CN115290796A - 一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法，涉及化学检测领域。本发明使用如下式所示的试剂进行衍生化反应，其中，R1，R2，R3各自独立地选自直链烷基；检测包括以下步骤：提取：样品与氨水混匀，得到待衍生液；衍生化：将衍生化试剂、缓冲液、有机溶剂混匀，和待衍生液混合，取上清液；纯化：将上清液过柱洗脱，洗脱液干燥后与流动相混匀，使用液相色谱质谱联用仪进行草甘膦及其代谢产物残留的检测。该检测方法响应值高、稳定性好、准确度高、得到的杂质少、污染少，响应迅速且不影响设备的性能，对农残检测具有广泛的应用前景。
Figure DDA0003806553770000011

Description

一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法
技术领域
本发明属于化学检测领域，具体涉及一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法。
背景技术
随着社会的发展和安全意识的提高，人们对药物残留的检测要求也越来越高，所需检测的项目也越来越多。部分药物由于分子结构特点，无法在常规设备中较好地分离，或在常规设备中响应值较低。因此，本领域技术人员常用需要将此类药物进行衍生化处理。样品的衍生化作用主要是把难于分析的物质转化为易于分析的物质，便于量化或分离。一般化学衍生化主要有以下目的：提高样品检测的灵敏度，改善样品混合物的分离度，适合于进一步做结构鉴定等。
衍生化试剂需要满足以下使用要求：反应条件温和、迅速、反应彻底，衍生化产物只有一种，副反应及过量衍生化试剂不影响待测物质的分离和检测。
草甘膦是一种有机膦类除草剂，是一种非选择性内吸传导型广谱灭生性除草剂，其化学名为N-膦羧甲基甘氨酸(N-phosphonomethyl-glycine，PMG)。草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)在植物中的残留已经引起世界的广泛关注。草甘膦的分子结构简单，分子量低，无发色基团，溶于水，不溶于有机溶剂，极性强。
本领域技术人员研究了多种草甘膦及其代谢物残留的检测方法：
SN/T 4655-2016采用水提取，经透析袋、RP柱及石墨化炭黑吸附剂净化后离心，液相色谱-质谱/质谱仪测定包含茶叶、小麦、玉米、大豆、柑橘、苹果大麦茶、棉籽油等植物源性食品中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留量。但由于检测需更换氨基色谱柱，降低设备的使用率，同时也增大了柱子漏液的风险。
SN/T 1923-2007使用水提取，经阳离子交换柱净化，在硼酸盐缓冲溶液环境下与9-芴基甲基三氯甲烷(Fmoc-Cl)常温衍生化反应过夜后过滤，用液相色谱-质谱/质谱测定大豆、玉米、大米、柑橙、茶叶、虾、鱼肉、畜禽肉、蜂蜜及香料中草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸残留量。但该方法中衍生化溶液直接进入质谱，其中的硼酸盐缓冲溶液为无机盐，在质谱中无法分解挥发，将会严重污染离子源甚至质谱内部四级杆等，对质谱将产生极强的抑制作用。
公开号为CN201810281233的中国发明专利公开了一种检测茶叶中草铵膦和草甘膦药物残留量的方法。发明选用氢氧化钠作为提取溶液，经HCl调酸度，PSA净化后，在硼酸盐缓冲溶液环境下以Fmoc-Cl在37℃下衍生化10-16小时后离心，过滤后用液相色谱-质谱联用仪测定。该方法中衍生化溶液直接进入质谱，其中的硼酸盐缓冲溶液为无机盐，在质谱中无法分解挥发，将会严重污染离子源甚至质谱内部四级杆等，对质谱将产生极强的抑制作用。
文献《高效液相色谱-质谱/质谱法测定茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸残留》(《食品与发酵工业》，肖泳等，42(9)，2016，217-222)建立了茶叶中草甘膦的柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法。茶叶以水提取，经C18固相萃取小柱净化后，在硼酸钠缓冲溶液环境下以Fmoc-Cl衍生一定时间，再以HLB固相萃取小柱富集衍生物，水和正己烷淋洗，5％氨水甲醇洗脱，氮吹至干后过有机滤膜，高效液相色谱-串联质谱检测。由于此填料为大孔共聚物，其孔内可保留部分非极性杂质，无法被淋洗液水完全洗脱，但在洗脱步骤可被强洗脱性的溶剂甲醇洗脱，进入上机液，给设备带来污染风险。
GB/T 23750-2009使用水提取，经阳离子交换柱净化，与七氟丁醇和三氟乙酸酐在90℃衍生化反应1小时后氮吹至干，加入0.2％柠檬醛乙酸乙酯溶液溶解残渣，用气相色谱-质谱联用仪测定粮谷、水果等植物产品中草甘膦及其降解产物氨甲基膦酸残留。而该标准中使用远高于三氟乙酸酐沸点的90℃衍生一小时，这将使三氟乙酸酐处于沸腾状态，有一定的泄露风险，同时也可能因为泄露造成衍生化不完全的情况。
常规使用的衍生化方法无法完全去除杂质，尤其是基质复杂的茶叶样品，测试一定数量后，质谱的离子源处均存在大量灰白色至绿色残渣，初步分析为衍生化时的硼酸盐及茶叶中的有机杂质在提取和净化步骤中未去除彻底，这些组分的存在可能污染质谱设备，严重降低质谱设备的响应值。因此，研发新的衍生化检测方法对进一步净化上机液很有必要。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法，该检测方法使用一种新的衍生化试剂对草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸进行检测，该检测方法的响应值高、稳定性好、准确度高、得到的杂质少、响应迅速且不影响设备的性能。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法，使用如下式所示的衍生化试剂进行衍生化，包括以下步骤：
Figure BDA0003806553750000031
其中，R1，R2，R3各自独立地选自直链烷基；
(1)提取：将样品与氨水混匀，得到待衍生液；
(2)衍生化：将衍生化试剂、缓冲液、有机溶剂混匀，和待衍生液混合，取上清液；
(3)纯化：将上清液过柱洗脱，洗脱液干燥后与流动相混匀；
(4)检测：用液相色谱质谱联用仪进行检测。
优选地，R1选自C1-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C1-12直链烷基。
进一步优选地，R1选自C8-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C2-10直链烷基。
更进一步优选地，R1选自C10-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C2-9直链烷基。
更进一步优选地，R1选自C12-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C2-8直链烷基。
优选地，衍生化试剂选自
Figure BDA0003806553750000032
Figure BDA0003806553750000041
Figure BDA0003806553750000042
中的至少一种。
进一步优选地，衍生化试剂为
Figure BDA0003806553750000043
优选地，步骤(1)中，所述提取具体为：将样品与0.1-1％的氨水混匀，样品与氨水固液比为1:5-15，提取20-60min后，得待衍生液。
进一步优选地，所述提取具体为：将样品与0.5-1％的氨水混匀，样品与氨水固液比为1:10-15，提取20-40min后，得待衍生液。
更进一步优选地，所述提取具体为：将样品与0.5％的氨水混匀，样品与氨水固液比为1:10，提取30min后，得待衍生液。
优选地，步骤(2)中所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷、醋酸盐缓冲液中的至少一种。
进一步优选地，所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种。
更进一步优选地，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液。
优选地，步骤(2)中所述有机溶剂选自乙腈、苯、吡啶、四氢呋喃、苯酚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙醇、甲醇、丙酮、氯化亚砜中的至少一种。
进一步优选地，所述有机溶剂选自乙腈、苯、吡啶、四氢呋喃、苯酚、二氯甲烷中的至少一种。
更进一步优选地，所述有机溶剂为乙腈。
优选地，步骤(2)中，所述衍生化具体为：0.2-0.8％衍生化试剂、2-8％缓冲液和有机溶剂按照1:2-3:2-3的体积比混合，与待衍生液反应1-3h，取上清液。
进一步优选地，所述衍生化具体为：0.4-0.6％衍生化试剂、4-6％缓冲液和有机溶剂按照1:2.5-3:2.5-3的体积比混合，与待衍生液反应2-3h，取上清液。
更进一步优选地，所述衍生化具体为：0.5％的衍生化试剂、5％缓冲液和有机溶剂按照1:2.5:2.5的体积比混合，与待衍生液反应2h，取上清液。
优选地，步骤(3)中，所述纯化具体为：上清液通过预先以甲醇、水活化的C18固相萃取小柱，弃去流出液；依次以水、乙腈水淋洗，弃去淋洗液，乙腈洗脱；将洗脱液干燥后，与流动相混匀。
进一步优选地，所述流动相为乙腈和5mmol/L乙酸铵溶液的混合液，其中乙酸铵溶液中含0.2％的甲酸。
优选地，步骤(4)中所述液相色谱的参数具体为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱，
柱温25-35℃，
流速350-450μL/min，
进样量3-8μL，
梯度洗脱；
所述质谱的检测参数具体为：
扫描方式：多反应监测(MRM)，
离子源温度450-500℃，
定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞气能量20-30V，去簇电压15-25V。
其次，本发明还提供上述检测方法所用衍生化试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)长链烷基苯和1,4-丁内酯在催化剂条件下进行Friedel-Crafts酰基化反应，得到长链烷基苯并环己酮；
(2)长链烷基苯并环己酮与苯肼在催化剂条件下反应，生成长链烷基氢化苯并咔唑，长链烷基氢化苯并咔唑在还原剂存在下反应，生成长链烷基苯并咔唑；
(3)在碱性条件下，长链烷基苯并咔唑与环氧氯丙烷反应，然后与硫脲和相转移催化剂混合反应，生成长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷；
(4)在催化剂的存在下，二烷基胺与长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷反应后，与三光气和N-甲基咪唑混合，反应得到衍生化试剂。
优选地，步骤(1)中，所述长链烷基苯选自十二烷基苯、十四烷基苯、十六烷基苯、十八烷基苯中的至少一种。
进一步优选地，所述长链烷基苯选自十六烷基苯、十八烷基苯中的至少一种。
更进一步优选地，所述长链烷基苯为十八烷基苯。
优选地，步骤(1)中，所述催化剂选自无水氯化铝、氯化锌、三氯化铁、三氟化硼、四氯化锡、硫酸中的至少一种。
进一步优选地，所述催化剂选自无水氯化铝、氯化锌、三氯化铁中的至少一种。
更进一步优选地，所述催化剂为无水氯化铝。
优选地，步骤(1)中，所述长链烷基苯和1,4-丁内酯的摩尔比为1:1.02-1.05，长链烷基苯和催化剂的摩尔比为1:4-5。
优选地，所述Friedel-Crafts酰基化反应具体为：长链烷基苯和1,4-丁内酯在0-10℃下加入催化剂，升温至140-160℃反应6-12h，降温至0-10℃，经后处理得到长链烷基苯并环己酮。
优选地，步骤(2)中，所述催化剂选自盐酸、氯化锌、三氯化铁、四氯化锡、硫酸、磷酸中的至少一种。
进一步优选地，所述催化剂选自盐酸、硫酸、磷酸中的至少一种。
更进一步优选地，所述催化剂为盐酸。
优选地，步骤(2)中所述还原剂选自1,4-四氯苯醌、硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化锂、N,N-二甲氨基硼氢化锂、二异丁基氢化铝中的至少一种。
进一步优选地，所述还原剂选自1,4-四氯苯醌、硼氢化钠、二异丁基氢化铝中的至少一种。
更进一步优选地，所述还原剂为1,4-四氯苯醌。
优选地，步骤(2)中，所述长链烷基苯并环己酮和苯肼的摩尔比为1:2.5-3，所述长链烷基苯并环己酮与催化剂的摩尔比为1:4-5，所述长链烷基苯并环己酮与1,4-四氯苯醌的摩尔比为1:1-1.15。
优选地，步骤(2)中，所述生成长链烷基苯并咔唑的反应具体为：催化剂加热至60-80℃，与苯肼混合升温至80-100℃反应1-2h后，与长链烷基苯并环己酮混合，沸腾反应3-6h；降温至20-30℃，加入二甲苯，向有机层加入还原剂，135-140℃反应3-5h，经后处理得长链烷基苯并咔唑。
优选地，步骤(3)中，所述碱性条件的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
优选地，步骤(3)中，所述催化剂选自β-环糊精、四丁基硫酸氢铵中的至少一种。
进一步优选地，所述催化剂为β-环糊精。
优选地，步骤(3)中所述长链烷基苯并咔唑与环氧氯丙烷反应的摩尔比为1:2-3，所述长链烷基苯并咔唑与碱的摩尔比为1:1-2，所述长链烷基苯并咔唑与硫脲的摩尔比为1:8-12，所述长链烷基苯并咔唑与催化剂的摩尔比为1:1-3。
进一步优选地，所述长链烷基苯并咔唑与环氧氯丙烷的摩尔比为1:2.2-3，所述长链烷基苯并咔唑与碱的摩尔比为1:1.2-1.5，所述长链烷基苯并咔唑与硫脲的摩尔比为1:10-12，所述长链烷基苯并咔唑与催化剂的摩尔比为1:1.5-2.5。
优选地，步骤(3)中，所述生成长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷的反应具体为：长链烷基苯并咔唑甲醇溶解后冷却至0-5℃，与20-50％的碱溶液混合，加入环氧氯丙烷，升温至35-50℃，反应3-4小时；有机溶剂萃取后，加入硫脲，催化剂和水，加热至35-50℃，反应7-12h后降温，经后处理得到长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷。
进一步优选地，所述生成长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷的反应具体为：长链烷基苯并咔唑甲醇溶解后冷却至0-5℃，与30-50％的碱溶液混合，加入环氧氯丙烷，升温至45-50℃，反应3-4小时；冷却至25℃，加入有机溶剂萃取后，调节pH＝7-8；加入硫脲，β-环糊精和水，加热至40-50℃，反应8-12h后降温，经后处理得到长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷。
优选地，步骤(4)中，所述二烷基胺选自二乙胺、二正丁胺、二正己胺、二正辛胺中的至少一种。
进一步优选地，所述二烷基胺选自二乙胺、二正丁胺、二正己胺中的至少一种。
更进一步优选地，所述二烷基胺为二正丁胺。
优选地，步骤(4)中所述的催化剂选自N,N-二甲基-4-吡啶胺、三乙胺中的至少一种。
进一步优选地，所述的催化剂为N,N-二甲基-4-吡啶胺。
优选地，步骤(4)中，所述长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷与催化剂的摩尔比为1:0.01-0.02，所述长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷与二烷基胺的摩尔比为1:1-1.05，所述长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷与三光气的摩尔比为1:0.4-0.6，所述长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷与N-甲基咪唑的摩尔比为1:0.04-0.06。
优选地，步骤(4)中，所述得到化合物产物的反应具体为：长链烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷与二氯甲烷混合，并降温至0-5℃，与二烷基胺和N,N-二甲基-4-吡啶胺混合，升温至30-50℃反应3-5h，降温至0-10℃；与三光气和N-甲基咪唑混合；在0-5℃下反应4小时升温至30-35℃，继续反应3-6小时，得到衍生化试剂。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的检测方法，使用特定的衍生化试剂进行衍生化，采用先衍生后纯化的方式，可不纯化即进行衍生；检测污染少，衍生化的时间段，省时；
(2)本发明的检测方法，将目标物草甘膦及其代谢物的衍生物保留在C18柱中，水溶性杂质、衍生化缓冲溶液淋洗除去，可得到杂质含量低的目标物溶液；
(3)使用本发明的检测方法所得的草甘膦及代谢物的衍生物在溶液中可稳定存储15天以上，响应值高，检测限低，检测成本低，操作方便，检测周期短，可作为安全风险评估的高效方法；
(4)本发明的检测方法所使用的衍生化试剂含有甲硫羰基氯官能团，在一定pH条件时，常温或稍微加热即可迅速与伯胺和仲胺反应，且不受衍生溶液中水的影响；相比常规甲氧羰基氯官能团，甲硫羰基氯与胺基的反应活性更高，反应条件温和，在常温条件下所需的衍生化时间更短；
(5)本发明的检测方法所使用的的衍生化试剂其分子量较高，而杂质一般分子量较小，由于质谱是以质荷比区分各物质的，因此在质谱内可高效地与其他小分子杂质分离。
附图说明
图1是本发明衍生化试剂检测草甘膦的多反应监测色谱图；
图2是本发明衍生化试剂检测氨甲基膦酸的多反应监测色谱图；
图3是本发明实施例1所制得衍生化试剂的结构1H NMR图谱；
图4是本发明实施例1所制得衍生化试剂的红外光谱图。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
下述实施例中，所述草甘膦购自上海安谱实验科技股份有限公司，货号为F0032398；氨甲基膦酸购自北京振翔科技有限公司，货号为D0017180；乙腈购自上海安谱实验科技股份有限公司，货号为4.003306.4000；十八烷基苯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为O159988；十二烷基苯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为P106336；β-环糊精购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为C104384；无水三氯化铝购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为A104930；1,4-丁内酯购自济南振达化工有限公司，纯度99.9％；苯肼购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为P108563；1,4-四氯苯醌购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为T105285；环氧氯丙烷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为E108182；硫脲购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为T112512；二正丁胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为D111219；二正己胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为D105361；N,N-二甲基-4-吡啶胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为D109207；三光气购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为T103041；N-甲基咪唑购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为M109227。
检测浓度计算方法：检测浓度＝质量浓度*定容体积/称样质量；
回收率计算方法：回收率＝(检测浓度/加标浓度)*100％。
实施例1
草甘膦及其代谢产物的检测方法为：
(1)提取：称取1.0g红茶(已验证不含草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的空白基质样品)，添加不同浓度的草甘膦和氨甲基膦酸标准溶液，以10mL0.5％氨水涡旋混匀，超声提取30min后，4000rpm离心5min，将上清液转入25mL玻璃比色管，待衍生；
(2)衍生化：准确称取0.5g衍生化试剂溶于100mL无水乙腈，超声溶解后摇匀，作为衍生化溶液；取5mL硼酸盐缓冲液(5％，pH＝9.0)，加入步骤(1)的待衍生溶液中，加入5mL乙腈和2mL衍生化溶液后密封混匀，室温中振荡反应2小时后待纯化；
(3)纯化：将上清液通过预先以3mL甲醇，3mL水活化的C18固相萃取小柱，弃去流出液。依次以5mL去离子水，5mL50％乙腈水淋洗，弃去淋洗液，5mL乙腈洗脱。将洗脱液在35℃下氮吹至近干，加入1.0mL流动相，涡旋混合30秒后，以0.22μm滤膜过滤除去杂质，得到无色透明溶液，待仪器测定；
(4)草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸浓度和回收率的检测：
液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱(1.7μm，50mm*1.0mm)，柱温30℃，流速400μL/min，进样量5μL，梯度洗脱程序见表1。
表1
时间，min 乙腈，％ 5mmol/L乙酸铵+0.2％甲酸溶液，％
0.00 50.0 50.0
1.50 50.0 50.0
2.00 95.0 5.0
4.00 95.0 5.0
5.00 50.0 50.0
6.00 50.0 50.0
质谱条件：Waters三重四极杆串联质谱联用仪UPLC-Xevo TQ-S micro，电喷雾ESI+离子源；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源温度490℃；定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞气能量质谱参数见表2。
表2
Figure BDA0003806553750000111
Figure BDA0003806553750000121
本实施例所用衍生化试剂的结构式如下式所示：
Figure BDA0003806553750000122
衍生化试剂的制备方法为：
(1)在四口瓶中加入38g十八烷基苯(0.115mol)和10.3g1,4-丁内酯(0.12mol)，在搅拌条件下冷却至5℃，分批次加入64g无水三氯化铝(0.48mol)，升温至150℃，反应10小时；降温至5℃，缓慢滴加0℃的1mol/L盐酸溶液500mL，保持温度不超过10℃，滴加完毕后搅拌1小时；加入甲苯100mL，静置分离出上层有机相，再以1000mL去离子水洗涤有机相2次，分离收集有机相；将有机相过硅胶柱，以甲苯淋洗，15％二氯甲烷-甲苯洗脱，减压蒸馏除去溶剂，得红色油状液体，十八烷基苯并环己酮43.8g，收率为95.60％，纯度为96.43％；
(2)在四口瓶中加入480mL1mol/L盐酸(0.48mol)，加热至75℃后缓慢加入27g苯肼(0.25mol)，升温至100℃回流1小时，缓慢滴加41g长链烷基苯并环己酮(0.1mol)，沸腾反应4小时；降温至20℃，加入二甲苯，水洗至水层pH＝7，分离并以无水氯化钙干燥有机层；向有机层加入22.5g1,4-四氯苯醌(0.11mol)，升温至130℃，反应3小时；降至室温，加入1mol/LNaOH至体系pH＝9，静置分离出有机相，减压蒸馏除去二甲苯，以甲醇重结晶，得浅黄色晶体，十八烷基苯并咔唑32.5g，收率为68.97％，纯度为97.55％；
(3)将20g长链烷基苯并咔唑(0.041mol)，甲醇100mL，搅拌溶解后冷却至4℃，加入4mL40％NaOH，缓慢滴加9.2g环氧氯丙烷(0.10mol)，升温至50℃，反应3小时；减压蒸馏除去溶剂及过量的环氧氯丙烷后冷却至25℃，加入100mL1,2-二氯乙烷溶解，除去水相，并以去离子水洗涤有机相至pH＝7；向有机相中加入由38g硫脲(0.50mol)，114gβ-环糊精(0.10mol)及500mL水组成的混合物溶液，加热至50℃，反应8小时后降温，弃去水相；将有机相过硅胶柱，以200mL二氯乙烷淋洗，200mL15％丙酮-二氯乙烷洗脱；将洗脱液于45℃下减压蒸馏挥去溶剂，得浅黄色晶体，十八烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷18.7g，收率为81.07％，纯度为98.72％；
(4)取17g十八烷基苯并咔唑甲基环硫乙烷(0.030mol)，用50mL二氯甲烷溶解并降温至至4℃，迅速加入4.0g二正丁胺(0.031mol)和0.036g催化剂N,N-二甲基-4-吡啶胺，氮气氛中升温至40℃回流反应3小时后，降温至0℃；加入6g三光气(0.02mol)和0.015gN-甲基咪唑。在4℃下搅拌4小时后缓慢升温至35℃，继续反应6小时。减压蒸馏至溶剂完全挥发；以无水乙醚重结晶二次，得到浅黄色晶体23.4g，即为化合物A，收率为92.96％，衍生化试剂A的总收率为49.69％，纯度为98.22％。
对获得的衍生化试剂进行1H NMR和红外光谱检测：
核磁谱图如图3所示，(1)0.00—定位化合物TMS的H化学位移；(2)0.87—CH3的H化学位移，峰面积152.5，9H；(3)1.28—烷基CH2(不与苯环、N连接的CH2)的H化学位移，峰面积573.4，34H；(4)2.36—与叔胺N连接的烷基CH2的H化学位移，峰面积69.5，4H；(5)1.39—与(3)相邻的CH2的H化学位移，峰面积68.9，4H；(6)2.62—与苯环连接的CH2的H化学位移，峰面积33.6，2H；(7)1.62—与(5)相邻的CH2的H化学位移，峰面积33.9，2H；(8)3.00—与叔胺的N相邻的CH2及S相邻的CH2的H的化学位移，峰面积50.2，3H；(9)4.48—与咔唑的N相邻的CH2的H的化学位移，峰面积33.9，2H；(10)7.16—芳环上的H的化学位移，峰面积101.4，6H；(11)7.46—芳环上的H的化学位移，峰面积16.9，1H；(12)7.55—芳环上的H的化学位移，峰面积17.2，1H；(13)7.66—芳环上的H的化学位移，峰面积16.7，1H。
红外光谱图如图4所示，其在3031、1600、1498、1030、769、740、690cm-1处出现苯基、联苯基特征吸收峰，在1769cm-1处出现酰氯基特征吸收峰，在723cm-1处出现碳数≥4的直链烃基特征吸收峰，在1438cm-1处出现C-S-C＝O特征吸收峰，在1143、1066cm-1处出现咔唑的C-N-C特征吸收峰，在1357、1247cm-1处出现叔胺的C-N-C特征吸收峰，在2956、1463cm-1处出现CH3的特征吸收峰，在2925、2826cm-1处出现CH2特征吸收峰。证明衍生化试剂A制备成功。
实施例2
与实施例1不同的是，检测方法步骤(2)中所用的衍生化试剂，其结构为：
Figure BDA0003806553750000141
上述衍生化试剂的制备方法为：将实施例1步骤(1)中的十八烷基苯替换为十二烷基苯，其余皆相同。
实施例3
与实施例1不同的是，步骤(2)中衍生反应为1h，其余皆相同。
实施例4
与实施例1不同的是，检测方法步骤(2)中所用的衍生化试剂，其结构为：
Figure BDA0003806553750000142
上述衍生化试剂的制备方法为：将实施例1步骤(1)中的十八烷基苯替换为十二烷基苯，步骤(4)中的二正丁胺替换为二正己胺，其余皆相同。
对比例1
与实施例1不同的是，步骤(1)中的氨水替换为纯水，其余皆相同。
对比例2
与实施例1不同的是，步骤(2)中的衍生化试剂替换为常用的氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc-Cl)乙腈，其余皆相同。
对比例3
SN/T 1923-2007的检测方法：
(1)提取：称取5g红茶(已验证不含草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的空白基质样品)于250mL塑料离心管中，加入草甘膦内标工作溶液，加入100mL水(茶叶样品浸泡0.5h)和50mL二氯甲烷，振荡20min，于4000r/min离心10min.将上层水溶液转移至另一塑料离心管中，残渣再加入50mL水重复提取一次，合并上层水溶液，充分混匀后，取4.5mL至10mL塑料试管中，加0.5mL酸度调节剂，混匀；
(2)净化：CAX小柱经10mL水活化后，加1.0mL提取液，用0.7mLCAX洗脱液淋洗两次，再用11mL洗脱液洗脱并收集，洗脱液于45℃减压旋转蒸发至干，加1mL5％硼酸盐缓冲溶液溶解残渣，此时pH约为9左右，需要时用20％氢氧化钠溶液和3mol/L盐酸溶液、0.3mol/L盐酸溶液调节pH至9；
(3)衍生化：取混合标准工作溶液各1.0mL加入200μL5％喷酸盐缓冲溶液，混匀。此系列溶液和净化后样液分别加入200μLFmoc-Cl丙酮溶液，混匀，室温下进行衍生化反应，放置过夜。将衍生化后溶液通过0.45μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
实验结果：
(1)草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸多反应监测色谱图见图1和图2。
从图中可以看出，本发明的检测方法可以高效地检测到草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸。说明，本发明的衍生化检测方法在草甘膦检测中具有很好的应用效果，所使用的的衍生化试剂可高效、温和且快速的对草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸进行反应，从而加快反应进程。
(2)实施例1-3和对比例1-3的草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的检测浓度、回收率数据见表3。
表3
Figure BDA0003806553750000161
从表3中可以看出，添加不同浓度草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的茶叶经过本发明所述的检测方法，经衍生化后上机检测，其回收率都较好，所得结果符合残留检测要求。且可以检测到较高的草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸浓度。同时，采用本发明所述的检测方法与SN/T 1923-2007的方法进行比较，不同添加浓度的草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的回收率都较好，所以本发明所述的采用衍生化试剂进行草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸检测的方法，是一种高效、省时、绿色、无污染的方法。本方法可用于草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留分析检测。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种草甘膦及其代谢产物残留的检测方法，其特征在于，使用如下式所示的衍生化试剂进行衍生化，包括以下步骤：
Figure FDA0003806553740000011
其中，R1，R2，R3各自独立地选自直链烷基；
(1)提取：将样品与氨水混匀，得到待衍生液；
(2)衍生化：将衍生化试剂、缓冲液、有机溶剂混匀，和待衍生液混合反应，取上清液；
(3)纯化：将上清液过柱洗脱，洗脱液干燥后与流动相混匀；
(4)检测：用液相色谱质谱联用仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，R1选自C8-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C2-10直链烷基。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，R1选自C12-18直链烷基，R2、R3各自独立地选自C2-8直链烷基。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化试剂选自
Figure FDA0003806553740000012
Figure FDA0003806553740000021
Figure FDA0003806553740000022
中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化试剂为：
Figure FDA0003806553740000023
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取具体为：将样品与0.1-1％的氨水混匀，样品与氨水固液比为1:5-15，提取20-60min后，得待衍生液。
7.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷、醋酸盐缓冲液中的至少一种；所述有机溶剂选自乙腈、苯、吡啶、四氢呋喃、苯酚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙醇、甲醇、丙酮、氯化亚砜中的至少一种。
8.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述衍生化具体为：0.2-0.8％衍生化试剂、2-8％缓冲液、有机溶剂按照1:2-3:2-3的体积比混合，与待衍生液反应1-3h，取上清液。
9.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化具体为：上清液通过预先以甲醇、水活化的C18固相萃取小柱，弃去流出液，依次以水、乙腈水淋洗，弃去淋洗液，乙腈洗脱；将洗脱液干燥后，与流动相混匀。
10.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述液相色谱的参数具体为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱，
柱温25-35℃，
流速350-450μL/min，
进样量3-8μL，
梯度洗脱；
所述质谱的检测参数具体为：
扫描方式：多反应监测，
离子源温度450-500℃，
定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞气能量20-30V，去簇电压15-25V。
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