JP7083799B2 - 標準較正液 - Google Patents
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Description
水と、
前記水と混和する非アルコール性溶媒と、
ステロイドホルモンと、
を含み、
前記非アルコール性溶媒の含有量が、10体積%以上50体積%以下であり、
質量分析装置を用いた定量測定に用いられる。
本実施形態の標準較正液は、水と、水と混和する非アルコール性溶媒と、ステロイドホルモンと、を含む。そして、非アルコール性溶媒の含有量が、標準較正液の全量を100体積%とした場合に、10体積%以上50体積%以下である。本実施形態の標準較正液は、質量分析装置を用いた定量測定に用いられ、質量分析用の「キャリブレーター」として用いることができる。以下、本実施形態の標準較正液の成分、用途について順次説明する。
本実施形態に係る標準較正液は、水を含む。水としては、例えば、イオン交換水、限外濾過水、逆浸透水、ミリQ水等を用いることができるが、不純物が極力少ないことが好ましく、例えば、分析実験用水や、バイオメディカル用水、等の規格を満たすものが好ましい。
以上90体積%以下程度であれば、多様なステロイドホルモンを溶解できる。
本実施形態に係る標準較正液は、非アルコール性溶媒を含む。非アルコール性溶媒は、アルコール性水酸基を有しない化合物である。非アルコール性溶媒は、上述の水と任意の割合で混和する。すなわち、非アルコール性溶媒は、水と互いに任意の濃度で完全に溶解し、均一な溶液を構成できる。
本実施形態の標準較正液は、ステロイドホルモンを含む。ステロイドホルモンとしては、アルドステロン(鉱質コルチコイド)、テストステロン、コルチゾール(ヒドロコルチゾン)、コルチゾン、プロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロン、プレドニゾン、アンドロステンジオン、糖質コルチコイド、アンドロゲン(男性ホルモン)、エストロゲン、黄体ホルモン等の副腎皮質ホルモンや性ホルモン、及び、ビタミンD、並びに、その代謝物、誘導体、及び、同位体標識物を挙げることができる。
分泌、免疫反応等に関与するタンパク質の発現制御に重要な役割を果たしている。このため、化学構造的にはステロールであっても、作用機構および機能の観点により、本明細書では、ビタミンD、ビタミンDの誘導体、ビタミンDの代謝物、及び、ビタミンDの同位体標識物は、ステロイドホルモンとみなす。
本実施形態の標準較正液は、質量分析装置を用いた定量測定に用いられる。
体と同じ媒体に溶解された較正物質の溶液(生物製剤)か、含水エタノール、含水メタノール等の人工的な媒体に溶解された較正物質の溶液が用いられてきた。
本実施形態の標準較正液によれば、血清などの生物由来の媒体を用いた較正液に比べ、生産ロット間の差を小さくすることができ、安定した品質を保つことができ、質量分析装置の較正を容易かつ再現性良く行うことができる。また、本実施形態の標準較正液は、非アルコール性溶媒を含むので、エタノールやメタノールなどのアルコール性溶媒に比べて逆相系シリカカラムに対する溶出力が緩やかであり、溶媒置換をせずにそのままLC/MSやLC/MS/MSに導入することができる。
以下、本発明を実験例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実験例に限定されるものではない。以下、溶媒に関する「%」は、特に記載のない限り、体積基準である。なお評価は、特に断りが無い場合は、温度25℃、相対湿度40%の環境下で行った。
標準較正液を調製する際に、溶媒(マトリクス)の違いが検量線に影響するかを以下の
実験により検証した。
以下に示すa)~c)の溶媒を準備した。
a) MSG1000(Golden West Diagonistics社より入手)Vitamin D Free血清
b) 30%アセトニトリル水溶液
c) プール血清(千葉大学医学部附属病院 健常人ボランティアより入手)
(1)表1に記載のキャリブレーター濃度となるように、表1に示すステロイドホルモン(ビタミンDの代謝物)の標品を、上記溶媒のそれぞれに溶解させて各キャリブレーターを調製した。
・25(OH)D3-13C5
・3-epi-25(OH)D3-13C5
・25(OH)D2-13C3
・24,25(OH)2D3-d6
(3)前処理で得られた抽出液を窒素下で乾固後、4-(4’-ジメチルアミノフェニル)-1,2,4-トリアゾリン-3,5-ジオン(DAPTAD)を加え、60分間、室温で反応させた。
(4)エタノールを加え、反応停止後、窒素下で乾固した。
(5)30%アセトニトリル溶液で再溶解し、LC/MS分析用試料とした。
(6)得られた試料をLC/MS/MS(Xevo TQ-XS,Waters)に注入し、表2に記載のMRM(多重反応モニタリング)パラメーターを用いて定量分析を行った。図1にはビタミンD代謝物のMRMクロマトグラムを示した。
(7)検量線は、キャリブレーターにおける内部標準物質及び測定対象化合物のピークエリア比を用いて作成した。
上記で得られた検量線を図2~図5に示した。図2~図5をみると、4種のビタミンD代謝物において、溶媒の違いによる検量線への影響(傾きの変化)は認められなかった。
プール血清に標品を添加し、添加回収試験を行った。キャリブレーターの溶媒として、MSG1000及び30%アセトニトリル水溶液を使用した2通りで検量線を作成し、キャリブレーター溶媒の違いにおける定量値への影響を検証した。表3~表6にその結果を記載した。
臨床検体(32例)の血清中のビタミンD代謝物をキャリブレーター溶媒(MSG1000及び30%アセトニトリル水溶液)の異なる2通りの検量線により定量分析した。図6~図9は、2通りの検量線により得られた臨床検体の定量分析値の相関を示すグラフである。図6~図9に示されるように、2通りの検量線から得られた定量値の相関を確認したところ、良好な相関と定量値の一致が認められた。
図10は、テストステロン(男性ホルモン)を用いて作成した、定量分析のための検量線である。テストステロンの定量分析においても、ビタミンD代謝物と同様に、血清ベースの溶媒の標準較正液を用いた場合と、30%アセトニトリル水溶液の標準較正液を用いた場合とで、良い一致を示すことが判明した。
図11は、25(OH)D3の内部標準物質(IS)に対する回収率の、アセトニトリル濃度に対する依存性を示すグラフである。溶媒中のアセトニトリル濃度が10%以上であれば回収率が良好であり、20%を超えると回収率がより一段と良好となることが分かった。また、LCへの導入において、移動相よりも有機溶媒の濃度が高いと、分離に悪影響を及ぼす観点から、溶媒中のアセトニトリルの濃度は50%以下が望ましいと考えられる。
上記実験の結果、以下のことが判明した。
・30%アセトニトリル水溶液ベースのキャリブレーターは血清ベースのキャリブレーターと非常に良い一致を示した。そのため、血清とほぼ同じマトリックス効果を持つことがわかった。すなわち質量分析用キャリブレーター媒体としての性能を十分有していることが示された。
・30%アセトニトリル水溶液では、水が70%存在するので保存時における溶媒の揮発による濃度の影響も100%有機溶媒とした場合に比べて抑制できることが期待され、保存安定性に優れていると考えられる。
Claims (6)
- 水と、
前記水と混和する非アルコール性溶媒と、
ビタミンD及びビタミンDの代謝物から選択される少なくとも1種と、
を含み、
前記非アルコール性溶媒の含有量が、10体積%以上50体積%以下であり、
質量分析装置を用いた、血清又は血漿中のビタミンD又はビタミンDの代謝物の定量測定に用いられる、検量線作成用標準較正液。 - 請求項1において、
前記非アルコール性溶媒は、シアノ基、カルボニル基、エーテル基及びスルフィニル基から選択される少なくとも1つの基を有する炭素数5以下の化合物を含む、標準較正液。 - 請求項1又は請求項2において、
前記非アルコール性溶媒は、シアノ基を有する炭素数3以下の化合物である、標準較正液。 - 請求項1ないし請求項3のいずれか1項において、
前記非アルコール性溶媒は、アセトニトリルである、標準較正液。 - 請求項1ないし請求項4のいずれか1項において、
前記非アルコール性溶媒の含有量が、20体積%以上50体積%以下である、標準較正液。 - 請求項1ないし請求項5のいずれか1項において、
前記非アルコール性溶媒の含有量が、20体積%以上40体積%以下である、標準較正液。
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HAUSER, B. et al. ,Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of 23 endogenous steroids in small quantities of primate urine,Journal of Chromatography B,2008年,862,100-112,sciencedirect.com/science/article/abs/pill/S157002320700774X |
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