CN117740989A - 一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种越橘提取物中杨梅素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和杨梅素‑3‑O‑半乳糖苷的含量测定方法，包括：将越橘提取物待测样品加入提取液提取，得供试品溶液；将供试品溶液采用液质联用色谱仪进行检测，采用外标法定量计算；本发明方法运用液质联用仪分析技术进行分析，并通过提取液及色谱条件的优化，可以排除越橘提取物中杨梅素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和杨梅素‑3‑O‑半乳糖苷以外黄酮类及杂质的干扰，专属性强，能够准确测定越橘提取物中杨梅素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和杨梅素‑3‑O‑半乳糖苷的含量，有利于实现对越橘提取物质量的有效控制。
Description
技术领域
本发明属于分析化学的技术领域，具体涉及一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法。
背景技术
越橘提取物是以欧洲越橘的新鲜冷冻果实为原料经提取加工而成的提取物，目前越橘提取物中活性成分的研究主要集中在花青素类化合物，对杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷这两种黄酮类化合物的研究甚少。杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷是植物中两种重要的黄酮类化合物，均具有强抗氧化能力，且苷元活性强于糖苷，在抗氧化、抗癌、抗糖尿病等方面均表现出比槲皮素、山柰酚等其他黄酮醇或黄酮类化合物更强的药理活性。
杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷，两者分子量相同，互为同分异构体，化学性质非常相似，同时分析两者的含量非常困难。如文献《黄酮醇糖苷与茶树品种适制性关系》食品科学2017,Vol.38,No.16中使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪检测了葡萄糖苷化黄酮醇与半乳糖苷化黄酮醇。色谱条件：Zorbax Eclipse PlusC18色谱柱(150mm×3.0mm，1.8μm)；流动相A相为0.1％甲酸-水，B相为甲醇；进样量3μL；流速0.4mL/min；柱温40℃；流动相线性梯度洗脱：0min，10％ B；4min，15％ B；7min，25％ B；9min，32％ B；16min，40％ B；22min，55％ B；28min，95％ B；30min，95％ B；柱后平衡时间5min。使用上述文献分析方法测试杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷，图谱见图19，可见杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷半峰宽处与杨梅素-3-O-半乳糖苷相连，没有达到完全分离的要求，不能准确定量目标物。
越橘提取物组分复杂，现有色谱分离技术仅针对杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷单一成分的分离，尚未有杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的色谱分离和同时准确定量的相关研究，使得具有优异抗氧化活力的两种黄酮类化合物在保健食品与药品中的应用受到了限制。因此开发一种专属性强，能准确定量越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的检测方法具有重要的研究意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法，该方法可以消除越橘提取物中其它黄酮类物质的基质干扰，专属性强，能准确定量越橘提取物中的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量。
本发明通过如下技术方案实现：
一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)将越橘提取物待测样品加入提取液提取，得供试品溶液；
(2)将供试品溶液采用液质联用色谱仪进行检测，采用外标法定量计算样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量；
其中，色谱条件为：采用T3色谱柱，以质量浓度为(0.05～0.5％)甲酸-(2～10mmol/L)乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：流动相A的起始占比90 -98％，保持2min；然后降低流动相A占比，到6min时流动相A占比80 -90％，保持至10min；然后一步降低流动相A占比，至20min时流动相A占比60-80％；然后22min迅速将流动相A占比降低到2-10％，并保持6min；然后28min迅速将流动相A占比升高到90-98％。
优选地，步骤(1)中，所述提取液为体积浓度为60-80％的乙醇水溶液或0.1-0.5mg/mL抗坏血酸甲醇溶液，优选为0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液。
优选地，步骤(2)中，所述T3色谱柱的柱长为10cm，内径为2.1mm，粒径为2.5μm。
优选地，步骤(2)中，所述流动相A为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液。
优选地，步骤(2)中，所述梯度洗脱程序如下:
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 98 | 2 |
| 2 | 98 | 2 |
| 6 | 90 | 10 |
| 10 | 90 | 10 |
| 20 | 78 | 15 |
| 22 | 5 | 95 |
| 28 | 5 | 95 |
| 30 | 98 | 2 |
| 35 | 98 | 2 |
优选地，步骤(2)中，所述柱温为25-40℃，流速为0.2-0.5mL/min。
优选地，步骤(2)中，所述质谱条件为：电离方式：电喷雾负离子模式；检测方式：多反应检测MRM；雾化气压力：30-40psi；离子喷雾电压：3000-4000V；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：8-11L/min。
本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
本发明方法运用液质联用仪分析技术进行分析，并通过提取液及色谱条件的优化，可以排除越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷以外黄酮类及杂质的干扰，两个目标物分离度达到2，基线平稳，达到完全分离的要求，从而能够准确测定越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量，有利于实现对越橘提取物质量的有效控制。
本发明方法专属性强，其线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，该方法科学有效，能对越橘提取物的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷含量起到质量控制的目的。
附图说明
图1为F5色谱柱的色谱图；
图2为C4色谱柱的色谱图；
图3为T3色谱柱、流动相四、梯度洗脱程序三的色谱图；
图4为C18色谱柱的色谱图；
图5为以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇为流动相的色谱图；
图6为以5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇为流动相的色谱图；
图7为以5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相的色谱图；
图8为梯度洗脱程序一的色谱图；
图9为梯度洗脱程序二的色谱图；
图10为梯度洗脱程序四的色谱图；
图11为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷空白色谱图；
图12为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照色谱图；
图13为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷样品色谱图；
图14为杨梅素-3-O-半乳糖苷空白色谱图；
图15为杨梅素-3-O-半乳糖苷对照色谱图；
图16为杨梅素-3-O-半乳糖苷样品色谱图；
图17为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷的标准工作曲线；
图18为杨梅素-3-O-半乳糖苷的标准工作曲线；
图19为文献《黄酮醇糖苷与茶树品种适制性关系》的色谱图；
图20为对比例1色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法1仪器
液相色谱-质谱联用仪：液相质谱联用仪：1290InfinityⅡ型液相色谱仪(Agilent，美国)串联G6470B型质谱仪(Agilent，美国)；XSE205DU型电子天平(MettlerToledo，瑞士)。
2试剂
试剂：一级用水；甲酸(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；L(+)-抗环血酸(分析纯)；乙酸铵(HPLC)。
对照品如下表1：
表1
| 名称 | 厂家 | 批号 | 纯度 |
| 杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷 | 成都德思特生物技术有限公司 | DSTDY027201 | 98.76％ |
| 杨梅素-3-O-半乳糖苷 | 成都普思生物科技股份有限公司 | PS010040 | 99.23％ |
提取溶液：100mg抗坏血酸溶于500ml甲醇，即0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液。
0.1甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液：称取乙酸铵0.385g加入适量水溶解，加入1mL甲酸，用水定容至1L,混匀。
3分析方法
3.1仪器条件与参数：
3.1.1液相条件
色谱柱：HSS T3 2.5μm，2.1×100mm；
柱温：30℃；
流速：0.2mL/min；
流动相：A为0.1甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，按下表2梯度洗脱；
表2
3.1.2质谱条件
a)电离方式：电喷雾负离子模式。
b)检测方式：多反应检测(MRM)。
c)雾化气压力：40psi。
d)离子喷雾电压：3000V。
e)干燥气温度：300℃。
f)干燥气流速：8L/min。
g)定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量见下表3：
表3
| 中文名称 | 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | 碎裂电压(V) | 碰撞能量(V) |
| 杨梅素-3-O-半乳糖苷 | 478.9 | 315.9 | 170 | 30 |
| 杨梅素-3-O-半乳糖苷 | 478.9 | 270.9 | 170 | 35 |
| 杨梅素-3-O-半乳糖苷 | 478.9 | 178.9 | 170 | 25 |
| 杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷 | 478.9 | 315.9 | 170 | 30 |
| 杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷 | 478.9 | 270.9 | 170 | 35 |
| 杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷 | 478.9 | 178.9 | 170 | 25 |
315.9为定量离子碎片，270.9、178.9为定性离子碎片。
3.2对照品溶液的配制
精密称取杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品9.80mg，置于50mL容量瓶中，加入25mL提取液和20mL水超声溶解，用水定容至刻度，摇匀，即得193.6μg/mL杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照储备液。
精密称取杨梅素-3-O-半乳糖苷对照品11.59mg，置于10mL容量瓶中，加入提取液溶解，并定容至刻度，摇匀，即得1150μg/mL杨梅素-3-O-半乳糖苷对照储备液。
精密移取1.0mL杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照储备液，0.2mL杨梅素-3-O-半乳糖苷对照储备液置10mL容量瓶中，加提取液定容至刻度，摇匀，即得19.4μg/mL的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、23.0μg/mL的杨梅素-3-O-半乳糖苷混合对照工作液。
3.3标准工作曲线绘制
精密吸取混合对照工作液0.2mL、0.4mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL置于10ml容量瓶中，加提取液定容至刻度，配制得到0.388μg/mL、0.776μg/mL、1.94μg/mL、2.91μg/mL、3.88μg/mL的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和0.460μg/mL、0.920μg/mL、2.30μg/mL、3.45μg/mL、4.60μg/mL的杨梅素-3-O-半乳糖苷混合标准工作曲线溶液，混合标准工作曲线溶液与供试品溶液进样量：2μL，注入高效液相色谱仪，建立标准曲线方程。
3.4供试品制备
精密称取均匀样品约0.2g，置于50ml棕色容量瓶中，加入适量提取液，摇匀，超声10min，溶解完全，冷却至室温，用提取液定容至刻度，摇匀，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，加入适量提取液定容至容量瓶刻度，摇匀，过滤膜，得样品供试液，上机待测。
3.5结果计算：
式中：X—试样中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷(杨梅素-3-O-半乳糖苷)的含量，g/100g；
C—试样溶液中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷(杨梅素-3-O-半乳糖苷)的浓度，μg/mL；
M—试样的质量，g；
V—试样稀释的体积，mL；
K—单位转换系数，10000。
4 方法学验证
4.1 方法优化试验
4.1.1提取液的优化
越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷具有抗氧化性，而杨梅素-3-O-半乳糖苷溶解性不强，选择合适的有机溶剂能让目标物溶解完全和不易氧化降解。通过称取三份0.2g越橘提取物分别用50％甲醇水溶液、70％乙醇水溶液、0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液，按照3.4处理，0小时和6小时分别测试，结果见表4，通过峰面积对比，0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液作为提取液，溶解能力更佳，通过降解率对比，0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液作为提取液，目标物稳定性更佳，有效防止降解。因此，本发明优选0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液作为提取液。
表4
4.1.2色谱柱的优化
越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷为同分异构体，其色谱、质谱行为都非常相似，需开发合适的色谱条件，使杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷到基线分离。
当分离度R≥1.5时,称为6σ分离,曝光峰面积为99.7％,R(>1.5)，称为完全分离。本发明试验了不同类型的色谱柱，对杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷进行分离。
本发明试验了F5色谱柱、C4色谱柱、T3色谱柱、C18色谱柱不同类型的色谱柱，对杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷进行分离。
如图1所示：F5色谱柱((柱长10cm，内径4.6mm，粒径2.6μm))分析越橘提取物，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷与杂质集中在25min-27min，且两个目标物出峰为一个色谱峰，不能满足完全分离的要求；
如图2所示：C4色谱柱(柱长15cm，内径4.6mm，粒径3.6μm)分析越橘提取物，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷与杂质集中在15min-19min，且两个目标物基本出峰为一个色谱峰，不能满足完全分离的要求；
如图3所示：T3色谱柱分析越橘提取物，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷与杂质集中在21min-24min，且两个目标物分离度为2，能满足完全分离的要求；
如图4所示：C18色谱柱分析越橘提取物，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷与杂质集中在21min-24min，且两个目标物分离度为0.7，不能满足完全分离的要求；
根据以上色谱图得本发明优选T3色谱柱，使杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷达到基线分离，且峰型最好。
4.1.3色谱条件的优化
要实现杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的有效分离，流动相及洗脱程序的选择也是关键技术之一。
(1)流动相的选择：
流动相一：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇为流动相检测越橘提取物，流速0.2ml/min,起始2％甲醇,保持2分钟，4分钟内甲醇由2％递增至10％，10％甲醇保持4分钟，10分钟内甲醇由10％递增至15％，2分钟内甲醇由15％递增至95％，95％甲醇保持6分钟，2分钟内恢复2％甲醇保持5分钟，其色谱图如为图5。结果显示，样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷在同一时间出峰，完全无法分离，因此0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇作流动相不适用。
流动相二：以5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇为流动相检测越橘提取物，流速0.2ml/min,起始2％甲醇,保持2分钟，4分钟内甲醇由2％递增至10％，10％甲醇保持4分钟，10分钟内甲醇由10％递增至15％，2分钟内甲醇由15％递增至95％，95％甲醇保持6分钟，2分钟内恢复2％甲醇保持5分钟，其色谱图如为图6。结果显示，样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷在同一时间出峰，完全无法分离，5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇作流动相不适用。
流动相三：以5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相检测越橘提取物，流速0.2ml/min,起始2％乙腈,保持2分钟，4分钟内乙腈由2％递增至10％，10％乙腈保持4分钟，10分钟内乙腈由10％递增至15％，2分钟内乙腈由15％递增至95％，95％乙腈保持6分钟，2分钟内恢复2％乙腈保持5分钟，其色谱图如为图7。结果显示，样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷没有完全分离，峰谷重合在一起，5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈作流动相不适用。
流动相四：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相检测越橘提取物，流速0.2ml/min,起始2％乙腈,保持2分钟，4分钟内乙腈由2％递增至10％，10％乙腈保持4分钟，10分钟内乙腈由10％递增至15％，2分钟内乙腈由15％递增至95％，95％乙腈保持6分钟，2分钟内恢复2％乙腈保持5分钟，其色谱图如图3。结果显示，样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷完全分离，因此，本发明优选0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈作流动相适用。
(2)梯度洗脱程序的优化：
梯度洗脱程序一：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相，流速0.2ml/min,起始15％乙腈,保持2.5分钟，1.5分钟内乙腈由15％递增至60％，60％乙腈保持3分钟，1分钟内恢复15％乙腈保持3分钟。越橘提取物图谱如图8所示，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷没有分离，同一时间出峰。由此可知，乙腈洗脱梯度变化幅度过大使目标物无法分离。
梯度洗脱程序二：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相，流速0.2ml/min,起始3％乙腈,保持2.5分钟，1.5分钟内乙腈由3％递增至10％，3分钟内乙腈由10％递增至25％，3分钟内乙腈由25％递增至40％，2分钟内乙腈由40％递增至70％，70％乙腈保持4分钟，1分钟内恢复3％乙腈保持3分钟。越橘提取物图谱如图9所示，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷没有分离，同一时间出峰。由此可知，乙腈比例过大使目标物无法分离。
梯度洗脱程序三：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相检测越橘提取物，流速0.2ml/min,起始2％乙腈,保持2分钟，4分钟内乙腈由2％递增至10％，10％乙腈保持4分钟，10分钟内乙腈由10％递增至15％，2分钟内乙腈由15％递增至95％，95％乙腈保持6分钟，2分钟内恢复2％乙腈保持5分钟。越橘提取物图谱如图3所示，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷有很好的分离，基线平整。此梯度洗脱程序可有效分离两种目标物。因此，本发明优选梯度洗脱程序三作为梯度洗脱程序。
梯度洗脱程序四：以0.1％甲酸+5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相检测越橘提取物，流速0.3ml/min,起始2％乙腈,保持2分钟，4分钟内乙腈由2％递增至10％，10％乙腈保持4分钟，10分钟内乙腈由10％递增至15％，2分钟内乙腈由15％递增至95％，95％乙腈保持6分钟，2分钟内恢复2％乙腈保持5分钟。越橘提取物图谱如图10所示，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷没有分离，同一时间出峰。由此可知，流速变大使目标物无法分离。
4.2专属性试验
4.2.1试验方法
按3.4试样制备方法处理空白溶液，按3.1色谱条件测定空白溶液，与杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷对照工作液的出峰时间对比。
4.2.2试验结果见图11-16。
4.2.3试验结论：
空白溶液在样品和杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷的出峰时间处均无峰，表明空白对测定结果基本无干扰。
4.3线性范围确认
4.3.1试验数据见表5-6：
表5
表6
4.3.2标准工作曲线图
以浓度的为横坐标，峰面积的为纵坐标，绘制标准工作曲线如图17-18所示：
线性评价：杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷相关系数R分别为0.999707、0.999747，所以用该方法测定杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷在浓度为0.388μg/mL至3.88μg/mL、杨梅素-3-O-半乳糖苷在浓度为0.460μg/mL至4.60μg/mL之间呈现良好的线性，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求相关系数R≥0.99】。
4.4检出限和定量限
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。
4.4.1检出限
当信噪比(S/N)为3时，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷检出限为0.388ng/mL；样品取样量0.2g，定容50mL，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，加入适量提取液定容至容量瓶刻度时，方法的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷检出限为0.97mg/kg。
当信噪比(S/N)为3时，杨梅素-3-O-半乳糖苷检出限为0.46ng/mL；样品取样量0.2g，定容50mL，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，加入适量提取液定容至容量瓶刻度时，方法的杨梅素-3-O-半乳糖苷检出限为1.15mg/kg。
4.4.2定量限
当信噪比(S/N)为10时，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷定量限为1.164ng/mL；样品取样量0.2g，定容50mL，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，加入适量提取液定容至容量瓶刻度时，方法的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷定量限为2.91mg/kg。
当信噪比(S/N)为10时，杨梅素-3-O-半乳糖苷定量限为4.6ng/mL；样品取样量0.2g，定容50mL，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，加入适量提取液定容至容量瓶刻度时，方法的杨梅素-3-O-半乳糖苷定量限为11.5mg/kg。
4.5精密度试验
4.5.1试验方法
称取6份样品，按3.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。
4.5.2试验数据(见下表7-8)【越橘提取物】
表7：杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷
表8：杨梅素-3-O-半乳糖苷
4.5.3试验结论
6份样品杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷含量的RSD为2.3％、杨梅素-3-O-半乳糖苷含量的RSD为2.5％，表明该方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD≤2.7％】。
4.6耐用性试验(稳定性)
4.6.1试验方法：
将杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷供试品溶液分别在室温下放置0h、3h、5h、8h、12h后，按3.1条件测定浓度，计算其RSD(％)。
4.6.2试验数据见表9：
表9
4.6.3试验结论
杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷供试品溶液分别在室温下放置0h、3h、5h、8h、12h后，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷浓度的RSD为2.8％，杨梅素-3-O-半乳糖苷浓度的RSD为2.5％，表明杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷供试品溶液在室温下12小时内的稳定性良好。
4.7准确度试验(回收率)
4.7.1试验方法
加标：精密称取约0.2g样品9份(已知样品的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷含量：0.144g/100g，杨梅素-3-O-半乳糖苷含量：0.175g/100g)，分成3组，每组3份，各组分别精密加入杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照储备液(0.1936mg/mL)1500μL、3000μL、4500μL，杨梅素-3-O-半乳糖苷对照储备液(1.150mg/mL)280μL、560μL、840μL。按3.4试样制备方法处理样品。
4.7.2试验数据如下表10-11【试验样品为：越橘提取物】
表10：杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果
表11：杨梅素-3-O-半乳糖苷回收率试验结果
测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量；
回收率(％)＝测得加入量/理论加入量×100％。
4.7.3试验结论
杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷平均回收率为：101.4％，RSD为3.0％，杨梅素-3-O-半乳糖苷平均回收率为：100.1％，RSD为2.8％；符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95～105％】。
4.8结论
本发明通过对杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对越橘提取物的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷含量起到质量控制的目的。
对比例1：
专利CN106841432A一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法中使用高效液相色谱仪分析越橘提取物的原花青素黄酮类物质，色谱条件为：色谱柱为AgilentC18，4.6×250mm，5μm，流速1mL/min，流动相A∶水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流动相B∶水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)，梯度条件为0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B。使用上述专利分析方法测试越橘提取物中的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷，图谱见图20，可见两个目标物与杂质峰谷重合一起，分离度为0.43，没有达到分离要求，不能定量目标物。
综上，本发明运用液质联用仪分析技术进行分析，并通过色谱条件的优化，可以有效分离越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷，从而实现了对目标物的准确定量。
Claims (8)
1.一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将越橘提取物待测样品加入提取液提取，得供试品溶液；
（2）将供试品溶液采用液质联用色谱仪进行检测，采用外标法定量计算样品中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量；
其中，色谱条件为：采用T3色谱柱，以质量浓度为 （0.05~0.5%）甲酸-（2~10mmol/L）乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：流动相A的起始占比90-98%，保持2min；然后降低流动相A占比，到6min时流动相A 占比80 -90%，保持至10min；然后一步降低流动相A占比，至20min时流动相A占比60-80%；然后22min迅速将流动相A占比降低到2-10%，并保持6min；然后28min迅速将流动相A占比升高到90-98%。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述提取液为体积浓度为60-80%的乙醇水溶液或0.1-0.5mg/mL抗坏血酸甲醇溶液，优选为0.2mg/mL抗坏血酸甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述T3色谱柱的柱长为10cm，内径为2.1mm，粒径为2.5μm。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述流动相A为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述梯度洗脱程序如下:
6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述柱温为25-40℃，流速为0.2-0.5mL/min。
7.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述质谱条件为：电离方式：电喷雾负离子模式；检测方式：多反应检测MRM；雾化气压力：30-40psi；离子喷雾电压：3000-4000V；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：8-11L/min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的含量测定方法在越橘提取物质量控制中的应用。
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| CN202311740339.0A CN117740989A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | 一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法 |
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