CN108027353A - 固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒 - Google Patents

固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108027353A
CN108027353A CN201680019469.7A CN201680019469A CN108027353A CN 108027353 A CN108027353 A CN 108027353A CN 201680019469 A CN201680019469 A CN 201680019469A CN 108027353 A CN108027353 A CN 108027353A
Authority
CN
China
Prior art keywords
analyte
sample
reagent
derivative
cannboid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680019469.7A
Other languages
English (en)
Inventor
黄琦
菲利浦·迪姆逊
E·L·马洛莱斯钱科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Emperor Ken Sample Preparation Of Ltd By Share Ltd
Original Assignee
Emperor Ken Sample Preparation Of Ltd By Share Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emperor Ken Sample Preparation Of Ltd By Share Ltd filed Critical Emperor Ken Sample Preparation Of Ltd By Share Ltd
Publication of CN108027353A publication Critical patent/CN108027353A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/948—Sedatives, e.g. cannabinoids, barbiturates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及用于固相萃取、用含冠醚的衍生试剂进行衍生化、以及衍生化分析物的质谱的方法、试剂和试剂盒。

Description

固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒
优先权
本申请依据35 U.S.C.§119要求优先权，并且有权要求于2015年03月28日提交的美国临时申请系列第62/139,692号的权益，其内容通过引用全文纳入本文。
介绍
需要获得快速、精简且自动检测特定分析物的方法。在医学环境中，这样的方法将促进分析物的检测，诸如药物、激素、信号剂(signaling agents)和氨基酸。在农业和公众健康的情况下，抗生素、杀虫剂或其它污染物的残留水平的检测融入了我们食用食物和饮用水的安全性中。此外，近来食品标签标准的变化，例如“无激素”或“有机”，导致了农业领域中简化测试的需要。
在许多情况下，经由放射免疫分析(RIA)来对特定分析物进行临床定量。近年来，由于质谱领域的技术进步，测试平台从RIA逐渐转移至液相色谱质谱(LCMS)。通常，基于LCMS的分析可提供快速、灵敏、分析物特异性读数，这些是RIA分析可能缺少的。然而，由于多种原因，特定分析物可能难以检测。例如，某些分析物难以测定，因为它们易于氧化并降解。此外，特定分析物定量的现有技术通常涉及萃取回收率不稳定的复杂且繁琐的萃取工艺。例如，不稳定的萃取回收率导致结果往往是不可靠的，并且具有高的定量下限(LLOQ)；例如LLOQ在＞10ng/mL的范围内。而且，现有的萃取工艺不能提供用于衍生化的可靠样品。
药物包括非法药物和合法药物、及其代谢物或衍生物。检测这些化合物对于法庭或处方依从性是非常重要的。此外，这些药物可能在体液中不稳定，因此检测可能是困难的。在任何情况下，非常需要一种完全自动化和简化的检测/定量方法，该方法能使人为介入或误差的空间最小化。
发明内容
本发明文件提供了能够用于测试可单酰化、含单胺、或含单酚的分析物水平的材料和方法。例如，感兴趣的分析物包括：在生物样品中的神经递质、激素、雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇)、大麻素如△-9-四氢大麻酚(THC)和HU210、5-羟色胺、氨基酸、BPA以及生物样品中许多其它含伯胺的分子、或者含酚的分子。
本发明文件还提供了能够用于测定含顺式二烯的分析物(如维生素D)、其类似物以及代谢物(例如，25-OH D3、25-OH D2、24,25-(OH)2D3、1,25-(OH)2 D3、1,25-(OH)2D2)的材料和方法。
本发明文件还提供了能够用于衍生并测试含有酮、或醛的分析物(例如、睾酮、孕酮、皮质酮、和许多类固醇激素)的材料和方法。
所需分析物可以通过质谱(包括串联质谱技术)选择性地、灵敏地检测和测量。如本文所述，整个定量过程包括样品制备过程，所述样品制备过程采用固相萃取以捕获分析物，然后进行分析物的化学衍生化，然后通过LC-MS/MS技术定量。
在该工作期间发现，固相萃取与用含冠醚试剂化学衍生化及LC-MS/MS的组合提供血浆/血清样品中pg/ml、fg/ml或更低、以及用于口腔液分析物检测的fg/ml范围的分析物水平的分析物特异、灵敏、准确、稳定且坚定的测定。用于此的定量方法也开发成具有相似的灵敏度和精确度。
敏感和准确测量这些分析物在临床设定相关的水平是有用的，特别是在毫微微克/毫升或低皮克/毫升的范围内，在小样本大小(100μl或更少的血浆/血清样品)，用简单的方法可以容易地构成为自动的、具有分析物特异性结果，而不需要在其它分析技术、例如放射免疫测定法(RIA)中常见的任何分析物交叉。
附图简要说明
图1证明了具有冠醚成分(即，灵敏度助推剂(sensitivity booster))(101)的衍生试剂(100)，所述冠醚成分连接到接头(即，连接物)(102)，进而结合分析物(衍生官能团)(103)。
图2A和2B证明了根据本方法测试的THC和HU210刺激的样品的线性回归。图2A提供了THC的线性回归，并且图2B提供了HU210的线性回归。
图3A和3B证明了根据本方法测试的雌酮和雌二醇样品的线性回归、及其色谱图。图3A提供了线性回归，并且图3B提供了色谱图。
图4A和4B证明了根据本方法测试的雌酮和雌二醇样品的色谱图、从10个个体获得的样品中雌二醇/雌酮的量。图4A提供色谱图，并且，图4B提供各样品中水平的图。
详述
本发明的方法涉及萃取、衍生化、检测和/或定量来自样品的分析物的方法。本发明的方法采用通过固相萃取(SPE)、使用冠醚的化学衍生过程结合检测或定量感兴趣的分析物的样品清理(clean-up)过程以获得分析物特异性、坚定、快速、灵敏和准确的结果。感兴趣的分析物的衍生化将分析物从可能潜在地与样品中发现的其它生物试剂重叠的区域转移出去，通过容易地捕获所检测阳离子来提高分析物的灵敏度，并使得亲脂分析物更亲水，并且由此能够进行分析。因此，在检测过程中，通常会妨碍准确定量检测感兴趣的分析物的其它生物分子或污染物是在显著不同的光谱范围内检测(或者完全洗脱)，使得能够精确定量感兴趣的分析物。此外，衍生的分析物的检测通过检测所捕获阳离子敏化。最终，由于冠醚独特的疏水/亲水结构，通过该技术可以分析难以分解的亲脂结构。这种分析物检测，例如在临床、兽医、法医和/或环境设定中是有用的。
本发明的方法可包括感兴趣分析物的衍生化以及通过色谱和/或质谱中至少一种确定一种或多种分析物的量。在一个实施方式中，本发明的方法还包括从生物样品固相萃取(SPE)分析物。在一个方面中，推荐使用基于阳离子交换的SPE来俘获含有胺的分析物。对于不含胺的分析物，基于反相的SPE可以与包括或不包括磷脂除去过程的蛋白碰撞一起使用，该吸附剂可以是C4-C18烷基结合的二氧化硅、或者苯基结合的二氧化硅、联苯基结合的二氧化硅、或者其它聚合物吸附剂。在其它实施方式中，可使用具有高pH(8≤pH≤14)的最终洗脱缓冲液从阳离子交换固相洗脱含胺分析物，任选地对感兴趣的含胺分析物进行原位衍生化，干净地制备用于检测和/或定量的分析物的衍生物。
在另外的实施方式中，不含胺的分析物可通过非醇、水易混溶的有机溶剂(例如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等)从SPE吸附剂洗脱下来，然后在pH缓冲条件下将分析物直接衍生化。在优选的实施方式中，用于检测含胺分析物的本发明方法包括阳离子交换SPE、用冠醚原位衍生化、以及随后通过感兴趣分析物的LC-MS定量；使得生物样品在线(inline)转变到初步分析物萃取以检测和/或定量。类似地，对于检测不含胺的分析物的优选实施方式，本发明的方法包括基于反相的SPE，有机洗脱，随后用冠醚直接衍生化，然后通过LC-MS/MS定量。或者，在另一实施方式中，可使用基于阴离子交换的SPE检测具有羧基官能团的分析物，高pH洗脱缓冲液与合适有机溶剂(如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等)混合、随后将分析物直接衍生化。
还存在用于检测和/或定量分析物的试剂盒。这些试剂盒可包括SPE柱(筒)和冠醚衍生化反应试剂。任选地，这种试剂盒可还包括SPE调节溶剂、加载缓冲液(loadingbuffer)、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，单独或者一起，以及HPLC柱。
本发明方法可检测多种分析物的存在。分析物是感兴趣样品中发现的任何感兴趣的化合物或组合物。更具体说，感兴趣的分析物是具有伯胺和/或仲胺基团的化合物、或是可单酰化的化合物、单胺化合物、和/或酚部分(moiety)。优选存在单酰化、或胺。感兴趣的分析物可以具有肼基团、酰肼基团、或羟胺基团。本文所述的分析物可以是药物(非法的和FDA批准的)及其衍生物或代谢物、杀虫剂及其衍生物或代谢物、环境污染物及其衍生物或代谢物、或生物化合物(如激素、细胞因子、信号剂、氨基酸、胆固醇或其衍生物之一、脂肪酸或糖脂)以及它们的衍生物或代谢物。
在一个实施方式中，分析物是维生素D、其类似物和代谢物(例如，在此处所述而并非限制的部分成员包括：25-OH维生素D3、25-OH维生素D2、24,25-(OH)2维生素D3、1,25-(OH)2维生素D3和1,25-(OH)2维生素D2，胆钙化醇，25-羟基胆钙化醇，1α,25-二羟基胆钙化醇，麦角钙化醇，1α,25-二羟基麦角钙化醇，22,23-双氢麦角钙化醇，1α,24R,25-三羟基胆钙化醇，(6Z)-他沙洛尔(tacalciol)，速甾醇3，异维生素D3，二氢速甾醇3，骨化三醇(calcitrol)，钙泊三醇等)。
在一个实施方式中，分析物是单胺神经递质或其衍生物或代谢物之一。
在另一实施方式中，分析物是雌激素，包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌四醇(E4)。
在另一实施方式中，分析物是植物雌激素，包括大豆黄素、芒柄花素、染料木黄酮、鸡豆黄素A、拟雌内酯、4'-甲氧基拟雌内酯、瑞索(repensol)、川服灵(trifoliol)或17-β-雌二醇。
在另一实施方式中，分析物是大麻素或其衍生物或代谢物之一。大麻素或其衍生物或代谢物的例子包括：大麻萜酚型(CBG)大麻素，例如大麻萜酚、大麻萜酚单甲醚、大麻酚酸A(Cannabinerolic acid A)、次大麻萜酚(Cannabigerovarin)、大麻萜酚酸A、大麻萜酚酸A单甲醚、和次大麻萜酚酸A(Cannabigerovarinic acid A)；大麻环萜酚型(CBC)大麻素，例如，(±)-大麻环萜酚、(±)-大麻色酸A、(±)-次大麻色烯、(±)-次大麻色酚(Cannabichromevarin)、或(±)-次大麻色酚酸A；大麻二酚型(CBD)大麻素，例如，(-)-大麻二酚、大麻二酚单甲醚、大麻二酚-C4、(-)-次大麻二酚、大麻二苔黑酚(Cannabidiorcol)、大麻二酚酸、次大麻二酚酸；大麻联苯二酚型(CBND)大麻素，例如，大麻联苯二酚或次大麻联苯二酚；四氢大麻酚型大麻素(THC)，例如，Δ9-四氢大麻酚、Δ9-四氢大麻酚-C4、Δ9-四氢次大麻酚、Δ9-四氢大麻苔黑酚(Tetrahydrocannabiorcol)、Δ9-四氢大麻酚酸A、Δ9-四氢大麻酚酸B、Δ9-四氢大麻酚酸-C4A、Δ9-四氢大麻酚酸-C4B、Δ9-四氢大次麻酚酸A、Δ9-四氢大麻苔黑酚酸(Tetrahydro-cannabiorcolic acid)A、Δ9-四氢四氢大麻苔黑酚酸B、(-)-Δ8-反式-(6aR,10aR)-Δ8-四氢大麻酚、(-)-Δ8-反式-(6aR,10aR)-四氢大麻酚酸A、(-)-(6aS,10aR)-Δ9-四氢大麻酚；大麻酚型(CBN)大麻素，例如，大麻酚、大麻酚-C4、次大麻酚、大麻酚-C2、大麻苔黑酚(Cannabiorcol)、大麻酚酸A、大麻酚单甲醚；大麻三醇型(CBT)大麻素，例如，(-)-(9R,10R)-反式-大麻三醇、(+)-(9S,10S)-大麻三醇、(±)-(9R,10S/9S,10R)-大麻三醇、(-)-(9R,10R)-反式-10-O-乙基-大麻三醇、(±)-(9R,10R/9S,10S)-大麻三醇-C3、8,9-二羟基-Δ6a(10a)-四氢大麻酚、大麻二酚酸A大麻三醇酯、(-)-(6aR,9S,10S,10aR)-9,10-二羟基-六氢大麻醇、(-)-6a,7,10a-三羟基-Δ9-四氢大麻酚、10-氧代-Δ6a(10a)-四氢大麻酚；六氢次大麻呋酚(Cannabielsoin)型(CBE)大麻素，例如，(5aS,6S,9R,9aR)-六氢次大麻呋酚、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-六氢次大麻呋酚、(5aS,6S,9R,9aR)-六氢次大麻呋酚酸A、(5aS,6S,9R,9aR)-六氢次大麻呋酚酸B、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-六氢次大麻呋酚酸B、大麻环醚萜酚-C3、脱氢大麻呋喃(Dehydrocannabifuran)、或大麻呋喃(Cannabifuran)；异大麻素，例如，(-)-Δ7-反式-(1R,3R,6R)-异四氢大麻酚、(±)-Δ7-1,2-顺式-(1R,3R,6S/1S,3S,6R)-异四氢次大麻酚、或(-)-Δ7-反式-(1R,3R,6R)-异四氢次大麻酚；大麻环酚型(CBL)大麻素，例如，(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-大麻环酚、(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-大麻环酚酸A、或(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-次大麻环酚；大麻二吡喃环烷型(CBT)大麻素，例如，大麻二吡喃环烷；或大麻色满酮型(CBCN)大麻素，例如，大麻色满酮、大麻色满酮-C3、或大麻香豆酮。此外，分析物可以是合成大麻素，例如，HU210、大麻环己醇(cannabicyclohexanol)、JWH-073、JWH-018、AM-2201、CP-47,497(以及其衍生物和代谢物)、JWH-015、JWH-081、JWH-133、JWH-200、JWH-250、JWH-398、JTE-907、CP55,244、CP55,940、HU210、HU-211、WIN55,212-2、AM-694、AM-1248、AM-2201、AM-2233、EAM-2201、MAM-2201、MN-25、NNE1、2NE1、UR-144、5F-UR-144、XLR11、AKB48、AKB-Nl、BAY38-7271、BB-22、CB-25、CB-52、AB-001、AB-034、PB-22、5F-PB-22、RCS-4、STS-135、URB-597、和URB-754。
在另一实施方式中，分析物是甲状腺激素或其衍生物或代谢物之一。甲状腺激素或其衍生物或代谢物之一的例子包括3,3',5-三碘甲腺原氨酸(T3)，3,5,5'-三碘甲腺原氨酸(rT3)，甲状腺素(T4)。
在另一实施方式中，分析物是阿片试剂(opiate)、阿片样物质(opioid)或其衍生物或代谢物之一。阿片试剂或阿片样物质或其衍生物或代谢物之一的例子包括天然存在的苄基异喹啉类生物碱(吗啡和东罂粟碱)、半合成衍生物(氢化吗啡酮和氧吗啡酮)，合成类阿片样物质(例如，丁丙诺啡、埃托啡，喷他佐辛)。
在另一实施方式中，分析物是芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一。芳基环己胺的例子包括替来他明、3-甲氧他胺(3-Methoxetamine)(MXE)、甲氧氯胺酮(Methoxyketamine)、N-乙基诺勒他明(ethylnorletamine)(爱科他明(Ethketamine))。
在另一实施方式中，分析物是安非他明。安非他明的例子是安非他明(本身)、甲基安非他明(methamphetamine)、麻黄碱、卡西酮、3,4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，“摇头丸”)和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或"STP")。
在另一实施方式中，分析物是氨基酸、人造氨基酸或小肽。氨基酸的例子包括但不限于：甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、GABA、色氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和苏氨酸。
样品制备
本说明书的各方面部分公开了测试样品。测试样品是指可能含有感兴趣的分析物的任何样品。测试样品可以是生物样品，即，从任何生物来源获得的样品，如动物、植物、真菌、微生物、细胞培养物、器官培养物等。在该实施例的各方面，生物样品包括血液样品包括全血样品、干燥的血液样品、血浆样品、或血清样品、唾液样品、泪液样品、精液样品、尿液样品、脑脊液样品，胆汁样品、胚胎流体样品、组织样品、或其它任何从生物来源获得、萃取或分离的样品。例如，该生物样品可以从医疗和临床环境中的患者获得；即，将自己置于用于诊断、预后或治疗疾病或病症的临床环境中的有生命的人、男性或女性。样品优选从患者获得，例如，血浆样本。血浆样品可以使用或不使用抗凝剂
该生物样品可以从以下获得：例如兽医环境中的动物，即宠物动物、或者农场动物或家畜、鱼、或者任何其它生活在淡水、海洋或海中的动物，本身存在于在用于诊断、预后、预防或治疗疾病或病症的兽医环境中的雄性或雌性。样品优选地从动物获得，例如，血浆样本。血浆样品可以使用或不使用抗凝剂
测试样品可以从以下获得：植物或任何植物来源，农业或环境设置中的叶、或花、或茎、或果实、或种子、或芽、或树皮、或根等。
测试样品可以从以下获得：死亡的人类尸体、或死亡的动物、或死亡植物、或者曾是活体的残骸，如在取证环境、或农业环境、或环境设置、或考古环境中。测试样品可以是血液样品、或干燥的血液样品、或任何其它体液样品(例如，唾液或其它口腔液(oralfluid))、或者任何其它干燥的体液样品、或取自身体的任何地方的身体组织样品或死亡的人、动物、或植物的残骸。
测试样品可以是环境样品。环境样品是从污物、植物物质或流体源(如地下水、海洋或河流等)获取的样品。污物(也叫做"土壤样品")可以从农业场所或感兴趣的环境场所获取，并且可具有萃取的分析物，包括除去微粒物质。
样品可以通过任何已知方式获取。样品可以进行保存或预处理以确保感兴趣分析物的稳定性。这种保存可以通过化学过程(例如水解或pH调节)或物理过程(例如制冷或冷冻)实现。如果样品是固体或组织，可以进行研磨、或萃取、或纯化、或过滤、或离心，以从感染组分分离感兴趣的分析物。或者，如果样品是液体，取决于感兴趣的分析物和化学吸附剂，优选地，溶解、或悬浮在pH范围从弱碱性到中性到弱酸性的溶液中(或“加载缓冲液”)，例如pH为10-3、或者优选9-4、或者优选8-5、或者更优选7-6。
可以获得任意样品体积，只要它具有足够体积，以适用于本发明所述的方法。在该实施方式的各方面中，例如，样品体积可以是：约10μL、约25μL、约50μL、约75μL、约100μL、约125μL、约150μL、约175μL、约200μL、约225μL、约250μL、约275μL、约300μL、约325μL、约350μL、约375μL、约400μL、约425μL、约450μL、约475μL、或约500μL。在该实施方式的其它方面中，例如，样品体积可以是：至少10μL、至少25μL、至少50μL、至少75μL、至少100μL、至少125μL、至少150μL、至少175μL、至少200μL、至少225μL、至少250μL、至少275μL、至少300μL、至少325μL、至少350μL、至少375μL、至少400μL、至少425μL、至少450μL、至少475μL、或至少500μL。在该实施方式的其它方面中，例如，样品体积可以是：至多10μL、至多25μL、至多50μL、至多75μL、至多100μL、至多125μL、至多150μL、至多175μL、至多200μL、至多225μL、至多250μL、至多275μL、至多300μL、至多325μL、至多350μL、至多375μL、至多400μL、至多425μL、至多450μL、至多475μL、或至多500μL。在该实施方式的其它方面中，例如，样品体积可以是：约10μL至约至多100μL、约10μL至约至多200μL、约10μL至约至多300μL、约10μL至约至多400μL、约10μL至约至多500μL、约10μL至约至多600μL、约10μL至约至多700μL、约10μL至约至多800μL、约10μL至约至多900μL、约10μL至约至多1000μL、约50μL至约至多100μL、约50μL至约至多200μL、约50μL至约至多300μL、约50μL至约至多400μL、约50μL至约至多500μL、约50μL至约至多600μL、约50μL至约至多700μL、约50μL至约至多800μL、约50μL至约至多900μL、约50μL至约至多1000μL、约100μL至约至多200μL、约100μL至约至多300μL、约100μL至约至多400μL、约100μL至约至多500μL、约100μL至约至多600μL、约100μL至约至多700μL、约100μL至约至多800μL、约100μL至约至多900μL,orabout100μL至约至多1000μL.
纯化
本文所公开的测试样品可以纯化。如本文所用，术语“纯化的”、“纯化”或“进行纯化”并不是指从样品中除去除了感兴趣分析物之外的所有材料。相反，纯化是指一种过程：相对于可能干扰感兴趣的分析物的检测的样品中的其它组分，富集一种或多种感兴趣的分析物的量。通过多种方法纯化样品能够相对减少一种或多种干扰物质，例如，可能干扰或可能不干扰所选分析物的所选母离子或子离子质谱的一种或多种物质。当使用该术语时，相对减少并不要求通过纯化完全去除待纯化材料中任何与感兴趣的分析物一起存在的材料。当检测尿液样品中的某些分析物(尤其是药物)时，可能需要进行水解以除去可能阻止分析物的溶解和萃取的葡萄糖醛酸苷键合。这种纯化技术通常通过尿液的酶或酸水解来进行。或者，去除微粒物质(例如，通过离心或过滤)、包括或不包括去除磷脂的蛋白质沉淀(任选地通过“蛋白碰撞”法)，可能是有用的纯化技术。
也可以进行纯化以产生或制造适用于衍生化反应的可获得的活性氨基或酚基。这些方法包括酯或胺的水解、或糖的酸水解。
这种通过预处理的纯化不受限制，但服务于制备用于通过固相萃取、载液萃取(supported liquid extraction,SLP)和液液萃取(LLP)中的一种或多种进行萃取的样品。
固相萃取
如本文所用，术语“固相萃取”或“SPE”是指一种过程，在该过程中，由于溶解或悬浮在溶液(即，流动相)中的组分对穿过或围绕溶液所经过的固体(即，固相)的亲和力，化学混合物被分离成各组分。在某些情况下，当流动相穿过或绕过固相时，流动相中不需要的组分由固相保留，导致流动相中分析物的纯化。在其它情况下，分析物可以由固相保留，使得流动相中不需要的组分穿过或围绕固相。在这种情况下，随后使用第二流动相将保留的分析物从固相洗脱下来用于进一步处理或分析。
将使用离子交换萃取过程的SPE应用于从样品萃取感兴趣的分析物。该分析物可以在某些缓冲液的某些pH范围下电离。SPE可以采用基于分析物适合的各种特征进行。分析物(诸如单胺神经递质、或儿茶酚胺、或变肾上腺素、或氨基酸、或甲状腺激素、或羧酸)可以通过基于SPE的离子交换萃取进行萃取、保留或纯化。更具体说，可采用强阳离子交换至弱阳离子交换。采用阳离子交换的SPE是应用于从血浆样品中萃取感兴趣分物析的本发明方法的一个例子。具有基于二乙烯基苯(DVB)的聚合物吸附剂的弱阳离子交换筒是儿茶酚胺类和变肾上腺素类的SPE的具体示例。采用基于SPE的强阳离子交换萃取的SPE也可用于用填充有基于DVB的聚合物吸附剂的SPE柱、通过更强的洗脱溶剂，纯化来自血浆样品的分析物。此外，基于二氧化硅的羧酸吸附剂可也用于从血浆样品萃取儿茶酚胺或变肾上腺素类。
基于二氧化硅或者一种或多种聚合物的强阳离子交换(磺酸化学)吸附剂也可用于在SPE过程中萃取分析物。具有强阳离子交换吸附剂的SPE特别示例用于甲状腺激素(T3/rT3/T4)的SPE的。氨基酸分析物可以类似地用基于聚合物、或基于二氧化硅的强阳离子交换吸附剂萃取。
阴离子交换聚合物可用于萃取羧酸分析物、氨基酸分析物、或磺酸分析物、或膦酸分析物。
本发明方法中用于萃取类固醇的感兴趣的具体的柱包括PWCX,1mL柱,10mg,96/Pk(目录号6750-0101R)。对于甲状腺激素，合适PSCX,1mL柱,10mg,96/Pk(目录号687-0101R)。
在另一实施方式中，当分析物不具有氨基(例如维生素D及其衍生物和代谢物、雌激素、或大麻素、或类黄酮)时，可以使用反相SPE柱或筒来萃取、或纯化、或保留选择的分析物。SPE/纯化期间选择的吸附剂可包括烷基结合的二氧化硅(C4、C8、C12和C18)，结合氰基的二氧化硅、结合苯基的二氧化硅、或结合联苯基的二氧化硅。感兴趣的具体柱包括：1cc柱(疏水性聚合物/弱阴离子交换柱，10μm粒度，300A，来自SPE Ware公司)
柱的尺寸可以变化，但是具体地，柱体积可以优选50uL-3000uL，并且吸附剂加载为100μg至50mg。在另一实施方式中，更优选的柱尺寸为100μL至2000μL，并且吸附剂加载为1mg至20mg。在另一实施方式中，更优选的柱尺寸为200μL至1000μL，并且吸附剂加载为2mg至10mg。SPE柱(筒)的形状和尺寸可以进行改变以适应具体平台。
吸附剂的粒度可进一步有助于感兴趣分析物的分离。在该实施方式的各方面中，例如，吸附剂的粒度的平均直径可以为约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、或约75μm。在该实施方式的其它方面中，例如，吸附剂的粒度的平均直径可以为至少0.5μm、至少1μm、至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、或至少75μm。在该实施方式的其它方面中，例如，吸附剂的粒度的平均直径可以为至多0.5μm、至多1μm、至多5μm、至多10μm、至多15μm、至多20μm、至多25μm、至多30μm、至多35μm、至多40μm、至多45μm、至多50μm、至多55μm、至多60μm、至多65μm、至多70μm、或至多75μm。在该实施方式的其它方面中，例如，吸附剂的粒度的平均直径可以为约0.5μm至约10μm、约0.5μm至约20μm、约0.5μm至约30μm、约0.5μm至约40μm、约0.5μm至约50μm、约0.5μm至约60μm、约0.5μm至约70μm、约0.5μm至约80μm、约1μm至约10μm、约1μm至约20μm、约1μm至约30μm、约1μm至约40μm、约1μm至约50μm、约1μm至约60μm、约1μm至约70μm、约1μm至约80μm、约5μm至约10μm、约5μm至约20μm、约5μm至约30μm、约5μm至约40μm、约5μm至约50μm、约5μm至约60μm、约5μm至约70μm、约5μm至约80μm、约10μm至约20μm、约10μm至约30μm、约10μm至约40μm、约10μm至约50μm、约10μm至约60μm、约10μm至约70μm、或约10μm至约80μm。
样品可以与加载溶剂或加载缓冲液一起加载到SPE柱上。加载溶剂可以是去离子水、或pH缓冲水溶液、或有机溶剂、或有机溶剂的混合物、或一种有机溶剂和去离子水的混合物、或多种有机溶剂和去离子水的混合物，或与一种有机溶剂或有机溶剂混合物混合的pH缓冲水溶液。pH缓冲水溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或磷酸盐缓冲液、或碳酸盐缓冲液、或琥珀酸盐缓冲液、或酒石酸盐缓冲液、或柠檬酸缓冲液、或甲酸缓冲液、或醋酸缓冲液、或另一种典型生化实验室中常用的缓冲溶液、或以下任意两种或更多种的混合物：磷酸盐缓冲液、或碳酸盐缓冲液、或醋酸缓冲液、或甲酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、或琥珀酸盐缓冲液、或酒石酸盐缓冲液，或者，pH范围从弱碱性到中性到弱酸性；例如具有pH范围为10-3、更优选9-4、或更优选8-5、或者甚至更优选7-6，浓度范围为0.1mM-100mM，或更优选0.5mM-50mM，或更优选1mM-25mM，或更优选5-10mM。有机溶剂可选自：乙腈、或丙酮，或1,4-二噁烷、或DMF、或四氢呋喃(THF)、或二乙醚、或乙酸乙酯、或乙酸甲酯、或甲酸乙酯、甲酸甲酯、或它们的混合物。在一个实施方式中，将样品加载到萃取和/或转移缓冲液中的柱上(Immunalysis公司，波莫纳，美国)。
在加载样品至SPE柱时，在具有或没有空气干燥过程的情况下，通过重力、或贯穿真空歧管的真空抽吸、或推动穿过正压力歧管的氮气或惰性气体压力，使得流体流过吸附剂。加载样品的筒可以用溶剂额外洗涤。选择的洗涤溶剂可以是去离子水、或pH缓冲水溶液、或有机溶剂、或有机溶剂的混合物、或有机溶剂与缓冲水溶液的混合物。有机溶剂可以是乙腈、或甲醇、或乙醇、或异丙醇、或丁醇、或乙醚、或丙酮、或1,4-二噁烷、或THF、或DMF、乙酸乙酯、或乙酸甲酯、或甲酸乙酯、或甲酸甲酯、或任何上述溶剂的混合物。
在加载和洗涤时，所加载的筒可以用洗脱流体直接处理，或者首先通过干燥氮气流、或者其他干燥惰性气体流穿过筒进行干燥。
衍生化
本说明书的各方面部分公开了采用衍生试剂对感兴趣分析物进行衍生化的方法。感兴趣的分析物与衍生试剂反应以提供分析物的衍生物。衍生化可以在原位。该衍生物显示改进的HPLC行为，显著改进串联MS/MS灵敏度，并且使得亲脂分析物更亲水。例如，当从血清样品中定量维生素D、大麻素、雌激素或其它分析物时，本发明方法出人意料地通过使用LC-串联MS/MS技术提供了提高接近或超过1000倍的检测限和/或量化灵敏度。
本文中所公开的衍生化试剂(derivatizing reagent，或derivatizationreagent)包括衍生试剂和合适的溶剂。衍生试剂是可以与存在于本文所公开分析物中的伯胺基团、和/或酚羟基、和/或伯醇(羟基)基团、和/或芳基或烷基硫醇基团反应的化合物。衍生试剂包括冠醚、连接物、与衍生官能团。
在一实施方式中，所衍生的结构具有冠醚成分(CE)、连接物或接头成分(L)、衍生化(或与分析物结合)的官能团(FG)、和分析物。式1提供了所保护衍生试剂的通式结构：
CE-L-FG
式1。
冠醚CE可以附着或稠合到与衍生官能团FG相连的接头L，衍生官能团FG可以共价附着到某些所选分析物上。衍生试剂的一个具体例子如图1所示，证明了具有冠醚成分(即，灵敏度助推剂)(101)的衍生试剂(100)，所示冠醚成分被结合到接头(即，连接物)(102)上，进而共价连接到分析物(衍生官能团)(103)上。
感兴趣的冠醚包括提供任何冠醚、及其变体。一方面，冠醚任选地稠合到一个或多个环己基或芳基基团上，任选地冠醚中的一个或多个氧由杂原子取代，例如氮(即，氮杂冠醚)或硫(硫杂冠醚)。在一实施方式中，冠醚包括12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30元环。在一实施方式中，冠醚的范围为12-冠醚-4至24-冠醚-8。一方面，所述冠醚的“冠”是12-冠醚-4、15-冠醚-5、16-冠醚-4、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8。
冠醚还可以具有套索结构。套索结构可以包括：任选取代或中断的C1-C12烷基(直链、环状、和/或支链)。例如，套索结构可以用作接头或连接物、或冠醚和所结合分析物之间的接头。
接头或连接物通过简单的共价键与冠醚结合。在一实施方式中，接头和连接物可以是C1-C12直链、支链或环状烷基。一方面，接头和连接物可以是C1-C6直链、支链或环状烷基。另一方面，接头或连接物与形成六元酚环的冠醚稠合。
与分析物结合的衍生化官能团可以包括但不限于：酰化基团、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、烷氧基胺、酰肼、醇、或胺。在一实施方式中，衍生化官能团可以是如式2所示的任意酰化基团。酰化试剂可以包括酰氯或其它酰卤。衍生试剂也可以发荧光或参与比色反应以协助检测结合的分析物。
衍生试剂中的酰化基团用于具有伯胺和仲胺、脂肪族羟基或酚羟基的分析物。例如单胺、氨基酸、雌激素、THC、其代谢物和类似物(例如HU210)等。在一实施方式中，具有酰化官能团的冠醚衍生试剂包括但不限于任意的组I结构：
一方面，冠醚衍生试剂是MB338。
用于衍生含顺式二烯的分析物的含有冠醚的衍生试剂包括但不限于：直接、或通过接头/连接基团或套索与4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)或1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)结合的冠醚。该衍生试剂包括但不限于任意的组II结构：
一方面，衍生试剂是MB409。在另一实施方式中，冠醚或分析物可以进一步与4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)部分、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)部分结合或连接。例如，当与维生素D结合时，通过与维生素D的s-顺式二烯部分反应PTAD产生了两个差向异构体。
适用于衍生醛和酮(例如睾酮和许多含有类固醇的酮和醛)的冠醚衍生试剂包括但不限于与烷氧基胺和酰肼结合的冠醚。在一实施方式中，具有与烷氧基胺、酰肼结合的冠醚的衍生试剂包括但不限于任意的组III结构：
适用于衍生羧酸(例如，脂肪酸、生物素、单甲基丙二酸(MMA)等)的冠醚衍生试剂包括但不限于与醇或胺结合的冠醚。在一实施方式中，衍生试剂是与醇或胺结合的冠醚，包括但不限于任意的组IV结构：
冠醚通过捕获阳离子用作质谱灵敏度增强剂。感兴趣的阳离子包括但不限于：NH4+、H30+、MeNH3+、Na+、K+、或Ca2+。基于冠醚的尺寸和形状，不同的冠醚具有对不同阳离子的不同亲和力。
原位衍生化或者在从固相萃取柱洗脱之前、洗脱期间、或洗脱后即刻进行，或者从洗脱之前持续进行直至洗脱后。
洗脱可以用高pH洗脱溶液进行。如此处所用，“高pH”包括具有碱性pH的洗脱溶液。在该实施方式的一方面中，例如，洗脱溶液的pH可以是约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、或约13。在该实施方式的另一方面中，例如，洗脱溶液的pH可以是至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、至少10.5、至少11、至少11.5、至少12、至少12.5、或至少13。在该实施方式的另一方面中，例如，洗脱溶液的pH可以是至多8、至多8.5、至多9、至多9.5、至多10、至多10.5、至多11、至多11.5、至多12、至多12.5、或至多13。在该实施方式的另一方面中，例如，洗脱溶液的pH的范围为约8至约9、约8至约9.5、约8至约10、约8至约10.5、约8至约11、约8至约11.5、约8至约12、约8至约12.5、约8至约13、约8.5至约9、约8.5至约9.5、约8.5至约10、约8.5至约10.5、约8.5至约11、约8.5至约11.5、约8.5至约12、约8.5至约12.5、约8.5至约13、约9至约9.5、约9至约10、约9至约10.5、约9至约11、约9至约11.5、约9至约12、约9至约12.5、约9至约13、约9.5至约10、约9.5至约10.5、约9.5至约11、约9.5至约11.5、约9.5至约12、约9.5至约12.5、约9.5至约13、约10至约10.5、约10至约11、约10至约11.5、约10至约12、约10至约12.5、约10至约13、约10.5至约11、约10.5至约11.5、约10.5至约12、约10.5至约12.5、约10.5至约13、约11至约11.5、约11至约12、约11至约12.5、或约11至约13。
本文所公开的洗脱溶液可以使用具有碱性缓冲能力的任何缓冲剂进行缓冲。在该实施方式的各方面，本文公开的洗脱溶液可使用一种有机或无机缓冲剂或有机或无机缓冲剂的混合物进行缓冲，例如POPSO、TEA、磷酸盐。在该实施方式的其它方面，本文公开的洗脱溶液可以在水中使用如下试剂进行缓冲：例如三烷基铵缓冲剂，包括例如，三烷基铵碳酸氢盐、三烷基铵硼酸盐、三烷基铵碳酸盐、或三烷基铵磷酸盐；铯缓冲剂，包括例如，碳酸氢铯、硼酸铯、碳酸铯、氢氧化铯、或磷酸氢二铯、或磷酸三铯；钾缓冲剂，包括例如，碳酸氢钾、硼酸钾、碳酸钾、氢氧化钾、或磷酸氢二钾、或磷酸三钾；钠缓冲剂，包括例如，碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、氢氧化钠、或四硼酸钠；四烷基铵缓冲剂，包括例如，四烷基铵碳酸氢盐、四烷基铵硼酸盐、四烷基铵碳酸盐、或四烷基铵磷酸盐，使用或不使用一种或多种如下的有机助溶剂：例如乙腈、或丙酮、或四氢呋喃(THF)、或1,4-二噁烷、或二甲基甲酰胺(DMF)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)、或二甲亚砜(DMSO)、或六甲基磷酰胺(HMPA)、或乙醚、或异丙醇(IPA)、或叔丁醇、或2-丁醇等，以期望的比例，如处于/以下/或以上，5％或10％、或15％、或20％、或25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％、或55％、或60％、或70％、或75％、或80％、或85％或90％、或95％的有机溶剂在水中。
洗脱溶液中使用的缓冲剂的量可以是能够有效维持缓冲剂的碱性缓冲能力的任意浓度。在该实施方式的各方面中，例如，缓冲剂的有效浓度可以是约1.0mM、约5.0mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、或约900mM、或约1M。在该实施方式的各方面中，例如，缓冲剂的有效浓度可以是至少1.0mM、至少5.0mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM、至少400mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、或至少900mM、或至少1M。在该实施方式的各方面中，例如，缓冲剂的有效浓度可以是至多1.0mM、至多5.0mM、至多10mM、至多20mM、至多30mM、至多40mM、至多50mM、至多60mM、至多70mM、至多80mM、至多90mM、至多100mM、至多200mM、至多300mM、至多400mM、至多500mM、至多600mM、至多700mM、至多800mM、或至多900mM、或至多1M。
在该实施方式的各方面中，例如，缓冲剂的有效浓度范围可以是约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约25mM、约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约75mM、约0.1mM至约100mM、约0.1mM至约200mM、约0.1mM至约300mM、约0.1mM至约400mM、约0.1mM至约500mM、约0.1mM至约1000mM、约1mM至约10mM、约1mM至约25mM、约1mM至约50mM、约1mM至约75mM、约1mM至约100mM、约1mM至约200mM、约1mM至约300mM、约1mM至约400mM、约1mM至约500mM、约1mM至约1000mM、约5mM至约25mM、约5mM至约50mM、约5mM至约75mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约400mM、约5mM至约500mM、约5mM至约1000mM、约10mM至约25mM、约10mM至约50mM、约10mM至约75mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约400mM、约10mM至约500mM、约10mM至约1000mM、约25mM至约50mM、约25mM至约75mM、约25mM至约100mM、约25mM至约200mM、约25mM至约300mM、约25mM至约400mM、约25mM至约500mM、约25mM至约1000mM、约50mM至约75mM、约50mM至约100mM、约50mM至约200mM、约50mM至约300mM、约50mM至约400mM、约50mM至约500mM、约50mM至约1000mM、约75mM至约100mM、约75mM至约200mM、约75mM至约300mM、约75mM至约400mM、约75mM至约500mM、约75mM至约1000mM、约100mM至约150mM、约100mM至约200mM、约100mM至约300mM、约100mM至约400mM、约100mM至约500mM、约100mM至约1000mM、约200mM至约300mM、约200mM至约400mM、约200mM至约500mM、约200mM至约1000mM、约250mM至约300mM、约250mM至约400mM、约250mM至约500mM、或约250mM至约1000mM。在另一实施方式中，洗脱缓冲液的有效浓度范围可以为约5mM至约250mM。
本文公开的洗脱溶液可包含本文公开的衍生试剂。添加到本文所述洗脱溶液的衍生试剂的量是足以能够使感兴趣的分析物完全衍生化用于后续检测的量。衍生试剂可在洗脱之前与洗脱缓冲液混合，如原位衍生化过程那样，它也可以在洗脱之后即刻加入洗脱液，以进行洗脱后衍生化过程。
在一个实施方式中，通过向与固相吸附剂载体基质结合的分析物施加包含衍生试剂的洗脱缓冲液可实现分析物同时洗脱和衍生化。一旦施加洗脱溶液，将分析物转化为其衍生物的衍生化反应发生，然后衍生物从吸附剂基质洗脱，同时分析物从固相载体基质洗脱。
衍生化反应可以在适合分析物结合的任何条件下进行。在一个实施方式中，衍生化反应在适合衍生化试剂附着到分析物的温度条件下进行。在该实施方式的方面，衍生化反应可以在如下温度范围进行：约或大于0℃至约或低于100℃、更优选约5℃至约90℃、更优选10℃至80℃、更优选15℃至70℃、更优选18℃至60℃、更优选18℃至40℃。
衍生化反应在适合衍生化试剂附着到分析物的时间条件下进行。在该实施方式的各方面中，衍生化反应在在如下持续时间范围内进行：约1分钟至约24小时、更优选约3分钟至约5小时、更优选约5分钟至约60分钟、更优选约10分钟至约45分钟。在一方面，反应为约15分钟至约30分钟。
当然，改变温度可以改变反应时间。例如，如果反应进行加热，例如加热至40℃，则反应时间可以缩短。
衍生化反应可通过加入含有一种或多种缓冲剂的缓冲溶液淬灭。在一个实施方式中，缓冲剂是铵缓冲剂，如甲酸铵、或乙酸铵、或碳酸铵、或磷酸三铵、或硫酸铵、或硼酸铵、氢氧化铵、氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵、硫酸氢铵、磷酸二铵(bisammonium phosphate)等。在另一个实施例中，淬灭试剂也可以是缓冲的□-氨基酸溶液，如甘氨酸、丙氨酸，或缓冲的□-丙氨酸，或缓冲的伯胺溶液，例如在水、或水和有机溶剂的混合溶剂中的浓度范围为1mM至500mM，所述有机溶剂例如醇，如，甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或二醇、或丙三醇等，或乙腈，或丙酮，或醚，或THF，或1,4-二噁烷，或DMF，或NMP，或DMSO，或HMPA。淬灭过程能够中和可能仍保留在洗脱溶液中的大部分任意过量衍生化试剂，并且也能够通过降低反应混合物的pH来稳定产物。在该实施方式的各方面中，可以将含有衍生的分析物的洗脱剂的pH降低至约4至约9.5。
色谱分析
淬灭之后，随后含有衍生的分析物的反应混合物可用于直接分析感兴趣分析物的存在。该分析的性质可以是定性的或定量。在该实施方式的各方面中，含有衍生的分析物的洗脱剂可使用例如色谱和/或质谱检测，直接分析感兴趣的分析物存在。
如本文所用，术语“色谱”是指如下过程：当由液体或气体携带的化学混合物流到固定液相或固相周围、或流过固定液或固相时，由于化学实体的差示分布，所述化学混合物分离为各组分。
如本文所用，术语“液相色谱”或“LC”是指当流体均匀渗滤通过细碎物质的柱、或者通过毛细管道时，流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的过程。延迟是由于当该流体相对于固定相移动时，混合物各组分分布在一种或多种固定相和本体流体(即流动相)之间所导致的。“液相色谱”的例子包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)、超高压液相色谱(UHPLC)和湍流液相色谱(TFLC)(有时称为高湍流液相色谱)(HTLC)或高通量液相色谱，或纳米流液相色谱(nano-flow liquid chromatography)或纳米LC。
如本文所用，术语“高效液相色谱”或“HPLC”是指通过迫使流动相在压力下通过固定相(通常是致密填充的柱)来提高分离程度的液相色谱。
如本文所用，术语“湍流液相色谱”或“TFLC”(有时称为高湍流液相色谱(HTLC)或高通量液相色谱)是指一种形式的色谱：利用所述材料的湍流流动通过作为用于进行分离基础的柱填充物。在通过质谱进行分析之前，TFLC已经应用于制备包含两种未命名药品的样品。参见，例如Zimmer等人,J Chromatogr A 854:23-35(1999)；也可参见美国专利5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释了TFLC。本领域的普通技术人员理解“湍流”。当流体流动缓慢且平稳时，所述流动被称为"层流"。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层状的。层流中流体的颗粒运动是有序的，并且颗粒大体沿直线移动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体的摩擦力而获得湍流。与不规则边界接触的流体“超过(outrun)”了由摩擦减慢或被不均匀表面转向的流体。如果流体是流动的紊流，其以旋涡和回旋(或涡流)流动，具有比流体是层状时更多的"拖拽"。很多参考文献可以用于帮助确定何时流体流动是层状或湍流(例如，湍流分析测量与预测(Turbulent Flow AnalysisMeasurement and Prediction),P.S.Bernard和J.M.Wallace,约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.)(2000)；湍流介绍(An Introduction to Turbulent Flow),JeanMathieu和Julian Scott,剑桥大学出版社(Cambridge University Press)(2001))。
如本文所用，术语“气相色谱”或“GC”是指如下色谱：其中样品混合物气化并注射入载气流(如氮气或氦气)中，移动通过包含由液体或微粒固体组成的固定相的柱，并根据化合物对固定相的亲和力分离为其组分化合物。
如本文所用，术语"大颗粒柱"或"萃取柱"是指含有大于约50μm平均粒径的色谱柱。如用在本文中，术语“约”表示±10％。
如本文所用，术语“分析柱”是指具有足够色谱板的色谱柱，以实现从所述柱洗脱的样品中的材料分离足以测定分析物的存在或含量。该柱通常与“萃取柱”不同，所述萃取柱的常规目的是从非保留材料分离或萃取所保留材料以获得纯化的样品用于进一步分析。如用在本文中，术语“约”表示±10％。
某些液相色谱方法——包括HPLC——依赖于相对缓慢的层流技术。传统HPLC分析依赖于柱填充物，其中样品通过柱的层流是将感兴趣分析物与样品分离的基础。本领域技术人员将理解：在该柱中的分离是扩散过程，并且可以选择适用于感兴趣分析物使用的HPLC设备和柱。色谱柱通常包括介质(即填充材料)，以利于化学物质的分离(即分馏(fractionation))。介质可以包括微小颗粒。颗粒包括与各种化学部分相互作用以利于化学物质分离的结合表面。一种合适的结合表面是疏水结合表面，例如烷基结合、氰基结合、或五氟苯基丙基(F5)表面、或苯基/结合、或联苯基结合表面。烷基结合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18结合烷基基团。在优选实施方式中，柱是C-18柱。色谱柱包括用于从固相萃取或HTLC柱直接或间接接收样品的进口以及用于排出包含分馏样品的洗脱剂的出口。
在某些实施方式中，通过在由柱填充材料可逆保留感兴趣分析物、而不保留一种或多种其它材料的条件下将样品施加到柱中，可以把分析物富集到样品中。在这些实施方式中，可采用通过柱保留感兴趣分析物的第一流动相条件，一旦非保留材料洗出，随后可以采用第二流动相条件，以从柱中去除所保留材料。或者，通过在感兴趣分析物与一种或多种其它材料相比以不同速率洗脱的流动相条件下将样品施加到柱上，可以把分析物富集到样品中。该过程可以相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣分析物的量。在另一实施方式中，分析物的反应混合物可以首先加载到具有弱溶剂的保护柱上，以使所需的分析物产物保留在保护柱上，然后LC洗脱溶剂将物质携带到用于分离和分析的分析柱上。
在一个实施方式中，样品可以在进口处施加到LC柱上，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口排出。可选择不同的溶剂用于洗脱感兴趣的分析物。例如，液相色谱可采用梯度模式、等度模式、或多型(即混合)模式进行。在色谱期间，材料的分离通过变量实现，诸如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。
在一个优选的实施方式中，HPLC采用疏水柱色谱系统进行。在某些优选实施方式中，使用C18分析柱(例如，C18,3μm 50x 2.1，或等同物)。在某些优选实施方式中，使用pH为3.0的含0.1％甲酸的HPLC级5.0mM甲酸铵以及0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相进行HPLC。
通过仔细选择阀和连接物管道，两种或更多种色谱柱可以按需要连接，使得材料从一个通过到下一个而不需要任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀和管道的选择通过预编程序的计算机控制以进行必要步骤。更优选地，色谱系统还与检测器系统(例如MS系统)以在线方式连接。这样，操作者可将一盘样品置于自动取样器中，剩余的操作在计算机控制下进行，从而纯化和分析所有选择的样品。
在一些实施方式中，可以在高通量平台中使用固相萃取，用于在质谱前富集衍生的感兴趣分析物。在该实施方式中，可以使用高通量SPE筒或保护柱萃取样品，其捕获衍生的分析物，然后在分析型HPLC柱(诸如C-18柱)上洗脱，然后进行质谱(MS)分析。因为这些色谱过程中涉及的步骤可以以自动方式连接，能够使得对分析物纯化期间操作者参与的需求最小化。该特征可节省时间和成本、消除或降低操作者误差的可能。
直接定量
直接定量是“在线”或“联机”使用所萃取的衍生分析物进行定量。如本文所用，术语“在线”或“联机”、例如在“联机自动方式”或“联机萃取”中是指不需要操作人员干预的执行过程。相反，本文所用的术语“离线”是指需要操作者手动干预的过程。因此，如果样品经过沉淀，并且随后上清液被手动加载到自动取样器中，则沉淀和加载步骤是与随后步骤离线的。在该方法的各实施方式中，一个或多个步骤可以以联机自动方式进行。
如本文所用，术语“样品注射”是指将等分的单一样品引入分析仪器，例如质谱仪。这种引入可以直接或间接进行。例如，间接样品注射可通过将等分的样品注射入以在线方式连接到质谱仪的HPLC柱实现。
如本文所用，相对于通过质谱分析多个分析物的术语“相同的样品注射”意味着通过测定来自同一(即相同)样品注射的不同分析物的分子离子基本上同时检测两种或更多种不同分析物的分子离子。
质谱法
在各实施方式中，存在于测试样品中的感兴趣分析物可通过本领域技术人员已知的任意方法电离。质谱分析使用质谱仪进行，它包括离子源，用于将分馏样品店里并产生带电分子用于进一步分析。例如，样品的电离可通过以下方式进行：电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快速原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场致解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、感应耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。本领域技术人员应理解：电离方法的选择可根据待测定的分析物、样品类型、检测器类型、正-负模式的选择等进行。
如本文所用，术语"质谱法"或"MS"是指通过化合物质量鉴定化合物的分析技术。MS指过滤、检测和根据其质荷比、或"m/z"测定离子的方法。MS技术一般包括：(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可以通过任何合适的方法进行电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。通常，一个或多个感兴趣分子进行电离，随后离子被引入质谱仪，在质谱仪中，由于磁场和电场的组合，所述离子依赖于质量("m")和电荷("z")沿着空间中的路径移动。参见，例如标题为标题“来自表面的质谱”("Mass Spectrometry From Surfaces")的美国专利6,204,500；标题为标题“串联质谱的方法和设备”("Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry")的6,107,623；标题为“基于质谱的DNA诊断”("DNA Diagnostics Based On MassSpectrometry")的6,268,144；标题为“用于分析物的解吸附和检测的表面改善的光不温度连接和释放("Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release ForDesorption And Detection Of Analytes")的6,124,137；Wright等人，前列腺癌及前列腺疾病(Prostate Cancer and Prostatic Diseases)1999,2：264-76；以及Merchant和Weinberger，电泳(Electrophoresis)2000,21:1164-67。
如本文所用，术语"电喷雾电离"或"ESI"是指如下方法：其中，溶液沿着毛细管的短长度流动到施加高正电势或高负电势的末端。到达管末端的溶液蒸发(雾化)为溶剂蒸汽中非常小的溶液液滴的喷射流或喷雾。这种液滴雾流动通过汽化室，汽化室可进行加热以防止冷凝，并以促进溶剂蒸发。随着液滴变得更小，表面电荷密度增加，直到相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子释放。在一实施方式中，检测在ESI之后进行。
如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指与ESI相似的质谱方法；但是，APCI通过在大气压下在等离子体中发生的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷射毛细管与对电极之间的放电维持。然后，通过使用一组差别泵送的撇渣器(skimmer)阶段，通常将离子萃取至质量分析仪。逆流干燥并预热的N2气体可用于改进溶剂的去除。APCI中的气相电离可以比ESI更有效地用于分析更小极性的种类。
如本文所用的术语“大气压光致电离”或“APPI”是指这种形式的质谱法：其中分子M光致电离的机理是光子吸收和电子射出以形成分子离子M+。因为光子能量通常恰好大于电离电势，所述分子离子不易解离。在许多情况下，有可能分析样品而无需色谱，因此节省了大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂的存在下，分子离子可吸取H以形成MH+。这在M具有高质子亲合力时会趋向于发生。这不影响量化精确度，因为M+与MH+之和是常数。质子溶剂中的药物化合物通常被视作MH+，而非极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。参见，例如，Robb等人，分析化学(Anal.Chem.)2000,72(15):3653-3659。
如本文所用，术语“解吸”指分析物从液体表面易位和/或分析物进入气相。激光解吸热解吸是这样一种技术：其中，含有分析物的样品通过激光脉冲热解吸为气相。激光撞击具有金属基底的特制96孔板的背面。激光脉冲加热基底并且加热导致样品转变为气相。然后，将气相样品抽入质谱仪中。
如本文所用，术语“选择性离子监测”是一种质谱仪的检测模式：其中，仅检测相对窄质量范围内的离子，一般是大约一个质量单位。
如本文所用，“多反应模式”有时被称为“选择反应监测”，是一种质谱仪的检测模式：其中，选择性检测前体离子和一种或多种碎片离子。
离子可使用几种检测模式进行检测。例如，所选离子可以进行检测，即，使用选择性离子监测模式(SIM)进行检测，或者可选地，离子可使用扫描模式，例如多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)进行检测。优选地，质荷比使用四极分析器进行测定。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，在振荡射频场中的离子经历与施加在电极之间的直流电势、RF信号振幅和质荷比成正比的力。可以选择电压和振幅，以致只有具有特定质荷比的例子经过四极的长度，而所有其它离子偏离。因此，四极仪器可用作注入仪器的离子的"质量过滤器"和"质量检测器"。
可以通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在这种技术中，从感兴趣的分子的产生的前体离子(也称为母离子)可在MS仪器中进行过滤，并且前体离子随后碎片化以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二MS过滤器和检测器(四极)中进行分析。通过仔细选择前体离子，仅仅由某些分析物产生的离子通过至碎裂室(fragmentation chamber)，在片段化室中与惰性气体原子的碰撞产生了碎片离子。因为前体和碎片离子在给定设置的电离/碎裂条件下以可再现的方式产生，MS/MS技术可提供极其有力的分析工具。例如，过滤/碎裂的组合可用于消除干扰物质，并且可特别用于复杂样品诸如生物样品。
质谱仪一般为用户提供离子扫描；即，给定范围上各个离子的相对丰度与特定质/荷比(例如m/z:5-1250，对于API5000)。分析物分析(即质谱)的结果可与通过本领域已知的各种方法得到的原始样品中分析物的量相关。例如，假定对取样和分析参数进行仔细控制，给定离子的相对丰度可以与将相对丰度转化成原始分子绝对量的表进行比较。可选地，分子标准物可与样品一起运行，基于从那些标准物中产生的离子构建标准曲线。使用该标准曲线，给定离子的相对丰度可转化成原始分子的绝对量。在某些优选实施方式中，可使用一种或多种内标物产生标准曲线，用于计算感兴趣分析物的量。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域公知的，并且本领域普通技术人员能选择合适的内标物。例如，可使用同位素标记的分析物作为内标物；在某些优选实施方式中，可使用D6-25OH维生素D3、D6-25-OH维生素D2、25(OH)2维生素D3、D6-1,25(OH)2维生素D2等作为内标物。将离子的量与原始分子的量相关联的许多其它方法是本领域普通技术人员熟知的。
在特别优选的实施方式中，感兴趣的分析物使用MS/MS在样品中进行定量。样品中的一种或多种感兴趣分析物在FMOC-Cl或其变体的存在下首先在高pH下过滤通过固相萃取柱并洗脱。然后，将获得的洗脱液进行液相色谱，优选HPLC。来自色谱柱的流动相进入MS/MS分析仪的加热的ESI探针，并且分析物发生电离。离子(例如，前体离子)穿过仪器的孔并且进入第一四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，能够基于它们的质荷比(m/z)选择离子(即，在Q1和Q3中分别选择“前体”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞单元，在碰撞单元中离子发生碎裂。质谱仪的第一四极(Q1)选择具有感兴趣分析物的质荷比的分子。允许具有正确质荷比的前体离子穿过进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它质荷比的不需要的离子与四极侧面碰撞并消除。进入Q2的前体离子与中性氩气分子碰撞并碎裂。该过程被称为碰撞活化解离(CAD)或碰撞诱导解离(CID)。所产生的碎片离子穿过进入四极3(Q3)，在四极3中碎片离子被选择而其它离子被除去。在单一样品的分析期间，可以调节Q1和/或Q3，从而首先选择针对一种具体分析物的一种或多种前体离子/碎片离子对的质荷比，然后，在某一随后的时间选择针对第二种具体分析物的一种或多种前体离子/碎片离子对的质荷比，任选地随后在某一稍后的时间选择针对第三种具体分析物的一种或多种前体离子/碎片离子对的质荷比，以此类推。在特别优选的实施方式中，在单一样品的分析期间，检测针对肾上腺素的前体/碎片离子对的质荷比、针对去甲肾上腺素的前体/碎片离子对的质荷比、针对分析物的前体/碎片离子对的质荷比，但是检测的顺序可以以任意顺序进行。
该方法可包括在正离子模式或负离子模式下进行的MS/MS；优选正离子模式。使用本领域公知的标准方法，本领域普通技术人员能够鉴定可用于四极3(Q3)中选择的感兴趣分析物的具体前体离子的一种或多种碎片离子。
在各种实施方式中，将感兴趣的分析物进行质谱用于检测和定量。质谱技术可以采用大气压化学电离(APCI)或电喷雾电离(ESI)产生带电离子。感兴趣的分析物可以作为质子加合物或质子化分子离子(即[M+H+])存在于流动相中。当丰富的铵离子存在于流动相中，分析物也可以显示为铵加合物[M+NH4+]作为分子离子，或者当对应阳离子存在于流动相中时，分析物还可以显示为其它阳离子加合物。不同的加合物也是可能的，并且可以由本领域技术人员认识到，通常显示为[M+A+H]+，其中A是加合物。加合物可以或可以不是溶剂化的。在电离过程中，分子离子解吸为气相，然后聚集进入质谱仪用于分析和检测。如本领域技术人员所知，关于APCI的更多信息参见US 6,692,971。
MS分析可以用单个质量分析仪，例如单个四极质谱仪(MS)，或串联质量分析仪，例如三重四极杆串联质谱仪(MS/MS)。在串联质谱分析模式中，第一质量过滤器或四极(Q1)可以进行调节以独立选择感兴趣分析物和选择的内标物的一种或多种分子离子。分子离子(前体离子)可以在第二四极(Q2)发生碰撞诱导解离(CID)以产生碎片离子或产物离子。碎片离子可在Q3处的第二质量过滤器进行检测和分析。该过程可以称为产品优化。然后调节第二质量过滤器以选择性地监测由具体分子离子产生的一种或多种最丰富的产物离子。这种技术被称为多反应监测(MRM)。
对于如下具有MB338的激素雌酮、雌二醇、和17β-雌二醇-2,3,4-13C3，可以监测前体-产物离子对的MRM转变：
可以将1,25-二羟基维生素D及其衍生物的冠醚衍生物的分子离子[M+NH4 +]鉴别为前体-产物离子对的MRM转变。内标物(例如氘代分析物)可以应用于本文描述的方法。在一实施方式中，可使用D6-25OH维生素D3、D6-25-OH维生素D2、D6-1,25(OH)2维生素D3、D6-1,25(OH)2维生素D2。
具有MB338的THC或HU210的冠醚衍生物的分子离子[M+NH4 +]显示在下面作为前体-产物离子对的MRM转变：
可以通过一些参数评估本文所述的方法，所述参数包括例如，准确度、精确度、检测极限(LOD)、定量限(LOQ)、线性范围、特异性、选择性、线性度、强度、和系统适用性。方法的精确度是分析方法准确性的测定，或测定值与作为常规真实值接受的值或接受的参比值之间的一致性的接近度。该方法的精确度是当过程重复应用于同质样品的多个采样时，个体测试结果间的一致性的程度。因此，精确度评估了1)在分析内的变异性；2)日内变异性(可重复性)；以及3)日之间变异性(中间精确度)；和4)在实验室之间变异性(重现性)。变异系数(CV％)是相对于观察到的平均值或者理论平均值表达的精确度的定量测定。方法的检测极限(LOD)是指产生显著不同于阴性对照或者空白的信号的分析物的浓度、并且表示可以与背景进行区分的分析物最低浓度。
本发明的定量限(LOQ)是能够用可接受准确度和精确度测定的样品中分析物的最低浓度和最高浓度。定量的最低限是指检测方法可以始终从背景测定出的最低剂量。定量的上限是指在发生信号饱和之前检测方法始终能够测定出的最高剂量。方法的线性范围是指定量的下限和上限之间的区域。线性范围通过将定量的上限减去定量的下限进行计算。如本文所用，术语“下渐近线的信噪比”是指在检测下限处该方法中检测到的信号除以背景信号。如本文所用，术语“上渐近线的信噪比”是指在检测上限处该方法中检测到的信号除以背景信号。
如本文所用，体液样品中分析物的“量”通常是指反映体液体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，量也可以考虑相对于另一分析物的量的相对量。例如，体液中分析物的量可以是大于正常存在的对照水平或正常水平的分析物量。
本发明方法、试剂和试剂盒可用于感兴趣分析物的定量或检测。
实施方式部分
实施方式1是用于确定测试样品中一种或多种分析物存在的方法，所述方法包括：
a)用固相萃取、载液萃取(SLP)和液液萃取(LLP)中的一种或多种从测试样品中萃取和纯化分析物；
b)用冠醚衍生试剂使得分析物衍生化；
c)使用液相色谱和/或质谱检测所衍生的分析物。
在实施方式1的一方面中，所述分析物是具有伯胺或酚羟基的化合物。在另一方面，所述分析物是药物、激素、信号剂、氨基酸或杀虫剂。在一特定方面，所述分析物是单胺神经递质，包括维生素D或其衍生物或代谢物之一、性激素或其衍生物或代谢物之一、大麻素或其衍生物或代谢物之一，阿片试剂、阿片样物质或其衍生物或代谢物之一、或芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一、安非他明或其衍生物或代谢物之一。例如，单胺神经递质是组胺、色胺、5-羟色胺或胍丁胺。类似地，性激素或其衍生物或代谢物之一是雌激素。此外，维生素D的衍生物是25-OH D3、25-OH D2、24,25-(OH)2D3、1,25-(OH)2D3和1,25-(OH)2D2，胆钙化醇，25-羟基胆钙化醇，1α,25-二羟基胆钙化醇，麦角钙化醇，1α,25-二羟基麦角钙化醇，22,23-双氢麦角钙化醇，1α,24R,25-三羟基胆钙化醇，(6Z)-他沙洛尔，速甾醇3，异维生素D3，二氢速甾醇3。
在实施方式1的另一方面，大麻素(cannabinoid)或其衍生物或代谢物之一是大麻萜酚型(CBG)大麻素、大麻环萜酚型(CBC)大麻素、大麻二酚型(CBD)大麻素、大麻联苯二酚型(CBND)大麻素、四氢大麻酚型大麻素(THC)、大麻酚型(CBN)大麻素、大麻三醇型(CBT)大麻素、六氢次大麻呋酚型(CBE)大麻素、异大麻素、大麻环酚型(CBL)大麻素、大麻二吡喃环烷型(CBT)大麻素或大麻色满酮型(CBCN)大麻素。类似地，阿片试剂、阿片样物质、或者阿片试剂或阿片样物质衍生物或代谢物是吗啡、东罂粟碱、吗啡酮、氢化吗啡酮、或氧吗啡酮。在一个特定方面中，所述阿片试剂、阿片样物质、或阿片试剂或阿片样物质的衍生物或代谢物是苄基异喹啉生物碱、半合成苄基异喹啉生物碱衍生物，或阿片样物质。
在另一方面，芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一是替来他明、3-甲氧他胺(3-Methoxetamine，MXE)、甲氧氯胺酮(Methoxyketamine)、N-乙基诺勒他明(N-Ethylnorletamine，爱科他明(Ethketamine))、安非他明、麻黄素(Ephedrine)、或甲基安非他明。
在其它方面中，安非他明或其衍生物或代谢物之一是安非他明(本身)、甲基安非他明(methamphetamine)、麻黄碱(ephedrine)、卡西酮、3,4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，"摇头丸")和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或"STP")。
在实施方式1的特定方面中，所述固相萃取用离子交换柱或筒进行。例如，在一个特定方面中，离子交换柱是阳离子交换柱。例如，阳离子交换柱可以是弱阳离子交换柱。在另一特定方面中，离子交换柱是阴离子交换柱。在另一方面中，所述固相萃取用反相二氧化硅柱或筒进行。例如，反相二氧化硅是烷基结合的(C4、C8、C12或C18)二氧化硅、氰基结合的二氧化硅，苯基结合的二氧化硅、苯基结合的二氧化硅、或联苯基结合的二氧化硅。
在实施方式1中，所述样品是生物样品、土壤样品、或食品样品。在另一特定方面中，所述生物样品是血液样品、唾液样品、泪液样品、尿液样品、或组织样品。例如，所述血液样品是全血样品、血浆样品、或血清样品。
在第二具体实施方式中，本发明涉及具有衍生试剂的衍生化试剂。一方面，冠醚衍生试剂包括：。冠醚、连接物、与分析物结合的官能团。在另一特定方面，所述冠醚包括一个环，并且所述环是12-30元环。在其它方面，所述环具有12-30个成环原子，其中8-20个原子是碳。在另一方面，非碳的成环原子选自氧、氮、和硫。在特定方面中，所述冠醚选自：可选地具有一个或多个氧取代了杂原子的12-冠醚-4、15-冠醚-5、16-冠醚-4、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8。
在特定方面中，所述连接物是C1-C12直链烷基、支链烷基和/或环烷基，并且甚至进一步，所述连接物可以是与冠醚稠合的酚环。
在实施方式1的特定方面中，所述与分析物结合的官能团是酰化基团、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、烷氧基胺、酰肼、醇、或胺。例如，在一特定方面中，酰化基团是式2的酰化剂：
其中A是分析物，并且X是连接物。例如，在特定方面中，与分析物结合的基团是酰化剂，所述酰化剂是酰氯或酰卤。
在特定方面，冠醚衍生试剂选自组I的试剂(如上所述)。一方面，衍生试剂是MB338。另一方面，衍生试剂选自组II的试剂(如上所述)。一方面，衍生试剂是MB409。另一方面，衍生试剂选自组III的试剂(如上所述)。另一方面，衍生试剂选自组IV的试剂。
然而，可以将任何衍生试剂纳入衍生化试剂、并且/或者在第一实施方式的方法中使用。
特别是，在实施方式1的分析物具有伯胺和仲胺、脂肪族羟基或酚羟基的情况下，可以试样酰化剂。一方面，所述酰化剂是酰氯或酰卤。在一特定方面中，冠醚衍生试剂选自组I的试剂(如上所述)。一方面，衍生试剂是MB338。另一方面中，当分析物是氨基酸或其代谢物或衍生物、雌激素或其代谢物或衍生物、THC或其代谢物或衍生物、或者HU210或其代谢物或衍生物时，可以使用酰化剂。
此外，当分析物具有顺式二烯基团时，冠醚衍生试剂可以选自组II的试剂(如上所述)。一方面，衍生试剂是MB409。
一方面，如上文更全面描述地，分析物可以是维生素D、其类似物、或其代谢物。
甚至此外，当分析物具有醛或酮时，冠醚衍生试剂可以选自组III的试剂(如上所述)。在一特定方面中，分析物是睾酮或其代谢物、或含有酮或醛的类固醇。
当分析物是脂肪酸、生物素或单甲基丙二酸(MMA)时，冠醚衍生试剂可以选自组IV的试剂(如上所述)。
在其它实施方式中，衍生试剂通过添加一种或多种溶剂或添加剂纳入衍生化试剂中，随后可以整合到用于分析一种或多种特定分析物的试剂盒中。
在另一实施方式中，质谱包括串联质谱技术，所述串联质谱技术包括LC-MS/MS技术，例如大气压化学电离(APCI)技术，电喷雾电离(EIS)技术；在多反应检测(MRM)或选择反应监测(SRM)中使用三重四极质谱仪，正离子模式；Q1扫描调整到选择对应于用于产物优化的所需分析物的酰化衍生物[M+H]+、或[M+NH4]+、或[M+A+H]+的前体离子，其中A是分子加合物。分析物的检测可以是定性或定量的。
本说明书各方面可以按如下进行描述：
1.用于确定测试样品中一种或多种分析物存在的方法，所述方法包括：
a)用固相萃取、载液萃取(SLP)和液液萃取(LLP)中的一种或多种从测试样品中萃取和纯化分析物；
b)用冠醚衍生试剂使得分析物衍生化；
c)使用液相色谱和/或质谱检测所衍生的分析物。
2.如实施方式1的方法，其中，所述分析物是具有伯胺或酚羟基的化合物。
3.如实施方式1或2的方法，其中，所述分析物是药物、激素、信号剂、氨基酸或杀虫剂。
4.如实施方式1-3的方法，其中，所述分析物是单胺神经递质，包括维生素D或其衍生物或代谢物之一，性激素或其衍生物或代谢物之一，大麻素或其衍生物或代谢物之一，阿片试剂、阿片样物质或其衍生物或代谢物之一，或芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一，安非他明或其衍生物或代谢物之一。
5.如实施方式4的方法，其中，所述单胺神经递质是组胺、色胺、5-羟色胺或胍丁胺。
6.如实施方式4的方法，其中，所述性激素或其衍生物或代谢物之一是雌激素。
7.如实施方式4的方法，其中，维生素D的衍生物是25-OH D3、25-OH D2、24,25-(OH)2D3、1,25-(OH)2D3和1,25-(OH)2D2，胆钙化醇，25-羟基胆钙化醇，1α,25-二羟基胆钙化醇，麦角钙化醇，1α,25-二羟基麦角钙化醇，22,23-双氢麦角钙化醇，1α,24R,25-三羟基胆钙化醇，(6Z)-他沙洛尔，速甾醇3，异维生素D3，二氢速甾醇3。
8.如实施方式4的方法，其中，大麻素(cannabinoid)或其衍生物或代谢物之一是大麻萜酚型(CBG)大麻素、大麻环萜酚型(CBC)大麻素、大麻二酚型(CBD)大麻素、大麻联苯二酚型(CBND)大麻素、四氢大麻酚型大麻素(THC)、大麻酚型(CBN)大麻素、大麻三醇型(CBT)大麻素、六氢次大麻呋酚型(CBE)大麻素、异大麻素、大麻环酚型(CBL)大麻素、大麻二吡喃环烷型(CBT)大麻素或大麻色满酮型(CBCN)大麻素。
9.如实施方式4的方法，其中，所述阿片试剂、阿片样物质、或阿片试剂或阿片样物质的衍生物或代谢物是吗啡、东罂粟碱、吗啡酮、氢化吗啡酮、或氧吗啡酮。
10.如实施方式4的方法，其中，所述阿片试剂、阿片样物质、或阿片试剂或阿片样物质的衍生物或代谢物是苄基异喹啉生物碱、半合成苄基异喹啉生物碱衍生物，或阿片样物质。
11.如实施方式4的方法，其中，所述芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一是替来他明、3-甲氧他胺(MXE)、甲氧氯胺酮、N-乙基诺勒他明(爱科他明)、安非他明、麻黄素、或甲基安非他明。
12.如实施方式4的方法，其中，安非他明或其衍生物或代谢物之一是安非他明(本身)、甲基安非他明、麻黄碱、卡西酮、3,4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，"摇头丸")和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或"STP")。
13.如实施方式1-12的方法，其中，固相萃取用离子交换柱或筒进行。
14.如实施方式13的方法，其中，所述离子交换柱是阳离子交换柱。
15.如实施方式14的方法，其中，所述离子交换柱是弱阳离子交换柱。
16.如实施方式13的方法，其中，所述离子交换柱是阴离子交换柱。
17.如实施方式1-13的方法，其中，固相萃取用反相二氧化硅柱或筒进行。
18.如实施方式17的方法，其中，反相二氧化硅柱是烷基结合的(C4、C8、C12或C18)二氧化硅、氰基结合的二氧化硅，苯基结合的二氧化硅、苯基结合的二氧化硅、或联苯基结合的二氧化硅。
19.如实施方式1-18的方法，其中，所述样品是生物样品、土壤样品、或食品样品。
20.如实施方式19的方法，其中，所述生物样品是血液样品、唾液样品、泪液样品、尿液样品、或组织样品。
21.如实施方式20的方法，其中，所述血液样品是全血样品、血浆样品、或血清样品。
22.如实施方式1-21的方法，其中，所述冠醚衍生试剂包括：冠醚、连接物、及与分析物结合的官能团。
23.如实施方式22的方法，其中，所述冠醚包括一个环，并且所述环是12-30元环。
24.如实施方式23的方法，其中，所述环具有12-30个成环原子，其中8-20个原子是碳。
25.如实施方式24的方法，其中，非碳的成环原子选自氧、氮、和硫。
26.如实施方式25的方法，其中，所述冠醚选自：可选地具有一个或多个氧取代了杂原子的12-冠醚-4、15-冠醚-5、16-冠醚-4、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8。
27.如实施方式22-26的方法，其中，所述连接物是C1-C12直链烷基、支链烷基和/或环烷基。
28.如实施方式22-27的方法，其中，所述连接物是与冠醚稠合的酚环。
29.如实施方式22-28的方法，其中，所述与分析物结合的官能团是酰化基团、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、烷氧基胺、酰肼、醇、或胺。
30.如实施方式1-29中任一项的方法，其中，所述酰化基团是式2的酰化剂：
其中A是分析物，并且X是连接物。
31.如实施方式30所述的方法，其中，所述酰化剂是酰氯或酰卤。
32.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述冠醚衍生试剂选自组I的试剂：
33.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述衍生试剂是MB338。
34.如实施方式30-33中任一项的方法，其中，所述分析物具有伯胺和仲胺、脂肪族羟基或酚羟基。
35.如实施方式34的方法，其中，分析物是氨基酸或其代谢物或衍生物、雌激素或其代谢物或衍生物、THC或其代谢物或衍生物、或者HU210或其代谢物或衍生物。
36.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述冠醚衍生试剂选自组II的试剂：
37.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述衍生试剂是MB409。
38.如实施方式36或实施方式37的方法，其中，所述分析物具有顺式二烯基团。
39.如实施方式38的方法，其中，所述分析物是维生素D、其类似物、或其代谢物。
40.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述衍生试剂选自组III的试剂：
41.如实施方式40的方法，其中，所述分析物具有醛或酮。
42.如实施方式41的方法，其中，分析物是睾酮或其代谢物、或含有酮或醛的类固醇。
43.如实施方式1-31中任一项的方法，其中，所述冠醚衍生试剂选自组IV的试剂：
44.如实施方式43的方法，其中，所述分析物是脂肪酸、生物素或单甲基丙二酸(MMA)。
45.如实施方式1-44中任一项的方法，其中，所述质谱包括串联质谱技术。
46.如实施方式1-45中任一项的方法，其中，所述质谱包括LC-MS/MS技术。
47.如实施方式46的方法，其中，LC-MS/MS技术包括大气压化学电离(APCI)技术、或电喷雾电离(EIS)技术。
48.如实施方式46的方法，其中，LC-MS/MS技术包括在多反应检测(MRM)或选择反应监测(SRM)中使用三重四极质谱仪，正离子模式。
49.如实施方式48的方法，其中，LC-MS/MS技术包括将Q1扫描调整到选择对应于用于产物优化的所需分析物的酰化衍生物[M+H]+、或[M+NH4]+、或[M+A+H]+的前体离子，其中A是分子加合物。
50.如实施方式1-49中任一项的方法，其中，分析物的检测是定性或定量的。
51.用于质谱的具有衍生试剂的衍生化试剂，所述衍生试剂包含：冠醚、连接物、及与分析物结合的官能团。
52.如实施方式51的衍生化试剂，其中，所述冠醚包括一个环，并且所述环是12-30元环。
53.如实施方式52的衍生化试剂，其中，所述环具有12-30个成环原子，其中8-20个原子是碳。
54.如实施方式53的衍生化试剂，其中，非碳的成环原子选自氧、氮、和硫。
55.如实施方式51-54的衍生化试剂，其中，所述冠醚选自：可选地具有一个或多个氧取代了杂原子的12-冠醚-4、15-冠醚-5、16-冠醚-4、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8。
56.如实施方式51-55的衍生化试剂，其中，所述连接物是C1-C12直链烷基、支链烷基和/或环烷基。
57.如实施方式51-56的衍生化试剂，其中，所述连接物是与冠醚稠合的酚环。
58.如实施方式51-57的衍生化试剂，其中，所述与分析物结合的官能团是酰化基团、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、烷氧基胺、酰肼、醇、或胺。
59.如实施方式51-58任一项的衍生化试剂，其中，所述酰化基团是式2的酰化剂：
其中A是分析物，并且X是连接物。
60.如实施方式59所述的衍生化试剂，其中，所述酰化剂是酰氯或酰卤。
61.如实施方式51-60任一项的衍生化试剂，其中，所述冠醚衍生试剂选自组I的试剂：
62.如实施方式51-61中任一项的衍生化试剂，其中，所述衍生试剂是MB409。
63.如实施方式51-61任一项的衍生化试剂，其中，所述冠醚衍生试剂选自组II的试剂：
64.如实施方式51-61中任一项的衍生化试剂，其中，所述衍生试剂是MB409。
65.如实施方式51-60中任一项的衍生化试剂，其中，所述衍生试剂选自组III的试剂：
66.如实施方式51-58中任一项的衍生化试剂，其中，所述冠醚衍生试剂选自组IV的试剂：
实施例
提供以下非限制性实施例仅用于说明性目的，以便于更完整地理解所公开的主题。这些实施例不应当构成限制任何本说明书中所述实施方式，包括涉及用于检测分析物的方法、包括进行所公开方法必要组件的试剂盒的那些。
实施例1
血浆中1,25-二羟基维生素D的定量
样品收集
从人类患者的血液获取血浆样品。样品被抽取(血浆肝素钠&EDTA)至预冷的抽血管中。真空抽血管翻转5次并冷冻直至离心。在30分钟收集时间内血浆在冷冻离心分离机(1000xg，10分钟)中进行分离，然后在塑料小瓶中于-20℃立即冻存。
将血浆解冻并稀释，然后用于固相萃取。
标准物
空白、校准样品和血浆样品中掺混内标物(例如，D6-1,25(OH)2维生素D3和/或D6-,25(OH)2维生素D2)。
采用掺混已知量的1,24-二羟基维生素D的血浆溶液绘制标准曲线。掺混溶液连续稀释，然后加入从相同血浆样品获取的血浆中。
萃取
(3cc/15mg)柱用1.0ml的甲醇处理，随后用1ml的去离子水处理。
然后，200μL样品与1mL 28％异丙醇水溶液混合。10μL内标物与1mL28％异丙醇水溶液混合。将样品/缓冲液混合物在2-3psi的压力下加载到柱上。柱用1mL 28％异丙醇水溶液在6psi下进行洗涤。柱在氮气流下于室温干燥8分钟，或者在氮气流下加热至45℃干燥4分钟。
使用0.8ml的洗脱缓冲液(20％乙酸乙酯在己烷中)从柱中洗脱样品。
在氮气流下加热至40℃，使得溶剂蒸发4分钟。萃取物液用乙酸乙酯(100μL)重构。
萃取物按如下进行衍生：
将溶于乙酸乙酯的MB409(冠醚衍生化试剂)(1mg/mL，5μL)加入到重构的萃取物中，并且旋涡处理20秒。衍生化反应在室温下进行30分钟。通过加入20μL甲醇并旋涡处理10秒停止反应。通过用氮气蒸发3分钟将衍生的分析物浓缩。浓缩的分析物用50μL乙腈/NH4CO2H(50mM)(以3:1)进行重构。
将重构的分析物加载至自动取样器上用于LCMS分析。
LC-MS/MS分析
将从甲酸铵反应获得的10μL溶液自动注入C18 3μm粒度50x2.1mm分析柱。对分析柱采用二元HPLC梯度，从而将1,25-二羟基维生素D的冠醚衍生物与样品中获得的其他分析物分离。流动相A是含0.1％甲酸、pH为3.0的5.0mM甲酸铵，流动相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在35℃的温度、流速600μl/分钟下按如下进行5分钟：
使用与Agilent 1200二元LC泵相连的用于检测的AB Sciex 4000QTrap，由分析家(Analyst)软件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多伦多)控制进行MS/MS。从HPLC分析柱排出的分析物通过流动相流动到MS/MS分析仪的加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管道中转化为蒸汽。雾化溶剂中的分析物通过加热的电喷雾电离源进行电离。
离子通过第一四极(Q1)，所述第一四极选择具有由分析物之一产生的母离子的质荷比的离子。进入四极2(Q2)的离子与碰撞气体碰撞以产生离子碎片，所述离子碎片穿过四极3(Q3)用于进一步选择。同时，用内标物(D6-1.25(OH)2维生素D3和/或D6-1,25(OH)2维生素D2)进行采用同位素稀释质谱的相同过程。在来自相同样品注射的正极上的确认期间，将以下质量转变用于检测并定量的1,25-二羟基维生素D(及其相应的内标物)。
结果：
结果证实了用于萃取1,25-二羟基维生素D的自动方法。该方法通过使用与Agilent 1200二元LC泵相连的用于检测的AB Sciex 4000QTrap提供了对于5pg mL-20ng/mL标准物曲线的两种化合物的良好线性响应，并且对于1,25-二羟维生素D，LOD为10pg/mL的血浆。
实施例2
口腔液中THC或HU210的定量
样品收集
使用QUANTISALTM(Immunalysis公司，加利福尼亚)从人体获取口腔样品。使用来自QUANTISAL的收集装置从患者获取唾液，并且将试样冷藏并最终冷冻。将唾液解冻，然后用于本发明的定量方法。
标准物
空白、校准样品和血浆样品掺混内标物(例如，THC-d3)。
用掺混已知量的THC或HU210(合成大麻素)的唾液溶液绘制标准曲线。掺混溶液连续稀释，然后加入从相同口腔样品获取的唾液中。
萃取
(3cc/15mg)柱用0.5ml的甲醇处理，随后用0.5ml的0.1％HCL(6M)水溶液处理。
然后，300μL的口腔液在QUANTISALTM缓冲液(25％体积/体积)中。加入10μL内标物和600μL的100mM pH6的磷酸盐缓冲液。将样品/缓冲液混合物在2-3psi的压力下加载到柱上。柱用1mL的去离子水洗涤，然后用1mL 20％甲醇水溶液在2-3psi下进行洗涤。柱在氮气流下于室温干燥8分钟，或者在氮气流下加热至45℃干燥4分钟。
使用0.8ml的洗脱溶剂(20％乙酸乙酯在己烷中)从柱中洗脱样品。
在氮气流下加热至40℃，使得溶剂蒸发8分钟。萃取物用乙腈(50μL)K2CO3(50mM,25μL)重构。将溶于乙腈的MB388(冠醚衍生化试剂)(10mg/mL，5μL)加入到重构的萃取物中，并且旋涡处理20秒。衍生化反应在室温下进行30分钟。通过加入20μL碳酸氢铵(300mM)停止反应。
将重构的分析物加载至自动取样器上用于LCMS分析。
LC-MS/MS分析
将从甲酸铵反应获得的10μL溶液自动注入C18(2.7μm粒度50x 2.1mm分析柱。对分析柱采用二元HPLC梯度，从而将THC或HU210的冠醚衍生物与样品中获得的其他分析物分离。
流动相A是含0.1％甲酸、pH为3.0的5.0mM甲酸铵，流动相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在35℃的温度、流速600μl/分钟下按如下进行5分钟：
采用API 5000三重四极质谱仪，由分析家(Analyst)软件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多伦多)控制进行MS/MS。从HPLC分析柱排出的分析物通过流动相流动到MS/MS分析仪的加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管道中转化为蒸汽。雾化溶剂中的分析物通过加热的电喷雾电离源进行电离。
离子通过第一四极(Q1)，所述第一四极选择具有由分析物之一产生的母离子的质荷比的离子。进入四极2(Q2)的离子与碰撞气体碰撞以产生离子碎片，所述离子碎片穿过四极3(Q3)用于进一步选择。同时，用内标物((-)-□-9-THC(D3))进行采用同位素稀释质谱的相同过程。在来自相同样品注射的正极上的确认期间，以下质量转变用于检测并定量的THC或HU210(及其相同内标物)。
结果:
表4显示THC标准曲线的结果。
表4：THC标准曲线数据
表5显示H210标准曲线的数据。
表5：H210数据
表4和表5显示了表示来自掺混有250fg/mL-2ng/mLTHC或HU210血浆样品的THC或HU210的回收率百分比的数据。LLOD：柱上200fg，LLOQ：柱上400fg。分析物LLOD为20pg/mL，并且LLOQ为40pg/mL，并且萃取75μL的唾液。分析物的回收率为80-92％。图2A和2B显示对于THC和HU210的线性回归。
结果说明了用于从口腔液萃取THC和HU210的自动方法。该方法通过使用与一对Shimadzu 20AD LC泵相连的用于检测的AB Sciex 5000提供了对于250fg/mL-20ng/mL标准物曲线的两种化合物的良好线性响应，并且对于THC和HU210，LOD为1pg/mL的口腔液。
实施例3
血浆中雌二醇/雌三醇/雌酮/17β-雌二醇-1,25-13C3的定量
样品收集
从人类患者的血液获取血浆样品。样品被抽取(血浆肝素钠&EDTA)至预冷的抽血管中。真空抽血管翻转5次并冷冻直至离心。在30分钟收集时间内血浆在冷冻离心分离机(1000xg，10分钟)中进行分离，然后在塑料小瓶中于-20℃立即冻存。
将血浆解冻并稀释，然后用于固相萃取。
标准物
空白、校准样品和血浆样品掺混内标物(例如，17β-雌二醇-2,3,4-13C3)。
采用掺混已知量的雌二醇或雌酮的血浆溶液绘制标准曲线。掺混溶液连续稀释，然后加入从相同血浆样品获取的血浆中。
萃取
A(1cc/15mg)柱用1.0ml的甲醇处理，随后用0.5ml的去离子水处理。
然后，100μL样品与0.5mL水混合。加入另外0.5mL的水。将样品/缓冲液混合物在2-3psi的压力下加载到柱上。柱用1mL 20％异丙醇水溶液在6psi下进行洗涤。柱在氮气流下于室温干燥10分钟，或者在氮气流下加热至45℃干燥5分钟。
使用0.7ml的洗脱溶剂(8:20己烷：乙酸乙酯)从柱中洗脱样品。
在氮气流下加热至40℃，使得溶剂蒸发4分钟。萃取物用乙腈(50μL)K2CO3(50mM,25μL)重构。
萃取物按如下进行衍生：
将溶于乙腈的MB388(冠醚衍生化试剂)(10mg/mL，5μL)加入到重构的萃取物中，并且旋涡处理20秒。衍生化反应在室温下进行30分钟。通过加入20μL碳酸氢铵(300mM)停止反应。
将重构的分析物加载至自动取样器上用于LCMS分析。
LC-MS/MS分析
将从甲酸铵反应获得的10μL溶液自动注入C18(3μm粒度50x 2.1mm分析柱。对分析柱采用二元HPLC梯度，从而将雌二醇或雌酮的冠醚衍生物与样品中获得的其它分析物分离。流动相A是含0.1％甲酸、pH为3.0的5.0mM甲酸铵，流动相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在35℃的温度、流速600μl/分钟下按如下进行5分钟。
使用与Agilent 1200二元HPLC泵相连的用于检测的API 4000QTRAP三重四极质谱仪，由分析家(Analyst)软件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多伦多)控制进行MS/MS。从HPLC分析柱排出的分析物通过流动相流动到MS/MS分析仪的加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管道中转化为蒸汽。雾化溶剂中的分析物通过加热的电喷雾电离源进行电离。
离子通过第一四极(Q1)，所述第一四极选择具有由分析物之一产生的母离子的质荷比的离子。进入四极2(Q2)的离子与碰撞气体碰撞以产生离子碎片，所述离子碎片穿过四极3(Q3)用于进一步选择。同时，用内标物进行采用同位素稀释质谱的相同过程。
在来自相同样品注射的正极上的确认期间，以下质量转变用于检测并定量的雌二醇或雌酮(及其对应内标物)。
该方法是用于从100μL血浆萃取雌酮(E1)和17β-雌二醇(E2)的自动方法。该方法通过使用与Agilent 1200HPLC相连的用于检测的AB Sciex Qtrap4000提供了对于5-500pgmL的两种化合物的良好线性响应，并且对于雌二醇，LOD为5pg/mL，对于雌酮，LOD为10ng(参见图3A和3B)。
其它实验验证了在图表范围中雌酮和雌二醇的检测，并且对于两种化合物，LOQ为10pg/mL。雌酮和雌二醇的绝对回收率为＞90％(参见图4A，另外的色谱)。
为了测试变异性，将10个重复样品掺入浓度为100pg/mL。随后萃取和分析显示出对于雌酮和雌二醇为7.6％和8.6％CSV(数据未显示)。
最后，将来自10位志愿者的血浆对雌二醇和雌酮进行重复测定并进行分析。所有样品中雌酮和雌二醇的水平对应于在健康成年人中发现的生理水平(参见图4B)。女性(例如，患者)取决于生育和健康因素具有宽范围的雌激素水平，并且分析物能够测定这些值的全部范围。
最后，应该理解的是，虽然本说明书的各方面通过参照特定实施方式进行强调，但是本领域技术人员将容易地理解，这些公开的实施方式仅仅阐述说明本文所公开主题的原理。因此，应当理解，所公开的主题并不局限于本文所公开的特定化合物、组合物、制品、设备、方法、方案和/或试剂等，除非有如此的表述。此外，本领域普通技术人员认识到根据本文的教导，可进行某些改变、修改、排列、选择、添加、减少、以及其子组合而不背离本发明的精神和范围。因此，所附权利要求书和之后引入的权利要求旨在包括所有这类改变、修改、排列、选择、添加、减少、以及其子组合，如在其真正精神和范围内中那样。
本文描述了本发明的某些实施方式，包括本发明人已知的实施本发明所需的最佳模式。当然，阅读以上说明书后，所述实施方式的变型对本领域普通技术人员将是显而易见的。本发明人预期，普通技术人员将适当地利用这些变型，并且本发明人旨在使本发明以本文具体描述之外其它方式实施。因此，根据申请原则，本发明包括所附权利要求书所涉及主题的所有修改和等同形式。而且，所有可能的变型中的上述要素的任意组合包括在本发明范围内，除非另有说明或者清楚指出相反。
本发明的可选实施方式、要素或步骤的分组不应解释为限制性的。各组成员都可被单独提及并要求保护，或与本文公开的其它组成员的任意组合。预计出于便利和/或专利性的原因，组中可以包括或者删除一个或多个成员。在发生任何这种包括或者删除时，认为说明书包括经修饰的组，因而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markushgroup)的书写描述。
除非另有说明，本说明书和权利要求书所用的表示特征、项目、含量、参数、性质、术语等的所有数值应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”表示限定的特征、项目、数量、参数、属性涵盖了在所述特征、项目、数量、参数、特性或属性的值之上或之下加上或减去10％。因此，除非有相反说明，以下说明书和所附权利要求中所述的数值参数是近似值。例如，质谱分析仪可以在测定给定分析物的质量时轻微变化，术语离子质量或离子的质/荷比的“约”是指+/-0.50原子质量单位。并非试图限制将等同原则应用在权利要求的范围，最起码，每个数值指示少应根据所记录的有效数字的位数并考虑到运用了常用的四舍五入规则进行解释。
参考一个实施方式或实施方式的一方面中，使用术语“可”或“可能”还带有“不”或“不能”的替代含义。这样，如果本说明书公开的实施方式或实施方式的一方面可以是或者可能被包含作为本发明的主题的一部分，则负面限制或排除条件也明确表示，也就是说一个实施方式或者实施方式的一个方面可以不是或不能被包含作为本发明的主题。以类似的方式，使用术语"任选地"参考一个实施方式或实施方式的一方面意味着这样的实施方式或实施方式的方面可以被包括作为本发明主题的部分或可以不被包括作为本发明的主题。无论这种负面限制或是禁入条件应用将基于负面限制或排除条件叙述在所要求保护的主题。
虽然限定本发明宽泛范围的数值范围和值是近似值，但是具体实施例中列出的数值范围和值是尽可能准确记录的。然而，任何数值范围或值不可避免地包含由其各自的实验测定中存在的标准偏差所必然造成的某些误差。本文中对数值范围的引用仅仅意图用作一种速记方法，单独表示落在该范围内的各个独立的值。除非另有说明，否则，各个独立的数值范围包括在说明书范围内，如同它们被单独引用。
描述本发明的内容时使用的术语“一个”、“一种”、“该”等类似表达(尤其在权利要求书的内容中)应解释为涵盖单数和复数，除非另有说明或者清楚指出相反。此外，例如“第一”、“第二”、“第三”等用于识别元件的常规指示用于在元件之间进行区分，除非另有说明，否则，并不表示或暗示该元件的所需数量或限制数量，并且不表示该元件的特定位置或顺序。所有本文所述的方法可以任何合适的顺序进行，除非另有说明或上下文明确另有所指。本文涉及的任何和所有实施例，或者示例性的语言(例如，“例如”)的使用仅仅是为了更好地阐述本发明，而不是对本发明范围的限制。本发明说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明实施必需的非要求的元件。
当在权利要求中使用时，无论是否提交或添加每个修改，开放式连接词"包括"(及其等效的开放式连接词，比如包含、含有、及具有)包括：仅所有明确陈述的元件、限制、步骤和/或特征，或者与未陈述主题结合；所命名元件、限制和/或特征是必不可少的，但其它未命名元件、限制和/或特征可以进行添加，并且仍然形成在权利要求范围内的构造。本文所公开的具体实施方式可以进一步限制于使用“由……组成”或“基本由……组成”封闭式连接词的权利要求书中。当在权利要求中使用时，无论是提交时的或是在每次修改添加，封闭式连接术语“由……组成”不包括没有在该权利要求中明确描述的任何元件、限制、步骤或特征。封闭式连接词“基本由……组成”将权利要求的范围限定为所述明确描述的元件、限制、步骤和/或特征，以及不会实质上影响所保护主体的基础和新颖特性的任何其它元件、限制、步骤和/或特征。因此，开放式连接词“包括”的意思是限定为包括所有特别描述的元件、限制、步骤和/或特征、以及任何可选的、额外的非特定的那些。封闭式连接词“由……组成”的意思是限定为仅仅包括在权利要求书中具体描述的那些元件、限制、步骤、和/或特征，而封闭式连接词“基本由……组成”的意思是限定为仅仅包括在权利要求书中具体描述的那些元件、限制、步骤、和/或特征，以及不会实质上影响所保护主体的基础和新颖特性的那些元件、限制、步骤和/或特征。因此，在进行限制的情况下，开放式连接词“包括”(及其等效的开放式连接词)在其意思中包括通过封闭式连接词“由……组成”或“基本由……组成”指定的所保护主体。在本文中所描述或以词语"包含"所要求保护的这些实施方式明确或暗示地毫无疑义地描述、实现和支持本文中的词语“基本由……组成”和“由……组成”。
在本说明书中引用并标识的所有专利、专利出版物和其它出版物被单独且明确地以引用方式全文并入本文，用于描述和公开的目的，例如，这些出版物中描述的组合物和方法可以与本发明结合使用。本文讨论的出版物仅提供针对其在本申请提交日之前的公开。在这方面，不应被解释为承认本发明人无权凭借在先发明或任何其它原因早于这些公开的日期。因此，所有关于日期或表示为这些文档的内容的声明是基于申请人可获得的信息，不构成对这些文献的日期或内容的正确性的任何认可。
最后，在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例的目的，而不是用来限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。因此，本发明并不限于具体所示和所述的内容。

Claims (21)

1.用于确定测试样品中一种或多种分析物存在的方法，所述方法包括：
a)用固相萃取、载液萃取(SLP)和液液萃取(LLP)中的一种或多种从测试样品中萃取和纯化一种或多种分析物；
b)用冠醚衍生试剂使得所述一种或多种分析物衍生化；
c)使用液相色谱和/或质谱检测所述衍生的一种或多种分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物是药物、激素、信号剂、氨基酸或杀虫剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物是单胺神经递质，包括维生素D或其衍生物或代谢物之一、性激素或其衍生物或代谢物之一、大麻素或其衍生物或代谢物之一、阿片试剂、阿片样物质或其衍生物或代谢物之一、或芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一、安非他明或其衍生物或代谢物之一。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，单胺神经递质是组胺，色胺，5-羟色胺或胍丁胺；其中，性激素或其衍生物或代谢物之一是雌激素；其中，维生素D的衍生物是25-OH D3、25-OH D2、24,25-(OH)2D3、1,25-(OH)2D3和1,25-(OH)2D2，胆钙化醇，25-羟基胆钙化醇，1α,25-二羟基胆钙化醇，麦角钙化醇，1α,25-二羟基麦角钙化醇，22,23-双氢麦角钙化醇，1α,24R,25-三羟基胆钙化醇，(6Z)-他沙洛尔，速甾醇3，异维生素D3，二氢速甾醇3；其中，大麻素或其衍生物或代谢物之一是大麻萜酚型(CBG)大麻素、大麻环萜酚型(CBC)大麻素、大麻二酚型(CBD)大麻素、大麻联苯二酚型(CBND)大麻素、四氢大麻酚型大麻素(THC)、大麻酚型(CBN)大麻素、大麻三醇型(CBT)大麻素、六氢次大麻呋酚型(CBE)大麻素、异大麻素、大麻环酚型(CBL)大麻素、大麻二吡喃环烷型(CBT)大麻素或大麻色满酮型(CBCN)大麻素；其中，阿片试剂、阿片样物质或其衍生物或代谢物是吗啡、东罂粟碱、吗啡酮、氢化吗啡酮、氧吗啡酮、苄基异喹啉生物碱、半合成或苄基异喹啉生物碱衍生物；其中芳基环己胺或其衍生物或代谢物之一是替来他明、3-甲氧他胺(MXE)、甲氧氯胺酮、N-乙基诺勒他明(爱科他明)、安非他明、麻黄素、或甲基安非他明；或者其中，安非他明或其衍生物或代谢产物之一是安非他明(本身)、甲基安非他明、麻黄碱、卡西酮、3,4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA、“摇头丸”)和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或“STP”)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述固相萃取采用离子交换柱或筒进行，其中所述离子交换柱是阳离子交换柱、弱阳离子交换柱、或阴离子交换柱。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述固相萃取采用反相二氧化硅柱或筒进行。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反相二氧化硅是烷基结合的(C4、C8、C12或C18)二氧化硅、氰基结合的二氧化硅，苯基结合的二氧化硅、或联苯基结合的二氧化硅。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是生物样品、土壤样品、或食品样品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物样品是血液样品、唾液样品、泪液样品、尿液样品、或组织样品。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血液样品是全血样品、血浆样品、或血清样品。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述冠醚衍生试剂包括：冠醚、连接物、和与分析物结合的官能团基团。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述冠醚包括一个环，并且所述环是12-30元环。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述环具有12-30个成环原子，其中8-20个原子是碳，并且其中非碳成环原子选自氧、氮、和硫。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述冠醚选自：可选地具有一个或多个氧取代了杂原子的12-冠醚-4、15-冠醚-5、16-冠醚-4、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述连接物是C1-C12直链烷基、支链烷基和/或环烷基、或与冠醚稠合的酚环。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述与分析物结合的基团是酰化基团、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(TAD)、烷氧基胺、酰肼、醇、或胺。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述酰化基团是式2的酰化剂：
其中A是分析物，并且X是连接物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述酰化剂是酰氯或酰卤。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述冠醚衍生试剂选自组I、组II、组III或组IV的试剂：
组I；
组II；
组III；
组IV。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述衍生试剂是MB338或MB409。
21.用于质谱的具有衍生试剂的衍生化试剂，所述衍生试剂包含：冠醚、连接物、以及与分析物结合的官能团。
CN201680019469.7A 2015-03-28 2016-03-28 固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒 Pending CN108027353A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562139692P 2015-03-28 2015-03-28
US62/139,692 2015-03-28
PCT/US2016/024586 WO2016160741A1 (en) 2015-03-28 2016-03-28 Solid phase extraction, derivatization with crown ethers, and mass spectrometry, methods, reagents and kits

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108027353A true CN108027353A (zh) 2018-05-11

Family

ID=56974024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680019469.7A Pending CN108027353A (zh) 2015-03-28 2016-03-28 固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20160282371A1 (zh)
EP (1) EP3278100B1 (zh)
CN (1) CN108027353A (zh)
WO (1) WO2016160741A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111875811A (zh) * 2020-08-19 2020-11-03 常州大学 一种超分子聚合物及其制备方法和应用
CN113418829A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 厦门市产品质量监督检验院 一种4,4′-联苯二酚迁移量的检测方法
CN113905797A (zh) * 2019-06-14 2022-01-07 株式会社大赛璐 胺的基于液相色谱的分离方法
CN114007603A (zh) * 2019-04-24 2022-02-01 因美制药公司 用于使用大麻素进行神经保护的组合物和方法
CN115290796A (zh) * 2022-08-19 2022-11-04 广电计量检测(福州)有限公司 一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法
CN117805304A (zh) * 2024-02-29 2024-04-02 中国环境科学研究院 检测血液样品中激素的方法及试剂盒

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3278100B1 (en) * 2015-03-28 2023-06-14 Tecan SP, Inc. Methods and uses comprising solid phase extraction, derivatization with crown ethers, and mass spectrometry
CN106872621B (zh) * 2015-12-10 2020-11-03 国家食品安全风险评估中心 一种动物性样品中残留雌激素的提取净化方法
US11280802B2 (en) * 2016-05-26 2022-03-22 Academisch Ziekenhuis Groningen Methods and kits for the derivatization of a biogenic amine
US11619636B2 (en) 2016-12-19 2023-04-04 Metabolon, Inc. Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of kidney function metabolites
US12019002B2 (en) * 2019-07-03 2024-06-25 Pinpoint Testing, Llc Ready-to-extract platforms for chemical analysis and quantification of unknown samples using spiked matrix standards
CN111398490A (zh) * 2020-03-04 2020-07-10 上海睿质科技有限公司 质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒
AU2021269584A1 (en) * 2020-05-11 2023-01-19 Denise A. Valenti Method of testing tears as a biomarker for cannabinoids
CN112229918A (zh) * 2020-07-09 2021-01-15 中山大学 Uplc-ms/ms法测定海洛因成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用
US11585790B1 (en) 2020-07-31 2023-02-21 Pace Analytical Services, LLC Analytical herbicide detection technology
EP4232824A1 (en) * 2020-10-22 2023-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Detection of an analyte of interest by nanoesi mass spectrometry
CN114594170B (zh) * 2020-12-03 2024-05-17 复旦大学 一种磁固相萃取结合快速原位衍生化的体内药物分析方法
CN113267589B (zh) * 2021-03-18 2022-11-04 司法鉴定科学研究院 一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法
CN114414548B (zh) * 2021-12-23 2024-04-05 安徽中科赛飞尔科技有限公司 一种sers基底及其应用
WO2023155000A1 (en) * 2022-02-15 2023-08-24 Mcmaster University High throughput rapid screening of vitamin d
CN114441498B (zh) * 2022-03-01 2023-12-01 中国海洋大学 基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4902627A (en) * 1985-02-05 1990-02-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method for detecting amine-containing drugs in body fluids by sims
US5635404A (en) * 1993-03-29 1997-06-03 New York University Applications of electrospray ionization mass spectrometry to neutral organic molecules including fullerenes
US5854084A (en) * 1996-07-12 1998-12-29 Biotraces, Inc. Enhanced chromatography using multiphoton detection
US6716634B1 (en) * 2000-05-31 2004-04-06 Agilent Technologies, Inc. Increasing ionization efficiency in mass spectrometry
US7169329B2 (en) * 2003-07-07 2007-01-30 The Research Foundation Of State University Of New York Carbon nanotube adducts and methods of making the same
AU2008311114C1 (en) * 2007-10-08 2014-03-13 Blackeye Optics, Llc Liquid optics zoom lens and imaging apparatus
US7972868B2 (en) 2007-11-28 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
CA2783797C (en) * 2009-12-11 2021-06-08 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of non-derivatized, non-metabolized vitamin d
US9588130B2 (en) * 2012-04-18 2017-03-07 Waters Technologies Corporation Methods for quantifying polypeptides using mass spectrometry
US9377468B2 (en) * 2013-03-15 2016-06-28 Agilent Technologies, Inc. Ion mobility mass spectrometry tags for quantitative applications and methods thereof
EP3278100B1 (en) * 2015-03-28 2023-06-14 Tecan SP, Inc. Methods and uses comprising solid phase extraction, derivatization with crown ethers, and mass spectrometry

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPHEN R.WILSON等: "Applications of Electrospray Ionization Mass Spectrometry to Neutral Organic Molecules Including Fullerenes", 《JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY》 *
中国卫生检验杂志: "固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中5种生物碱", 《中国卫生检验杂志》 *
张琳等: "固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测尿样中的麻黄碱和N-甲基麻黄碱", 《色谱》 *
曾义: "高效液相色谱-质谱法检测血清中维生素D含量", 《中国药业》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114007603A (zh) * 2019-04-24 2022-02-01 因美制药公司 用于使用大麻素进行神经保护的组合物和方法
CN113905797A (zh) * 2019-06-14 2022-01-07 株式会社大赛璐 胺的基于液相色谱的分离方法
CN111875811A (zh) * 2020-08-19 2020-11-03 常州大学 一种超分子聚合物及其制备方法和应用
CN111875811B (zh) * 2020-08-19 2022-02-11 常州大学 一种超分子聚合物及其制备方法和应用
CN113418829A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 厦门市产品质量监督检验院 一种4,4′-联苯二酚迁移量的检测方法
CN115290796A (zh) * 2022-08-19 2022-11-04 广电计量检测(福州)有限公司 一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法
CN115290796B (zh) * 2022-08-19 2024-02-27 广电计量检测(福州)有限公司 一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法
CN117805304A (zh) * 2024-02-29 2024-04-02 中国环境科学研究院 检测血液样品中激素的方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016160741A1 (en) 2016-10-06
US20160282371A1 (en) 2016-09-29
US11513132B2 (en) 2022-11-29
US20190293667A1 (en) 2019-09-26
EP3278100A4 (en) 2018-08-29
EP3278100A1 (en) 2018-02-07
EP3278100B1 (en) 2023-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108027353A (zh) 固相萃取、用冠醚衍生化、以及质谱、方法、试剂和试剂盒
CN106794388A (zh) 分析物的提取、衍生化和定量
CN102812356B (zh) 多重样品中的甾族化合物的质谱法
CN103323561B (zh) 通过质谱法检测雌二醇的方法
JP6324321B2 (ja) 標識化学およびｌｃ−ｍｓｍｓを使用するエストラジオールおよびフェノール性ｏｈを有する分析物の分析
US11821889B2 (en) Vitamin B2 detection by mass spectrometry
US20140147878A1 (en) Lc-ms separation and detection of vitamin d metabolites
US11513130B2 (en) Detection of vitamins A and E by tandem mass spectrometry
AU2018275011A1 (en) Quantitation of tamoxifen and metabolites thereof by mass spectrometry
Chen et al. Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of four organoarsenic compounds in the feeds of swine and chicken
Douša et al. HPLC/UV/MS method application for the separation of obeticholic acid and its related compounds in development process and quality control
CN105092733B (zh) Lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的降低方法和装置
CN108802241A (zh) 一种注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的液相色谱-串联质谱定性分析方法
Song et al. Economical irregular silica as an effective dispersive solid-phase extraction sorbent for the quantification of calcitriol in soft capsules
CN105092745B (zh) 降低lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法和装置
Desai et al. ADVANCEMENTS IN LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY: METHOD DEVELOPMENT AND APPLICATIONS
Bråtveit LC-MS/MS Analysis of Thyroid Hormones in Blood Serum: Instrumental Method Development and Optimization of Extraction from Bovine Serum

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180511