CN117126938A - 一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疾病诊断方法技术领域,尤其涉及一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法。包括血浆和尿液中细胞外囊泡miR‑4639和miR‑210。与健康对照组相比,膜性肾病患者尿液细胞外囊泡的浓度及标志物的表达显著升高(P均<0.05),血浆和尿液细胞外囊泡内miR‑4639和miR‑210水平显著提高(P均<0.05)。细胞外囊泡miR‑4639和miR‑210在血浆和尿液中的水平分别与肾小球滤过率(eGFR)的下降和蛋白尿的升高显著相关,表明细胞外囊泡miR‑4639和miR‑210可用作为有效的生物标志物,以协助膜性肾病的诊断,评估其严重程度和疾病进展。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断方法技术领域,尤其涉及一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法。具体涉及血浆和尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210在膜性肾病中的表达及疾病监测和预后评估。
背景技术
膜性肾病是病理定义的肾小球疾病,也称为膜性肾小球肾炎,以基底膜外侧形成免疫复合物造成肾小球毛细血管壁明显增厚为特异性病变。免疫复合物沉积和膜攻击复合物形成所引起的足细胞结构紊乱可介导尿液中大量蛋白质的丢失,是造成肾病综合征的重要原因。膜性肾病是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因,且有40%-50%表现为肾病综合征的膜性肾病患者在10年内进展为ESRD,因而早期诊断和疾病进展监测在预防膜性肾病进展为ESRD方面起着关键作用。如今,肾病诊断的金标准仍是肾脏活检,然而由于活检操作的侵入性,容易引起一些并发症,不适用于频繁的临床监测。因此,探索用于膜性肾病的非侵入性诊断和疾病监测的生物学标志物尤为重要。
近年来研究发现,细胞外囊泡(extracellular vehicles,EV)可以包裹和携带非编码微小RNA(miRNAs)并稳定存在于循环系统,使得EV miRNA具备了成为无创、可靠生物标志物的条件。近年来,利用血液或尿液EV miRNA作为肾脏疾病生物标志物的研究已有报道,例如,血清EV hsa-miR-377可能是诊断糖尿病肾病的非侵入性生物标志物。血清EV miR-93-5p可作为生物标志物来辅助早期诊断慢性肾脏病。尿液EV miR-29和miR-200b已被证明可作为肾纤维化的生物标志物。尿液EV miR-26a可作为生物标志物来诊断活动性狼疮性肾炎和预测肾小球肾炎中足细胞损伤。尿液EV miR-451和miRNAs组合(miR-15b、miR-34a和miR-636)可作为糖尿病肾病的生物标志物。本团队前期的系列研究表明,在患有慢性移植肾功能障碍的同种异体肾移植受者的血浆EV中,包括miR-4639、miR-210在内的多种miRNA表达显著增高,具有疾病诊断价值;在lgA肾病患者中,血浆和尿液EV中miRNAs可作为预测进展的生物标志物。然而,在膜性肾病的相关研究中,仅有游离miRNA与膜性肾病的相关报道,而血浆和尿液EV miRNA在膜性肾病患者中的研究尚未见报道。该组EV miRNAs的改变是否在不同类型的肾脏疾病中存在相似的变化,从而介导共通的肾脏损伤病理过程,尚未得到充分研究。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于诊断膜性肾病的生物标志物,探讨血浆和尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210在膜性肾病中的表达及疾病监测和预后评估。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
一种用于诊断膜性肾病的生物标志物,包括血浆和尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210。膜性肾病患者中70%~80%的患者表现为肾病综合征,约30%伴有镜下血尿,且肾静脉血栓发生率可高达40%~50%。膜性肾病作为ESRD的重要原因之一,缺乏无创非侵入性的诊断方法。EV因其独特的膜结构使包裹在内的物质更稳定,故EV miRNA常被作为各类疾病的非侵入性诊断生物标志物。本申请聚焦于EV miR-4639和miR-210作为膜性肾病生物标志物的联合诊断效能这一问题展开探究。在膜性肾病的相关领域中,实现无创非侵入性的诊断方法。
本发明的第二个目的是提供细胞外囊泡miR-4639和miR-210作为膜性肾病生物标志物的研究方法,以协助膜性肾病的诊断,评估其严重程度和疾病进展。
本发明的上述技术目的是由以下技术方案实现的:
作为优选的,通过检测miR-4639和miR-210的相对丰度来确定受试者是否患有膜性肾病;其中,相比于健康人群,在膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度显著改变,所述显著改变是指同健康人群相比,膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度具有统计学显著性差异,即P值<0.05;所述统计学方法包括方差检验,t-检验,秩和检验。
具体的,纳入30例健康对照、30例膜性肾病患者作为研究对象。入组对象的临床特征见表1。纳入标准:(1)肾脏活检确认肾脏组织病理学损伤;(2)年龄>18岁;(3)签署知情同意书。排除标准:(1)患有恶性肿瘤、狼疮或严重肝病;(2)怀孕或哺乳期患者;(3)接受过肾脏移植或透析治疗;(4)患有其他器官明显纤维化的患者,如肝脏、心脏、肺和广泛的皮肤疤痕;(5)患有急性或慢性感染的患者。对照组纳入30例无蛋白尿、高血压、糖尿病、恶性肿瘤、肾功能受损或急慢性炎性反应性疾病的健康受试者。肾小球滤过率采用“CKD-EPI方程”评估。
作为优选的,使用PEG化学沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡。电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪观察细胞外囊泡的形态学特征;蛋白质印迹测定囊泡表面标志物的表达水平。
作为优选的,清晨从禁食的研究对象身上采集2mL血液样本和50mL尿液样本。血液样本在收集的2h内离心并分离上层血浆。血浆和尿液分别于与等体积的16%或24% PEG溶液混合,4℃孵育过夜后以10,000rpm离心1h,完全弃去上清液,将EV沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过透射电子显微镜(TEM)观察EV形态。采用纳米颗粒跟踪分析仪分析EV的大小和浓度。采用蛋白质印迹法分析EV表面标志物(Alix、CD63和CD81)表达情况:EV样本中加入蛋白裂解液,提取蛋白质,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。
作为优选的,使用qRT-PCR来检测血浆及尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210的表达水平。
具体的,采用Trizol LS试剂提取EV RNA,采用miRNA茎环法特异性逆转录引物将miRNA逆转录成cDNA。采用ABI 7500荧光定量PCR仪进行目的序列扩增和熔解曲线分析,miR-4639定量扩增引物序列为:F:5'TTG CTA AGT AGG CTG AGA 3',R:5'CTC AAC TGG TGTCGT G 3'。MiR-210定量扩增引物序列为:F:5'TCT GTG CGT GTG ACA GC 3',R:5'TGG TGTCGT GGA GTC G 3'。EVs miR-16为内参,miR-16定量扩增引物序列为:F:5'AGC AGC ACGTAA ATA TTG 3',R:5'AAC TGG TGT CGT GGA G 3'。采用ΔΔCt法计算miRNA表达差异。
作为优选的,采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和统计。通过Image J软件分析蛋白质印迹的灰度值。所有数据以平均数±标准差、百分比或中位数表示。数据通过正态性检验后,使用独立样本t检验比较两组数据间的差异,采用单因素方差分析(ANOVA)比较多组数据间的差异,多重比较采用Turkey法。采用Pearson相关系数计算miR-4639和miR-210表达量与eGFR或者尿蛋白之间的相关性。通过受试者工作特征曲线(ROC)评估生物标志物的诊断效能。所有P值均为双尾值,P<0.05为差异具有统计学意义。
作为优选的,血浆中细胞外囊泡miR-4639和miR-210水平与研究对象的肾小球滤过率分别呈显著负相关。“肾小球滤过率”是指一种能够确定肾脏功能的量度。一般而言,正常肾小球滤过率的范围在约120-90ml/分钟/1.73m2体表面。当肾小球滤过率低于90ml/分钟/1.73m2体表面时认为肾功能受损。当肾小球滤过率降至低于约30ml/分钟/1.73m2体表面时可能肾衰竭。当肾小球滤过率降至低于约15ml/分钟/1.73m2体表面时往往开始透析。
作为优选的,尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210水平与研究对象的24小时尿蛋白定量分别呈显著正相关。24小时尿蛋白定量是通过收集24小时的全部尿液,来测定其中的蛋白质的含量,进而计算出24小时内的蛋白总量。在正常尿液中蛋白质含量极微,其正常水平在150mg/24h以下。当尿蛋白含量>150mg/24h,表明存在肾功能损伤。24小时尿蛋白含量<0.5g/24h为轻度蛋白尿,可见于功能性蛋白尿,体位性蛋白尿和尿路感染等;24小时尿蛋白含量在0.5~2.0g/24h区间时为中度蛋白尿,可能与肾小球肾炎、间质性肾炎有关;24小时尿蛋白含量>2.0g/24h为重度蛋白尿,多见于各种原因导致的肾病综合征。
在临床指标中,肾小球滤过率、24小时尿蛋白定量水平可以间接反映肾脏功能受损的水平。在相关性分析中发现,血浆EV miR-4639和miR-210水平与eGFR呈负相关,尿液EVmiR-4639和miR-210水平与24小时尿蛋白定量呈正相关,表明血浆、尿液EV miR-4639和miR-210可以反映肾功能受损程度。
作为优选的,通过受试者工作特征曲线(ROC)评估生物标志物的诊断效能。
本发明使用多指标联合诊断的模型算法进行评估。相较于传统的ROC曲线只考虑了一个评估指标,无法全面反映模型的性能。多指标ROC曲线可以同时评估多个指标,提供更全面、准确的性能评估结果。本发明首先使用miR-4639和miR-210这2个变量建立逻辑回归(Logistic Regression),然后计算逻辑回归给出的概率,即可绘制多指标联合诊断的ROC曲线。同时逻辑回归给出联合分析的系数,生成联合计算公式,将不同个体的miR-4639和miR-210测定值代入公式,可计算某个个体患该疾病的概率。
在血浆中,双miRNAs在不同肾功能分组(eGFR<90和eGFR≥90)下的联合ROC曲线的具体方程如下:Logit(P)=(-4.565)+0.732×[miR-4639-5p]+1.941×[miR-210-3p]。
在尿液中,双miRNAs在不同24小时尿蛋白定量分组(≥3.5g/24h和<3.5g/24h)下的联合ROC曲线的组合方程如下:Logit(P)=(-7.954)+1.790×[miR-4639-5p]+1.982×[miR-210-3p]。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
本发明中,与健康对照组相比,膜性肾病患者尿液细胞外囊泡的浓度及标志物的表达显著升高(P均<0.05),血浆和尿液细胞外囊泡内miR-4639和miR-210水平显著提高(P均<0.05)。细胞外囊泡miR-4639和miR-210在血浆和尿液中的水平分别与肾小球滤过率(eGFR)的下降和蛋白尿的升高显著相关(r分别为-0.3079,0.3548和r=-0.4734,0.4749,P均<0.05)。在肾功能受损个体(eGFR<90)的血浆细胞外囊泡和具有严重蛋白尿个体(≥3.5g/24h)的尿液细胞外囊泡中,miR-4639和miR-210的表达均显著升高(P均<0.05)。随访研究表明,膜性肾病进展组的患者基线血浆细胞外囊泡miR-4639和miR-210表达量更高(P均<0.05)。与单个miRNA相比,双miRNAs组合在评估肾功能水平和24小时尿蛋白水平方面均具有更好的诊断价值(灵敏度75%、93.33%,特异度79.17、85.71%,曲线下面积0.83、0.93)。表明细胞外囊泡miR-4639和miR-210可用作为有效的生物标志物,以协助膜性肾病的诊断,评估其严重程度和疾病进展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为血浆和尿液EV的代表性电镜图,其中(A)为血浆EV的代表性电镜图;(B)为尿液EV的代表性电镜图;
图2为膜性肾病患者和健康人群血浆EV浓度表达;
图3为通过Western-blot实验评估两组人群血浆EV标志物Alix,CD63和CD81的含量表达;
图4为通过Western-blot实验比较两组人群血浆EV标志物Alix,CD63和CD81的相对表达量;
图5为膜性肾病患者和健康人群尿液EV浓度表达;
图6为通过Western-blot实验评估两组人群血浆EV标志物Alix,CD63和CD81的含量表达;
图7为通过Western-blot实验比较两组人群尿液EV标志物的相对表达量;
图8为血浆EV miR-4639在两组人群中的表达;
图9为尿液EV miR-4639在两组人群中的表达;
图10为血浆EV miRNA-210在两组人群中的表达;
图11为尿液EV miR-210在两组人群中的表达;
图12为血浆EV miR-4639与eGFR负相关表达;
图13为尿液EV miR-4639与24小时尿蛋白定量正相关表达;
图14为血浆EV miR-210与eGFR负相关表达;
图15为尿液EV miR-210与24小时尿蛋白定量正相关表达;
图16为血浆EV miR-4639在具有不同eGFR水平的研究对象(n=60)中的表达水平;
图17为尿液EV miR-4639在具有不同24小时尿蛋白定量水平的研究对象(n=50)中的表达;
图18为基线血浆EV miR-4639在进展组患者(n=11)和稳定组(n=10)中的表达;
图19为血浆EV miR-210在具有不同eGFR水平的研究对象(n=60)中的表达水平;
图20为尿液EVmiR-210在具有不同24小时尿蛋白定量水平的研究对象(n=50)中的表达;
图21为基线血浆EV miR-210在进展组患者(n=11)和稳定组(n=10)中的表达;
图22为ROC曲线评估EV miRNA的诊断性能。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,对依据本发明提出的一种用于诊断膜性肾病的生物标志物组合及其应用方法,其具体实施方式、特征及其功效,详细说明如后。
实施例1
1.研究对象及分组
2020年9月至2021年3月期间于苏州大学附属第三医院纳入30例健康对照、30例膜性肾病患者作为研究对象。入组对象的临床特征见表1。纳入标准:(1)肾脏活检确认肾脏组织病理学损伤;(2)年龄>18岁;(3)签署知情同意书。排除标准:(1)患有恶性肿瘤、狼疮或严重肝病;(2)怀孕或哺乳期患者;(3)接受过肾脏移植或透析治疗;(4)患有其他器官明显纤维化的患者,如肝脏、心脏、肺和广泛的皮肤疤痕;(5)患有急性或慢性感染的患者。对照组纳入30例无蛋白尿、高血压、糖尿病、恶性肿瘤、肾功能受损或急慢性炎性反应性疾病的健康受试者。肾小球滤过率采用“CKD-EPI方程”评估。本发明经苏州大学附属第三医院伦理委员会审核通过(审批号:2021-科第125号),所有研究对象知情同意。
表1:研究对象的临床特征
数据以平均值±标准差表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
2.EV的提取及鉴定
清晨从禁食的研究对象身上采集2mL血液样本和50mL尿液样本。血液样本在收集的2h内离心并分离上层血浆。血浆和尿液分别于与等体积的16%或24% PEG溶液(北京索莱宝科技有限公司)混合,4℃孵育过夜后以10,000rpm离心1h,完全弃去上清液,将EV沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过透射电子显微镜(TEM)观察EV形态。采用纳米颗粒跟踪分析仪(ZetaView,德国Particle Metrix公司)分析EV的大小和浓度。采用蛋白质印迹法(western blot)分析EV表面标志物(Alix、CD63和CD81)表达情况:EV样本中加入蛋白裂解液,提取蛋白质,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。使用的抗体为:Alix单克隆抗体(鼠抗人)购自美国CST公司(1∶1000稀释),CD63单克隆抗体(兔抗人)购自美国Proteintech公司(1∶1000稀释),CD81单克隆抗体(兔抗人)购自英国Abcam公司(1∶1000稀释),HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗均购自杭州联科生物有限公司(1∶10000稀释)。
3.实时荧光定量PCR
采用Trizol LS试剂(美国赛默飞世尔科技有限公司)提取EV RNA,采用miRNA茎环法特异性逆转录引物(上海冠泰生物科技有限公司)将miRNA逆转录成cDNA(逆转录试剂盒购自日本Takara公司)。采用ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)进行目的序列扩增和熔解曲线分析(荧光定量PCR引物购自上海冠泰生物科技有限公司),miR-4639定量扩增引物序列为:F:5'TTG CTA AGT AGG CTG AGA 3',R:5'CTC AAC TGG TGT CGTG 3'。MiR-210定量扩增引物序列为:F:5'TCT GTG CGT GTG ACA GC 3',R:5'TGG TGT CGTGGA GTC G 3'。EVs miR-16为内参,miR-16定量扩增引物序列为:F:5'AGC AGC ACG TAAATA TTG 3',R:5'AAC TGG TGT CGT GGA G 3'。采用ΔΔCt法计算miRNA表达差异。
4.统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和统计。通过Image J软件分析蛋白质印迹的灰度值。所有数据以平均数±标准差、百分比或中位数表示。数据通过正态性检验后,使用独立样本t检验比较两组数据间的差异,采用单因素方差分析(ANOVA)比较多组数据间的差异,多重比较采用Turkey法。采用Pearson相关系数计算miR-4639和miR-210表达量与eGFR或者尿蛋白之间的相关性。通过受试者工作特征曲线(ROC)评估生物标志物的诊断效能。所有P值均为双尾值,P<0.05为差异具有统计学意义。
结果验证
1.各组EV的浓度和标志物表达比较:
透射电子显微镜揭示了血浆与尿液EV的典型形态(图1,A和B)。结合纳米颗粒跟踪分析仪检测结果和蛋白质印迹分析,发现膜性肾病患者血浆EV的浓度及其标志物表达较健康对照组无明显改变(图2~4)。而膜性肾病患者的尿液EV的浓度与健康对照组相比有显著升高(P<0.05),同时其尿液EV标志物表达也显著升高(图5~7,P均<0.05)。
2.各组EVmiR-4639和miR-210水平与临床指标的相关性分析:
qRT-PCR检测结果表明,血浆EV中miR-4639和miR-210的相对表达量在膜性肾病患者(n=30)中显著高于健康对照组(n=30)(图8、图10,P均<0.05)。尿液EV中miR-4639和miR-210的相对表达量在膜性肾病患者(n=20)中显著高于健康对照组(n=30)(图9、图11,P均<0.05)。此外,血浆EV miR-4639和miR-210水平与研究对象(30例膜性肾病患者和30例健康对照)的eGFR分别呈显著负相关(r=-0.3079和r=-0.4734,P均<0.05)(图12、图14),尿液EV miR-4639和miR-210水平与研究对象(30例膜性肾病患者和20例健康对照)的24小时尿蛋白定量分别呈显著正相关(r=0.3548和r=0.4749,P均<0.05)(图13、图15)。
3.EV miR-4639和miR-210作为膜性肾病生物标志物的分析:
3.3.1各组eGFR水平比较:将所有研究对象(30例膜性肾病患者和30例健康对照)根据eGFR水平分为两组:肾功能受损的个体eGFR<90(mL/min/1.73m2,n=12)与肾功能正常的个体eGFR≥90(mL/min/1.73m2,n=48)。结果表明,与肾功能正常的个体相比,肾功能受损的个体血浆EV miR-4639和miR-210的表达显著增高(图16、图19,P均<0.05)。
3.3.2各组24小时尿蛋白水平比较:在所有具有严重蛋白尿水平的研究对象中(≥3.5g/24h,n=15),尿液EV miR-4639和miR-210的表达水平显著高于无严重蛋白尿的个体(<3.5g/24h,n=35)(图17、图20,P均<0.05)。
3.3.3EV miR-4639和miR-210预测膜性肾病进展的作用:膜性肾病组患者随访(6.28±2.60)个月,将eGFR降低30%定义为疾病进展。与稳定组相比,处于进展组的膜性肾病患者的血浆EV miR-4639和miR-210的基线表达水平更高(图18、图21,P均<0.05)。
4.EV miR-4639和miR-210的诊断性能分析:
为了探究血浆和尿液中的这两种EV miRNAs是否可分别用于评估肾功能受损水平和24小时尿蛋白定量水平,我们采用ROC曲线构建预测模型,分别对血浆和尿液EV的诊断性能进行评估。
在血浆中,先分别描绘出所有研究对象的EV miR-4639和miR-210的ROC曲线,再计算出双miRNAs在不同肾功能分组(eGFR<90和eGFR≥90)的数值后绘制出联合ROC曲线,以进一步探索它们对评估肾功能受损水平的诊断性能(图22,A)。双miRNAs组合的算法是通过Logistic回归方程生成的,具体方程如下:Logit(P)=(-4.565)+0.732×[miR-4639-5p]+1.941×[miR-210-3p]。ROC曲线分析显示,在区分eGFR≥90和eGFR<90的个体时,miR-210的灵敏度为83.33%。而与任意单个miRNA相比,双miRNAs组合的特异度有所升高。血浆中miR-4639、miR-210和双miRNAs组合评估肾功能水平的AUC值分别为0.6979、0.7969和0.8264,表明在血浆中双miRNAs诊断性能优于单个指标(具体数值详见表2)。
在尿液中,同样先分别描绘出所有研究对象的EV miR-4639和miR-210在不同24小时尿蛋白定量分组(≥3.5g/24h和<3.5g/24h)的ROC曲线,再绘制出联合ROC曲线,以进一步探索它们对评估24小时尿蛋白定量水平的诊断性能(图22,B)。尿液EV双miRNAs组合方程如下:Logit(P)=(-7.954)+1.790×[miR-4639-5p]+1.982×[miR-210-3p]。结果显示,在区分严重蛋白尿(≥3.5g/24h)和无严重蛋白尿(<3.5g/24h)的个体时,EV miR-4639单指标的特异度最高,为97.14%,而双miRNAs组合在灵敏度和AUC值方面较单个miRNA有明显升高(具体数值详见表2)。
表2:血浆和尿液EV中单个miRNA和组合miRNA的诊断性能评估
综上可知,灵敏度是“真阳性率”,是正确判断患者的概率;特异度是“真阴性率”,是正确判断非患者的概率;曲线下面积AUC越接近1,表明诊断效能越好。
血浆EV单指标miR-4639的特异度是70.83%,单指标miR-210的特异度是66.67%,联合miR-4639+210的特异度是79.17%,大于任一单独指标。血浆中miR-4639、miR-210和双miRNAs组合评估肾功能水平的AUC值分别为0.70、0.80和0.83,表明在血浆中双miRNAs诊断性能优于单个指标。
尿液EV单指标miR-4639的灵敏度是66.67%,单指标miR-210的灵敏度是80.00%,联合miR-4639+210的灵敏度是93.33%,大于任一单独指标。尿液中miR-4639、miR-210和双miRNAs组合的AUC值分别为0.83、0.86和0.93,表明在血浆中双miRNAs诊断性能优于单个指标。
本发明针对不同组别EV分泌量的检测表明,与健康对照相比,膜性肾病患者尿液EV浓度和标志物表达均显著升高,而血浆EV浓度和标志物表达无明显改变。尿液EV的主要来源是肾脏细胞的分泌,因此,相较于血浆而言,尿液EV浓度和内含miRNA水平的改变更能反映直接肾脏的病理生理状态。研究表明,EV的表达水平与缺氧、热休克、氧化应激等条件刺激密切相关,故本发明中疾病组尿液EV的表达增加可认为是肾脏损伤的一种体现。
本发明中,EV中miR-4639和miR-210的表达在膜性肾病组显著高于健康对照组。EVmiR-4639和miR-210均显示出区分患者肾功能和蛋白尿水平的能力,特别是尿液中EV miR-4639在区分无严重蛋白尿个体与具有严重蛋白尿个体方面的特异度为97.14%,以及血浆EV miR-210在区分eGFR≥90和eGFR<90的患者的灵敏度为83.33%。我们进一步构建了基于EV miR-4639和miR-210的联合诊断模型,结果表明无论在血浆还是尿液中,双miRNAs组合的诊断效能均优于单个miRNA。因此联合诊断模型对临床早期诊断及预后提供一定的参考依据。
在膜性肾病患者的随访研究中,我们发现可以通过检测患者的基线miR-4639和miR-210水平来预测疾病进展情况。随访分析表明,疾病进展组有着更高的基线血浆EVmiR-4639和miR-210表达量(P均<0.05),而具有较低基线miR-4639和miR-210表达的患者,其肾功能的恢复趋势更好。综上所述,EV miR-4639和miR-210可用作为有效的膜性肾病生物标志物,且两种miRNA的联合诊断膜性肾病的诊断效能更高。
本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种用于诊断膜性肾病的生物标志物,其特征在于,包括血浆和尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡miR-4639和miR-210在诊断膜性肾病中的应用方法,通过检测miR-4639和miR-210的相对丰度来确定受试者是否患有膜性肾病;其中,相比于健康人群,在膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度显著改变,所述显著改变是指同健康人群相比,膜性肾病患者中miR-4639和miR-210的相对丰度具有统计学显著性差异,即P值<0.05;所述统计学方法包括方差检验,t-检验,秩和检验。
3.根据权利要求2所述的应用方法,其特征在于,使用PEG化学沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡。
4.根据权利要求2或3所述的应用方法,其特征在于,清晨从禁食的研究对象身上采集2mL血液样本和50 mL尿液样本;血液样本在收集的2 h内离心并分离上层血浆;血浆和尿液分别与等体积的16%或24% PEG溶液混合,4℃孵育过夜后以10,000 rpm离心1h,完全弃去上清液,将EV沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中;得到血浆和尿液细胞外囊泡。
5.根据权利要求2所述的应用方法,其特征在于,使用qRT-PCR来检测血浆及尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210的表达水平。
6.根据权利要求2或5所述的应用方法,其特征在于,miR-4639定量扩增引物序列为:F:5' TTG CTA AGT AGG CTG AGA 3',R: 5' CTC AAC TGG TGT CGT G 3';MiR-210定量扩增引物序列为:F : 5' TCT GTG CGT GTG ACA GC 3',R : 5' TGG TGT CGT GGA GTC G 3'。
7.根据权利要求2所述的应用方法,其特征在于,采用Pearson相关系数计算miR-4639和miR-210表达量与肾小球滤过率或者尿蛋白定量之间的相关性。
8.根据权利要求7所述的应用方法,其特征在于,血浆中细胞外囊泡 miR-4639和miR-210水平与研究对象的肾小球滤过率分别呈显著负相关。
9.根据权利要求7所述的应用方法,其特征在于,尿液中细胞外囊泡miR-4639和miR-210水平与研究对象的24小时尿蛋白定量分别呈显著正相关。
10.根据权利要求2所述的应用方法,其特征在于,通过受试者工作特征曲线(ROC)评估生物标志物的诊断效能。
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Also Published As
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