionization APC I
  • liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry mass spectrometry is particularly preferably used.
  • the measurement by MS / MS is carried out by dissolving the residue containing the conjugate of the ferrocene compound of the present invention and the VD compound obtained as described above in a mobile phase, Inject into MSZMS and measure.
  • the amount and type of the sample to be measured the amount of the VD compound present in the sample, What is necessary is just to adjust and set suitably according to the kind, the required measurement sensitivity, the kind of the fluorene compound of the present invention used as a derivatizing agent, the configuration of the LC / ES I-MS / MS instrument used for the measurement, and the like.
  • the MRM (Multiple Reaction Monitoring) conditions of the conjugate of the Fe-mouth compound and the VD compound of the present invention are carefully examined and various conditions are appropriately set, and LC conditions that enable efficient ionization are set. Also set.
  • I.S. an internal standard
  • I.S. preferably a stable isotope label of the analyte
  • Measure each. I. S. Calculate the peak area ratio (or peak height ratio) of the object to be measured, and create a calibration curve from the relationship with the added concentration, and calculate the biological area from the calibration curve and the peak area ratio (or peak height ratio) of the measurement sample.
  • the method of measuring the VD compound of the present invention performed in this way is a measurement method with higher sensitivity than the conventional method.
  • the measurement method of the present invention provides a VD compound that does not have a hetero atom such as an ester bond, an ether bond, a thioether bond, or an amide bond in the molecule (specifically, the sensitivity is insufficient with the conventional measurement methods).
  • the measurement of VD 3 , calcipotriol, 1 ⁇ , 25 (OH) 2 D 3 , ALF, farrecalcitriol, EB1089, compound A, etc., described above is several hundred times larger than the conventional method. This is a measurement method that can achieve high sensitivity.
  • VD compounds having a hetero atom such as an ester bond, an ether bond, a thioether bond, or an amide bond (specifically, the above-mentioned OCT, ED-71, etc.) but also those hetero atoms. It is a highly sensitive measurement method applicable to all VD compounds, up to VD compounds that do not.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectrum
  • EX-270 manufactured by JEOL
  • Electrospray Ionization LC / MS / MS (LC / ESI-MS / MS) was used as a high-performance liquid chromatograph A11 iance 2790 (manufactured by Waters Co.) and a quadrupole mass spectrometer.
  • LC Micromass UK Ltd.
  • Microsoft Lyx Ver 3.3 manufactured by Microsoft uks
  • Microsoft Excel 2000 manufactured by Microsoft
  • reaction mixture was diluted with dichloromethane, washed sequentially with a 1% aqueous hydrochloric acid solution and a saturated sodium hydrogen carbonate solution, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain a 4 mL toluene solution.
  • To the resulting toluene solution was added 2 m of toluene, and while stirring at room temperature, 0.34 g (3.27 mmo 1) of carbazic acid ethyl ester was added, followed by heating under reflux for 1 hour.
  • the reaction mixture was diluted with dichloromethane at methane, washed successively with a 1% aqueous hydrochloric acid solution and a saturated sodium hydrogen carbonate solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • the obtained residue was washed with a hexane-dichloromethane (1: 1) mixture, and 0.52 g (72%) of 3-ferrosenylcarbamoylcarbazate ethyl ester was added as a yellow powder. I got it.
  • Example 1-2 a mixture of 4-ferrocenylperazole (5 mg, 0.017 mmo 1) and tetrahydrofuran (0.25 mL) was mixed with 4.5 mg (0.014 mmo 1) of eodobenzene diacetate. The mixture was added at room temperature and stirred for 1 hour to obtain a tetrahydrofuran solution of 4-phenyl-1-enyl-1,2,4-triazoline-1,3-dione. The obtained solution was mixed with 1 mg of alpha canolecidol (0.00255) produced according to the method described in JP-A-48-62750 and Tetrahedron Lett., 1973, 2339, Tetrahedron, 30, 2701 (1974).
  • Example 2-3 Synthesis of cholecalciferol 4- (fuerosenylmethyl) -1,2,4_triazoline_3,5-dione adduct (VD 3 -FMTAD) Refer to Example 1-1. , 4 (Ferocenyl methyl) ⁇ lazonore 10mg
  • Example 1_2 4-phenyl phenyl perazole 1 Omg (0.035 mmo 1) and 0.5 mL of tetrahydrofuran were added to a mixture of 0.5 mL of tetrahydrofuran diacetate llmg (0.034 mmo 1). The mixture was added at room temperature and stirred for 1 hour to obtain a tetrahydrofuran solution of 4-phenyl-1-enyl-1,2,4-triazoline-1,5-dione. Tetra hydrofuran Kore the resulting solution Cal Schiff We roll (VD 3, S olvay P harmaceutical Ltd.) 1 0m g (0. 0 2 6mmo l) (0.
  • Triethylamine 0.10 mg (0.043 mmo 1), diphenylphosphoryl azide 0.5 mL (0.046 mmo 1) and toluene 0.5 mL mixed with ice 5 mL (0.108 mmo 1) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction mixture was diluted with dichloromethane, washed with 1% hydrochloric acid and saturated aqueous sodium bicarbonate, the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and dichloromethane was distilled off under reduced pressure to obtain an unpurified toluene solution.
  • Example 3-1 Alpha-calcidone 4- (fueroseninolemethyl) -1,2,4-triazoline_3,5-dione adduct (ALF-FMTAD) and alfa-canolesi-donole 4-hue mouth Measurement of Cenyl-1,2,4-triazoline_3,5-dione adduct (ALF-FTAD)
  • Alphacalcidol 4- (Ferocenylme) synthesized with reference to Example 2-1 Tyl) _1,2,4-triazoline_3,5-dione adduct (AL F—FMTAD) and alpha-calcidol synthesized with reference to Example 2_2 4-fluoro-2,1,2,4_ Triazoline 1,3,5-dione adduct (AL F—FTAD) each in mobile phase (l Ommol ZL ammonium acetate nocetonitrile acetate)
  • Fig. 2 shows an example of the measurement results.
  • the sensitivity at the time of direct measurement of alphacalcidol (ALF) measured in the same manner is 75 pg (188 fmol) / inj (S / N ratio is about 6).
  • the method was about 300 times more sensitive than the direct measurement.
  • Fig. 3 shows an example of these measurement results.
  • Example 3-2 Cholecalciferonole 4-((Ferocenylmethyl) -11,2,4-triazoline_3,5-dione adduct (VD 3 —FMTAD) and Colecaniferonele 4 _ Measurement of ferrocenyl_1,2,4-triazoline-1 3,5-dione adduct (VD 3 — FTAD) Cholecalciferol 4_ (Frocenylmethyl) — 1, 2, 4-triazoline-13, 5-dione adduct synthesized with reference to Example 2-3 (VD 3 — FMTA D) and Reference to Example 2-4 cholecalciferol Schiff Errol 4- Fuwerose two Lou 1, 2 synthesized in 4 Toriazorin one 3, 5-dione adduct - using (VD 3 FTAD), were optimized similarly measuring conditions as in example 3-1 As a result, all were 250 fg
  • VD 3 Hue mouth force lubamate
  • Comparative Example 2-1 has a sensitivity of 50 pg (130 fmol) / inj (S / N ratio is about 8), 1 pg (1.64 fmo 1) / inj (S / N ratio is about 5), and the measurement method of the present invention was about 200 times more sensitive than the direct measurement method, and 4 times or more more sensitive than the measurement method based on the phage mouth force rubamate derivatization.
  • Fig. 4 shows an example of these measurement results.
  • Alpha calcidol produced according to the method described in JP-A-48-62750, Tetrahedron Lett., 1973, 2339, Tetrahedron, 30, 2701 (1974), in 100 ⁇ L of rat blank plasma. Were added to prepare calibration curve preparation samples of 0, 0.08, 0.25, 0.8, 2.5, 8 and 25 ng ZmL. At each concentration of 100 ⁇ L, add ⁇ 116111. Ph a rm.
  • Source block setting temperature 150 ° C
  • Desolator set temperature 450 ° C
  • ALF-FMTAD m / zG91 [M] +> 199 [MC 29 H440 4 N3] +
  • the lower limit of the calibration curve in the measurement method of the present invention was 0.08 ng / mL, and the direct measurement shown in Comparative Example 4_1 was performed.
  • the sensitivity was 125 times higher than the time (10 ng / mL), and 12.5 times higher than the time (I ng / mL) measured by PTAD derivatization shown in Comparative Example 4-2.
  • the lower limit of the calibration curve was determined in the same manner as described above using 1 mL of rat plasma. As a result, the lower limit of the calibration curve in the measurement method of the present invention was 0.01 ngZm.
  • Fig. 6 shows an example of the chromatogram at the lower limit of the calibration curve.
  • the samples used in the previous step of (2) were measured for 3 days each, the peak area ratio of the measurement object to IS was determined, and a calibration curve was created by the least square method from the relationship with the added concentration, and (1 / y 2 weights), the correlation coefficient (r) and the trueness of the back calculated value at each concentration were determined. From the calibration curve and the peak area ratio of each sample, the actually measured value was determined in ngZmL units with three significant figures. Although two types of isomers (6R / 6S) are generated in the derivatization reaction using FMTAD, a peak having a large SZN ratio is selected (retention time).
  • Table 3 shows the results of a three-day calibration curve, and Fig. 7 shows a typical rough graph.
  • the correlation coefficient of the calibration curve (r) 0. 991 in the range of 0. 08 ⁇ 25 n gZmL is 27 7 ⁇ 0 999741 (1 / y 2 weighted), trueness of back-calculated values of the concentrations -. 7. It showed good linearity of 6 to 9.9%.
  • the CV value at each concentration was 15% or less (20% or less at the lower limit of quantification), and the accuracy was within ⁇ 15% (within ⁇ 20% at the lower limit of quantification), indicating good accuracy and accuracy.
  • Table 5 shows an example of the results.
  • the CV value at each concentration was 15% or less (20% or less at the lower limit of quantification), and the accuracy was within soil% (within ⁇ 20% at the lower limit of quantification), with good accuracy and accuracy.
  • (7) Examination of recovery rate The simultaneous reproducibility sample used in the above (5) was used as a sample for the recovery rate.
  • 100 L of 0.145, 0.436, 4.36 and 43.6 ng / mL ALF-FMTAD was added to the sample pretreated with rat blank plasma. Dispensed two at a time. Each was measured, and the average value of the peak area of the reference sample was set to 100%, and the recovery rate of ALF was determined by comparison with the peak area of the measured sample.
  • Table 6 shows an example of the results. In each case, the recovery rates were practically acceptable.
  • the sample with simultaneous reproducibility used in the above (5) was used as a sample for derivatization ratio.
  • Guidance Rat blank plasma was deproteinized with ethanol as a control sample (reference sample) for solidification calculation, and solid phase was extracted using a solid phase extraction cartridge (Bond E 1 ut SI, 3 cc, 500 mg: manufactured by Varian SPP). After the extraction, two samples prepared by adding ALF-FMTAD to the sample containing FM TAD were prepared. Each was measured, and the average value of the peak area of the reference sample was set to 100%, and the derivatization ratio of ALF was calculated by comparison with the peak area of the measured sample.
  • Derivatization rate (Peak area of sample for derivatization rate Z Average value of peak area of reference sample) X 100 (%)
  • Table 7 shows an example of the results. In all cases, the derivatization ratio was sufficient for practical use.
  • Example 4-12 Measurement of ED-71 in rat plasma by FMTAD derivatization Except that ED-71 was used as a vitamin D compound, the same procedure as in the preceding paragraph of Example 4_1 (2) was performed. ED-71 was determined by FMTAD derivatization using LC / ES IMS ZMS. Table 8 shows the measurement conditions. Table 8
  • Source block setting temperature 150 ° C
  • Desolator set temperature 450 ° C
  • the measurement method of the present invention showed that the measurement was performed at 0.25 ⁇ g / mL.
  • rat blank plasma was spiked with alphacalcidol (ALF), and calibration of 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 and 100 OngZmL was performed.
  • a sample for preparing a line was prepared.
  • ALF 2 E ethanol deproteinization
  • solid-phase extraction cartridge B ond E 1 ut SI, 3 cc, 500 mg: Varian SPP.
  • the residue was dissolved in 40 ⁇ L of the mobile phase, and 10 ⁇ L was injected into LCZE SI-MS, MS. Table 10 shows the measurement conditions.
  • Table 10 shows the measurement conditions. Table 10
  • rat blank plasma was spiked with alphacalcidol (ALF) to give 0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 30, 100 and 300 ng.
  • a sample for preparing a calibration curve of / mL was prepared. Each concentration 1 00 ⁇ L, d 4 of 40 n gZmL as an internal standard substance (I S..) - After addition of ALF 20 L, ethanol deproteinization, solid-phase extraction cartridge (B ond E 1 ut SI, 3 cc, 500mg: Varian SPP), and then perform the solid-phase extraction, followed by the description in the paper (Biological Mass Spectrometer try 1999).
  • the sample pretreatment method shown in FIG. 5 was simplified as follows.
  • Alphacalcid After adding 40 ng / raL of d4-ALF (IS) 20 ⁇ L to rat blank plasma (100 ⁇ L) to which rat (ALF) was added, deproteinizing with acetonitrile, a 96-well solid phase extraction cartridge (Oasis HLB) Solid-phase extraction was performed using a 96-well plate, lcc, 10 mg: manufactured by Waters.
  • Source block setting temperature 150 ° C
  • ALF-FMTAD m / z 697 [M] +> 199 [M - C 29 H 44 0 4 N 3] +
  • Figure 9 shows the column switching. Derivatization with FMTAD Two isomers (6R / 6S) are generated in the reaction, but since the S / N ratio of the first eluting isomer on HPLC was high, this S / N ratio was applied from the trapping column to the analytical column. Column switching conditions were set to pass only the eluted fraction of the higher isomer.
  • ALF ethanol solution 100 ng / mL ALF ethanol solution was diluted with rat blank plasma to prepare calibration curve preparation samples at 0, 0.05, 0, 15, 0.5, 1.5, 1.5, 5 and 15 ng / mL.
  • Sample 100 1 for preparing a calibration curve was processed under the conditions described in (1) above and measured. This sample was measured for 3 days. The peak area ratio of the measurement target to IS is calculated, and a calibration curve is created by the least squares method (1 / ⁇ weighting) from the relationship with the added concentration, and the correlation coefficient (r) and the back-calculated value at each concentration are calculated. The trueness of was sought.
  • Table 13 shows the results of creating a calibration curve for three days, and Fig. 10 shows a typical graph.
  • Table 1 3 Addition concentration I B 12 2 Day 3
  • Soybean curd concentration Measured value Average soil SD CV Accuracy
  • the CV value at each concentration was 15% or less (20% or less at the lower limit of quantification), and the accuracy was within ⁇ 15% (within ⁇ 20% at the lower limit of quantification), indicating good accuracy and accuracy.
  • Reference sample 1 The sample with simultaneous reproducibility used in the above (3) was used as a sample for the recovery rate.
  • Reference sample 1 rat blank plasma was pre-treated on a sample pretreated with rat blank plasma. L was dispensed in triplicate, and after derivatization, it was measured. The average value of the peak area of Reference Sample 1 was set to 100%, and the ALF recovery was determined by comparing the peak areas of the measurement samples. Table 16 shows the results. In all cases, the recovery rates were practically acceptable.
  • reference sample (1) prepared in (5) As a control sample for derivatization ratio calculation (reference sample 2), pre-treat rat blank plasma and add 0.0436, 0.0871, 1.39 and 13.9 ng / mL ALF-FMTAD ethanol solution 100 / iL each to the derivatized sample. It was dispensed one by one and measured. The average value of the peak area of Reference Sample 2 was set to 100%, and the extraction efficiency of ALF was determined by comparing the peak areas of the measurement samples. Table 16 shows. In all cases, the derivatization rates were practically acceptable.
  • Fig. 11 shows the chromatogram of ALF-FMTAD
  • Fig. 12 shows the chromatogram of d4-ALF-FMTAD.
  • the pretreatment method for the derivatization method of vitamin D derivatives using FMTAD was simplified, and the LC / ESI-MS / MS method using column switching was adopted.
  • the recovery rate was improved, and higher sensitivity was achieved with a lower limit of quantification of 0.05 ng / mL.
  • This method is a quantitative method with excellent sensitivity, specificity, linearity, and accuracy, and is considered to be sufficiently applicable to the analysis of multiple samples.
  • the VD compound is reacted with the VD compound according to the present invention, and the compound obtained by reacting the compound is subjected to LC / ESI-MSZMS. It became possible to measure. Furthermore, the measurement method of the present invention provides a VD compound that does not have a hetero atom such as an ester bond, an ether bond, a thioether bond, or an amide bond in a molecule, the sensitivity of which has been insufficient with conventional measurement methods.
  • a hetero atom such as an ester bond, an ether bond, a thioether bond, or an amide bond in a molecule
  • VD 3 calcipotriol, Oite the measurement of la, 25 (OH) 2 D 3, ALF, file Leka Rushito triol, EB 1089, compound a, etc.
  • This is a measurement method that can achieve a sensitivity 100 times higher.
  • VD compounds having hetero atoms such as ester bond, ether bond, thioether bond, amide bond, etc. (specifically, OCT, ED-71, etc. described above), but also VD compounds having no hetero atoms. It is a highly sensitive measurement method applicable to all VD compounds, including compounds. Also, unlike the case of using phenylenyl azide as a derivatizing agent, it is a method for measuring VD compounds that is easy to handle because there is no need to heat the reaction conditions.
  • the Feue sen compound of the present invention is very useful as a derivatizing agent when measuring a VD compound by LC / ES I MSZMS.
  • conjugate of the fluorocene compound and the VD compound obtained by reacting the fluorocene compound of the present invention with the VD compound is a standard for measuring the VD compound by LC / ES I-MS ZMS.

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Description

明細書
フエロセン化合物およびその用途 技術分野
本発明は、 新規なフエ口セン化合物、 その化合物を含有する試薬、 その試薬を 用いるビタミン D化合物の高感度測定法、 およびそのフエ口セン化合物とビタミ ン D化合物とが結合した化合物に関する。 背景技術
現在、 医薬品としてのビタミン D化合物 （VD化合物） として、 カルシトリオ ール （商品名 口カルトロール （登録商標） ） 、 アルファカルシドール （商品名 アルファロール （登録商標） ） 、 マキサカルシトール （商品名 ォキサロール (登録商標） ） 、 タカルシトール （商品名 ボンアルファ （登録商標） ） 、 カル シポトリオール （商品名 ドボネックス （登録商標） ） 、 ファレカルシトリォー ル （商品名 ホーネル （登録商標） ；商品名 フルスタン （登録商標） ) 、 2 β - (3—ヒ ドロキシプロピルォキシ） 一 1 α， 25—ジヒ ドロキシビタミン D3 (ED— 7 1 (開発コード名） 、 中外製薬株式会社） 等、 各種の化合物が上巿或 いは臨床開発段階にある。 VD化合物はごく微量で薬効を発揮し、 副作用である C a上昇作用も発現することから、 高感度測定法が必須である。 近年、 質量分析 法の発展に伴い、 液体クロマトグラフィー マススぺタトロメ トリー （LCZM S) およびタンデム型の液体クロマトグラフィー マススぺクトロメ トリー/マ ススぺクトロメ トリー （LCZMSZMS) が薬物の高感度分析、 代謝研究に広 く用いられる。 なかでも、 エレク トスプレーイオン化法 （E S I ) および大気圧 化学イオン化法 （APC I ) が最も繁用されており、 VD化合物についても LC /MS法がよく用いられている。 しかし、 マキサカルシトールや ED— 7 1等の 分子内にエステル結合 .エーテル結合 ·チォエーテ^/結合 .ァミ ド結合等のへテ 口原子を有する VD化合物は高感度測定が可能であるのに対して、 アルフ,ァカル シドールゃコレカルシフエロール （VD3) 等の分子内にエステル結合'エーテ ル結合 ·チォエーテル結合 ·アミ ド結合等のへテロ原子を有しない VD化合物で は、 ヘテロ原子を有する VD化合物の 1 5〜1/100程度の感度しか得られ ていない。 このことから、 あらゆる VD化合物に適用可能な高感度測定法の開発 が求められている。
マススぺク トロメ トリー測定における VD化合物の高感度化には誘導体化法が 有用であると考えられる。 VD化合物の誘導体化には D i e 1 s— A 1 d e r反 応でトリェン構造に選択的に反応するトリァゾリン誘導体 (C o o k s o n型試 薬） がよく用いられ 〔① An a 1 y t i c a 1 B i o c h em i s t r y 1 992 ； 1 94 ： 77— 8 1、 ②薬学雑誌 1 998 ; 1 18 (6) : 206— 21 5、 ③薬学雑誌 1999 ; 1 19 (12) ： 898— 920 、 ④ B i o l o g i c a l Ma s s S p e c t r ome t r y 1993 ;
22 : 621 -632, ©J o r n a 1 o f Ch r oma t o g r a p h y 1993 ; 645 : 115— 123、 ⑥ A n a 1 y t i c a 1 B i o c h em i s t r y 1996 ； 243 ： 28— 40、 等〕 、 L C/MS において共鳴電子捕獲を利用した PTAD (4_フエニル一 1， 2， 4—トリア ゾリンー 3， 5—ジオン） 〔前掲の④、 ⑤〕 や PFB TAD (4—ペンタフルォ 口べンジルー 1， 2， 4一トリァゾリン— 3， 5—ジオン） 〔前掲の⑤〕 等があ る。 P TADはボストカラム誘導体化により 7〜70倍感度が向上するとされて いるが、 生体試料に適用された例はない 〔前掲の④〕 。 PFBTADは定量下限 25 p g/mL (ヒ ト血漿 lmL) を達成しているが 〔前掲の⑥〕 、 この感度で は不十分である。 我々の検討によると、 PFBTADの類似物である PFPTA D (4—ペンタフルオロフェニル— 1， 2， 4一トリァゾリン一 3， 5—ジオン ) を利用した方法では、 誘導体化により 5倍程度の感度しか得られなく、 また、 生体試料に適用すると誘導体化率が悪い等から十分な感度が得られなかった。 従 つて、 LC/MSに対してより高感度に応答する原子団を有する試薬 （誘導体化 剤） の開発が求められている。
B e r k e 1 らは E S Iに対してフエ口セン化合物が高感度に応答し、 水酸基 を有する化合物に対してフエ口セニルアジドを誘導体化剤として用いる時、 高感 度測定が可能であることを報告している 〔⑦ An a 1 y t i c a 1 C h e m i s t r y 1998 ； 70 : 1544— 1554〕 。 ES Iはィオン性の化 合物に対して高感度測定が可能であり、 本誘導体化法はィオン化 （正ィオンモー ド） の際にフエ口センが容易に酸化され、 安定なイオンを効率よく生成すること を利用したものである。 しかしながら、 これを VD化合物の測定方法に応用した 例は報告されていない。 また、 フエ口セ-ルアジドを誘導体化剤として用いる場 合、 その反応条件に加熱を要するばかりかフエ口セニルアジド自身も爆発性を有 するため、 取り扱いが困難であるという問題もあった。
上述した如く、 あらゆるビタミン D化合物に適用可能であり且つ利用しやすい 高感度のビタミン D化合物の測定法、 それに用いる誘導体化剤、 およびその誘導 体化剤とビタミン D化合物とが結合した化合物は現在のところ存在していない。 発明の開示
本発明者らは、 力かる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、 下記式 (1)
Figure imgf000005_0001
( 1 )
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 — X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを表し； Xは一 O 一、 -N (Ra) C (=0) 一、 一 N (Ra) C (=0) NH—、 — OC (= O) NH—または一 N (Ra) OS (=O) —を表し、 Raは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニ^/基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数を表す。 ） で表されるフエ口セン化合物をビタミン D化合物 （VD化合物） に結合させ、 液 体クロマトグラフィ一/マススぺク トロメ トリー （LCZMS) 、 特に液体クロ マトグラフィー エレク トロスプレーイオン化一マススぺク トロメ トリー Ζマス スぺク トロメ トリー （LC/ES I -MS/MS) により測定することにより、 あらゆる VD化合物に適用可能であり且つ利用しやすく、 なおかつ従来にない高 感度で VD化合物の測定が可能となることを見出し、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、 下記式 （1) で表されるフエ口セン化合物に関する。
Figure imgf000006_0001
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは— Wi_X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し ； W2はアルキレンを表し； Xは一 O 一、 -N (Ra) C (=0) ―、 -N (Ra) C ( = 0) NH―、 一 OC (= O) NH—または一 N (Ra) OS (=0) 一を表し、 Raは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し ； nは 1〜4の整数を表す。 ） 本発明においては、 前記式 （1) で表される化合物中、 Rおよび R' が水素原 子であるフエ口セン化合物にも関する。 また、 本発明は、 前記式 （1) で表され る化合物中、 Qが直接結合またはアルキレンを表すフエ口セン化合物にも関する。 さらに Qがメチレンである前記フエ口セン化合物、 および Qが直接結合であるフ エロセン化合物にも関する。
本発明のフエ口セン化合物としては、 具体的には、 4— (フエロセニルメチル） — 1， 2, 4一トリァゾリンー3， 5—ジオン （FMTAD) 、 4—フエロセニ ルー 1， 2， 4一 トリァゾリン一 3, 5—ジオン （FTAD) 等が挙げられる。 また、 本発明は、 上記フエ口セン化合物を含有する、 トリェン構造を有する化 合物を測定するための試薬にも関する。 このような試薬は、 さらにフエ口セン化 合物を溶解し得る溶媒を含有することができる。 .
また、 本発明は、 下記式 （1)
Figure imgf000007_0001
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 W — X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し ； W2はアルキレンを表し ； Xは一 O 一、 -N (Ra) C (=0) ―、 — N (Ra) C ( = 0) NH—、 _OC (= O) NH—または一 N (Ra) OS (=O) 一を表し、 Raは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数を表す。 ） で表されるフヱロセン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物に関する。 また、 本発明は、 前記化合物において、 前記フエ口セン化合物と前記ビタミン D化合物との結合が共有結合であるフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結 合した化合物にも関する。
さらに本発明は前記のフエロセン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合 物が、 下記式 （2)
Figure imgf000008_0001
(式中、 A iおよび A 3はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アル キレン、 置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していて もよい低級アルカイ二レンを表し； A2は直接結合、 一 CH = CH—、 — C≡C 一、 一 O—、 — S—または一NH—を表し； は水素原子または一 OR9 (R9 は水素原子または保護基を表す。 ） を表し； R2は水素原子、 水酸基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級アル ケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有していても よい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級ァシル基を表し； R 3は水素原子または保護基を表し； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水素 原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級 アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していて もよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基 を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有していてもよい力ルバモイ ル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し； R7および R8はそれぞ れ独立して水素原子または水酸基を表すか、 或いは、 R7および R8がー緒にな つて二重結合を形成し； Qは直接結合、 アルキレンまたは一 Wi— X— W2—を 表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを 表し； Xは一 O—、 一N (Ra) C (=O) ―、 一 N (Ra) C (=O) NH―、 一 OC (=O) NH—または一 N (Ra) OS (=0) —を表し、 Raは低級ァ ルキル基を表す。 ） ； Rおよび R， はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 二 トロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換 基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキ ニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよ い低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有して いてもよい力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数 を表す。 ）
で表される化合物であるフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合 物にも関する。
本発明は、 前記式 （2) で表される化合物中、 — A2— A3は一 CH (CH 3) ― (CH2) 3—、 一 CH (CH3) — CH=CH—または一 CH (CH3) 一 CH=CH— CH=CH—を表し； は水素原子または水酸基を表し； R2は 水素原子またはヒ ドロキシプロポキシ基を表し； R3は水素原子であり ； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水素原子、 水酸基、 ハロゲンにより置換され ていてもよい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し； R7および R 8は水素原子であるか、 または、 R7および R8がー緒になって二重結合を形成す る化合物にも関する。 また、 前記式 （2) で表される化合物中、 Rおよび R' が 水素原子である化合物にも関する。
さらに、 本発明は、 前記式 （2) で表される化合物中、 Qが直接結合またはァ ルキレンを表すフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物にも関 する。 さらに Qがメチレンである前記フエ口セン化合物とビタミン D化合物とが 結合した化合物、 および Qが直接結合であるフエロセン化合物とビタミン D化合 物とが結合した化合物にも関する。 また、 本発明は、 前記フエ口セン化合物とビ タミン D化合物とが結合した化合物のうち、 ビタミン D化合物がビタミン D3ィ匕 合物であるフ 口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物にも関する また、 さらに本発明は、 試料中に含まれるビタミン D化合物の測定方法であつ て、 下記式 （1)
Figure imgf000010_0001
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 Wi— X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し ； W2はアルキレンを表し； Xは一 O 一、 — N (Ra) C (=0) —、 — N (Ra) C (=0) NH—、 — OC ( = 0 ) NH—または一 N (RJ OS ( = 0) —を表し、 Raは低級アルキル基を表 す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァ ノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有してい てもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニノレ基、 置換 基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル 基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい力 ルバモイル基を表し； mは 1〜 3の整数を表し； nは 1〜 4の整数を表す。 ） で表されるフエ口セン化合物と、 試料中のビタミン D化合物とを反応させ、 得ら れたフヱ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物を液体クロマトグ ラフイー マススぺクトロメ トリー （LC/MS) により測定することを特徴と するビタミン D化合物の測定方法にも関する。
また、 本発明は、 前記のフヱロセン化合物とビタミン D化合物とが結合した化 合物が、 前記フエ口セン化合物と前記ビタミン D化合物とが共有結合により結合 した化合物である前記のビタミン D化合物の測定方法にも関する。
さらに本発明は前記のフエロセン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合 物が、 下記式 （2)
Figure imgf000011_0001
(式中、 A および A3はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アル キレン、 置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していて もよい低級アルカイ二レンを表し； A2は直接結合、 — CH二 CH―、 — C≡C ―、 一◦一、 一 S—または一NH—を表し； 1^は水素原子または一 OR9 (R9 は水素原子または保護基を表す。 ） を表し； R2は水素原子、 水酸基、 ハロゲン 、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級ァ ノレケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有していて もよい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級ァシル基を表し； R3は水素原子または保護基を表し； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水 素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低 級アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有してい てもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換 基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル 基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有していてもよい力ルバ モイル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し； R7および R8はそ れぞれ独立して水素原子または水酸基を表すか、 或いは、 R 7および R 8がー緒 になって二重結合を形成し； Qは直接結合、 アルキレンまたは一 W — X— W2 —を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し ； W2はアルキレ ンを表し； Xは一 O—、 一 N (Ra) C ( = 0) ―、 一 N (RJ C (=0) N H―、 一 OC (=0) NH—または _N (Ra) OS ( = 0) —を表し、 Raは 低級アルキル基を表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸 基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基 、 置換基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級 アルキニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有してい てもよレ、低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を 有していてもよい力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4 の整数を表す。 ）
で表される化合物である前記のビタミン D化合物の測定方法にも関する。
本発明は、 前記のフエ口セン化合物および前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物において、 — A2— A3は一 CH (CH3) 一 ( CH2) 3—、 -CH (CH3) — CH = CH_または一 CH (CH3) — CH = CH— CH=CH—を表し； は水素原子または水酸基を表し； R2は水素原 子またはヒドロキシプロポキシ基を表し； R3は水素原子であり ； R4、 R5およ び R6はそれぞれ独立して水素原子、 水酸基、 ハロゲンにより置換されていても よい低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し； R7および R8は水素 原子であるか、 または、 R7および R8がー緒になって二重結合を形成する、 ビ タミン D化合物の測定方法にも関する。 また、 本発明は、 前記のフエ口セン化合 物および前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物におい て、 Rおよび R' が水素原子であるビタミン D化合物の測定方法にも関する。 ま た本発明は、 前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物が 、 前記式で表される化合物中、 Qが直接結合またはアルキレンを表すフエ口セン 化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物であるビタミン D化合物の測定方 法にも関する。 さらに Qがメチレンである前記フエ口セン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物である前記のビタミン D化合物の測定方法、 および Qが 直接結合であるフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物である 前記のビタミン D化合物の測定方法にも関する。
また、 本発明は、 前記フエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合 物のうち、 ビタミン D化合物がビタミン133化合物であるフエ口セン化合物とビ タミン D化合物とが結合した化合物である前記のビタミン D化合物の測定方法に も関する。 また、 さらに本発明は、 前記試料 （測定対象の試料） が生体由来の試料である 前記のビタミン D化合物の測定方法にも関する。
また、 さらに本発明は、 液体クロマトグラフィーノマススぺク トロメ トリー （ LC/MS) 力 液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化一マス スぺク トロメ トリー Zマススぺク トロメ トリー （LC/ES I -MS/MS) で ある前記のビタミン D化合物の測定方法にも関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ALF— FMTADおよび ALF— FTADの E S Iマススぺク トル を測定した結果の一例を示す。
図 2は、 AL F— FMTADの分子イオン 〔M〕 +および A L F— F T ADの 分子イオン 〔M〕 +をプリカーサイオンとしてプロダク トイオンスぺク トルを測 定した結果の一例を示す。
図 3は、 LCZE S I— MSZMS測定条件を最適化した際の、 ALF— FM TAD、 ALF— FT ADおよび ALF直接測定時 （対照） の測定結果の一例を 示す。
図 4は、 LC/E S I—MSZMS測定条件を最適化した際の、 VD3— FM TAD、 VD3— FTAD、 VD3直接測定時 （対照） および VD3—フエ口セン 力ルバメート （対照） の測定結果の一例を示す。
図 5は、 ラット血漿を試料として用いた場合の、 本発明測定法における前処理 の具体的な処理スキームの一例を示す。
図 6は、 本発明測定法および従来法の検量線下限におけるクロマトグラムの一 例を示す。 A) はラット血漿 lmLを用いた場合の本発明測定法の検量線下限に おけるクロマトグラム、 B) はラット血漿 100 μ Lを用いた場合の本発明測定 法の検量線下限におけるクロマトグラム、 C) は P TAD誘導体化による測定時 の検量線下限におけるクロマトグラム （対照） 、 D) は直接測定時の検量線下限 におけるクロマトグラムである。
図 7は、 A LF— FMTADによる本発明測定法の検量線を示す典型的なダラ フの一例を示す。 図 8は、 ラット血漿を試料として用いた場合の、 本発明測定法における前処理 の具体的な処理スキームの一例で、 図 5の処理法を簡便化したものである。
図 9は、 本発明測定法におけるカラムスィツチングの図を示す。
図 10は、 本発明測定方法において図 8、 図 9および表 1 2の条件下で測定し た時の、 典型的な検量線のグラフの一例を示す。
図 1 1は、 本発明測定方法において図 8、 図 9および表 1 2の条件下で測定し た時の、 ALF- FMTAD の特異性のクロマトグラムを示す。 A) はラットブランク血 漿のクロマトグラム、 B) は検量線ブランク （ALF： 0 ng/mL) のクロマトグラム、 C) は検量線下限 （ALF : 0.05 ng/mL) のクロマトグラムである。
図 1 2は、 本発明測定方法において図 8、 図 9および表 1 2の条件下で測定し た時の、 d4-ALF-FMTAD の特異性のクロマトグラムを示す。 A) はラットブランク 血漿のクロマトグラム、 B) 検量線下限 （ALF： 0.05 ng/mL, も- ALF： 8 ng/mL 相 当） のクロマトグラムである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を更に具体的に説明する。
下記式 （1)
Figure imgf000014_0001
で表される本発明のフヱロセン化合物において、 「Q」 は直接結合、 アルキレン または一 W^— X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを 表し； W2はアルキレンを表し； Xは一 O—、 一 N (Ra) C ( = O) 一、 -N (Ra) C (=O) NH—、 一 OC (=0) NH—または一 N (Ra) OS (= O) —を表し、 Raは低級アルキル基を表す。 ） 、 好ましくは直接結合、 アルキ レンまたは一 V^— X— W2—を表し （ここで、 はメチレンまたはフエ二レン を表し； W2はメチレンを表し； Xは一 O—、 一 N (CH3) C (=0) 一、 - N ( C H 3 ) C ( = 0) N H—または— O C (= 0) N H—を表す。 ；） 、 より好 ましくは直接結合またはアルキレンであり、 更に好ましくはアルキレンであり、 更により好ましくはメチレンである。 また、 「R a」 における 「低級アルキル 基」 とは、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 s ーブチノレ、 tーブチノレ、 ペンチノレ、 イソペンチル、 ネオペンチノレ、 へキシノレ等の 炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状のアルキル基を指す。
上記の Q、 「W iおよび W2におけるアルキレン」 とは、 メチレン、 エチレン、 プロピレン、 イソプロピレン、 ブチレン等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状の アルキレン鎖を指す。 また、 における 「フエ二レン」 とは、 o—フエ二レン、 m—フエ二レンまたは p—フエ二レンを指す。
また、 上記の 「R」 および 「R ' 」 は、 それぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置 換基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アル キニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していても よい低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有し ていてもよい力ルバモイル基であり、 好ましくは水素原子、 水酸基、 ハロゲンま たは低級アルキル基であり、 より好ましくは水素原子である。 ここで、 「ハロゲ ン」 とは塩素、 フッ素、 臭素、 ヨウ素等を指し； 「低級アルキル基」 とは、 メチ ル、 ェチノレ、 プロピノレ、 イソプロピノレ、 ブチル、 イソブチノレ、 s—ブチノレ、 t - ブチル、 ペンチル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 へキシル等の炭素数 1〜 6の 直鎖または分岐状のアルキル基を指し； 「低級アルケニル基」 とは、 ェテュル、 1一プロぺニノレ、 ァリル、 1一ブテニノレ、 2—ブテュル、 3—ブテニノレ、 ペンテ ニル、 へキセニル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状のアルケニル基を指し； 「低級アルキニル基」 とは、 ェチュル、 プロピニル、 ブチュル、 ペンチニル、 へ キシュル等の炭素数 1〜6の直鎖または分岐状のアルキニル基を指し； 「低級ァ ルコキシ基」 とは、 メ トキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキ シ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシ、 フエノキシ等の炭素数 1〜 6のアルコキ シ基を指し； 「低級ァシル基」 とは、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ブチ リル、 イソブチリル、 バレリル、 イソバレリル、 ビバロイル、 へキサノィル等の 6のァシル基を指す。
また上記置換基における 「置換基を有していてもよい」 とは、 所望により 1ま たは複数 （例えば 1 〜 3個） の水酸基；ニトロ基；シァノ基；塩素、 フッ素、 臭 素、 ヨウ素等のハロゲン；メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチノレ、 s—ブチノレ、 t—ブチノレ、 ペンチノレ、 イソペンチノレ、 ネオペンチノレ、 へキシル等の炭素数 1 〜 6の直鎖または分岐状のアルキル基；ェテニル、 1—プ ロぺニノレ、 ァリノレ、 1—ブテニノレ、 2—ブテニノレ、 3—ブテニノレ、 ペンテ-ノレ、 へキセニル等の炭素数 1 〜 6の直鎖または分岐状のアルケニル基；ェチュル、 プ ロビニル、 ブチェル、 ペンチニル、 へキシュル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分 岐状のアルキニル基；メ トキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブト キシ、 ペンチルォキシ、 へキシ /レオキシ、 フエノキシ等の炭素数 1 〜 6のア^^コ キシ基；ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ブチリル、 イソブチリル、 バレリ ノレ、 イソバレリノレ、 ビバロイル、 へキサノィル等の炭素数 1〜 6のァシル基；力 ルポキシ基；力ルバモイル基；および/またはアミノ基等の置換基を有していて もよいことを意味する。
本発明のフエ口セン化合物 （下記製造スキーム中の化合物 6 ) は、 下記の製造 スキームに従って製造することができる。
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
(式中、 Q、 R、 R， 、 mおよび nは前述の式 （1 ) における定義と同一であ る。 ）
工程 1において、 化合物 2は化合物 1からジフエ二ルホスホリルアジドおよび 塩基を作用させる方法、 カルボン酸を酸塩化物、 酸無水物に変換後ナトリウムァ ジドを作用させる方法、 カルボン酸をエステルに変換後、 ヒドラジンを作用させ、 ヒドラジンとのアミ ドに変換させた後、 亜硝酸または亜硝酸エステルを作用させ る方法などにより、 合成することができ、 好ましくは、 ジフエ-ルホスホリルァ ジドおよび塩基を作用させる方法により合成することができる。 なお、 出発物質 である化合物 1は公知であるか、 或いは公知の化合物から公知の合成法によって 容易に合成できる。 また、 化合物 1は市販もされており、 例えば東京化成株式会 社より購入することもできる。 ジフエ-ルホスホリルアジドおよび塩基を作用さ せる方法に用いられる塩基としてはトリエチルァミン、 ジイソプロピルェチルァ ミンなどが挙げられ、 好ましくはトリエチルァミンが挙げられる。 ジフエニルホ スホリルアジドおよび塩基を作用させる方法に用いられる溶媒としては、 ジクロ ロメタン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テ トラヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンなどが挙 げられ、 好ましくはジクロロメタンが挙げられる。 ジフエニルホスホリルアジド および塩基を作用させる方法の反応温度は、 進行する温度であれば特に制限はな いが、 一般に、 一 7 8〜5 0 °Cで行い、 好ましくは一 1 0〜 1 0 °Cで行う。
工程 2において、 化合物 3は化合物 2を加熱することにより、 合成することが できる。 上記工程 2に用いられる溶媒としては、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テトラヒ ドロフラン、 ジェチ ルエーテル、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンなどが挙げられ、 好ましくはトルェ ンが挙げられる。 反応温度は、 反応が進行する温度であれば特に制限はないが、 一般に、 2 0 °C〜2 0 0 °Cで行い、 好ましくは 5 0〜 1 5 0 °Cで行う。
工程 3において、 化合物 4は化合物 3にカルバジン酸ェステルを作用させるこ とにより行うことができる。 上記工程 3に用いられる溶媒としては、 ジクロロメ タン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレエン、 キシレン、 テトラ ヒドロフラン、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンなどが挙げら れ、 好ましくはトルエンが挙げられる。 反応温度は、 反応が進行する温度であれ ば特に制限はないが、 一般に、 0〜2 0 0 °Cで行い、 好ましくは 2 0〜1 2 0 °C で行う。 工程 4において、 化合物 5は化合物 4に塩基を作用させることにより行うこと ができる。 上記工程 4に用いられる塩基としてはナトリウムメ トキシド、 ナトリ ゥムェトキシド、 ナトリウム t e r t —ブトキラート、 カリゥムメ トキシド、 カリウムエトキシド、 カリウム t e r t—ブトキシド、 n—ブチルリチウム、 s e c—ブチルリチウム、 t e r t —ブチルリチウム、 リチウムジイソプロピル アミ ド、 リチウムジシクロへキシルアミ ド、 リチウムビス （トリメチノレシリノレ） アミ ド、 カリウムビス （トリメチルシリル） アミ ド、 水素化ナトリウム、 水素化 力リゥム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸水素力リゥム、 炭酸力リゥム、 炭酸ナトリ ゥム、 炭酸カルシウム、 炭酸セシウムなどが挙げられ、 好ましくは炭酸カリウム が挙げられる。 上記工程 4に用いられる溶媒としては、 メタノール、 エタノール、 イソプロノ ノ一ノレ、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 テトラヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジ メ トキシェタンなどが挙げられ、 好ましくはエタノールが挙げられる。 反応温度 は、 反応が進行する温度であれば特に制限はないが、 一般に、 0〜2 0 0 °Cで行 い、 好ましくは 2 0〜1 2 0 °Cで行う。
工程 5において、 化合物 6は化合物 5にョードベンゼンジアセテートを作用さ せることにより行うことができる。 上記工程 4に用いられる溶媒としては、 酢酸 ェチ /レ、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テトラヒ ドロフラン （T H F ) 、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジ メ トキシェタンなどが挙げられ、 好ましくはテトラヒ ドロフラン （T H F ) また はジォキサンが挙げられる。 反応温度は、 反応が進行する温度であれば特に制限 はないが、 一般に、 — 7 8〜 1 0 0 °Cで行い、 好ましくは— 1 0〜5 0 °Cで行う。 また、 本発明のフエ口セン化合物 （化合物 6において、 Q =W1— X _W2の 化合物） は、 下記の製造スキームに従って製造することもできる。 Y-W,
Figure imgf000019_0001
(式中、 Q、 R、 R ' 、 W 1 X、 W2、 mおよび nは前述の式 （1 ) における 定義と同一である。 ）
工程 6において、 化合物 9は化合物 7 (Yは水酸基、 カルボン酸酸塩化物残基、 カルボン酸酸無水物残基、 カルボン酸エステル基、 イソシァネート基、 スルホ二 ルクロリ ド残基、 ハロゲン原子、 アルキルスルホニルォキシ基またはァリールス ルホニルォキシ基を示す） と化合物 8 ( Zは水酸基、 置換基を有していても良い アミノ基、 ハロゲン原子、 アルキルスルホニルォキシ基、 ァリールスルホニルォ キシ基を示す） を反応させることにより合成することもできる （工程 6 ) 。 この 際、 反応は塩基存在下にて行うことが好ましい。 Yおよび Zの組み合わせとして は、 Yがカルボン酸酸塩化物残基、 カルボン酸酸無水物残基、 カルボン酸エステ ル基、 イソシァネート基またはスルホニルクロリ ド残基である化合物 7と、 Zが 水酸基、 置換基を有していても良いアミノ基である化合物 8の組み合わせ； Yが 水酸基である化合物 7と、 Zがハロゲン原子、 アルキルスルホニルォキシ基また はァリールスルホニルォキシ基である化合物 8の組み合わせ；或いは Yがハロゲ ン原子、 アルキルスルホニルォキシ基またはァリ一ルスルホニルォキシ基である 化合物 7と、 Zが水酸基である化合物 8の組み合わせが挙げられる。 なお、 出発 物質である化合物 7および化合物 8は公知であるか、 或いは公知の化合物から公 知の合成法によって容易に合成できる。 また、 化合物 7は市販もされており、 例 えば東京化成株式会社より購入することもできる。 上記工程 6に用いられる塩基 としては水酸化ナトリゥム、 水酸化力リゥム、 炭酸水素ナトリゥム、 炭酸水素力 リゥム、 水素化ナトリゥム、 水素化力リゥム、 炭酸力リゥム、 炭酸ナトリゥム、 炭酸カルシウム、 炭酸セシウム、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルアミ ン、 ピリジン、 2， 6—ジメチノレピリジン、 2， 4 , 6—トリメチルピリジン、 4 - (ジメチルァミノ） ピリジンなどが挙げられる。 上記工程 6に用いられる溶 媒としては、 水、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テトラヒ ドロ フラン、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンなどが挙げられる。 反応温度は、 進行する温度であれば特に制限はないが、 一般に、 — 78〜20 0 °Cで行い、 好ましくは一 10〜 150 °Cで行う。 なお、 工程 5の反応条件など については前述の通りである。
このようにして得られた本発明のフエ口セン化合物は、 必要に応じ公知の方法 に従って精製 ·乾燥等の操作を行い単離することができる。 なお、 得られたフヱ 口セン化合物が不安定である場合もあり、 その場合は、 その化合物が安定して存 在することのできる溶媒中 （例えば、 テトラヒドロフラン、 ジォキサンなど） で 保存するとよい。
本発明のフエ口セン化合物は、 ビタミン D化合物 （VD化合物） などのトリエ ン構造を有する化合物を液体ク口マトグラフィ一/マススぺクトロメ トリー （L C/MS) 、 特に液体クロマトグラフィー/エレク トロスプレーイオン化一マス スぺク トロメ トリー Zマススぺク トロメ トリー （LCZES I -MS/MS) に て測定する際の試薬 （誘導体化剤） として有用である。
本発明の試薬は、 上記フエ口セン化合物単体、 および上記フエ口セン化合物を 含有する溶液の両方を意味する。 本発明の試薬において用いることができる溶媒 としては、 酢酸ェチノレ、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベン ゼン、 トノレェン、 キシレン、 テトラヒ ドロフラン （THF) 、 ジェチノレエーテノレ、 ジォキサン、 ジメ トキシェタンなどが挙げられ、 好ましくはテトラヒ ドロフラン (THF) またはジォキサンが挙げられる。 この溶液中のフエ口セン化合物の含 有量は、 特に限定されないが、 例えば、 0. 001〜99重量％、 好ましくは 0. 005〜50重量％、 さらに好ましくは 0. 01〜10重量％の範囲から適宜選 択される。 本発明の試薬を用いて対象化合物を測定する場合、 具体的には、 その 試薬中のフエロセン化合物と V D化合物とを反応させ、 これらを結合した化合物 を LC/ES I— MS/MS等に供することにより、 VD化合物を測定する。 測 定の詳細については後述する。
ここで、 本発明のフエ口セン化合物と結合させる VD化合物 （即ち、 測定対象 となる VD化合物） としては、 ビタミン D3化合物 （VD3化合物） が好ましレ、。 ここで VD 3化合物とは、 9， 1 0—セココレスタ一 5， 7, 1 0 (1 9) —ト リエン構造を有する化合物であり、 好ましくは （5 Z， 7 E) — 9， 1 0—セコ コレスター 5， 7, 1 0 (1 9) —トリェン構造を有する化合物であり、 より好 ましくは （l et, 5 Z, 7 E) — 9， 1 0—セココレスター 5， 7, 1 0 (1 9) —トリェン— 1一オール構造を有する化合物、 (3 β, 5 Ζ， 7 Ε) 一 9， 1 0—セココレスター 5， 7， 1 0 (1 9) —トリェン一 3 _オール構造を有す る化合物、 または （1 α， 5 Ζ, 7 Ε) — 9， 1 0—セココレスタ一 5， 7， 1 0 (1 9) —トリェン— 1， 3—ジオール構造を有する化合物である。 これら V D 3化合物の具体的な化合物としては、 コレカルシフエロール （VD3) 、 カル シトリオール （ 1 α， 2 5 (OH) 2D3 ；商品名 口カルトロール （登録商 標） 、 カプセル/製造 ·販売元 中外製薬株式会社、 販売元 杏林製薬株式会社、 注/輸入先 中外製薬株式会社、 販売先 麒麟麦酒株式会社） 、 アルファカルシ ドール （ALF ；商品名 アルファロール （登録商標） 、 中外製薬株式会社；特 開昭 48- 6 2 7 50号公報おょぴ T e t r a h e d r o n L e t t . , 1 9 7 3， 2 3 3 9、 T e t r a h e d r o n, 3 0， 2 70 1 (1 9 7 4) 等） 、 マキサカルシトール （OCT ；商品名 ォキサロール （登録商標） 、 軟膏/販売先 マルホ株式会社、 製造元 中外製薬株式会社、 注 Z製造販売元 中外製薬株式会社；特開昭 6 1 - 26 7 5 50号公報等） 、 タカルシトール （商 品名 ボンアルファ （登録商標） 、 帝人株式会社） 、 カルシポトリオール （商品 名 ドボネックス （登録商標） 、 輸入元 帝国製薬株式会社、 販売 藤沢薬品株 式会社、 ティコクメディックス株式会社） 、 ファレカルシトリオール （商品名 ホーネル （登録商標） 、 大正製薬株式会社；商品名 フルスタン （登録商標） 、 製造元 住友製薬株式会社、 販売元 キツセィ薬品株式会社） 、 2 β— (3—ヒ ドロキシプロピルォキシ） 一 1 α， 2 5—ジヒ ドロキシビタミン D3 (ED— 7 1 (開発コード名） 、 中外製薬株式会社；特開昭 6 1 - 26 7 548号公報等） 、 EB 1 08 9 (開発コード名、 L e o P h a r ma c e u t i c a l P r o d u c t s社； J . c h r oma t o g r . B， 740， 1 1 7— 1 2 8 ( 2000 ) 等） 、 国際公開 WO 9 5/2 76 9 7号公報、 同 WO 98/28 2 6 6号公報、 同 WO 0 0/4 9 4 0 3号公報、 同 WO 0 0/6 1 7 7 6号公報、 同 WO 0 0/ 6 4 8 7 0号公報、 同 WO 0 0/6 6 5 4 8号公報、 同 WO 0 1 / 1 6 0 9 9号公報、 同 WO 0 1 / 6 2 7 2 3号公報、 同 WO 0 1ノ 7 9 1 6 6号 公報、 同 WO 0 1 / 9 0 0 6 1号公報、 同 WO 0 1 / 9 6 2 9 3号公報、 同 WO 02Z13 8 32号公報等に記載の化合物が挙げられる。 尚ここで、 VD 3、 1 α , 2 5 (OH) 2 D 3、 A L F等は市販されており、 例えば、 S o 1 v a y P h a r m a c e u t i c a l社、 C A L B I O社、 F LUKA社、 F ORMO S A社、 WAKO社等から購入することができる。 これら化合物の代表的な構造 を以下に示す。
. コレカノレシフェローノレ （VD3)
Figure imgf000022_0001
アルファカルシドール （A L F)
Figure imgf000022_0002
• 2 β— ( 3—ヒ ドロキシプロピルォキシ） 一 1 α， 2 5—ジヒ ドロキシビタ ミン03 (ED- 7 1 )
Figure imgf000023_0001
•国際公開 WOO 2/13832号公報の実施例 6に記載の化合物 （以下、 化 合物 Aと称する）
Figure imgf000023_0002
上述した本発明のフエ口セン化合物と結合させる VD化合物 （即ち、 測定対象 となる VD化合物） のうち、 特に好ましくは、 分子内にエステル結合 'エーテル 結合 ·チォエーテル結合 'アミ ド結合等のへテロ原子を有しない VD化合物 （具 体的には、 前掲の VD3、 カルシポトリオール、 1 α， 25 (OH) 2D3、 AL F、 ファレカルシトリオール、 EB 1089、 化合物 A等） である。
本発明のフエ口セン化合物と VD化合物を結合させるには、 本発明のフエロセ ン化合物のトリアゾリン骨格を D i e 1 s -A 1 d e r反応で VD化合物のトリ ェン構造に選択的に反応させればよい。 具体的には、 酢酸ェチル、 ジクロロメタ ン、 クロロホノレム、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テトラヒ ドロフラン （THF) 、 ジェチルエーテル、 ジォキサン、 ジメ トキシェタン （好 ましくはテトラヒ ドロフラン （THF) またはジォキサン） などの適当な溶媒中 で、 本発明のフヱロセン化合物と VD化合物を 5分間〜 5時間 （好ましくは 1 5 分間〜 3時間） 反応させればよい。 反応温度は、 進行する温度であれば特に制限 はないが、 一般に、 _ 78〜100°Cで行い、 好ましくは _ 10〜50°Cで行う。 尚、 必要により反応を停止するために、 水またはメタノール、 エタノール、 プロ パノール、 イソプロパノールなどのアルコール溶媒を加えてもよい。 このように して得られた本発明のフヱロセン化合物と V D化合物の結合体は、 必要に応じ公 知の方法に従って精製 ·乾燥等の操作を行い単離することができる。
このようにして得られた本発明のフエ口セン化合物と VD化合物の結合体は、 前記フエ口セン化合物と前記 V D化合物とが共有結合している化合物である。 また、 本発明のフエ口セン化合物と VD化合物の結合体は、 好ましくは、 下記 式 （2)
Figure imgf000024_0001
で表される化合物である。 ここで、 前記式中、 「Q、 R、 R' 、 mおよび n」 は 前掲の式 （1) と同一の定義である。 「Aiおよび A3」 はそれぞれ独立して、 置換基を有していてもよい低級アルキレン、 置換基を有していてもよい低級アル ケニレンまたは置換基を有していてもよい低級アルカイ二レンを表す。 ΓΑ2」 は直接結合、 一CH = CH―、 一 C≡C一、 一 O—、 一 S—または一 NH—を表 し、 好ましくは直接結合、 一 CH=CH—または一 C≡C—である。 — A2 一 A3は、 好ましくは、 一 CH (CH3) - (CHJ 2ノ 3 CH (CH J — C
H=CH—または一 CH (CH3) — CH=CH— CH=CH—であり、 最も好 ましくは一 CH (CH3) 一 (CH2) 3—である。 「RJ は水素原子または一 OR9 (R9は水素原子または保護基を表す。 ） を表し、 好ましくは水素原子ま たは水酸基である。 「R2」 は水素原子、 水酸基、 ハロゲン、 置換基を有してい てもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基 を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキ シ基または置換基を有していてもよい低級ァシル基を表し、 好ましくは水素原子 またはヒ ドロキシプロポキシ基である。 「R 3」 は水素原子または保護基を表し、 好ましくは水素原子である。 「R 4、 1 5ぉょび尺6」 はそれぞれ独立して水素原 子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級ァ ルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していても よい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を 有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有していてもよい力ルバモイ ル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し、 好ましくはそれぞれ独立 して水素原子、 水酸基ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基また は低級シクロアルキル基である。 「R 7および R 8」 はそれぞれ独立して水素原 子または水酸基を表すか、 或いは、 R 7および R 8がー緒になって二重結合を形 成し、 好ましくは水素原子または R 7および R 8がー緒になって二重結合を形成 する。
前述の A iおよび A 3における 「低級アルキレン」 とは、 炭素数 1〜 6の直鎖 または分岐状のアルキレン鎖を指し、 「低級アルケニレン」 とは炭素数 1〜6の 直鎖または分岐状のアルケニレン鎖を指し、 「低級アルカイ二レン」 とは炭素数 ：!〜 6の直鎖または分岐状のアルカイ二レン鎖を指す。 また 「置換基を有してい てもよレ、」 とは、 所望により 1または複数 （例えば 1〜3個） の水酸基；ニトロ 基；シァノ基；塩素、 フッ素、 臭素、 ヨウ素等のハロゲン；メチル、 ェチル、 プ ロピノレ、 イソプロピノレ、 ブチノレ、 イソブチノレ、 s—ブチル、 t一プチ/レ、 ペンチ ル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 へキシル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐 状のアルキル基；ェテニル、 1—プロぺニル、 ァリル、 1—ブテニル、 2—ブテ ニル、 3—ブテュル、 ペンテニル、 へキセニル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分 岐状のアルケニル基；ェチュル、 プロビュル、 ブチュル、 ペンチュル、 へキシニ ル等の炭素数 1〜6の直鎖または分岐状のアルキニル基；メ トキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシ、 フ エノキシ等の炭素数 1〜6のアルコキシ基；ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリル、 イソプチリル、 バレリル、 イソバレリル、 ビバロイル、 へキサノィル 等の炭素数 1〜 6のァシル基；カルボキシ基；力ルバモイル基；および/または アミノ基等の置換基を有していてもよいことを意味する。
前述の R 2、 R 4、 R 5および R 6における 「ハロゲン」 とは、 塩素、 フッ素、 臭素、 ヨウ素等を指し； 「低級アルキル」 とは、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ィ ソプロピノレ、 ブチノレ、 イソブチノレ、 s—ブチノレ、 tーブチノレ、 ペンチノレ、 イソぺ ンチル、 ネオペンチル、 へキシル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状のアルキ ル基を指し； 「低級アルケニル」 とは、 ェテュル、 1—プロぺニル、 ァリル、 1 —ブテ二ノレ、 2 _ブテニノレ、 3—ブテニノレ、 ペンテ二ノレ、 へキセニル等の炭素数 1〜6の直鎖または分岐状のアルケニル基を指し； 「低級アルキニル」 とは、 ェ チュル、 プロピニル、 ブチニル、 ペンチニル、 へキシュル等の炭素数 1〜6の直 鎖または分岐状のアルキニル基を指し； 「低級アルコキシ基」 とは、 メ トキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシル ォキシ、 フエノキシ等の炭素数 1〜6のアルコキシ基を指し； 「低級ァシル基」 とは、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ブチリル、 イソプチリル、 ノ レリル、 イソバレリル、 ビバロイル、 へキサノィル等の炭素数 1〜6のァシル基を指す。 また、 R 4、 R 5および R 6の 「シクロアルキル基」 とは、 シクロプロピル、 シク ロブチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロへプチノレ、 シクロアクチノレ 等の炭素数 3〜 8のシクロアルキル基を指す。
また上記置換基における 「置換基を有していてもよい」 とは、 所望により 1ま たは複数 （例えば 1〜3個） の水酸基；ニトロ基；シァノ基；塩素、 フッ素、 臭 素、 ヨウ素等のハロゲン；メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 プチル、 イソプチル、 s—ブチル、 t —ブチル、 ペンチル、 イソペンチノレ、 ネオペンチル、 へキシル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状のアルキル基；ェテュル、 1ープ ロぺニノレ、 ァリノレ、 1 —ブテニノレ、 2—ブテニノレ、 3—プテニノレ、 ペンテ二ノレ、 へキセニル等の炭素数 1〜 6の直鎖または分岐状のアルケニル基；ェチュル、 プ ロビニル、 ブチュル、 ペンチニル、 へキシュル等の炭素数;！〜 6の直鎖または分 岐状のアルキニル基；メ トキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブト キシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシ、 フエノキシ等の炭素数 1〜 6のァノレコ キシ基；ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリル、 イソブチリル、 バレリ ル、 イソバレリル、 ビバロイル、 へキサノィル等の炭素数 1〜 6のァシル基；力 ルポキシ基；力ルバモイル基；および またはアミノ基等の置換基を有していて もよいことを意味する。
また、 前述の および R 3における 「保護基」 とは、 水酸基の保護基として 適切なものであれば特に限定はなく、 例えば、 低級ァシル基、 置換基を有してい てもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル基、 置換シリル基等が挙げ られる。 「低級ァシル基」 、 「低級アルキル基」 、 「低級アルコキシ基」 、 可能 な 「置換基」 などについては、 前段において説明した通りである。
上述の本発明のフエロセン化合物と V D化合物とを反応させることにより得ら れたフヱ口セン化合物と V D化合物の結合体は、 V D化合物を L C/ E S I— M S /M S等にて測定する際の標品等として有用である。
尚、 試料中に存在する V D化合物を測定するに際しても、 前述の方法に従って 本発明のフエ口セン化合物と V D化合物を結合させればよい。 ここで、 前記試料 は生体由来の試料であることが好ましレ、。 生体由来の試料とは、 体液 （血液、 リ ンパ液、 髄液） や尿などを指し、 好ましくは血漿、 血清、 尿である。 さらに、 生 体由来とは好ましくは哺乳類由来を意味し、 より好ましくはヒ ト、 サル、 ィヌ、 ゥサギ、 モルモット、 ラット、 マウス由来である。 生体由来の試料中に存在する V D化合物を測定する場合、 エタノール除蛋白等の公知の方法により除蛋白を行 うなどの必要な前処理を行つた後、 前述した方法と同様にして本発明のフエロセ ン化合物と試料中に存在する V D化合物を結合させ、 得られた本発明のフエロセ ン化合物と V D化合物の結合体を後の測定に用いればよい。
ここで、 試料の前処理として、 試料の除蛋白を行った後、 本発明のフヱロセン 化合物と試料中に存在する V D化合物を反応させる前に、 試料の固相抽出を行う ことが好ましい。 また、 本発明のフエ口セン化合物と試料中に存在する V D化合 物を反応させた後、 試料の固相抽出を行うことが好ましい。 特に好ましくは、 試 料の除蛋白を行い、 試料の固相抽出を行った後、 本発明のフエ口セン化合物と試 料中に存在する V D化合物を反応させ、 その後再度試料の固相抽出を行う。 試料 の除蛋白を行った後、 本発明のフエ口セン化合物と試料中に存在する V D化合物 を反応させる前の固相抽出は、 好ましくは順相系の固相抽出カートリッジを用い て行い、 特に好ましくはシリカゲル系の固相抽出カートリッジを用いて行う。 本 発明のフエロセン化合物と試料中に存在する V D化合物を反応させた後の固相抽 出は、 好ましくは逆相系の固相抽出カートリッジを用いて行う。
このようにして得られた本発明のフエ口セン化合物と VD化合物の結合体を、 LCZMSに供して測定する。 ここで、 LC/MSとは、 LC/MS (液体クロ マトグラフィー マススぺクトロメ トリー） による測定原理を利用または応用し た測定法或いは測定機器を指し、 具体的には液体クロマトグラフィー マススぺ タトロメ トリー （LC/MS) およびタンデム型の液体クロマトグラフィー Zマ ススぺク トロメ トリー //マススぺク トロメ トリー （LC/MSZMS) 、 並びに それらにエレク トスプレーイオン化法 （ES I ) および大気圧化学イオン化法 (APC I ) を組み合わせた測定法或いは測定機器である。 このうち、 本発明の 測定法を実施するにあたって、 特に好ましくは液体クロマトグラフィー エレク トロスプレーイオンィ匕一マススぺク トロメ トリー マススぺク トロメ トリー （L C/ES I— MS/MS) を用いる。
LC/E S I—MS/MSによる測定は、 具体的には、 前述のようにして得ら れた本発明のフエロセン化合物と V D化合物の結合体を含む残渣を移動相に溶解 し、 LC/E S I— MSZMSに注入し測定する。 ここで、 各測定における LC /E S I一 MS ZMS測定条件の設定等の具体的な操作については、 公知の方法 に従って、 測定対象となる試料の量や種類、 試料中に存在する VD化合物の量や 種類、 必要とされる測定感度、 誘導体化剤として用いる本発明フ 口セン化合物 の種類、 測定に使用する LC/ES I— MS /MS機器の構成等に合わせて適宜 調整 ·設定すればよい。 具体的には、 本発明のフエ口セン化合物と VD化合物の 結合体の MRM (Mu l t i p l e R e a c t i o n M o n i t o r i n g) 条件を精査して各種条件を適宜設定するとともに、 効率的なイオン化が可能 な LC条件も設定する。 生体試料中濃度測定に際しては、 ブランク試料に濃度勾 配をつけた既知濃度の測定対象物を添加し、 内部標準物質 （I . S. 、 好ましく は測定対象物質の安定同位元素標識体） を加え、 それぞれ測定する。 I . S. に 対する測定対象物のピーク面積比 （またはピーク高さ比） を求め、 添加濃度との 関係から、 検量線を作成し、 検量線と測定試料のピーク面積比 （またはピーク高 さ比） から、 生体試料中濃度を算出する。 これらの詳細については、 最新のマス スぺクトロメ トリー （第 1版、 発行：化学同人、 編集：丹羽利充、 1995年） 、 バイオロジカルマススぺク トロメ トリー （発行：東京化学同人、 編集：上野民夫、 平山和雄、 原田健一、 1997年） 、 LC MSの実際 （第 1版、 発行：講談社 サイェンティフィック、 編集：原田健一、 岡尚男、 1996年） 等を参照するこ とができる。
このようにして行う本発明の VD化合物の測定方法は、 従来方法よりも高感度 の測定法である。 さらに本発明の測定方法は、 今までの測定方法では感度が不十 分であった分子内にエステル結合 ·エーテル結合 ·チォエーテル結合 ·アミ ド結 合等のへテロ原子を有しない VD化合物 （具体的には、 前掲の VD3、.カルシポ トリオール、 1 α， 25 (OH) 2D3、 ALF、 ファレカルシトリオール、 E B 1089、 化合物 A等） の測定においては、 従来法に比べて数百倍もの高感度 化を達成可能な測定方法である。 従って、 エステル結合 ·エーテル結合 ·チォェ 一テル結合 ·アミ ド結合等のへテロ原子を有する VD化合物 （具体的には、 前掲 の OCT、 ED— 71等） のみならず、 それらへテロ原子を有さない VD化合物 に至るまで、 あらゆる VD化合物に適用可能な高感度測定法である。
以下、 本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、 '本発明はこれ らの実施例に限定されるものではない。
実施例
以下の実施例においては、 核磁気共鳴スぺク トル （NMR) は EX— 270 (J EOL社製） を用いて測定した。 また、 エレク トロスプレーイオン化 LC/ MS/MS (LC/E S I -MS/MS) として、 高速液体クロマトグラフ A 1 1 i a n c e 2790 (Wa t e r s C o. 社製） および四重極型質量分析 計 Qu a t t r o LC (M i c r oma s s UK L t d. 社製） を用い た。 また、 データ解析には、 Ma s s l yn x V e r 3. 3 (Mi c r oma s s UK社製） および M i c r o s o f t Ex c e l 2000 (M i c r o s o f t社製） を使用した。 実施例 1 誘導体化剤の合成
〔実施例 1— 1〕 4一 （フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン— 3， 5—ジオン （FMTAD) の合成
(1) 3— （フエロセニノレメチノレ） 力ルバモイルカルバジン酸ェチルエステルの 合成
フエ口セン酢酸 （東京化成株式会社製） 0. 5 g (2mmo 1) 、 ジフエニル ホスホリルアジド 0. 44mL (2mmo 1 ) およびトルエン 4mLの混合物に 氷冷下トリエチルァミン 0. 57mL (4mmo 1 ) を加え、 室温で、 30分間 攪拌した。 反応混合物をジクロロメタンで希釈し、 1%塩酸水溶液、 飽和炭酸水 素ナトリウム溶液で順次洗浄し、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、 濾過後、 減圧下濃縮し、 4 mLトルエン溶液として得た。 得られたトルエン溶液に 2 mL のトルエンを加え、 室温攪拌下カルバジン酸ェチルエステル 0. 32 g (3mm o 1 ) を加え、 3時間加熱還流した。 反応混合物をジクロロメタンで希釈し、 1%塩酸水溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、 有機層を無水硫酸 マグネシウムで乾燥、 濾過後、 減圧下濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィー （クロロホルム ： メタノール = 20 : 1) で精製し、 3 - (フエロセニルメチル） 力ルバモイルカルバジン酸ェチルエステル 0. 55 g (78%) を黄色油状物として得た。
XH NMR (CD C 1 3) δ ： 1. 2 7 (3 Η, t , J = 7. 3 H z ) , 4. 0-4. 3 (13 H, m) , 5. 59 (1 H, m) , 6. 59 ( 1 H, s) ， 6. 66 (1 H, s)
(2) 4 - (フエロセニルメチル） ゥラゾールの合成
上記 （1) で得られた 3— (フエロセニルメチル） 力ルバモイルカルバジン酸 ェチルエステル 0. 55 g (1. 6mmo 1 ) 、 炭酸力リウム 460mg (3. 3mmo 1) およびエタノール 16 m Lの混合物を 14時間加熱還流した。 反応 混合物を濾過後、 減圧下濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィー （クロ口ホルム ： メタノール = 10 : 1) で精製し、 4— (フエロセニ ルメチル） ゥラゾール 376 m g (78%) を得た。 JH NMR (THF— d 8) δ 3. 86 ( 2 H, m) , 3. 96 (5 H， s ) ， 4. 10 (2H, m) 4. 1 3 (2 H, s ) , 8. 38 (2 H, b r s )
(3) 4 - (フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジォ ンの合成
上記 （2) で得られた 4一 （フエロセニルメチル） ゥラゾール 10mg (0. 033mmo 1 ) およびテトラヒ ドロフラン一 d 8 0. 5mLの混合物にョー ドベンゼンジアセテート 1 1 mg (0. 034mmo 1 ) を室温で加え、 2時間 攪拌し、 4— (フエロセニルメチル） 一1， 2， 4—トリァゾリン— 3， 5—ジ オンのテトラヒ ドロフラン溶液を得た。
XH NMR (THF - d 8) δ ·· 3. 98 ( 2 H, m) ， 4. 04 (5 H， s) ， 4. 16 (2H， m) ， 4. 38 (2 H, s) 〔実施例 1— 2〕 4—フエ口セニル—1， 2， 4一トリァゾリン— 3， 5—ジ オン （FTAD) の合成
( 1 ) 3 _フエロセニルカルバモイルカルバジン酸ェチルエステルの合成 フエ口センカルボン酸 （東京化成株式会社製） 0. 5 g (2. 1 7mmo 1 ) 、 ジフエ二ノレホスホリルアジド 0. 47mL (2. 17mmo 1 ) およびトルエン 4 mLの混合物に氷冷下トリエチルァミン 0. 6mL (4. 3mmo 1 ) を加え、 室温で、 30分間攪拌した。 反応混合物をジクロロメタンで希釈し、 1%塩酸水 溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、 有機層を無水硫酸マグネシゥ ムで乾燥、 濾過後、 減圧下濃縮し、 4 mLトルエン溶液として得た。 得られたト ルェン溶液に 2mしのトルエンを加え、 室温攪拌下カルバジン酸ェチルエステル 0. 34 g (3. 27mmo 1 ) を加え、 1時間加熱還流した。 反応混合物をジ クロ口メタンで希釈し、 1 %塩酸水溶液、 飽和炭酸水素ナトリゥム溶液で順次洗 浄し、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、 濾過後、 減圧下濃縮した。 得られ た残渣をへキサン—ジクロロメタン （1 : 1) 混合液で洗浄し、 3 _フエロセニ ルカルバモイルカルバジン酸ェチルエステル 0. 52 g (72%) を黄色粉末と して得た。
1 H NMR (CDC 13) S '· 1. 3 1 (3 H, t, J = 7. 1 Hz) 4. 03 (2 H, s) , 4. 20 (5H， s ) , 4. 25 (2H， q, J 7. 1 H z) ， 4. 47 (2H, s ) ， 6. 24 (1H， b r s) ， 6 40 (1 H, b r s) , 6. 55 (1 H， b r s)
MS (ES I) ： m/z 332 (M++ 1) ， 331 (M+)
(2) 4—フエロセニノレゥラゾーノレの合成
上記 （1) で得られた 3—フエロセニルカルバモイルカルバジン酸ェチルエス テル 0. 52 g (1. 57mmo 1 ) 、 炭酸力リウム 434mg (3. 14 mm o 1 ) およびエタノール 16!111^の混合物を13時間加熱還流した。 減圧下濃縮 後、 2 N塩酸で酸性にした後、 ジクロロメタン一メタノール （10 ： 1) の混合 溶媒で抽出し、 水で洗浄後、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、 濾過後、 減 圧下濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ジクロ口 メタン： メタノール = 20 ： 1 ) で精製し、 4—フエロセニルゥラゾール 320 mg (71%) を得た。
XH NMR (THF- d 8) δ : 3. 87 (2H， t , J = 2. 0Hz) ， 3. 96 (5H， s) ， 4. 86 (2H, t, J = 2. OH z) ， 8. 64 (2 H， b r s)
MS (ES I) ： m/z 286 (M++1) ， 285 (M+)
(3) 4—フエロセニルー 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンの合成 上記 （2) で得られた 4 _フエロセニルゥラゾール 1 Omg (0. 035mm o 1 ) およびテトラヒドロフラン一 d8 0. 5 mLの混合物にョードベンゼン ジアセテート l lmg (0. 034mmo 1 ) を室温で加え、 1時間攪拌し、 4 —フエ口セニル一 1， 2, 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンのテトラヒ ドロフ ラン溶液を得た。
XH NMR (THF - d 8) δ ： 4. 0— 4. 1 (7H， m) ， 4. 6 6 (2H, t， J = 2. OH z) (4) 4—フエ口セニル— 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンの合成 (その 2)
上記 （2) で得られた 4—フエロセニルゥラゾール 1 Omg (0. 035mm 0 1 ) ぉょぴ1， 4一ジォキサン _d8 0. 5mLの混合物にョードベンゼン ジアセテート 1 1m g (0. 034mmo 1 ) を室温で加え、 2時間攪拌し、 4 一フエロセニルー 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンの 1， 4—ジォキ サン溶液を得た。
2H NMR (1， 4—ジォキサン一 d8) 8 ： 4. 2— 4. 3 ( 7 Η, m) , 4. 87 (2Η, m) 実施例 2 誘導体化剤とビタミン D化合物との結合体の合成
〔実施例 2— 1〕 アルファカルシドール 4— (フエロセニルメチル） —1，
2, 4—トリァゾリン一 3, 5—ジオン付加体 （ALF— FMTAD) の合成 実施例 1— 1を参考にして、 4— (フヱロセニルメチル） ゥラゾール 5 m g
(0. 01 7mmo 1 ) およぴテトラヒ ドロフラン 0. 25 m Lの混合物にョー ドベンゼンジアセテート 5 m g (0. 016mmo 1 ) を室温で加え、 2時間攪 拌し、 4一 （フエロセニルメチル） 一1， 2， 4—トリァゾリン一3, 5—ジォ ンのテトラヒ ドロフラン溶液を得た。 得られた溶液に、 特開昭 48— 62750 号公報および T e t r a h e d r o n Le t t. , 1973， 2339、 Te t r a h e d r o n, 30， 2701 (1 974) に記載の方法に従つ て製造したアルファカルシドール 1 mg (0. 0025mmo 1 ) のテトラヒ ド 口フラン （0. 25mL) 溶液を加え、 室温で 1時間攪拌した。 得られた混合物 を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン： 酢酸ェチル = 1 ： 2) で精製し、 標題のアルファカルシドール 4_ (フエロセ ニルメチル） 一1, 2, 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （ALF— F MTAD) 1 mg (57%) を黄色油状物として得た。
^ NMR (CD C 13) δ ： 0. 4— 0. 6 ( 3 Η, m) , 3. 6 -
3. 8 (l H， m) ， 4. 0-4. 6 (1 6 H, m) , 4. 6— 4. 8 (1 H， m) ， 4. 8— 4. 9 (1H， m)
〔実施例 2— 2〕 アルファカルシドール 4—フエ口セニル— 1， 2， 4—ト リアゾリンー 3， 5—ジオン付加体 （ALF— FTAD) の合成
実施例 1— 2を参考にして、 4一フエロセニルゥラゾール 5 m g (0. 01 7 mmo 1 ) およびテトラヒ ドロフラン 0. 25mLの混合物にョードベンゼンジ アセテート 4. 5mg (0. 014 mmo 1 ) を室温で加え、 1時間攪拌し、 4 一フエ口セニル一1， 2, 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンのテトラヒ ドロフ ラン溶液を得た。 得られた溶液に、 特開昭 48-62750号公報および Te t r a h e d r o n L e t t . , 1 973, 2339, Te t r a h e d r o n, 30， 2701 ( 1974 ) に記載の方法に従って製造したアルファ カノレシドール 1 mg (0. 0025 mmo 1 ) のテトラヒ ドロフラン （0. 25 mL) 溶液を加え、 室温で 1時間攪拌した。 得られた混合物を減圧下濃縮し得ら れた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン ：酢酸ェチル = 1 ： 2) で精製し、 標題のアルファカルシドール 4一フエ口セニル— 1， 2， 4 - トリァゾリン _3， 5—ジオン付加体 （ALF— FTAD) lmg (57%) を 黄色油状物として得た。
XH NMR (CDC 13) δ ·· 0. 54 (3 H, s ) ， 0. 85 (6 H, d, J = 6. 3Hz) ， 0. 89 (3H， d， J = 5. 3Hz) ， 3. 79 (lH， b r d， J = 1 5. 5Hz) ， 4. 0— 4. 4 (l lH， m) ， 4. 66 ( 1 H, d, J = 1 7. 6 Hz) , 4. 9一 5. 1 (3H， m)
〔実施例 2— 3〕 コレカルシフエロール 4— (フエロセニルメチル） — 1， 2, 4_トリァゾリン _3， 5—ジオン付加体 （VD3— FMTAD) の合成 実施例 1— 1を参考にして、 4一 （フエロセニルメチル） ゥラゾーノレ 10m g
(0. 033mmo 1 ) およびテトラヒドロフラン一 d8 0. 5mLの混合物 にョードベンゼンジアセテート 1 1 mg (0. 034mmo 1 ) を室温で加え、 2時間攪拌し、 4— (フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンのテトラヒ ドロフラン溶液を得た。 得られた溶液にコレカルシフエ口 一ノレ (VD3、 S o l v a y P h a r m a c e u t i c a l社製) 5 m g ( 0. 0 1 3mm o 1 ) のテトラヒ ドロフラン （0. 5mL) 溶液を加え、 室温で 1時 間攪拌した。 得られた混合物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロ マトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 2) で精製し、 標題のコレカルシ フェローノレ 4— (フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5 —ジオン付加体 （VD3— FMTAD) 8 m g (9 0%) を黄色油状物として得 た。
JH NMR (CDC 1 3) δ ·· 0. 4 7 (3 H, s ) ， 0. 8 7 (6 H， d, J = 6. 4H z) ， 0. 9 2 (3 H, d , J = 5. 9 H z) ， 3. 7 1 (1 H， b r d， J = 1 5. 2H z ) ， 4. 0— 4. 5 (1 5 H， m) ， 4. 6 0 (1 H， d, J = 9. 9 H z) ， 4. 8 6 ( 1 H, d， J = 9. 6 H z )
〔実施例 2— 4〕 コレカルシフエロール 4—フエ口セニル _ 1， 2， 4—ト リアゾリン— 3, 5—ジオン付加体 （VD3_FTAD) の合成
実施例 1 _ 2を参考にして、 4—フエ口セニルゥラゾ一ル 1 Omg (0. 0 3 5mmo 1 ) およぴテトラヒドロフラン 0. 5 m Lの混合物にョードベンゼンジ アセテート l l m g (0. 0 34mmo 1 ) を室温で加え、 1時間攪拌し、 4一 フエ口セニル一 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオンのテトラヒ ドロフラ ン溶液を得た。 得られた溶液にコレカルシフヱロール （VD3、 S o l v a y P h a r m a c e u t i c a l社製） 1 0m g (0. 0 2 6mmo l ) のテトラ ヒドロフラン （0. 5 mL) 溶液を加え、 室温で 1時間攪拌した。 得られた混合 物を減圧下濃縮し得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー （へキサ ン：酢酸ェチル = 2 ： 1) で精製し、 標題のコレカルシフエロール 4 _フエ口 セニル— 1， 2， 4一トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （VD3— F T A D) 1 1 m g (6 3%) を黄色油状物として得た。
'Η NMR (CD C 1 3) δ ·· 0. 6 0 (3 Η, s ) ， 0. 8 5 (6 Η, d， J = 6. 6 H z) ， 0. 9 2 (3 H， d， J = 5. 8 H z ) ， 3. 8 1 (1 H, b r d, J = 1 5. 5 H z ) , 4. 0— 4. 3 (1 1 H, m) ， 4. 73 (1 H, d， J = 9. 9 H z) ， 4. 9— 5. 0 (2H， m) , 5. 0 5 (1H， d， J = 1. 5H z)
〔比較例 2— 1〕 3— （フエロセニルカルバモイルォキシ） コレカルシフエ口 ールの合成 （VD3—フエ口セン力ルバメート） の合成
フエ口セン力ノレボン酸 1 Omg (0. 043 mm o 1 ) 、 ジフエニルホスホリ ルアジド 0. O lmL (0. 046mmo 1 ) およびトルエン 0. 5mLの混合 物に氷冷下トリエチルァミン 0. 01 5mL (0. 108 mm o 1 ) を加え、 室 温で 30分間攪拌した。 反応混合物をジクロロメタンで希釈後、 1%塩酸、 飽和 重曹水で洗浄し、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、 濾過後、 減圧下ジクロ ロメタンを留去し、 未精製のトルエン溶液を得た。 得られたトルエン溶液にコレ カノレシフェローノレ (VD3、 S o l v a y P h a r ma c e u t i c a l社 製） 10mg (0. 026mmo 1 ) を室温で加え、 100。Cで 1時間攪拌した。 反応混合物を減圧下濃縮し、 得られた残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー (へキサン：酢酸ェチル = 5 ： 1) により精製し、 3_ (フヱロセニルカルバモ ィルォキシ） コレカノレシフェロールの合成 （VD3—フエ口セン力ルバメート） 6mgを黄色油状物として得た。
NMR (CDC 13) δ ： 0. 55 (3H， s ) ， 0. 87 (6 H, d， J = 6. 4H z) ， 0. 92 (3H， d， J = 6. 1Hz) ， 3. 99 (2H, b r s) ， 4. 1 7 ( 7 H, b r s) , 4. 48 (2H, b r s) ， 4. 86 ( 1 H, s ) , 4. 94 ( 1 H, b r s) , 5. 08 (1H, s) ,
5. 7— 5. 9 (1 H， m) ， 6. 06 ( 1 H, d, J = 1 1. 1Hz) ，
6. 25 (1 H, d， J = 1 1. 1Hz) 実施例 3 誘導体化剤とビタミン D化合物との結合体の測定
〔実施例 3— 1〕 アルファカルシドーノレ 4— (フエロセニノレメチル） 一 1, 2， 4—トリァゾリン _3， 5—ジオン付加体 （ALF— FMTAD) およびァ ルファカノレシドーノレ 4—フエ口セニル一1， 2， 4—トリァゾリン _ 3， 5— ジオン付加体 （ALF— FTAD) の測定
実施例 2— 1を参考に合成したアルファカルシドール 4— (フエロセニルメ チル） _ 1， 2， 4—トリァゾリン _ 3， 5—ジオン付加体 （AL F— FMTA D) および実施例 2 _ 2を参考に合成したアルファカルシドール 4一フエロセ 二ルー 1， 2, 4 _トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （AL F— FTAD) それぞれを移動相 （l O mm o l ZL 酢酸アンモニゥムノァセトニトリル
(1 ： 9、 v/v) ) 5 0 Lに溶解し、 2 0 μ Lを LCZE S I -MS /MS に注入した。 HP LCカラムに C a p c e 1 1 P a k C 1 8 UG— 1 20
(5 /z m, 1 5 0 X 2. Omm i . d. ：株式会社資生堂製） を用い正イオン モードで AL F— FMTADおよび AL F— FTADの E S Iマススぺク トルを 測定したところ、 それぞれ mZz 6 9 7, m/z 6 8 3に分子イオン 〔M〕 +をベースピークとして与えた。 測定結果の一例を図 1に示す。 また、 コーン電 圧をそれぞれ 70 V、 6 6 Vに設定する時、 強度が最大となった。
これら分子イオンをプリカーサイオンとしてプロダクトイオンスぺクトノレを測 定したところ、 フエ口セン骨格を有する強いフラグメントイオンをそれぞれ z 1 9 9, m/ z 2 2 7に与えた。 測定結果の一例を図 2に示す。
そこで、 ALF— FMTADおよび AL F— FTADの MRM (Mu 1 t i p
1 e R e a c t i o n M o n i t o r i n g ) 条件を精査した結果、 モニタ リングチャンネルにそれぞれ m/ z 6 9 7 〔M〕 +〉 1 9 9 〔M— C29H44〇 4N3〕 +、 m/ z 6 8 3 〔M〕 +> 2 2 7 [M- C 28 H44 O 3 N 2] +を用い、 コリジョンエネルギーを 44 e Vに設定する時、 超高感度測定が可能で、 いずれ も 2 5 0 f g (3 5 9 a mo K 3 6 6 a mo l ) / i n j ( S /N比が約 6〜 8) という感度を得た。 一方、 同様にして測定したアルファカルシドール （AL F) の直接測定時における感度は 7 5 p g ( 1 8 8 f mo l ) / i n j (S/N 比が約 6 ) であり、 本発明の測定法は直接測定時に比べ約 3 0 0倍高感度であつ た。 これら測定結果の一例を図 3に示す。
〔実施例 3— 2〕 コレカルシフェローノレ 4 - (フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン _ 3， 5—ジオン付加体 （VD3— FMTAD) およびコ レカノレシフェローノレ 4 _フェロセニル_ 1， 2， 4一トリァゾリ ン一 3， 5 - ジオン付加体 （VD3— FTAD) の測定 実施例 2— 3を参考に合成したコレカルシフエロール 4_ (フヱロセニルメ チル） — 1， 2， 4一トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （VD3— FMTA D) および実施例 2— 4を参考に合成したコレカルシフエロール 4—フヱロセ 二ルー 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （VD3— FTAD) を用い、 実施例 3— 1と同様に測定条件を最適化した結果、 いずれも 250 f g
(367 amo 375 amo l ) / i n j (S N比が約8〜1 1) という 感度を得た。 一方、 同様にして測定したコレカルシフエロール （VD3) の直接 測定時、 および 3— (フエロセニルカルバモイルォキシ） コレカルシフエロール
(VD3—フエ口セン力ルバメート） （比較例 2— 1参照） における感度は 50 p g (130 f mo l ) / i n j ( S /N比が約 8) 、 1 p g (1. 64 f m o 1) / i n j (S/N比が約 5) であり、 本発明の測定法は直接測定時に比べ約 200倍、 フエ口セン力ルバメート誘導体化による測定時に比べても 4倍以上高 感度であった。 これら測定結果の一例を図 4に示す。 〔実施例 3— 3〕 ED— 71の 4_ (フエロセニルメチル） — 1， 2， 4—ト リアゾリン— 3， 5—ジオン付加体 （ED— 71— FMTAD) および国際公開 WOO 2/13832号公報の実施例 6に記載の化合物 （化合物 A) の 4一 （フ エロセニルメチル） — 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （化合 物 A— FMTAD) の測定
実施例 2を参考に合成した ED— 71の 4— (フエロセニルメチル） 一 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 （ED— 71—FMTAD) およぴ国 際公開 WO 02/13832号公報の実施例 6に記載の化合物 （化合物 A) の 4 一 （フヱロセニルメチル） _ 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン付加体 (化合物 A— FMTAD) を用い、 実施例 3— 1と同様に測定条件を最適化した 結果、 それぞれ 300 f g (381 amo l) i n j、 500 f g (668 a mo 1 ) / i n j という感度を得た。 一方、 同様にして測定した E D _ 71およ び化合物 Aの直接測定時における感度は、 それぞれ 1 O p g (20 f mo 1 ) / i n i、 50 p g (l l l f mo l) / i n jであつ 7こ。 上記の実施例 3— 1、 3— 2および 3— 3の結果のまとめを表 1に示す。
Figure imgf000039_0001
実施例 4 生体試料中のビタミン D化合物の測定
〔実施例 4— 1〕 ラット血漿中のアルファカルシドール （ALF) の FMTA D誘導体化による測定
(1) ラットブランク血漿の調製
SD系無処置ラット （SPFグレード、 S i c社より購入） よりへパリンナト リゥムを抗凝固剤として採血し、 遠心分離して得られた数個体分の血漿を混合し た血漿を使用した。 プール血漿は— 20 °C以下で保存した。
(2) アルファカルシドール （ALF) の検量線下限検討 （FMTAD誘導体 ィ匕）
ラットブランク血漿 100 μ Lに特開昭 48-62750号公報おょぴ Te t r a h e d r o n Le t t. , 1973, 2339、 Te t r a h e d r o n， 30， 2701 ( 1974 ) に記載の方法に従って製造したアルファ カルシドール （ALF) のエタノール溶液を添加し、 0、 0. 08、 0. 25、 0. 8、 2. 5、 8および 25 n gZmLの検量線作成用試料を調製した。 各濃 度 100 μ Lに、 內部標準物質 （1. 3. ) として〇116111. Ph a rm. Bu l l . , 48， 215 ( 2000 ) に記載の方法に従って製造した 40 n g/ mLの d4_ALF 2 を加え、 エタノール除蛋白、 固相抽出カー トリッジ （B o n d E l u t S I、 3 c c、 500mg : V r i a n I n c. 社製） による固相抽出を行った後、 FMTADにより誘導体化した。 誘導体 化後、 再び固相抽出カートリッジ （Oa s i s HLB、 l c c、 30 m g ： W a t e r s社製） により固相抽出を行い、 窒素乾固後、 残渣を移動相 40 しに 溶解し、 10 Lを LCZE S I—MS/MSに注入した。 試料の前処理の具体 的な処理スキームを図 5に示す。 LCZES I—MS/MSの測定条件は表 2に 示す。 表 2
ALF-FMTAD測定 ：
カラム： CapceU Pak C18 UG 120 (5 μπι, 150 X 2.0 mm i.d.) 移動相： A液 lOmmol/L酢酸アンモニゥム、
B液 ァセトニトリノレ （A： 15%、 B： 85%)
カラム温度： 30°C
流速： 0.2 mU分
イオン化モード： ESI (+)
キヤピラリー設定電圧： 2.5 kV
コーン設定電圧： 70 V
ソースブロック設定温度： 150°C
デソルベーター設定温度： 450°C
コリジョン設定エネルギー 46 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件：
ALF-FMTAD： m/zG91 [M]+> 199 [M-C29H4404N3]+
d4 ALF-FMTAD： m/z 101 [M]+> 199 [M-C29H40D4O4N3
S /N比が約 3〜 5で検量線下限値を求めた結果、 本発明の測定法における検 量線下限値は 0. 08 n g/mLであり、 比較例 4 _ 1に示される直接測定時 (10 n g/mL) に比べて 125倍、 比較例 4— 2に示される P T AD誘導体 化による測定時 （I n g/mL) に比べて 12. 5倍、 高感度であった。 また、 ラット血漿 lmLを用いて、 上記と同様に検量線下限値を求めた結果、 本発明の 測定法における検量線下限値は 0. 01 n gZm であった。 検量線下限におけ るクロマトグラムの一例を図 6に示す。
(3) 特異性検討
前記 （2) の前段で用いた検量線ブランク （O n gZmL) および検量線下限 (0. 08 n g/mL) のクロマトグラムとを比較した。 その結果、 ALF— F MTADおよび d4— ALF— FMTADの測定を妨害するピークは認められず、 検量線ブランク試料にも、 A L F— F M T A Dの溶出時間に妨害ピークは認めら れなかった。
(4) 検量線の範囲と直線性の検討
前記 （2) の前段で用いた試料をそれぞれ 3日間測定し、 I. S. に対する測 定対象物のピーク面積比を求め、 添加濃度との関係から最小二乗法により検量線 を作成し、 （1/y2重みづけ） 、 相関係数 （r) および各濃度における逆算値 の真度を求めた。 検量線と各試料のピーク面積比から実測値を n gZmL単位で 有効数字 3桁で求めた。 尚、 FMTADによる誘導体化反応において 2種類の異 性体 （6R/6 S) が生成するが、 SZN比の大きいピークを選択し （保持時間
(R. T. ) 約 8. 8分） 、 定量を行った。
検量線を 3日間作成した結果を表 3に、 またその典型的なダラフを図 7に示す。
表 3
添加濃度 1 曰目 2曰目 30目
(ng/mL) 実測値 真度 実測値 真度 実測値 真度
(ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%)
0.08 0.0769 -3.9 0.0790 -1.3 0.0812 1.5
0.25 0.260 4.0 0.251 0.4 0.240 -4.0
0.8 0.858 7.2 0.879 9.9 0.830 3.7
2.5 2.55 2.0 2.4 -2.4 2.58 3.2
8 8.01 0.1 8.12 1.5 7.70 -3.8
25 23.1 -7.6 23.6 -5.6 25.1 0.4
直線回帰式
日目 =0.954488x+0.0550209 r=0.991277 (1/v2重みづけ） 2日目 y=1.15772x+0.0282662 r=0.995203 (1/y2重みづけ）
3日目 y=1.05255x+0.0404921 r=0.999741 (1/y2重みづけ）
検量線の相関係数 （r) は 0. 08〜25 n gZmLの範囲で 0. 991 27 7〜0. 999741 (1/y2重みづけ） 、 各濃度の逆算値の真度は— 7. 6 〜9. 9%と、 良好な直線性を示した。
(5) 同時再現性の検討
前記 （2) の前段と同様に、 ラットブランク血漿 （100 // L) に ALFを添 加することにより、 0. 08、 0. 25、 2. 5および 25 n gZmLの同時再 現性用試料を調製してそれぞれ処理し測定した。 各濃度 n = 5で 3日間測定し、 1日単位で変動係数 （Co e f f i c i e n t o f Va r i a t i o n、 以 下 CV値） および真度を求めた。 尚、 CV値および真度は、 次式により算出した。
〇 値= (実測値標準偏差/実測値平均値） X I 00 (%)
真度 = { (実測値平均値一理論値） Z理論値 } X 100 (%) 結果の一例を表 4に示す。
表 4
曰目
添加濃度 実測値 平均土 SD cv 真度
(ng/mL) (ng/mL) (ng mL) (%) (%)
0.08 0.0675 0 ± 0 0094 14.3 -17.6
0.0593
0.0795
0.0551
0.0679
0.25 0.274 0 282 士 0 039 】3·8 12.8
0.295
0.319
0.219
0.304
2.5 2.75 2.71 ± 0.08 3.0 8.4
2.70
2.57
2.77
2.77
25 24.6 23.4 ± 1.5 6.4 -6.4
24.6
21.7
24.1
21.9 曰目
添加濃度 実測値 平均土 SD CV 真度
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (%) (%)
0.08 0.0878 0.0854 ± 0.0104 12.2 6.8
0.0949
0.0727
0.0763
0.0951
0.25 0.263 0.267 ± 0.015 5.6 6.8
0.256
0.275
0.290
0.252
2.5 2.75 2.33 ± 0.33 14.2 -6.8
1.98
2.06
2.30
2.58
25 24.8 25.2 ± 1.0 4.0 0.8
24.5
26.8
25.6
24.5 表 4 (続き）
3曰 S
Figure imgf000044_0001
各濃度における CV値は 1 5%以下 （定量下限では 20%以下） 、 真度は ± 1 5%以内 （定量下限では ±20%以内） で、 良好な精度、 真度であった。
(6) 日差再現性の検討
前記 （5) の測定結果をもとに、 3日間全体の CV値および真度を同様に求め た。
結果の一例を表 5に示す。
Figure imgf000045_0001
各濃度における CV値は 1 5%以下 （定量下限では 20%以下） 、 真度は土 %以内 （定量下限では ± 20%以内） で、 良好な精度、 真度であった。 (7) 回収率の検討 前記 （5) で用いた同時再現性試料を回収率用試料として利用した。 回収率算 出の対照となる試料 （リファレンス試料） として、 ラットブランク血漿を前処理 した試料に 0. 145、 0. 436、 4. 36および 43. 6 n g/mLの AL F— FMTAD 100 Lを 2本ずつ分注した。 それぞれ測定し、 リファレンス 試料のピーク面積の平均値を 100%とし、 測定試料のピーク面積との比較によ り A L Fの回収率を求めた。
回収率 = (回収率用試料のピーク面積 Zリファレンス試料のピーク面積の平均 値） X 100 (%)
結果の一例を表 6に示す。 いずれも実用に耐えうる回収率であった。
表 6
添加濃度 測定試料 リファレンス試料 回収率 平均 SD
— (ng/mL)―のピーク面積 のピーク面積
0.08 70 137 53.8 37.7 11.6
51 123 39.2
33 25.4
55 42.3
36 27.7
0.25 148 239 44.2 39.1 8.0
149 431 44.5
85 25.4
129 38.5
143 42.7
2.5 1193 3127 40.1 41.2 9.5
1313 2828 44.1
757 25.4
1394 46.8
1474 49.5
25 5207 22412 20.7 24.5 4.8
5406 27884 21.5
5323 21.2
7820 31.1
7075 28.1
(7) 誘導体化率の検討
前記 （5) で用いた同時再現性試料を誘導体化率用試料として利用した。 誘導 体化率算出の対照となる試料 （リファレンス試料） として、 ラットブランク血漿 をエタノール除蛋白、 固相抽出カートリッジ （B o n d E 1 u t S I、 3 c c、 500mg : Va r i a n S PP社製） による固相抽出を行った後、 FM T A Dを加えた試料に ALF— FMTADを添加した試料を 2本調製した。 それ ぞれ測定し、 リファレンス試料のピーク面積の平均値を 100%とし、 測定試料 のピーク面積との比較により ALFの誘導体化率を求めた。
誘導体化率 = (誘導体化率用試料のピーク面積 Zリファレンス試料のピーク面 積の平均値） X 100 (%)
結果の一例を表 7に示す。 いずれも実用に耐えうる誘導体化率であった。
表 7
添加濃度 測定試料 リファレンス試料 誘導体化率 平均
(ng/mL) のピーク面積 のピーク面積 (%) (%)
0.08 99 92 114.5 89.6
56 81 64.7
0.25 191 338 52.9 54.3
201 384 55.7
2.5 1734 3023 57.3 46.3
1069 3034 35.3
25 11141 26204 45.1 45.3
11239 23215 45.5
(8) サンプルクーラー中での安定性の検討
前記 （2) の前段と同様に、 ラットブランク血漿 （I O O L) に AL Fを添 加することにより、 0. 08、 0. 25、 2. 5および 25 n gZmLの安定性 検討用試料を調製してそれぞれ処理し測定した。 各濃度 n = 3で、 試料調製日の 実測値 （I n i t i a 1値） と、 サンプルクーラー中で 5 °C · 24時間保存後の 実測値 （P o s t値） 力、ら、 次式を用いて変動率を算出した。 変動率 = {P o s t値の平均値/ I n i t i a l値の平均値 } X 100 (%) 変動率を調べた結果、 いずれの濃度においても大きな変動は認められず、 安定 性に問題は認められなかった
〔実施例 4一 2〕 ラット血漿中の ED— 71の FMTAD誘導体化による測定 ビタミン D化合物として ED— 71を用いた他は実施例 4 _ 1 (2) の前段と 同様にして、 ラット血漿中の ED— 71を FMTAD誘導体化により LC/ES I MS ZMSを用いて測定した。 測定条件は表 8に示す。 表 8
ED-71-FMTAD 驗：
カラム： Capcell Pak C18 UG-120 (5 μπι, 150 X 2.0 mm i.d.) 移動相： A液 10mmol/L酢酸アンモニゥム '
B液 ァセ トニトリノレ （A： 45%、 B： 55%)
カラム温度： 30°C
流速： 0.2 mL/分
イオン化モード： ESI (+)
キヤピラリー設定電圧： 1.0 kV
コーン設定電圧： 72 V
ソースブロック設定温度： 150°C
デソルベーター設定温度： 450°C
コリジョン設定エネルギー： 52 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件：
ED-71FMTAD： ζπ/ζ787 [Μ]+> 199 [M-C33H5o07N3]+
de-ED-71-FMTAD： ^793 [M]+> 199 [M- C33H44D607N3ト
SZN比が約 3で検量線下限値を求めた結果、 本発明の測定法では 0. 25 η g / m Lでめつ 7こ。
〔実施例 4一 3〕 ラット血漿中の国際公開 WOO 2/13832号公報の実施 例 6に記載の化合物 （化合物 A) の FMTAD誘導体化による測定
E D— 71の代わりに国際公開 WO 02/13832号公報の実施例 6に記載 の化合物 （化合物 A) を用いた他は実施例 3— 2と同様にして、 ラット血漿中の 化合物 Aを FMTAD誘導体化により LCZE S I一 M S ,M Sを用いて測定し た。 測定条件は表 9に示す。 表 9 化合物 A-FMTAD測定条件
カラム ： Capcell Pak C18 UG-120 (5 μιη, 150 X 2.0 mm i.d.)
移動相： Α液 10 mmol/L酢酸ァンモニゥム
B液 ァセトニトリル （A： 35%、 B： 65%) カラム温度： 30°C
流： ¾： 0.2 mL/分
イオン化モード： ESI (+)
キヤピラリー設定電圧： 1.0 kV
コーン設定電圧： 65V
ソースプロック設定温度： 150。C
デソルベーター設定温度： 450。C
コリジョン設定エネルギー ： 55 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件：
化合物 A-FMTAD： m/z 749 [M]+> 199 [M-C32H4405N3
S/N比が約 3で検量線下限値を求めた結果、 本発明の測定法では 0. 2 5 η g Z mLでめった。
〔比較例 4— 1〕 誘導体化を行わないラット血漿中のアルファカルシドール (ALF) の直接測定
実施例 4— 1 (2) と同様に、 ラットブランク血漿にアルファカルシドール (ALF) を添カ卩し 0、 1、 3、 1 0、 30、 1 00、 300および 1 00 O n gZmLの検量線作成用試料を調製した。 各濃度 1 0 0 に、 内部標準物質 ( I . S. ) として 400 n g/mLの d4— ALF 2 を加えた後、 ェ タノール除蛋白、 固相抽出カートリッジ （B o n d E 1 u t S I、 3 c c、 500mg : V a r i a n S PP社製） による固相抽出を行った。 窒素乾固後、 残渣を移動相 40 μ Lに溶解し、 1 0 μ Lを LCZE S I一 MS, MSに注入し た。 測定条件は表 1 0に示す。 表 1 0
ALF測定条件：
カラム： Capcell Pak C18 UG-120 (5 μηι, 150X2.0 mm i.d.)
移動相： Α液 10 mmol/L酢酸ァンモニゥム
B液 メタノール （A： 15%、 B： 85%)
カラム温度： 30。C
流速： 0.2 mL/分
イオン化モード： ESI (+)
キヤピラリー設定電圧： 2.8 kV
コーン設定電圧： 15 V
ソースプロック設定温度 110°C
デソルベーター設定温度 350°C
コリジョン設定エネルギ 10 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件：
ALF： m/z 418 [M+NH4]+ > 383 [M-H20+H]+
d4-ALF-FMTAD： m/z 422 [M+NH4]+> 387 [M H20+H]^
SZN比が約 3で検量線下限値を求めた結果、 直接測定における検量線下限値 は 1 0 n gZmLであった。 検量線下限におけるクロマトグラムの一例は、 実施 例 4一 1 (2) の結果および後述の比較例 4一 2の結果とともに図 6に示す。
〔比較例 4— 2〕 ラッ ト血漿中のアルファカルシドール （ALF) の PTAD (4—フエニル一 1， 2, 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン） 誘導体化による 測定
実施例 4— 1 (2) と同様に、 ラットブランク血漿にアルファカルシドール (ALF) を添加し 0、 0. 1、 0. 3、 1、 3、 1 0、 30、 1 00および 3 00 n g/mLの検量線作成用試料を調製した。 各濃度 1 00 μ Lに、 内部標準 物質 （I . S. ) として 40 n gZmLの d4— ALF 20 Lを加えた後、 エタノール除蛋白、 固相抽出カートリッジ （B o n d E 1 u t S I、 3 c c、 500mg : V a r i a n S PP社製） による固相抽出を行った後、 論文記載 の方 (B i o l o g i c a l Ma s s S p e c t r ome t r y 1 9 9 3 ； 22 : 6 2 1 -6 3 2, J o r n a l o f Ch r oma t o g r a p h y 1 9 93 ； 64 5 : 1 1 5— 1 23等） に従って 4—フエ二ルー 1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン （PTAD ： S I GMA社製） により誘 導体化した。 誘導体化後、 窒素乾固し残渣を移動相 40 μ Lに溶解し、 I O L を L C/E S I — MS /MSに注入した。 測定条件は表 1 1に示す。
ALF PTAD測定条件
カラム： Capcell Pak C18 UG 120 (5 μηι, 150X2.0 mm i.d.) 移動相 ： A液 10 mmol/L 酢酸アンモニゥム /ァセ トニトリル (1： 1)
B 液 10 mmol/L 酢酸アンモニゥム /ァセ トニ ト リル (2： 98)
(A： 35%、 B： 65%)
カラム温度： 40°C
0.2 mL/分
イオン化モード： ESI (+)
キヤピラリー設定電圧： 3.5 kV
コーン設定電圧： 26 V
ソースブロック設定温度 110°C
デソルベーター設定温度 350°C
コリジョン設定エネルギー ： 16 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件：
ALF-PTAD： /z 576 [M+H]+> 314 [M-Ci9H33]+
d4 ALF-PTAD： m/z 580 [M+H]+> 314 [M-C19H29D4]
S/N比が約 2で検量線下限値を求めた結果、 P TAD誘導体化による測定時 における検量線下限値は 1 n g/m乙であった。 検量線下限におけるクロマトグ ラムの一例は、 実施例 4一 1 (2) の結果および比較例 4一 1の結果とともに図 6に示す。
[実施例 4 -4] 生体試料中ビタミン D誘導体の測定の前処理法簡便化
( 1 ) 前処理条件簡便化
図 5に示す試料の前処理方法を以下のごとく、 簡便化した。 アルファカルシド ール （ALF) を添加したラットブランク血漿 （100 μ ΐ) に 40 ng/raL の d4-ALF (I. S. ) 20 μ ΐ を加え、 ァセトニトリルによる除蛋白処理後、 96 ゥェル固相 抽出カートリッジ （Oasis HLB 96wel l plate, lcc, 10 mg： Waters 社製） によ り、 固相抽出を行った。 FMTAD による誘導体化を行い、 窒素乾固後、 10 ramol/L 酢酸アンモニゥム /ァセトニトリル （23 : 77, v/v) 100 μ ΐ に溶解し、 30 /x L を カラムスイッチングを用いる LC/ESI- MS/MS に注入した。 試料の具体的な処理ス キームを図 8に示す。 LC/ESI-MS/MSの測定条件は表 1 2に示す。 表 1 2
ALF-FMTAD測定条件②
トラッピングカラム： Cadenza CD-C18 (3 μπι, 50 X 2.0 mm I.d.)
カラム温度
分析カラム: Capcell Pak C18 UG-120 (5 μπι, 150 X 2.0 mm I.d.)
カラム温度 室温
移動相 1 : A液 lO nunol/L酢酸アンモニゥム、 B液 ァセトニトリ 流速 0.5 mL/分
0 min-5.20 min A： 23%、 B： 77%
5.21 min-8.00 min A: 0%、 B : 100%
8.01 min- 14.00 min A： 23%、 B： 77%
移動相 2 : 10 mmol/L酢酸アンモニゥム /ァセトニトリル（10 : 90, v/v:
流速 0.2 mL/分
バルブスイッチング: 0 min: Position 1
4.25 min: Position 2
5.2 min: Position 1
イオン化モード： ESI (+)
キヤビラリ一電圧： 1.0 kV
コーン設定電圧： 70V
ソースブロック設定温度： 150°C
デソルべ—ター設定電圧： 450。C
コリジョン設定エネルギー： 46 eV
MRM (Multiple Reaction Monitoring)条件
ALF-FMTAD： m/z 697 [M]+ > 199 [M - C29H4404N3]+
d4 - ALF- FMTAD : m/z 701 [M]+ > 199 [ -C29H40D4O4N4]+
また、 カラムスイッチングについては図 9に示す。 尚、 FMTAD による誘導体化 反応において 2種類の異性体 （6R/6S) が生成するが、 HPLC上、 はじめに溶出す る異性体の S/N比が高かったことから、 トラッピングカラムから分析カラムには、 この S/N比の高い異性体の溶出画分のみを通導するカラムスィツチング条件を設 定した。
( 2 ) 検量線の範囲と直線性の検討
100 ng/mL ALF エタノール溶液をラッ トブランク血漿で希釈し、 0, 0. 05， 0. 15, 0. 5, 1. 5, 5 および 15 ng/mL の検量線作成用試料を調製した。 検量線作 成用試料 100 1 を前記 （1) に示した条件にて処理し、 測定した。 本試料は 3 日間測定した。 I. S.に対する測定対象物のピーク面積比を求め、 添加濃度との関 係から最小二乗法により検量線を作成し （1/χ 重みづけ） 、 相関係数 （r) およ び各濃度における逆算値の真度を求めた。
検量線を 3日間作成した結果を表 1 3に、 その典型的なグラフを図 1 0に示す。 表 1 3 添加濃度 I B 1 2曰目 3日目
(ng/mL) 実測値 真度 実測値 真度 実測値 真度
(%) (ng mL) (%) (ng mL) (%)
0.05 0.0412 -17.6 0.0497 -0.7 0.0470 -5.9
0.15 0.152 1.5 0.139 -7.3 0.161 7.5
0.5 0.541 8.3 0.517 3.3 0.513 2.5
1.5 1.53 1.7 1.5 1.6 1.42 -5.1
5 5.49 9.8 5.24 4.8 5.05 1.0
15 14.4 -3.7 14.7 -1.8 15.0 0.0
直線回帰式
1日目 y=1.64608x+0.0281324 r=0.996552 (1/x重みづけ）
2日目 =1.63152x+0.0257574 r=0.999206 (1/x重みづけ）
3日目 y=1.58456x+0.0548324 r=0.999950 (1/x重みづけ） 検量線の相関係数 （r) は 0. 05〜15 ng/mL の範囲で 0. 996552~0. 999950、 各 濃度の逆算値の真度は- 17. 6〜9. 8%と良好な直線性を示した。
( 3 ) 同時再現性の検討
前記 （2 ) の前段と同様に、 100 ng/mL ALF エタノール溶液をラットブランク 血漿で希釈し、 0. 05, 0. 15， 1. 5 および 15 ng/mL の同時再現性用試料を調製し てそれぞれ処理し測定した。 各濃度 n=5で 3 日間測定し、 各測定日ごとに CV値 および真度を求めた。 結果を表 1 4に示す。
表 1 4
Figure imgf000054_0001
曰目
添カ卩濃度 実測値 平均土 SD CV 真度
fne/mL ine/mL) i、n"e/mL (%) (%)
0.05 0.0526 0.0407 ± 0.0069 17.0 -18.6
0.0365
0.0357
0.0401
0.0384
0.15 0.145 0.149 土 0.010 6.7 -0.7
0.144
0.138
0.165
0.152
1.5 1.67 1.68 ± 0.05 3.0 12.0
1.68
1.68
1.75
1.61
15 16.2 15.9 土 0.2 1.3 6.0
16.0
15.6
15.9
15.7 表 1 4 (続き）
3曰目
添加濃度 実測値 平均土 SD CV 真度
(ng/mし） (ng/mL) (ng/mL) (%) (%)
0.05 0.042 0.0406 ± 0.0076 18.7 -18.8
0.0392
0.0287
0.0442
0.0492
0.15 0.156 0.147 土 0.014 9.5 -2.0
0.156
0.122
0.152
0.151
1.5 1.63 1.61 土 0.10 ん 3
1.68
1.71
1.57
1.46
15 20.0 17.1 土 1.8 10.5 14.0
15.7
15.4
17.8
16.8 いずれの測定日も、 各濃度における CV値は 15%以下 （定量下限では 20%以下） ， 真度は ± 15%以内 （定量下限では ±20%以内） で、 良好な精度、 真度であった。
( 4 ) 日差再現性の検討
前記 （3 ) の結果をもとに、 3 日間全体の CV値および真度を求めた。 結果を 表 1 5に示す。
表 15
添加濃度 i\I 平 ±SD CV 添加濃度 実測 fiT 平
(ng/mL) (ngmL) (ngmL) (%) (%) (ngmL) (ngmL)
0.05 0.0545 0.0453 0.0088 19.4 -9.4 1.5 1.40 1.65
0.0546 1.73
0.0575 1.69
0.0517 1.74
0.0547 1.79
0.0526 1.67
0.0365 1.68
0.0357 1.68
0.0401 1.75
0.0384 1.61
0.0418 1.63
0.0392 1.68
Figure imgf000056_0001
各濃度における CV値は 15%以下 （定量下限では 20%以下） 、 真度は ±15%以内 (定量下限では ±20%以内） で、 良好な精度、 真度であった。
(5) 回収率の検討
前記 （3) で用いた同時再現性試料を回収率用試料として利用した。 回収率算 出の対照となる試料 （リファレンス試料 1) として、 ラットブランク血漿を前処 理した試料に前記 （3) で調製した 0.05， 0.15, 1.5および 15 ng/mL ALFェタノ ール溶液各 100 Lを 3本ずつ分注し、 誘導体化後、 測定した。 リファレンス試 料 1のピーク面積の平均値を 100%とし、 測定試料のピーク面積の比較により ALF の回収率を求めた。 結果を表 16に示す。 いずれも実用に耐えうる回収率であつ た。
表 16
Figure imgf000057_0001
(6) 誘導体化率の検討
前記 （5) で調製したリファレンス試料 （1) を誘導体化率用試料として利用 した。 誘導体化率算出の対照となる試料 （リファレンス試料 2) として、 ラット ブランク血漿を前処理し、 誘導体化した試料に 0.0436， 0.0871, 1.39 および 13.9 ng/mL ALF-FMTADエタノール溶液各 100 /iL を 3本ずつ分注し、 測定した。 リファレンス試料 2 のピーク面積の平均値を 100%とし、 測定試料のピーク面積 の比較により ALFの抽出効率を求めた。 表 16に示す。 いずれも実用に耐えうる 誘導体化率であった。
(7) 特異性の検討
ラットブランク血漿、 前記 （2) で用いた検量線ブランク （0 ng/mL) および 検量線下限 （0.05 ng/mL) のクロマトグラムを比較した。 ALF-FMTAD のクロマト グラムを図 1 1に、 d4-ALF-FMTADのクロマトグラムを図 12に示す。
ラットブランク血漿に ALF-FMTADおよび d4- ALF- FMTADの測定を妨害するピー クは認められなかった。 また、 検量線ブランク （0 ng/mL) に ALF-FMTAD の測定 を妨害するピークは認められなかった。
(まとめ）
以上の実施例に示されたように、 ビタミン D誘導体の FMTADを用いた誘導体化 法について前処理方法を簡便化するとともに、 カラムスィツチングを用いる LC/ESI - MS/MS法を採用したことにより回収率が向上し、 定量下限 0.05 ng/mL と さらに高感度化を達成することができた。 本法は、 感度、 特異性、 直線性および 精度に優れる定量法であり、 多検体の分析にも十分適用可能であると考えられる。 産業上の利用可能性
以上述べたように、 本発明のフエ口セン化合物と VD化合物とを反応させ、 こ れらを結合した化合物を LC/E S I—MSZMSに供することにより、 従来方 法よりも高感度で VD化合物を測定することが可能となった。 さらに本発明の測 定方法は、 今までの測定方法では感度が不十分であった分子内にエステル結合 · エーテル結合 ·チォエーテル結合 ·アミ ド結合等のへテロ原子を有しない VD化 合物 （具体的には、 前掲の VD3、 カルシポトリオール、 l a, 25 (OH) 2 D3、 ALF、 ファレカルシトリオール、 EB 1089、 化合物 A等） の測定に おいては、 従来法に比べて数百倍もの高感度化を達成可能な測定方法である。 従 つて、 エステル結合 ·エーテル結合 ·チォエーテル結合 ·アミ ド結合等のへテロ 原子を有する VD化合物 （具体的には、 前掲の OCT、 ED— 71等） のみなら ず、 それらへテロ原子を有しない VD化合物に至るまで、 あらゆる VD化合物に 適用可能な高感度測定法である。 また、 フエ口セニルアジドを誘導体化剤として 用いる場合のように、 反応条件に加熱を要する必要等もなく、 取り扱いの容易な V D化合物の測定方法である。
また、 上述のとおり、 本発明のフエ口セン化合物は、 VD化合物を LC/ES I MSZMSにて測定する際の誘導体化剤として非常に有用である。
さらに、 本発明のフ mロセン化合物と V D化合物とを反応させることにより得 られたフヱロセン化合物と VD化合物の結合体は、 VD化合物を LC/ES I - MS ZMSにて測定する際の標品等として有用である。

Claims

請求の範囲
1. 下記式 （1) で表されるフエ口セン化合物。
Figure imgf000060_0001
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 W — X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを表し； Xは一 O
―、 一 N (RJ C ( = 0) ―、 — N (Ra) C ( = 0) NH―、 — OC (= O) NH—または _N (Ra) OS (=0) —を表し、 Raは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数を表す。 ） 2. Rおよぴ1 ， が水素原子である請求項 1記載のフエ口セン化合物。
3. Qが直接結合またはアルキレンを表す請求項 1または 2に記載のフエロセ ン化合物。
4. Qがメチレンである請求項 1または 2に記載のフエ口セン化合物。
5. Qが直接結合である請求項 1または 2に記載のフエ口セン化合物。
6. 4— (フエロセニルメチル） 一1， 2， 4—トリァゾリン一 3， 5—ジォ ンまたは 4―フエ口セニル一 1， 2， 4_トリァゾリン一 3， 5—ジオンである 請求項 1に記載のフエロセン化合物。
7. 請求項 1に記載のフエ口セン化合物を含有する、 トリェン構造を有する化 合物を測定するための試薬。
8. さらに前記フエロセン化合物を溶解し得る溶媒を含有する請求項 7に記載 の試薬。
9. 下記式 （1)
Figure imgf000061_0001
(1)
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 Wi_X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを表し； Xは一 O 一、 — N (Ra) C ( = 0) ―、 -N (Ra) C (=0) 題―、 — OC (= O) NH—または一 N (Ra) OS (=0) —を表し、 Raは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R， はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数を表す。 ） で表されるフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物。
10. 前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物が、 前 記フエロセン化合物と前記ビタミン D化合物とが共有結合により結合した化合物 である請求項 9に記載の化合物。
1 1. 前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物が、 下 記式 (2)
Figure imgf000061_0002
(2) (式中、 A iおよぴ八3はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アル キレン、 置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していて もよい低級アルカイ二レンを表し； A2は直接結合、 一 CH二 CH—、 — C≡C ―、 一 O—、 一 S—または一 NH—を表し； 1^は水素原子または一 OR9 (R9 は水素原子または保護基を表す。 ） を表し； R2は水素原子、 水酸基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級アル ケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有していても よい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級ァシル基を表し； R 3は水素原子または保護基を表し； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水素 原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級 アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していて もよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基 を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有していてもよい力ルバモイ ル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し； R7および R8はそれぞ れ独立して水素原子または水酸基を表すか、 或いは、 R7および R8が一緒にな つて二重結合を形成し； Qは直接結合、 アルキレンまたは— W — X— W2—を 表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを 表し； Xは一0—、 一 N (Ra) C ( = 0) 一、 一 N (Ra) C (=0) NH―、 — OC (=0) NH—または一 N (Ra) OS (=0) —を表し、 Raは低級ァ ルキル基を表す。 ) ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 二 トロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換 基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキ ニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよ い低級ァシル基または置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有して いてもよい力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数 を表す。 ）
で表される化合物である請求項 9に記載の化合物。
1 2. A「 A2— A3は一 CH (CH3) - (CH2) 3—、 -CH (CH3) — CH=CH—または一 CH (CH3) — CH=CH_CH = CH—を表し； R iは水素原子または水酸基を表し； R2は水素原子またはヒ ドロキシプロポキシ 基を表し； R3は水素原子であり ； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水素 原子、 水酸基、 ハロゲンにより置換されていてもよい低級アルキル基または低級 シクロアルキル基を表し； R7および R8は水素原子である力、 または、 R7およ び R8がー緒になって二重結合を形成する請求項 9、 1 0または 1 1に記載の化 合物。
1 3. Rおよび R， が水素原子である請求項 9〜1 2のいずれか一項に記載の 化合物。
1 4. Qが直接結合またはアルキレンを表す請求項 9〜1 3のいずれか一項に 記載の化合物。
1 5. Qがメチレンである請求項 9〜1 3のいずれか一項に記載の化合物。
1 6. Qが直接結合である請求項 9〜1 3のいずれか一項に記載の化合物。
1 7. 前記ビタミン D化合物がビタミン D 3化合物である請求項 9〜1 6のい ずれか一項に記載の化合物。
1 8. 試料中に含まれるビタミン D化合物の測定方法であって、 下記式 （1)
Figure imgf000063_0001
(式中、 Qは直接結合、 アルキレンまたは一 Wi_X— W2—を表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し； W2はアルキレンを表し； Xは _o 一、 — N (RA) C (-0) ―、 -N (RA) C ( = 0) NH—、 — OC (= O) NH—または一 N (RA) OS (=O) —を表し、 RAは低級アルキル基を 表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 ニトロ基、 シ ァノ基、 ノヽロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシ ル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有していてもよい 力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数を表す。 ） で表されるフエ口セン化合物と、 試料中のビタミン D化合物とを反応させ、 得ら れたフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物を、 液体クロマト グラフィ一/マススぺク トロメ トリー （LC/MS) により測定することを特徴 とするビタミン D化合物の測定方法。
19. 前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物が、 前 記フニ口セン化合物と前記ビタミン D化合物とが共有結合により結合した化合物 である請求項 18に記載のビタミン D化合物の測定方法。
20. 前記のフエ口セン化合物とビタミン D化合物とが結合した化合物が、 下 記式 (2)
Figure imgf000064_0001
(式中、 および A3はそれぞれ独立して置換基を有していてもよい低級アル キレン、 置換基を有していてもよい低級アルケニレンまたは置換基を有していて もよい低級アルカイ二レンを表し； A2は直接結合、 — CH = CH—、 一 C≡C ―、 一 O—、 一 S—または一 NH—を表し； は水素原子または— OR9 (R9 は水素原子または保護基を表す。 ） を表し； R2は水素原子、 水酸基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい低級アル ケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有していても よい低級アルコキシ基または置換基を有していてもよい低級ァシル基を表し； R 3は水素原子または保護基を表し； R4、 R5および R6はそれぞれ独立して水素 原子、 水酸基、 ニトロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級 アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していて もよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基 を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよい低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基、 置換基を有していてもよい力ルバモイ ル基または置換基を有していてもよいアミノ基を表し； R7および R8はそれぞ れ独立して水素原子または水酸基を表すか、 或いは、 R7および R8が一緒にな つて二重結合を形成し； Qは直接結合、 アルキレンまたは— Wi— X— W2—を 表し （ここで、 はアルキレンまたはフエ二レンを表し ； W2はアルキレンを 表し； Xは一 O—、 一 N (Ra) C (=0) ―、 一 N (Ra) C (=0) NH―、 — OC ( = 0) NH—または一 N (Ra) OS (=0) —を表し、 Raは低級ァ ルキル基を表す。 ） ； Rおよび R' はそれぞれ独立して、 水素原子、 水酸基、 二 トロ基、 シァノ基、 ハロゲン、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換 基を有していてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキ ニル基、 置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよ い低級ァシル基、 置換基を有していてもよいカルボキシ基または置換基を有して いてもよい力ルバモイル基を表し； mは 1〜3の整数を表し； nは 1〜4の整数 を表す。 ）
で表される化合物である請求項 18に記載のビタミン D化合物の測定方法。
21. 前記のフエ口セン化合物おょぴ前記のフヱロセン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物において、 Ai— A2— A3は一 CH (CH3) - (CH 2) 3—、 一 CH (CH3) ― CH = CH—または一 CH (CH3) ― CH = CH ― CH = CH—を表し； 1^は水素原子または水酸基を表し； R2は水素原子ま たはヒ ドロキシプロポキシ基を表し； R3は水素原子であり ； R4、 R5および R 6はそれぞれ独立して水素原子、 水酸基、 ハロゲンにより置換されていてもよい 低級アルキル基または低級シクロアルキル基を表し； R7および R8は水素原子 であるか、 または、 R7および R8が一緒になつて二重結合を形成する請求項 1 8、 1 9または 20に記載のビタミン D化合物の測定方法。
22. 前記のフヱロセン化合物および前記のフエ口セン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物において、 Rおよび R' が水素原子である請求項 18〜 21のいずれか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
23. 前記のフエ口セン化合物および前記のフ 口セン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物において、 Qが直接結合またはアルキレンを表す、 請求 項 18〜22のいずれか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
24. 前記のフエ口セン化合物および前記のフエ口セン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物において、 Qがメチレンである請求項 18〜22項のい ずれか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
25. 前記のフエ口セン化合物および前記のフエ口セン化合物とビタミン D化 合物とが結合した化合物において Qが直接結合である、 請求項 18〜22のいず れか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
26. 前記の試料中のビタミン D化合物がビタミン D 3化合物である、 請求項 18-25のいずれか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
27. 前記試料が生体由来の試料である請求項 18〜26のいずれか一項に記 載のビタミン D化合物の測定方法。
28. 液体クロマトグラフィー /マススぺク トロメ トリー （LCZMS) 1 液体クロマトグラフィー zエレクトロスプレーイオン化一マススぺクトロメ トリ 一/マススぺタトロメ トリー （LC/E S I— MSZMS) である請求項 18〜 27のいずれか一項に記載のビタミン D化合物の測定方法。
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