JP6538004B2 - 質量分析によってジヒドロキシビタミンd代謝物を検出するための方法 - Google Patents
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Description
製造されるミルク製品およびある種の食品に添加される一般的なサプリメントでもある。食餌および内因性に合成されたビタミンD3の両方とも代謝活性化を受けて生理活性の代
謝物を生じるはずである。ヒトではビタミンD3活性化の最初の工程は主として肝臓で生
じ、水酸化されて中間の代謝物25−ヒドロキシビタミンD3(25−ヒドロキシコレカ
ルシフェロール;カルシフェジオール;25OHD3)が形成される。カルシフェジオー
ルは循環中のビタミンD3の主な形態である。次いで、循環する25OHD3は腎臓によって1,25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール;1,25(OH)2D3)に
変換され、これは一般には、最高の生物学的活性を有するビタミンD3の代謝物であると
考えられる。
プリメントは、コレカルシフェロール(ビタミンD3)ではなくエルゴカルシフェロール
(ビタミンD2)を含む。ドリスドールは米国で利用可能なビタミンDの唯一の高力価の
処方箋書式であり、エルゴカルシフェロールで処方される。ビタミンD2はヒトではビタ
ミンD3と同様の経路の代謝活性化を受け、代謝物25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)および1,25−ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D2)を形成する。ビタミンD2およびビタミンD3はヒトでは生物学的に等価であると長らくみなされてきたが、近年の報告では、ビタミンDのこれらの2つの形態の生理活性およびバイオアベイラビリティにおいて相違がある場合があることが示唆されている(非特許文献1)。
タミンD2(総25−ヒドロキシビタミンD;“25OHD”)の血清レベルがビタミン
Dの栄養状態およびある種のビタミンD類似体の有効性の有用な指標である。従って、25OHDの測定はカルシウム代謝の障害の診断および管理で共通して用いられる。これに関して、低レベルの25OHDは、低カルシウム血症、低リン酸血症、二次性副甲状腺機能更新症、アルカリホスファターゼ上昇、成体の骨軟化症および小児のくる病などの疾患に関連するビタミンD欠損の指標である。ビタミンD中毒が疑われる患者では、25OHDのレベルの上昇によって、この障害を、高カルシウム血症を生じる他の障害から識別する。
態、例えば、腎不全は、循環する1,25(OH)2Dのレベル低下によって診断するこ
とができ、そして1,25(OH)2Dのレベル上昇は、過剰な副甲状腺ホルモンの指標
であることができ、またはサルコイドーシスまたは特定のタイプのリンパ腫などの特定の疾患の指標でもあり得る。
タミンD2に同時に特異的な抗体を用いるラジオイムノアッセイによって行われている。
現在の免疫学ベースのアッセイは25−ヒドロキシビタミンD3および25−ヒドロキシ
ビタミンD2を別々に分離しないので、ビタミンD栄養の欠損の原因は、他の試験を行う
ことなしには決定できない。近年では、質量分析を用いて特定のビタミンD代謝物を検出するための方法を開示している報告が公開されている。例えば、非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;および非特許文献5は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて種々のビタミンD代謝物を検出するための方法を開示する。これらの方法には、質量分析による検出の前に代謝物を誘導体化することが必要である。誘導体化されない1,25(OH)2D3を液体クロマトグラフィー/質量分析によって検出する方法は、非特許文献6に開示されている。
は、固体支持体に結合された抗ジヒドロキシビタミンD抗体を用いてサンプルから免疫精製され;好ましくはこのジヒドロキシビタミンD代謝物は免疫粒子を用いて免疫精製され;好ましくはこの免疫粒子はそれらの表面上に抗ジヒドロキシビタミンD抗体を有する。特定の実施形態では、このジヒドロキシビタミンD代謝物(単数または複数)は1α,25(OH)2D2を含み;特定の実施形態では、このジヒドロキシビタミンD代謝物(単数または複数)は1α,25(OH)2D3を含み;ある特に好ましい実施形態では、1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3の存在または量を単一のアッセイで検出するための方法が提供される。
工程(c)から得られた1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3の量をタンデム型質量分析によって決定する工程であって:(i)586.37±0.5の質量/電荷比を有している誘導体化された1α,25(OH)2D2の前駆イオン、および574.37±0.5の質量/電荷比を有している誘導体化された1α,25(OH)2D3の前駆イオンを生成すること;(ii)工程(i)由来の前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成することであって、ここで断片イオンの少なくとも1つが314.12±0.5の質量/電荷比を有すること;ならびに(iii)工程(i)もしくは(ii)または両方で生成された1つ以上のイオンの存在または量を検出すること、およびこの検出されたイオンをサンプル中の1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3の存在または量に対して関連付けることによる工程。
1α,25(OH)2D3)または1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1α,25(
OH)2D2)である。特定の好ましい実施形態では、このジヒドロキシビタミンD代謝物は哺乳動物、さらに好ましくはヒトの体液中に自然に存在する。特定の特に好ましい実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3
(1α,25(OH)2D3)および/または1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1
α,25(OH)2D2)を検出し、24,25−ジヒドロキシビタミンD;25,26−ジヒドロキシビタミンD;および1α,3α−ジヒドロキシビタミンDからなる群より選択される1つ以上のジヒドロキシビタミン−D代謝物は検出しない。
またはモノクローナル抗体を指す。特定の好ましい実施形態では、抗ジヒドロキシビタミンD抗体は1α,25(OH)2D3および1α,25(OH)2D2に結合する。いくつかの好ましい実施形態では、抗ジヒドロキシビタミンD抗体は1α,25(OH)2D3および1α,25(OH)2D2と等しいかまたは同様の親和性で結合する。他の好ましい実施形態では、抗ジヒドロキシビタミンD抗体は、1α,25(OH)2D3と1α,25(OH)2D2よりも有意に高い親和性で結合し;別の好ましい実施形態では、この抗ジヒドロキシビタミンD抗体は1α,25(OH)2D2と1α,25(OH)2D3よりも有意に高い親和性で結合する。種々の実施形態では、ジヒドロキシビタミンD代謝物以外の化学種に対する抗ジヒドロキシビタミンD抗体の特異性は、変化し得;例えば、特定の好ましい実施形態では、この抗ジヒドロキシビタミンD抗体は、ジヒドロキシビタミンD代謝物に対して特異的であり従って、ジヒドロキシビタミンD代謝物以外の化学種(例えば、他のビタミンD代謝物、例えば、ビタミンDまたは25−ヒドロキシビタミンD)には親和性をほとんど有さないかまたは全く有さないが、他の好ましい実施形態では、この抗ジヒドロキシビタミンD抗体は非特異的であり、従ってジヒドロキシビタミンD代謝物以外の特定の化学種に結合する(例えば、非特異的な抗ジヒドロキシビタミンD抗体は、他のビタミンD代謝物、例えば、ビタミンDまたは25−ヒドロキシビタミンDに結合し得る)。
D2の前駆イオンを生成する工程;(d)前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する
工程であって、断片イオンの少なくとも1つが314.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンを含む工程;ならびに(e)工程(c)もしくは(d)またはその両方で生成された1つ以上のイオンの存在または量を検出し、この検出されたイオンをサンプル中の1α,25(OH)2D2の存在または量に対して関連付ける工程を含む。特定の好ましい実施形態では、サンプル中の1α,25(OH)2D2は工程(a)の前に免疫精製によって精製され;好ましくはこの免疫精製は、免疫粒子による免疫精製を含む;好ましくはこの免疫粒子は、この表面に対して結合した抗ジヒドロキシビタミンD代謝物を有する。この局面のいくつかの好ましい実施形態では、この方法はさらに、サンプル中の1α,25(OH)2D3の存在または量を検出する工程を含み;好ましくはこの1α,25(OH)2D3は質量分析の前に4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)で誘導体化され;さらに好ましくはこの1α,25(OH)2D3の前駆イオンが574.37±0.5の質量/電荷比を有する。
量を決定する工程を含み;好ましくはこの1α,25(OH)2D2は、質量分析の前に4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)で誘導体化され;さらに好ましくはこの1α,25(OH)2D2の前駆イオンは、586.37±0.5の質量/電荷比を有する。
D2をHPLCによって精製する工程;(b)411.35±0.5の質量/電荷比を有
している1α,25(OH)2D2の前駆イオンを生成する工程;(c)この前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、この1つ以上の断片イオンが151.12±0.5および135.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群より選択される1つ以上のイオンを含む、工程;ならびに(d)工程(b)もしくは(c)またはその両方で生成されたこの1つ以上のイオンの存在または量を検出する工程、およびこの検出されたイオンをこのサンプル中の1α,25(OH)2D2の存在または量に対して関連付ける工程を含む。この局面の好ましい実施形態では1α,25(OH)2D2は質量分析の前には誘導体化されていない。特定の好ましい実施形態では、サンプル中の1α,25(OH)2D2が工程(a)の前に免疫精製によって精製され;好ましくはこの免疫精製は、免疫粒子での免疫精製を含み;好ましくはこの免疫粒子は、表面に結合した抗ジヒドロキシビタミンD代謝物抗体を有する。この局面のいくつかの好ましい実施形態では、この方法はさらに、サンプル中の1α,25(OH)2D3の存在または量を決定する工程を含み;好ましくはこの1α,25(OH)2D3は質量分析の前に誘導体化されておらず;さらに好ましくはこの1α,25(OH)2D3の前駆イオンは399.35±0.5の質量/電荷比を有する。
(MS)の固有の方法とを組み合わせて、これによって試験サンプル中のジヒドロキシビタミンD代謝物を検出および定量するための高速アッセイシステムを提供する。特定の特に好ましい実施形態では、ジヒドロキシビタミンD代謝物は質量分析前に免疫精製される。この好ましい実施形態は特に、大規模な臨床検査室への適用に十分適している。特異性が向上しており、他のジヒドロキシビタミンD代謝物アッセイで必要な時間とサンプルよりも少ない時間とサンプルとで達成される、ジヒドロキシビタミンD代謝物を検出および定量する方法が提供される。
質量分析前にサンプル中の他の成分に対してジヒドロキシビタミンD代謝物を富化するか、またはサンプル中のジヒドロキシビタミンD代謝物の濃度を増大する方法が用いられ得る。このような方法としては例えば、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー(TLC)、電気泳動、例えば、キャピラリー電気泳動、アフィニティ分離、例えば、イムノアフィニティー分離、抽出方法、例えば、酢酸エチル抽出およびメタノール抽出、ならびにカオトロピック剤または上記の任意の組み合わせなどが挙げられる。
特に好ましい実施形態では、この方法は、質量分析の前にジヒドロキシビタミンD代謝物を免疫精製する工程を含む。この免疫精製工程は、当該分野で周知の任意の免疫精製方法を用いて行うことができる。しばしばこの免疫精製手順は、固体支持体、例えば、カラム、ウェル、チューブ(試験管)、カプセル、粒子などに対して結合するか、コンジュゲートするか、固定するかそうでなければ付着した抗体を利用する。一般には、免疫精製方法は、目的の分析物を含むサンプルと抗体とをインキュベートして、その結果その分析物をこの抗体に結合させる工程、(2)1回以上の洗浄工程を行う工程、および(3)抗体からこの分析物を溶出する工程を含む。
せる。カラムの使用によって、インキュベーション、洗浄および溶出工程を行う容易さが改善され得る。いくつかの好ましい実施形態では、この免疫精製は、アフィニティークロマトグラフィー;好ましくは自動的アフィニティークロマトグラフィー;好ましくはアフィニティー−HPLC;または好ましくはGE Healthcare(以前はAmersham biosciences)が市販しているAKTA FPLCクロマトグラフィック・システムなどの自動的なシステムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって行う。
Iラジオイムノアッセイキット(Catalogue Number AA−54F1)を供給する。その全体が出典明記によって本明細書に援用されるキットである、カタログ番号AA−54F1 IDS,Inc.の「Product Support」文書を参照のこと。詳細には、IDS ジヒドロキシビタミンD RIAキットは、硫酸デキストラン/塩化マグネシウム脱脂質工程および1,25ジヒドロキシビタミンDに特異的なモノクローナル抗体に結合される粒子の懸濁物を含むイムノカプセルデバイスを用いる免疫抽出工程を含む。従って、本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、このサンプルを、IDSのキットまたは方法、試薬およびIDSキットに示されるものと類似のジヒドロキシビタミンD免疫精製デバイスを用いてビタミンD免疫精製に供する。抗体およびジヒドロキシ精製の免疫精製デバイスはまた、ALPO Diagnostics(Salem,NH)が市販している1,25−(OH)2−ビタミンD ImmunoTube ELISA Kit(カタログ番号30−2113)とともに提供される。このキットは抗1,25−(OH)2ビタミン−D検出抗体(カタログ番号K2113A1)、1
,25−ジヒドロキシビタミンDの免疫精製のためのImmunoTube columns(カタログ番号K2113.SI)ならびに1,25−ジヒドロキシビタミンDを免疫精製するために用いられ得る緩衝液および他の試薬を備える。本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、ALPO Diagnosticsキットの1つ以上の成分を用いて1,25−ジヒドロキシビタミンDを免疫精製する。
一般には、クロマトグラフィーは質量分析前に行われ、好ましくはこのクロマトグラフィーは液体クロマトグラフィー、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である。いくつかの好ましい実施形態では、このクロマトグラフィーはガスクロマトグラフィーではない。好ましくは、本発明の方法は、サンプルまたは目的のジヒドロキシビタミンD代謝物を質量分析の前にガスクロマトグラフィーにかけることなく行う。
Monitoring 22:608〜12(2000)(血液サンプルの手動的な沈殿、続いて手動的なC18固相抽出、C18分析カラム上のクロマトグラフィーのためのHPLCへの注入、およびMS/MS分析(manual precipitation of blood samples,followed by manual C18 solid phase extraction,injection into an
HPLC for chromatography on a C18 analytical column,and MS/MS analysis));ならびにSalm et al.,Clin.Therapeutics 22 Supl.B:B71−B85(2000)(血液サンプルの手動的な沈殿、続いて手動的なC18固相抽出、C18分析カラム上のクロマトグラフィーのためのHPLCへの注入、およびMS/MS分析(manual precipitation of blood samples,followed by manual C18 solid phase extraction,injection into an HPLC forchromatography on a C18 analytical column,and MS/MS analysis))。
供される分離特徴を改善すると考えられる。いくつかの実施形態では、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)は、単独でまたは1つ以上の精製方法と組みわせて、質量分析の前に目的のジヒドロキシビタミンD代謝物を精製してもよい。このような実施形態では、サンプルを、分析物を捕獲するHTLC抽出カートリッジを用いて抽出してもよく、次いでイオン化の前に第二のHTLCカラム上で、または分析的HPLCカラム上に溶出およびクロマトグラフィーしてもよい。これらのクロマトグラフィー手順を含む工程は、自動的な形式で連結することが可能で、分析物の精製の間の操作者の関与のための要件を最小化することができる。この方法の特定の実施形態では、サンプルをHTLCカラム上のローディングの前に上記の様なタンパク質沈殿に供し;別の実施形態では、サンプルをタンパク質沈殿の供することなくHTLC上に直接ロードしてもよい。
方法を提供する。Kamaoらが記載したキラルクロマトグラフィー手順は、本発明の方法に適切であるが、当業者は、やはり適切である多数の他のキラルクロマトグラフィー方法があることを理解する。好ましい実施形態では、この方法は、もしサンプル中にあれば、キラルクロマトグラフィーを用いて、25(OH)D3を3−エピ−25(OH)D3から分離する工程;および質量分析を用いてサンプル中の25(OH)D3および3−エピ
−25(OH)D3の存在および/または量を検出する工程を含む。関連の実施形態では
、この方法は、もしサンプル中にあれば、キラルクロマトグラフィーを用いて、1α,25(OH)2D3を3−エピ−1α,25(OH)2D3から分離する工程;および質量分析を用いてサンプル中の1α,25(OH)2D3および3−エピ−1α,25(OH)2D3の存在および/または量を検出する工程を含む。本発明の特定の実施形態では、キラルクロマトグラフィーを上記のHTLC方法と組み合わせて用いる。
サンプル中の1つ以上のジヒドロキシビタミンD代謝物の存在または量を検出するための方法が開示される。特定の局面では、この方法は、ジヒドロキシビタミンD代謝物(単数または複数)をイオン化する工程、このイオン(単数または複数)を質量分析によって検出する工程、およびこのイオン(単数または複数)の存在または量をサンプル中のジヒドロキシビタミンD代謝物(単数または複数)の存在または量に対して関連付ける工程を含む。この方法は、(a)サンプル中に存在する場合、ジヒドロキシビタミンD代謝物を精製する工程、(b)この精製されたジヒドロキシビタミンD代謝物をイオン化する工程、および(c)このイオンの存在または量を検出する工程であって、このイオンの存在または量をサンプル中のジヒドロキシビタミンD代謝物の存在または量に関連付ける工程を含み得る。好ましい実施形態では、このイオン化工程(b)は、(i)サンプル中に存在する場合、ジヒドロキシビタミンD代謝物をイオン化して、イオンを生成する工程;(ii)このジヒドロキシビタミンD代謝物イオンを質量分析によって単離して前駆イオンを得る工程、および(iii)単離された前駆イオンと不活性な衝突ガスとの間の衝突を果たして、質量分析計で検出可能な少なくとも1つの断片イオンを生成する工程を含み得る
。特定の好ましい実施形態では、この前駆イオンはジヒドロキシビタミンD代謝物のプロトン化および脱水されたイオンである。
これが第二のMS手順で分析される。前駆イオンの注意深い選択によって、特定の分析物によって生成されるイオンのみが断片化チャンバに渡され、ここで不活性ガスの原子と衝突して娘イオンを生じる。前駆イオンおよび断片イオンの両方が所定のセットのイオン化/断片化条件下で再現性の方式で産生されるので、MS/MS技術は、極めて強力な分析ツールをもたらすことができる。例えば、濾過/断片化の組み合わせを用いることによって妨害物質を排除することが可能で、特に、生体サンプルなどの複雑なサンプルでは有用であり得る。
]−2Hまたはその両方である。もとの分子の存在または量に対してイオンの存在または
量を関連付けるための多数の他の方法が当業者に周知である。
物(すなわち、ジヒドロキシビタミンD代謝物)をその界面のコロナ放電針でイオン化し、これによって噴霧された溶媒/分析物混合物に大きい電圧を印加する。このイオン、すなわち、前駆イオンは、装置の開口部を通過して、第一の四重極に入る。四重極1および3(Q1およびQ3)は質量フィルターであって、それによって、その質量対電荷比(m/z)に基づいてイオン(すなわち、「前駆」イオンおよび「断片」イオン)を選択することが可能になる。四重極2(Q2)は衝突セルであり、ここでイオンが断片化される。質量分析計の第一の四重極(Q1)は、分析されるべき特定のジヒドロキシビタミンD代謝物の質量対電荷比を有する分子を選択する。特定のジヒドロキシビタミンD代謝物の前駆イオンの正確なm/z比を有する前駆イオンは衝突チャンバ(Q2)に通ることが可能であるが、任意の他のm/zを有する望ましくないイオンは四重極の横で衝突して排除される。Q2に入る前駆イオンは中性のアルゴンガス分子および断片と衝突する。この過程は衝突活性化解離(CAD)と呼ばれる。生成された断片イオンは、四重極3(Q3)に通過し、ここでこの望ましいジヒドロキシビタミンD代謝物の断片イオンが選択されるが、他のイオンは排除される。
5OHD3の1つ以上のイオンのピークに基づいた較正標準曲線を用いて、元の分析物、
すなわち、ジヒドロキシビタミンD代謝物の絶対量に変換してもよい。
D代謝物の前駆イオンの量と1つ以上の断片イオンの量の比(単数または複数)を計算して、同様に測定したジヒドロキシビタミンD代謝物の分子標準の比(単数または複数)に対して比較してもよい。ジヒドロキシビタミンD代謝物の2つ以上の断片イオンがモニターされる実施形態では、種々の断片イオンについての比(単数または複数)を、前駆イオンに比べた断片イオン(単数または複数)の比の代わりに、またはそれに加えて決定してもよい。このような比がモニターされる実施形態では、分子標準に比較してサンプル中のイオン比に実質的な相違がある場合、サンプル中の分子は結果を妨げている可能性が高い。逆に、サンプルおよび分子標準におけるイオン比が同様であるならば、妨害がないという信頼が増大している。従って、サンプル中のこのような比をモニタリングすること、およびこの比を確証的な分子標準の比と比較することを用いて、この方法の正確性を増大してもよい。
25−ジヒドロキシビタミンD2の決定
50μlの内部標準混合物(1α,25(OH)2D3−[6,19,19]−2Hを50pg/50マイクロリットルで用い、かつ1α,25(OH)2D2−[26,26,26,27,27,27]−2Hを200pg/50マイクロリットルで用いてスパイクした剥離血清)を試験管に添加し、次いで500μlの較正溶液、品質管理試験溶液、または血清標準、続いて内部標準混合物を添加した。その溶液を、50μlのMgCl2
/硫酸デキストラン溶液を添加して、徹底的に混合することによって脱脂した。その試験管を次に、20分間遠心分離して、500μlの上清を、ALPCO Diagnostics(カタログ番号K2113.SI)の抗ジヒドロキシビタミンD免疫カプセルを含むImmunoTubeカートリッジに移した。そのカートリッジをシェーカー上で室温で2時間インキュベートした。次いでそのビーズを750μlの脱イオン水で3回洗浄した。そのビーズを、カートリッジを遠心分離することによって洗浄の間に排出させた。ビーズに結合したジヒドロキシビタミンDを、250μlのエタノールを用いて直接ガラスのHPLCインサート中に溶出し、次いで窒素下で完全に乾燥させた。次いでサンプルを、50μlの50マイクロリットルの4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)溶液(アセトニトリル中0.8mg/mL)を添加することによって誘導体化した。その誘導体化反応を、50μlの脱イオン水を添加することによって停止した。
移動相Aおよび50%の移動相Bから2%の移動相Aおよび98%の移動相Bであった;洗浄工程(60秒)は2%の移動相Aおよび98%の移動相Bであった;そして再調節工程は50%の移動相Aおよび50%の移動相Bであった。
部標準)の質量対電荷比を有する分子を選択した。これらのm/z比を有するイオン(下の表を参照のこと)によって、衝突チャンバへ(Q2)の通過が可能になったが、任意の他のm/zを有する望ましくないイオンは、四重極の横で衝突して、排除される。Q2に入るイオンは天然のアルゴンガス分子および断片と衝突する。生成された断片イオンは、四重極3(Q3)に通過して、ここで1α,25(OH)2D2、1α,25(OH)2D3、6D−1α,25(OH)2D2(内部標準)および−1α,25(OH)2D3(内部標
準)の断片イオンが選択され(下の表を参照のこと)、他のイオンが排除される。以下の質量移行をバリデーションの間の検出および定量のために用いた:
面積比を用いて、較正曲線を構築し、次にこれを用いて分析物濃度を計算した。較正曲線を用いて、1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3の濃度を患者のサンプル中で定量した。
1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3のストック溶液をプールした血
清に添加して、低プール(Low Pool)(10〜15ng/mLの各々の代謝物)、中−低プール(Medium−Low Pool)(25〜35ng/mLの各々の代謝物)、中−高プール(Medium−High Pool)(55〜65ng/mLの各々の代謝物)および高プール(High Pool)(115〜130ng/mL)を作製した。各々の低(Low)、中−低(Medium−Low)、中−高(Medium−High)および高(High)のプール由来の4つのアリコートを、実施例1に記載されるLC−MS/MSプロトコールを用いて単一アッセイで分析した。以下の正確な値を決定した:
Claims (20)
- サンプル中の1つ以上のジヒドロキシビタミンD代謝物の量を、タンデム型質量分析によって、決定するための方法であって:
(i) 1α,25(OH) 2 D 2 または1α,25(OH) 2 D 3 を含むジヒドロキシビタミンD代謝物の前駆イオンを、前記ジヒドロキシビタミンD代謝物をイオン化することによって、生成する工程、
ここで、前記1α,25(OH) 2 D 2 から生成する前駆イオンが411.35±0.5の質量/電荷比を有し、前記1α,25(OH) 2 D 3 から生成する前駆イオンが399.35±0.5の質量/電荷比を有する;
(ii) 前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程、ただし、前記1つ以上の断片イオンは、151.12±0.5および135.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群から選ばれる1つ以上のイオンを含む;および
(iii) 工程(i)もしくは(ii)または両方で生成された1つ以上の前記イオンの量を検出して、検出されたイオンの量を前記サンプル中の前記ジヒドロキシビタミンD代謝物の量に対して関連付ける工程;
但し、前記ジヒドロキシビタミンD代謝物は誘導体化に供されていない、
を含む方法。 - 免疫精製工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫精製工程が、抗ジヒドロキシビタミンD抗体を使用することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ジヒドロキシビタミンD代謝物が1α,25(OH)2D2および1α,25(OH)2D3を含み、前記代謝物の前記量が単一のアッセイで決定される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- サンプル中の1α,25(OH)2D2の量をタンデム型質量分析によって決定するための方法であって:
(a) 1α,25(OH)2D2をHPLCによって精製する工程;
(b) 工程(a)で得られた411.35±0.5の質量/電荷比を有する前記1α,25(OH)2D2の前駆イオンを、前記1α,25(OH)2D2をイオン化することによって、生成する工程;
(c) 前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、前記1つ以上の断片イオンが151.12±0.5および135.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群から選ばれる1つ以上のイオンを含む、工程;および
(d) 工程(b)もしくは(c)またはその両方で生成される前記1つ以上のイオンの量を検出し、検出されたイオンを前記サンプル中の1α,25(OH)2D2の量に対して関連付ける工程;
但し、前記1α,25(OH)2D2は誘導体化されていない、
を含む方法。 - 前記サンプル中の1α,25(OH)2D2が工程(a)の前に免疫精製によって精製される、請求項5に記載の方法。
- 免疫精製が免疫粒子を利用する、請求項6に記載の方法。
- 前記サンプル中の1α,25(OH)2D3の量を決定する工程をさらに含む、請求項5〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記1α,25(OH)2D3が、質量分析の前に誘導体化されておらず;前記1α,25(OH)2D3の前記前駆イオンが399.35±0.5の質量/電荷比を有する、請求項8に記載の方法。
- サンプル中の1α,25(OH)2D3の量をタンデム型質量分析によって決定するための方法であって:
(a) 1α,25(OH)2D3をHPLCによって精製する工程;
(b) 工程(a)で得られた399.35±0.5の質量/電荷比を有している1α,25(OH)2D3の前駆イオンを、前記1α,25(OH)2D3をイオン化することによって、生成する工程;
(c) 前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、前記1つ以上の断片イオンが151.12±0.5および135.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群から選ばれる1つ以上のイオンを含む、工程;
(d) 工程(b)もしくは(c)またはその両方で生成された前記イオンの1つ以上の量を検出し、検出されたイオンを前記サンプル中の1α,25(OH)2D3の量に対して関連付ける工程;
但し、前記1α,25(OH)2D3は質量分析の前に誘導体化されていない、
を含む方法。 - 前記サンプル中の1α,25(OH)2D3が工程(a)の前に免疫精製によって精製される、請求項10に記載の方法。
- 免疫精製が免疫粒子を利用する、請求項11に記載の方法。
- 前記サンプル中の1α,25(OH)2D2の量を決定する工程をさらに含む、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記1α,25(OH)2D2が、質量分析の前に誘導体化されておらず;前記1α,25(OH)2D2の前記前駆イオンが411.35±0.5の質量/電荷比を有する、請求項13に記載の方法。
- ヒトサンプル中の1つ以上のジヒドロキシビタミンD代謝物の量を、タンデム型質量分析によって、決定するための方法であって:
(i) 1α,25(OH) 2 D 2 または1α,25(OH) 2 D 3 を含むジヒドロキシビタミンD代謝物の前駆イオンを、前記ジヒドロキシビタミンD代謝物をイオン化することによって、生成する工程、
ここで、前記1α,25(OH) 2 D 2 から生成する前駆イオンが411.35±0.5の質量/電荷比を有し、前記1α,25(OH) 2 D 3 から生成する前駆イオンが399.35±0.5の質量/電荷比を有し、前記ジヒドロキシビタミンD代謝物は誘導体化に供されていない;
(ii) 前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程、ただし、前記1つ以上の断片イオンは、151.12±0.5および135.12±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群から選ばれる1つ以上のイオンを含む;および
(iii) 工程(i)もしくは(ii)または両方で生成された1つ以上の前記イオンの量を検出して、検出されたイオンの量を前記サンプル中の前記ジヒドロキシビタミンD代謝物の量に対して関連付ける工程;
を含む方法。 - 前記ジヒドロキシビタミンD代謝物が免疫精製によって精製される、請求項15に記載の方法。
- 前記免疫精製されたジヒドロキシビタミンD代謝物が、質量分析の前に液体クロマトグラフィーによってさらに精製される、請求項16に記載の方法。
- 前記サンプルが前記免疫精製の前にタンパク質沈殿に供される、請求項16または17に記載の方法。
- 6D−25OHD3が内部標準として用いられる、請求項15〜18のいずれかに記載の方法。
- C18固相抽出をさらに含む、請求項15〜19のいずれかに記載の方法。
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