CN113061070A - 一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，其结构式如式II所示，以化合物I为原料，在氘标记的溶剂即氘源中，在碱的存在下，在适宜的温度下，进行H‑D交换反应得到。本发明所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，对天然丰度美替诺龙结构中的1位甲基‑H、羰基α位的2位烯键H和4位亚甲基H进行了氘置换，与美替诺龙相差6个质量数，质谱响应数据有明显的区别，完全满足同位素稀释质谱法所需内标物的物性要求，其制备方法工艺设计合理，实验过程可控，操作简便，制备得到的目标产物纯度高，收率达到90.0％左右，且最终产物的同位素丰度达到93.5％‑95.0％左右，重现性较好，可为食品安全检测行业提供标准样品。

Description

一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物
技术领域
本发明属于药物合成领域，尤其是涉及一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物。
背景技术
美替诺龙(Methenolone)，中文名17β-羟基-1-甲基-5α-雄甾-1-烯-3-酮，是一种温和的合成代谢类固醇，具有极低的雄激素生成作用。可以用来让人体在低碳水的情况下保持肌肉饱满度和合成代谢能力，还可以提高人的免疫能力。由于它对人的肝脏任何副作用小，而且很少引发高血压症状，被认为是“所有类固醇中最安全的”。具有极大的治疗价值。在临床上长会用作蛋白同化制剂，服用或者误服将会对运动员的成绩造成较大影响。
世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency，WADA)在《2013年违禁物质名单》中已将包括美替诺龙、美曲勃龙、诺龙、美睾酮、去氢甲睾酮、氟氢甲睾酮、康力龙、康复龙等78种合成类固醇药物列为违禁药品。近年来在兴奋剂检查中频繁发生运动员美替诺龙等合成类固醇阳性事件。因此，有效的检测手段运用于各种食材的检测以及人体的检测，显得尤为重要。
日前，关于美替诺龙的检测方法主要有HPLC-UV法、LC-MS法和GC-MS法等。尽管GC-MS方法相较于前两者灵敏度较高、通用性较强，广泛应用于运动员的血样、尿样以及各类保健品和食品的分析中，但是其灵敏度还是有一定的局限性，对违禁品浓度有一定的要求，当浓度低于检测阈值时，就无法满足要求，而同位素稀释质谱法(Isotope Dilution MassSpectrometry,IDMS)很好的解决了这一问题。同位素稀释质谱法采用稳定性同位素标记化合物作为内标试剂，很好地结合了色谱的分离能力和质谱的定性能力，具有检测限低，不受基质干扰等优点，己被定为国际上食品安全检测最权威的仲裁检测方法，并被美国、欧盟、日本等发达国家列为相关检验标准，IDMS是一种可用于微量、痕量和超痕量元素权威的测量方法。另外，稳定同位素标记试剂作为内标试剂应用于同位素稀释质谱法时，一般要求有至少3个质量数的差异。
当前，专利(DE1135900、DE1122947)及文献(张沪跃，复旦学报(医学版)，2002)等对美替诺龙及其衍生物的合成方法均有报道，天然丰度的美替诺龙已经实现了工业化生产。但关于其同位素标记化合物的文献报道相对较少，其中文献(Von H.Breuer，DeutscheMedizinische Wochenschrift，1962)中报道了美替诺龙醋酸酯-14C1的合成，该反应中使用了昂贵的重氮甲烷-14C1,不仅成本高，具有危险性，而且相对分子质量与自然丰度的美替诺龙相差不大，无法满足内标试剂的要求。此外，文献(Paul-E.Schulze，ChemischeBerichte,1968)也报道了美替诺龙-T1的合成。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，以为更准确的定量检测美替诺龙的痕量残留提供标准试剂。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，所述化合物的结构式如式II所示：
Figure BDA0002997744350000021
如上述所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，包括以下步骤：
a.将化合物I与碱在含氘溶剂中混合均匀，进行H-D交换反应，得到反应液，所述化合物I的结构式如式I所示：
Figure BDA0002997744350000031
优选的，所述H-D交换反应温度为20-60℃，反应时间为12-72h；优选的，所述H-D交换反应温度为25℃，反应时间为48h。
优选的，所述化合物I与碱的摩尔比为1：(1-20)；优选的，所述化合物I与碱的摩尔比为1：3。
优选的，所述碱为甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氘氧化纳中的一种；优选的，所述碱为甲醇钠。
优选的，所述含氘溶剂与化合物I的摩尔比为1:(20-200)；优选的，所述含氘溶剂与化合物I的摩尔比为1:100。
优选的，所述含氘溶剂为氘标记溶剂或氘标记溶剂与非标记溶剂的混合溶剂，所述氘标记溶剂为重水(D2O)、氘代甲醇(CD3OD)、(CH3OD)、氘代乙醇(CH3CH2OD)、氘代乙醇(CD3CD2OD)等具有活泼D的氘标记溶剂中的一种或多种的混合溶剂，所述非标记溶剂为四氢呋喃或乙腈；优选的，所述含氘溶剂为氘代甲醇。
优选的，还包括以下步骤：
b.将步骤a得到的反应液用氘盐酸淬灭至pH＝6，萃取剂萃取2-3次，合并有机相，干燥，过滤，减压浓缩得到产物。
优选的，所述萃取剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸中的一种或多种的混合物。
优选的，还包括以下步骤：
c.将步骤b中得到的产物替代步骤a中的化合物I重复步骤a-b，重复次数为2-5次；优选的，重复次数为3次。
相对于现有技术，本发明所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物具有以下优势：
(1)本发明所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，即美替诺龙-D6，对天然丰度美替诺龙结构中的1位甲基-H、羰基α位的2位烯键H和4位亚甲基H进行了氘置换，所得化合物与美替诺龙相差6个质量数，质谱响应数据有明显的区别，完全满足同位素稀释质谱法所需内标物的物性要求；
(2)本发明所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法通过常规化学反应，仅通过1步H-D交换反应即可得到目标产物，工艺设计合理，实验过程可控，操作简便，制备得到的目标产物纯度高，达到98％以上，收率达到90.0％左右，且最终产物的同位素丰度达到93.5％-95.0％左右，重现性较好，本发明制备的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物可为食品安全检测行业提供标准样品。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所述的反应原理示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明，如图1所示，以化合物I为原料，在含氘溶剂即氘源中，在碱的存在下，在适宜的温度下，进行H-D交换反应，得到具有一定氘丰度的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，重复该过程一定次数，最终得到较高同位素丰度的目标化合物。
实施例1
将原料化合物I(1.0g)溶于13mL的氘代甲醇(CH3OD)中，氮气保护，于室温下加入甲醇钠(0.5g,3eq)，加毕，在此温度下反应48小时左右。反应混合物用30％的氘盐酸(DCl)淬灭，监测体系至pH＝6，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有机相，干燥、过滤，减压浓缩得到产品，重复上述过程3次，再经过正相纯化得到目标化合物(0.92g)，收率90％，HPLC检测，化学纯度99.3％，MS检测，同位素丰度94.7％。
实施例2
将原料化合物I(1.5g)溶于10mL的四氢呋喃和10mL的重水(D2O)中，氮气保护，于室温下加入碳酸钾(2.1g,3eq)，加毕，在此温度下反应48小时左右。反应混合物用30％的氘盐酸淬灭，至pH＝6，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并有机相，干燥、过滤，减压浓缩后得到粗产品，重复上述过程3次，再经过正相纯化得到目标化合物(1.4g)，收率92％，HPLC检测，化学纯度99.6％，MS检测，同位素丰度93.0％。
实施例3
将原料化合物I(1.2g)溶于10mL的四氢呋喃和10mL的重水(D2O)中，氮气保护，于室温下加入氢氧化纳(1.6g,10eq)，加毕，在此温度下反应48小时左右。反应混合物用30％的氘代盐酸淬灭，至pH＝6，用乙酸萃取2-3次，合并有机相，干燥、过滤，减压浓缩后得到粗产品，重复上述过程3次，正相纯化得到目标化合物(1.1g)，收率91.0％，HPLC检测，纯度99.1％，MS检测，同位素丰度92.5％。
实施例4
将原料化合物I(1.4g)溶于20mL的氘代甲醇(CH3OD)中，氮气保护，于室温下加入叔丁醇钾(1.6g,3eq)，加毕，在此温度下反应48小时左右。反应混合物用30％的氘盐酸淬灭，至pH＝6，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有机相，干燥、过滤，减压浓缩后得到粗产品，重复上述过程3次，再经过正相纯化得到目标化合物(1.4g)，收率96％，HPLC检测，纯度99.6％，MS检测，同位素丰度94.0％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物，其特征在于：所述化合物的结构式如式II所示：
Figure FDA0002997744340000011
2.如权利要求1所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将化合物I与碱在含氘溶剂中混合均匀，进行H-D交换反应，得到反应液，所述化合物I的结构式如式I所示：
Figure FDA0002997744340000012
3.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述H-D交换反应温度为20-60℃，反应时间为12-72h；优选的，所述H-D交换反应温度为25℃，反应时间为48h。
4.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述化合物I与碱的摩尔比为1：(1-20)；优选的，所述化合物I与碱的摩尔比为1：3。
5.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述碱为甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氘氧化纳中的一种；优选的，所述碱为甲醇钠。
6.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述含氘溶剂与化合物I的摩尔比为1:(20-200)；优选的，所述含氘溶剂与化合物I的摩尔比为1:100。
7.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述含氘溶剂为氘标记溶剂或氘标记溶剂与非标记溶剂的混合溶剂，所述氘标记溶剂为重水、氘代甲醇、氘代甲醇、氘代乙醇、氘代乙醇中的一种或多种的混合溶剂，所述非标记溶剂为四氢呋喃或乙腈；优选的，所述含氘溶剂为氘代甲醇。
8.根据权利要求2所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
b.将步骤a得到的反应液用氘盐酸淬灭至pH＝6，萃取剂萃取2-3次，合并有机相，干燥，过滤，减压浓缩得到产物。
9.根据权利要求8所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于：所述萃取剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸中的一种或多种的混合物。
10.根据权利要求8所述的氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
c.将步骤b中得到的产物替代步骤a中的化合物I重复步骤a-b，重复次数为2-5次；优选的，重复次数为3次。
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