JP7316218B2 - 安定同位体標識化合物 - Google Patents
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Description
化学構造としては、ステロイド誘導体であり、天然にある主なアンドロゲンとして、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、その硫酸抱合体(DHEAS)、テストステロン(T)、及びアンドロステンジオン(A4)などがあるが、アンドロゲン作用の最も強いのはTの代謝物であるジヒドロテストステロン(DHT)である。
ステロイドホルモンの合成・分泌は視床下部-下垂体-副腎(生殖腺)系の内分泌系で調節され、副腎、精巣、及び卵巣などの器官でステロイド生合成酵素によって厳密に調節されている。
特に、内因性のアンドロゲンである11-ケトテストステロン(11-KT)は、その存在意義については不明な点が多い。近年、11-KTがユニークな性質を持っており、ヒトでも検出される。また前立腺がん等種々の疾患のバイオマーカーになる可能性が示唆されている(非特許文献1~5)。
また、内部標準物質として安定同位体標識化合物を使用する場合、前述のPROG-d9、17OHPROG-d8、T-d2、Cortisol-d4、Drospirenone、及びGestodeneは、測定対象物質との保持時間が異なるため、内因性の測定対象物質に対するマトリックス効果を十分に補正することができていなかった。
本発明の課題は、また、前処理を簡略化し得る、液体クロマトグラフィー質量分析法、特にLC-MS/MSを用いた、高選択性かつ高感度(正確)なアンドロゲンの測定方法を提供することにもある。
本発明の課題は、さらに、上記アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供することにもある。
以上の知見をもとに、本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
以下の化学構造式(I)~(III):
(前記式中、Dは重水素を示す)
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。
〔2〕
試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
〔3〕
以下の手順:
(手順1)測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順;
(手順2)前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順;
(手順3)測定すべき試料と、前記手順2で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順;
(手順4)測定すべき試料と、前記手順1で作製された測定対象標準溶液及び前記手順2で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順;及び
(手順5)前記手順3で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順4で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、前記項目〔2〕に記載の方法。
〔4〕
前記アンドロゲンが、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、11-ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンからなる群から選択される少なくとも一つである、前記項目〔2〕又は〔3〕に記載の方法。
〔5〕
前記手順1に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が0.01~20ng/mLである、前記項目〔3〕又は〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記手順2に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が10ng/mLである、前記項目〔3〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔7〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
〔8〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
〔9〕
11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
〔10〕
11-ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
〔11〕
前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程:
(工程1)以下の式(IV):
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式(I):
で表される化合物を得る工程;
(工程2)前記式(I)の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(II):
で表される化合物を得る工程;及び
(工程3)前記式(IV)の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(III):
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法(前記式中、Dは重水素を示す)。
また、本発明によれば、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症、特に前立腺がん及び去勢抵抗性前立腺がんの鑑別も可能となった。
さらに、本発明の製造方法によれば、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることで、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析において、慣用の手順、例えば、前記項目〔3〕の手順で使用することができる。
特に、高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点から、測定対象物質は、好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)、テストステロン(T)、及びジヒドロテストステロン(DHT)であり、より好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)である。
とりわけ、内部標準物質として11-KA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)が好ましく;内部標準物質として11-KT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトテストステロン(11-KT)が好ましく;内部標準物質として11-OHT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)が好ましく;内部標準物質としては11-OHA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)が好ましく;内部標準物質としてはT-d3が使用される場合は、測定対象物質はテストステロン(T)が好ましく;内部標準物質としてはDHT-d3が使用される場合は、測定対象物質はジヒドロテストステロン(DHT)が好ましい。
本発明においては、測定対象物質となるアンドロゲンは1種でもいいし、2種以上であってもよい。本発明においては、一度に、2種以上のアンドロゲンを測定することができる。また、このような際には、本発明の安定同位体標識化合物は、2種以上組み合わせて内部標準物質として使用してもよく、ならびに/あるいは他の内部標準物質、例えば、T-d3、DHT-d3、又は11-OHA4-d7と併用してもよい。
また、本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の鑑別法に使用するための鑑別用キットにも関する。
本発明は、特に、本発明の測定方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
デス・マーチン酸化は慣用の手法で行い得るが、例えば以下の方法で行ってもよい。
先ず、式(IV)の化合物:[2,2,4,6,6,16,16-D7]11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4-d7)を溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。この11-OHA4-d7溶液にデス・マーチン酸化用試薬を添加して、例えば室温にて、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(I)の化合物(11-KA4-d7)を単離する。
上記のデス・マーチン酸化用試薬は、慣用の試薬を使用してもよく、例えば、デス・マーチン過ヨウ素酸と呼ばれる1,1,1-トリアセトキシ-1,1-ジヒドロ-1,2-ベンズヨードキソール-3(1H)-オンを使用することができる。
また、上記の溶媒は、デス・マーチン酸化に慣用されるものであれば特に制限されず、例えば、有機溶媒、好ましくはジクロロメタンを使用することができる。
これらの工程で使用される超脱水溶媒は、水分含有量が0.001%(10ppm)以下まで抑えられた溶媒であれば特に制限されず、メタノール、エタノールなどのアルコール;ならびにベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素から選択された有機溶媒を超脱水したものが例示される。良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物が得られることから、超脱水メタノール及び超脱水ベンゼンが好ましく、特に原料の重水素化化合物を超脱水芳香族炭化水素、とりわけ超脱水ベンゼンに溶解させるのが好ましく、還元剤を超脱水アルコール、とりわけ超脱水メタノールに溶解させるのも好ましい。
超脱水していない溶媒としては、ピリジンが挙げられる。
すなわち、工程2は、先ず、式(I)の化合物(11-KA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-KA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-KA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約1~約10分間、好ましくは約5分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(II)の化合物(11-KT-d7)を単離する。
工程3は、先ず、式(IV)の化合物(11-OHA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-OHA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約5~約30分間、好ましくは約15分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約100分間、好ましくは約1時間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(III)の化合物(11-OHT-d7)を単離する。
実施例1 11-KA4-d7の製造
11-OHA4-d7を15mg秤取し、ジクロロメタン5mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を3mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン5mLを加えて抽出し有機層を得た。ジクロロメタン5mLの抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を窒素気流下溶媒留去し残渣を得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣10.75mgを得た(11-KA4-d7として収率71.2%)。これをNMR分析に供した。
11-OHA4-d7を40mg秤取し、ジクロロメタン10mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を6mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン6mLを加えて有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いてさらに抽出し、有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いた抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を減圧下溶媒留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣37.5mgを得た(11-KA4-d7として収率94.69%)。
このようにして得られた残渣を3mLのベンゼン(超脱水)と2mLのピリジンに溶解し11-KA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方で、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-KA4-d7溶液に5分間かけて滴下し、続けて氷冷下30分間撹拌して反応させた。反応終了後、反応液に氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、反応液の溶媒を留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下、溶媒留去し残渣37.1mgを得た(11-KA4-d7を原料とし、11-KT-d7として収率98.4%)。これをNMR分析に供した。
11-OHA4-d7の15mgを1.5mLのベンゼン(超脱水)と1mLのピリジンに溶解し11-OHA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-OHA4-d7溶液に15分間かけて滴下した。1時間氷冷下で撹拌して反応させ、反応終了後、氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をベンゼン:アセトン(3:1)のTLCで精製し、11-OHT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出させた。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下溶媒留去し残渣16.7mgを得た(11-OHT-d7として収率110.6%)。これをNMR分析に供した。
実施例1~3で製造された化合物について、1H-NMR及び13C-NMR測定ならびに精密質量測定を行った。その結果を以下の表に示す。
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(CDN ISOTOPES製)、DHT-d3(CDN ISOTOPES製)、及び11-OHA4-d7(CDN ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~20ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を10ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
ヒト血漿として、KAC(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各3検体)を等量混合したプール血漿を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は特級又はHPLC用規格品もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
アセトニトリル50μL、測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及びアセトニトリル50μLを加えて測定対象物質濃度測定用試料(測定対象物質濃度QC、n=3)を調製した。
また、ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及び測定対象標準溶液50μLを加えて添加回収試験用試料(低濃度QC:0.1ng/mL及び中濃度QC:1ng/mL、高濃度QC:10ng/mL、各n=3)を調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌したのち毎分12,000回転で2分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
制御コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (J3LPQ02 DELL)
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (3XKPQ02 DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
検量線用標準試料の添加濃度に対する真度は以下の式から算出した。
添加濃度に対する真度(%)=検量線用標準試料の逆回帰濃度/添加濃度×100
精度は以下の式から算出した。
精度(%)=標準偏差/平均値×100
添加回収試験における理論値及び真度は以下の式から算出した。
理論値(ng/mL)=測定対象物質濃度の平均値+添加濃度
真度(%)=平均値/理論値×100
実施例1~3で製造された安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いて測定した結果を以下の表11~14に示す。
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(Sigma-Aldrich製)、DHT-d3(Sigma-Aldrich製)、及び11-OHA4-d7(C/D/N ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~100ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を2ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
健常ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各6検体)を使用した。
患者由来ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(ProteoGenex)より購入した、前立腺肥大症患者(男性6検体)、前立腺がん患者(男性6検体)、去勢抵抗性前立腺がん患者(男性2検体)、多嚢胞性卵胞症候群患者(女性6検体)、糖尿病患者(男性5検体)、及び糖尿病性腎症患者(男性7検体)を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は、特級、又はHPLC用規格、分子生物学用規格、もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
前記の0.01~100ng/mLの濃度で調製した各測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
健常ヒト血漿及び患者由来ヒト血漿50μLにアセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLを添加して調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌した後、4℃、毎分13,000回転で5分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
(a) アンドロゲン濃度の算出
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
(b) 検量線及び定量下限の評価
作成した検量線(各濃度n=1)の判断基準は、個々の検量線用標準試料の真度が定量下限において80.0~120.0%、それ以外で85.0~115.0%である試料が、全検量線用標準試料の3/4以上、定量下限及び上限を含む試料とした。
検討した測定対象の検量線は良好な直線性を示し、また、定量下限は、T、DHT、11-OHT、11-KA4、及び11-KTが0.01ng/mL、11-OHA4が0.02ng/mL、11-KDHTが0.1ng/mLだった(表18)。
ISに各測定対象の安定同位体標識体を使用した場合、ISにT-d3を使用した場合と比較して、前記項目「2.アンドロゲンの測定(1)」と同様に、精度及び真度の改善がみられた(但し、11-KDHTは安定同位体標識体がないため、11-KT-d7をISに使用して解析した)。血漿中アンドロゲン濃度を、各測定対象の安定同位体標識体をISに使用して求めた。
血漿中アンドロゲン濃度の平均値及び標準偏差は、Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation)により算出し、以下の表19に表示した。個体別値に定量下限未満(Lower limit of quantification, LLOQ)を含む場合は、以下のように平均値及び標準偏差を算出又は表示した。
・半数例未満がLLOQの場合には、LLOQを0として平均値のみを算出した。
・半数例以上がLLOQの場合には、平均値及び標準偏差を算出せずNC(not calculated)として表示した。
BPH、PCa、及びCRPC患者の血漿中11-KT濃度は健常男性の1.6~2.1倍高かった。PCOS患者の血漿中T及び11-KT濃度はそれぞれ健常女性の2.0倍及び1.8倍高く、PCOSのアンドロゲン過剰症状を反映した結果が得られた。DM及びDMN男性患者の血漿中T濃度は健常男性と比較して低値を示した。
以上の結果から、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が上昇しており、これらの疾患のバイオマーカーとして11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が利用できる可能性が示唆された。特に、11-KA4がバイオマーカーとして有効であり、とりわけ、CRPC(去勢抵抗性前立腺癌)とPCa(前立腺癌)を差別化することが可能と考えられた。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生、食品検査等の分野で利用できる。
Claims (9)
- 以下の化学構造式(I)~(III):
(前記式中、Dは重水素を示す)
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。 - 試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、請求項1に記載の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
- 以下の手順:
(手順1)測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順;
(手順2)請求項1に記載の安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順;
(手順3)測定すべき試料と、前記手順2で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順;
(手順4)測定すべき試料と、前記手順1で作製された測定対象標準溶液及び前記手順2で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順;及び
(手順5)前記手順3で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順4で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記手順1に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が0.01~20ng/mLである、請求項3に記載の方法。
- 前記手順2に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が10ng/mLである、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記アンドロゲンが、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、11-ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、及びジヒドロテストステロンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、及び11β-ヒドロキシテストステロンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法(但し、医師によるヒトを診断する行為を除く)。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法(但し、医師によるヒトを診断する行為を除く)。
- 請求項1に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程:
(工程1)以下の式(IV):
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式(I):
で表される化合物を得る工程;
(工程2)前記式(I)の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(II):
で表される化合物を得る工程;及び
(工程3)前記式(IV)の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(III):
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法(前記式中、Dは重水素を示す)。
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