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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Messung von Wechselwirkungen
und insbesondere biospezifischen Wechselwirkungen in einem Assay
unter Verwendung von Massenspektrometrie. Insbesondere ermöglicht die
vorliegende Erfindung die Messung von spezifischen Wechselwirkungen
in einem homogenen biochemischen Assay. In einer besonderen Ausführungsform
wird diese Nachweistechnik als Überwachungsverfahren
für biochemische
Assays unter Verwendung eines bekannten Liganden verwendet. Weiterhin
bezieht sich diese Erfindung auf die Verwendung von neu nachgewiesenen
Verbindungen als Ligand für
Affinitätsmoleküle.
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Biochemische
Assays sind hochempfindliche Nachweistechniken für die Messung von biospezifischen
Wechselwirkungen. Die Affinität
von zu testenden Liganden zu einem Affinitätsmolekül, zum Beispiel einem Affinitätsprotein,
wie einem Antikörper,
Rezeptor oder Enzym, wird typischerweise unter Verwendung eines
markierten Liganden, d.h. einer Verbindung mit bekannter Affinität zu dem
Affinitätsmolekül, wie eines
Proteins, das eine nachweisbare Struktureinheit, wie einen Radiomarker,
ein Fluorophor oder ein Enzym, enthält, als Reportermolekül getestet.
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Biochemische
Assays werden diskontinuierlich, zum Beispiel in einer Mikrotiterplatte,
oder als Durchflussverfahren durchgeführt. Typischerweise wird das
Affinitätsmolekül mit der
Probe und einem geeigneten Marker inkubiert, und nach einer bestimmten
Inkubationszeit wird die Menge des freien oder gebundenen Markers
bestimmt. Wenn die Nachweiseigenschaften des freien und des gebundenen
Markers identisch sind, müssen
beide Fraktionen vor dem Nachweis getrennt werden. Es sind mehrere
homogene Assayformate bekannt, die sich Nachweisunterschiede zwischen
freiem und gebundenem Marker, zum Beispiel eine unterschiedliche Fluoreszenz-Quantenausbeute,
zu Nutze machen. In einem solchen Fall kann eine Fraktion in Gegenwart der
anderen nachgewiesen werden, wodurch zeitraubende und aufwändige Trennschritte
vermieden werden.
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Ein
Nachteil von biochemischen Assays auf der Basis der Verwendung von
besonderen Markern ist die Notwendigkeit, einen geeigneten Marker
für das
einem Screening zu unterziehende Affinitätsmolekül, wie ein Protein, zu finden.
Die Synthese von Markern, die einerseits empfindliche Nachweiseigenschaften
haben und andererseits ihre vorzugsweise hohe Bindungsaffinität beibehalten,
ist eine schwierige Aufgabe, insbesondere für Rezeptoren, bei denen die
Bindung eines Fluorophors oder Enzyms an einen bekannten Liganden
häufig
die Bindungsaffinität des
synthetisierten Markers signifikant reduziert.
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Die
Synthese von neuen Markern kann vermieden werden, wenn Detektoren
verwendet werden, die keine spezifischen chemischen oder biochemischen
Reportermoleküle,
wie Fluorophore oder Enzyme, benötigen.
Ein Massenspektrometer (MS) ist ein Beispiel für einen Detektor, der eine
Verbindung in ihrem nativen Zustand mit der erforderlichen Empfindlichkeit
messen kann, d.h. die Verbindung kann nachgewiesen werden, ohne
eine chemische Modifizierung zu erfordern. Die Verwendung von Massenspektrometrie
als Nachweistechnik in biochemischen Assays erübrigt daher die Synthese neuer Marker,
bevor der Assay entwickelt und verwendet werden kann.
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Seiffert
et al. (J. Anal. Chem., 363 (1999), 767-770) schlagen ein Screeningverfahren
auf MS-Basis vor, wobei aktive Liganden unter Verwendung einer immobilisierten
Rezeptorsäule
aus der Probe isoliert werden. Anschließend wird die gebundene Fraktion
desorbiert und durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie
gemessen. Dieses Verfahren stellt den direkten Nachweis des aktiven Moleküls unter
Verwendung von Massenspektrometrie dar. Dies ist besonders nachteilig
bei Anwendungen, bei denen neue, unbekannte Liganden nachgewiesen
werden müssen,
da das MS in dem ziemlich unempfindlichen Gesamtionenstrom(TIC)-Modus
betrieben werden muss. Außerdem
kann die Immobilisierung von Rezeptoren zu einer partiellen oder
vollständigen
Deaktivie rung des Proteins aufgrund von sterischer Hinderung führen. Außerdem führen die Desorptionsbedingungen
für die
Freisetzung der gebundenen aktiven Liganden häufig zu einer irreversiblen
Denaturierung des Rezeptors, was einen häufigen Austausch der immobilisierten
Rezeptorsäule erfordert.
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Nedved
et al. (Analytical Chemistry, 68 (1996), 4226-4236) beschreiben
eine ähnliche
Technik, bei der kombinatorische Bibliotheken von kleinen Molekülen unter
Verwendung einer immobilisierten Immunaffinitätssäule, die an Umkehrphasen-Flüssigchromatographie
und Ionenspray-Massenspektrometrie gekoppelt sind, durchmustert
werden. Wiederum werden aktive Verbindungen direkt im vollen Scan-Modus
nachgewiesen. Die Verwendung einer immobilisierten Antikörpersäule ist
mit dem oben beschriebenen Verfahren von Seiffert et al. mit allen Nachteilen
dieses Assayformats identisch.
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Hsieh
et al. (Molecular Diversity, 2 (1996), 189-196) beschreiben ein
mehrdimensionales chromatographisches Screeningverfahren unter Verwendung
von Massenspektrometrie zum Nachweis. Nach der Inkubation des Affinitätsproteins
mit der bzw. den Verbindungen, die einem Screening unterzogen werden
sollen, wird die gebundene Fraktion mit Hilfe von Ausschlusschromatographie
von der ungebundenen Fraktion getrennt. Anschließend wird die proteingebundene
Fraktion zu einer an Massenspektrometrie gekoppelten Umkehrphasen-Flüssigchromatographie-Säule geleitet,
und die an das Affinitätsprotein
gebundenen kleinen Moleküle
werden bestimmt. Im Gegensatz zu Seiffert et al. und Nedved et al.
beschreiben Hsieh et al. einen biochemischen Assay, bei dem die
Wechselwirkung von Liganden und Rezeptoren in Lösung stattfindet, d.h. der
Rezeptor ist nicht immobilisiert. Nach dem primären Inkubationsschritt müssen jedoch
zwei chromatographische Verfahren angewendet werden, bevor die aktive
Verbindung direkt nachgewiesen werden kann. Da die Struktur der
aktiven Verbindung nicht bekannt ist, muss das Massenspektrometer
außerdem
im unselektiven TIC-Modus betrieben werden.
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J.
Chromatography A 775, 1996, S. 179-187, beschreibt einen immunchemischen
Nachweisschritt, der als Nachsäulenreaktion
nach der Chromatographie durchgeführt wird. Es wird kein MS-Schritt
durchgeführt.
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Die
nicht vorveröffentlichte
EP-A-1 048 951 (Irth und Van der Greef) beschreibt die Verwendung von
Massenspektrometrie als Nachweistechnik für die Messung von biospezifischen
Wechselwirkungen. Anstatt einen Marker zu verwenden, wird ein bekannter
Ligand mit guten MS-Nachweiseigenschaften als Reportermolekül verwendet,
um die Anwesenheit von aktiven Verbindungen in einer Probe nachzuweisen.
Das beschriebene Verfahren umfasst eine sequentielle biochemische
Reaktion, wobei die Probe mit einem Affinitätsprotein inkubiert wird, und anschließend wird
ein bekannter Ligand hinzugefügt, um
die übrigen
freien Bindungsstellen zu titrieren. In einem letzten Schritt wird
die freie Fraktion des bekannten Liganden unter Verwendung eines
Hohlfaser-Trennmoduls oder einer Restricted-Access-Säule von
der proteingebundenen Fraktion getrennt. Nur die freie Fraktion
wird zum Massenspektrometer geleitet, während die Proteinfraktion verworfen
wird. Das Verfahren von EP-A-1 048 951 ist somit ein heterogenes
Assayformat, das die Trennung des nachweisbaren Moleküls von der
proteingebundenen Fraktion erfordert.
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Die
vorliegende Erfindung möchte
ein Verfahren bereitstellen, das leichter durchzuführen ist als
heterogene Assays, die die Trennung von freien und proteingebundenen
Reportermolekülen
erfordern. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen
homogenen biochemischen Assay unter Verwendung von Massenspektrometrie
als Ausgabeverfahren. Der Assay erfordert nicht die Trennung von freiem
und gebundenem Marker, wie es von Irth und Van der Greef beschrieben
wird. Die Unterschiede zwischen dem Verfahren von Irth und Van der
Greef und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in Schema
1 gezeigt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung hat sich gezeigt, dass die oben genannten Probleme mit
einem mitlaufenden Nachweisverfahren überwunden werden können, bei
dem eine ausfließende
Flüssigkeit
eines Fraktionierungsschritts mit einer definierten Menge von Affinitätsmolekülen in Kontakt
gebracht wird, gefolgt von einem Schritt, bei dem man die Affinitätsmoleküle an Analyten
binden lässt,
von denen man annimmt, dass sie in der ausfließenden Flüssigkeit vorhanden sein könnten, gefolgt
von der Zugabe einer definierten Menge bekannter Liganden, gefolgt
von einem Schritt, bei dem man Liganden unter Bildung von Komplexen
aus Ligand/Affinitätsmolekül an die
Affinitätsmoleküle binden
lässt,
und gefolgt von einem Nachweis der freien Liganden in Gegenwart
der Komplexe aus Ligand/Affinitätsmolekül mit Hilfe
eines Massenspektrometers.
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Überraschenderweise
kann das MS verwendet werden, um freie Liganden in Gegenwart der Komplexe
aus Ligand/Affinitätsprotein
nachzuweisen, was aufwändige
Trennschritte erübrigt.
Die vorliegende Erfindung überwindet
außerdem
ein Problem, das mit Trennschritten verbunden ist und dass in der
unspezifischen Bindung von Proteinen an Oberflächen von Trennvorrichtungen,
wie Hohlfasermodulen oder Restricted-Access-Phasen, die in Verfahren
des Standes der Technik, wie dem Verfahren von Irth und Van der
Greef, erforderlich sind, liegt. Außerdem ist keine Regeneration
von Trennvorrichtungen erforderlich, was einen kontinuierlichen
Betrieb von Assaysystemen erlaubt. Weiterhin ist die Assayentwicklungszeit
für neue
Screening-Assays erheblich reduziert, da es nicht notwendig ist,
die Trennbedingungen zu untersuchen und zu optimieren.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der mitlaufenden Kopplung eines
Fraktionierungsschritts, wie Flüssigchromatographie,
an ein biochemisches Reaktionsmodul. Zu der ausfließenden Flüssigkeit des
Fraktionierungsschritts wird eine definierte Menge eines Affinitätsmoleküls, z.B.
eines Proteins, wie eines Rezeptors, Antikörpers oder Enzyms, gegeben.
Nach einer kurzen Reaktionszeit (maximal etwa 3 Minuten) wird eine
definierte Menge eines bekannten Liganden zu dem Reaktionsgemisch
gegeben und während
einer kurzen Zeit, d.h. 2-3 Minuten, wechselwirken gelassen. Das
gesamte Reaktionsgemisch wird ohne vorherige Trennung von freiem
und gebundenem bekannten Liganden in ein Massenspektrometer eingeführt. Die
durch das MS nachgewiesene Änderung
der Menge des bekannten Liganden zeigt die Anwesenheit einer das
Affinitätsmolekül bindenden
Verbindung in der ausfließenden
Flüssigkeit
an. Im Gegensatz zu den von Irth und Van der Greef beschriebenen
heterogenen Assays wird die Menge der freien bekannten Liganden
in Gegenwart des Komplexes aus gebundenem Liganden/Affinitätsprotein
nachgewiesen. Es ist sehr überraschend, dass
freier Ligand unabhängig
von der Menge des in Komplexen mit Affinitätsmolekülen gebundenen Liganden durch
MS nachgewiesen wird.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht den Nachweis der Anwesenheit
einer aktiven Verbindung in einem Gemisch durch Überwachen der Änderungen
der Konzentration eines bekannten Liganden bei seinem spezifischen
Masse-Ladungs-Verhältnis.
Außerdem
kann die Molekülmasse
der aktiven Verbindung gleichzeitig gemessen werden, indem man das
Gesamtionenstromchromatogramm zu dem Zeitpunkt, wenn das Maximum
für den
bekannten Liganden auftritt (siehe Schema 2), überwacht.
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Ein
Vergleich der MS-Daten, die man erhält, wenn Analyten injiziert
werden, mit dem Signal, das man erhält, wenn nur die definierten
Mengen an Affinitätsmolekül und nachweisbarem
Liganden in das Durchflusssystem eingeführt werden, liefert Informationen
in Bezug auf den Prozentsatz der Bindungsstellen, die von in der
ausfließenden
Flüssigkeit
des Fraktionierungsschritts vorhandenen Analyten besetzt sind. Der
Fachmann besitzt das Wissen, um die aus dem Nachweisverfahren erhaltenen
Daten zu verarbeiten und zu bewerten. Der Prozentsatz der Bindungsstellen,
die von einem in der ausfließenden Flüssigkeit
vorhandenen Analyten besetzt sind, kann verwendet werden, um neue
Verbindungen zu finden, die eine Wechselwirkung mit einem bekannten Affinitätsmolekül zeigen.
Diese Information liefert die Möglichkeit,
das mitlaufende Trennungs-/Affinitätsmolekülnachweis-Verfahren der vorliegenden
Erfindung zum Beispiel bei der Suche nach Wirkstoffen auszuführen.
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Ein
System zum Hochdurchsatz-Screening, das bei der Suche nach Wirkstoffen
verwendet werden soll, besteht zum Beispiel aus den folgenden Schritten.
Komplexe Proben, die zum Beispiel in einem vorgeschalteten System
der kombinatorischen Chemie entstehen, werden vorfraktioniert zu
Fraktionen, die Verbindungen mit ähnlicher Polarität enthalten,
wobei man zum Beispiel eine Festphasenextraktionstechnik oder elektrophoretische
Probenhandhabungsprinzipien verwendet. Jede Fraktion kann zusätzlich aufgetrennt
werden, wobei man zum Beispiel flüssigchromatographische Trennsäulen entweder
im analytischen oder im präparativen
Maßstab
verwendet. Die Verbindungen, die aus der LC-Säule
eluiert werden, werden mitlaufend nachgewiesen, wobei man eine geeignete
Affinitätsmolekül-Nachweistechnik
verwendet. Wenn Trennsäulen
im präparativen Maßstab angewendet
werden, wird eine der Säule nachgeschaltete
Stromaufteilung durchgeführt.
Einer der beiden Ströme
wird einem Nachweis unter Verwendung der Affinitätsmolekül-Nachweistechnik unterzogen;
der andere Strom wird einem Fraktionssammler zugeleitet. Abhängig von
dem Signal, das von dem Affinitätsmoleküldetektor
erhalten wird, werden Fraktionen, die Verbindungen enthalten, die
eine positive Reaktion verursachen, gesammelt, während Fraktionen, die eine
negative Reaktion verursachen, verworfen werden. Dieses vollständige Screening-Verfahren
kann unter Verwendung von bekannten Ventilumschaltvorgängen automatisiert
werden.
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Ein
geeignetes Fraktionierungsverfahren, das in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden soll, umfasst eine Flüssigchromatographietrennung
oder einen Kapillarelektrophoreseschritt. Andere Trenn- oder Fraktionierungstechniken,
die dem Fachmann bekannt sind und die einen relativ kontinuierlichen
Ausgabestrom ermöglichen, können jedoch
ebenfalls verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Flüssigchromatographie-Trennschritt
ein Umkehrphasen-HPLC-Schritt.
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Man
wird sich darüber
im Klaren sein, dass gemäß der vorliegenden
Erfindung unter der ausfließenden
Flüssigkeit
eines Fraktionierungsschritts auch die ausfließende Flüssigkeit einer Fließinjektion zu
verstehen ist, bei der ein Gemisch von verschiedenen Verbindungen
injiziert wird. Die erforderliche Selektivität kann erhalten werden, indem
man die MS so betreibt, dass eine selektive Aufspürung bei
der MS erhalten wird.
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Da
die Fließinjektionstechnik
ein flexibles und schnelles Screening-Verfahren ergibt, ist sie
eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Im
Fließinjektionsmodus
sind alle Moden des MS-Betriebs möglich, doch aufgrund des höheren Hintergrunds
sind insbesondere die sehr selektiven Modi geeignet, die den Nachweis
von Ionen einer ausgewählten
einzelnen m/z-Spur oder von ausgewählten mehrfachen m/z-Spuren
umfassen.
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Wie
bereits erwähnt,
kann der Fraktionierungsschritt eine Flüssigchromatographietrennung, ein
Kapillarelektrophoreseschritt oder ein System der kombinatorischen
Chemie sein. Bevorzugte Flüssigchromatographie-Fraktionierungsschritte
umfassen HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Kapillarelektrophorese (CE), Kapillarelektrochromatographie
(CEC), isoelektrische Fokussierung (IEF) oder mizellare elektrokinetische
Chromatographie (MEKC); diese Techniken sind dem Fachmann alle bekannt.
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Alle
möglichen
Variationen in MS-Techniken, die in der Technik bekannt sind, können gemäß der vorliegenden
Erfindung genutzt werden. Vorzugsweise ist das MS von dem Typ, der
aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus dem Elektrospray-Ionisationstyp, dem
Atmosphärendruck-Ionisationstyp,
dem Quadrupoltyp, dem Magnetsektortyp, dem Flugzeittyp, MS/MS, MSn, FTMS-Typ, Ionenfallentyp und Kombinationen
davon besteht.
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Im
Scanning-Modus zum Aufspüren
von Verbindungen kann zum Beispiel ein niedrigauflösendes MS
mit allen möglichen
instrumentellen Ausgestaltungen des MS verwendet werden, insbesondere Quadrupol,
Magnetsektor, Flugzeit, FTMS und Ionenfalle. Dabei entstehen typischerweise
Molekulargewichtsdaten mit nomineller Massengenauigkeit.
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Wenn
hochauflösendes
MS angewendet wird und alle möglichen
hochauflösenden
instrumentellen Ausgestaltungen, insbesondere Magnetsektor, Flugzeit,
FTMS und Ionenfalle, verwendet werden, können Molekulargewichtsdaten
mit hoher Massengenauigkeit kombiniert mit der elementaren Zusammensetzung
der Verbindung erhalten werden.
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Weitere
bekannte MS-Techniken umfassen Tandem-MS, wie MS/MS oder MSn (zum Beispiel MS3).
Die Anwendung dieser Techniken ermöglicht die Sammlung von strukturellen
Informationen über die
Liganden, was eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist. Die Daten im Scanning-Modus können im datenabhängigen Modus
erfasst werden, was bedeutet, dass für jeden beobachteten Peak automatisch
die Tandem-MS-Messung durchgeführt
wird. Zusätzlich
kann die bei der Tandem-MS-Messung induzierte Fragmentierung mit ausgefeilteren
Verfahren gekoppelt werden, zum Beispiel einer Breitbandanregung,
die ebenfalls erwartete Fragmente von geringerer Wichtigkeit fragmentiert,
wie den [protoniertes Molekül-H2O]+-Peak im Naturprodukt-Screening.
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Das
MS kann auch im Einzel/Mehrfach-Ionenüberwachungsmodus, der für den hochselektiven Nachweis
verwendet werden kann, betrieben werden.
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Der
Einzel/Mehrfach-Ionenüberwachungsmodus
kann für
einen hochselektiven Nachweis verwendet werden. Bei Verwendung von
niedrigauflösendem
MS im Einzel/Mehrfach-Ionenüberwachungsmodus
mit allen möglichen
niedrigauflösenden
instrumentellen Ausgestaltungen, insbesondere Quadrupol, Magnetsektor,
Flugzeit, FTMS und Ionenfalle, kann ein selektiver Nachweis auf
der Basis der Überwachung
von zuvor bestimmten m/z-Spuren erhalten werden. Wenn hochauflösendes MS
angewendet wird, können
alle möglichen
instrumentellen Ausgestaltungen der MS verwendet werden, insbesondere
Quadrupol, Magnetsensor, Flugzeit, FTMS und Ionenfalle. Dies ermöglicht typischerweise
einen sehr selektiven Nachweis auf der Basis der Überwachung
von zuvor bestimmten m/z-Spuren
in hoher Auflösung.
Wenn Tandem-MS angewendet wird, können alle möglichen instrumentellen Ausgestaltungen verwendet
werden, insbesondere Ionenfalle, Quadrupol-Flugzeit (Q-TOF), Tripelquadrupole
(QQQ), FTMS und Kombinationen von Sektorinstrumenten mit Quadrupolen
und Ionenfallen. Dies ermöglicht den
sehr selektiven Nachweis auf der Basis der Überwachung eines oder mehrerer
resultierender Peaks in MS/MS- und/oder MSn-Messungen.
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Es
ist auch möglich,
das MS im Scanning-Modus zu betreiben. Auf diese Weise ist die Senkung
des vorbestimmten Signals mit der Zunahme anderer Signale korreliert,
so dass die aktive Verbindung in demselben Durchlauf charakterisiert
werden kann.
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Mit
den Assays gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Aufspürung
von (bio)aktiven Verbindungen in Lösungen komplexer Natur, zum
Beispiel biologischen Flüssigkeiten
oder Extrakten, Naturproduktextrakten, Lösungen oder Extrakten aus biotechnologischen
Verfahren, die aus chemischen Experimenten resultieren, wie kombinatorischen
Techniken und Verfahren und dergleichen, mit höherer Effizienz, Selektivität und Flexibilität durchgeführt werden.
Außerdem
sorgt die vorliegende Erfindung für die Möglichkeit, die Störung von
Hintergrundverbindungen zu beschränken.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
weiterhin die Identifizierung von Verbindungen auf der Basis von
herkömmlichen
Massenspektren, hochauflösenden
Daten oder Spektren auf MSn-Basis.
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Mit
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, Bibliotheksrecherchen
auf der Basis einer Vielzahl von massenspektrometrischen Experimenten
durchzuführen,
die die Durchmusterung großer
Reihen von Proben und das Klassifizieren derselben in Klassen auf
der Basis von ähnlichen
aktiven Verbindungen ermöglichen,
ohne dass die Verbindungen vollständig identifiziert werden müssen.
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Das
Assayverfahren der vorliegenden Erfindung kann in miniaturisierten
Formaten von Systemen auf Assaybasis angewendet werden, zum Beispiel
mit Screening-Systemen auf der Basis von Chiptechnologie.
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In
den Verfahren der vorliegenden Erfindung können alle Moleküle, die
zur Wechselwirkung mit oder Bindung an anderen Molekülen befähigt sind, als
Affinitätsmolekül verwendet
werden. Das Affinitätsmolekül kann zum
Beispiel aus der Gruppe der cytosolischen Rezeptoren, z.B. Estrogen-
und Glucocorticoid-Rezeptor,
solubilisierten membrangebundenen Rezeptoren, zum Beispiel ein β-Rezeptor, Affinitätsproteinen,
wie Antikörpern,
Enzymen, Avidin, Polynucleotiden und Polysacchariden, ausgewählt sein.
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Eine "definierte Menge
an Affinitätsmolekül", die zu der ausfließenden Flüssigkeit
gegeben wird, soll eine Menge bekannter Konzentration und bekannter
Fließgeschwindigkeit
bedeuten.
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Der
Ausdruck "bekannter
Ligand", wie er
in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf einen Liganden, der mit dem oben definierten Affinitätsmolekül wechselwirken
oder reagieren kann und der durch MS nachgewiesen werden kann. Ein
Beispiel für
einen nachweisbaren Liganden ist ein zuvor gefundener Analyt, der
von dem Affinitätsmolekül gebunden
werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung hat den großen Vorteil, dass keine Herstellung
eines Markers erforderlich ist. Dies ist besonders vorteilhaft für diejenigen
Affinitätsmoleküle, bei
denen die Markierung eines bekannten Liganden zu einem dramatischen Verlust
der Affinität
führt,
zum Beispiel aufgrund von sterischer Hinderung. Assays unter Verwendung
von bekannten natürlichen
Liganden ohne Marker als Reportermoleküle sind viel schneller zu entwickeln.
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Die
mitlaufende Kopplung, wie sie in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, erfordert schnelle Reaktionszeiten, um
eine Bandverbreiterung außerhalb
der Säule
zu vermeiden. Dies bedeutet, dass Wechselwirkungen zwischen Affinitätsmolekül und Ligand
mit Reaktionszeiten in der Größenordnung
von Minuten statt Stunden berücksichtigt
werden sollten. Die geeigneten Bindungsbedingungen, unter denen
die Affinitätsmoleküle an den
Analyten binden, umfassen eine Kontaktzeit, die in derselben Größenordnung
liegt. Geeignete Bindungsbedingungen sind Bedingungen, die für eine optimale
Bindung zwischen den Affinitätsmolekülen und
dem Analyten sorgen. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die
genauen Bedingungen, wie Temperatur, Verweilzeit, chemische Zusammensetzung,
stark vom Assaytyp und den dort verwendeten Proteinen abhängen. Im
Gegensatz zu biochemischen Assays auf der Basis von fluoreszenten,
radioaktiven oder Enzymmarkern, wo Hintergrundpufferlösungen hauptsächlich aus
unflüchtigen
Phosphat- oder Trispuffern bestehen, werden die hier vorgestellten
homogenen massenspektrometrischen biochemischen Assays unter Verwendung
von flüchtigen
Puffern, wie Ammoniumformiat oder Ammoniumacetat, bei neutralem
pH-Wert durchgeführt.
Um die Ionisierungseigenschaften des bekannten Liganden zu verbessern,
werden außerdem
kleine Mengen Methanol (2,5-10%) zum Hintergrundpuffer gegeben.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
können
Kombinationen von Affinitätsproteinen und
bekannten Liganden verwendet werden, um nach mehreren biomolekularen
Targets gleichzeitig zu suchen (siehe Schema 3). Zu diesem Zweck
wird ein Gemisch von Affinitätsproteinen
hergestellt und zu der ausfließenden
Flüssigkeit
des Fraktionierungsverfahrens gegeben. Anschließend wird ein Gemisch von bekannten
Liganden, die wenigstens einen aktiven bekannten Liganden pro Affinitätsprotein
enthalten, hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wird zum MS geleitet. Im MS wird jeder aktive
bekannte Ligand durch SIM (Selected Ion Monitoring) überwacht.
Die Anwesenheit einer aktiven Verbindung in der ausfließenden Flüssigkeit
der Fraktionierung führt
zu einer Signaländerung
der entsprechenden bekannten Ligandenspur im Massenspektrometer.
Gemäß dieser
bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung liegen die Affinitätsmoleküle somit in einem Gemisch von
zwei oder mehr verschiedenen Typen von Affinitätsmolekülen vor, und die bekannten
Liganden liegen in einem Gemisch verschiedener Liganden vor, während jeder
dieser Liganden bekanntermaßen
an eines der Affinitätsmoleküle bindet.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist der mitlaufende biochemische Assay an eine Multiplex-Einlasseinheit
für das
Massenspektrometer gekoppelt (siehe Schema 4). Die Multiplex-Einlasseinheit
ermöglicht
die Verbindung eines Massenspektrometers mit mehreren (z.B. acht)
verschiedenen Fraktionierungslinien. In jeder Linie wird ein individueller
bekannter Ligandenassay durchgeführt. Diese
Methode ist besonders gut für
die Durchmusterung von ähnlichen
Affinitätsproteinen
geeignet. Sie ermöglicht
die gleichzeitige Durchführung
einer Vielzahl von Assays, ohne dass diese einander beeinflussen
(zum Beispiel durch aktive Verbindungen, die mit mehreren Affinitätsproteinen
reagieren). Auf diese Weise können
mitlaufende biochemische Assays parallel durchgeführt werden,
wobei man ein einziges Massenspektrometer als Detektor verwendet.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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Schema
1 ist eine schematische Darstellung des mitlaufenden Assays gemäß der Erfindung
im Vergleich zu dem verfahren von Irth und Van der Greef (EP-A-1 048 951).
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Schema
2 zeigt ein typisches Chromatogramm, das mit dem Verfahren der Erfindung
erhalten wird. Das obere Chromatogramm (MS-Signal vs. Retentionszeit)
wird erhalten, indem man die ausfließende Flüssigkeit einem Screening im
SIM-Modus (Selected
Ion Monitoring) unterzieht, d.h. das MS sucht nur nach einem Wert
für m/z,
der für
den bekannten Liganden L typisch ist. Das Chromatogramm zeigt eine
Erhöhung
in der Konzentration an freiem Liganden, [L], bei einer bestimmten
Retentionszeit an, was auf die Anwesenheit einer Verbindung (eines Analyten),
die an das Affinitätsmolekül bindet,
hinweist. Dieser Peak wird auch im Gesamtionenstrommodus gemessen
(mittleres Diagramm von Schema 2). Das volle Massenspektrum zu der
Retentionszeit, die dem Peak in [L] entspricht, ist im unteren Diagramm
von Schema 2 angegeben. Aus diesem Spektrum können strukturelle Informationen über den Analyten
erhalten werden.
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Schema
3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung, wobei Kombinationen von Affinitätsproteinen und bekannten Liganden
verwendet werden, um nach mehreren biomolekularen Targets gleichzeitig
zu suchen.
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Schema
4 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform,
bei der eine Multiplex-Einlasseinheit für das Massenspektrometer verwendet
wird.
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1 zeigt
die mit Beispiel 1 erhaltenen Ergebnisse; das MS-Signal bei m/z
= 390 als Funktion der Zeit.
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2 zeigt
die für
biotinylierte Analyten erhaltenen Ergebnisse (Experiment 1).
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3 zeigt
das SIM(Selected Ion Monitoring)-MS-Signal bei m/z = 408 (Experiment
2).
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Beispiel 1
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Die
Machbarkeit eines homogenen mitlaufenden massenspektrometrischen
biochemischen Assays wurde bewiesen, wobei Streptavidin als Affinitätsprotein,
Fluorescein-Biotin als Reportermoleküle und biotinylierte Verbindungen
als Analyten verwendet wurden. Streptavidin ist ein wohlbekanntes Affinitätsprotein
mit einer hohen Affinität
zu Biotin und biotinylierten Verbindungen. Zu einer Trägerlösung, die
aus 10 mmol/l Ammoniumformiat/Methanol (90:10, v/v) bestand und
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 50 μl/min
gepumpt wurde, wurde eine Lösung
von 32 nmol/l Streptavidin, das in 10 mmol/l Ammoniumformiat gelöst war,
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 50 μl/min
zugeführt.
Das Gemisch wurde durch eine Reaktionsschlange aus Polytetrafluorethylen
mit Strickgewebe mit einem Innendurchmesser von 300 mm mit einem
Innenvolumen von 17 μl
gepumpt. Anschließend
wurde eine Lösung
von 96 nmol/l Fluorescein-Biotin, das in 10 mmol/l Ammoniumformiat/Methanol
(90:10, v/v) gelöst
war, mit einer Fließgeschwindigkeit
von 100 μl/min
zugeführt.
Dann wurde das Gemisch durch eine Reaktionsschlange aus Polytetrafluorethylen
mit Strickgewebe mit einem Innendurchmesser von 300 mm mit einem
Innenvolumen von 33 μl
gepumpt und anschließend
in ein Massenspektrometer eingeführt,
das mit einer Elektrospray-Ionisations(ESI)-Quelle ausgestattet
war. Massenspektrometrie wurde im SIM-Modus (Selected Ion Monitoring)
im Positive-Ionen(PI)-Modus an [M+H]+ und
an einem oder mehreren intensiven Fragmentionen durchgeführt. Die
ESI- Quellenbedingungen
für das
Streptavidin/Biotin-System: Quellentemperatur 80°C; Kapillarenspannung 3,2 kV.
Die Sampling-Cone-Spannung betrug 30 bzw. 60 V für Biotin bzw. fluoresceinmarkiertes
Biotin.
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1 zeigt
ein Experiment, bei dem die gesamte Reaktionssequenz verfolgt werden
kann. An Punkt 1 wurde nur Trägerpuffer
in das Massenspektrometer gepumpt, was ein Referenz-Hintergrundsignal
ergab. An Punkt 2 wurde die Fluorescein-Biotin-Pumpe angeschaltet,
was zu einer Zunahme des SIM-MS-Signals bei m/z = 390 führte. An
Punkt 3 wurde die Streptavidinpumpe angeschaltet. Die Zugabe des
Affinitätsproteins
Streptavidin führt
zu einer Abnahme der Konzentration an freiem Fluorescein-Biotin,
was zu einer Abnahme des SIM-MS-Signals
führt.
An Punkt 4 wurden Injektionen von Biotin durchgeführt, was
zu einer Abnahme der Bindungsstellen für freies Streptavidin und einer
Zunahme der Konzentration an freiem Fluorescein-Biotin führte, die
als Peak im SIM-MS-Signal
bei m/z = 390 beobachtet werden kann.
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2 zeigt,
dass das Screening-Verfahren selektiv für biotinylierte Analyten war.
Injektionen von gleichen Konzentrationen an Biotin (m/z 245), N-Biotinyl-6-aminocapronsäurehydrazid
(m/z 372), Biotinhydrazid (m/z 259) und N-Biotin-L-lysin (m/z 373) führen zu fast gleichen Signalen
an der Fluorescein-Biotin-Spur (m/z 390), was darauf hinweist, dass alle
Verbindungen die Bindung des Reportermoleküls Fluorescein-Biotin an Streptavidin
verhindern können.
Weiterhin konnte die Molekülmasse
der aktiven Verbindungen für
diejenigen Verbindungen, die unter den ausgewählten Bedingungen ionisiert
werden, identifiziert werden.
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Beispiel 2
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Die
Machbarkeit eines homogenen mitlaufenden massenspektrometrischen
biochemischen Assays für
die Messung von schwächeren
Wechselwirkungen als bei Streptavidin/Biotin wurde bewiesen, wobei
Fab-Fragmente von Anti-Digoxigenin-Antikörpern (Fab-Anti-Digoxigenin)
als Affinitätsprotein, Digoxigenin
als Reportermoleküle
und Digoxin als Analyten verwendet wurden. Zu einer Trägerlösung, die
aus 10 mmol/l Ammoniumformiat/Methanol (90:10, v/v) bestand und
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 50 μl/min
gepumpt wurde, wurde eine Lösung
von 100 nmol/l Fab-Anti-Digoxigenin, das in 10 mmol/l Ammoniumformiat
gelöst
war, mit einer Fließgeschwindigkeit
von 50 μl/min
zugeführt.
Das Gemisch wurde durch eine Reaktionsschlange aus Polytetrafluorethylen
mit Strickgewebe mit einem Innendurchmesser von 300 mm mit einem
Innenvolumen von 65 μl
gepumpt. Anschließend
wurde eine Lösung von
200 nmol/l Digoxigenin, das in 10 mmol/l Ammoniumformiat/Methanol
(90:10, v/v) gelöst
war, mit einer Fließgeschwindigkeit
von 100 μl/min
zugeführt. Dann
wurde das Gemisch durch eine Reaktionsschlange aus Polytetrafluorethylen
mit Strickgewebe mit einem Innendurchmesser von 300 mm mit einem Innenvolumen
von 33 μl
gepumpt und anschließend in
ein Massenspektrometer eingeführt,
das mit einer Elektrospray-Ionisations(ESI)-Quelle ausgestattet war.
Massenspektrometrie wurde im SIM-Modus (Selected Ion Monitoring)
im Positive-Ionen(PI)-Modus an [M+H]+ und
an einem oder mehreren intensiven Fragmentionen durchgeführt.
-
3 zeigt
ein Experiment, bei dem die gesamte Reaktionssequenz verfolgt werden
kann. An Punkt 1 wurde nur Trägerpuffer
in das Massenspektrometer gepumpt, was ein Referenz-Hintergrundsignal
ergab. An Punkt 2 wurde die Digoxigenin-Pumpe angeschaltet, was
zu einer Zunahme des SIM-MS-Signals bei m/z = 408 (dem Ammoniumaddukt
von Digoxigenin) führte.
An Punkt 3 wurde die Fab-Anti-Digoxigenin-Pumpe angeschaltet. Die
Zugabe des Affinitätsproteins
Fab-Anti-Digoxigenin führt
zu einer Abnahme der Konzentration an freiem Digoxigenin, was zu
einer Abnahme des SIM-MS-Signals führt. An Punkt 4 wurden Injektionen
von Digoxin durchgeführt,
was zu einer Abnahme der Bindungsstellen für freies Fab-Anti-Digoxigenin
und einer Zunahme der Konzentration an freiem Digoxigenin führte, die
als Peak im SIM-MS-Signal bei m/z = 408 beobachtet werden kann.